CN101180055A - 用于治疗疾病的包含二芳基脲的组合治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含二芳基脲化合物和PI3K/AKT信号途径抑制剂的药物组合物和组合，用于治疗癌症。有益的组合包括例如二芳基脲化合物BAY－43－9006。

Description

用于治疗疾病的包含二芳基脲的组合治疗

发明背景

BAY 42-9006是指4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺，它是一种二芳基脲化合物，为有效的抗癌和抗血管生成的药物，具有多种活性，包括抑制VEGFR、PDGFR、raf、p38、和/或flt-3激酶信号分子的活性。例如参见US 20050038080。RAS/RAF/MEK/ERK途径涉及细胞增殖、分化、和转化，并累及多种癌症。PI3K/AKT信号途径(signaling pathway)为细胞的另一个重要的生理学途径。它介导细胞外刺激，包括生长因子、细胞因子、细胞-细胞粘着和细胞-细胞外的基质(Vivanco和Sawyers，Nat Rev Cancer，2：489-501，2002，Downward，Curr Opin Cell Biol，10：262-267，1998)。AKT途径在人类癌症的许多类型中似乎是有活性的(Nicholson and Anderson，CellSignal，14：381-395，2002)。

图形简述

图1(A-B).与阻断MAP激酶信号途径比较，在单层培养中阻断AKT信号途径不影响黑色素瘤细胞增殖。当比较分别为对照的451Lu转移性黑色素瘤细胞和以2-20μM剂量的PI3K抑制剂渥曼青霉素(A)处理的451Lu转移性黑色素瘤细胞的单层培养时，没有观察到增殖细胞数目的显著影响。相反地，以1-7μM剂量的BAY 43-9006(B)处理451Lu转移性黑色素瘤细胞，导致细胞增殖显著地减少。以平均值给出的萤光强度表示孔中活细胞的数目。

图2(A-B).阻断AKT或MAPK信号途径分别下调单层中451Lu黑色素瘤细胞的黏着分子MelCAM和avβ3整合素(integrin)的表达。用单独的溶媒、4μM渥曼青霉素、6μM BAY 43-9006或4μM渥曼青霉素与6μM BAY 43-9006结合处理单层培养的451Lu转移性黑色素瘤细胞96小时，用抗avβ3或MelCAM的抗体染色，并以流式细胞计量术(flowcytometry)测定。单独用或与BAY 43-9006结合用渥曼青霉素处理会下调MelCAM(A)细胞表面的表达。单独用或与渥曼青霉素结合用BAY43-9006会下调avβ3整合素的细胞表面表达，但是单独用渥曼青霉素没有出现这种下调(B)。

图3(A-D).阻断MAPK但不阻断AKT的信号途径会在器官型培养抑制增殖。将掺入皮肤构建(dermal reconstructs)的Skmel28转移性黑色素瘤细胞用培养基或加有作为对照的DMSO、4μM PI3K抑制剂渥曼青霉素、6μM RAF激酶抑制剂BAY 43-9006或与6μM BAY 43-9006组合的4μM渥曼青霉素的培养基处理，并用Ki-67增殖标记剂染色(Ki-67：红色，x100)。对照的转移性黑色素瘤细胞大多数染有Ki-67增殖标记(A)。单独用PI3K抑制剂渥曼青霉素处理对增殖速度产生很少的影响或没有影响(B)。用BAY 43-9006处理导致细胞增殖的显著减少(C)。在用组合的抑制剂处理后，根本不能检测到增殖的细胞。

图4(A-D).阻断AKT和MAPK信号途径引起细胞凋亡。为了调查PI3K抑制剂渥曼青霉素和/或BAY 43-9006对在生理学环境中黑色素瘤细胞的凋亡前影响，将对照和经抑制剂处理过的Skmel28转移性黑色素瘤构建物中的活性细胞凋亡蛋白酶(caspase)-3染色(活性细胞凋亡蛋白酶-3：红色，x50)。对于活性细胞凋亡蛋白酶-3，对照的掺入皮肤构建中的Skmel28转移性黑色素瘤细胞大多数是阴性的(A)。在应用PI3K抑制剂渥曼青霉素(B)或RAF激酶抑制剂BAY 43-9006(C)或此两者(D)后，在大多数人皮肤构建的Skmel28转移性黑色素瘤细胞中发现了活性细胞凋亡蛋白酶-3。

图5(A-H).阻断AKT和MAPK信号途径分别下调黏着分子MelCAM和β3整合素的表达。对转移性黑色素瘤构建用4μM PI3K抑制剂渥曼青霉素或6μM BAY 43-9006或4μM渥曼青霉素与6μM BAY43-9006组合处理，并对黏着分子MelCAM和β3整合素分别染色(MelCAM：红色，x100；β3整合素：红色x50)。对照的掺入皮肤构建中的转移性黑色素瘤细胞强烈地表达了黏着分子MelCAM(A)和β3整合素(E)。由渥曼青霉素阻断的AKT信号途径下调MelCAM的表达(B)，而BAY 43-9006阻断MAPK信号途径没有显示会影响MelCAM的表达(C)，这提示了用两种抑制剂组合所观察到的效果(D)主要是由于阻断AKT途径。β3整合素的表达不因渥曼青霉素处理(F)而改变，而单独应用或与渥曼青霉素组合应用BAY 43-9006(G)基本减少了β3整合素的表达(H)。

图6(A-D).阻断PI3K/AKT(AKT)和RAS/RAF/MEK/ERK(MAPK)信号途径在人皮肤构建中会抑制侵袭性黑色素瘤生长。将Skmel28转移性黑色素瘤细胞将掺入皮肤构建中，并用培养基或加有作为对照的DMSO、4μM PI3K抑制剂渥曼青霉素、6μM BAY 43-9006或4μM渥曼青霉素与6μM BAY 43-9006组合的培养基处理，然后用苏木素(HE，x100)染色。(A)对照的Skmel28转移性黑色素瘤细胞显示出整个皮肤的多数个肿瘤细胞巢和肿瘤细胞簇侵袭性生长。(B)在用渥曼青霉素处理后，减少了黑色素瘤细胞巢的数目和大小，降低了黑色素瘤细胞的内聚性，并改变了黑色素瘤细胞形态，伴有显示丰度树突表型(multidendriticphenotype)的黑色素瘤细胞。(C)BAY 43-9006也减少了黑色素瘤细胞巢的数目和大小，伴有散布遍及皮肤的小黑色素瘤细胞巢和单个黑色素瘤细胞。(D)渥曼青霉素与BAY 43-9006的组合完全取消了侵袭性黑色素瘤生长，只有非常少的圆形黑色素瘤细胞留在皮肤。

发明描述

本发明提供药物组合、组合物、和方法，用于治疗疾病和病状，包括但不限于细胞增生性病症(诸如癌症)、炎症、免疫调节性病症、和与异常的或不希望的血管生成相关的疾病。该药物组合包含至少一种式I的化合物和至少一种为PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物。该方法可包含例如施用如下所述的二芳基脲化合物和PI3K/AKT信号途径抑制剂、其药学上可接受的盐、及其衍生物等。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和AKT(蛋白激酶B)信号途径调节多种生物进程，包括细胞存活、细胞增殖、细胞生长、和细胞运动。PI3K-AKT信号的异常促使许多疾病和病状(包括细胞增殖性病症(诸如癌症)、炎症、和免疫调节性病症)发病。

许多生长和存活因子激活PI3K家族成员，特异地将一种脂质信号分子PIP2转化成另一种的PI(3，4，5)P3。磷酸化的生成物补充Akt家族成员至内部质膜，激发它们的蛋白激酶活性。迄今为止，业已鉴定了在若干生物进程中牵涉许多Akt效应物。例如，Akt激酶通过对细胞凋亡机制性成分的磷酸化作用和失活斡旋细胞存活。PI3K/AKT信号途径包括参与信号传导级联的任何成员或成分。这些中包括但不限于例如PI3-激酶、Akt-激酶、FKBP12、mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标；也称为FRAP、RAFT1、或RAPT1)、RAPTOR(调控mTOR相关的蛋白质)、TSC(结节性硬化复合体)、PTEN(同源性磷酸酶-张力蛋白)、及它们的下游效应物。本发明组合可用于治疗和/或预防与前面提到的活性相关的任何病状和/或疾病。

PI3K/AKT信号途径的抑制剂是抑制一种或多种前面提到的信号传导级联成员的化合物。虽然这样的化合物涉及作为途径抑制剂，本发明可包括这些抑制剂治疗任何提及的疾病或病状的用途，而不论作用机制或如何达到治疗效果。实际上，认识到这样的化合物可具有一个以上的靶点，并且当给受试者施用时最初认识到化合物的活性可能不是它在体内所具有的活性，或者其为何达到治疗效果。因此，化合物作为途径或蛋白质靶标(例如，Akt或mTOR)抑制剂的描述是指化合物具有这样的活性，但在用作治疗或预防剂时决不以此限制具有此活性的化合物。

AKT家族成员的实例包括：Akt1、Akt2(通常在肿瘤中过度表达；Bellacosa等，Int.J.Cancer，64：280-285，1995)、和Akt3。

PI3K家族成员的实例包括：pl10-α、pl10-β、pl10-δ、和pl10-γ(催化的)。

PI3K/AKT信号途径抑制剂包括但不限于，例如FTY720(例如Lee等，Carcinogenesis，25(12)：2397-2405，2004)，UCN-01(例如，Amornphimoltham等，Clin Cancer Res.，10(12Ptl)：4029-37，2004)；

磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3-激酶)抑制剂的实例包括但不限于例如塞来考昔及其类似物，诸如OSU-03012和OSU-03013(例如，Zhu等，Cancer Res.，64(12)：4309-18，2004)；

3-脱氧-D-肌醇类似物(例如，美国申请号.20040192770；Meuillet等，Oncol.Res.，14：513-27，2004)，诸如PX-316；

2′-取代的3′-脱氧-磷脂酰肌醇类似物(例如，Tabellini等，Br.J.Haematol.，126(4)：574-82，2004)；

稠合的杂芳基衍生物(美国专利号.6,608,056)；

3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)衍生物(例如，美国专利号.6,403,588和6,653,320)；

Ly294002(例如，Vlahos，等，J.Biol.，Chem.，269(7)5241-5248，1994)；

喹唑啉-4-酮衍生物，诸如IC486068(例如，美国申请号.20020161014；Geng等，Cancer Res.，64：4893-99，2004)；

3-(杂)芳氧基取代的苯并(b)噻吩衍生物(例如，WO 04108715；又如WO 04108713)；

绿胶霉素(viridins)，包括半合成的绿胶霉素诸如PX-866(乙酸(1S，4E，10R，11R，13S，14R)-[4-二烯丙基氨基亚甲基-6-羟基-1-甲氧基甲基-10，13-二甲基-3，7，17-三氧-1，3，4，7，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-2-氧杂环戊[a]菲-11-基酯](例如，Ihle等，Mol Cancer Ther，3(7)：763-72，2004；美国申请号.20020037276；美国专利5,726,167)；和

渥曼青霉素及其衍生物(例如，美国专利号.5,504,103；5,480,906，5,468,773；5,441,947；5,378,725；3,668,222)。

Akt激酶(也称为蛋白激酶B)抑制剂的实例包括但不限于，例如，Akt-1-1(抑制剂Akt1)(Barnett等，Biochem.J.，385(续2)：399-408，2005)，Akt-1-1，2(抑制剂Akt1和2)(Barnett等，Biochem.J.，385(续2)：399-408，2005)，API-59CJ-Ome(例如，Jin等，Br.J.Cancer.，91：1808-12，2004)，1-H-咪唑并[4，5-c]吡啶基化合物(例如，WO05011700)，吲哚-3-甲醇及其衍生物(例如，美国专利号.6,656,963；Sarkar和Li，J Nutr.，134(12期增刊)：3493S-3498S，2004)，哌立福辛(例如，干扰Akt膜定位；Dasmahapatra等，Clin Cancer Res.，10(15)：5242-52，2004)，磷脂酰肌醇醚脂类似物(例如，Gills和Dennis，Expert.Opin.Investig.Drugs，13：787-97，2004)，曲西立滨(TCN或API-2或NCI鉴定剂：NSC 154020；Yang等，Cancer Res.，64：4394-9，2004)。

mTOR抑制剂的实例包括但不限于，例如，

FKBP 12增强子；

雷帕霉素及其衍生物，包括：CCI-779(temsirolimus)，RAD001(依维莫司；WO 9409010)，TAFA93和AP23573；支架类药物(rapalogs)，例如WO 98/02441和WO 01/14387中公开的诸如AP23573、AP23464、AP23675、或AP23841；40-(2-羟乙基)雷帕霉素，40-[3-羟基(羟甲基)甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称CC 1779)，40-表-(四唑基(tetrazolyt))-雷帕霉素(也称ABT578)，32-脱氧雷帕霉素(deoxorapamycin)，16-戊炔基氧基(pentynyloxy)-32(S)-二氢雷帕霉素，和WO 05005434中公开的其它衍生物；USP 5,258,389、WO 94/090101、WO 92/05179、USP 5,118,677、USP5,118,678、USP 5,100,883、USP 5,151,413、USP 5,120,842、WO93/111130、WO 94/02136、WO 94/02485、WO 95/14023、WO 94/02136、WO 95/16691(例如SAR 943)、EP 509795、WO 96/41807、WO 96/41807和USP 5,256,790中公开的衍生物；

