ITRM20120178A1 - Derivati del 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo per terapia antitumorale - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
- C07D271/12—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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Description
“Derivati del 7-Nitro-2,1,3-Benzossadiazolo per terapia antitumoraleâ€
SETTORE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione concerne derivati del 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo per la terapia dei tumori. Più in particolare, l’invenzione si riferisce all’uso di nuovi derivati del composto eterociclico noto come 7-nitro-benzofurazano o 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo, come agenti dotati di una potente attività inibitoria nei confronti della superfamiglia delle glutatione S-transferasi (GST) che sono iperespresse nelle cellule tumorali e conferiscono loro particolare resistenza a molteplici fattori di stress. Tali composti sono quindi utili per la produzione di farmaci da impiegare nella terapia dei tumori, sia da soli che in combinazione con altri chemioterapici.
I tumori rappresentano la seconda causa di morte nel nostro Paese. Lo sviluppo di questi composti rappresenta una nuova promettente strategia per la cura di tumori molto poco responsivi come, l’osteosarcoma, il mesotelioma ed il melanoma maligno.
TECNICA ANTERIORE
Le Glutatione S-trasferasi (GST, EC 2.5.1.18) sono enzimi presenti in tutte le classi di vertebrati e invertebrati; sono divise in almeno dieci classi citosoliche: a cui si aggiunge una classe di GST legata alle membrane, definita GST microsomiale. La funzione principale di tutte le GST à ̈ quella di catalizzare l’addizione del GSH a molecole che hanno gruppi elettrofili. Questi enzimi sono noti già da molti anni per essere coinvolti nella detossificazione di una varietà di composti sia endogeni che esogeni, quali carcinogeni, insetticidi, erbicidi e antibiotici, in un’azione coordinata svolta insieme alle pompe di membrana (Hayes JD et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005;45:51-88). La specificità delle GST per il GSH, che legano nel sito G, à ̈ molto elevata, mentre quella per il secondo substrato, che legano nel sito H, à ̈ meno pronunciata e permette di poter legare al GSH una vasta gamma di composti idrofobi (Mannervik B et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985;82(21):7202-6).
La reazione di coniugazione tra uno xenobiotico ed il GSH rende la sostanza più solubile, grazie all’introduzione di una porzione idrofila; il prodotto successivamente viene riconosciuto come substrato dalle pompe di membrana MRP1 e MRP2 (ATP-dependent glutathione S-conjugate export pump) ed eliminato dalla cellula (Wang D et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2005; 4:307-320). La porzione tripeptidica del coniugato (GS-) infatti agisce come sito di riconoscimento per queste pompe, permettendo loro di trasportare un elevato numero di composti strutturalmente diversi (Hayes JD et al., Biochem. J.
1990;272(2):281-95). Una volta fuori dalla cellula i metaboliti vengono trasformati ulteriormente, per essere poi escreti con le urine o con la bile. In ragione di tale meccanismo l’attività della GST, ed in particolare della GSTP1-1, à ̈ stata considerata uno dei fattori responsabili del fenomeno della farmaco-resistenza nelle cellule tumorali. E’ noto già da tempo che alti livelli di GST sono presenti in un gran numero di tumori e che questa famiglia isoenzimatica svolge un ruolo nella detossificazione di diversi farmaci antineoplastici o loro metaboliti usati in clinica oncologica (O'Brien ML et al., Eur J Cancer. 1996;32A(6):967-78; Lo HW, Ali-Osman F., Curr. Opin. Pharmacol.
2007;7(4):367-74). La maggioranza delle cellule tumorali umane, incluse quelle selezionate in vitro per la resistenza a chemioterapici, iperesprimono l’isoenzima GSTP1-1 che può arrivare fino a circa il 3% del totale delle proteine citosoliche. In uno studio condotto dal National Cancer Institute americano (Tew KD et al., Mol. Pharmacol.
1996;50(1):149-59) sono stati riscontrati alti livelli di attività enzimatica, contenuto proteico ed mRNA della GSTP1-1 in molte linee cellulari tumorali, particolarmente in quelle linee selezionate per la resistenza ad agenti alchilanti quali il melphalan, il clorambucile, la ciclofosfamide, la BCNU (N;N’-bis(2cloroetil)-N-nitrosurea) e il cisplatino (CDDP) che possono essere coniugati al glutatione dalla GST. Inoltre questo enzima potrebbe detossificare altri farmaci non agendo direttamente sulle molecole ma su un loro metabolita. Ciò porta ad una diminuzione dell’effetto dose/risposta e dell’efficacia del trattamento farmacologico. E’ stata inoltre dimostrata in diversi tipi di tumore una stretta correlazione tra alti livelli di GST, in particolare dell’isoenzima GSTP1-1, e una diminuita sensibilità verso numerosi chemioterapici, come antimetaboliti, inibitori della topoisomerasi I e II, mitomicina C e adriamicina, che non sono substrati diretti delle GST (Townsend DM, Tew KD, Oncogene 2003; 22:7369– 7375).
Questo fenomeno à ̈ stato spiegato dalla scoperta che molti isoenzimi della GST, in particolare la GSTP1-1, sono in grado di modulare le vie di trasduzione del segnale che controllano la proliferazione e la morte cellulare. Un ruolo importante in questa cascata di segnali à ̈ svolto dalle mitogen activated protein kinases (MAPK), enzimi coinvolti nei processi proliferativi, apoptotici e nella patogenesi di molte malattie. I membri principali della famiglia delle MAPchinasi sono JNK (c-Jun N-terminal kinase), p38 ed ERK (extracellular signal-regulated kinase) (Dhillon AS et al.,Oncogene 2007; 26:3279-3290). Numerosi antitumorali svolgono la loro azione citotossica/citostatica attivando le vie mediate da queste chinasi ed à ̈ noto già da un decennio che le GST sono in grado di legarsi ad alcune di queste chinasi, inibendo la loro azione. Quindi il ruolo inibitorio svolto dalle GST si traduce in una resistenza verso gli agenti chemioterapici. In particolare, à ̈ noto che la GSTP1-1 à ̈ in grado di legare direttamente e inibire JNK, una chinasi che può mediare processi apoptotici (Adler V et al., Mol Carcinog.2007; 46:591-598). Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che le GST di classe Mu (GSTM1-1) sono in grado di modulare l’attività di ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1) (Cho SG et al., J. Biol Chem.2001;276:12749-55.). A sua volta, ASK1 controlla l’attivazione di JNK e p38; infatti, ASK1 oscilla tra una forma monomerica inattiva e una dimerica attiva in grado di attivare le chinasi MAPKK a monte di JNK e p38. Per la completa attivazione di ASK1 à ̈ però necessario il legame con la proteina TRAF2 (tumor necrosis factor receptorassociated factor 2). Recentemente, à ̈ stato dimostrato, sia in vitro che in vivo, che la GSTP1-1 si trova fisicamente associata anche a TRAF2 impedendone l’associazione con ASK1 (Wu Y et al., Oncogene. 2006; 25(42):5787-5800). Quindi, l’iperespressione di GSTP1-1 inibisce il segnale apoptotico impedendo l’attivazione di JNK e p38 mediata dal complesso TRAF2/ASK1. TRAF2 à ̈ una proteina adattatrice fondamentale per mediare la risposta indotta da TNF-1 (tumor necrosis factor 1). Quando TNF-1 si lega al proprio recettore di membrana, permette alle code citosoliche di reclutare le proteine adattatrici come TRADD (TNF receptor associate death domain). L’oligomerizzazione di TRADD determina l’attivazione di TRAF2 e la dissociazione del complesso GSTP1-1/TRAF2 e quindi l’attivazione della via delle MAP chinasi.
