KR20080012902A - 질병을 치료하기 위한 디아릴 우레아를 포함하는 병용요법 - Google Patents

질병을 치료하기 위한 디아릴 우레아를 포함하는 병용요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디아릴 우레아 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 조합물에 관한 것이다. 유용한 조합물은 예를 들어, 디아릴 우레아 화합물로서 BAY 43-9006을 포함한다.
디아릴 우레아 화합물, 워르트만닌, PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제, BAY 43-9006.

Description

질병을 치료하기 위한 디아릴 우레아를 포함하는 병용요법{COMBINATION THERAPY COMPRISING DIARYL UREAS FOR TREATING DISEASES}
BAY 43-9006은 4{4-[3-(4-클로로-3-트리플루오로메틸페닐)-우레이도]-페녹시}-피리딘-2-카복실산 메틸 아미드를 의미하며, VEGFR, PDGFR, raf, p38 및/또는 flt-3 키나제 시그날링 분자에 대한 억제활성을 포함하는 다양한 활성을 갖는 강력한 항암 및 항혈관형성제인 디아릴 우레아 화합물의 종류이다 (참조예: US 20050038080). RAS/RAF/MEK/ERK 경로는 세포 증식, 분화 및 변형에 관여하며, 다수의 암에 연루된다. PI3K/AKT 시그날링 경로는 세포에서 또 다른 중요한 생리학적 경로이다. 이것은 성장인자, 사이토킨, 세포-세포 유착 및 세포-세포외 매트릭스를 포함하는 세포외 자극을 매개한다 (Vivanco and Sawyers, Nat Rev Cancer, 2: 489-501, 2002,Downward, Curr Opin Cell Biol, 10: 262-267, 1998). AKT 경로는 인간 암의 다양한 유형에서 활성인 것으로 보인다 (Nicholson and Anderson, Cell Signal, 14: 381-395, 2002).
<도면의 간단한 설명>
도 1 (A-B). MAP 키나제 시그날링 경로의 차단과는 대조적으로 AKT 시그날링 경로의 차단은 단층 배양시에 흑색종 세포의 증식에 영향을 미치지 않는다. 대조용 451Lu 전이성 흑색종 세포 및 2-20 μM 범위의 투약량의 PI3K 억제제 워르트 만닌 (wortmannin)으로 처리된 451Lu 전이성 흑색종 세포 각각으로부터의 단층 배양물을 비교했을 때 (A), 증식성 세포의 수에 대한 유의적인 효과는 나타나지 않았다. 반대로, 1-7 μM 범위의 투약량의 BAY 43-9006에 의한 451Lu 흑색종 세포의 처리 (B)는 세포 증식에서 유의적인 감소를 나타내었다. 평균값으로 제공된 형광의 강도는 웰 내의 생존세포의 수를 나타낸다.
도 2 (A-B). AKT 또는 MAPK 시그날링 경로의 차단은 단층에서 451Lu 흑색종 세포의 유착분자 MelCAM 및 avβ3 인테그린의 발현을 각각 하향조절한다. 451Lu 전이성 흑색종 세포의 단층 배양물을 비히클 단독, 4 μM 워르트만닌, 6 μM BAY 43-9006, 또는 6 μM BAY 43-9006와 조합된 4 μM 워르트만닌으로 96 시간 동안 처리하고, av.β3 또는 MelCAM에 대한 항체로 염색하고, 유동세포분석 (flow cytometry)에 적용하였다. 워르트만닌 단독으로, 또는 BAY 43-9006와 병용하여 처리하는 것은 MelCAM의 세포 표면 발현을 하향조절한다 (A). avβ3 인테그린의 세포 표면 발현은 BAY 43-9006 단독 또는 그와 워르트만닌과의 병용에 의해서 하향조절되지만, 워르트만닌 단독에 의해서는 그렇지 않다 (B).
도 3 (A-D). AKT 시그날링 경로가 아닌 MAPK 시그날링 경로의 차단은 기관형적 배양 (organotypic culture)에서 증식을 억제한다. 피부 복원체 (dermal reconstructs) 내에 혼입된 Skmel28 전이성 흑색종 세포를 배양매질 또는 대조군으로서의 DMSO, 4 μM PI3K 억제제 워르트만닌, 6 μM RAF 키나제 억제제 BAY 43-9006, 또는 4 μM 워르트만닌과 6 μM BAY 43-9006의 조합물이 첨가된 배양매질로 처리하고, Ki-67 증식 마커 (marker)(Ki-67: 적색, ×100)에 대해서 염색하였다. 대조군 전이성 흑색종 세포의 대부분은 Ki-67 증식 마커에 대해서 염색되었다 (A). PI3L 억제제 워르트만닌 단독으로 처리하는 것은 증식율에 대해서 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다 (B). BAY 43-9006에 의한 처리는 세포 증식의 유의적인 감소를 야기하였다 (C). 억제제의 조합물로 처리한 후에는 어떤 증식성 세포도 전혀 검출되지 않았다 (D).
도 4 (A-D). AKT 및 MAPK 시그날링 경로의 차단은 세포소멸을 유도한다. 생리학적 관계에서 흑색종 세포에 대한 PI3K 억제제 워르트만닌 및/또는 BAY 43-9006의 전-세포소멸성 (pro-apoptotic) 효과를 조사하기 위하여, 대조군 및 억제제-처리된 Skmel28 전이성 흑색종 복원체를 활성 카스파제 3 (활성 카스파제 3: 적색, ×50)에 대해서 염색하였다. 피부 복원체에 혼입된 대조군 Skmel128 전이성 흑색종 세포의 대부분은 활성 카스파제 3에 대해서 음성이었다 (A). PI3K 억제제 워르트만닌 (B) 또는 RAF 키나제 억제제 BAY 43-9006 (C) 또는 둘 다 (D)를 적용한 후에, 활성 카스파제 3은 인간 피부 복원체 중의 Skmel28 전이성 흑색종 세포의 대부분에서 발견되었다.
도 5 (A-H). AKT 및 MAPK 시그날링 경로의 차단은 유착분자 MelCAM 및 β3 인테그린의 발현을 각각 하향조절한다. 전이성 흑색종 복원체를 4 μM PI3K 억제제 워르트만닌, 또는 6 μM BAY 43-9006, 또는 4 μM 워르트만닌과 6 μM BAY 43-9006의 조합물로 처리하고, 유착분자 MelCAM 및 β3 인테그린에 대해서 각각 염색하였다 (MelCAM: 적색, ×100; β3 인테그린: 적색, ×50). 피부 복원체 내에 혼입된 대조군 전이성 흑색종 세포는 유착분자 MelCAM (A) 및 β3 인테그린 (E)를 강 력하게 발현하였다. 워르트만닌에 의한 AKT 시그날링 경로의 차단은 MelCAM의 발현을 하향조절하였고 (B), 그 반면에 BAY 43-9006에 의한 MAPK 시그날링 경로의 차단은 MelCAM 발현에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았으며 (C), 이것은 두 가지 억제제의 조합물에 의해서 관찰된 효과 (D)는 주로 AKT 경로의 차단에 기인하는 것임을 시사한다. β3 인테그린의 발현은 워르트만닌 처리에 의해서 변화되지 않았으며 (F), 그 반면에 BAY 43-9006를 단독으로 (G) 또는 워르트만닌과 조합하여 적용한 것은 β3 인테그린 발현을 실질적으로 감소시켰다 (H).
도 6 (A-D). PI3K/AKT (AKT) 및 RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK) 시그날링 경로의 차단은 인간 피부 복원체에서 침습성 흑색종 성장을 억제한다. Skmel28 전이성 흑색종 세포를 인간 피부 복원체 내에 혼입시키고, 배양매질, 또는 대조군으로서의 DMSO, 4 μM PI3K 억제제 워르트만닌, 6 μM BAY 43-9006, 또는 4 μM 워르트만닌과 6 μM BAY 43-9006의 조합물이 첨가된 배양매질로 처리하고, 헤마톡실린 (HE, ×100)으로 염색하였다. (A) 대조군 Skmel28 전이성 흑색종 세포는 전체 진피에 걸쳐서 다수의 종양 세포소 및 종양 세포 클러스터 (cluster)의 공격적 성장을 나타내었다. (B) 워르트만닌으로 처리한 후에, 흑색종 세포소의 수 및 크기는 감소되었으며, 흑색종 세포의 응집은 저하되었고, 흑색종 세포의 형태는 다수상돌기성 (multidendritic) 표현형으로 변화되었다. (C) BAY 43-9006은 또한 흑색종 세포소의 수 및 크기를 감소시켰고, 작은 흑색종 세포소 및 단일 흑색종 세포가 진피 전체를 통해서 분산되었다. (D) BAY 43-9006과 조합된 워르트만닌은 침습성 흑색종 성장을 완전하게 억제하였고, 매우 소수의 둥글어진 흑색종 세포가 진피 내에 잔류 하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 세포 증식성 장애 (예를 들어, 암), 염증, 면역조절 장애, 및 비정상적이거나 바람직하지 않은 혈관형성과 연관된 상태를 치료하기 위한 약물 조합물, 조성물 및 방법을 제공한다. 약물 조합물은 하나 이상의 화학식 I의 화합물, 및 PI3K/AKT 시그날링 경로의 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물을 포함한다. 방법은 예를 들어, 이하에 기술하는 바와 같은 디아릴 우레아 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 그의 유도체 등을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3K) 및 AKT (단백질 키나제 B) 시그날링 경로는 세포 생존, 세포 증식, 세포 성장, 및 세포 운동성을 포함하는 다양한 생물학적 과정을 조절한다. PI3K-AKT 시그날링에서의 이상은 세포 증식성 장애 (예를 들어, 암), 염증 및 면역조절 장애를 포함하는 다수의 질환 및 상태 발병기전의 원인이 된다.
다수의 성장 및 생존 인자는 PI3K 집단 구성원을 활성화시켜 하나의 지질 시그날링 분자 PIP2를 또 다른 것인 PI(3,4,5)P3로 특이적으로 전환시킨다. 포스포릴화된 생성물은 내부 형질막에 Akt 집단 구성원을 보충하여 그들의 단백질 키나제 활성을 자극한다. 현재까지, 몇 가지 생물학적 과정에 수반되는 다수의 Akt 효과기가 확인되었다. 예를 들어, Akt 키나제는 세포소멸성 기관 성분의 포스포릴화 및 불활성화를 통해서 세포 생존을 매개한다. PI3K/AKT 시그날링 경로는 시그날 전달체계 (signal transduction cascade)에 참여하는 모든 구성원 또는 성분을 포함한다. 이들에는 예를 들어, PI3-키나제, Akt-키나제, FKBP12, mTOR (라파마이신의 포유동물성 표적; 또한 FRAP, RAFT1 또는 RAPT1), RAPTOR (mTOR인 경우의 조절 관련된 단백질), TSC (결절성 경화증 컴플렉스 (tuberous sclerosis complex)), PTEN (포스파타제 및 텐신 동족체), 및 그의 하류 효과기가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 조합물은 상기 언급한 활성 중의 어떤 것과 관련된 모든 상태 및/또는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다.
PI3K/AKT 시그날링 경로의 억제제는 상기 언급한 시그날 전달체계의 하나 또는 그 이상의 구성원을 억제하는 화합물이다. 이러한 화합물은 경로 억제제로 불릴 수 있지만, 본 발명은 작용의 기전이나 치료학적 효과가 어떻게 달성되는지 와는 관계없이 상기 언급된 질환 또는 상태 중의 어떤 것을 치료하기 위한 이들 억제제의 용도를 포함한다. 실제로, 이러한 화합물은 하나 이상의 표적을 가질 수 있으며, 화합물에 대해서 인식된 초기 활성은 대상체에 투여된 경우에 이것이 생체내에서 가지는 활성이나 그에 의해서 그의 치료학적 효과를 달성하는 활성이 아닐 수도 있는 것으로 인식된다. 따라서, 경로 또는 단백질 표적 (예를 들어, Akt 또는 mTOR) 억제제로서 화합물을 기술하는 것은 화합물이 이러한 활성을 갖는 것을 나타내지만, 치료학적 또는 예방적 약제로 사용되는 경우에 화합물을 그 활성을 갖는 것으로 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.
AKT 집단 구성원의 예로는 Akt1, Akt2 (통상적으로, 종양에서 과발현됨; Bellacosa et al., Int . J. Cancer, 64:280-285, 1995), 및 Akt3이 포함된다.
PI3K 집단 구성원의 예로는 p110-알파, p110-베타, p110-델타 및 p110-감마 (촉매적)가 포함된다.
PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제에는 예를 들어, FTY720 (예를 들어, Lee et al., Carcinogenesis, 25(12):2397-2405, 2004), UCN-01 (예를 들어, Amornphimoltham et al., Clin Cancer Res., 10(12 Pt 1):4029-37, 2004)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3-키나제) 억제제의 예로는 예를 들어, 다음의 물질들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다:
셀레콕시브 및 OSU-03012 및 OSU-03013 (예를 들어, Zhu et al., Cancer Res., 64(12):4309-18, 2004)과 같은 그의 유사체;
PX-316과 같은 3-데옥시-D-마이오-이노시톨 유사체 (예를 들어, 미국 출원 제 20040192770 호; Meuillet et al., Oncol . Res ., 14:513-27, 2004);
2'-치환된 3'-데옥시-포스파티딜-마이오-이노시톨 유사체 (예를 들어, Tabellini et al., Br . J. Haematol., 126(4): 574-82, 2004);
융합된 헤테로아릴 유도체 (미국 특허 제 6,608,056 호);
3-(이미다조[1,2-a]피리딘-3-일) 유도체 (예를 들어, 미국 특허 제 6,403,588 및 6,653,320 호);
Ly294002 (예를 들어, Vlahos, et al., J. Biol . Chem ,., 269(7): 5241-5248, 1994);
IC486068 (예를 들어, 미국 출원 제 20020161014; Geng et al., Cancer Res., 64:4893-99, 2004)과 같은 퀴나졸린-4-온 유도체;
3-(헤테로)아릴옥시 치환된 벤조(b)티오펜 유도체 (예를 들어, WO 04 108715; 또한 WO 04 108713);
PX-866 (아세트산 (1S,4E,10R,11R,13S,14R)-[4-디알릴아미노메틸렌-6-하이드록시-1-메톡시메틸-10.13-디메틸-3,7,17-트리옥소-1,3,4,7,10,11,12,13,14,15,16,17-옥타데카하이드로-2-옥사-사이클로펜타[a]페난트렌-11-일 에스테르) (예를 들어, Ihle et al., Mol . Cancer Ther., 3(7):763-72, 2004; 미국 출원 제 20020037276 호; 미국 특허 제 5,726,167 호)과 같은 반합성 비리딘을 포함하는 비리딘; 및
워르트만닌 및 그의 유도체 (예를 들어, 미국 특허 제 5,504,103; 5,480,906; 5,468,773; 5,441,947; 5,378,725; 3,668,222 호).
Akt-키나제 (또한, 단백질 키나제 B로도 공지됨) 억제제의 예로는 예를 들어, Akt-1-1 (Akt1을 억제함) (Barnett et al., Biochem . J., 385 (Pt.2): 399-408, 2005), Akt-1-1,2 (Ak1 및 2를 억제함) (Barnett et al., Biochem . J., 385 (Pt.2): 399-408, 2005), API-59CJ-Ome (예를 들어, Jin et al., Br . J. Cancer., 91:1808-12, 2004), 1-H-이미다조[4,5-c]피리디닐 화합물 (예를 들어, WO05011700), 인돌-3-카비놀 및 그의 유도체 (예를 들어, 미국 특허 제 6,656,963 호; Sarkar and Li, J Nutr., 134(12 Suppl):3493S-3498S, 2004), 페리포신 (예를 들어, Akt 막 국재화를 저해함; Dasmahapatra et al., Clin . Cancer Res., 10(15):5242-52, 2004), 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체 (예를 들어, Gills and Dennis, Expert . Opin . Investig . Drugs, 13:787-97, 2004), 트리시리빈 (TCN 또는 API-2 또는 NCI 식별명: NSC 154020; Yang et al., Cancer Res., 64:4394-9, 2004)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
mTOR 억제제의 예로는 예를 들어, 다음의 물질들이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다:
FKBP12 인핸서 (enhancer);
CCI-779 (템시롤리무스), RAD001 (에버롤리무스; WO9409010), TAFA93 및 AP23573; 예를 들어, WO 98/02441 및 WO 01/14387에 기술된 것과 같은 라파로그 (rapalogs), 예를 들어, AP23573, AP23464, AP23675 또는 AP23841; 40-(2-하이드록시에틸)라파마이신, 40-[3-하이드록시(하이드록시메틸) 메틸프로파노에이트]-라파마이신 (또한, CC1779로 불림), 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신 (또한, ABT578로 불림), 32-데옥소라파마이신, 16-펜티닐옥시-32(S)-디하이드로라파마이신, 및 WO 05005434에 기술된 그 밖의 유도체; USP 5,258,389, WO 94/090101, WO 92/05179, USP 5,118,677, USP 5,118,678, USP 5,100,883, USP 5,151,413, USP 5,120,842, WO 93/111130, WO 94/02136, WO 94/02485, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 95/16691 (예를 들어, SAR 943), EP 509795, WO 96/41807 및 USP 5,256,790에 기술된 유도체를 포함하는 라파마이신 및 그의 유도체;
인-함유 라파마이신 유도체 (예를 들어, WO 05016252); 및
4H-1-벤조피란-4-온 유도체 (예를 들어, 미국 가출원 제 60/528,340 호).