含有磷的雷帕霉素衍生物(例如，WO 05016252)；

4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物(例如，美国临时申请号.60/528,340)。

感兴趣的磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3-激酶)抑制剂的实例为渥曼青霉素及其衍生物或类似物和渥曼青霉素的药学上可接受的盐及其衍生物和类似物。因此，本发明的方法包括式W的PI3-激酶抑制剂、式W化合物的衍生物或类似物、式W化合物的药学上可接受的盐、和式W化合物的药学上可接受的盐的衍生物或类似物的用途：

本文提到的曼青霉素或“式W”化合物的衍生物和类似物旨在包括美国专利号5,504,103；5,480,906；5,468,773；5,441,947；5,378,725；3,668,222中鉴定的衍生物和类似物。适用的式W化合物的衍生物和类似物包括：

a)式W1的化合物

其中R为H(11-去乙酰氧基渥曼青霉素)或乙酰氧基和R′为C_1-6烷基，

b)式W2的Δ9，11-去氢去乙酰氧基渥曼青霉素化合物，

其中R′为C_1-6烷基，

c)式W3的17(α-二氢-渥曼青霉素化合物

其中R为H或乙酰氧基，和R′为C_1-6烷基，和R″为H、C_1-6烷基、-C(O)OH或-C(O)O-C₁-C₆烷基；

d)式W4的渥曼青霉素化合物的A-开环酸或酯

其中R₁为H、甲基或乙基和R₂为H或甲基或

e)式W5渥曼青霉素的11-取代的和17-取代的衍生物

其中R₄为＝O或-0(CO)R₆，R₃为＝0、-OH或-0(CO)R₆，每个R₆独立为苯基、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基，其中R₄为＝O或-OH时，R₃不为＝0。

指定了优先选择的PI3K抑制剂，其选自塞来考昔、OSU-03012、OSU-03013、PX-316、2′-取代的3′-脱氧磷脂酰肌醇衍生物、3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)衍生物、Ly294002、IC486068、3-(杂)芳氧基取代的苯并(b)噻吩衍生物、PX-866、或它们的药学上可接受的盐。也指定了优选的mTOR抑制剂FKBP 12增强子及其药学上可接受的盐。

也指定了优选的Akt激酶抑制剂，其选自Akt-1-1、Akt-1-1，2、API-59CJ-Ome、1-H-咪唑并[4，5-c]吡啶基衍生物、吲哚-3-甲醇及其衍生物、哌立福辛、磷脂酰肌醇醚脂类似物、曲西立滨、或它们的药学上可接受的盐。

也指定了优选的雷帕霉素及其衍生物，包括：CCI-779(temsirolimus)，RAD001(依维莫司；WO 9409010)，TAFA93和AP23573；rapalogs，例如WO 98/02441和WO 01/14387中公开的诸如AP23573、AP23464、AP23675、或AP23841；40-(2-羟乙基)雷帕霉素，40-[3-羟基(羟甲基)甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称CC 1779)，40-表-(四唑基(tetrazolyt))-雷帕霉素(也称ABT578)，32-脱氧雷帕霉素，16-戊炔基氧基-32(S)-二氢雷帕霉素，和WO 05005434中公开的其它衍生物；USP 5,258,389、WO94/090101、WO 92/05179、USP 5,118,677、USP 5,118,678、USP5,100,883、USP 5,151,413、USP 5,120,842、WO 93/111130、WO94/02136、WO 94/02485、WO 95/14023、WO 94/02136、WO 95/16691(例如SAR 943)、EP 509795、WO 96/41807、WO 96/41807和USP 5,256,790中公开的衍生物。

式(I)结构的化合物、其药学上可接受的盐、多晶型物(polymorphs)、溶剂化物、水合物、代谢物和前体药物，包括非对映异构体形式(分离出的立体异构体和立体异构体的混合物)在本文中共同地指作“式I化合物”。

式(I)如下：

其中

Q为-C(O)Rx

Rx为羟基、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基或NR_aR_b，

R_a和R_b独立地为：

a)氢；

b)C_1-4烷基，任选地被下列取代基取代

-羟基，

-C_1-4烷氧基，

-杂芳基基团，其选自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、四唑、噻二唑、二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、三嗪、苯并唑、异喹啉(isoquiolin)、喹啉和咪唑并嘧啶，

-杂环基团，其选自四氢吡喃、四氢呋喃、1，3-二氧戊环、1，4-二氧杂环己烷、吗啉、硫代吗啉(thiomorpholine)、哌嗪、哌啶、哌啶酮(piperidinone)、四氢嘧啶酮、五甲撑硫、四氢噻吩、二氢吡喃、二氢呋喃、和二氢噻吩，

-氨基，-NH₂，任选地被一个或两个C_1-4烷基取代，或

-苯基，

c)苯基，任选地用下列取代基取代

-卤素，或

-氨基，-NH₂，任选地被一个或两个C_1-4烷基取代，或

d)-杂芳基基团，其选自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、四唑、噻二唑、二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、三嗪、苯并唑、异喹啉、喹啉和咪唑并嘧啶；

A为任选取代的苯基、吡啶基、萘基、苯并唑、异喹啉、喹啉和咪唑并嘧啶；

B为任选取代的苯基或萘基：

L为-S-或-O-的桥连基团；

M为0、1、2或3，和

各个R²独立为C_1-5烷基、C_1-5卤代烷基、C_1-3烷氧基、N-氧代或N-羟基。

特别感兴趣的式(I)中A的任选取代的苯基部分的结构包括式1xx的结构：

特别感兴趣的式(I)中A的任选取代的吡啶基部分的结构包括式1x的结构：

特别感兴趣的式(I)中A的任选取代的萘基部分的结构包括式1y的结构：

结构1y表示取代基R³可出现在任一环的任何碳原子上，该碳原子含有否则是以氢原子为取代基配齐的化合价。也可通过在任一环的任何碳原子上与脲基形成键，该碳原子含有否则是以氢原子为取代基配齐的化合价。

B为任选取代的苯基或萘基。特别感兴趣的式(I)中B的任选取代的苯基或萘基部分的结构包括结构2a和2b：

和

结构2a和2b表示取代基R¹可出现在该结构的任何碳原子上，该碳原子含有否则是以氢原子为取代基配齐的化合价，和可通过在该结构的任何碳原子上与脲基形成键，该碳原子含有否则是以氢原子为取代基配齐的化合价。

在本发明的一类实施方案中，B被至少一个卤素取代基取代。在另一类实施方案中，Rx为NR_aR_b并且R_a和R_b独立地为氢或任选地被羟基取代的C_1-4烷基，以及L为-S-或-O-的桥连基团。

变量p为0、1、2、3、或4，通常为0或1。变量n为0、1、2、3、4、5或6，通常为0、1、2、3或4。变量m为0、1、2或3，通常为0。

各个R¹独立地为：卤素、C_1-5卤代烷基、NO₂、C(O)NR⁴R⁵、C_1-6烷基、C_1-6二烷基胺、C_1-3烷基胺、CN、氨基、羟基或C_1-3烷氧基。当存在时，R¹更通常为卤素和卤素类，一般为氯或氟，和更通常为氟。

各个R²独立地为：C_1-5烷基、C_1-5卤代烷基、C_1-3烷氧基、N-氧代或N-羟基。当存在时，R²一般为甲基或三氟甲基。

各个R³独立地选自：卤素、R⁴、OR⁴、S(O)R⁴、C(O)R⁴、C(O)NR⁴R⁵、氧、氰基或硝基(NO₂)。

R⁴和R⁵独立地选自：氢、C_1-6烷基、和最高至全卤代的C_1-6烷基。

A的其它实例包括：3-叔丁基苯基、5-叔丁基-2-甲氧基苯基、5-(三氟甲基)-2苯基、3-(三氟甲基)-4氯苯基、3-(三氟甲基)-4溴苯基和5-(三氟甲基)-4氯-2甲氧基苯基。

B的其它实例包括：

优选地，脲基-NH-C(O)-NH-和桥连基团L不邻近接在B的环碳上，而是更正确地说具有1或2个环碳将它们分开。

R¹基团的实例包括氟、氯(chorine)、溴、甲基、NO₂、C(O)NH₂、甲氧基、SCH₃、三氟甲基、和甲磺酰基。

R²基团的实例包括甲基、乙基、丙基、氧、和氰基。

R³基团的实例包括三氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基、氯、氟、溴、氰基、甲氧基、乙酰基、三氟甲磺酰基、三氟甲氧基、和三氟甲硫基。

一类感兴趣的化合物为下式II的化合物

其中Ra和Rb独立地为氢和C_1-4烷基，

式II的B为

其中脲基-NH-C(O)-NH-和氧桥连基团不邻近地接在B的环碳上，而是更正确地说具有1或2个环碳将它们分开，

和式II的A为

或

其中变量n为0、1、2、3或4。

R³为三氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基、氯、氟、溴、氰基、甲氧基、乙酰基、三氟甲磺酰基、三氟甲氧基、或三氟甲硫基。

在这些化合物的亚类中，式II中A的各个R³取代基选自氯、三氟甲基、叔丁基或甲氧基。

在这些化合物的另一亚类中，式II的A为

和式II的B为亚苯基、氟取代的亚苯基或二氟取代的亚苯基。

另一类感兴趣的化合物包括具有下面式X结构的化合物，其中苯基环″B″任选地具有一个卤素取代基。

对于式X的化合物，X、R²、m和A的定义是如同上述式I中的定义。变量″m″优选为零，留下C(O)NHCH₃作为吡啶基部分上的唯一取代基。至于A优选的值为具有至少一个取代基R³取代的苯基。R³优选为卤素(优选Cl或F)、三氟甲基和/或甲氧基。

感兴趣的亚类化合物包括具有下面式Z1和Z2结构的化合物：

优选的用作根据本发明式I化合物为4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺(BAY 43-9006)或4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺的对甲苯磺酸盐(化合物(I)的甲苯磺酸盐)。更优选地，4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺的对甲苯磺酸盐存在至少80％的稳定多晶型物I。最优选地，4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺的对甲苯磺酸盐存在至少80％的稳定多晶型物I并且是微粉化的形式。

通过技术人员已知的标准碾磨方法(优选通过空气碎石磨(air chatmilling))可以实现微粉化。微粉化的形式可具有平均粒度0.5至10μm，优选1至6μm，更优选1至3μm。指定的粒度是指通过技术人员已知的激光衍射测量的粒度分布的平均值(测量装置：HELOS，Sympatec)。

4{4-[3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)-脲基]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲基酰胺的对甲苯磺酸盐及其稳定的多晶型物I的制备方法描述于专利申请EP04023131.8和EP 04023130.0中。

当任何部分是“取代的”时，它可具有高达指定的最高数目的取代基，以及各个取代基可位于该部分的任何可用位置，并可通过该取代基的任何可用原子相连接。“任何可用位置”是指该部分的任何位置，这可通过本领域已知的或本文所教导的方法化学地得到并且不产生不稳定的分子(例如不能给人施用)。当在任何部分上有两个或更多个取代基时，各个取代基独立地定义为任何另一个取代基，因此各个取代基可以相同或不同。

术语“任选取代”是指如此修饰的部分可以是未被取代的，或被标识取代基所取代的。

应当理解作为吡啶取代基的术语“羟基”包括2-、3-、和4-羟基吡啶，并且也包括本领域所提及的1-氧-吡啶、1-羟基吡啶或吡啶N-氧化物的那些结构。

在本文应用化合物、和盐等词的复数形式时，这也可是指单数的化合物、和盐等。

除非另外指明，术语C_1-6烷基是指具有一至六个碳原子的直链、支链或环状的烷基，其可以是环状的、直链或具有单个或多个分枝的支链。这样的基团包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、和环丁基等。