La proteina JNK, inoltre, svolge un ruolo fondamentale anche nella regolazione del ciclo cellulare, mediante la regolazione dell’onco-soppressore p53 e del suo substrato p21. La proteina p53 à ̈ fosforilata da molte chinasi, tra cui JNK. Il residuo fosforilato da JNK à ̈ la Thr81 e questo evento à ̈ fondamentale per stabilizzare p53 e permettere la sua attività trascrizionale (Bogoyevitch MA et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006; 70:1061-1095). Il principale target di p53 à ̈ p21, una proteina che controlla il ciclo cellulare tramite inibizione di Cdk2 durante la fase G1, e di Cdc2 durante la fase G2. p53 promuove l’inibizione della Cdc2 tramite accumulo di p21 (Gaul L et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2008; 134:245-253). La proteina p21 infatti à ̈ responsabile dell’inibizione diretta di MPF (mitosis promoting factor), un complesso formato dalle proteine Cdc2/Ciclina B, riconosciuto come il controllore chiave della progressione da G2 a M. La fosforilazione di p21 da parte di p53 ha un azione stabilizzante, e quindi porta ad un aumento della concentrazione intracellulare di questa proteina. Questo risultato può essere ottenuto anche indirettamente attraverso l’azione di JNK. Infatti JNK, con la sua attività chinasica, fosforila c-Jun che a sua volta risulta un transattivatore del promotore di p21. A conferma di ciò à ̈ stato notato che un aumento dell’espressione di p21 à ̈ associato ad un aumento dell’espressione e fosforilazione di JNK (Kardassis D et al., J. Biol. Chem. 1999; 274:29572-29581). Anche la MAPchinasi p38 svolge un ruolo rilevante nel ciclo cellulare; infatti, questa proteina sembra essere responsabile del blocco cellulare in G2 dopo danno al DNA. La fosforilazione, con conseguente attivazione di p38, avviene su Thr180 e Tyr182 ad opera delle MAPKK (Kang YJ et al., J. Biol. Chem.2006; 281:26225-26234). La proteina p38 può agire direttamente sul ciclo cellulare tramite la fosforilazione diretta di Cdc2 sulla Tyr15, e questo porta ad un blocco persistente in G2/M (Kurosu T et al., Apoptosis 2005; 10:1111-1120 ). Inoltre, p38 à ̈ in grado anche di fosforilare e stabilizzare p53 sulla Ser33 e Ser46 e quindi di aumentare i livelli di p21 (Bulavin DV et al., EMBO J.1999; 18:6845-6854).
Queste evidenze permettono di comprendere l’importante ruolo svolto dalle GST, in particolare dalla GSTP1-1, nel fenomeno della farmaco resistenza dei tumori. Infatti, le GST inibiscono a più livelli una via di trasduzione del segnale che può mediare sia effetti apoptotici che citostatici.
Alla luce di queste evidenze, le GST costituiscono da diversi anni un bersaglio terapeutico (Sau A et al., Arch. Biochem. Biophys. 2010, 500:116-22). Uno degli obiettivi dell’oncologia à ̈ infatti la ricerca di nuove molecole che siano in grado di interagire efficacemente con questi enzimi, inibendone sia l’attività catalitica che il ruolo antiapoptotico. E’ necessario tuttavia che queste molecole non incorrano nel fenomeno della farmaco-resistenza. Infatti, i tradizionali inibitori delle GST sono derivati del GSH che vengono facilmente estrusi dalla cellula mediante le pompe di membrana (multi resistance protein, MRP); altri invece possono essere metabolizzati in composti non più efficaci.
Gli autori della presente invenzione hanno già sintetizzato una classe di derivati del 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo (WO2004/093874). Il composto 6-(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-iltio)esanolo (NBDHEX), descritto in WO2004/093874, inibisce le GST con un meccanismo diverso rispetto a quello di altri composti noti che hanno come bersaglio questi enzimi (Ricci G et al., J Biol. Chem. 2005; 280(28):26397-26405). Inoltre, il legame del NBDHEX alla GSTP1-1 citoplasmatica induce il rilascio della stessa dal complesso con JNK. A questo segue l’attivazione di JNK e l’innesco di una cascata di eventi che porta a morte la cellula mediante apoptosi. L’NBDHEX può quindi essere considerato un attivatore della via di trasduzione del segnale mediata dalla MAP chinasi JNK (Turella P et al.,Cancer Res. 2005; 65(9):3751-3761). Studi di citotossicità condotti su linee cellulari derivanti sia da tumori solidi che in sospensione hanno dimostrato che i derivati del 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo hanno un’attività citotossica caratterizzata da LC50nell’ordine del micromolare, valori compatibili con l’affinità (IC50) di questi composti per la GSTP1-1 purificata. Il composto, inoltre, non viene riconosciuto come substrato dalle pompe di membrana P-glicoproteina e MRP1 (multidrug-resistance associated protein), che sono tra i maggiori fattori responsabili della resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali. L’NBDHEX non viene quindi espulso attivamente dalle cellule tumorali per opera di queste pompe risultando quindi altamente pro-apoptotico anche nei confronti di tumori resistenti verso molti chemioterapici tra cui vinblastina, doxorubicina, cisplatino, metotrexate, ed etoposide (Turella P et al., J Biol. Chem. 2006; 281(33):23725-23732; Filomeni G et al., Mol. Cancer Ther.2008; 7:371-379; Ascione A et al.,Cancer Chemother. Pharmacol. 2009; 64:419-424).
Il meccanismo di morte cellulare indotto dall’NBDHEX à ̈ stato caratterizzato in linee leucemiche sia sensibili che resistenti: K562 (human chronic myeloid leukemia), CCRF-CEM (human T-lynphoblastic leukemia) e CEM resistenti alla Vinblastina (Turella 2005; Turella et al., 2006); HL60 (acute myeloid leukemia), HL60/DNR (resistenti alla Daunorubicina) e HL60/ADR (resistenti alla Adriamicina) (Ascione et al., 2009); in linee di carcinoma polmonare a piccole cellule: GLC-4 (Turella et al., 2005), H69 e H69AR (linea resistente) (Filomeni et al., 2008) ; in una linea di carcinoma epatico: HepG2 (Turella et al., 2005); in linee di osteosarcoma sensibili e resistenti alla doxorubicina, al cisplatino e al metotressato ((Turella et al., 2006; Pasello M et al., Cancer Res. 2008; 68:6661-6668). In particolare, à ̈ stata saggiata l’efficacia del NBDHEX su 10 linee cellulari di osteosarcoma umano e 20 varianti resistenti. Il composto à ̈ risultato molto attivo su quasi tutte queste linee, incluse le resistenti con una elevata espressione della GST (in particolare l’isoforma GSTP1-1). Studi di combinazione hanno mostrato un'attività sinergica tra NBDHEX e cisplatino, suggerendo l’utilizzo dell’NBDHEX in combinazione con questo farmaco per il trattamento dell’osteosarcoma.
