CN107531683B - Usp7抑制剂化合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了式I的2‑氨基吡啶化合物及各种替代物(包括其立体异构体、互变异构体和药用盐)，其可用于调节USP7并用于治疗癌症和免疫病症例如由USP7介导的炎症。本申请公开了使用式I化合物进行体外、原位和体内诊断和治疗哺乳动物细胞中的上述疾病或相关病理学疾病的方法。

Description

USP7抑制剂化合物及使用方法
技术领域
本申请大体涉及用于治疗由USP7介导的包括炎症、免疫学和癌症在内的病症的化合物且更具体地涉及抑制或调节USP7活性或功能的化合物。本申请还涉及使用所述化合物用于体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理状况的方法。
背景技术
泛素即一种作为其它蛋白质上翻译后标记起作用的小蛋白质具有惊人量的构象异质性(Lange,O.F.等人(2008)Science 320,1471-1475)。蛋白质泛素介导许多细胞过程例如细胞周期控制、凋亡、表观遗传学和转录调控(Clague,M.J.等人(2010)Cell 143:682-685)。泛素的C末端通过以下三类酶的协同作用共价附接至底物蛋白质的赖氨酸或N末端：E1活化物、E2共轭物和泛素连接酶(泛素E3)(Pickart,C.M.(2001)Annu.Rev.Biochem.70:503-533)。泛素的七个赖氨酸或N末端各自也可用作进一步泛素化的底物，这允许聚合成具有传达大量信息的连接的泛素链(Pickart,C.M.等人(2004)Curr.Opin.Chem.Biol.8:610-616)。泛素的β1-β2环内的运动已经涉及到其被配偶体蛋白所识别，尽管目前尚不清楚每种配偶体如何“阅读”apo泛素的构象状态。apo泛素的多重构象可能代表一种折中，所述折中允许其单一蛋白表面以中等亲和力结合很多种不相关的配偶体(Humphris,E.L.等人(2007)PLoS Comput.Biol.3,e164(2007)；Friedland,G.D.等人(2009)PLoSComput.Biol.5,e1000393)。
脱泛素酶(DUB)是一类专门的蛋白酶，其通过解开泛素链或从底物中除去单泛素化来调节由泛素介导的信号传导(Heideker,J.和Wertz,I.E.(2015)Biochem.J.465:1-26；Lill,J.R.和Wertz,I.E.(2014)Trends in Pharm.Sci.35(4):187-207；Komander,D.等人(2009)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.10:550-563)。有约100种确定的人DUB，其中大多数有待广泛研究。一个例外是USP7(也称为HAUSP)即一种泛素特异性蛋白酶(USP)，其通过其对Mdm2、p53、FOXO4和PTEN的作用在肿瘤发生中具有确定的作用(Nicholson,B.等人(2011)CellBiochem.Biophys.60:61-68；Hussain,S.等人(2009)Cell Cycle8:1688-1697)。虽然USP7在一些途径中的精确功能的确定已经由于冲突的报道而变得复杂(Li,M.等人(2004)Mol.Cell 13:879-886；Li,M.等人(2002)Nature 416:648-653)，但是该酶参与许多癌症相关过程已经成为有吸引力的治疗靶标。
尽管其具有细胞重要性，但是USP7的催化中心意外地无活性，其具有约103M-1s-1的催化效率(kcat/Km)和几百微摩尔浓度的对泛素的亲和力(KD)(Faesen,A.C.等人(2011)Mol.Cell 44:147-159；Fernández-Montalván,A.等人(2007)FEBS J.274,4256-4270)。构象异质的β1-β2环被所有DUB(包括USP7)所直接接触。因此，寻求确定使泛素的β1-β2区域的USP7结合构象得以稳定是否可产生对靶标DUB具有高亲和力的变体。鉴于USP7在细胞分裂中的作用和围绕USP7敲除的技术难题，构象经优化的基于泛素的对USP7具有高亲和力和特异性的抑制剂可证明是了解USP7的细胞功能的有力工具。在相关方法中，泛素的表面工程化用于产生泛素信号传导酶的强效结合剂(Ernst等人,Science doi:10.1126/science.1230161(2013年1月3日)；Zhang,Y.等人(2013)Nature Chemical Biology 9(1):51-58)。
USP7或HAUSP(疱疹病毒相关USP)是使泛素与其底物裂解的泛素特异性蛋白酶或脱泛素酶(Holowaty MN等人(2003)J.Biol.Chem.278(48):47753-47756)。由于泛素化(多泛素化)最常与细胞蛋白的稳定性和降解相关，因此HAUSP活性通常稳定其底物蛋白质。HAUSP公知为Mdm2(针对肿瘤抑制蛋白p53的E3泛素连接酶)的直接拮抗剂(Li M等人(2002)Nature416(6881):648-53)。通常，p53水平部分由于由Mdm2介导的泛素化和p53的降解而保持在低水平。响应于致癌损害，HAUSP可使p53去泛素化并保护p53免受由Mdm2介导的降解，这表明它可能具有肿瘤抑制功能，从而在应激时立即稳定p53。HAUSP功能的另一重要作用涉及p53的致癌稳定。据信致癌基因例如Myc和E1A通过p19替代阅读框(p19ARF,也称为ARF)依赖性途径激活p53，尽管一些证据表明ARF在该过程中不是必需的。一种可能性是HAUSP提供了保护细胞免受致癌损害的替代途径。