除非另外指明，术语C_1-6卤代烷基是指具有最高达六个碳原子的饱和烃基，具有至少一个卤原子最高至全卤取代的。该基可以是环状的、直链或具有单个或多个分枝的支链。卤素取代包括氟代、氯代、溴代、或碘代。优选氟代、氯代和溴代，更优选氟代和氯代。卤素取代可位于任何可用的碳上。当此部分存在多于一个卤素取代时，卤素可以相同或不同。卤代烷基取代基的实例包括但不限于氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、和1，1，2，2-四氟乙基等。

除非另外指明，术语C_1-6烷氧基是指具有一至六个饱和碳原子的环状的、直链或支链的烷氧基，其可以是环状的、直链或具有单个或多个分枝的支链，包括诸如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、丁氧基、和戊氧基等这样的基团。它也包括卤代的基团，诸如2，2-二氯乙氧基、和三氟甲氧基等。

卤或卤素是指氟、氯、溴、或碘。优选氟、氯和溴，和更优选氟和氯。

除非另外指明，C_1-3烷基胺是指甲氨基、乙氨基、丙胺或异丙胺基。

C_1-6二烷基胺的实例包括但不限于二乙氨基、乙基异丙氨基、甲基异丁基氨基和二己基氨基。

术语杂芳基是指单环和双环的杂芳基环。单环杂芳基表示具有5至6个环原子的芳香单环，具有1-4个选自N、O和S的杂原子，其余为碳原子。当该部分中存在多于一个杂原子时，杂原子独立地选自另一(多)个，以致于杂原子可以相同或不同。单环的杂芳基环包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、四唑、噻二唑、二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪和三嗪。

双环杂芳基表示稠合的双环部分，其中一个环选自上述的单环杂芳基环并且第二个为苯或为另一个上述的单环杂芳基环。当双环部分的两个环均为杂芳基环时，它们可以相同或不同，只要它们可通过本领域已知的方法化学地得到。双环杂芳基环包括合成得到的5-5、5-6、或6-6稠合的双环芳香族结构，例如包括但不限于苯并唑(稠合的苯基和唑)、喹啉(稠合的苯基和吡啶)、和咪唑并嘧啶(稠合的咪唑和嘧啶)等。

在标明的地方，双环杂芳基部分可以是部份饱和的。当部份饱和时，或者如上所述的单环杂芳基环是完全或部份饱和的，或者如上所述的第二个环是完全或部份饱和的，或者两个环均是部份饱和的。

术语“饱和的、部份饱和的、或芳香的含有选自氧、氮和硫中至少一个原子的5或6元杂环”不限于地包括四氢吡喃、四氢呋喃、1，3-二氧戊环、1，4-二氧杂环己烷、吗啉、硫代吗啉、哌嗪、哌啶、哌啶酮、四氢嘧啶酮、五甲撑硫、四氢噻吩、二氢吡喃、二氢呋喃、和二氢噻吩、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、和三嗪等。

术语“C_1-3烷基苯基”包括例如2-甲基苯基、异丙基苯基、3-苯基丙基、或2-苯基-1-苯丙基。取代的实例包括2-[2-氯苯基]乙基、和3，4-二甲基苯基甲基等。

除非另外说明或指明，术语“芳基”包括6-12元的单或双环芳烃基团(例如苯基、萘、甘菊环、茚基)，具有0、1、2、3、4、5或6个取代基。

式(I)的化合物可含有一个或多个不对称中心，这取决于预期的各种取代基的位置和特性。不对称碳原子可为(R)或(S)构型或(R，S)构型。在一些情况中，不对称也可以由于在指定键(例如特定化合物的两个取代的芳环邻接的中心键)附近的受限旋转而存在。环上的取代基也可以为顺式或反式。旨在将所有这些构型(包括对映异构体和非对映异构体)包括在本发明的范围内。优选的化合物为式(I)化合物中产生更理想生物活性的绝对构型的那些化合物。本发明化合物的异构体或外消旋混合物的分离、纯化或部分纯化也包括在本发明的范围内。可通过本领域已知的标准技术实现所述异构体的纯化和所述异构体混合物的分离。

根据常规方法，例如应用具旋光性的酸或碱形成非对映异构体的盐或形成共价的非对映异构体，通过拆分外消旋混合物可获得光学异构体。适用酸的实例为酒石酸、二乙酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。基于它们的物理和/或化学差别，通过本领域已知的方法，例如通过色谱法或分步结晶法，可将非对映异构体的混合物分离成它们的个体非对映异构体。然后将具旋光性的碱或酸从分离的立体异构体的盐上释出。不同的分离光学异构体的方法涉及应用手性色谱法(例如，手性HPLC柱)，用或不用常规的衍生物，以及优化选择以最大化分离对映异构体。适用的手性HPLC柱是由Diacel制造的，例如在许多之中的Chiracel OD和Chiracel OJ，所有的均是常规可选择的。用或不用衍生物的酶分离法也是有用的。应用旋光活性的起始材料，通过手性合成同样可以获得式I的旋光活性化合物。

本发明也涉及如本文所述的化合物的有用形式，诸如药学上可接受的盐、代谢物、前体药物。术语“药学上可接受的盐”是指相对无毒的本发明化合物的无机或有机酸加成盐。例如，参见S.M.Berge，等″Pharmaceutical Salts，″J.Pharm.Sci.1977，66，1-19。药学上可接受的盐包括通过将充当碱的主要化合物与无机或有机酸反应形成盐而获得的那些盐，例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、樟脑磺酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐和柠檬酸盐。药学上可接受的盐包括其中充当酸的主要化合物与适当的碱反应形成的那些盐，例如钠盐、钾盐、钙盐、镁(mangnesium)盐、铵、和胆碱盐。本领域技术人员将进一步认识到经由任何大量的已知方法，通过将化合物与适当的无机或有机酸起反应，可制得所要求化合物的酸加成盐。替代选择性地，经由多种已知的方法，通过将本发明化合物与适当的碱起反应，可制得碱和碱土金属的盐。

本发明化合物的代表性盐包括常规无毒的盐和季铵盐，这可例如通过本领域众所周知的方法由无机或有机酸或碱形成。例如，这样的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、肉桂酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、衣康酸盐、乳酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、磺酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐、和十一酸盐。

碱盐包括碱金属盐诸如钾和钠盐，碱土金属盐诸如钙和镁盐，以及与有机碱如二环己基胺和N-甲基-D-葡萄糖胺形成的铵盐。此外，含碱性氮的基团可以被试剂季铵化，这样的试剂例如低级烷基卤化物(如甲基、乙基、丙基、和丁基的氯化物、溴化物和碘化物)；硫酸二烷基酯(如二甲基、二乙基、和二丁基硫酸酯)；和硫酸二戊基酯，长链卤化物(如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基(strearyl)的氯化物、溴化物和碘化物)，芳基或芳烷基卤化物(如苄基和苯乙基溴化物和其它单取代的芳烷基卤化物或多取代的芳烷基卤化物)。

用于本发明目的的溶剂化物是本化合物的那些形式，其中溶剂分子形成固态的复合物，并且溶剂分子包括但不限于例如乙醇和甲醇。水合物为溶剂化物的具体形式，其中溶剂分子为水。

一些药理学活性剂可以用在体内施用后裂解的不稳定的官能团来进一步修饰，以供给母体活性剂和药理学无活性的衍生基团。这些衍生物通常称为前体药物，可用于例如改变活性剂的理化性质、使活性剂靶向于特定的组织、改变活性剂的药动学和药效性质、和减少不希望的副作用。本发明的前体药物包括例如耐受性好的本发明化合物适当的酯，药学上可接受的酯诸如烷基酯包括甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、异丁酯或戊酯。尽管优选甲酯，也可以应用其它的酯诸如苯基-C₁-C₅烷基酯。

可用于合成其它前体药物的方法描述于下述主题综述中，在此将它们引入作为这些合成方法描述的参考：

·Higuchi，T.；Stella，V.编.Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems.ACS Symposium Series.American Chemical Society：Washington，DC(1975)。

·Roche，E.B.Design of Biopharmaceutical Properties throughProdrugs and Analogs.American Pharmaceutical Association：Washington，DC(1977)。

·Sinkula，A.A.；Yalkowsky，S.H.J Pharm Sci.1975，64，181-210。

·Stella，V.J.；Charman，W.N.Naringrekar，V.H.Drugs 1985，29，455-473。

·Bundgaard，H.，编.Design of Prodrugs.Elsevier：New York(1985)。

·Stella，V.J.；Himmelstein，K.J.J.Med.Chem.1980，23，1275-1282。

·Han，H-K；Amidon，G.L.AAPS Pharmsci 2000，2，1-11。

·Denny，W.A.Eur.J.Med.Chem.2001，36，577-595。

·Wermuth，C.G.in Wermuth，C.G.编.The Practice of MedicinalChemistry Academic Press：San Diego(1996)，697-715。

·Balant，L.P.；Doelker，E.in Wolff，M.E.编.Burgers MedicinalChemistry And Drug Discovery John Wiley&Sons：New York(1997)，949-982。

本发明化合物的代谢物包括式I、II、X、Z1和Z2化合物的氧化衍生物，其中一个或多个氮被羟基取代；包括吡啶基的氮原子为氧化物形式(本领域是指1-氧代-吡啶)或具有羟基取代基(本领域是指1-羟基-吡啶)的衍生物。

一般制备方法

用于本发明实施方案中化合物制备所应用的具体方法取决于预期的具体化合物。象选择具体取代基这样的因素在制备本发明具体化合物所遵照的途径中会起作用。本领域普通技术人员容易认识到这些因素。

通过应用如下述出版的国际申请WO 00/42012、WO03/047579、WO2005/009961、WO 2004/078747和WO05/000284和欧洲专利申请EP04023131.8和EP 04023130.0中所述的已知的化学反应和方法，可制备本发明化合物。

可根据常规的化学法和/或按照下面公开的从商业上可得的或根据惯例的常规的化学法生产的原料开始可制得本发明化合物。以下给出制备本化合物的一般方法。

式(I)脲类的化合物的制备可在光气、双光气、三光气、羰二咪唑或等同物存在下，在不与任何原料起反应的溶剂中，将两种芳香胺片段的缩合制得，这如同一个或多个这些出版物中所述。替代选择地，可通过氨基化合物与异氰酸酯化合物起反应合成式(I)化合物，这如同一个或多个上述出版的国际申请中所述。

异氰酸酯类是商业上可得的或根据本领域技术人员通常已知的方法从杂环胺合成[例如用光气或光气等同物诸如氯甲酸三氯甲酯(双光气)、双(三氯甲基)碳酸酯(三光气)或N，N′-羰二咪唑(CDI)处理胺；或者选择地进行酰胺或羧酸衍生物如酯、酰基卤或酸酐的Curtius型重排]。

式中芳基胺是商业上可得的或根据本领域技术人员通常已知的方法合成。芳基胺通常应用金属催化剂如Ni、Pd、或Pt，和H₂或氢化物转移试剂如甲酸盐、环己二烯或硼氢化物将硝基芳基类化合物(nitroaryls)还原来合成(Rylander.Hydrogenation Methods；Academic Press：London，UK(1985))。硝基芳基类化合物也可以应用强氢化物源如LiAlH₄(Seyden-Penne.Reductions by the Alumino-and borohydrides inOrganic Synthesis；VCH Publishers：New York(1991))，或应用零价金属如Fe、Sn或Ca通常在酸性介质中直接还原。存在许多方法可用于合成硝基芳基类化合物(March.Advanced Organic Chemistry，第三版；JohnWiley：New York(1985).Larock.Comprehensive Organic Transformations；VCH Publishers：New York(1989))。硝基芳基类化合物通常应用HNO₃，或替代物NO₂ ⁺源通过亲电子的芳香硝化来形成。

式(I)吡啶-1-氧化物(其中在吡啶环的氮原子上携带羟基取代基和A、B、L如上明白定义)可应用本领域已知的氧化条件由相应的吡啶来制备。一些实例如下：

·过酸诸如于氯化溶剂如二氯甲烷、二氯乙烷、或氯仿中的间氯过苯甲酸(Markgraf等，Tetrahedron 1991，47，183)；

·在催化剂量的高铼酸存在下，于氯化溶剂如二氯甲烷中的(Me₃SiO)₂(Coperet等，Terahedron Lett.1998，39，761)；

·在几种联合的卤代溶剂中的全氟-顺式-2-丁基-3-丙基哑嗪(propyloxaziridine)(Amone等，Tetrahedron 1998，54，7831)；