L’efficacia antitumorale à ̈ stata dimostrata anche in vivo su modelli di melanoma umano. In particolare, à ̈ stata valutata l’attività antitumorale del NBDHEX sulle linee di melanoma Me501e A375 impiantante rispettivamente in topi SCID e Nude (Pellizzari Tregno, F et al., Eur J Cancer, 2009; 45, 2606-2617). Il composto à ̈ stato somministrato per via orale ottenendo una inibizione della crescita tumorale del 60-70%. In questi esperimenti, l’NBDHEX non à ̈ risultato tossico ma à ̈ stato ben tollerato.
Recentemente à ̈ stata determinata la struttura cristallografica del NBDHEX in complesso con la GSTP1-1 e con la GSTM2-2 (Federici, L et al., Cancer Res; 2009; 69: (20), 8024-8035). E’ stato così possibile osservare che l’NBDHEX si lega al sito H della GSTP1-1 adattandosi perfettamente al sito di legame dell’enzima. Nelle condizioni sperimentali impiegate, l’addotto sigma può essere formato mediante una interazione covalente tra il derivato del 7-nitrobenzofurazano e il gruppo tiolico del GSH legato al sito attivo della GSTP1-1. Tuttavia, nel sito attivo della GSTP1-1 l’NBDHEX non appare legato covalentemente allo zolfo del GSH, quindi questa struttura rappresenta uno stato che precede la formazione del complesso sigma tra GSH ed NBDHEX. In queste condizioni lo zolfo del GSH à ̈ orientato verso il C6 dell’anello benzossadiazolico in accordo con precedenti osservazioni che hanno mostrato che l’attacco di un nucleofilo all’anello del 7-nitrobenzofurazano viene favorito cineticamente alla posizione 6. Quindi segue una lenta isomerizzazione verso l’addotto in posizione 4 che risulta la struttura più stabile (Crampton MR et al., Org. Biomol. Chem.2003; 1, 3438–3443; Ricci et al 2005).
La struttura cristallografica della GSTM2-2 in complesso con NBDHEX mostra uno stato successivo all’evento di coniugazione. Il composto à ̈ legato al GSH attraverso un legame covalente tra lo zolfo del GSH ed il C4 dell’anello benzossadiazolico (σ-complex). E’ rilevante il fatto che il sito H della GSTM2-2 appaia più aperto di quello della GSTP1-1 e che l’NBDHEX sia fortemente stabilizzato attraverso una interazione diretta tra il gruppo NO2e due residui di arginina (R165 and R107). Al contrario, nel sito attivo della GSTP1-1 l’NBDHEX non può interagire direttamente con il residuo di arginina 13 a causa dell’ingombro sterico della Ile 114. Il residuo topologicamente corrisponde alla I104 della GSTP1-1 à ̈ sostituito da una alanina nella GSTM2-2 e questo permette all’NBDHEX di inserirsi più a fondo nel sito H dell’enzima.
Questi dati forniscono una dettagliata descrizione a livello molecolare dell’interazione tra NBDHEX e le GST di classe Mu e Pi e sono utili per la sintesi di nuovi derivati del NBDHEX caratterizzati da una maggior selettività nei confronti della isoforma GSTP1-1, altamente espressa nei tumori, e da una maggior solubilità in soluzioni acquose.
Infatti, uno dei problemi che limita l’utilizzo del NBDHEX in vivo à ̈ la sua scarsa solubilità in acqua che si traduce in una scarsa biodisponibilità in vivo. Un altro limite dell’NBDHEX à ̈ la sua elevata attività nei confronti della isoforma GSTM2-2 (appartenente alla classe Mu delle GST) abbondante nel fegato e nel tessuto muscolare (Rowe, JD et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1993; 1203 (1),131-141). Risulta quindi necessaria la sintesi di nuovi derivati del NBDHEX che conservino l’anello benzossadiazolico, per sfruttare la forte interazione con il sito attivo della GSTP1-1, ma differiscano nel gruppo legato al C4 dell’anello.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione concerne una nuova classe di composti derivati del 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo. La presente invenzione rivendica l’uso di tali derivati del 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo che conservano l’anello benzossadiazolico ma differiscono nel gruppo legato all’atomo di zolfo in posizione C4 dell’anello stesso per terapia antitumorale. Le modifiche strutturali apportate a questi composti permettono di superare alcune criticità dei già noti derivati del 7-nitro-2,1,3-benzossadiazolo descritti in WO2004/093874: la scarsa solubilità in acqua che si traduce in una scarsa biodisponibilità in vivo e la elevata affinità nei confronti della classe Mu delle GST espressa in molti tessuti non tumorali. Forma pertanto oggetto della presente invenzione un composto di formula generale (I):
in cui:
A = , , ; dove
- se A =
n, m = numero di metileni compreso tra 0 e 6;
X = COOR, CONRR1o CONHOR2in cui R, R1e R2= H, alchile C1-C5 eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico;
- se A = ,
X, Y = H, R;
Z = H, R, OH, OR, COOH, COOR;
in cui R rappresenta un alchile C1-C5, eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico;
W = CH2OH, CH2OR, OR, COOR, NR1R2, CONR1R2 ,NHCOR3;
in cui R rappresenta un alchile C1-C10 eventualmente sostituito con almeno una funzione di tipo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo, ammidico; R1e R2possono essere H, alchile C1-C5, eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico; NR1R2possono formare un composto-4-on-1-ile; R3 rappresenta un alchile C1-C5 direttamente legato o legato attraverso un atomo di ossigeno;
Z e W possono essere ciclizzati per formare un C3-7 cicloalchile
- se A =
n = numero di metileni da 0 a 10;
X, Y = NH, O, S;
Z = R, OR, SR, NRR1;
R, R1e R2possono essere H, alchile C1-C5, eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico.
In una forma preferita, il composto di formula generale (I) dell’invenzione appartenente al gruppo consistente in:
- 4-(((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)metil)benzoato;
- acido 4-(((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)metil)benzoico;
- 4-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)-N-((tetrahydro-2H-piran-2-il)ossi)benzammide;
- 1-(3-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)propanoil)piperidin-4-one;
- 3-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)propano-1,2-diolo;
- acido 4-((6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)esil)ossi)-4-ossobutanoico;
- 6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)esil acetato;
-N-(2-(dimethylamino)ethyl)-4-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)benzamide hydrochloride;
- N-(2-hydroxyethyl)-3-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)propanamide;
-2-(2-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)ethoxy)ethanol; o
-2-(2-(2-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)ethoxy)ethoxy)ethanol.
I composti prefriti dell’invenzione sono anche denominati MC2872, MC2878, MC2877, MC2875, MC2924, MC2893, MC2901, MC2915, MC2753, MC2995, MC3001, MC3165, MC2994, MC3040, MC3181.
Composti preferiti sono indicati nelle tabelle II e/o III.
Preferibilmente il composto dell’invenzione come indicato sopra é per uso medico. Preferibilmente per uso nel trattamento di un tumore.
In una forma preferita il tumore à ̈ caratterizzato da un’aumentata espressione e/o attività della glutatione S-transferasi (GST). Ancora preferibilmente il tumore à ̈ un tumore farmaco-resistente. Più preferibilmente il tumore può essere un sarcoma muscoloscheletrico, mesotelioma, melanoma, linfoma, leucemia, carcinoma polmonare a piccole cellule, tumore epatico.