USP7是通过改变Mdm2、p53、PTEN和FOXO4的稳定性来控制细胞增殖的DUB。尽管USP7在肿瘤相关途径中具有重要性，但关于其细胞和生物化学调节知之甚少且关于其在Mdm2-p53轴中的精确作用有一些困惑，部分原因是缺乏抑制性工具。USP7的催化结构域在体外相对低效，具有对其泛素底物几乎不可检测的亲和力和相对较差的催化效率。USP7的C末端及第四和第五个Ubl结构域通过增加的kcat和降低的Km的组合大大增加其活性，尽管目前尚不知道实现这些效果的机制。泛素构象的工程化可大大增加其与脱泛素酶例如USP7的相互作用(Zhang,Y.等人(2013)Nature Chemical Biology 9(1):51-58)。
泛素/蛋白酶体系统(UPS)的失调已经涉及包括癌症在内的许多人类疾病的发病机理(Vucic,D.等人(2011)Nature Reviews Molecular Cell Biology12:439-452)。泛素特异性蛋白酶(USP)是参与蛋白底物的去泛素化的半胱氨酸蛋白酶。USP7与基本病毒蛋白和致癌途径(例如p53/Mdm2和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B网络)之间的功能联系强烈地表明用小分子抑制剂靶向USP7可用于治疗癌症和病毒性疾病。
靶向作为泛素-蛋白酶体系统一部分的凋亡调节蛋白的治疗剂可能提供临床益处(Vucic,D.等人(2011)Nature Reviews Molecular Cell Biology12:439-452)。已经报道了脱泛素酶抑制剂和拮抗剂(Lill,J.R.和Wertz,I.E.(2014)Trends in Pharm.Sci.35(4):187-207,参见第195页表2；Ndubaku,C.和Tsui,V.(2015)J.Med.Chem.DOI:10.1021/jm501061a)。靶向泛素-蛋白酶体系统用于治疗癌症的推理通过FDA批准和用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的硼替佐米(
Figure BDA0001454033950000032
；Millennium Pharmaceuticals)的临床疗效验证。与USP7沉默相关的表型强烈地表明USP7的小分子抑制剂可具有用于抗病毒和抗癌治疗的潜力(Li,M.等人(2002)Nature 416:648-653；Daviet,L.和Colland,F.(2008)Biochimie 90:270-283)。
发明内容
本申请大体涉及具有USP7调节活性或功能的具有式I结构的2-氨基吡啶化合物：
Figure BDA0001454033950000031
包括其立体异构体、互变异构体或药用盐。各个取代基在本申请中定义。
本申请一个方面是由式I化合物和药用载体、助流剂、稀释剂或赋形剂构成的药物组合物。所述药物组合物还可包含第二治疗剂。
本申请另一方面是用于制备药物组合物的方法，其包括将式I化合物与药用载体组合。
本申请包括治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的式I化合物，所述患者具有选自以下并由USP7介导的疾病或病症：免疫病症、癌症、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌功能障碍和神经学病症。
本申请包括用于治疗由USP7介导的疾病的试剂盒，其包含：a)包含式I化合物的第一药物组合物；和b)使用说明。
本申请包括式I化合物，其用作药物且用于治疗选自以下并由USP7介导的疾病或病症：免疫病症、癌症、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌功能障碍和神经学病症。
本申请包括式I化合物，其用于与治疗疾病或病症的另外的治疗剂组合。
本申请包括式I化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下并由USP7介导的疾病或病症：免疫病症、癌症、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌功能障碍和神经学病症。
本申请包括制备式I化合物的方法。
附图说明
图1A显示了化合物25、89和45在HCT116结肠癌细胞中的细胞增殖和半胱天冬酶活性(
Figure BDA0001454033950000041
Essen BioScience)数据。
图1B显示了化合物88和92在HCT116结肠癌细胞中的细胞增殖和半胱天冬酶活性(
Figure BDA0001454033950000042
Essen BioScience)数据。
图2A显示了Western印迹数据，其表明活性Palm化合物25、88、92而非化合物45和89在同基因HCT116结肠癌细胞系(分别为野生型(WT)、无USP7型和无p53型)中以p53依赖性和USP7依赖性方式稳定p53和p21。