관심의 대상인 포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3-키나제) 억제제의 예는 워 르트만닌 및 그의 유도체 또는 유사체 및 워르트만닌 및 그의 유도체 또는 유사체의 약제학적으로 허용되는 염이다. 따라서, 본 발명의 방법은 하기 화학식 W의 PI3-키나제 억제제 워르트만닌, 화학식 W의 화합물의 유도체 또는 유사체, 화학식 W의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 및 화학식 W의 화합물의 유도체 또는 유사체의 약제학적으로 허용되는 염의 사용을 포함한다:
Figure 112007085202109-PCT00001
본 명세서에서 워르트만닌 또는 화학식 W의 화합물의 유도체 및 유사체를 언급하는 것은 미국 특허 제 5,504,103; 5,480,906; 5,468,773; 5,441,947; 5,378,725; 3,668,222 호에서 확인된 유도체 및 유사체를 포함하고자 하는 것이다. 화학식 W의 화합물의 적합한 유도체 및 유사체에는 다음의 화합물들이 포함된다:
a) 화학식 W1의 화합물
Figure 112007085202109-PCT00002
상기식에서, R은 H (11-데스아세톡시워르트만닌) 또는 아세톡시이고, R'는 C1-C6 알킬이다;
b) 화학식 W2의 Δ9,11-데하이드로데스아세톡시워르트만닌 화합물
Figure 112007085202109-PCT00003
상기식에서, R'는 C1-C6 알킬이다;
c) 화학식 W3의 17(α-디하이드로-워르트만닌 화합물
Figure 112007085202109-PCT00004
상기식에서, R은 H 또는 아세톡시이고, R'는 C1-C6 알킬이며, R"는 H, C1-C6 알킬, -C(O)OH 또는 -C(O)O-C1-C6 알킬이다;
d) 화학식 W4의 워르트만닌 화합물의 개방 A-환 산 또는 에스테르
Figure 112007085202109-PCT00005
상기식에서, R1은 H, 메틸 또는 에틸이고, R2는 H 또는 메틸이다; 또는
e) 화학식 W5의 워르트만닌의 11-치환 및 17-치환된 유도체
Figure 112007085202109-PCT00006
상기식에서, R4는 =O 또는 -O(CO)R6이고, R3는 =O, -OH 또는 -O(CO)R6이며, R6는 각각 독립적으로 페닐, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기에서 R4가 =O 또는 -OH이면, R3는 =O가 아니다.
바람직한 것은 셀레콕시브, OSU-03012, OSU-03013, PX-316, 2'-치환된 3'-데옥시-포스파티딜-마이오-이노시톨 유도체, 3-(이미다조[1,2-a]피리딘-3-일) 유도체, Ly294002, IC486068, 3-(헤테로)아릴옥시 치환된 벤조(b)티오펜 유도체, PX-866, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는 PI3K 억제제이다. 바람직한 것은 또한, FKBP12 인핸서 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염인 mTOR 억제제이다.
또한 바람직한 것은 Akt-1-1, Akt-1-1,2, API-59CJ-Ome, 1-H-이미다조[4,5-c]피리디닐 유도체, 인돌-3-카비놀 및 그의 유도체, 페리포신, 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체, 트리시리빈, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된 Akt-키나제 억제제이다.
또한, 바람직한 것은 CCI-779 (템시롤리무스), RAD001 (에버롤리무스; WO9409010), TAFA93 및 AP23573; 예를 들어, WO 98/02441 및 WO 01/14387에 기술된 것과 같은 라파로그, 예를 들어, AP23573, AP23464, AP23675 또는 AP23841; 40-(2-하이드록시에틸)라파마이신, 40-[3-하이드록시(하이드록시메틸) 메틸프로파노에이트]-라파마이신 (또한, CC1779로 불림), 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신 (또한, ABT578로 불림), 32-데옥소라파마이신, 16-펜티닐옥시-32(S)-디하이드로라파마이신, 및 WO 05005434에 기술된 그 밖의 유도체; USP 5,258,389, WO 94/090101, WO 92/05179, USP 5,118,677, USP 5,118,678, USP 5,100,883, USP 5,151,413, USP 5,120,842, WO 93/111130, WO 94/02136, WO 94/02485, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 95/16691 (예를 들어, SAR 943), EP 509795, WO 96/41807 및 USP 5,256,790에 기술된 유도체를 포함하는 라파마이신 및 그의 유도체이다.
부분입체이성체 형태 (분리된 입체이성체 및 입체이성체의 혼합물 둘 다)를 포함하는, 화학식 I의 구조를 갖는 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 다형체, 용매화물, 수화물, 대사산물 및 전구약물을 본 명세서에서는 총체적으로 "화학식 I의 화합물"이라 칭한다.
화학식 I은 다음과 같다:
Figure 112007085202109-PCT00007
상기 식에서,
Q는 -C(O)Rx이고,
Rx는 하이드록시, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시 또는 NRaRb이며;
Ra 및 Rb는 독립적으로
a) 수소;
b) 임의로 하이드록시; C1 -4 알콕시; 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 트리아진, 벤즈옥사졸, 이소퀴놀린, 퀴놀린 및 이미다조피리미딘으로부터 선택된 헤테로아릴기; 테트라하이드로피란, 테트라하이드로푸란, 1,3-디옥솔란, 1,4-디옥산, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 피페리디논, 테트라하이드로피리미돈, 펜타메틸렌 설파이드, 테트라메틸렌 설파이드, 디하이드로피란, 디하이드로푸란 및 디하이드로티오펜으로부터 선택된 헤테로사이클릭기; 하나 또는 두 개의 C1 -4 알킬기에 의해서 임의로 치환된 아미노 -NH2; 또는 페닐
에 의해서 치환된 C1 -4 알킬;
c) 임의로 할로겐, 또는 하나 또는 두 개의 C1 -4 알킬에 의해서 임의로 치환된 아미노 -NH2
에 의해서 치환된 페닐; 또는
d) 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 트리아진, 벤즈옥사졸, 이소퀴놀린, 퀴놀린 및 이미다조피리미딘으로부터 선택된 헤테로아릴기이고,
A는 임의로 치환된 페닐, 피리디닐, 나프틸, 벤즈옥사졸, 이소퀴놀린, 퀴놀린 또는 이미다조피리미딘이며,
B는 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
L은 -S- 또는 -O-인 가교기 (bridging group)이며,
M은 0, 1, 2 또는 3이고,
각각의 R2는 독립적으로 C1 -5 알킬, C1 -5 할로알킬, C1 -3 알콕시, N-옥소 또는 N-하이드록시이다.
특히 중요한 화학식 I의 A에 대한 임의로 치환된 페닐 잔기의 구조는 화학식 1xx의 구조를 포함한다:
Figure 112007085202109-PCT00008
특히 중요한 화학식 I의 A에 대한 임의로 치환된 피리디닐 잔기의 구조는 화학식 1x의 구조를 포함한다:
Figure 112007085202109-PCT00009
특히 중요한 화학식 I의 A에 대한 임의로 치환된 나프틸 잔기의 구조는 화학식 1y의 구조를 포함한다:
Figure 112007085202109-PCT00010
구조 1y는 치환체 R3가 다른 경우라면 치환체로서 수소 원자에 의해서 완결되는 원자가를 갖는 어느 하나의 환에서 어떤 탄소 원자에서라도 존재할 수 있음을 나타낸다. 우레아기에 대한 결합도 또한, 다른 경우라면 치환체로서 수소 원자에 의해서 완결되는 원자가를 갖는 어느 하나의 환 상의 어떤 탄소 원자를 통해서도 이루어질 수 있다.
B는 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸이다. 특히 중요한 화학식 I의 B에 대한 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸 잔기의 구조는 화학식 2a 및 2b의 구조를 포함한다:
Figure 112007085202109-PCT00011
Figure 112007085202109-PCT00012
구조 2a 및 2b는 치환체 R1이 다른 경우라면 치환체로서 수소 원자에 의해서 완결되는 원자가를 갖는 구조내 어떤 탄소 원자에서라도 존재할 수 있고, 우레아기에 대한 결합이, 다른 경우라면 치환체로서 수소 원자에 의해서 완결되는 원자가를 갖는 구조내 어떤 탄소 원자를 통해서도 이루어질 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 구체예의 한 부류에서, B는 하나 이상의 할로겐 치환체에 의해서 치환된다. 또 다른 부류의 구체예에서, Rx는 NRaRb이고, Ra 및 Rb는 독립적으로 수소 또는 임의로 하이드록시에 의해서 치환된 C1 -4 알킬이며, L은 -S- 또는 -O-인 가교기이다.
변수 p는 0, 1, 2, 3 또는 4, 일반적으로 0 또는 1이다. 변수 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6, 일반적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다. 변수 m은 0, 1, 2 또는 3, 일반적으로 0이다.
각각의 R1은 독립적으로 할로겐, C1 -5 할로알킬, NO2, C(O)NR4R5, C1 -6 알킬, C1 -6 디알킬아민, C1 -3 알킬아민, CN, 아미노, 하이드록시 또는 C1 -3 알콕시이다. 존재하는 경우에 R1은 더욱 통상적으로는 할로겐이고, 할로겐 중에서도 일반적으로 염 소 또는 불소, 더욱 통상적으로는 불소이다.
각각의 R2는 독립적으로 C1 -5 알킬, C1 -5 할로알킬, C1 -3 알콕시, N-옥소 또는 N-하이드록시이다. 존재하는 경우에, R2는 일반적으로 메틸 또는 트리플루오로메틸이다.
각각의 R3는 독립적으로 할로겐, R4, OR4, S(O)R4, C(O)R4, C(O)NR4R5, 옥소, 시아노 또는 니트로 (NO2)로부터 선택된다.
R4 및 R5는 독립적으로 수소, C1 -6 알킬, 및 퍼할로겐화까지 된 C1 -6 알킬로부터 선택된다.
A의 다른 예로는 3-tert 부틸 페닐, 5-tert 부틸-2-메톡시페닐, 5-(트리플루오로메틸)-2-페닐, 3-(트리플루오로메틸)-4-클로로페닐, 3-(트리플루오로메틸)-4-브로모페닐 및 5-(트리플루오로메틸)-4-클로로-2-메톡시페닐이 포함된다.
B의 다른 예로는 다음의 기들이 포함된다:
Figure 112007085202109-PCT00013
바람직하게는 우레아기 -NH-C(O)-NH- 및 가교기 L은 B의 인접한 환 탄소에 결합되지 않으며, 1 또는 2 개의 환 탄소에 의해서 분리되어 결합된다.
R1 기의 예로는 불소, 염소, 브롬, 메틸, NO2, C(O)NH2, 메톡시, SCH3, 트리플루오로메틸 및 메탄설포닐이 포함된다.
R2 기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 산소 및 시아노가 포함된다.
R3 기의 예로는 트리플루오로메틸, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, tert-부틸, 염소, 불소, 브롬, 시아노, 메톡시, 아세틸, 트리플루오로메탄설포닐, 트리플루오로메톡시, 및 트리플루오로메틸티오가 포함된다.
중요한 화합물의 부류는 이하의 화학식 II의 화합물이다:
Figure 112007085202109-PCT00014
상기 식에서,
Ra 및 Rb는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬이며,
화학식 II의 B는 하기 화학식의 기이고,
Figure 112007085202109-PCT00015
여기에서 우레아기 -NH-C(O)-NH- 및 산소 가교기는 B의 인접한 환 탄소에 결합되지 않으며, 1 또는 2 개의 환 탄소에 의해서 분리되어 결합되며,
화학식 II의 A는 화학식 1xx 또는 1x의 기이고,
[화학식 1xx]
Figure 112007085202109-PCT00016
[화학식 1x]
Figure 112007085202109-PCT00017
여기에서 변수 n은 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
R3는 트리플루오로메틸, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, tert-부틸, 염소, 불소, 브롬, 시아노, 메톡시, 아세틸, 트리플루오로메탄설포닐, 트리플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸티오이다.
이러한 화합물의 소부류 (subclass)에서, 화학식 II의 A 상의 각각의 R3 치환체는 염소, 트리플루오로메틸, tert-부틸 또는 메톡시로부터 선택된다.
이러한 화합물의 또 다른 소부류에서, 화학식 II의 A는
Figure 112007085202109-PCT00018
이며, 화학식 II의 B는 페닐렌, 플루오로 치환된 페닐렌 또는 디플루오로 치환된 페닐렌이다.
중요한 또 다른 부류의 화합물은 페닐 환 "B"가 임의로 하나의 할로겐 치환체를 갖는 이하의 화학식 X의 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure 112007085202109-PCT00019
화학식 X의 화합물의 경우에 R2, m 및 A는 화학식 I에 대해서 상기 정의한 바와 같다. 변수 "m"은 바람직하게는 0이어서 피리디닐 잔기 상에 유일한 치환체로서 C(O)NHCH3를 남긴다. A에 대해서 바람직한 값은 하나 이상의 치환체 R3를 갖는 치환된 페닐이다. R3는 바람직하게는 할로겐, 바람직하게는 Cl 또는 F, 트리플루오로메틸 및/또는 메톡시이다.
중요한 화합물의 소부류에는 이하의 화학식 Z1 및 Z2의 구조를 갖는 화합물 이 포함된다:
Figure 112007085202109-PCT00020
Figure 112007085202109-PCT00021
본 발명에 따르는 화학식 I의 화합물로서 바람직하게 사용되는 것은 4{4-[3-(4-클로로-3-트리플루오로메틸페닐)-우레이도]-페녹시}-피리딘-2-카복실산 메틸 아미드 (BAY 43-9006) 또는 4{4-[3-(4-클로로-3-트리플루오로메틸페닐)-우레이도]-페녹시}-피리딘-2-카복실산 메틸 아미드의 p-톨루엔설폰산 염 (화합물 (I)의 토실레이트 염)이다. 더욱 바람직하게는, 4{4-[3-(4-클로로-3-트리플루오로메틸페닐)-우레이도]-페녹시}-피리딘-2-카복실산 메틸 아미드의 p-톨루엔설폰산 염은 안정한 다형체 I로 적어도 80％가 존재한다. 가장 바람직하게는, 4{4-[3-(4-클로로-3-트리플루오로메틸페닐)-우레이도]-페녹시}-피리딘-2-카복실산 메틸 아미드의 p-톨루엔설폰산 염은 안정한 다형체 I 및 미분화된 형태로 적어도 80％가 존재한다.
미분화는 숙련된 전문가에게 공지된 표준 분쇄방법에 의해서, 바람직하게는 에어캣트 분쇄 (air chat milling)에 의해서 달성될 수 있다. 미분화된 형태는 0.5 내지 10 ㎛, 바람직하게는 1 내지 6 ㎛, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 ㎛의 평 균 입자크기를 가질 수 있다. 제시된 입자크기는 숙련된 전문가에게 공지된 레이저 회절에 의해서 측정된 입자크기 분포의 평균치이다 (측정장치: HELOS, Sympatec).
4{4-[3-(4-클로로-3-트리플루오로메틸페닐)-우레이도]-페녹시}-피리딘-2-카복실산 메틸 아미드의 p-톨루엔설폰산 염 및 그의 안정한 다형체 I을 제조하는 방법은 특허출원 EP 04023131.8 및 EP 04023130.0에 기술되어 있다.