Forma ulteriore oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente una quantità farmacologicamente efficace di un composto dell’invenzione come descritto sopra e almeno un eccipiente appropriato.
Preferibilmente la composizione farmaceutica comprendente un ulteriore agente antitumorale.
Forma ulteriore oggetto dell’invenzione un processo per la preparazione del composto dell’invenzione come descritto sopra comprendente la reazione tra un opportuno tiolo di formula A-SH ed il 4-cloro-7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo in presenza di piridina in una miscela di H2O/EtOH (Schema 1).
Schema 1
Preferibilmente il ratio H2O/EtOH Ã ̈ di 3/1. Preferibilmente la reazione avienne a temperatura ambiente.
Gli opportuni tioli di formula A-SH possono essere acquistati o preparati secondo metodiche standard di letteratura (es., Woerle GH et al., Langmuir 2004, 20, 5982-5988). Le molecole dell’invenzione, pur mantenendo un grado di apolarità tale da consentire l’interazione con il sito attivo della GST, in particolare la GSTP1-1, presentano almeno un gruppo chimico che contribuisce a migliorare la loro selettività verso l’isoforma GSTP1-1 e/o la loro solubilità in soluzioni acquose.
I composti dell’invenzione sono inibitori selettivi della glutatione S-transferasi GST e possono essere vantaggiosamente impiegati nelle terapie antineoplastiche, somministrandoli da soli come agenti citotossici o in combinazione con altri chemioterapici per aumentarne l’effetto terapeutico, riducendo il fenomeno della farmaco-resistenza.
La presente invenzione ha per oggetto in maniera più specifica l’uso dei composti di formula generale come definita sopra per la terapia di varie forme tumorali caratterizzate dall’iperespressione della GST. Le suddette isoforme enzimatiche, iperespresse in tumori solidi, linfomi e leucemie, possono appartenere alle classi GST Pi, GST Mu, della glutatione S-transferasi, e più in particolare possono essere le isoforme GSTP1-1, GSTM2-2.
I preparati farmaceutici adatti per la somministrazione, a scopo terapeutico, degli inibitori della glutatione S-transferasi secondo l’invenzione possono essere formulati secondo tecniche convenzionali note agli esperti del settore, mediante l’uso di eccipienti e veicoli farmaceuticamente accettabili, in modo da ottenere preparati adatti per iniezione parenterale (endovenosa, intramuscolare o sottocutanea), per somministrazione orale in forma solida o liquida, per somministrazione transdermica, rettale, intravaginale o locale, ad esempio sulle mucose del cavo oronasale, e simili.
La percentuale di composto attivo nella composizione e il metodo per trattare i tumori possono essere variati in modo da ottenere un dosaggio ottimale. Il dosaggio da somministrare tiene in considerazione i seguenti fattori: la via di somministrazione, la durata del trattamento, il peso e le condizioni del paziente, l’efficacia del composto attivo e la responsività del paziente.
Una volta determinato il corretto dosaggio del principio attivo, la formulazione e la scelta di eccipienti e coadiuvanti adatti ad ogni singola esigenza possono essere fatte sulla base delle comuni conoscenze del settore.
Alcuni composti dell’invenzione sono riportati con loro codice e nome nella tabella seguente e negli esempi.
<O>CH3
NH
S N N-(2-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-O ylthio)ethyl)acetamide
N NO2
MC2994
N-(2-hydroxyethyl)-3-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)propanamide
2-(2-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)ethoxy)ethanol 2-(2-(2-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)ethoxy)ethoxy)ethanol
N-(2-(dimethylamino)ethyl)-4-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)benzamide hydrochloride
La presente invenzione verrà descritta in esempi non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure:
Figura 1. Reazione spontanea del composto MC2875 (0.1mM) con GSH (1mM) a 25°C, in tampone K-fosfato 0.1M, pH 6.5.
Figura 2. Reazione spontanea tra GSH (1mM) e 40 mM NBDHEX (A), MC2995 (B), MC3001 (C), MC3040 (D) a 25°C in tampone K-fosfato 0.1M, pH 6.5.
SINTESI CHIMICA
Esempi
Esempio 1: preparazione del 4-(((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)metil)benzoato di etile (MC2890).
Ad un soluzione di 4-(bromometil)benzoato di etile (0.4 g, 1.64 mmol) in CH3CN anidro (8.5 mL) si aggiungono K2CO3anidro (681.37 mg, 4.93 mmol) ed etil xantogenato di potassio (790 mg, 4.93 mmol) e la miscela risultante à ̈ lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 20 ore. Al termine della reazione si spegne con H2O (10 mL) e si estrae con AcOEt (6 x 10 mL). Le fasi organiche riunite sono poi lavate con NaClss (1 x 10mL), anidrificate, filtrate ed evaporate a pressione ridotta fino ad ottenere un grezzo, che viene poi purificato su SiO2(AcOEt/n-Esano 1:20) fornendo il 4-((etossitiocarbonil)tiometil)benzoato di etile come composto oleoso. 1H-NMR (CDCl3) Î ́ 1.39-1.45 (m, 6H, CSOCH2CH3e COOCH2CH3), 4.39 (q, 2H, COOCH2CH3), 4.42 (s, 2H, SCH2), 4.67 (q, 2H, CSOCH2CH3), 7.44 (d, 2H, H anello benzenico), 8.01 (d, 2H, H anello benzenico).
Ad una soluzione di 4-((etossitiocarbonil)tiometil)benzoato di etile (200 mg, 0.74 mmol) in EtOH anidro (3 mL) vengono aggiunti 1.48 mL (1.48 mmol) di una soluzione 1M di EtONa in EtOH e la risultante miscela à ̈ lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 6 ore. Al termine della reazione il solvente viene evaporato a pressione ridotta. Il grezzo viene quindi ripreso con H2O (5 mL) ed acidificato con acido citrico al 5% p/p. La fase acquosa à ̈ quindi estratta con AcOEt (4 x 10 mL), che a sua volta viene lavato con NaClss, anidrificato, filtrato ed evaporato a pressione ridotta dando un grezzo di reazione che viene purificato su SiO2(AcOEt/n-Esano 1:20) fornendo il 4-(mercaptometil)benzoato di etile desiderato. 1H-NMR (CDCl3) Î ́ 1.41 (t, 3H, COOCH2CH3), 1.80 (t, 1H, SH), 3.79 (d, 2H, CH2SH), 4.39 (q, 2H, COOCH2CH3), 7.41 (d, 2H, H anello benzenico), 8.02 (d, 2H, H anello benzenico).
Ad una soluzione di 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoossadiazolo (115.9 mg, 0.58 mmol) in 3.5 mL di una miscela EtOH:H2O (0.3:1) si aggiunge piridina (0.117 mL, 1.45 mmol) ed il 4-(mercaptometil)benzoato di etile (114 mg, 0.58 mmol) e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 5 ore. Al termine della reazione si filtra il solido in sospensione ottenuto che viene poi purificato su SiO2(AcOEt/n-Esano 1:3) fornendo il prodotto desiderato come solido di colore giallo. 1H-NMR (DMSO) Î ́ 1.31 (t, 3H, COOCH2CH3), 4.31 (q, 2H, COOCH2CH3), 4.80 (s, 2H, CH2S), 7.59 (d, 1H, anello benzofurazanico), 7.70 (d, 2H, H anello benzenico), 7.97 (d, 2H, H anello benzenico), 8.58 (d, 1H, anello benzofurazanico).