·氯仿中的次氟酸-乙腈复合物(Dayan等，Synthesis 1999，1427)；

·在碱如KOH存在下，臭氧水溶液(Robker等，J.Chem.Res.，Synop.1993，10，412)；

·在冰醋酸存在下，单过氧邻苯二甲酸镁(Klemm等，J.HeterocylicChem.1990，6，1537)；

·在水和乙酸存在下，过氧化氢(Lin A.J.，Org.Prep.Proced.Int.1991，23(1)，114)；

·丙酮中的二甲基二环氧乙烷(Boyd等，J.Chem.Soc，Perkin Trans.1991，9，2189)。

此外，用于制备二芳基脲和中间化合物的具体方法已在别处的专利文献中有描述，并且可适合于本发明的化合物。例如，Miller S.等，″Inhibition of p38 Kinase using Symmetrical and Unsymmetrical DiphenylUreas″PCT Int.Appl.WO 9932463，Miller，S等″Inhibition of raf Kinaseusing Symmetrical and Unsymmetrical Substituted Diphenyl Ureas″PCT Int.Appl.，WO 9932436，Dumas，J.等，″Inhibition ofp38 Kinase Activity usingSubstituted Heterocyclic Ureas″PCT Int.Appl.，WO 9932111，Dumas，J.等，″Method for the Treatment of Neoplasm by Inhibition of raf Kinaseusing N-Heteroaryl-N′-(hetero)arylureas″PCT Int.Appl，WO 9932106，Dumas，J.等，″Inhibition of p38 Kinase Activity using Aryl-andHeteroaryl-Substituted Heterocyclic Ureas″PCT Int.Appl，WO 9932110，Dumas，J.，等，″Inhibition of raf Kinase using Aryl-and Heteroaryl-Substituted Heterocyclic Ureas″PCT Int.Appl，WO 9932455，Riedl，B.，等，″O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as raf Kinase Inhibitors″PCTInt.Appl，WO 0042012，Riedl，B.，等，″O-Carboxy Aryl SubstitutedDiphenyl Ureas as p38 Kinase Inhibito″PCT Int.Appl.，WO 0041698，Dumas，J.等″Heteroaryl ureas containing nitrogen hetero-atoms as p38kinase inhibitors″美国专利申请公开，US 20020065296，Dumas，J.等″Preparation of N-aryl-N′-[(acylphenoxy)phenyljureas as raf kinaseinhibitors″PCT Int.Appl，WO 0262763，Dumas，J.等″Inhibition of rafkinase using quinolyl，isoquinolyl or pyridyl ureas″PCT Int.Appl，WO 0285857，Dumas，J.等″Preparation of quinolyl，isoquinolyl or pyridyl-ureasas inhibitors of raf kinase for the treatment of tumors and/or cancerous cellgrowth″美国专利申请公开，US 20020165394。特此将所有上述专利申请引入作为参考。

式(I)化合物合成和式(I)化合物合成中的涉及中间产物合成中可应用的合成转化是本领域技术人员已知的或可获得的。合成转化的收集可见于如下汇编中：

·J.March.Advanced Organic Chemistry，第四版；John Wiley：NewYork(1992)；

·R.C.Larock.Comprehensive Organc Transformations，第二版；Wiley-VCH：New York(1999)；

·F.A.Carey；R.J.Sundberg.Advanced Organic Chemistry，第二版；Plenum Press：New York(1984)；

·T.W.Greene；P.G.M.Wuts.Protective Groups in Organic Synthesis，第三版；John Wiley：New York(1999)；

·L.S.Hegedus.Transition Metals in the Synthesis of Complex OrganicMolecules，第二版；University Science Books：Mill Valley，CA(1994)；

·L.A.Paquette，编.The Encyclopea of Reagents for OrganicSynthesis；John Wiley：New York(1994)；

·A.R.Katritzky；O.Meth-Cohn；CW.Rees，编.ComprehensiveOrganic Functional Group Transformations；Pergamon Press：Oxford，UK(1995)；

·G.Wilkinson；F.G A.Stone；E.W.Abel，编.ComprehensiveOrganometallic Chemistry；Pergamon Press：Oxford，UK(1982)；

·B.M.Trost；I.Fleming.Comprehensive Organic Synthesis；PergamonPress：Oxford，UK(1991)；

·A.R.Katritzky；CW.Rees编.Comprehensive Heterocylic Chemistry；Pergamon Press：Oxford，UK(1984)；

·A.R.Katritzky；CW.Rees；E.F.V.Scriven，编.ComprehensiveHeterocylic Chemistry II；Pergamon Press：Oxford，UK(1996)；和

·C.Hansch；P.G.Sammes；J.B.Taylor，编.Comprehensive MedicinalChemistry：Pergamon Press：Oxford，UK(1990)。

此外，关于recur ring合成方法和相关主题的综述包括OrganicReactions；John Wiley：New York；Organic Syntheses；John Wiley：NewYork；Reagents for Organic Synthesis；John Wiley：New York；The TotalSynthesis of Natural Products；John Wiley：New York；The OrganicChemistry of Drug Synthesis；John Wiley：New York；Annual Reports inOrganic Synthesis；Academic Press：San Diego CA；和Methoden derOrganischen Chemie(Houben-Weyl)；Thieme：Stuttgart，Germany。另外，合成转化的数据库包括可以用CAS OnLine或SciFinder检索的ChemicalAbstracts，可以用SpotFire检索的Handbuch der Organischen Chemie(Beilstein)，和REACCS。

式I化合物先前已表现出具有多种活性的特征，包括抑制Raf/MEK/ERK途径、c-raf、b-raf、p38、VEGFR、VEGFR2、VEGR3、FLT3、PDGFR、PDGFR-β、和c-kit。这些活性以及它们用于治疗多种疾病和病状公开在例如，WO 00/42021、WO 00/41698、WO03/068228、WO 03/047579、WO 2005/009961、WO 2005/000284和美国专利申请号.2005003 8080中，在此将这些专利全文引入作为参考。

适应症

本发明的药物组合可用于治疗与细胞路径相关的或细胞路径介导的任何疾病或病状，所述细胞途径是指由包含本化合物的组合所调节的。这些途径包括但不限于包含例如VEGFR、VEGFR2、Raf/Mek/Erk、Akt/PI3K、MTOR、PTEN等(也参见上述)的信号途径其。该药物组合可用于治疗与突变相关的或突变介导的疾病，所述突变位于这些途径中的多个基因之一，包括在PTEN、ras、Raf、Akt、PI3K等中的癌症相关的突变。

如上论及，尽管本化合物可称为特异性抑制剂，本发明不论其作用机制或其如何达到，包括任何改善的或治疗效果。

药物组合可具有一种或多种下述的活性，包括抗增殖；抗肿瘤；抗血管生成；抑制内皮或肿瘤细胞的增殖；抗赘生物；抑制免疫；免疫调节；促进细胞凋亡等。

根据本发明可治疗的病状或疾病包括增生性病症(诸如癌症)、炎症性疾病、免疫调节性疾病、变态反应、自身免疫性疾病(诸如类风湿性关节炎或多发性硬化)、异常或过度的血管生成、等。

可治疗的任何肿瘤或癌症包括但不限于具有一种或多种突变的癌症，所述突变位于raf、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、Flt-3、ras、PTEN、Akt、PI3K、mTOR以及这些信号途径中的任何上游或下游成员(它们为信号途径的一部分)。可用本发明药物组合治疗的肿瘤或癌症，而不考虑作为它的原因的机制。可治疗任何器官的癌症，包括但不限于例如结肠、胰腺、乳腺、前列腺、骨、肝、肾、肺、睾丸、皮肤、胰脏、胃、前列腺、卵巢、子宫、头与颈、血细胞、淋巴等的癌症。

根据本发明可治疗的癌症尤其包括但不限于脑肿瘤、乳癌、骨肉瘤(例如成骨肉瘤(osteosarcoma)和尤因肉瘤)、支气管癌前病变、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、恶性血液病、肝细胞癌、何杰金氏病、肾赘生物、白血病、平滑肌肉瘤(leimyosarcoma)、脂肉瘤、淋巴瘤、Lhermitte-Duclose疾病、恶性神经胶质瘤、黑素色瘤、恶性黑色素瘤、转移灶、多发性骨髓瘤、骨髓样化生、骨髓成形性综合征、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌(例如晚期的、晚期难治的癌)、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、皮肤鳞状上皮瘤、与PTEN功能缺失相关的癌；活化的Akt(例如PTEN裸瘤(PTEN null tumors)和ras突变瘤)。

乳癌的实例包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌、和原位小叶癌。

呼吸道癌症的实例包括但不限小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管腺瘤、和胸膜肺母细胞瘤。

脑癌的实例包括但不限于脑干和垂体神经胶质瘤(hypophtalmicglioma)、小脑和大脑星细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、以及神经外胚层和松果体瘤。

雄性生殖器官的肿瘤包括但不限于前列腺和睾丸癌。雌性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、和外阴癌以及子宫肉瘤。

消化道的肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌、和唾液腺癌。

泌尿道的肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、和尿道癌。

眼癌包括但不限于眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。

肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(有或没有纤微板层变化的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)、和混合型肝细胞胆管癌。

皮肤癌包括但不限于鳞状上皮细胞瘤、卡波西氏肉瘤、恶性黑色素瘤、默克尔细胞皮肤癌、和非黑色素瘤皮肤癌。

头与颈癌包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌、和/或口咽癌、以及唇和口腔癌。

淋巴瘤包括但不限于AIDS相关的淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T淋巴细胞瘤、何杰金氏淋巴瘤、和中枢神经系统淋巴瘤。

肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤、和横纹肌肉瘤。

白血病包括但不限于急性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、和多毛细胞性白血病。

除了抑制肿瘤细胞增殖外，本发明的药物组合也可引起肿瘤消退、例如减少肿瘤的大小或体内肿瘤的广度。

优选指定为治疗黑色素瘤、肾癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、乳癌或胰腺癌。

血管生成相关的疾病和病症也可用本发明的药物组合治疗。血管生成的不适当和异位表达可有害于生物体。许多病理学病症与额外的血管生长有关。这些包括例如糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、银屑病、晶状体后纤维增生症、血管纤维瘤、炎症、再狭窄等。此外，与癌性和赘生物组织相关的供血增加促进生长，导致肿瘤迅速增大和转移。而且，肿瘤中新血管的生长为脱离细胞提供了逃逸路径，促进了转移和随之的肿瘤扩散。

调节血管生成有用的系统包括例如肿瘤移出物的新生血管形成(例如，美国专利号.5,192,744；6,024,688)、鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)测定(例如，Taylor和Folkman，Nature，297：307-312，1982；Eliceiri等，J.Cell Biol.，140，1255-1263，1998)、牛毛细管内皮(BCE)细胞测定(例如，美国专利号.6,024,688；Polverini，P.J.等，Methods Enzymol.，198：440-450，1991)、迁移测定法、和HUVEC(人脐带血管内皮细胞)生长抑制测定(例如，美国专利号.6,060,449)。此外，调节淋巴血管生成有用的系统包括例如兔耳模型(例如，Szuba等，FASEB J.，16(14)：1985-7，2002)。

可通过任何适用的方法测定血管生成的调节。例如，通常通过在给出的样品中评价血管存在的数目和密度，可测定组织血管分布的程度。例如通过在高倍显微视野中内皮集群数计数或通过检测微血管内皮的特异性标记或生长中的或已建立的血管的其它标记(例如CD31，也称为血小板-内皮细胞粘附分子或PECAM)可评价微血管密度(MVD)。如同例如，Penfold等，Br.J.Oral和Maxill.Surg.，34：37-41；美国专利号.6,017,949；Delias等，Gyn.Oncol.，67：27-33，1997；及其它文献所述，CD31抗体可在常规的免疫组织学方法中用于组织切片的免疫染色。血管生成的其它标记包括例如，Vezfl(例如，Xiang等，Dev.Bio.，206：123-141，1999)、血管生成素、Tie-1、和Tie-2(例如，Sato等，Nature，376：70-74，1995)。