어떤 잔기가 "치환된" 경우에, 이것은 지시된 치환체의 최고의 수까지를 가질 수 있으며, 각각의 치환체는 그 잔기 상의 어떤 이용가능한 위치에라도 존재할 수 있으며, 치환체 상의 어떤 이용가능한 원자를 통해서도 부착될 수 있다. "어떤 이용가능한 위치"라는 것은 본 기술분야에서 공지되어 있거나, 본 명세서에 교시된 방법을 통해서 화학적으로 접근할 수 있으며, 예를 들어, 인간에게 투여할 수 없는 불안정한 분자를 생성시키지 않는 잔기 상의 모든 위치를 의미한다. 어떤 잔기 상에 두 개 또는 그 이상의 치환체가 존재하는 경우에, 각각의 치환체는 모든 다른 치환체들 중에서 독립적으로 정의되며, 따라서 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "임의로 치환된"은 그렇게 변형된 잔기가 지정된 치환체(들)에 의해서 치환되거나 비치환될 수 있음을 의미한다.
피리딘 치환체로서 용어 "하이드록시"는 2-, 3- 및 4-하이드록시피리딘을 포함하며, 또한 본 기술분야에서 1-옥소-피리딘, 1-하이드록시-피리딘 또는 피리딘-N-옥사이드로 언급되는 구조를 포함하는 것으로 이해된다.
단어 화합물, 염 등이 복수 형태로 사용되는 경우에, 이것은 또한 단일 화합 물, 염 등도 의미하는 것으로 해석된다.
용어 C1 -6 알킬은 다른 식으로 나타내지 않는 한, 환형이거나, 선형이거나 하나 또는 다수의 가지치기 (branching)로 분지될 수 있는, 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 알킬기를 의미한다. 이러한 기에는 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸 등이 포함된다.
용어 C1 -6 할로알킬은 다른 식으로 나타내지 않는 한, 하나 이상의 할로겐 원자에 의해서 퍼할로까지 치환된, 6 개까지의 탄소 원자를 갖는 포화된 하이드로카본 래디칼을 의미한다. 래디칼은 환형이거나, 선형이거나 하나 또는 다수의 가지치기로 분지될 수 있다. 할로 치환체(들)는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 포함한다. 플루오로, 클로로 및 브로모가 바람직하며, 플루오로 및 클로로가 더욱 바람직하다. 할로겐 치환체(들)는 어떤 이용가능한 탄소 상에라도 존재할 수 있다. 하나 이상의 할로겐 치환체가 이 잔기 상에 존재하는 경우에, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 할로겐화된 알킬 치환체의 예로는 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸 및 1,1,2,2-테트라플루오로에틸 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 C1 -6 알콕시는 다른 식으로 나타내지 않는 한, 환형이거나, 선형이거나 하나 또는 다수의 가지치기로 분지될 수 있는, 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 직 쇄, 측쇄 또는 사이클릭 알콕시기를 의미하며, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 펜톡시 등과 같은 기를 포함한다. 이것은 또한, 2,2-디클로로에톡시, 트리플루오로메톡시 등과 같은 할로겐화된 기를 포함한다.
할로 또는 할로겐은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다. 플루오로, 클로로 및 브로모가 바람직하며, 플루오로 및 클로로가 더욱 바람직하다.
C1 -3 알킬아민은 다른 식으로 나타내지 않는 한, 메틸아미노, 에틸아미노, 프로필아미노 또는 이소프로필아미노를 의미한다.
C1 -6 디알킬아민의 예로는 디에틸아미노, 에틸-이소프로필아미노, 메틸-이소부틸아미노 및 디헥실아미노가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 헤테로아릴은 모노사이클릭 및 비사이클릭 헤테로아릴 환 둘 다를 나타낸다. 모노사이클릭 헤테로아릴은 5 내지 6 개의 환 원자 및 N, O 및 S 중에서 선택된 1-4 개의 헤테로 원자를 가지며 나머지 원자는 탄소인 방향족 모노사이클릭 환을 의미한다. 하나 이상의 헤테로 원자가 잔기에 존재하는 경우에, 이들은 다른 것들로부터 독립적으로 선택되며, 따라서 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 모노사이클릭 헤테로아릴 환에는 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진 및 트리아진이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
비사이클릭 헤테로아릴은 환 중의 하나가 상술한 모노사이클릭 헤테로아릴 환으로부터 선택되고, 두번째 환은 벤젠이거나 상술한 또 다른 모노사이클릭 헤테로아릴 환인 융합된 비사이클릭 잔기를 의미한다. 비사이클릭 잔기에서 두 개의 환이 헤테로아릴 환인 경우에, 이들은 이들이 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 화학적으로 접근할 수 있는 한은 동일하거나 상이할 수 있다. 비사이클릭 헤테로아릴 환은 예를 들어, 벤즈옥사졸 (융합된 페닐 및 옥사졸), 퀴놀린 (융합된 페닐 및 피리딘), 이미다조피리미딘 (융합된 이미다졸 및 피리미딘) 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 합성적으로 접근가능한 5-5, 5-6, 또는 6-6 융합된 비사이클릭 방향족 구조를 포함한다.
지적된 경우에, 비사이클릭 헤테로아릴 잔기는 부분적으로 포화될 수 있다. 부분적으로 포화된 경우에는, 상술한 모노사이클릭 헤테로아릴 환이 완전히 또는 부분적으로 포화되거나, 상술한 두번째 환이 완전히 또는 부분적으로 포화되거나, 또는 두 개의 환이 모두 부분적으로 포화된다.
용어 "포화되거나, 부분적으로 포화되거나, 방향족이며, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 하나 이상의 원자를 함유하는 5 또는 6 원 헤테로사이클릭 환"은 테트라하이드로피란, 테트라하이드로푸란, 1,3-디옥솔란, 1,4-디옥솔란, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 피페리디논, 테트라하이드로피리미돈, 펜타메틸렌 설파이드, 테트라메틸렌 설파이드, 디하이드로피란, 디하이드로푸란, 디하이드로티오펜, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 트리아진 등을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "C1 -3 알킬-페닐"은 예를 들어, 2-메틸페닐, 이소프로필페닐, 3-페닐프로필, 또는 2-페닐-1-메틸페닐을 포함한다. 치환된 예로는 2-[2-클로로페닐]에틸, 3,4-디메틸페닐메틸 등이 포함된다.
다른 식으로 언급되거나 나타내지 않는 한, 용어 "아릴"은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 치환체를 갖는 6-12 원 모노 또는 비사이클릭 방향족 하이드로카본 기 (예를 들어, 페닐, 나프탈렌, 아줄렌, 인덴 기)를 포함한다.
화학식 I의 화합물은 원하는 다양한 치환체의 위치 및 성질에 따라서 하나 또는 그 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있다. 비대칭 탄소 원자는 (R) 또는 (S) 배위 또는 (R,S) 배위로 존재할 수 있다. 어떤 경우에, 비대칭은 또한 소정의 결합, 예를 들어, 특정의 화합물의 두 개의 치환된 방향족 환을 결합시키는 중심 결합에 대한 제한된 회전으로 인하여 존재할 수도 있다. 이러한 배위는 모두 (에난티오머 및 부분입체이성체를 포함) 본 발명의 범위 내에 포함된다. 바람직한 화합물은 더 바람직한 생물학적 활성을 제공하는 화학식 I의 화합물의 절대배위를 갖는 것이다. 본 발명의 화합물의 분리되거나, 순수하거나 부분적으로 정제된 이성체 또는 라세미 혼합물도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 이성체의 정제 및 상기한 이성체 혼합물의 분리는 본 기술분야에서 공지된 표준기술에 의해서 성취될 수 있다.
광학이성체는 라세미 혼합물을 통상적인 방법에 따라서 분할함으로써, 예를 들어, 광학적 활성인 산 또는 염기를 사용하여 부분이성체 염을 형성시키거나 공유 결합 부분입체성체를 형성시킴으로써 수득될 수 있다. 적절한 산의 예는 타르타르산, 디아세틸타르타르산, 디톨루오일타르타르산 및 캄포설폰산이다. 부분입체이성체의 혼합물은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서, 예를 들어, 크로마토그라피 또는 분별결정화에 의해서 그들의 물리적 및/또는 화학적 차이를 기초로 하여 그들의 각각의 부분입체이성체로 분리될 수 있다. 그 후에 광학적으로 활성인 염기 또는 산은 분리된 부분입체이성체 염으로부터 분리된다. 광학적 이성체의 분리를 위한 상이한 방법은 에난티오머의 분리를 최대화하도록 최적으로 선택된, 통상적인 유도체화가 존재하거나 존재하지 않은 키랄 크로마토그라피 (예를 들어, 키랄 HPLC 칼럼)의 사용을 수반한다. 적합한 키랄 HPLC 칼럼은 디아셀 (Diacel)에 의해서 제조된 것이며, 예를 들어, 여러 가지 다른 것들 중에서 키라셀 (Chiracel) OD 및 키라셀 OJ이고, 이들은 모두 일상적으로 선택할 수 있다. 유도체화가 존재하거나 존재하지 않는 효소적 분리도 또한 유용하다. 화학식 I의 광학적 활성 화합물은 마찬가지로 광학적 활성 출발물질을 이용한 키랄 합성에 의해서 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 염, 대사산물 및 전구약물과 같은 본 명세서에 기술된 화합물의 유용한 형태에 관한 것이다. 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 비교적 비독성인 무기 또는 유기 산부가염을 나타낸다 (예를 들어, 참조: S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm . Sci . 1977, 66, 1-19). 약제학적으로 허용되는 염에는 염기로 작용하는 주화합물을 무기 또는 유기산과 반응시켜 염, 예를 들어, 염산, 황산, 인산, 메탄설폰산, 캄포설폰산, 옥살산, 말레산, 석신산 및 시트르산의 염을 형성시킴으로써 수득되는 것이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 염은 또한 주화합물이 산으로 작용하고, 적절한 염기와 반응하여 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 및 콜린 염을 형성한 것을 포함한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 또한, 특허청구된 화합물의 산부가염이 다수의 공지된 방법들 중의 어떤 것에 의해 적절한 무기 또는 유기산과 화합물의 반응에 의해서 제조될 수 있음을 인식할 것이다. 대신으로, 알칼리 및 알칼리 토금속염은 본 발명의 화합물을 공지된 다수의 방법에 의해서 적절한 염기와 반응시킴으로써 제조된다.
본 발명의 화합물의 대표적인 염에는 예를 들어, 본 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해서 무기 또는 유기산 또는 염기로부터 형성된 통상적인 비독성염 및 4급 암모늄염이 포함된다. 예를 들어, 이러한 산부가염에는 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 신나메이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 이타코네이트, 락테이트, 말리에이트, 만델레이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 설포네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 트리플루오로메탄설포네이트 및 운데카노에이트가 포함된다.
염기 염은 칼륨 및 나트륨염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘 및 마그네슘 염과 같은 알칼리 토금속염, 및 디사이클로헥실아민 및 N-메틸-D-글루카민과 같은 유기 염기와의 암모늄염을 포함한다. 추가로, 염기성 질소 함유 기는 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드와 같은 저급 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸 및 디부틸 설페이트와 같은 디알킬 설페이트; 및 디아밀 설페이트, 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드와 같은 장쇄 할라이드, 벤질 및 펜에틸 브로마이드와 같은 아릴 또는 아르알킬 할라이드, 및 그 밖의 다른 일치환된 아르알킬 할라이드 또는 다치환된 아르알킬 할라이드와 같은 물질에 의해서 4급화될 수 있다.
본 발명의 목적에 따른 용매화물은 용매 분자가 고체 상태의 컴플렉스를 형성하며, 예를 들어, 에탄올 및 메탄올을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 경우의 화합물의 형태이다. 수화물은 용매 분자가 물인 경우의 용매화물의 특정한 형태이다.
특정의 약물학적 활성 약제는 생체내 투여한 후에 분해되어 모 활성약제 및 약물학적으로 불활성인 유도체화 기를 공급하는 불안정한 작용기에 의해서 더 변형될 수 있다. 통상적으로 전구약물으로 불리는 이들 유도체는 예를 들어, 활성약제의 물리화학적 특성을 변화시키고, 활성약제를 특정 조직에 대해 표적화하고, 활성약제의 약력학적 및 약동학적 특성을 변화시키고, 원치 않는 부작용을 감소시키기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 전구약물은 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 또는 펜틸 에스테르를 포함하는 알킬 에스테르와 같은 내약성이 우수한 약제학적으로 허용되는 에스테르인 본 발명의 적절한 화합물의 에스테르를 포함한다. 메틸 에스테르가 바람직하지만, 페닐-C1-C5 알킬과 같은 추가의 에스테르가 사용될 수도 있다.
다른 전구약물을 합성하기 위해서 사용될 수 있는 방법은 이 주제에 대한 이하의 문헌들에 기술되어 있으며, 이들은 이들 합성방법의 설명에 대한 참고로 본 명세서에 포함되어 있다:
Figure 112007085202109-PCT00022
본 발명의 화합물의 대사산물은 하나 또는 그 이상의 질소는 하이드록시기에 의해서 치환된 화학식 I, II, X, Z1 및 Z2의 화합물의 산화된 유도체를 포함하며, 여기에는 피리딘기의 질소 원자가 옥사이드 형태이거나 (본 기술분야에서 1-옥소-피리딘이라 칭함), 하이드록시 치환체를 갖는 (본 기술분야에서 1-하이드록시-피리 딘이라 칭함) 유도체가 포함된다.
일반적 제조방법
본 발명의 이 구체예에서 사용된 화합물의 제조에 이용될 특정의 방법은 특정의 목적하는 화합물에 따라서 좌우된다. 특정의 치환체의 선택과 같은 인자들이 본 발명의 특정 화합물의 제조방법에서 수행되는 경로에서 중요한 역할을 한다. 이들 인자는 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 쉽게 인식된다.
본 발명의 화합물은 다음의 공개된 국제출원 WO 00/42012, WO 03/047579, WO 2005/009961, WO 2004/078747 및 WO 05/000284 및 유럽 특허출원 EP 04023131.8 및 EP 04023130.0에 기술된 바와 같은 공지된 화학반응 및 과정을 사용함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은 통상적인 화학적 방법에 따라서, 및/또는 이하에 기술된 바와 같이, 시판품으로 이용할 수 있거나 일상적인 통상적 화학적 방법에 따라서 생산될 수 있는 출발물질로부터 제조될 수 있다. 화합물의 제조를 위한 일반적 방법은 이하에 제시한다.
화학식 I의 우레아의 제조는 이들 공개된 문헌 중의 하나 또는 그 이상에 기술된 바와 같이, 포스겐, 디-포스겐, 트리-포스겐, 카보닐디이미다졸 또는 등가물의 존재 하에 출발물질 중의 어떤 것과도 반응하지 않는 용매 중에서 두 개의 아릴아민 단편의 축합으로부터 제조될 수 있다. 대신으로, 화학식 I의 화합물은 상술한 공개된 국제출원 중의 하나 또는 그 이상에 기술된 바와 같이 아미노 화합물을 이소시아네이트 화합물과 반응시킴으로써 합성될 수 있다.
이소시아네이트는 시판품을 이용할 수 있거나, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 통상적으로 공지된 방법 [예를 들어, 포스겐, 또는 트리클로로메틸 클로로포르메이트 (디포스겐), 비스(트리클로로메틸)카보네이트 (트리포스겐) 또는 N,N-카보닐디이미다졸 (CDI)와 같은 포스겐 등가물에 의한 아민의 처리로부터; 또는 대신으로 아미드, 또는 에스테르, 산 할라이드 또는 무수물과 같은 카복실산 유도체의 커티우스-유형 재배열 (Curtius-type rearrangement)에 의해서]에 따라서 헤테로사이클릭 아민으로부터 합성될 수 있다.
화학식의 아릴 아민은 시판품을 이용할 수 있거나, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 통상적으로 공지된 방법에 따라서 합성될 수 있다. 아릴 아민은 통상적으로, 니트로아릴을 Ni, Pd 또는 Pt와 같은 금속 촉매 및 H2 또는 포르메이트, 사이클로헥사디엔 또는 보로하이드라이드와 같은 하이드라이드 전이제를 사용하여 환원시킴으로써 합성된다 (Rylander. Hydrogenation Methods; Academic Press: London, UK (1985)). 니트로아릴은 또한, LiAlH4와 같은 강한 하이드라이드 공급원을 사용하거나 (Seyden-Penn. Reductions by the Alumino - and borohydrides in Organic Synthesis; VCH Publishers: New York (1991)), 종종 산성 매질 중에서 Fe, Sn 또는 Ca와 같은 0가 금속을 사용하여 직접적으로 환원시킬 수도 있다. 니트로아릴의 합성을 위한 다수의 방법이 존재한다 (March. Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed.; John Wiley: New York (1985); Larock. Comprehensive Organic Transformations; VCH Publishers: New York (1989)). 니트로아릴은 통상적으로, HNO3 또는 대용 NO2 + 공급원을 사용한 친전자성 방향족 니트로화에 의해서 형성된다.