Esempio 2: preparazione dell’acido 4-(((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)metil)benzoico (MC2892).
Ad una soluzione di 4-((etossitiocarbonil)tiometil)benzoato di etile (250 mg, 0.93 mmol) in 4 mL di una miscela EtOH-H2O (1:1) si aggiungono 2 mL di una soluzione di KOH 2N e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 7 ore. Al termine della reazione si evapora l’EtOH e si acidificano le acque risultanti con acido citrico al 5% p/p ottenendo un solido in sospensione che viene filtrato. Il grezzo solido à ̈ poi purificato su SiO2(AcOEt/n-Esano 2:1) fornendo l’acido 4-(mercaptometil)benzoico desiderato. 1H-NMR (DMSO) Î ́ 2.96 (t, 1H, SH), 3.79 (d, 2H, CH2SH), 7.46 (d, 2H, H anello benzenico), 7.88 (d, 2H, H anello benzenico), 12.84 (s, 1H, COOH).
Ad una soluzione di 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoossadiazolo (71.2 mg, 0.356 mmol) in 3.2 mL di una miscela EtOH:tampone fosfato (1:1) si aggiunge l’acido 4 (mercaptometil)benzoico (60 mg, 0.356 mmol) e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 24 ore aggiungendo ogni tanto poche gocce di una soluzione di KOH 1M al fine di mantenere neutro il pH della miscela di reazione. Al termine della reazione si acidifica con acido citrico al 5% p/p ottenendo un solido in sospensione che viene filtrato. Il grezzo solido à ̈ poi purificato su SiO2(CHCl3/MeOH 10:1) fornendo il prodotto desiderato come solido di colore giallo. 1H-NMR (DMSO) Î ́ 4.78 (s, 2H, CH2S), 7.57 (d, 1H, anello benzofurazanico), 7.65 (d, 2H, H anello benzenico), 7.93 (d, 2H, H anello benzenico), 8.58 (d, 1H, anello benzofurazanico), 13.18 (s, 1H, COOH).
Esempio 3: preparazione del 4-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)-N-((tetrahydro-2H-piran-2-il)ossi)benzammide (MC2873).
Ad una soluzione di acido 4-mercaptobenzoico (500 mg, 3.24 mmol) e N-metilmorfolina (0.75 mL, 6.8 mmol) in etilenglicol-dimetiletere (10 mL) si aggiunge, raffreddando in bagno a ghiaccio, cloroformiato di etile (0.65 mL, 6.8 mmol) e la risultante miscela à ̈ lasciata in agitazione a temperatura ambiente per tre ore. Dopo filtrazione del sale di morfolinio, la risultante soluzione à ̈ trattata con O-(tetraidro-2H-piran-2-il)idrossilammina (493 mg, 4.21 mmol) per due ore a temperatura ambiente e quindi concentrata sotto vuoto a fornire un solido bianco. Il solido viene dissolto in una miscela di H2O (10 mL) e CHCl3(10 mL), la fase acquosa à ̈ resa basica con KOH 2N ed estratta con CHCl3(4 x 10 mL). Le fasi organiche riunite sono poi anidrificate, filtrate ed evaporate a pressione ridotta fino a fornire un solido bianco che viene trattato con una soluzione di metossido di sodio in metanolo (10 mL). Al termine della reazione si acidifica con acido citrico al 5% p/p e poi la fase acquosa à ̈ estratta con CHCl3(4 x 15 mL). La fase cloroformica à ̈ poi anidrificata, filtrata ed evaporata a pressione ridotta fino a fornire un grezzo solido che viene purificato per triturazione con etere di petrolio ottenendo cosi’ la 4-mercapto-N-((tetraidro-2H-piran-2-il)ossi)benzammide desiderata che viene utilizzata nello stadio successivo senza ulteriore purificazione.
Ad una soluzione di 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoossadiazolo (199.6 mg, 1.0 mmol) in 6 mL di una miscela EtOH:H2O (0.3:1) si aggiunge piridina (0.2 mL, 2.5 mmol) ed la 4-mercapto-N-((tetraidro-2H-piran-2-il)ossi)benzammide (316.6 mg, 1.25 mmol) e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine della reazione si filtra il solido in sospensione ottenuto che viene poi purificato su SiO2(AcOEt/n-Esano 1:1) fornendo il prodotto desiderato come solido di colore giallo. 1H-NMR (CDCl3) Î ́ 1.67-1.92 (m, 6H, OCH2CH2CH2CH2CH), 3.73 (m, 1H, OCHHCH2CH2CH2CH), 4.02 (m, 1H, OCHHCH2CH2CH2CH), 5.14 (m, 1H, OCH2CH2CH2CH2CHO) 6.74 (d, 1H, anello benzofurazanico), 7.78 (d, 2H, H anello benzenico), 7.96 (d, 2H, H anello benzenico), 8.27 (d, 1H, anello benzofurazanico), 8.87 (s, 1H, NH).
Esempio 4: preparazione del 1-(3-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)propanoil)piperidin-4-one (MC2891).
Ad una soluzione di acido 3-mercaptopropionico (687.8 mg, 6.48 mmol) e N-metilmorfolina (1.5 mL, 13.6 mmol) in etilenglicol-dimetiletere (20 mL) si aggiunge, raffreddando in bagno a ghiaccio, cloroformiato di etile (1.3 mL, 13.6 mmol) e la risultante miscela à ̈ lasciata in agitazione a temperatura ambiente per tre ore. Dopo filtrazione del sale di morfolinio, la risultante soluzione à ̈ trattata con 4-piperidone (1.35 g, 13.6 mmol) per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi concentrata sotto vuoto a fornire un solido bianco. Il solido viene dissolto in una miscela di H2O (10 mL) e AcOEt (10 mL), la fase acquosa à ̈ resa basica con KOH 2N ed estratta con AcOEt (4 x 10 mL). Le fasi organiche riunite sono poi anidrificate, filtrate ed evaporate a pressione ridotta fino a fornire un solido bianco che viene purificato su SiO2(AcOEt/n-Esano 2:1) fornendo l†̃O-etil-S-(3-osso-3-(4-ossopiperidin-1-il)propil)carbonotioato desiderato come intermedio oleoso. 1H-NMR (CDCl3) Î ́ 1.32 (t, 3H, SCOOCH2CH3), 2.48-2.52 (m, 4H, CH2COCH2), 2.83 (t, 2H, SCH2CH2CON), 3.19 (t, 2H, SCH2CH2CON), 3.77 (m, 2H, CHHNCHH), 3.91 (m, 2H, CHHNCHH), 4.28 (q, 2H, SCOOCH2CH3).