本发明的药物组合也具有广泛的治疗活性，用于治疗或预防一大群疾病的进展，例如炎症性疾病、冠状动脉再狭窄、与瘤相关的血管生成、动脉粥样硬化、自身免疫疾病、炎症、一些与肾小球或肾小球系膜细胞增殖相关的肾病、与视网膜血管增殖相关的眼病、银屑病、肝硬化、糖尿病、动脉粥样硬化、再狭窄、血管移植后再狭窄、支架内狭窄(in-stentrestenosis)、血管生成、眼疾病(ocurlar diseases)、肺纤维化、闭塞性细支气管炎、肾小球肾炎、风湿性关节炎。

本发明也提供用于治疗、预防、调节等的一种或多种以下的人和/或其它哺乳动物的疾病：视网膜病，包括糖尿病视网膜病、缺血性视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病和老年性黄斑退化症；风湿性关节炎、银屑病、或与表皮下水泡形成相关的大疱病(包括大疱性类天疱疮、多形红斑、或疱疹样皮炎)、风湿热、骨吸收、经绝后骨质疏松(osteoperosis)、脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、脓毒性休克、内毒素性休克、中毒性休克综合征、系统性炎症反应综合征、炎性肠病(克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、雅里希-赫克斯海默反应、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、急性肺纤维化病、肺结节病、过敏性呼吸系疾病、矽肺、煤工尘肺、肺泡损伤、肝功能衰弱、急性炎症中的肝病、重症酒精性肝炎、疟疾(恶性疟原虫和脑型疟疾)、非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、充血性心力衰竭、心脏病后损伤、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、急性脑炎、脑损伤、多发性硬化(多发性硬化中脱髓鞘和少突胶质细胞缺失)、晚期癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺炎、感染中伤口治愈不良、炎症和癌症、骨髓增生异常综合征、系统性红斑狼疮、胆汁性肝硬化、肠坏死、放射性损伤/单克隆抗体施用后的毒性、宿主抗移植物反应(缺血再灌注损伤和肾脏、肝脏、心脏、和皮肤的同种异体移植物排斥)、肺同种异体移植物排斥(闭塞性支气管炎)、或全髋关节置换术并发症、以及传染病(其选自肺结核、消化性溃疡病中幽门螺杆菌感染、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)感染引起的查格斯氏(Chaga′s)疾病、大肠杆菌感染引起的志贺样毒素效应、葡萄球菌Staphylococcus感染引起的肠毒素A效应、脑膜炎球菌感染和伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、巨细胞病毒、流感病毒、流感病毒和人免疫缺陷病毒(HTV)的感染)、乳头状瘤、胚神经胶质瘤(blastoglioma)、卡波西肉瘤、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、星细胞瘤、头部癌症、颈癌、膀胱癌、乳癌、结直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、白血病、淋巴瘤、何杰金氏病、伯基特氏病、关节炎、类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、血管生成、再狭窄、支架内再狭窄、血管移植后再狭窄、肺纤维化、肝硬化、动脉粥样硬化、肾小球肾炎、糖尿病肾病、血栓性微血管(thrombicmicoangiopathy syndromes)、移植排斥、银屑病、糖尿病、伤口愈合、炎症、和神经变性疾病、过度免疫病、血管瘤、心肌血管生成、冠状和脑侧突血管化、缺血、角膜病、虹膜红变(rubeosis)、新生血管性青光眼、早产儿黄斑变性视网膜病、伤口愈合、螺杆菌溃疡相关疾病、骨折、子宫内膜异位、糖尿病病症、猫抓热、甲状腺肥大、哮喘或烧伤后水肿、外伤、慢性肺病、中风、息肉、囊肿、滑膜炎、慢性和过敏性炎症、卵巢过度刺激综合征、肺和脑水肿、瘢痕疙瘩、纤维症、硬化、腕管综合征、成人呼吸窘迫综合征、腹水、眼病、心脏血管病、Crow-Fukase(POEMS)疾病、克罗恩氏病、肾小球肾炎、骨关节炎、多发性硬化、移植物排斥、莱姆病、脓毒症、希-林二氏病、类天疱疮、佩吉特氏病、多囊性肾病、肉状瘤病、甲状腺炎(throiditis)、高粘稠度综合征、奥斯勒-韦伯-朗迪病(Osler-Weber-Rendu disease)、慢性闭塞性肺疾病、辐射、缺氧、先兆子痫、月经过多、子宫内膜异位、单纯疱疹感染、缺血性视网膜病、角膜血管生成(angiogenisis)、带状疱疹、人免疫缺陷病毒、副痘病毒、原生动物、弓形虫病、椎关节炎、强直性脊柱炎、别奇捷列夫疾病(MorbusBechterew)、禽流感(包括例如血清型H5N1)和肿瘤相关的渗出和水肿。

本发明提供治疗前面提到的任何疾病和/或病状(包括在任何引用的参考文献中提及的那些病)的方法，包含施用有效量的至少一种式I化合物和至少一种AKT/PI3K信号途径抑制剂的化合物。“有效量”是化合物用于达到预期效果(例如治疗病或病状)的量。

本发明也涉及在包括细胞的系统中抑制血管生成的方法，包含给该系统施用有效量的本文所述的化合物的组合。包括细胞的系统可以是体内系统(诸如患者的肿瘤)，离体器官、组织或细胞，体外测定系统(CAM、BCE等)，动物模型(例如体内的皮下的癌症模型)、需要治疗的宿主(例如患有血管生成成分(如癌症)疾病或经历再狭窄的宿主)等。

此外，可施用药物组合以调节一种或多种下列过程：细胞生长(例如增殖)、肿瘤细胞生长(包括例如分化、细胞存活、和/或增殖)、肿瘤消退、内皮细胞生长(包括例如分化、细胞存活、和/或增殖)、血管生成(血管生长)、血管生成、和/或血细胞生成(例如增殖、T-细胞发育等)。

本发明的化合物或药物组合可以以任何形式任何有效途径施用，包括例如口、肠胃外、肠内、静脉内、腹膜内、表面(topical)、经皮(例如应用任何标准的贴剂)、眼、鼻、局部、非口诸如气雾(aerosal)、吸入、皮下、肌内、颊、舌下、直肠、阴道(vaginal)、动脉内、鞘内等途径。它们可单独或与活性或非活性的任何成分联合施用。它们可以以任何有效剂量施用，例如以总体重的大约0.1至大约200mg/kg。

本发明的组合可以在任何时间和以任何有效形式施用。例如，这些化合物可以同时地施用，例如以单个组合物或剂量单位(例如包含两者成分的丸剂或液体)；或它们可以在同时但以分开的成分施用(例如其中一种药物静脉内施用，另一种口服或肌内施用)。也可在不同的时间相继施用这些药物。药剂可以常规地按配方制造，以在延长的时间段(例如12小时、24小时)内实现预期的释放速率。这可通过应用具有适用代谢半衰期的药物和/或其衍生物，和/或通过应用控释制剂来实现。

药物组合可以是协同作用的，例如其中药物的协同作用是联用效果大于它们个体效果的代数和。因此，可以施用减少量的药物，例如可减少毒性或其它有害或不利作用，和/或应用与药物单独施用时所用的相同量，但可达到更大的效力，例如具有更有效的抗增殖的和促细胞凋亡作用。

本发明的化合物或药物组合可进一步与任何其它适用的添加剂或药学上可接受的载体结合。这样的添加剂包括已提及的任何物质，以及任何常规应用的那些添加剂，诸如那些添加剂，它们被描述于Remington： The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro和Gennaro编，第20版，Lippincott Williams&Wilkins，2000)；Theory and Practice of Industrial Pharmacy(Lachman等编，第三版，Lippincott Williams&Wilkins，1986)；Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(Swarbrick和Boylan编，第二版，Marcel Dekker，2002)。本文所称“药学上可接受的载体”是指它们与活性药物结合，并且可用于治疗目的给受试者安全地施用。

此外，本发明的化合物或药物组合可与用于治疗任何前述疾病和/或病状的其它活性剂或治疗(例如放射)一起施用。

本发明提供至少一种式I化合物和至少一种选自目录A(例如为用于治疗疾病或病症的PI3K/AKT信号途径抑制剂)的化合物的组合。用于本发明目的的“组合”包括：

-单个组合物或剂型，其含有至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物；

-组合包装，其含有至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物，可同时地或相继地施用；

-药盒，其包含至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物，彼此分开包装为单位剂量或独立单位剂量，可有或没有指示它们同时或相继施用的说明书；和

-至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物的分开独立剂型，它们合力达到治疗效果，例如在同时地或相继地施用时预防或治疗同样的疾病。

对于疾病和/或疾病状态的不同和/或种类，可选择组合的各种药物剂量，以提供预期的治疗活性。例如，可以以固定的组合存在并施用组合中的活性剂。“固定的组合”本文旨在表示其中组分以固定比率存在的药物形式，以提供预期的效力。对于具体患者，可常规地确定这些剂量，其中选自适当的剂量可利用多种参数(例如癌症的类型、患者的年龄、疾病状态、患者健康状态、体重等)，或这些剂量可为相对标准的剂量。

组合可包含有效量的至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物，其可达到比任一化合物单独应用时更大的治疗效果。该组合可用于产生肿瘤消退、引起疾病稳定、预防或减少转移或其它治疗终点，然而在这些药物单独应用时观察不到疗效或在施用该组合时观察到增强的效果。

基于它们各自的作用机制和疾病生物学可选择组合中的每个化合物的相对比值。例如在大于60％的人类黑色素瘤中观察到B-RAF基因的激活突变，那么治疗黑色素瘤的组合物可有益地包含比PI3K/AKT信号途径抑制剂化合物更多有效量的式I化合物。对比地，在与PI3K/AKT信号途径中突变相关的癌症(例如卵巢癌和乳癌)中，在这种信号途径中具有活性的药物相对于Ref/MEK/ERK途径抑制剂，可以存在更多有效的量。每个化合物的相对比值可以很大程度地变化，并且本发明包括用于治疗癌症的组合，其中可以常规地调整式I化合物和第二种活性剂的量，使得任一种药物以更高的量存在。

当在单个剂型、组合包装、药盒或当在分开的独立剂型中，如果适当，也可以控制组合中的一种或多种药物的释放，以提供预期的治疗活性。

试验

根据任何有效的体外或体内方法可测定本发明组合的活性。

激酶活性

应用惯例的测定方法可常规地确定激酶活性。激酶试验一般包含激酶酶kinase enzyme、底物、缓冲剂和检测系统的组分。一般的激酶试验涉及蛋白激酶与肽底物和ATP(如³²P-ATP)的反应，产生磷酸化的最终产物(比方说，当应用肽底物时为磷蛋白质)。应用任何适合的方法可检测所生成的最终产物。当应用放射性ATP时，使用亲和膜或凝胶电泳可将放射性标记的磷蛋白质从未反应的γ-³²P-ATP中分离，然后应用放射自显影术在凝胶上显影或用闪烁计数器检测。也可应用非放射活性的方法。可应用能识别磷酸化底物的抗体方法，例如抗磷酸酪氨酸抗体。比方说，可在酶对磷酸化底物有效的条件下，在ATP和激酶缓冲剂存在时，孵育激酶酶与底物。例如通过电泳法，可分离反应混合物，然后例如应用抗磷酸酪氨酸抗体的蛋白质印迹法(Western blotting)可测量底物的磷酸化。可用可检测的标记将抗体标记，例如酶(诸如HRP、抗生物素蛋白或生物素)、化学发光试剂等。可应用ELISA形式、亲和膜分离、荧光偏振测定、发光的测定等的其它方法。

放射性形式的替代方法为时间分辨的荧光共振能量转移(TR-FRET)。该方法按照标准的激酶反应，其中在ATP存在下通过蛋白激酶将底物例如生物素化的聚(GluTyr)磷酸化。然后用铕螯合的磷酸化特异性抗体(抗磷酸酪氨酸或磷酸丝氨酸/苏氨酸)和可结合生物素化底物的链亲和素(streptavidin)-APC检测最终产物。这两组分空间上集合性结合，从磷酸化特异性抗体至受体(SA-APC)的能量转移产生均一形式的荧光示值读数。

Raf/MEK/ERK活性

用Lck激酶活化(磷酸化)的c-Raf酶可进行c-Raf激酶试验。通过在多角体蛋白促进剂GST-c-Raf(从氨基酸302至氨基酸648)和Lck(全长)的控制下，用杆状病毒群表达共传染细胞，在Sf9昆虫细胞中产生Lck活化的c-Raf(Lck/c-Raf)。在感染复数为2.5下应用杆状病毒群并在感染后48小时收集这些细胞。