피리딘 환이 그의 질소 원자 상에 하이드록시 치환체를 가지며, A, B, L이 상기한 바와 같이 정의되는 화학식 I의 피리딘-1-옥사이드는 본 기술분야에서 공지된 산화반응 조건을 사용하여 상응하는 피리딘으로부터 제조될 수 있다. 몇 가지 예는 다음과 같다:
● 디클로로메탄, 디클로로에탄 또는 클로로포름과 같은 염소화된 용매 중의 메타 클로로퍼벤조산과 같은 과산 (Markgraf et al., Tetrahedron 1991, 47, 183);
● 디클로로메탄과 같은 염소화된 용매 중에서 촉매량의 퍼레닌산의 존재 하의 (Me3SiO)2 (Coperet et al., Tetrahedron Lett . 1998, 39, 761);
● 할로겐화된 용매의 몇 가지 조합물 중의 퍼플루오로-시스-2-부틸-3-프로필옥사지리딘 (Amone et al., Tetrahedron 1998, 54, 7831);
● 클로로포름 중의 하이포플루오르산-아세토니트릴 컴플렉스 (Dayan et al., Synthesis 1999, 1427);
● 물 중에서 KOH와 같은 염기의 존재 하의 옥손 (Robker et al., J. Chem. Res ., Synop . 1993, 10, 412);
● 빙초산의 존재 하의 마그네슘 모노퍼옥시프탈레이트 (Klemm et al., J. Heterocyclic Chem . 1990, 6, 1537);
● 물 및 아세트산의 존재 하의 과산화수소 (Lin A.J., Org . Prep . Proced. Int. 1991, 23(1), 114);
● 아세톤 중의 디메틸디옥시란 (Boyd et al., J. Chem . Soc ., Perkin Trans. 1991, 9, 2189).
또한, 디아릴 우레아 및 중간체 화합물을 제조하는 특정의 방법은 특허 문헌들의 다른 곳에서 이미 기술되어 있으며, 본 발명의 화합물에 적용될 수 있다 [예를 들어, Miller, S. et al., "Inhibition of p38 Kinase using Symmetrical and Unsymmetrical Diphenyl Ureas" PCT 국제출원 WO 99 32463 호, Miller, S. et al., "Inhibition of raf Kinase using Symmetrical and Unsymmetrical Substituted Diphenyl Ureas" PCT 국제출원 WO 99 32436 호, Dumas, J. et al., "Inhibition of p38 Kinase Activity using Substituted Heterocyclic Ureas" PCT 국제출원 WO 99 32111 호, Dumas, J. et al., "Method for the Treatment of Neoplasm by Inhibition of raf Kinase using N-Hereroaryl-N'-(hetero)arylureas" PCT 국제출원 WO 99 32106 호, Dumas, J. et al., "Inhibition of p38 Kinase Activity using Aryl- and Heteroaryl- Substituted Heterocyclic Ureas" PCT 국제출원 WO 99 32110 호, Dumas, J. et al., "Inhibition of raf Kinase using Aryl- and Heteroaryl- Substituted Heterocyclic Ureas" PCT 국제출원 WO 99 32455 호, Riedl, B. et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as raf Kinase Inhibitors" PCT 국제출원 WO 00 42012 호, Riedl, B. et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as p38 Kinase Inhibitors" PCT 국제출원 WO 00 41698 호, Dumas, J. et al., "Heteroaryl ureas containing nitrogen hetero-atoms as p38 kinase inhibitors" 미국 특허출원공개 제 US 20020065296 호, Dumas, J. et al., "Preparation of N-aryl-N'-[(acylphenoxy)phenyl]ureas as raf kinase inhibitors" PCT 국제출원 WO 02 62763 호, Dumas, J. et al., "Inhibition of raf kinase using quinolyl isoquinolyl or pyridyl ureas" PCT 국제출원 WO 02 85857 호, Dumas, J. et al., "Preparation of quinolyl, isoquinolyl or pyridyl-ureas as inhibitors of raf kinase for the treatment of tumors and/or cancerous cell growth" 미국 특허출원공개 제 US 20020165394 호]. 전술한 모든 특허출원들은 본 발명에 참고로 포함된다.
화학식 I의 화합물의 합성 및 화학식 I의 화합물의 합성에 수반된 중간체의 합성에 사용될 수 있는 합성적 변형은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있거나, 그들에 의해서 쉽게 이용될 수 있다. 합성적 변형의 컬렉션은 다음과 같은 편집물에서 볼 수 있다:
Figure 112007085202109-PCT00023
또한, 합성방법 및 관련된 주제의 반복적인 검토에는 다음의 문헌들이 포함된다 [Organic Reactions; John Wiley: New York; Organic Syntheses; John Wiley: New York; Reagents for Organic Synthesis: John Wiley: New York; The Total Synthesis of Natural Products; John Wiley: New York; The Organic Chemistry of Drug Synthesis; John Wiley: New York; Annual Reports in Organic Synthesis; Academic Press: San Diego CA; and Methoden der Organischen Chemie (Houben- Weyl); Thieme: Stuttgart, Germany]. 또한, 합성적 변형의 데이타베이스에는 다음이 포함된다: Chemical Abstracts (CAS 온라인 (OnLine) 또는 사이파인더 (SciFinder)를 사용하여 검색될 수 있음), Handbuch der Organischen Chemie (Beilstein) (스포트파이어 (SpotFire) 및 REACCS를 사용하여 검색될 수 있음).
화학식 I의 화합물은 이미 Raf/MEK/ERK 경로, c-raf, b-raf, p38, VEGFR, VEGFR2, VEGR3, FLT3, PDGFR, PDGFR-베타 및 c-kit를 억제하는 것을 포함하는 다양한 활성을 갖는 것으로 특정화되었다. 이들 활성 및 다양한 질환 및 상태를 치료하는데 있어서의 그들의 용도는 예를 들어, 본 명세서에 온전히 참고로 포함된 WO 00/42021, WO 00/41698, WO 03/068228, WO 03/047579, WO 2005/009961, WO 2005/000284 및 미국 특허출원 제 20050038080에 기술되어 있다.
적응증
본 발명의 약물 조합물은 조합물을 구성하는 화합물에 의해서 변조되는 세포성 경로와 연관되거나, 그에 의해서 매개되는 모든 질환 또는 상태를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 이들 경로에는 예를 들어, VEGFR, VEGFR2, Raf/Mek/Erk, Akt/PI3K, MTOR, PTEN 등을 포함하는 시그날링 경로가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다 (또한, 상기 참조). 약물 조합물은 PTEN, ras, Raf, Akt, PI3K 등에서의 암-연관된 돌연변이를 포함하는, 이들 경로에 존재하는 다수의 유전자 중의 하나에서의 돌연변이와 연관되거나, 그러한 돌연변이에 의해서 매개되는 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 비록 화합물은 특이적 억제제로 공지될 수 있지만, 본 발명은 작용기전 또는 이것이 어떻게 달성되는지 와는 무관하게 임의의 개선적 또는 치료학적 효과를 포함한다.
약물 조합물은 항증식성; 항종양성; 항혈관형성성; 내피 또는 종양 세포의 증식 억제성; 항신생물성; 면역억제성; 면역조절성; 세포소멸-촉진성 등을 포함하는 활성 중의 하나 또는 그 이상을 가질 수 있다.
본 발명에 따라서 치료될 수 있는 상태 또는 질환에는 증식성 장애 (예를 들어, 암), 염증성 장애, 면역-조절성 장애, 앨러지, 자가면역질환 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 또는 다발성 경화증), 비정상적이거나 과도한 혈관형성 등이 포함된다.
raf, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-베타, Flt-3, ras, PTEN, Akt, PI3K, mTOR뿐만 아니라 이들이 일부분인 시그날링 경로의 상류 또는 하류의 모든 구성원에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 암을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 모든 종양 또는 암이 치료될 수 있다. 종양 또는 암은 이것이 책임지는 기전과는 관계없이 본 발명의 약물 조합물로 치료될 수 있다. 결장, 췌장, 유방, 전립선, 뼈, 간, 신장, 폐, 고환, 피부, 췌장, 위, 전립선, 난소, 자궁, 두경부, 혈구, 림프를 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 어떤 기관의 암이라도 치료될 수 있다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 암에는 특히 뇌종양, 유방암, 뼈의 육종 (예를 들어, 골육종 및 유잉육종 (Ewings sarcoma)), 기관지 전암상태, 자궁내막암, 교아세포종, 혈액종양, 간세포암, 호지킨병, 신장 신생물, 백혈병, 평활근육종, 지 방육종, 림프종, 레미테-듀클로즈병 (Lhermitte-Duclose disease), 악성 신경교종, 흑색종, 악성 흑색종, 전이성 암, 다발성 골수종, 골수양화생, 골수성백혈구 증후군, 비-소세포 폐암, 췌장암, 전립선암, 신세포암 (예를 들어, 진행성, 진행성 치료저항성), 횡문근육종, 연조직 육종, 피부의 편평상피암, PTEN의 기능 상실, 활성화된 Akt과 연관된 암 (예를 들어, PTEN 부재 종양 및 ras 돌연변이를 갖는 종양)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
유방암의 예로는 침습성 유관암, 침습성 소엽암, 유관상피내암, 및 소엽상피내암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
호흡기의 암의 예로는 소세포, 비-소세포 폐암, 기관지 선종 및 흉막폐아세포종이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
뇌암의 예로는 뇌간 및 시상하부 신경교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 수아세포종, 상의세포종, 및 신경외배엽 및 송과체 종양이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
남성 생식기관의 종양에는 전립선 및 고환 암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 여성 생식기관의 종양에는 자궁내막, 경구, 난소, 질 및 외음부 암뿐만 아니라, 자궁의 육종이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
소화기계의 종양에는 항문, 결장, 결장직장, 식도, 담낭, 위, 췌장, 직장, 소장 및 타액선의 암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
요로의 종양에는 방광, 음경, 신장, 신우, 요관 및 요도의 암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
안암에는 안내 흑색종 및 망막아세포종이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
간암의 예로는 간세포암 (섬유층판 변이 (fibrolamellar variant)가 있거나 없는 간세포암), 담관암 (간내 담관암) 및 혼합된 간세포 담관암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
피부암에는 편평세포암, 카포시 육종, 악성 흑색종, 머켈 세포 (Merkel cell) 피부암, 및 비-흑색종 피부암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
두경부암에는 후두, 하인두, 비인두, 및/또는 구강인두의 암, 및 구순 및 구강의 암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
림프종에는 AIDS-관련된 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병, 및 중추신경계의 림프종이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
육종에는 연조직의 육종, 골육종, 악성 섬유성조직구종, 림프육종, 및 횡문근육종이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
백혈병에는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 모양세포성 백혈병이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
종양세포의 증식을 억제하는 것 이외에도, 본 발명의 약물 조합물은 또한 종양 퇴행, 예를 들어, 종양의 크기 또는 신체에서 암의 범위의 감소를 야기할 수 있다.
바람직한 것은 흑색종, 신장암, 간세포암, 비-소세포 폐암, 난소암, 전립선 암, 결장직장암, 유방암 또는 췌장암의 치료에 대한 것이다.
혈관형성-관련된 상태 및 장애도 또한 본 발명의 약물 조합물로 치료될 수 있다. 혈관형성의 부적절하고 이소성인 발현은 유기체에 유해할 수 있다. 다수의 병리학적 상태는 생체외 혈관의 성장과 연관된다. 이들에는 예를 들어, 당뇨병성 망막증, 혈관신생성 녹내장, 건선, 후수정체 섬유증식증, 혈관섬유종, 염증, 재발협착증 등이 포함된다. 또한, 암 및 신생물성 조직과 연관된 증가된 혈액 공급은 성장을 촉진하여 빠른 종양 확대 및 전이를 야기한다. 더구나, 종양에서 새로운 혈관의 성장은 변절한 세포 (renegade cell)를 위한 탈출 경로를 제공하여 전이를 및 이에 따른 암의 확산을 촉진시킨다.
혈관형성을 변조시키는데 유용한 시스템에는 예를 들어, 종양 이식물의 혈관신생 (예를 들어, 미국 특허 제 5,192,744; 6,024,688 호), 닭의 융모요막 (chicken chorioallantoic membrane; CAM) 시험 (예를 들어, Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998), 소의 모세혈관 내피 (bovine capillary endothelial cell assay; BCE) 세포 시험 (예를 들어, 미국 특허 제 6,024,688 호; Polverini, P.J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991), 이동시험 (migration assay) 및 HUVEC (인간 제대혈관 내피세포 (human umbilical cord vascular endothelial cell)) 성장 억제시험 (예를 들어, 미국 특허 제 6,060449 호)이 포함된다. 또한, 림프관형성을 변조시키는데 유용한 시스템에는 예를 들어, 토끼 귀 모델 (예를 들어, Szuba et al., FASEB J., 16(14):1985-7, 2002).
혈관형성의 변조는 어떤 적합한 방법에 의해서라도 측정될 수 있다. 예를 들어, 조직 혈관분포의 정도는 일반적으로 제시된 샘플 내에 존재하는 혈관의 수 및 밀도를 평가함으로써 측정된다. 예를 들어, 미세혈관 밀도 (MVD)는 강확대 현미경시야에서 내피 클러스터의 수를 계수하거나, CD31 (또한, 혈소판-내피세포 유착분자 또는 PECAM)과 같은 미세혈관 내피에 대해서 특이적인 마커 또는 성장하거나 정착된 혈관의 다른 마커를 검출함으로써 평가될 수 있다. CD31 항체는 예를 들어, 문헌 (Penfold et al., Br. J. Oral and Maxill. Surg., 34: 37-41; 미국 특허 제 6,017,949 호; Dellas et al., Gyn. Oncol., 67:27-33, 1997 등)에 기술된 바와 같이 조직 절편을 면역염색하기 위한 통상적인 면역조직화학적 방법에서 사용될 수 있다. 혈관형성에 대한 그 밖의 다른 마커에는 예를 들어, Vezf1 (예를 들어, Xiang et al., Dev. Bio., 206:123-141, 1999), 안지오포이에틴, Tie-1, 및 Tie-2 (예를 들어, Sato, et al., Nature, 376:70-74, 1995)가 포함된다.
본 발명의 약물 조합물은 또한, 염증성 상태, 관상혈관 재발협착증, 종양-연관된 혈관형성, 아테롬성 경화증, 자가면역질환, 염증, 사구체 또는 사구체간질 세포의 증식과 연관된 특정의 신장질환, 및 망막혈관 증식과 연관된 안질환, 건선, 간경화증, 당뇨병, 아테롬성 경화증, 재발협착증, 혈관이식 재발협착증, 스텐트-내 협착증, 혈관형성, 안질환, 폐섬유증, 폐색성 세기관지염, 사구체신염, 류마티스성 관절염과 같은 광범한 부류의 질환의 진행을 치료하거나 예방하는 광범한 치료학적 활성을 갖는다.