L†̃O-etil-S-(3-osso-3-(4-ossopiperidin-1-il)propil)carbonotioato (400 mg, 1.54 mmol) viene quindi trattato con una soluzione 1M di metossido di sodio in metanolo (10 mL). Al termine della reazione dopo due ore si acidifica con acido citrico al 5% p/p e poi la fase acquosa à ̈ estratta con AcOEt (4 x 10 mL). La fase organica à ̈ poi anidrificata, filtrata ed evaporata a pressione ridotta fino a fornire un grezzo solido che viene purificato per triturazione con THF e MeOH ottenendo così l’1-(3-mercaptopropanoil)piperidin-4-one desiderato che viene utilizzata nello stadio successivo senza ulteriore purificazione. 1H-NMR (DMSO) Î ́ 2.33-2.45 (m, 4H, CH2COCH2), 2.68-2.74 (m, 4H, SCH2CH2CON), 3.73 (m, 4H, CH2NCH2).
Ad una soluzione di 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoossadiazolo (53.3 mg, 0.267 mmol) in 2.4 mL di una miscela EtOH:tampone fosfato (1:1) si aggiunge l’1-(3-mercaptopropanoil)piperidin-4-one (50 mg, 0.267 mmol) e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 24 ore aggiungendo ogni tanto poche gocce di una soluzione di KOH 1M al fine di mantenere neutro il pH della miscela di reazione. Al termine della reazione si acidifica con acido citrico al 5% p/p ottenendo un solido in sospensione che viene filtrato. Il grezzo solido à ̈ poi purificato su SiO2(CHCl3/MeOH 20:1) fornendo il prodotto desiderato come solido di colore giallo. 1H-NMR (DMSO) Î ́ 2.35-2.45 (m, 4H, CH2COCH2), 3.01 (t, 2H, SCH2CH2CON), 3.58 (t, 2H, SCH2CH2CON), 3.70-3.79 (m, 4H, CH2NCH2), 7.57 (d, 1H, anello benzofurazanico), 8.58 (d, 1H, anello benzofurazanico).
Esempio 5: preparazione del 3-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)propano-1,2-diolo (MC3001).
Ad una soluzione di 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoossadiazolo (1.99 g, 10.0 mmol) in 60 mL di una miscela EtOH:H2O (0.3:1) si aggiunge piridina (2.0 mL, 25 mmol) ed il tioglicerolo (1.30 mL, 15.0 mmol) e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 5 ore. Al termine della reazione si filtra il solido in sospensione ottenuto che viene poi purificato su SiO2(CHCl3/MeOH 20:1) fornendo il prodotto desiderato come solido di colore giallo. 1H-NMR (DMSO) Î ́ 3.28-3.33 (m, 1H, SCHHCH(OH)CH2OH), 3.40-3.44 (m, 1H, SCHHCH(OH)CH2OH), 3.49-3.57 (m, 2H, SCH2CH(OH)CH2OH), 3.82-3.89 (m, 1H, SCH2CH(OH)CH2OH), 4.89 (t, 1H, CH2OH), 5.34 (d, 1H, CHOH), 7.54 (d, 1H, anello benzofurazanico), 8.57 (d, 1H, anello benzofurazanico).
Esempio 6: preparazione dell’acido 4-((6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)esil)ossi)-4-ossobutanoico (MC3040).
Ad una soluzione di NBDHEX (200 mg, 0.672 mmol) e DMAP (82.09 mg, 0.672 mmol) in DCM anidro (6 mL) viene aggiunta l’anidride succinica (134.49 mg, 1.344 mmol) e la risultante miscela scaldata a 40 °C per due ore. Al termine della reazione si aggiunge HCl 2N (15 mL) e la fase acquosa à ̈ estratta con AcOEt (3 x 15 mL). Le fasi organiche riunite sono poi anidrificate, filtrate ed evaporate a pressione ridotta fino a fornire un grezzo solido giallastro che viene purificato su SiO2(CHCl3/MeOH 25:1 poi 20:1) fornendo il prodotto desiderato come solido di colore giallo. 1H-NMR (CDCl3) Î ́ 1.42-1.44 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 1.48-1.52 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 1.57-1.63 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 1.85-1.92 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 2.62-2.66 (t, 2H, COCH2CH2COOH), 2.69-2.72 (t, 2H, COCH2CH2COOH), 3.30 (t, 2H, SCH2), 4.14 (t, 2H, CH2OCO), 7.18 (d, 1H, anello benzofurazanico), 8.43 (d, 1H, anello benzofurazanico).
Esempio 7: preparazione del 6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)esil acetato (MC2752).
Ad una soluzione di NBDHEX (150 mg, 0.504 mmol) e TEA (0.126 mL, 0.908 mmol) in DCM anidro (7.5 mL) viene aggiunta goccia a goccia, raffreddando in bagno a ghiaccio, una soluzione in DCM anidro (1.5 mL) di acetil cloruro (0.05 mL, 0.706 mmol) e la risultante miscela lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 6 ore. Al termine della reazione si aggiunge H2O (10 mL) e la fase acquosa à ̈ estratta con DCM (4 x 10 mL). Le fasi organiche riunite sono lavate in successione con HCl 2N (2 x 10 mL), NaHCO3ss (2 x 10 mL), NaClss ( 1 x 10 mL) poi anidrificate, filtrate ed evaporate a pressione ridotta fino a fornire un grezzo solido giallastro che viene purificato su SiO2(AcOEt/n-Esano 1:3) fornendo il prodotto desiderato come solido di colore giallo. 1H-NMR (CDCl3) Î ́ 1.41-1.48 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 1.54-1.60 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 1.62-1.79 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 1.83-1.91 (m, 1H, SCH2CH2CH2CH2CH2CH2OCO), 2.05 (s, 3H, OCOCH3), 3.28 (t, 2H, SCH2), 4.08 (t, 2H, CH2OCO), 7.15 (d, 1H, anello benzofurazanico), 8.41 (d, 1H, anello benzofurazanico).
ATTIVITA’ BIOLOGICA
Materiali e metodi
Studio dell’attività biologica di inibizione delle glutatione S-transferasi ad opera dei derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo
Questi composti sono stati saggiati come inibitori dell’attività degli isoenzimi GSTP1-1, e GSTM2-2 appartenenti alle classi delle GST più abbondanti nelle cellule tumorali: le classi Pi e Mu. Le GSTM2-2 e P1-1, espresse in Escherichia coli, sono state purificate utilizzando un passaggio cromatografico su una resina d’affinità capace di trattenere selettivamente le GST (Lo Bello M, Battistoni A, Mazzetti AP, Board P. et al. J. Biol. Chem. 1995; 270, 1249–1253). L’attività delle GST à ̈ stata saggiata a 25°C in tampone fosfato di potassio 0,1 M, ad un pH pari a 6,5 in presenza dei substrati, cioà ̈ del glutatione (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) in concentrazione pari a 1 mM e dell’1-cloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) 1 mM (Habig WH, Jakoby WB. Methods Enzymol.1981; 77, 398–405).
Nel corso del saggio per la determinazione dell’IC50(concentrazione di inibitore alla quale si osserva una inibizione dell’attività enzimatica del 50%), sono state aggiunte alla miscela d’attività le diverse quantità dei derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo da analizzare.
L’attività enzimatica à ̈ stata seguita spettrofotometricamente a 340 nm, lunghezza d’onda alla quale assorbe il prodotto di reazione S-(2,4-dinitrobenzen)-glutatione (GS-NBD) (ï ¥ï€ = 9.6 mM-1 cm-1).
Evidenza spettroscopica della formazione di un addotto tra i derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo ed il GSH.