在感染复数为5下应用杆状病毒群表达GST-MEK-1(全长)融合蛋白传染细胞，然后在感染后48小时收集这些细胞，可在Sf9昆虫细胞中产生MEK-1蛋白。对于GST-c-Raf 302-648和GST-MEK-1，应用相似的纯化方法。

将转染细胞以100mg湿细胞生物量/mL混悬于缓冲剂中，该缓冲剂含有10mM磷酸钠、pH7.3的140mM氯化钠、0.5％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和蛋白酶抑制剂混合物。用Polytron均浆器破裂细胞，并在30,000g离心30分钟。将30,000g离心的上清液应用至GSH-琼脂糖Sepharose。将该树脂用含50mM Tris pH8.0、150mM NaCl和0.01％Triton X-100的缓冲剂洗涤。将GST标记的蛋白质用含100mM谷胱甘肽、50mM Tris pH8.0、150mM NaCl和0.01％Triton X-100的溶液洗脱。将纯化的蛋白质透析至含20mM Tris pH7.5、150mM NaCl和20％甘油的缓冲剂中。

以三倍稀释度用DMSO连续地稀释测试化合物至储备液浓度一般为50μM至20nM(例如，试验中的终浓度可为1μM至0.4nM)。按照放射性滤器(Filtermat)测定法在96-孔Costar聚丙烯板(Costar 3365)进行c-Raf生物化学的测定。将板加载75μL的溶液，该溶液含50mM HEPESpH7.5、70mM NaCl、80ng的Lck/c-Raf和1μg MEK-1。接着，在加ATP之前，加入2μL连续稀释的个体化合物至反应中。用25μL含5μM ATP和0.3μ Ci[33P]-ATP的ATP溶液开始该反应。将板密封并在32℃孵育1小时。加入50μl的4％磷酸将反应淬火，并应用WallacTomtec Harvester收集至P30 filtermats滤器(PerkinElmer)。首先用1％磷酸然后用去离子H2O洗涤滤器。在过滤器在微波中干燥，浸泡在闪烁液中，并在Wallac 1205 Betaplate计数器中(Wallac Inc.，Atlanta，GA，U.S.A.)读数。结果表示为抑制百分率。

％抑制＝[100-(Tib/Ti)]×100

其中

Tib＝(含抑制剂的每分钟计数)-(背景)

Ti＝(不合抑制剂的每分钟计数)-(背景)

通过其开始级联反应导致ERK磷酸化(即raf/MEK/ERK)得到磷酸-ERK的能力也可监测Raf活性。如下进行Bio-Plex Phospho-ERK1/2免疫测定：

建立了应用激光流式(laser flow cytometry)细胞计量术平台的96孔磷酸-ERK(pERK)免疫测定法，用于测量细胞系中基础pERK的抑制。以每孔50,000个细胞将MDA-MB-231细胞平板接种在96孔微量滴定板的完全生长培养基中。至于测试化合物对基础pERK的抑制影响，在平板接种后的次日，将MDA-MB-231细胞转移到含0.1％BSA的DMEM，并以1∶3的比例用0.1％DMSO稀释至终浓度为3mM至12nM的测试化合物将其孵育。细胞与测试化合物孵育2小时、洗涤、并在Bio-Plex全细胞裂解缓冲液A裂解。用缓冲液B按1∶1(v/v)的比例稀释样品，并直接转移到测定板或在-80℃冷冻备用。将50mL稀释的MDA-MB-231细胞裂解液与大约2000个偶联抗ERK1/2抗体的5微米Bio-Plex珠在振荡器上室温下孵育过夜。次日进行生物素化的磷酸ERK1/2夹入免疫测定，在每次孵育期间将这些珠洗涤3次，然后将50mL的PE-链亲和素用作显影剂。通过在高灵敏度下用Bio-Plex流式细胞(探针)对25个珠计数，检测pERK1/2相对荧光单位。通过用未经处理的细胞作为最大值以及用无细胞(仅有珠)作为背景，计算IC50。

磷脂酰肌醇3-激酶活性

例如应用商业上可得的试剂盒(例如Perkin-Elmer、FlashPlatePlatform)可常规地测定PKI3的活性，Frew等，AnticancerRes.，14(6B)：2425-8，1994。也可参见PKI3抑制剂项目下所列的出版物。

Akt活性

按照WO 05011700中所述，可从表达有His-标记的AKT1(aa 136-480)的昆虫细胞中分离出AKT。将表达细胞于pH7.5的25mM HEPES、100mM NaCl、20mM咪唑中应用polytron裂解(5ml裂解缓冲液/g细胞)。在28,000xg离心30分钟除去细胞碎片。通过4.5微米的过滤器将上清液滤过，然后装载至用裂解缓冲液预平衡的镍螯合柱。将柱用5柱体积(CV)的裂解缓冲液洗涤，然后用5CV的20％缓冲液B洗涤，其中缓冲液B为pH7的25mM HEPES、100mM NaCl、300mM咪唑。将His-标记的AKT1(aa 136-480)用10CV的20-100％线性梯度的缓冲液B洗脱。收集His-标记的AKT1(aa 136-480)洗脱部分，并用三倍缓冲液C稀释，其中缓冲液C为pH7的25mM HEPES。然后将样品经缓冲液C预平衡的CQ-Sepharose HP柱进行色谱。将柱用5CV的缓冲液C洗涤，然后用5 CV 10％D、5 CV 20％D、5 CV 30％D、5 CV 50％D和5 CV of100％D逐步洗脱，其中缓冲液D为25mM HEPES、1000mM NaCl；pH7.5。

将含His-标记的AKT1(aa 136-480)部分收集并在10-kDa分子量筛截的浓缩器中浓缩。将His-标记的AKT1(aa 136-480)经Superdex 75凝胶过滤柱进行色谱，该柱已用pH7.5的25mM HEPES、200mM NaCl、1mM DTT预平衡。应用SDS-PAGE和质谱法检测His-标记的AKT1(aa136-480)部分。将蛋白质收集、浓缩、并在80℃贮藏。

以类似方式可以分离并纯化His-标记的AKT2(aa 138-481)和His-标记的AKTAKT3(aa 135-479)。

AKT酶测定化合物可用于底物磷酸化试验中测试AKT蛋白丝氨酸抑制活性。这种试验测试小分子有机化合物抑制肽底物丝氨酸磷酸化的能力。该底物磷酸化试验应用催化域的AKT 1、2、或3。AKT 1、2、和3也可从Upstate USA，Inc商业获得。该方法测量离体酶催化γ磷酸盐从ATP转移至生物素化合成肽(Biotin-ahx-ARKRERAYSFGHHA-酰胺)72残基-丝氨酸上的能力。通过WO 05011700所述的下列方法可检测底物磷酸化。

在384孔U型底白板中进行试验。在20ul含有50mM MOPS pH7.5、20mM MgCl₂、4uM ATP、8uM肽、0.04uCi[g-³³P]ATP/孔、1mMCHAPS、2mM DTT、和1μl的溶于100％DMSO中的测试化合物的试验体积中，将10nM活性AKT酶于室温孵育40分钟。通过加入50μl SPA珠混合物(由不含Mg2+和Ca2+的Dulbecco′s PBS、0.1％Triton X-100、5mM EDTA、50μM ATP、2.5mg/ml链亲和素涂布的SPA珠)，将反应停止。将板密封，让这些珠沉降过夜，然后在Packard TopcountMicroplate Scintillation Counter(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)中将板计数。

以数据归纳式100*(U1-C2)/(C1-C2)计算值作为对照％对化合物的浓度，其中U为未知值、Cl为由DIVISO获得的平均对照值、和C2为由0.1M EDTA获得的平均对照值，标绘剂量反应的数据。将数据拟合为y＝((Vmax*x)K+x))所描绘的曲线，其中Vmax为上渐近线和K为IC50。

细胞增殖

在以下实施例中描述细胞增殖测定的实例。然而，可通过任何适用的方法进行增殖测定。例如，如下可进行乳腺癌细胞增殖测定。其它的细胞类型可乳腺癌MDA-MB-231细胞系。

在37℃，含5％CO₂(体积/体积)的湿润培养器中，将人乳癌细胞(MDA MB-231，NCI)在增补10％热灭活FBS的标准生长培养基(DMEM)中培养。以每孔3000个细胞的密度将细胞平板接种在96孔培养皿的90μL生长培养基中。为了测定T_OhCTG值，平板接种后24小时，将100μL的CellTiter-Glo发光试剂(Promega)加至每孔中，并在室温孵育30分钟。在Wallac Victor II仪器上记录发光值。CellTiter-Glo试剂导致细胞裂解并产生与ATP存在量成比例的发光信号，而ATP又与细胞存在量成正比例。

将测试化合物溶于100％DMSO以制备10mM储备液。以1∶400将储备液进一步稀释在生长培养基以得到0.25％DMSO中的25μM测试化合物工作储备液。将测试化合物在含0.25％DMSO的生长培养基中连续地稀释，以维持所有孔中恒定的DMSO浓度。向每个培养孔中加入60μL稀释的测试化合物，得到180μL最终体积。将用和没用各个测试化合物的细胞孵育72小时，此时如同先前所述测量ATP依赖的发光值，得到T_72h值。任选地，应用化合物浓度对抑制百分比的最小二乘法分析程序，可确定值IC₅₀。

％抑制＝[-(T_72h测试-T_Oh/(T_72h对照-T_Oh)]×100，其中

T_72h测试＝在测试化合物存在下72小时的ATP依赖发光值

T_72h对照＝在测试化合物缺失下72小时的ATP依赖发光值

T_Oh＝零时间的ATP依赖发光值

血管生成

研究血管生成的一个有用的模型是基于以下观测，在构建基膜基质如基质胶(Matrigel)时，增补生长因子(例如，FGF-1)，皮下注射至宿主动物，将内皮细胞添补至基质，经几天的时期形成新的血管。参见例如Passaniti等Lab.Invest.，67：519-528，1992。对于在不同时间取提取物，可将血管生成暂时分开，以允许在血管生成的所有阶段鉴定涉及的基因，包括例如内皮细胞迁移至基质、内皮细胞对血管生成途径的行为、细胞延伸和囊肿样(sac-like)的空间形成、和包含连接的功能毛细血管的建立、和含红血细胞的有线性结构。为了稳定生长因子和/或减慢其从基质中释放，生长因子可与肝素或其它的稳定剂结合。基质也可以周期地再输入生长因子以促进和延伸血管生成的过程。

研究血管生成的其它有用的系统包括例如肿瘤外植体的新生血管形成(例如美国专利号.5,192,744；6,024,688)、鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)测定(例如，Taylor和Folkman，Nature，297：307-312，1982；Eliceiri等，J.CellBiol.，140，1255-1263，1998)、牛毛细管内皮(BCE)细胞测定(例如，美国专利号.6,024,688；Polverini，P.J.等，Methods Enzymol.，198：440-450，1991)、迁移测定法、和HUVEC(人脐带血管内皮细胞)生长抑制测定(例如，美国专利号.6,060,449)。

本发明也提供一种或多种下述特征：

前述任何疾病和/或病状的治疗方法，包含施用有效量的至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物。

一种或多种前述活性的调节(例如抑制)方法，包含施用有效量的至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物。

组合，包含至少一种式I化合物和至少一种PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物。

相信本领域技术人员不需进一步详细说明地应用上述说明，可利用本发明至最完整的程度。因此，下列优选的具体实施方案仅仅是用作说明的解释，无论如何不以任何方式限制剩余的公开内容。在此将上面和下面引用的所有专利和出版物的全部公开内容全文引入作为参考。

实施例

人细胞的分离和培养

在获得知情许可后，随着常规包皮环切术，从人包皮中分离人成纤维细胞。在4℃将皮肤样品储存在含有青霉素、庆大霉素和两性霉素的不含Ca2+或Mg2+的汉克Hank′s平衡盐溶液(HBSS w/o Ca2+或Mg2+)中。剪去皮下脂肪，并将剩余皮肤剪切成小片，然后在含有0.25％胰蛋白酶(Trypsin)作为活性成分(12)的溶液B中，4℃消化大约19小时。从皮肤上分离表皮后，用溶液A(12)停止胰蛋白酶的作用。从人包皮的皮肤外植体获得人成纤维细胞，然后在含10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养。至于黑色素瘤构建，可应用最高至7代的成纤维细胞。将Skmel28(13)和451Lu(14)转移的人黑色素瘤细胞分别培养于添加0％FBS的RPMI 1640培养基和含5μg/ml胰岛素和2％FBS的MCDB153/L15培养基中(15)。