본 발명은 또한, 인간 및/또는 다른 포유동물에서 다음의 상태들 중의 하나 또는 그 이상을 치료하거나, 예방하거나, 변조시키는 등의 방법을 제공한다: 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막-정맥 폐색, 미숙아의 망막증 및 연령-관련된 황반변성을 포함한 망막증; 류마티스성 관절염, 건선, 또는 수포성 유사천포창, 다형홍반 또는 포진성 피부염을 포함하는 표피하 수포 형성과 연관된 수포성 장애, 류마티스 열, 골흡수, 폐경기후 골다공증, 패혈증, 그람 음성 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독소 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 전신성 염증반응 증후군, 염증성 장질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 야리쉬-헤륵스하이머 (Jarisch-Herxheimer) 반응, 천식, 성인성 호흡곤란 증후군, 급성 폐섬유증 질환, 폐 유육종증, 앨러지성 호흡기 질환, 규폐증, 탄광부 진폐증, 폐포 손상, 간부전, 급성 염증 중의 간질환, 중증의 알콜성 간염, 말라리아 (플라스모디움 팔시파룸 말라리아 (Plasmodium falciparum malaria) 및 뇌 말라리아), 비-인슐린-의존성 진성당뇨병 (NIDDM), 울혈성 심부전, 심장질환에 의한 손상, 아테롬성 경화증, 알츠하이머병, 급성 뇌염, 뇌손상, 다발성 경화증 (다발성 경화증에서의 수초탈락 및 회돌기교세포 상실), 진행된 암, 림프계 종양, 췌장염, 감염, 염증 및 암에서 손상된 창상 치유, 골수이형성 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 담도 경화증, 장괴사, 방사선 손상/모노클로날 항체의 투여에 의한 독성, 이식편대숙주 반응 (허혈성 재관류 손상 및 신장, 간, 심장 및 피부의 동종이식 거부반응), 폐 동종이식 거부반응 (폐쇄성 기관지염), 또는 고관절 전치환술에 기인한 합병증, 및 결핵, 소화성 궤양 질환 중의 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 감염, 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) 감염으로 인한 샤가병 (Chaga's disease), 이. 콜라이 (E. coli) 감염으로 인한 시가-양 (Shiga-like) 독 소의 영향, 스타필로코커스 감염으로 인한 장독소 A의 영향, 수막염균 감염, 및 보렐리아 버그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 사이토메갈로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 타일러의 (Theiler's) 뇌척수염 바이러스 및 인간 면역결핍성 바이러스 (HIV)의 감염으로부터 선택된 감염성 질환, 유두종, 블라스토글리오마 (blastoglioma), 카포시 육종, 흑색종, 폐암, 난소암, 전립선암, 편평세포암, 성상세포종, 두부암, 경부암, 방광암, 유방암, 결장직장암, 갑상선암, 췌장암, 위암, 간세포암, 백혈병, 림프종, 호지킨병, 버킷병 (Burkitt's disease), 관절염, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막증, 혈관형성, 재발협착증, 스텐트-내 재발협착증, 혈관 이식 재발협착증, 폐섬유증, 간경호, 아테롬성 경화증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 혈전성 미세혈관증 증후군, 이식 거부반응, 건선, 당뇨병, 창상 치유, 염증 및 신경변성 질환, 과면역 (hyperimmune) 장애, 혈관종, 심근성 혈관형성, 관상 및 뇌측부 혈관신생, 허혈증, 각막 질환, 피부조홍, 혈관신생성 녹내장, 미숙아의 황반변성 망막증, 창상 치유, 궤양 헬리코박터 관련 질환, 골절, 자궁내막증, 당뇨병성 상태, 묘소열, 갑상선 과형성, 천식, 또는 화상, 외상, 만성 폐질혼, 졸중, 폴립 (polyps), 낭포, 활막염, 만성 및 앨러지성 염증에 의한 부종, 난소 과자극 증후군, 폐 및 뇌 부종, 켈로이드 (keloid), 섬유증, 경화증, 수근관 증후군, 성인성 호흡곤란 증후군, 복수, 안질환, 심혈관 질환, 크로우-후케이스 (POEMS) 병 (Crow-Fukase disease), 크론병, 사구체신염, 골관절염, 다발성 경화증, 이식 거부반응, 라임병 (Lyme disease), 패혈증, 폰 힙펠-린도우병 (von Hippel Lindau disease), 유천포창, 파제트병 (Paget's disease), 다낭성 신장병, 유육종증, 갑상선염, 과점성 증후군, 오슬러-웨버-랑뒤병 (Osler-Weber-Rendu disease), 만성 폐쇄성 폐질환, 방사선 조사, 저산소증, 자간전증, 기능성자궁출혈, 자궁내막증, 헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex)에 의한 감염, 허혈성 망막증, 각막 혈관형성, 헤르페스 주스터 (Herpse Zoster), 인간 면역결핍성 바이러스, 파라폭스바이러스, 프로토조아, 톡소플라즈모시스, 척추관절염, 강직성 척추염, 베크테로병 (Morbus Bechterew), 예를 들어, 혈청형 H5N1을 포함하는 조류 인플루엔자, 및 종양-연관된 삼출 및 부종.
본 발명은 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 AKT/PI3K 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 전술한 질환 및/또는 상태 (인용된 문헌들 중의 어떤 것에나 언급된 것을 포함)를 치료하는 방법을 제공한다. "유효량"은 원하는 결과를 달성하는데, 예를 들어, 질환 또는 상태를 치료하는데 유용한 화합물의 양이다.
본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 화합물의 유효량의 조합물을 시스템에 투여하는 것을 포함하여, 세포를 포함하는 시스템에서 혈관형성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 세포를 포함하는 시스템은 환자에게서의 종양, 분리된 기관, 조직 또는 세포와 같은 생체내 시스템, 시험관내 시험 시스템 (CAM, BCE 등), 동물 모델 (예를 들어, 생체내 피하, 암 모델), 치료가 필요한 숙주 (예를 들어, 암과 같이 혈관형성성 성분을 갖는 질환을 앓고 있거나; 재발협착증을 겪는 숙주) 등일 수 있다.
또한, 약물 조합물은 다음의 과정들 중의 하나 또는 그 이상을 변조시키기 위해서 투여될 수 있다: 세포 성장 (예를 들어, 증식), 종양세포 성장 (예를 들어, 분화, 세포 성장 및/또는 증식을 포함), 종양 퇴행, 내피세포 성장 (예를 들어, 분화, 세포 생존 및/또는 증식을 포함), 혈관형성 (혈관 성장), 혈관형성 및/또는 조혈 (예를 들어, 증식, T-세포 발생 등).
본 발명의 화합물 또는 약물 조합물은 예를 들어, 경구, 장관외, 장내, 정맥내, 복강내, 국소, 경피 (예를 들어, 어떤 표준 패치라도 사용함), 안내, 비내, 국부, 비-경구, 예를 들어, 에어로졸, 흡입, 피하, 근육내, 협측, 설하, 직장, 질내, 동맥내 및 초내 등을 포함하는 어떤 효과적인 경로에 의해서, 어떤 형태로도 투여될 수 있다. 이들은 단독으로, 또는 활성이거나 비활성인 어떤 성분(들)과의 조합물로도 투여될 수 있다. 이들은 어떤 유효 용량으로도, 예를 들어, 총 체중 ㎏당 약 0.1 내지 약 200 ㎎으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조합물은 어떤 시점에, 어떤 효과적인 형태로도 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물들은 동시에, 예를 들어, 단일 조성물 또는 단위 투약형 (예를 들어, 두 가지 조성물을 함유하는 환제 또는 액체)로 투여될 수 있거나, 이들은 별도의 조성물로 동시에 (예를 들어, 하나의 약물은 정맥내로 투여하고, 다른 것은 경구 또는 근육내로 투여하는 경우) 투여할 수도 있다. 약물은 또한, 상이한 시점에 순차적으로 투여될 수도 있다. 약제들은 연장된 시간에 걸쳐서, 예를 들어, 12-시간, 24-시간에 걸쳐서 원하는 방출율을 달성하도록 통상적으로 제제화될 수 있다. 이것은 적합한 대사적 반감기를 갖는 약제 및/또는 그들의 유도체를 사용하거나, 조절방출 제제를 사용함으로써 달성될 수 있다.
약물 조합물은 상승적으로 작용할 수 있는데, 예를 들어, 약물의 공동작용이 조합효과가 그들 각각의 효과의 대수적 합보다 크도록 할 수 있다. 따라서, 감소된 양의 약물을 투여하여 예를 들어, 독성 또는 그 밖의 다른 유해하거나 원치 않는 효과를 감소시킬 수 있고/있거나, 약제를 단독으로 투여하는 경우에 사용된 것과 동일한 양을 사용하여 더 큰 효능을 달성할 수, 예를 들어, 더 강력한 항증식성 및 전-세포소멸성 작용을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 약물 조합물은 어떤 다른 적합한 첨가제 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 더 조합될 수도 있다. 이러한 첨가제에는 이미 언급된 모든 물질뿐만 아니라 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro and Gennaro, eds, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2000); Theory and Practice of Industrial Pharmacy (Lachman et al., eds., 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins, 1986); Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Swarbrick and Boylan, eds., 2nd edition, Marcel Dekker, 2002)]에 기술된 것과 같은 통상적으로 사용되는 모든 성분들이 포함된다.
또한, 본 발명의 화합물 또는 약물 조합물은 상기 언급된 질환 및/또는 상태를 치료하기 위해서 사용되는 다른 활성 약제 또는 치료법 (예를 들어, 방사선 조사)과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 화학식 I의 화합물, 및 예를 들어, 질환 또는 장애를 치료하는데 유용한 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인, 리스트 A로부터 선택된 하나 이상의 화합물의 조합물을 제공한다. 본 발명의 목적에 따르면, "조합물"에는 다 음이 포함된다:
- 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물을 함유하는 단일 조성물 또는 투약형;
- 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물을 함유하는 조합 팩 (packs);
- 서로 별도로 포장된 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물을, 이들을 동시에 또는 순차적으로 투여하도록 하는 설명서가 있거나 없이, 단위 투약형으로 또는 독립적인 단위 투약형으로 포함하는 키트; 및
- 동시에 또는 순차적으로 투여한 경우에 치료학적 효과, 예를 들어, 동일한 질환의 예방 또는 치료를 달성하도록 협력하는 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물의 별개의 독립적인 투약형.
조합물의 각각의 약제의 투약량은 원하는 치료학적 활성을 제공하기 위하여 질환 및/또는 질환 상태의 유형 및/또는 그 밖의 다른 것들을 참고로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 조합물 중에서 활성 약제는 고정된 조합물로 존재하여 투여될 수 있다. "고정된 조합물"이란 여기에서 성분들이 원하는 효능을 제공하는 고정된 비로 존재하는 약제학적 형태를 의미하는 것이다. 이들 양은 개개 환자에 대해서 일상적으로 결정될 수 있는데, 여기에서는 다양한 파라메터를 이용하여 적절 한 용량이 선택되거나 (예를 들어, 암의 유형, 환자의 연령, 질환 상태, 환자 건강, 체중 등), 양은 비교적 표준일 수 있다.
조합물은 어느 하나의 화합물을 단독으로 사용하는 경우에 비해서 더 큰 치료학적 효능을 달성하는 유효량의 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물을 포함할 수 있다. 조합물은 종양 퇴행을 생성시키거나, 질환 안정성을 발생시키거나, 전이를 방지 또는 감소시키거나, 약제를 단독으로 사용한 경우에는 치료학적 효과가 관찰되지 않거나 조합물을 투여한 경우에 증진된 효과가 관찰되는 다른 치료학적 종말점을 제공하는데 유용할 수 있다.
조합물 내에서의 각각의 화합물의 상대적 비는 그들 각각의 작용 기전 및 질환 생물학을 기준으로 선택될 수 있다. 예를 들어, B-RAF 유전자의 활성화 돌연변이는 인간 흑색종의 60％ 이상에서 관찰되며, 흑색종의 치료를 위한 조성물은 유리하게는 화학식 I의 화합물을 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 화합물보다 더 강력한 양으로 포함할 수 있다. 비교하여, 암이 PI3K/AKT 시그날링 경로에서의 돌연변이와 연관된 경우에는 (예를 들어, 난소 및 유방암)이 시그날링 경로에서 활성을 갖는 약제가 Ref/MEK/ERK 경로 억제제에 비해서 더 강력한 양으로 존재할 수 있다. 각각의 화합물의 상대적 비는 광범하게 변화할 수 있으며, 본 발명은 화학식 I의 화합물 및 제 2 활성 약제의 양을 어느 하나가 더 다량으로 존재하도록 일상적으로 조정할 수 있는 암 치료용 조합물을 포함한다.
조합물의 하나 또는 그 이상의 약제의 방출은 또한, 경우에 따라서, 단일 투 약형, 조합 팩, 키트로, 또는 별도의 독립적 투약형으로 존재하는 경우에 원하는 치료학적 활성을 제공하도록 조절될 수 있다.
시험방법
본 발명의 조합물의 활성은 효과적인 시험관내 또는 생체내 방법에 따라서 측정될 수 있다.
키나제 활성
키나제 활성은 통상적인 시험방법을 사용하여 일상적으로 측정될 수 있다. 키나제 시험은 일반적으로 키나제 효소, 기질, 완충제, 및 검출 시스템의 성분들을 포함한다. 대표적인 키나제 시험은 단백질 키나제와 펩타이드 기질 및 32P-ATP와 같은 ATP의 반응으로 포스포릴화된 최종-생성물 (예를 들어, 펩타이드 기질이 사용된 경우에는 포스포프로테인)을 생성하는 것을 수반한다. 생성된 최종-생성물은 어떤 적합한 방법에 의해서도 검출될 수 있다. 방사성 ATP가 사용되는 경우에, 방사성 표지된 포스포프로테인은 친화성 막 또는 겔 전기영동을 사용하여 미반응된 감마-32P-ATP로부터 분리하여, 자가방사기록법을 사용하여 가시화하거나 섬광계수기로 검출할 수 있다. 비-방사성 방법이 사용될 수도 있다. 이 방법은 포스포릴화된 기질, 예를 들어, 안티-포스포타이로신 항체를 인식하는 항체를 이용할 수 있다. 예를 들어, 키나제 효소는 기질을 포스포릴화시키는 효소에 대해 효과적인 조건 하에서 ATP 및 키나제 완충제의 존재 하에 기질과 함께 배양할 수 있다. 반응 혼합물은 예를 들어, 전기영동적으로 분리시킬 수 있으며, 그 다음에 기질의 포스 포릴화는 예를 들어, 안티-포스포타이로신 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅에 의해서 측정할 수 있다. 항체는 검출가능한 표지물, 예를 들어, HRP와 같은 효소, 아비딘 또는 비오틴, 화학발광성 시약 등으로 표지될 수 있다. 그 밖의 다른 방법은 ELISA 체제, 친화성 막분리, 형광 편광측정법, 발광측정법 등을 이용할 수 있다.
방사성 체제에 대한 대용법은 시간-분해 형광 공명 에너지 전달 (time-resolved fluorescence resonance energy transfer; TR-FRET)이다. 이 방법은 기질, 예를 들어, 비오티닐화된 폴리(GluTyr)을 ATP의 존재 하에서 단백질 키나제로 포스포릴화시키는 표준 키나제 반응에 따른다. 그 후에, 최종-생성물은 유로피움 킬레이트 포스포특이적 항체 (안티-포스포타이로신 또는 포스포세린/트레오닌), 및 비오티닐화된 기질을 결합시키는 스트렙타비딘-APC에 의해서 검출될 수 있다. 이들 두 가지 성분은 결합시에 공간적으로 함께 접촉하며, 포스포특이적 항체로부터 수용체 (SA-APC)로의 에너지 전달은 균질한 체제에서 형광성 리드아웃 (readout)을 발생시킨다.
Raf / MEK / ERK 활성
c-Raf 키나제 측정시험은 Lck 키나제에 의해서 활성화된 (포스포릴화된) c-Raf 효소를 사용하여 수행될 수 있다. Lck-활성화된 c-Raf (Lck/c-Raf)는 Sf9 곤충세포에서 그 세포를 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에, GST-c-Raf (아미노산 302부터 아미노산 648까지) 및 Lck (전체-길이)를 발현하는 바큘로바이러스로 공동-감염시킴으로써 생산된다. 두 가지 바큘로바이러스는 모두 2.5의 감염 중복도 (multiplicity of infection)로 사용되며, 세포는 감염시킨 지 48시간 후에 수거한 다.
MEK-1 단백질은 Sf9 곤충세포에서 그 세포를 GST-MEK-1 (전체-길이) 융합 단백질을 발현하는 바큘로바이러스에 의해서 5의 감염 중복도 감염시키고, 감염시킨 지 48 시간 후에 세포를 수거함으로써 생산된다. 유사한 정제과정을 GST-c-Raf 302-648 및 GST-MEK-1에 대해서 사용된다.
형질감염된 세포를 10 mM 인산나트륨, 140 mM 염화나트륨 pH 7.3, 0.5％ 트리톤 X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 완충제 중에서 ㎖당, 100 ㎎의 습윤 세포 생물량 (wet cell biomass)으로 현탁시킨다. 세포를 폴리트론 균질화기로 붕괴시키고, 30 분 동안 30,000 g으로 원심분리한다. 30,000 g 상등액을 GSH-세파로즈 상에 적용한다. 수지를 50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.01％ 트리톤 X-100을 함유하는 완충제로 세척한다. GST-태그 (tag)를 붙인 단백질을 100 mM 글루타치온, 50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.01％ 트리톤 X-100을 함유하는 용액으로 용출시킨다. 정제된 단백질을 20 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl 및 20％ 글리세롤을 함유하는 완충액 내로 투석한다.