图2B显示了用化合物45、25、88、92、89处理的HCT116结肠癌细胞系(野生型和无USP7型)中p53/微管蛋白变化的曲线图。
图2C显示了用化合物45、25、88、92、89处理的HCT116结肠癌细胞系(野生型和无USP7型)中p21/微管蛋白变化的曲线图。
图3A显示了Western印迹数据，其表明化合物88与活性较低的化合物89(15μM)在MCF7乳腺癌细胞中在放线菌酮(CHX)存在下对MDM2、微管蛋白、USP7、p53和p21的不稳定作用。
图3B显示了在放线菌酮(CHX)存在下用化合物88和89处理的细胞中MDM2/微管蛋白定量的曲线图。
图4显示了化合物88和89以USP7依赖性方式影响HCT116细胞(野生型和无USP7型)的细胞活力的曲线图，其表明活力的USP7依赖性降低。
图5显示了基于活性的分布的Western印迹数据，其显示与USP7对应的HA-探针缀合条带(箭头所指)在用化合物88处理的裂解物中是降低的，其表明88具有选择性DUB抑制作用。星号表示内源性HA-探针缀合DUB。
图6显示了基于活性的分布的Western印迹数据，其显示通过Western印迹评价，仅Palm结合化合物88而非89与其它DUB相比选择性拮抗内源性USP7，其表明88具有选择性DUB抑制作用。
图7显示了基于活性的分布的曲线图，其显示通过质谱法评价，活性Palm结合化合物与其它DUB相比选择性拮抗内源性USP7，其表明所述活性化合物具有选择性DUB抑制作用。
图8A显示了对相对于正常骨髓样本在多发性骨髓瘤样本中升高的USP7表达进行的免疫组织化学分析：核心1B：1+；核心1E：2+；核心2A：3+；和正常骨髓：0至1+。
图8B显示了对相对于正常乳腺样本在乳腺癌样本中升高的USP7表达进行的免疫组织化学分析：核心10E：淋巴结转移，3+；核心10F：转移，3+；核心10J：淋巴结转移，3+；和正常乳腺：腔细胞2+，基底细胞0。
图9显示了CellTiter-
Figure BDA0001454033950000051
(Promega Corp.)数据，其表明当用化合物88相对于化合物89处理时，含有野生型p53的肿瘤细胞系MCF-7和U2Os具有降低的活力，但是匹配的正常成骨细胞系及匹配的相同组织来源的无p53细胞系MDA-MB157和SaOs没有显示出类似的细胞活力降低，其表明与正常细胞相比对肿瘤的潜在治疗指数和肿瘤细胞活力降低的p53依赖性。
图10显示了来自实施例906的细胞增殖和半胱天冬酶活性数据(
Figure BDA0001454033950000052
EssenBioScience)，其表明与MDA-MB157无p53细胞相比，活性palm位点化合物88与89相比降低MCF-7p53WT乳腺癌细胞的细胞活力。
图11显示了来自实施例906的细胞增殖和半胱天冬酶活性数据(
Figure BDA0001454033950000061
EssenBioScience)，其表明与SaOs无p53细胞相比，活性palm位点化合物88与89相比降低U2Osp53WT骨肉瘤细胞的细胞活力。
图12A显示了Western印迹数据，其表明活性化合物88与89相比增加p53野生型乳腺癌和骨肉瘤细胞但不是正常细胞中的p53和p21水平。细胞在低血清培养基中用15μM化合物88和89处理<24小时。
图12B显示了用化合物88和89处理的p53野生型乳腺癌和骨肉瘤细胞但不是正常细胞中p53/微管蛋白变化的曲线图。
图12C显示了用化合物88和89处理的p53野生型乳腺癌和骨肉瘤细胞但不是正常细胞中p21/微管蛋白变化的曲线图。
图12D显示了用化合物88和89处理的p53野生型乳腺癌MCF7和MDA-MB157及骨肉瘤细胞U2Os和SaOs但不是正常细胞中MDM2/微管蛋白变化的曲线图。
图13A显示了细胞活力数据，其表明活性化合物88与89相比降低Cell Titer Glo信号，其表明KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中细胞活力的降低。
图13B显示了Western印迹数据，其表明活性化合物88与89相比增加KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中的p21水平。
图13C显示了用化合物88和89处理的KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中p53/微管蛋白变化的曲线图。
图13D显示了用化合物88和89处理的KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中p21/微管蛋白变化的曲线图。
图14A显示了Western印迹数据，其表明palm结合化合物88和89在结肠癌细胞系RKO和RKO-E6及宫颈癌细胞系Vibo和SiHA中使p53和p21稳定并使MDM2和E6AP不稳定。
图14B显示了用化合物88和89处理的结肠癌细胞系RKO和RKO-E6及宫颈癌细胞系Vibo和SiHA中E6AP/微管蛋白变化的曲线图。
图14C显示了用化合物88和89处理的结肠癌细胞系RKO和RKO-E6及宫颈癌细胞系Vibo和SiHA中MDM2/微管蛋白变化的曲线图。