转移性黑色素瘤的体外构建

转移性黑色素瘤的体外构建是基于器官特征的人皮肤培养技术(14)。制备无细胞的缓冲胶原溶液，其组成为溶于含10％FBS的达尔伯克改良伊格尔培养基中的终浓度1.35mg/ml大鼠尾胶原I型(BDBiosciences，Bedford，MA，USA)。向位于六孔组织培养皿的组织培养嵌入物(Millicell PC，Millipore，Bedford，MA，USA)中，加入1.0ml无细胞的胶原溶液。当无细胞的胶原层凝固时，类似于第一种胶原溶液地制备第二种胶原溶液，加入人成纤维细胞和色素瘤细胞SKMEL28或451LU。使分汇合培养的人成纤维细胞和人黑色素瘤细胞受到胰蛋白酶作用、洗涤并以15×10⁵/ml的密度和成纤维细胞与黑色素瘤细胞1∶1的比例再悬浮在第二种胶原溶液中。将3.0ml含成纤维细胞和黑色素瘤细胞的胶原溶液置于固化无细胞的胶原层。37℃孵育5天后，成纤维细胞的收缩力引起胶原凝胶收缩。这种结构表示黑色素瘤构建成皮肤等同物。至于浸没培养(submerged culture)条件，将3ml添有10％FBS的黑色素瘤细胞培养基加至嵌入物之下，内部嵌入物2ml允许种子细胞增殖。每隔一天更换培养基。在深层培养的10至14天，收集并评价黑色素瘤的构建。

用信号途径抑制剂对黑色素瘤细胞的治疗

为了阻断AKT和MAPK信号途径，将PI3K抑制剂渥曼青霉素(Sigma，Steinheim，Germany)和BAY 43-9006单独或联合地分别以4μM和6μM直接加至黑色素瘤构建的培养基或单层培养黑色素瘤细胞中。先前已描述了这些浓度对黑色素瘤细胞6是有效的(16)。每隔一天更换培养基。作为对照，用培养基或加有DMSO的培养基处理黑色素瘤构建。所有的实验双份进行并重复两次。

免疫组织化学

将黑色素瘤构建用4％甲醛固定8～9小时，脱水，并埋入石蜡。将石蜡切片用苏木素染色，用于常规光学显微镜检查。至于免疫组织化学，将黑色素瘤构建的石蜡切片与抗磷酸-AKT(Ser473)和磷酸-ERK的单克隆抗体(磷酸-p44/42 MAP激酶，Thr202/Tyr204)(New EnglandBiolabs，Frankfurt am Main，Germany)、作为增殖标记的Ki-67(Dianova，Hamburg，Germany)、抗活性细胞凋亡蛋白酶3的多克隆抗体(R&DSystems，Wiesbaden，Germany)、或抗β3整合素亚基17和MeICAM的单克隆抗体(Novocastra Laboratories，Newcastle upon Tyne，UK)一起孵育。将切片用PBS洗涤，然后在室温用各自的次级抗体孵育30分钟(Vector，Burlingame，CA)。在进一步用PBS洗涤切片后，用VectastainABC-AP System(Vector，Burlingame，CA)在室温孵育1小时。将切片再用PBS洗涤，用中性品红显影和用苏木素对比染色。

增殖测定

以每孔1,500个细胞的密度在96孔板150μl培养基中(1×10⁴个细胞/ml)接种细胞。将PI3K抑制剂渥曼青霉素(Sigma，Steinheim，Germany)以2-20μM的浓度直接加至培养基中。将BAY 43-9006以0.5-7μM的浓度直接加至培养基中。培养基、用培养基处理的细胞、和用加有DMSO的培养基处理的细胞充当对照。在指定的时间点开始测定。除去培养基，用PBS(不含Ca2+and Mg2+)洗涤每个孔两次，加入100μl含有100μg MUH(4-甲基伞花基庚酸酯methylumbelliferyl-hepanoat)庚酸酯/ml PBS的溶液。在37℃将板孵育1小时，然后在Fluoroskan II(Labsystems，Helsinki)中用λ_cm355nm和λ_cx460nm测量。荧光强度表示孔中活细胞的数目(18，19)。

流式细胞计量术

1×10⁵-1×10⁶451Lu转移性黑色素瘤细胞表面蛋白质的染色如下：将细胞以1,800rpm(Heraeus variofuge 3.OR)粒化5分钟，用1xPBS/1％BSA处理(blocked)，离心后用抗Mel-CAM(QBiogene-Alexis)或avβ3整合素(BD Biosciences，Heidelberg)抗体在室温孵育15分钟。将细胞用1xPBS/1％BSA洗涤，随后用抗小鼠IgG-FITC(BD Biosciences，Heidelberg)或单独小鼠IgG-同型对照-FITC(BD Biosciences，Heidelberg)孵育。在洗涤并将细胞粒化后，将粒化的细胞再悬浮于1xPBS中，并在FACScalibur(BD Bioscienses，Heidelberg)中测量。

结果

阻断MAPK或AKT信号途径对黑色素瘤细胞生长和粘着受体表达引起不同效果。

为了分析抑制MAPK或AKT信号途径或这两种途径对黑色素瘤细胞增殖的影响，我们用PI3K抑制剂渥曼青霉素、BAY 43-9006、或这两种一起处理单层转移性黑色素瘤细胞系451Lu。基于先前的研究(6-16)，我们选择了4μM渥曼青霉素和6μM BAY 43-9006作为工作浓度。

通过应用4-甲基伞花基庚酸酯(MUH)的荧光测定(18，19)，可确定抑制这些信号途径对细胞增殖的影响。当比较来自对照的451Lu转移性黑色素瘤细胞和以2-20μM剂量的PI3K抑制剂渥曼青霉素处理过的451Lu转移性黑色素瘤细胞的单层培养时，观察到增殖细胞数目有小的影响或没有影响(图1A)。相反地，在1-7μM剂量的BAY 43-9006处理后，451Lu细胞的增殖速度显著地减少(图1B)。用Skmel28转移性黑色素瘤细胞获得了相似的发现。这表明在单层中阻断MAPK但不阻断AKT的信号途径抑制黑色素瘤细胞增殖。

此外，我们检测了抑制这些信号途径是否影响黏着分子MelCAM和avβ3整合素(已知在黑色素瘤细胞侵袭中担任关键作用)的表达。通过在处理开始后96小时的流式细胞计量术，分析PI3K抑制剂渥曼青霉素和BAY 43-9006对451Lu转移性黑色素瘤细胞中MelCAM和avβ3整合素表达的影响(图2)。感兴趣地，阻断AKT下调黏着分子MelCAM但不下调avβ3整合素的表达，然而阻断ERK下调avβ3整合素但不下调MelCAM的表达。用Skmel28转移性黑色素瘤细胞可观察到相似的效果。

阻断MAPK但不阻断AKT的信号途径在人皮肤构建中抑制黑色素瘤细胞的增殖

为了确定抑制PI3K/AKT信号途径和RAS/RAF/MEK/ERK信号途径是否能影响在生理学环境中的黑色素瘤生长和存活，将Skmel28转移性黑色素瘤细胞掺入人皮肤构建中。用4μM渥曼青霉素、6μM BAY43-9006或与BAY 43-9006组合的渥曼青霉素处理构建的转移性黑色素瘤。2-3周内每隔一日将这些抑制剂加到培养基中。当通过免疫组织化学分别观测磷酸化的AKT或ERK时，这些抑制剂的浓度在抑制AKT或MAP激酶途径的磷酰化作用中是有效的。为了评价抑制剂的抗增殖效果，将黑色素瘤构建物染Ki-67增殖标记。如图3A中所示，没有用抑制剂或只用DMSO处理的Skmel28转移性黑色素瘤细胞大多数在皮肤构建中增殖。在用渥曼青霉素处理的转移性黑色素瘤构建物中，对增殖速度观察到小的影响或没有影响(图3B)。相反地，用BAY 43-9006处理导致细胞增殖的显著减少(图3C)。当将Skmel28转移性黑色素瘤细胞掺入皮肤构建中并用组合的抑制剂处理时，Skmel28黑色素瘤细胞的增殖完全被阻滞(图3D)。这些数据表明BAY 43-9006不仅在单层而且在生理学环境中限制转移性黑色素瘤细胞的生长，并且组合的抑制PI3K和MAPK信号途径完全取消了黑色素瘤细胞的增殖。

阻断AKT和MAPK信号途径在人皮肤构建中引起黑色素瘤细胞的细胞凋亡

为了研究PI3K抑制剂渥曼青霉素和/或BAY 43-9006对在器官型培养中的黑色素瘤细胞存活影响，将对照和抑制剂处理Skmel28转移性黑色素瘤构建物的活性细胞凋亡蛋白酶-3染色，作为进行的细胞凋亡的标记。大多数对照的掺入皮肤构建中的Skmel28转移性黑色素瘤细胞，在细胞质中对活性细胞凋亡蛋白酶-3是阴性反应的(图4A)。相反地，在用PI3K抑制剂渥曼青霉素(图4B)或BAY 43-9006(图4C)或此两者(图4D)处理的人皮肤构建中，Skmel28转移性黑色素瘤细胞大多数发现活性细胞凋亡蛋白酶-3。这些观察提示转移性黑色素瘤细胞的存活涉及AKT和MAPK两种信号途径。

阻断AKT和MAPK信号途径分别下调皮肤构建中转移性黑色素瘤细胞的黏着分子MelCAM和β3整合素的表达。

我们及其他人先前描述了调黏着分子MelCAM和β3整合素在黑色素瘤进程和侵袭中中担有作用(9，6，10，11)。因此，我们检测了阻断AKT和RAF对MelCAM和β3整合素表达的影响。为了分析在生理学环境中受体的表达，将转移性黑色素瘤细胞Skmel28和WM451Lu掺入人皮肤构建中，并用PI3K抑制剂渥曼青霉素(4μM)、BAY 43-9006(6μM)或两种抑制剂的组合处理。分别为了黏着分子MelCAM(图5A-D)和β3整合素(图5E-H)，将对照和经抑制剂处理过的转移性黑色素瘤构建物染色。

渥曼青霉素处理下调了MelCAM的表达，而β3整合素的表达不受影响(图5A-H)。另一方面，BAY 43-9006处理显著地减少了β3整合素的表达，而MelCAM的表达不受影响。用两种抑制剂处理导致MelCAM和β3整合素的表达下调。这些数据表明阻滞两种信号途径-PI3K/AKT和MAP激酶，会下调两种黏着分子。

阻断AKT和MAPK信号途径抑制侵袭性黑色素瘤生长

最后，我们确定了抑制PI3K/AKT信号途径和MAP激酶信号途径是否能够影响生理学环境中侵袭性黑色素瘤生长。将Skmel28转移性黑色素瘤细胞掺入人皮肤构建中。用4μM渥曼青霉素、6μM BAY 43-9006、或与BAY 43-9006组合的渥曼青霉素处理构建的转移性黑色素瘤。当转移性Skmel28黑色素瘤细胞掺入构建的人皮肤时，它们显示出遍及整个皮肤的多个肿瘤细胞巢迅速生长(图6A)。由渥曼青霉素抑制AKT信号途径或由BAY 43-9006抑制MAPK信号途径等在构建的皮肤中导致Skmel28转移性黑色素瘤细胞的侵袭性肿瘤生长减少(图6B和C)。在用PI3K抑制剂渥曼青霉素(图6B)处理后，减少了黑色素瘤细胞巢的数目和大小，出现了疏松，提示黑色素瘤-黑色素瘤细胞粘着降低。此外，黑色素瘤细胞显示了丰度树突形态。抑制剂BAY 43-9006(图6C)的应用也减少了黑色素瘤细胞巢的数目和大小。

小黑色素瘤细胞巢和单个黑色素瘤细胞散布于整个皮肤。此外，由渥曼青霉素与BAY 43-9006的组合同时阻断AKT和MAPK信号途径，完全取消了侵袭性黑色素瘤生长，只有非常少的圆形黑色素瘤细胞留在皮肤(图6D)。用转移性黑色素瘤细胞系451Lu获得了相似的结果。

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Claims (33)

1.组合，包含至少一种式I化合物或其药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢物、前体药物或非对映异构体形式，其中所述的式I化合物为：