시험화합물은 DMSO 중에서 일반적으로 50 μM 내지 20 nM의 원액 농도로 3-배 희석을 사용하여 계열 희석한다 (예를 들어, 시험에서의 최종 농도는 1 μM 내지 0.4 nM의 범위일 수 있다). c-Raf 생화학적 시험은 96-웰 코스타 (Costar) 폴리프로필렌 플레이트 (Costar 3365)에서 방사성 필터매트 시험 (radioactive filtermat assay)으로 수행한다. 플레이트를 50 mM HEPES pH 7.5, 70 mM NaCl, 80 ng의 Lck/c-Raf 및 1 ㎍ MEK-1을 함유하는 75 ㎕의 용액으로 부하시킨다. 이어서, ATP를 첨가하기 전에 2 ㎕의 계열 희석된 개개 화합물을 반응에 첨가한다. 반응은 5 μM ATP 및 0.3 μCi [33P]-ATP를 함유하는 25 ㎕ ATP 용액에 의해서 개시시킨다. 플레이트를 밀봉하고, 32℃에서 1 시간 동안 배양한다. 반응을 50 ㎕의 4％ 인산을 첨가하여 켄칭하고, 월락 톰테크 하베스터 (Wallac Tomtec Harvester)를 사용하여 P30 필터매트 상에서 수거한다. 필터매트를 일차는 1％ 인산으로, 이차는 탈이온화 H2O로 세척한다. 필터를 마이크로웨이브 중에서 건조시키고, 섬광 유체에 침지시켜 월락 1205 베타플레이트 계수기 (Wallac 1205 Betaplate Counter; Wallac Inc., Atlanta, GA, U.S.A.)에서 판독한다. 결과는 억제율 ％로 표현한다.
억제율 ％ = [100-(Tib/Ti)]×100
여기에서,
Tib = (억제제 존재하에서의 분당 계수) - (배경량)
Ti = (억제제 부재하에서의 분당 계수) - (배경량)
Raf 활성은 또한, ERK 포스포릴화를 유도하는 캐스케이드 (cascade) (즉, raf/MEK/ERK)를 개시시켜 포스포-ERK를 제공하는 그의 능력에 의해서 모니터될 수 있다. 바이오-플렉스 (Bio-Plex) 포스포-ERK1/2 면역측정시험은 다음과 같이 수행될 수 있다:
레이저 유세포분석 플랫폼 (laser flow cytometry platform)을 사용한 96-웰 포스포-ERK (pERK) 면역측정법은 세포 라인에서 기본적 pERK의 억제를 측정하기 위해서 확립되었다. MDA-MB-231 세포를 완전 성장배지 중의 96-웰 미량역가 플레이 트에서 웰당 50,000 세포로 플레이팅한다. 기본적 pERK1/2 억제에 대한 시험 화합물의 효과에 대해서는, 플레이팅한 다음 날에 MDA-MB-231 세포를 0.1％ BSA를 함유하는 DMEM 에 옮기고, 0.1％ DMSO 중에서 3 mM 내지 12 mM의 최종 농도로 1:3 희석된 시험 화합물과 함께 배양한다. 세포를 2 시간 동안 시험 화합물과 함께 배양하고, 세척하고, 바이오-플렉스 전세포 용해 완충액 A 내에서 용해시켰다. 샘플을 완충액 B 1:1 (v/v)로 희석하고, 직접 시험 플레이트에 옮기거나, 처리할 때까지 -80℃에서 동결시킨다. 50 ㎖의 희석된 MDA-MB-231 세포 용해물을 실온에서 안티-ERK1/2 항체와 컨쥬게이트된 5 미크론 바이오-플렉스 비드 약 2000 개와 함께 진탕기 상에 밤새 배양한다. 다음 날, 비오티닐화된 포스포-ERK1/2 샌드위치 면역측정법을 수행하고, 비드를 각각의 배양 중에 3 회 세척한 다음, 현색제로서 50 ㎖의 PE-스트레파비딘을 사용한다. pERK1/2의 상대적 혈광단위는 고감도의 바이오-플렉스 유동 세포 (프로브)에 의해서 25 개의 비드를 계수함으로써 검출된다. IC50은 최대치로 비처리된 세포를, 배경량으로 세포 부재 (비드 단독)를 채택함으로서 계산된다.
포스파티딜이노시톨 3- 키나제 활성
PKI3 활성은 예를 들어, 시판품으로 이용가능한 키트 (예를 들어, Perkin-Elmer, FlashPlate Platform)를 사용하여 일상적으로 측정될 수 있다 (Frew et al., Anticancer Res., 14(6B):2425-8, 1994). 또한, PKI3 억제제에 대해 기술된 문헌들도 참고로 한다.
Akt 활성
AKT는 WO 05011700에 기술된 바와 같이 His-태그를 붙인 AKT1 (aa 136-480)를 발현하는 곤충세포로부터 분리할 수 있다. 발현 세포를 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.5 중에서 폴리트론을 사용하여 용해시킨다 (5 ㎖ 용해 완충액/세포 g). 세포 파편을 28,000×g으로 30 분 동안 원심분리하여 제거한다. 상등액을 4.5 미크론 필터를 통해서 여과한 다음에, 용해 완충액으로 전-평형화시킨 니켈-킬레이트화 칼럼 상에 부하시킨다. 칼럼을 5 칼럼 용적 (column volumes; CV)의 용해 완충액으로 세척한 다음에, 5 CV의 20％ 완충액 B (여기에서, 완충액 B는 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 300 mM 이미다졸; pH 7이다)로 세척한다. His-태그를 붙인 AKT1 (aa 136-480)을 10 CV에 걸쳐서 완충액 B의 20-100％ 선형 구배로 용출시킨다. His-태그를 붙인 AKTI (136-480) 용출 분획을 모아서 완충액 C (여기에서, 완충액 C는 25 mM HEPES, pH 7이다)로 3-배 희석한다. 그 후, 샘플을 완충액 C로 전-평형화된 Q-세파로즈 HP 칼럼 상에서 크로마토그라피한다. 칼럼을 5 CV 완충액으로 세척한 다음에 5 CV 10％ D, 5 CV 20％ D, 5CV 30％ D, 5 CV 50％ D 및 5 CV의 100％ D로 단계적 용출시키는데, 여기에서 완충액 D는 25 mM HEPES, 1000 mM NaCl; pH 7.5이다.
His-태그를 붙인 AKT1 (aa 136-480) 함유 분획을 모아서 10-kDa 분자량 컷오프 농축기에서 농축시킨다. His-태그를 붙인 AKT1 (aa 136-480)을 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 1 mM DTT; pH 7.5로 전-평형화된 슈퍼덱스 (Superdex) 75 겔여과 칼럼 상에서 크로마토그라피한다. His-태그를 붙인 AKT1 (aa 136-480) 분획을 SDS-PAGE 및 질량분석을 사용하여 검사한다. 단백질을 모아서 농축시키고, 80℃에서 저장한다.
His-태그를 붙인 AKT2 (aa 138-481) 및 His-태그를 붙인 AKT3 (aa 135-479)를 유사한 방식으로 분리하여 정제할 수 있다.
AKT 효소 측정시험 화합물은 기질 포스포릴화 측정시험에서 AKT 단백질 세린 키나제 억제활성에 대해 시험할 수 있다. 이 측정시험은 펩타이드 기질의 세린 포스포릴화를 억제하는 소분자 유기 화합물의 능력을 검사하는 것이다. 기질 포스포릴화 측정시험은 AKT 1, 2 또는 3의 촉매적 영역을 사용한다. AKT 17 2 및 3은 또한, 업스테이트 유에스에이, 인코포레이티드 (Upstate USA, Inc.)로부터 시판품을 이용할 수 있다. 이 방법은 감마-포스페이트가 ATP로부터 비오티닐화된 합성 펩타이드 (비오틴-ahx-ARKRERAYSFGHHA-아미드)의 세린-72 잔기 상으로 전이하는 것을 촉진시키는 분리된 효소의 능력을 측정하는 것이다. 기질 포스포릴화는 WO 05011700에 기술된 다음의 방법에 의해서 검출될 수 있다.
측정시험은 384 웰 U-바닥 백색 플레이트에서 수행된다. 10 nM 활성화된 AKT 효소를 100％ DMSO 중에 50 mM MOPS, pH 7.5, 20 mM MgCl2, 4 μM ATP, 8 μM 펩타이드, 0.04 μCi [g-33P] ATP/웰, 1 mM CHAPS, 2 mM DTT 및 1 ㎕의 시험 화합물을 함유하는 시험 용적 중에서 실온으로 40 분 동안 배양한다. 반응은 50 ㎕ SPA 비드 혼합물 (Mg2+ 및 Ca2+를 함유하지 않는 둘베코 (Dulbecco)의 PBS, 0.1％ 트리톤 X-100, 5 mM EDTA, 50 μM ATP, 2.5 ㎎/㎖ 스트렙타비딘-코팅된 SPA 비드)을 첨가하여 중지시킨다. 플레이트를 밀봉하고, 비드를 밤새 침강하도록 둔 다음에, 플 레이트를 팩카드 톱카운트 마이크로플레이트 섬광계수기 (Packard Topcount Microplate Scintillation Counter; Packard Instrument Co., Meriden, CT)에서 계수하였다.
용량 반응에 대한 데이타는 화합물의 농도에 대비한 데이타 감소식 100*(U1-C2)/(C1-C2)에 의해서 계산된 제어율 ％ (Control ％)로 도시될 수 있으며, 여기에서 U는 미지의 값이며, C1은 DIVISO에 대해서 수득된 평균 제어값이고, C2는 0,1 M EDTA에 대해서 수득된 평균 제어값이다. 데이타는 y = ((Vmax*x)K+x))로 기술되는 곡선에 부합하며, 여기에서 Vmax는 상위 점근선이고, K는 IC50이다.
세포 증식
세포 증식시험의 예는 이하의 실시예에 기술된다. 그러나, 증식시험은 어떤 적합한 방법에 의해서나 수행될 수 있다. 예를 들어, 유방암 세포 증식은 다음과 같이 수행될 수 있다. 다른 유형의 세포가 MDA-MB-231 세포 라인에 대해서 대체될 수 있다.
인간 유방암 세포 (MDA MB-231, NCI)를 가습된 배양기 내에서 5％ CO2 (vol/vol) 하에 37℃에서 10％ 열-불활성화된 FBS가 보충된 표준 성장배지 (DMEM) 내에서 배양한다. 세포를 96 웰 배양접시 내에서 90 ㎕ 성장 배지 내에 웰당 3000 세포의 밀도로 플레이팅한다. TOh CTG 값을 측정하기 위해서, 플레이팅한 지 24 시간 후에, 각각의 웰에 100 ㎕의 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo) 발광시약 (Promega)을 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 배양한다. 발광을 월락 빅터 (Wallac Victor) II 장치 상에서 기록한다. 셀타이터-글로 시약은 세포 용해, 및 존재하는 세포의 수에 또한 정비례하는 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 시그날의 생성을 야기한다.
시험 화합물을 100％ DMSO에 용해시켜 10 mM 원액을 제조한다. 원액을 성장배지 내에서 1:400으로 더 희석하여 0.25％ DMSO 중의 25 μM 시험 화합물의 작업용 원액을 수득한다. 시험 화합물을 0.25％ DMSO를 함유하는 성장배지 내에서 계열 희석하여 모든 웰에 대해서 일정한 DMSO 농도를 유지시킨다. 60 ㎕의 희석된 시험 화합물을 각각의 배양 웰에 첨가하여 180 ㎕의 최종 용적을 수득한다. 개별적인 시험 화합물의 존재 및 부재 하의 세포를 72 시간 동안 배양하는데, 이 시기에 ATP 의존성 발광을 전술한 바와 같이 측정하여 T72h 값을 수득한다. 임의로, IC50 값은 화합물 농도 대비 억제율 ％를 사용하는 최소자승 분석 프로그램에 의해서 결정될 수 있다.
억제율 ％ = [1-(T72h test - T0h)/(T72h ctrl-T0h)]×100
여기에서,
T72h test = 시험 화합물의 존재 하의 72 시간에 ATP 의존성 발광
T72h ctrl = 시험 화합물의 부재 하의 72 시간에 ATP 의존성 발광
T0h = 시간 0에서의 ATP 의존성 발광.
혈관형성
혈관형성을 시험하는 한가지 유용한 모델은, 성장인자 (예를 들어, FGF-I)가 보충된 매트리겔 (Matrigek)과 같은 재구성된 기저막 매트릭스를 숙주 동물에게 피하 주사한 경우에 내피세포가 매트릭스 내로 보강되어 며칠의 기간에 걸쳐서 새로운 혈관을 형성한다는 관찰결과를 기초로 한다 (참조예: Passaniti et al., Lab . Invest., 67:519-528, 1992). 다양한 시점에서 추출물의 샘플을 취하여 혈관형성을 일시적으로 세밀히 조사하여 예를 들어, 내피세포의 매트릭스 내로의 이동, 혈관형성 경로에 대한 내피세포의 참여, 세포 연장 및 주머니 모양의 공간의 형성, 및 적혈구를 함유하는 연결된 선형 구조를 포함하는 기능적 모세관의 정착을 포함하는 혈관형성의 모든 단계에 수반된 유전자를 확인할 수 있다. 성장인자를 안정화시키고/시키거나, 매트릭스로부터의 그의 방출을 느리게 하기 위하여, 성장인자를 헤파린 또는 또 다른 안정화제에 결합시킬 수 있다. 매트릭스는 또한, 주기적으로 성장인자를 재주입하여 혈관형성 과정을 증진 및 연장시킬 수 있다.
혈관형성을 시험하는데 유용한 그 밖의 다른 시스템에는 예를 들어, 종양 이식물의 혈관신생 (예를 들어, 미국 특허 제 5,192,744; 6,024,688 호), 닭의 융모요막 (CAM) 시험 (예를 들어, Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998), 소의 모세혈관 내피 (BCE) 세포 시험 (예를 들어, 미국 특허 제 6,024,688 호; Polverini, P.J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991), 이동시험 및 HUVEC (인간 제대혈관 내피세포) 성장 억제시험 (예를 들어, 미국 특허 제 6,060449 호)이 포함된다.
본 발명은 다음의 특징들 중의 하나 또는 그 이상을 제공한다:
하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 언급된 질환 및/또는 상태를 치료하는 방법.
하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 하나 또는 그 이상의 상기 언급된 활성을 변조시키는 (예를 들어, 억제하는) 방법.
하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물을 포함하는 조성물.
더 상세함이 없이도, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 선행하는 설명을 사용하여 본 발명을 그의 최대 범위까지 이용할 수 있는 것으로 믿어진다. 따라서, 바람직한 특정의 구체예는 단순히 예시적인 것으로 해석되며 기술내용의 나머지를 어떤 것도 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되지는 않는다. 상기 및 이하에서 인용된 모든 특허 및 문헌들의 전체 기술내용은 온전히 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간 세포의 분리 및 배양
충분한 설명에 입각한 동의를 받은 후에, 인간 섬유아세포를 일상적인 환상절개 (circumcision)에 따라서 인간 포피로부터 분리하였다. 피부 샘플을 페니실린, 겐타마이신 및 암포테리신을 함유하며 Ca2+ 또는 Mg2+가 없는 행크의 균형 염용액 (Hank's balanced salt solution) (HBSS w/o Ca2+ 또는 Mg2+) 중에서 4℃에서 저장하였다. 피하지방을 제거하고, 나머지 피부를 조각으로 절단하고, 활성성분으로서 0.25％ 트립신을 함유하는 용액 B (12) 중에서 약 19 시간 동안 4℃에서 분해시켰다. 트립신의 작용은 용액 A (12)로 정지시키고, 그에 이어서 표피를 진피로부터 분리시켰다. 인간 섬유아세포를 인간 포피의 피부 이식물로부터 수득하여, 10％ 태자소혈청 (FBS)을 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) 중에서 배양하였다. 7 계대까지의 섬유아세포가 흑색종 재구성물을 위해서 사용되었다. Skme128 (13) 및 451Lu (14) 전이성 인간 흑색종 세포를 각각 10％ FBS가 보충된 RPMI 1640 배지, 및 5 ㎍/㎖ 인슐린 및 2％ FBS를 함유하는 MCDB153/L15 배지에서 배양하였다 (15).