图15显示了细胞增殖(
Figure BDA0001454033950000071
Essen BioScience)数据，其表明活性化合物88但不是化合物89降低结肠癌细胞系RKO和RKO-E6及宫颈癌细胞系Vibo和SiHA的细胞活力。
图16显示了顺铂(1μM)、化合物88和89(15μM)或88+顺铂和89+顺铂的组合在U2Os(骨肉瘤)细胞中的细胞增殖(
Figure BDA0001454033950000072
Essen BioScience)和半胱天冬酶活性数据。88+顺铂的组合治疗最有效地减少细胞增殖并提高半胱天冬酶活性。
图17显示了多柔比星(0.1μM)、化合物88和89(15μM)或88+多柔比星和89+多柔比星的组合在MCF7(乳腺癌)细胞中的细胞增殖(
Figure BDA0001454033950000073
Essen BioScience)和半胱天冬酶活性数据。88+多柔比星的组合治疗最有效地减少细胞增殖并提高半胱天冬酶活性。
具体实施方式
现详细描述本申请一些实施方案，其实例在所附结构和分子式中示例说明。虽然结合所列举的实施方案来描述本申请，但是应理解本申请不限于那些实施方案。相反地，本申请意在涵盖可包括在由权利要求书限定的本申请范围内的所有代替形式、修改形式和等同形式。本领域技术人员会认识到与本申请所述那些方法和材料类似或等同的多种方法和材料可用于实施本申请。本申请绝不限于所描述的方法和材料。在一份或多份所引入的文献、专利及类似材料与本申请(包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等)不同或矛盾的情况下以本申请为准。除非另有定义，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本申请所述那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本申请，但是以下描述了适当的方法和材料。通过引用的方式将本申请提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献全部引入到本申请中。除非另有说明，本申请使用的命名法基于IUPAC系统命名法。
定义
当说明取代基数目时，术语“一个或多个”是指一个取代基至最大可能数目的取代情况，即用取代基替换一个氢至替换全部氢。术语“取代基”表示对母体分子上的氢原子进行替换的原子或原子团。术语“取代”表示指定基团带有一个或多个取代基。当任何基团可带有多个取代基且提供各种可能取代基时，所述取代基是独立选择的且无需相同。术语“未取代”是指指定基团不带有取代基。术语“任选取代”是指指定基团是未取代的或被一个或多个独立选自可能取代基的取代基取代。当说明取代基数目时，术语“一个或多个”是指一个取代基至最大可能数目的取代情况，即用取代基替换一个氢至替换全部氢。
术语“烷基”用在本申请中是指具有1-12个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链的一价的烃基，其中所述烷基可任选独立被下述一个或多个取代基取代。在另一个实施方案中，烷基具有1-8个碳原子(C1-C8)或1-6个碳原子(C1-C6)。烷基的实例包括但不限于甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、1-庚基、1-辛基等。
术语“亚烷基”用在本申请中是指具有1-12个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链的二价的烃基，其中所述亚烷基可任选独立被下述一个或多个取代基取代。在另一个实施方案中，亚烷基具有1-8个碳原子(C1-C8)或1-6个碳原子(C1-C6)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。
术语“烯基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位点即碳-碳sp2双键的直链或支链的一价的烃基，其中所述烯基可任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代并包括具有“顺式”和“反式”取向或“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等。
术语“亚烯基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位点即碳-碳sp2双键的直链或支链的二价的烃基，其中所述亚烯基可任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代并包括具有“顺式”和“反式”取向或“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于亚乙烯基(-CH＝CH-)，亚烯丙基(-CH2CH＝CH-)等。
术语“炔基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位点即碳-碳sp叁键的直链或支链的一价的烃基，其中所述炔基可任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代。实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基、-CH2C≡CH)等。