Lo spettro UV-visibile del derivato del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo era ottenuto a 25° C in tampone K-fosfato 0.1 M, pH6.5 (o 7.5) in presenza di quantità stechiometriche di GSTP1-1 e/o 1 mM GSH ( vedi Ricci et al. 2005).
Saggi sulla linea cellulare di osteosarcoma umano dell’attività antitumorale dei derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo.
Per effettuare i saggi di attività antitumorale dei derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo, à ̈ stata impiegata la linea cellulare di osteosarcoma umano, U2OS,. Le cellule sono state mantenute in IMDM (contenente L-glutamina 2 mM e 0,1 g/l di penicillina-G /streptomicina solfato) arricchito con 10% di siero bovino fetale (FBS), a 37°C, 5% CO2 e 98% umidità .
Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti ad una densità di 20000 cellule per cm2 in un volume di mezzo di coltura pari a 100ï l. Dopo 24 ore, in ogni pozzetto à ̈ stato aggiunto al mezzo di coltura, ciascuno dei derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo da saggiare, alla concentrazione desiderata. Parallelamente sono state allestite delle prove di controllo aggiungendo nei pozzetti il solvente in cui il composto à ̈ stato sciolto (% v/v di DMSO in PBS). Tutte le misure sono state eseguite in quadruplicato.
Le cellule sono state incubate per 48 ore a 37°C, al 5% CO2.
Al fine di ottenere per ogni derivato del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo in esame un profilo dose-risposta, à ̈ stato utilizzato un processo di valutazione che si basa sul metodo descritto da Shekan et al (Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, et al. J. Natl. Cancer Inst.1990: 82, 1107–1112).
Al termine dell’incubazione à ̈ stata valutata la percentuale di crescita cellulare mediante una procedura di fissazione delle cellule in situ, seguita da un saggio SRB che si avvale di una procedura di colorazione con sulforodamina B capace di legarsi specificamente alle proteine. Il prodotto colorato à ̈ stato quindi solubilizzato e quantizzato per via spettrofotometrica, in modo da determinare la crescita delle cellule trattate con il composto in esame rispetto a quelle trattate con il solo solvente.
Risultati
I derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo dell’invenzione presentano l’inserzione, in diverse posizioni, di un anello benzenico, che conferisce rigidità strutturale e conformazionale alle nuove molecole e ne aumenta le possibilità di π–stacking all’interno del sito di binding con l’enzima. Tale anello benzenico risulta sostituito, dopo eventuale opportuna spaziatura, da gruppi acidi, esterei, amidici, idrossiamidici, alcossiamidici. Alcuni composti includono derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazol-4-iltiolo in cui il sostituente alchilico allo zolfo in C4 presenta contemporaneamente più di una sostituzione, caratterizzata da alchili, alcoli, ammine, ammidi, ammido-alcoli, esteri, amido-esteri, o un gruppo alchilico terminante con funzioni (esteri, acido-esteri).
Tutti i composti sono stati analizzati per valutare la loro solubilità limite e stabilità in acqua. E’ stata inoltre valutata la loro reattività spontanea con il glutatione e la loro propensione a formare complessi con il glutatione in assenza di GST. Mediante un saggio enzimatico, che utilizza il GSH ed il CDNB come susbstrati, à ̈ stata valutata la loro capacità di inibire l’attività di coniugazione della GSTP1-1 e della GSTM2-2. Sono stati quindi calcolati per ogni composto i valori di IC50nei confronti dei due isoenzimi.
Sulla base dei risultati ottenuti, sono stati selezionati i composti più solubili e stabili in acqua, caratterizzati da una scarsa o nulla reattività spontanea con il glutatione e da una buona affinità per la GSTP1-1. I composti scelti sono stati quindi ulteriormente analizzati per valutare il grado di tossicità nei confronti della linea di osteosarcoma umano U-2OS. I risultati sperimentali ottenuti nell’ambito della presente invenzione, in termini di aumentata solubilità in acqua e aumentata efficacia dei derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo come inibitori delle GST, e come agenti citotossici, sono evidenti dai dati contenuti nelle Tabelle I, II e III o sono mostrati nei grafici delle figure 1 e 2.
I composti dell’invenzione agiscono come inibitori specifici ed efficienti della GSTP1-1 (Tabella I).
Tabella I. Valori di IC50dei composti inclusi nella presente invenzione, nei confronti degli enzimi GSTP1-1 e GSTM2-2.
IC
Codice composto n m X Y Z W50, µM
GSTP1-1 GSTM2-2
MC2871 (I) 0 0 2-COOH 2.9 0.84
MC2868 (I) 0 0 3-COOH 1.25 0.059
MC2760 (I) 0 0 4-COOH 0.98 0.2
MC2773 (I) 0 0 4-COOEt 1.6 ND
MC2872 (I) 0 0 4-CONH20.8 0.1
MC2878 (I) 0 0 4-CONMe20.37 0.21
MC2873 (I) 0 0 4-CONHOTHP 1.15 0.22
MC2877 (I) 0 0 4-CONHOMe 0.3 0.1
MC2874 (I) 0 0 4-CONHOH 1.52 0.06
MC2876 (I) 0 0 4-CONH(CH2)2OH 1.17 0.41
MC2875 (I) 0 0 4-CONH(CH2)2Nme20.8 0.7
MC2892 (I) 1 0 4-COOH 1.3 0.005
MC2890 (I) 1 0 4-COOEt 1.19 0.007 MC2880 (II) H H H COOMe 1.75 0.11 MC2924 (II) H H cicloesano 0.26 ND MC2898 (II) H H H 4-piperidon-1-il 5.0 0.02 MC2891 (II) H H H CO-4-piperidon-1-il 6.5 0.03 MC2994 (II) H H H NHCOMe 1.59 0.06
MC2995 (II) H H H CONH(CH2)2OH 5.4 0.07
MC3001 (II) H H OH CH2OH 6.1 0.07
MC2893 (II) H H COOMe NHCOOCMe30.41 0.091 MC2901 (II) H H COOMe NHCOOCH2Ph 0.32 0.069 MC2915 (II) Me Me H H 0.34 ND
MC3165 (II) H H H O(CH2)2OH 4.7 0.050
MC3181 (II) H H H O(CH2)2O(CH2)2OH 2.2 0.110
MC3198 (II) H H H O(CH2)2OCO(CH2)2COOH 4.5 0.097
MC2752 (III) 3 O O Me 0.64 ND MC2753 (III) 3 O O Ph 0.07 0.8
MC3040 (III) 3 O O (CH2)2COOH 1.4 0.021
MC3142 (III) 1 O O (CH2)2COOH 1.7 0.07
NBDHEX 0.5-1 0.01
in cui:
(I) indica A = , (II) indica A = , (III) indica A =
Come si vede dai dati di Tabella I, molti dei nuovi derivati sintetizzati presentano un’IC50
contro GSTP1-1 minore rispetto a quella dell’NBDHEX, a cui si accompagna tuttavia un’IC50
contro GSTM2-2 circa uguale o superiore rispetto a quella dell’NBDHEX (vedi i composti
MC2872, MC2878, MC2877, MC2875, MC2924, MC2893, MC2901, MC2915 ed MC2753).