전이성 흑색종의 시험관내 재구성
전이성 흑색종의 시험관내 재구성은 기관형적 인간 피부 배양기술 (14)을 기초로 한다. 10％ FBS를 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배지 중에서 1.35 ㎎/㎖의 최종 농도의 랫트 꼬리 콜라겐 제 I 형 (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)으로 구성된 세포-부재의 완충된 콜라겐 용액을 제조하였다. 1.0 ㎖의 세포-부재 콜라겐 용액을 6-웰 조직배양 플레이트 내에 배치된 조직배양 삽입물 (tissue culture insert) (Millicell PC, Millipore, Bedford, MA, USA)에 첨가하였다. 무세포성 콜라겐 층을 고화시키면서, 제 2 콜라겐 용액을 인간 섬유아세포 및 흑색종 세포 SKMEL28 또는 451LU를 첨가하여 첫번째와 유사하게 제조하였다. 융합하 배양물 (subconfluent culture)로부터의 인간 섬유아세포 및 인간 흑색종 세포를 트립신 처리하고, 세척하고, 15×105/㎖의 밀도 및 1:1의 섬유아세포 대 흑색종 세포 비로 제 2 콜라겐 용액에 재현탁시켰다. 3.0 ㎖의 섬유아세포 및 흑색종 세포-함유 콜라겐 용액을 고화된 무세포성 콜라겐 층 상에 배치하였다. 37℃에서 배양 5일 후에, 섬유아세포 수축력은 콜라겐 겔이 수축하도록 야기한다. 이 구조는 피부 등가물에서 흑색종 재구성물을 나타낸다. 침액 배양조건을 위해서는 10％ FBS가 보충된 3 ㎖의 흑색종 세포 배양 배지를 삽입물의 아래에, 2 ㎖를 삽입물의 내부에 첨가하여 접종된 세포의 증식이 이루어지도록 하였다. 배양 배지는 매 2일 마다 교환하였다. 10 내지 14일의 침액 배양 후에, 흑색종 재구성물을 수거하여 평가하였다.
시그날링 경로 억제제에 의한 흑색종 세포의 처리
AKT 및 MAPK 시그날링 경로의 차단을 위해서, PI3K 억제제 워르트만닌 (Sigma, Steinheim, Germany) 및 BAY 43-9006을 단독으로 또는 조합물로 단층 배양물 중의 흑색종 재구성물 또는 흑색종 세포의 배양 배지에 각각 4 μM 및 6 μM로 직접 첨가하였다. 이들 농도는 흑색종 세포 6 (16)에 대해서 효과적인 것으로 이미 기술되었다. 배양 배지는 매 2일 마다 교환하였다. 배양 배지 또는 DMSO가 첨가된 배양 배지로 처리된 흑색종 재구성물은 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 이중으로 수행되었으며, 2 회 반복하였다.
면역조직화학
흑색종 재구성물을 4％ 포름알데히드로 8-9시간 동안 고정시키고, 탈수시키 고, 파라핀 내에 포매하였다. 파라핀 절편을 일상적인 광학 현미경검사를 위해서 헤마톡실린으로 염색하였다. 면역조직화학을 위해서, 흑색종 재구성물의 파라핀 절편을 포스포-AKT (Ser473) 및 포스포-ERK (포스포-p44/42 MAP 키나제, Thr202/Tyr204) (New England Biolans, Frankfurt am Main, Germany), 증식 마커로서 Ki-67 (Dianova, Hamburg, Germany), 활성 카스파제 3에 대한 폴리클로날 항체 (R&D Systems, Wiesbaden, Germany), 또는 β3 인테그린 서브유니트 17 및 MelCAM에 대한 모노클로날 항체 (Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK)와 함께 배양하였다. 절편을 PBS로 세척하고, 실온에서 30 분 동안 각각의 이차 항체 (Vector, Burlingame, CA)와 함께 배양하였다. PBS로 더 세척한 후에, 절편을 벡타스타틴 (Vectastatin®) ABC-AP 시스템 (Vector, Burlingame, CA)과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 절편을 다시 PBS로 세척하고, 뉴푹신 (neufuchsin)으로 발색시키고, 헤마톡실린으로 대비염색하였다.
증식 측정시험
세포를 150 ㎕ 배지 중에서 웰당 1,500 세포의 밀도로 96 웰 플레이트 내에 삼중으로 접종하였다 (1×104 세포/㎖). PI3K 억제제 워르트만닌 (Sigma, Steinheim, Germany)을 배양 배지에 2-20 μM 범위의 농도로 직접 첨가하였다. BAY 43-9006은 0.-7 μM 범위의 농도로 배양 배지에 직접 첨가하였다. 배양 배지, 배양 배지로 처리된 세포, DMSO를 첨가한 배양 배지로 처리한 세포가 대조군으로 사용되었다. 측정시험은 지시된 시점에서 시작하였다. 배지를 버리고, 각각의 웰 을 PBS (Ca2+ 및 Mg2+ 부재)로 2 회 세척하고, PBS의 ㎖당, 100 ㎍의 MUH (4-메틸움벨리페릴-헤파노에이트)를 함유하는 100 ㎕의 용액을 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 37℃에서 배양하고, 플루오로스캔 II (Fluoroskan II; Labsystems, Helsinki)에서 355 ㎚의 λem 및 460 ㎚의 λex로 측정하였다. 형광의 강도는 웰 내의 생존세포의 수를 나타낸다 (18,19).
유세포분석방법
1×105-1×106 451Lu 전이성 흑색종 세포의 표면 단백질을 다음과 같이 염색하였다: 세포를 5 분 동안 1,800 rpm (Heraeus variofuge 3.OR)으로 펠릿화하고, 1×PBS/1％ BSA로 차단하고, 원심분리한 후에 Mel-CAM (QBiogene-Alexis) 또는 avβ3 인테그린 (BD Biosciences, Heidelberg)에 대한 항체와 함께 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 세포를 1×PBS/1％ BSA로 세척하고, 이어서 안티 마우스 IgG-FITC (BD Biosciences, Heidelberg) 또는 마우스 IgG-이소타입 대조-FITC 단독 (BD Biosciences, Heidelberg)과 함께 배양하였다. 세포를 세척하고 펠릿화한 후에, 세포 펠릿을 1×PBS에 재현탁시키고, FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg)에서 측정하였다.
결과
MAPK 또는 AKT 시그날링 경로의 차단은 흑색종 세포 성장 및 유착 수용체 발현에 대하여 상이한 효과를 유도한다.
MAPK 또는 AKT 시그날링 경로 중의 어느 하나 또는 둘 다를 함께 억제하는 것이 흑색종 세포의 증식에 대해서 미치는 영향을 분석하기 위해서, 본 발명자들은 단일층 내의 전이성 흑색종 세포 라인 451Lu를 PI3K 억제제 워르트만닌, BAY 43-9006, 또는 둘 다를 함께 사용하여 처리하였다. 이전의 시험 (6-16)을 기초로 하여, 본 발명자들은 작업농도로서 4 μM 워르트만닌 및 6 μM BAY 43-9006을 선택하였다.
세포 증식에 대한 이들 시그날링 경로의 억제의 효과는 4-메틸움벨리페릴 헵타노에이트 (MUH)를 사용한 형광분석법에 의해서 측정하였다 (18,19). 대조용 451Lu 전이성 흑색종 세포, 및 2-20 μM 범위의 용량의 PI3K 억제제 워르트만닌으로 처리한 451Lu 전이성 흑색종 세포로부터의 단일층 배양물을 비교한 경우에 증식성 세포의 수에 대한 효과는 거의 또는 전혀 나타나지 않았다 (도 1A). 이와는 달리, 451Lu 세포의 증식율은 1-7 μM 범위의 용량의 BAY 43-9006으로 처리한 후에 현저하게 감소하였다 (도 1B). 유사한 결과는 Skme128 전이성 흑색종 세포에 의해서 수득되었다. 이것은 AKT 시그날링 경로의 차단이 아닌 MAPK 시그날링 경로의 차단이 단일층에서 흑색종 세포 증식을 억제함을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 이들 시그날링 경로의 억제가 흑색종 세포 침습에서 주된 역할을 하는 것으로 알려진 유착분자 MelCAM 및 avβ3의 발현에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 451Lu 전이성 흑색종 세포에서 MelCAM 및 avβ3 인테그린 발현에 대한 PI3K 억제제 워르트만닌 및 BAY 43-9006의 효과는 처리를 시작한 지 96 시간 후에 유세포분석방법에 의해서 분석하였다 (도 2). 흥미롭게도, AKT의 차단은 avβ3 인테그린이 아닌 유착분자 MelCAM의 발현을 하향조절하는 반면에, ERK 의 차단은 MelCAM이 아닌 avβ3 인테그린의 발현을 하향-조절한다. 유사한 효과는 Skme128 전이성 흑색종 세포에 의해서 나타났다.
AKT 시그날링 경로가 아닌 MAPK 시그날링 경로의 차단은 인간 피부 재구성물에 서 흑색종 세포의 증식을 억제한다.
PI3K/AKT 시그날링 경로 및 RAS/RAF/MEK/ERK 시그날링 경로의 억제가 생리학적 관계에서 흑색종 성장 및 생존에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 측정하기 위해서, Skme128 전이성 흑색종 세포를 인간 피부 재구성물에 혼입시켰다. 재구성된 전이성 흑색종을 4 μM 워르트만닌, 6 μM BAY 43-9006 또는 BAY 43-9006와 조합된 워르트만닌으로 처리하였다. 억제제를 배양 배지에 2-3 주일 동안 격일로 첨가하였다. 이들 억제제 농도는 각각 포스포릴화된 AKT 또는 ERK에 대한 면역조직화학에 의해서 나타난 바와 같이, AKT 또는 MAP-키나제 경로의 포스포릴화의 억제에 효과적이었다. 억제제의 항-증식성 효과를 평가하기 위해서, 흑색종 재구성물을 Ki-67 증식 마커에 대해서 염색하였다. 도 3A에서 볼 수 있는 바와 같이, 억제제로 처리하지 않거나, 단지 DMSO로 처리한 Skme128 전이성 흑색종 세포의 대부분은 피부 재구성물에서 증식하였다. 워르트만닌으로 처리된 전이성 흑색종 재구성물에서는 증식율에 대한 효과가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다 (도 3B). 이와는 달리, BAY 43-9006에 의한 처리는 세포 증식에서 현저한 감소를 제공하였다 (도 3C). Skme128 전이성 흑색종 세포를 피부 재구성물에 혼입시키고, 억제제의 조합물로 처리한 경우에, Skme128 흑색종 세포의 증식은 완전히 차단되었다 (도 3D). 이들 데이타는 BAY 43-9006가 단일층에서 뿐만 아니라 생리학적 관계에서도 전이성 흑색종 세포의 성장을 제한하며, PI3K 및 MAPK 시그날링 경로의 조합된 억제는 흑색종 세포 증식을 완전히 저지함을 시사한다.
AKT 및 MAPK 시그날링 경로의 차단은 피부 재구성물에서 흑색종 세포의 세포소멸을 유도한다.
기관형적 배양에서 흑색종 세포 생존에 대한 PI3K 억제제 워르트만닌 및/또는 BAY 43-9006의 효과를 조사하기 위하여, 대조용 및 억제제-처리된 Skme128 전이성 흑색종 재구성물을 진행중인 세포소멸에 대한 마커로서 활성 카스파제 3에 대해서 염색하였다. 피부 재구성물 내에 혼입된 대조용 Skme128 전이성 흑색종 세포의 대부분은 세포질에서 활성 카스파제 3에 대해서 음성이었다 (도 4A). 이와는 달리, 활성 카스파제 3은 PI3K 억제제 워르트만닌 (도 4B) 또는 BAY 43-9006 (도 4C) 또는 둘 다 (도 4D)로 처리한 인간 피부 재구성물 내의 Skme128 전이성 흑색종 세포의 대부분에서 발견되었다. 이들 관찰결과는 전이성 흑색종 세포의 생존에 AKT 및 MAPK 시그날링 경로 둘 다가 연루됨을 시사한다.
AKT 및 MAPK 시그날링 경로의 차단은 피부 재구성물 내의 전이성 흑색종 세포에서 각각 유착분자 MelCAM 및 av β3 인테그린의 발현을 하향조절한다.
본 발명자들 및 그 밖의 연구자들은 이전에, 유착분자 MelCAM 및 avβ3 인테그린이 흑색종 진행 및 침습에 주된 역할을 하는 것을 기술하였다 (9,6,10,11). 따라서, 본 발명자들은 MelCAM 및 avβ3 인테그린 발현에 대한 AKT 및 RAF를 차단하는 것의 효과를 검사하였다. 생리학적 관계에서 수용체 발현을 분석하기 위해서, 전이성 흑색종 세포 Skme128 및 WM451Lu를 인간 피부 재구성물 내에 혼입시키 고, PI3L 억제제 워르트만닌 (4 μM), BAY 43-9006 (6 μM), 또는 두 가지 억제제의 조합물로 처리하였다. 대조용 및 억제제-처리된 전이성 흑색종 재구성물을 각각 유착분자 MelCAM (도 5A-D) 및 β3 인테그린 (도 5E-H)에 대해서 염색하였다.
워르트만닌 처리는 MelCAM의 발현을 하향조절한 반면에, β3 인테그린의 발현에는 영향을 미치지 않았다 (도 5A-H). 다른 한편으로, β3 인테그린 발현은 BAY 43-9006 처리에 의해서 현저하게 감소한 반면에, MelCAM 발현은 영향을 받지 않았다. 두 가지 억제제 모두에 의한 처리는 MelCAM 및 β3 인테그린 발현의 하향조절을 제공하였다. 이들 데이타는 두 가지 시그날링 경로인 PI3K/AKT 및 MAP-키나제 경로가 차단되어 두 가지 유착분자 모두를 하향조절함을 나타낸다.
AKT 및 MAPK 시그날링 경로의 차단은 침습성 흑색종 성장을 억제한다.
마지막으로, 본 발명자들은 PI3K/AKT 시그날링 경로 및 MAP 키나제 시그날링 경로의 억제가 생리학적 관계에서 침습성 흑색종 성장에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 측정하였다. Skme128 전이성 흑색종 세포를 인간 피부 재구성물에 혼입시켰다. 재구성된 전이성 흑색종을 4 μM 워르트만닌, 6 μM BAY 43-9006, 또는 BAY 43-9006과 조합된 워르트만닌으로 처리하였다. 전이성 Skme128 흑색종 세포를 재구성된 인간 피부에 혼입시키면, 이들은 전체 피부에 걸쳐서 다수의 종양 세포 세포소의 빠른 성장을 나타내었다 (도 6A). 워르트만닌에 의한 AKT 시그날링 경로의 억제, 또는 BAY 43-9006에 의한 MAPK 시그날링 경로 등의 억제는 재구성된 피부에서 Skme128 전이성 흑색종 세포의 감소된 침습성 종양 성장을 제공하였다 (도 6B 및 C). PI3K 억제제 워르트만닌으로 처리한 후에 (도 6B), 흑색종 세포 세포소는 수 및 크기가 감소하였으며, 흐트러지는 것으로 보였으며, 이는 흑색종-흑색종 세포 유착의 감소를 시사한다. 또한, 흑색종 세포는 다수상돌기성 표현형을 나타내었다. 억제제 BAY 43-9006의 적용 (도 6C)은 또한 흑색종 세포 세포소의 수 및 크기를 감소시켰다.
작은 흑색종 세포 세포소 및 단일 흑색종 세포는 진피 전체에 걸쳐서 분산되었다. 또한, BAY 43-9006과 조합된 워르트만닌에 의한 AKT 및 MAPK 시그날링 경로의 동시 차단은 침습성 흑색종 성장을 완전하게 억제하였고, 매우 소수의 둥글어진 흑색종 세포가 진피 내에 잔류하였다 (도 6D). 유사한 결과는 전이성 흑색종 세포 라인 451Lu에 의해서도 수득되었다.