其中

Q为-C(O)Rx

Rx为羟基、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基或NR_aR_b，

R_a和R_b独立地为：

a)氢；

b)C_1-4烷基，任选地被下列取代基取代

-羟基，

-C_1-4烷氧基，

-杂芳基基团，其选自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、四唑、噻二唑、二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、三嗪、苯并唑、异喹啉、喹啉和咪唑并嘧啶

-杂环基团，其选自四氢吡喃、四氢呋喃、1，3-二氧戊环、1，4-二氧杂环己烷、吗啉、硫代吗啉、哌嗪、哌啶、哌啶酮、四氢嘧啶酮、五甲撑硫、四氢噻吩、二氢吡喃、二氢呋喃、和二氢噻吩，

-氨基，-NH₂，任选地被一个或两个C_1-4烷基取代，或

-苯基，

c)苯基，任选地用下列取代基取代

-卤素，或

-氨基，-NH₂，任选地被一个或两个C_1-4烷基取代，或

d)-杂芳基基团，其选自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、四唑、噻二唑、二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、三嗪、苯并唑、异喹啉、喹啉和咪唑并嘧啶；

A为任选取代的式1xx的苯基基团：

任选取代的式1x的吡啶基基团：

或任选取代的式1y的萘基基团：

B为任选取代的式2a和2b的苯基或萘基：

和

L为-S-或-O-的桥连基团，

p为0、1、2、3、或4，

n为0、1、2、3、4、5或6，

m为0、1、2或3，

各个R¹独立地为：卤素、C_1-5卤代烷基、NO₂、C(O)NR⁴R⁵、C_1-6烷基、C_1-6二烷基胺、C_1-3烷基胺、CN、氨基、羟基或C_1-3烷氧基，

各个R²独立地为：C_1-5烷基、C_1-5卤代烷基、C_1-3烷氧基、N-氧代或N-羟基，

各个R³独立地选自：卤素、R⁴、OR⁴、S(O)R⁴、C(O)R⁴、C(O)NR⁴R⁵、氧、氰基或硝基(NO₂)和

R⁴和R⁵独立地选自：氢、C_1-6烷基、或最高至全卤代的C_1-6烷基，

和至少一种为PI3K/AKT信号途径抑制剂的第二种化合物。

2.如权利要求1的组合，其中

A为：3-叔丁基苯基、5-叔丁基-2-甲氧基苯基、5-(三氟甲基)-2苯基、3-(三氟甲基)-4氯苯基、3-(三氟甲基)-4溴苯基或5-(三氟甲基)-4氯-2甲氧基苯基；

B为

R¹为氟、氯、溴、甲基、NO₂、C(O)NH₂、甲氧基、SCH₃、三氟甲基、或甲磺酰基；

R²基团的实例包括甲基、乙基、丙基、氧、或氰基和

R³为三氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基、氯、氟、溴、氰基、甲氧基、乙酰基、三氟甲磺酰基、三氟甲氧基、或三氟甲硫基。

3.如权利要求1至2的组合，其中式I化合物也为下式II的化合物或其盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢物、前体药物或非对映异构体形式：

其中

Ra和Rb独立地为氢和C_1-4烷基，

式II的B为

其中脲基-NH-C(O)-NH-和氧桥连基团不邻近地接在B的环碳上，而是更正确地说具有1或2个环碳将它们分开，

和式(II)的A为，

或

其中变量n为0、1、2、3或4，和

R³为三氟甲基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基、氯、氟、溴、氰基、甲氧基、乙酰基、三氟甲磺酰基、三氟甲氧基、或三氟甲硫基。

4.权利要求2的组合，其中各个R³取代基选自氯、三氟甲基、叔丁基或甲氧基，

式II的A为

和

式II的B为亚苯基、氟取代的亚苯基或二氟取代的亚苯基。

5.权利要求1至4的任何组合，其中式I化合物也为下式X的化合物或其盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢物、前体药物或非对映异构体形式：

其中苯基环″B″任选地具有一个卤素取代基，

A为任选取代的式1xx的苯基基团：

任选取代的式1x的吡啶基基团：

或任选取代的式1y的萘基基团：

n为0、1、2、3、4、5或6，

m为0、1、2或3，

各个R²独立地为：C_1-5烷基、C_1-5卤代烷基、C_1-3烷氧基、N-氧代或N-羟基，

各个R³独立地选自：卤素、R⁴、OR⁴、S(O)R⁴、C(O)R⁴、C(O)NR⁴R⁵、氧、氰基或硝基(NO₂)和

R⁴和R⁵独立地选自：氢、C_1-6烷基、或最高至全卤代的C_1-6烷基。

6.如权利要求5的组合，其中m为零和A为具有至少一个取代基R³取代的苯基。

7.如权利要求6的组合，其中R³为卤素、三氟甲基和/或甲氧基。

8.权利要求1的组合，其中式I化合物也具有下Z1或Z2之一结构或其盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢物、前体药物或非对映异构体形式：

或

9.权利要求8的组合，其中式I化合物为式Z1化合物的甲苯磺酸盐。

10.权利要求1至9的任何一项的组合，其中PI3K/AKT信号途径抑制剂选自以下化合物：FTY720、UCN-O1、塞来考昔及其类似物、3-脱氧-D-肌醇类似物、2′-取代的3′-脱氧-磷脂酰肌醇类似物、3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)衍生物、Ly294002、喹唑啉-4-酮衍生物、3-(杂)芳氧基取代的苯并(b)噻吩衍生物、绿胶霉素、半合成的绿胶霉素、Akt-1-1、Akt-1-1，2、API-59CJ-Ome、1-H-咪唑并[4，5-c]吡啶基化合物、吲哚-3-甲醇及其衍生物、哌立福辛、磷脂酰肌醇醚脂类似物、曲西立滨和FKBP 12增强子。

11.权利要求10的组合，其中塞来考昔的类似物为OSU-03012、OSU-03013。

12.权利要求10的组合，其中3-脱氧-D-肌醇类似物为PX-316。

13.权利要求10的组合，其中喹唑啉-4-酮衍生物为IC486068。

14.权利要求10的组合，其中半合成的绿胶霉素为PX-866。

15.权利要求10的组合，其中所述第二种化合物为FKBP 12增强子。

16.权利要求1至9的任何一项的组合，其中PI3K/AKT信号途径抑制剂为塞来考昔、OSU-03012、OSU-03013、PX-316、2′-取代的3′-脱氧磷脂酰肌醇衍生物、3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)衍生物、Ly294002、IC486068、3-(杂)芳氧基取代的苯并(b)噻吩衍生物、PX-866、哌立福辛、曲西立滨、FKBP 12增强子、磷脂酰肌醇醚脂类似物、渥曼青霉素或雷帕霉素或它们的衍生物、或它们的药学上可接受的盐。

17.权利要求1至9的任何一项的组合，其中所述第二种化合物为式W的渥曼青霉素化合物：

式W的渥曼青霉素化合物的衍生物或类似物、式W的渥曼青霉素化合物的药学上可接受的盐、式W的渥曼青霉素化合物的衍生物或类似物的药学上可接受的盐。

18.权利要求17的组合，其中所述的式W的衍生物或类似物选自

a)式W1的化合物

其中R为H(11-去乙酰氧基渥曼青霉素)或乙酰氧基和R′为C_1-6烷基，

b)式W2的Δ9，11-去氢去乙酰氧基渥曼青霉素化合物

其中R′为C_1-6烷基，

c)式W3的17(α-二氢-渥曼青霉素化合物

其中R为H或乙酰氧基，和R′为C_1-6烷基，和R″为H、C_1-6烷基、-C(O)OH或-C(O)O-C₁-C₆烷基；

d)式W4的渥曼青霉素化合物的A-开环酸或酯

其中R₁为H、甲基或乙基和R₂为H或甲基或

e)式W5渥曼青霉素的11-取代的和17-取代的衍生物

其中R₄为＝O或-0(CO)R₆，R₃为＝0、-OH或-0(CO)R₆，每个R₆独立为苯基、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基，其中R₄为＝O或-OH时，R₃不为＝0。

19.权利要求1至9的任何一项的组合，其中所述第二种化合物为Akt激酶抑制剂。

20.权利要求1至9的任何一项的组合，其中所述第二种化合物为Akt-1-1、Akt-1-1，2、API-59CJ-Ome、1-H-咪唑并[4，5-c]吡啶基衍生物、吲哚-3-甲醇及其衍生物、哌立福辛、磷脂酰肌醇醚脂类似物、曲西立滨、或它们的药学上可接受的盐。

21.权利要求1至9的任何一项的组合，其中所述第二种化合物为mTOR抑制剂。

22.权利要求1至9的任何一项的组合，其中所述第二种化合物为雷帕霉素、temsirolimus、依维莫司、AP23573、AP23675、AP23464、AP23841、40-(2-羟乙基)雷帕霉素、40-[3-羟基(羟甲基)甲基丙酸酯]-雷帕霉素、40-表-(四唑基(tetrazolyt))-雷帕霉素、32-脱氧雷帕霉素、或16-戊炔基氧基-32(S)-二氢雷帕霉素、SAR 943或它们的药学上可接受的盐。

23.权利要求1至9的任何一项的组合，包含式(I)化合物和渥曼青霉素。

24.权利要求1至9的任何一项的组合，包含式(I)化合物和雷帕霉素。

25.权利要求1的组合，其中所述第二种化合物为PI3激酶抑制剂。

26.权利要求1的组合，其中所述第二种化合物为塞来考昔、OSU-03012、OSU-03013、PX-316、2′-取代的3′-脱氧磷脂酰肌醇衍生物、3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)衍生物、Ly294002、IC486068、3-(杂)芳氧基取代的苯并(b)噻吩衍生物、PX-866或它们的药学上可接受的盐。

27.权利要求1至26的任何一项的组合，其中该组合的活性成分的量为协同作用的。

28.权利要求1至27的任何一项的组合，其用于治疗癌症。

29.权利要求28的组合，其中所述的癌症为黑素色瘤、肝细胞癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、乳癌或胰腺癌。

30.在需要治疗的受试者中治疗癌症的方法，包括施用至少一种有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂化物、水合物、代谢物、前体药物或非对映异构体形式，

其中所述的式I化合物为：

其中

Q为-C(O)Rx

Rx为羟基、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基或NR_aR_b，

R_a和R_b独立地为：

a)氢；

b)C_1-4烷基，任选地被下列取代基取代

-羟基，

-C_1-4烷氧基，

-杂芳基基团，其选自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、四唑、噻二唑、二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、三嗪、苯并唑、异喹啉、喹啉和咪唑并嘧啶

-杂环基团，其选自四氢吡喃、四氢呋喃、1，3-二氧戊环、1，4-二氧杂环己烷、吗啉、硫代吗啉、哌嗪、哌啶、哌啶酮、四氢嘧啶酮、五甲撑硫、四氢噻吩、二氢吡喃、二氢呋喃、和二氢噻吩，

-氨基，-NH₂，任选地被一个或两个C_1-4烷基取代，或

-苯基，

c)苯基，任选地用下列取代基取代

-卤素，或

-氨基，-NH₂，任选地被一个或两个C_1-4烷基取代，或

d)-杂芳基基团，其选自吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噻唑、唑、异唑、异噻唑、三唑、四唑、噻二唑、二唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、三嗪、苯并唑、异喹啉、喹啉和咪唑并嘧啶；

A为任选取代的式1xx的苯基基团：

任选取代的式1x的吡啶基基团：

或任选取代的式1y的萘基基团：

B为任选取代的式2a和2b的苯基或萘基：

和

L为-S-或-O-的桥连基团，

p为0、1、2、3、或4，

n为0、1、2、3、4、5或6，

m为0、1、2或3，

各个R¹独立地为：卤素、C_1-5卤代烷基、NO₂、C(O)NR⁴R⁵、C_1-6烷基、C_1-6二烷基胺、C_1-3烷基胺、CN、氨基、羟基或C_1-3烷氧基，

各个R²独立地为：C_1-5烷基、C_1-5卤代烷基、C_1-3烷氧基、N-氧代或N-羟基，和

R⁴和R⁵独立地选自：氢、C_1-6烷基、或最高至全卤代的C_1-6烷基；

和至少一种如权利要求1至26中任何一项所定义的第二种化合物。

31.权利要求1至26任何一项的组合的制备方法，其用于治疗癌症。

32.权利要求31的方法，其中所述的癌症为黑素色瘤、肝细胞癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、乳癌或胰腺癌。

33.药物组合物，包含权利要求1至29的任何一项的组合。