Pertanto, questi composti presentano delle caratteristiche promettenti per generare un derivato del NBDHEX che sia altamente affine per la GSTP1-1, ed al contrario meno affine alla GSTM2-2 rispetto all’NBDHEX.
E’ tuttavia necessario aumentare la solubilità dei composti, ad esempio mediante inserzione di gruppi idrofili e/o salificabili nella struttura, poiché per la maggior parte di quelli citati essa si mantiene su valori simili a quelli dell’NBDHEX (0.1 mM, Tabella II). Il composto MC2875 mostra una solubilità in acqua intorno a 2 mM, ma sembra fornire addotti spontanei con il glutatione (Figura 1). Alcuni derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo decisamente più solubili dell’NBDHEX, quali ad esempio l’MC2995, MC3001 e MC3165 (solubilità limite a pH7.5: 1, 10, e 8 mM, rispettivamente) sono anche meno potenti nei test enzimatici. Tuttavia i composti MC2994, MC3040, MC3142 e MC3181 (solubilità limite a pH7.5: 1, 7, 31 e 14 mM, rispettivamente) hanno una efficacia solo 1.5-2 volte inferiore a quella del NBDHEX.
Tabella II: Limite di solubilità a vari pH di alcuni derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo
<§>tampone K-Fosfato 0.1M contenente 20% DMSO
#tampone Na-Acetato 0.1M contenente 20% DMSO
Considerando i dati cellulari in vitro (Tabella III), alcuni composti hanno mostrato un’attività antiproliferativa di poco (2-3 volte) inferiore (vedi MC2872, ed in particolare MC2995, MC3001, MC3040, MC3142 e MC3165 tra i più solubili) o simile (vedi MC2873, MC2752, MC2753, ed in particolare l’MC2994 e l’MC3181, rispettivamente 10 e 140 volte più solubili del NBDHEX) o addirittura superiore (vedi MC2924 e MC2893) a quella dell’NBDHEX.
Tabella III. Attività antiproliferativa di derivati del 7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo su cellule U-2OS di osteosarcoma umano.
codice composto LC50
U-2OS, µM
MC2871 (I) 32
MC2868 (I) 14
MC2760 (I) 12
MC2773 (I) 9.0
MC2872 (I) 1.8
MC2878 (I) 8
MC2873 (I) 0.8
MC2877 (I) 4.6
MC2874 (I) 18
MC2876 (I) 11
MC2875 (I) 13
MC2924 (II) 0.43
MC2898 (II) 4.6
MC2994 (II) 0.64
MC2995 (II) 1.6
MC3001 (II) 1.1
MC2893 (II) 0.5
MC2901 (II) 2.9
MC2915 (II) 3.0
MC3165 (II) 1.3
MC3181 (II) 0.7
MC3198 (II) 14
MC2752 (III) 0.9
MC2753 (III) 0.8
MC3040 (III) 2
MC3142 (III) 2.1
NBDHEX 0.6
In conclusione, i composti dell’invenzione mostrano un’affinità che à ̈ dalle 10 alle 80 volte inferiore per l’isoforma GSTM2-2 rispetto all’NBDHEX ed una affinità per la GSTP1-1 anche due volte superiore a quella dell’NBDHEX. Risulta pertanto possibile generare nuovi derivati del nitrobenzofurazano in grado di legare più selettivamente la GSTP1-1. Tra i derivati descritti, i composti MC2994, MC2995, MC3001, MC3040, MC3165 e MC3181 presentano delle caratteristiche interessanti quali una buona solubilità , la relativa bassa reattività con il GSH (Figura 2) e una buona citotossicità in vitro. Essi si propongono pertanto anche come candidati molto promettenti per un utilizzo in vivo per uno screening antitumorale.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula generale (I): in cui: A = , o ; dove - se A = n, m = numero di metileni compreso tra 0 e 6; X = COOR, CONRR1o CONHOR2in cui R, R1e R2= H, alchile C1-C5 eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico; - se A = , X, Y = H, R; Z = H, R, OH, OR, COOH, COOR; in cui R rappresenta un alchile C1-C5, eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico; W = CH2OH, CH2OR, OR, COOR, NR1R2, CONR1R2 ,NHCOR3; in cui R rappresenta un alchile C1-C10 eventualmente sostituito con almeno una funzione di tipo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo, ammidico; R1e R2possono essere H, alchile C1-C5, eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico; NR1R2possono formare un composto-4-on-1-ile; R3 rappresenta un alchile C1-C5 direttamente legato o legato attraverso un atomo di ossigeno; Z e W possono essere ciclizzati per formare un C3-7 cicloalchile; - se A = n = numero di metileni da 0 a 10; X, Y = NH, O, S; Z = R, OR, SR, NRR1; R, R1e R2possono essere H, alchile C1-C5, eventualmente sostituito con almeno uno gruppo alcolico, etereo, amminico, acido, estereo o ammidico.
- 2. Composto di formula generale (I) secondo la rivendicazione 1, appartenente al gruppo consistente in: - 4-(((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)metil)benzoato; - acido 4-(((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)metil)benzoico; - 4-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)-N-((tetrahydro-2H-piran-2-il)ossi)benzammide; - 1-(3-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)propanoil)piperidin-4-one; - 3-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)propano-1,2-diolo; - acido 4-((6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)esil)ossi)-4-ossobutanoico; - 6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]ossadiazol-4-il)tio)esil acetato; -N-(2-(dimethylamino)ethyl)-4-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)benzamide hydrochloride; - N-(2-hydroxyethyl)-3-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)propanamide; -2-(2-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)ethoxy)ethanol; o -2-(2-(2-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-ylthio)ethoxy)ethoxy)ethanol.
- 3. Composto secondo le rivendicazioni 1 o 2 per uso medico.
- 4. Composto secondo la rivendicazione 3 per uso nel trattamento di un tumore.
- 5. Composto secondo la rivendicazione 4 in cui il tumore à ̈ caratterizzato da un’aumentata espressione e/o attività della glutatione S-transferasi (GST).
- 6. Composto secondo le rivendicazioni 4 o 5 in cui il tumore à ̈ un tumore farmacoresistente.
- 7. Composto secondo le rivendicazioni 4, 5 o 6 in cui il tumore può essere un sarcoma muscoloscheletrico, mesotelioma, melanoma, linfoma, leucemia, carcinoma polmonare a piccole cellule, tumore epatico.
- 8. Composizione farmaceutica comprendente una quantità farmacologicamente efficace di un composto secondo una qualsiasi rivendicazione da 1 a 7 e almeno un eccipiente appropriato.
- 9. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, comprendente un ulteriore agente anti-tumorale.
- 10. Processo per la preparazione del composto secondo le rivendicazioni 1 o 2 comprendente la reazione tra un opportuno tiolo di formula A-SH ed il 4-cloro-7-nitro-1,2,5-benzossadiazolo in presenza di piridina in una miscela di H2O/EtOH (Schema 1). Schema 1
- 11. Processo secondo la rivendicazione 10 in cui il ratio H2O/EtOH Ã ̈ di 3/1.
- 12. Processo secondo la rivendicazione 10 o 11 in cui la reazione avviene a temperatura ambiente.
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| CN113929639B (zh) * | 2020-06-29 | 2023-03-21 | 东南大学 | 一类以gstp1为靶点的抗肿瘤化合物及其制备方法与应用 |
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