참고문헌
Figure 112007085202109-PCT00024

Claims (33)

  1. 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 다형체, 용매화물, 수화물, 대사산물, 전구약물 또는 부분입체이성체 형태, 및 PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제인 하나 이상의 제 2 화합물을 포함하는 조합물:
    [화학식 I]
    Figure 112007085202109-PCT00025
    상기 식에서,
    Q는 -C(O)Rx이고,
    Rx는 하이드록시, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시 또는 NRaRb이며;
    Ra 및 Rb는 독립적으로
    a) 수소;
    b) 임의로 하이드록시; C1 -4 알콕시; 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 트리아진, 벤즈옥사졸, 이소퀴놀린, 퀴놀린 및 이미다조피리미딘으로부터 선택된 헤테로아릴기; 테트라하이드로피란, 테트라하이드로푸란, 1,3-디옥솔란, 1,4-디옥산, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페라 진, 피페리딘, 피페리디논, 테트라하이드로피리미돈, 펜타메틸렌 설파이드, 테트라메틸렌 설파이드, 디하이드로피란, 디하이드로푸란 및 디하이드로티오펜으로부터 선택된 헤테로사이클릭기; 하나 또는 두 개의 C1 -4 알킬기에 의해서 임의로 치환된 아미노 -NH2; 또는 페닐
    에 의해서 치환된 C1 -4 알킬;
    c) 임의로 할로겐, 또는 하나 또는 두 개의 C1 -4 알킬에 의해서 임의로 치환된 아미노 -NH2
    에 의해서 치환된 페닐; 또는
    d) 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 트리아진, 벤즈옥사졸, 이소퀴놀린, 퀴놀린 및 이미다조피리미딘으로부터 선택된 헤테로아릴기이고,
    A는 화학식 1xx의 임의로 치환된 페닐기, 화학식 1x의 임의로 치환된 피리디닐기, 또는 화학식 1y의 임의로 치환된 나프틸 잔기이며,
    [화학식 1xx]
    Figure 112007085202109-PCT00026
    [화학식 1x]
    Figure 112007085202109-PCT00027
    [화학식 1y]
    Figure 112007085202109-PCT00028
    B는 화학식 2a 및 2b의 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
    [화학식 2a]
    Figure 112007085202109-PCT00029
    [화학식 2b]
    Figure 112007085202109-PCT00030
    L은 -S- 또는 -O-인 가교기이며,
    p는 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
    n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며,
    m은 0, 1, 2 또는 3이고,
    각각의 R1은 독립적으로 할로겐, C1 -5 할로알킬, NO2, C(O)NR4R5, C1 -6 알킬, C1- 6 디알킬아민, C1 -3 알킬아민, CN, 아미노, 하이드록시 또는 C1 -3 알콕시이며,
    각각의 R2는 독립적으로 C1 -5 알킬, C1 -5 할로알킬, C1 -3 알콕시, N-옥소 또는 N-하이드록시이고,
    각각의 R3는 독립적으로 할로겐, R4, OR4, S(O)R4, C(O)R4, C(O)NR4R5, 옥소, 시아노 또는 니트로 (NO2)이며,
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, C1 -6 알킬, 또는 퍼할로겐화까지 된 C1 -6 알킬이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    A는 3-tert 부틸 페닐, 5-tert 부틸-2-메톡시페닐, 5-(트리플루오로메틸)-2-페닐, 3-(트리플루오로메틸)-4-클로로페닐, 3-(트리플루오로메틸)-4-브로모페닐 또는 5-(트리플루오로메틸)-4-클로로-2-메톡시페닐이고;
    B는 다음의 기이며,
    Figure 112007085202109-PCT00031
    ;
    R1은 불소, 염소, 브롬, 메틸, NO2, C(O)NH2, 메톡시, SCH3, 트리플루오로메틸 또는 메탄설포닐이고;
    R2는 메틸, 에틸, 프로필, 산소 또는 시아노이며;
    R3는 트리플루오로메틸, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, tert-부틸, 염소, 불소, 브롬, 시아노, 메톡시, 아세틸, 트리플루오로메탄설포닐, 트리플루오로메톡시, 또는 트리플루오로메틸티오인 조합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 또한 하기 화학식 II의 화합물, 또는 그의 염, 다형체, 용매화물, 수화물, 대사산물, 전구약물 또는 부분입체이성체 형태인 조합물:
    [화학식 II]
    Figure 112007085202109-PCT00032
    상기 식에서,
    Ra 및 Rb는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬이며,
    화학식 II의 B는 하기 화학식의 기이고,
    Figure 112007085202109-PCT00033
    상기 우레아기 -NH-C(O)-NH- 및 산소 가교기는 B의 환의 인접한 탄소들에 결합되지 않고, 1 또는 2 개의 환 탄소에 의해서 분리되어 결합되며,
    화학식 II의 A는 화학식 1x 또는 1xx의 기이고,
    [화학식 1x]
    Figure 112007085202109-PCT00034
    [화학식 1xx]
    Figure 112007085202109-PCT00035
    여기에서 변수 n은 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
    R3는 트리플루오로메틸, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소프로필, tert-부틸, 염소, 불소, 브롬, 시아노, 메톡시, 아세틸, 트리플루오로메탄설포닐, 트리플루오로메톡시 또는 트리플루오로메틸티오이다.
  4. 제 2 항에 있어서, 각각의 R3 치환체가 염소, 트리플루오로메틸, tert-부틸 또는 메톡시이고, 화학식 II의 A는
    Figure 112007085202109-PCT00036
    이며, 화학식 II의 B는 페닐렌, 플루오로 치환된 페닐렌 또는 디플루오로 치환된 페닐렌인 조합물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 또한 이하의 화학식 X의 화합물, 또는 그의 염, 다형체, 용매화물, 수화물, 대사산물, 전구약물 또는 부분입체이성체 형태인 조합물:
    [화학식 X]
    Figure 112007085202109-PCT00037
    상기 식에서,
    페닐 환 "B"는 임의로 하나의 할로겐 치환체를 가지며,
    A는 화학식 1xx의 임의로 치환된 페닐기, 화학식 1x의 임의로 치환된 피리디닐기, 또는 화학식 1y의 임의로 치환된 나프틸 잔기이고,
    [화학식 1xx]
    Figure 112007085202109-PCT00038
    [화학식 1x]
    Figure 112007085202109-PCT00039
    [화학식 1y]
    Figure 112007085202109-PCT00040
    n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며,
    m은 0, 1, 2 또는 3이고,
    각각의 R2는 독립적으로 C1 -5 알킬, C1 -5 할로알킬, C1 -3 알콕시, N-옥소 또는 N-하이드록시이며,
    각각의 R3는 독립적으로 할로겐, R4, OR4, S(O)R4, C(O)R4, C(O)NR4R5, 옥소, 시아노 또는 니트로 (NO2)이고,
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, C1 -6 알킬, 또는 퍼할로겐화까지 된 C1 -6 알킬이다.
  6. 제 5 항에 있어서, m이 0이고, A는 하나 이상의 치환체 R3를 갖는 치환된 페닐인 조합물.
  7. 제 6 항에 있어서, R3가 할로겐, 트리플루오로메틸 및/또는 메톡시인 조합물.
  8. 제 1 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 또한 이하의 화학식 Z1 또는 Z2 중의 하나의 구조, 또는 그의 염, 다형체, 용매화물, 수화물, 대사산물, 전구약물 또는 부분입체이성체 형태를 갖는 것인 조합물:
    [화학식 Z1]
    Figure 112007085202109-PCT00041
    [화학식 Z2]
    Figure 112007085202109-PCT00042
  9. 제 8 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 Z1의 화합물의 토실레이트 염인 조합물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제가 FTY720, UCN-01, 셀레콕시브 및 그의 유사체, 3-데옥시-D-마이오-이노시톨 유사체, 2'-치환된 3'-데옥시-포스파티딜-마이오-이노시톨 유사체, 3-(이미다조[1,2-a]피리딘-3-일) 유도체, Ly294002, 퀴나졸린-4-온 유도체, 3-(헤테로)아릴옥시 치환된 벤조(b)티오펜 유도체, 비리딘, 반합성 비리딘, Akt-1-1, Akt-1-1,2, API-59CJ-Ome, 1-H-이미다조[4,5-c]피리디닐 화합물, 인돌-3-카비놀 및 그의 유도체, 페리포신, 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체, 트리시리빈 및 FKBP12 인핸서로 구성된 군으로부터 선택되는 조합물.
  11. 제 10 항에 있어서, 셀레콕시브 유사체가 OSU-03012, OSU-03013인 조합물.
  12. 제 10 항에 있어서, 3-데옥시-D-마이오-이노시톨 유사체가 PX-316인 조합물.
  13. 제 10 항에 있어서, 퀴나졸린-4-온 유도체가 IC486068인 조합물.
  14. 제 10 항에 있어서, 반합성 비리딘이 PC-866인 조합물.
  15. 제 10 항에 있어서, 제 2 화합물이 FKBP12 인핸서인 조합물.
  16. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K/AKT 시그날링 경로 억제제가 셀레콕시브, OSU-03012, OSU-03013, PX-316, 2'-치환된 3'-데옥시-포스파티딜-마이오-이노시톨 유도체, 3-(이미다조[1,2-a]피리딘-3-일) 유도체, Ly294002, IC486068, 3-(헤테로)아릴옥시 치환된 벤조(b)티오펜 유도체, PX-866, 페리포신, 트리시리빈, FKBP12 인핸서, 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체, 워르트만닌 또는 라파마이신 또는 그의 유도체, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염인 조합물.
  17. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 화합물이 하기 화학식 W의 워르트만닌 화합물, 화학식 W의 워르트만닌 화합물의 유도체 또는 유사체, 화 학식 W의 워르트만닌 화합물의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 화학식 W의 워르트만닌 화합물의 유도체 또는 유사체의 약제학적으로 허용되는 염인 조합물:
    [화학식 W]
    Figure 112007085202109-PCT00043
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 화학식 W의 화합물의 유도체 또는 유사체가 다음의 화합물 a) 내지 e)로부터 선택되는 조합물:
    a) 화학식 W1의 화합물
    [화학식 W1]
    Figure 112007085202109-PCT00044
    (상기식에서, R은 H (11-데스아세톡시워르트만닌) 또는 아세톡시이고, R'는 C1-C6 알킬이다);
    b) 화학식 W2의 Δ9,11-데하이드로데스아세톡시워르트만닌 화합물
    [화학식 W2]
    Figure 112007085202109-PCT00045
    (상기식에서, R'는 C1-C6 알킬이다);
    c) 화학식 W3의 17(α-디하이드로-워르트만닌 화합물
    [화학식 W3]
    Figure 112007085202109-PCT00046
    (상기식에서, R은 H 또는 아세톡시이고, R'는 C1-C6 알킬이며, R"는 H, C1-C6 알킬, -C(O)OH 또는 -C(O)O-C1-C6 알킬이다);
    d) 화학식 W4의 워르트만닌 화합물의 개방 A-환 산 또는 에스테르
    [화학식 W4]
    Figure 112007085202109-PCT00047
    (상기식에서, R1은 H, 메틸 또는 에틸이고, R2는 H 또는 메틸이다); 또는
    e) 화학식 W5의 워르트만닌의 11-치환 및 17-치환된 유도체
    [화학식 W5]
    Figure 112007085202109-PCT00048
    (상기식에서, R4는 =O 또는 -O(CO)R6이고, R3는 =O, -OH 또는 -O(CO)R6이며, R6는 각각 독립적으로 페닐, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기에서 R4가 =O 또는 -OH이면, R3는 =O가 아니다).
  19. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 화합물이 Akt-키나제 억제제인 조합물.
  20. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 화합물이 Akt-1-1, Akt-1-1,2, API-59CJ-Ome, 1-H-이미다조[4,5-c]피리디닐 유도체, 인돌-3-카비놀 및 그의 유도체, 페리포신, 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체, 트리시리빈, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염인 조합물.
  21. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 화합물이 mTOR 억제제인 조합물.
  22. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 화합물이 라파마이신, 템시롤리무스, 에버롤리무스, AP23573, AP23675, AP23464, AP23841, 40-(2-하이드록시에틸)라파마이신, 40-[3-하이드록시(하이드록시메틸) 메틸프로파노에이트]-라파마이신, 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신, 32-데옥소라파마이신, 또는 16-펜티닐옥시-32(S)-디하이드로라파마이신, SAR 943, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염인 조합물.
  23. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물 및 워르트만닌을 포함하는 조합물.
  24. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물 및 라파마이신을 포함하는 조합물.
  25. 제 1 항에 있어서, 제 2 화합물이 PI3-키나제 억제제인 조합물.
  26. 제 1 항에 있어서, 제 2 화합물이 셀레콕시브, OSU-03012, OSU-03013, PX-316, 2'-치환된 3'-데옥시-포스파티딜-마이오-이노시톨 유도체, 3-(이미다조[1,2-a]피리딘-3-일) 유도체, Ly294002, IC486068, 3-(헤테로)아릴옥시 치환된 벤조(b)티오펜 유도체, PX-866, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염인 조합물.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 조합물의 활성성분의 양이 상승적인 양인 조합물.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하기 위한 것인 조합물.
  29. 제 28 항에 있어서, 암이 흑색종, 간세포암, 신세포암, 비-소세포 폐암, 난소암, 전립선암, 결장직장암, 유방암 또는 췌장암인 조합물.
  30. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 다형체, 용매화물, 수화물, 대사산물, 전구약물 또는 부분입체이성체 형태의 유효량, 및 하나 이상의 제 2 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법:
    [화학식 I]
    Figure 112007085202109-PCT00049
    상기 식에서,
    Q는 -C(O)Rx이고,
    Rx는 하이드록시, C1 -4 알킬, C1 -4 알콕시 또는 NRaRb이며;
    Ra 및 Rb는 독립적으로
    a) 수소;
    b) 임의로 하이드록시; C1 -4 알콕시; 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 트리아진, 벤즈옥사졸, 이소퀴놀린, 퀴놀린 및 이미다조피리미딘으로부터 선택된 헤테로아릴기; 테트라하이드로피란, 테트라하이드로푸란, 1,3-디옥솔란, 1,4-디옥산, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 피페리디논, 테트라하이드로피리미돈, 펜타메틸렌 설파이드, 테트라메틸렌 설파이드, 디하이드로피란, 디하이드로푸란 및 디하이드로티오펜으로부터 선택된 헤테로사이클릭기; 하나 또는 두 개의 C1 -4 알킬기에 의해서 임의로 치환된 아미노 -NH2; 또는 페닐
    에 의해서 치환된 C1 -4 알킬;
    c) 임의로 할로겐, 또는 하나 또는 두 개의 C1 -4 알킬에 의해서 임의로 치환된 아미노 -NH2
    에 의해서 치환된 페닐; 또는
    d) 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 티아졸, 옥사졸, 이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 테트라졸, 티아디아졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리미딘, 피리다 진, 피라진, 트리아진, 벤즈옥사졸, 이소퀴놀린, 퀴놀린 및 이미다조피리미딘으로부터 선택된 헤테로아릴기이고,
    A는 화학식 1xx의 임의로 치환된 페닐기, 화학식 1x의 임의로 치환된 피리디닐기, 또는 화학식 1y의 임의로 치환된 나프틸 잔기이며,
    [화학식 1xx]
    Figure 112007085202109-PCT00050
    [화학식 1x]
    Figure 112007085202109-PCT00051
    [화학식 1y]
    Figure 112007085202109-PCT00052
    B는 화학식 2a 및 2b의 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸이고,
    [화학식 2a]
    Figure 112007085202109-PCT00053
    [화학식 2b]
    Figure 112007085202109-PCT00054
    L은 -S- 또는 -O-인 가교기이며,
    p는 0, 1, 2, 3 또는 4이고,
    n은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며,
    m은 0, 1, 2 또는 3이고,
    각각의 R1은 독립적으로 할로겐, C1 -5 할로알킬, NO2, C(O)NR4R5, C1 -6 알킬, C1-6 디알킬아민, C1 -3 알킬아민, CN, 아미노, 하이드록시 또는 C1 -3 알콕시이며,
    각각의 R2는 독립적으로 C1 -5 알킬, C1 -5 할로알킬, C1 -3 알콕시, N-옥소 또는 N-하이드록시이고,
    각각의 R3는 독립적으로 할로겐, R4, OR4, S(O)R4, C(O)R4, C(O)NR4R5, 옥소, 시아노 또는 니트로 (NO2)이며,
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, C1 -6 알킬, 또는 퍼할로겐화까지 된 C1 -6 알킬이다.
  31. 암을 치료하기 위한 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 조합물을 제조하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 암이 흑색종, 간세포암, 신세포암, 비-소세포 폐암, 난소암, 전립선암, 결장직장암, 유방암 또는 췌장암인 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 조합물을 포함하는 약제학적 조성물.
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