术语“亚炔基”是指具有2-8个碳原子(C2-C8)的具有至少一个不饱和位点即碳-碳sp叁键的直链或支链的二价的烃基，其中所述亚炔基可任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代。实例包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-)、亚丙炔基(亚炔丙基、-CH2C≡C-)等。
术语“碳环”、“碳环基”、“碳环”和“环烷基”是指具有3-12个碳原子(C3-C12)呈单环形式或具有7-12个碳原子呈二环形式的一价的非芳族的饱和或部分不饱和的环。具有7-12个原子的二环碳环可排列成例如二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，而具有9或10个环原子的二环碳环可排列成二环[5,6]或[6,6]系统或可排列成桥环系统例如二环[2.2.1]庚烷、二环[2.2.2]辛烷和二环[3.2.2]壬烷。螺环碳环基也包括在该定义的范围内。螺环碳环基的实例包括[2.2]戊基、[2.3]己基和[2.4]庚基。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。碳环基任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代。
“芳基”是指通过由母体芳族环系的单个碳原子除去一个氢原子而得到的具有6-20个碳原子(C6-C20)的一价的芳族的烃基。一些芳基在示例性结构中表示为“Ar”。芳基包括包含与饱和环、部分不饱和环或芳族碳环稠合的芳族环的二环基团。典型的芳基包括但不限于由苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯、茚、茚满、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘等得到的基团。芳基任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代。
“亚芳基”是指通过由母体芳族环系的两个碳原子除去两个氢原子而得到的具有6-20个碳原子(C6-C20)的二价的芳族的烃基。一些亚芳基在示例性结构中表示为“Ar”。亚芳基包括包含与饱和环、部分不饱和环或芳族碳环稠合的芳族环的二环基团。典型的亚芳基包括但不限于由苯(亚苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯、茚、茚满、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘等得到的基团。亚芳基任选被本申请所述的一个或多个取代基取代。
术语“杂环”、“杂环基”和“杂环”在本申请中可互换使用且是指具有3至约20个环原子的其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和硫的杂原子且其余环原子是C的饱和或部分不饱和(即在环中具有一个或多个双键和/或叁键)的碳环基团，其中一个或多个环原子任选独立被下述一个或多个取代基取代。杂环可为具有3-7个环成员(2-6个碳原子和1-4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子和1-6个选自N、O、P和S的杂原子)的二环例如二环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂环参见Paquette,Leo A.,“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968),特别是第1、3、4、6、7和9章；“The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series ofMonographs”(John Wiley&Sons,New York,1950年至今),特别是第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。“杂环基”还包括其中杂环基与饱和环、部分不饱和环、芳族碳环或芳族杂环稠合的基团。杂环的实例包括但不限于吗啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫吗啉-4-基、S-二氧代硫吗啉-4-基、氮杂环辛烷-1-基、氮杂环丁烷-1-基、八氢吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮杂环庚烷-1-基、吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫吗啉代、硫杂氧杂环己烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧杂氮杂
Figure BDA0001454033950000101
基、二氮杂
Figure BDA0001454033950000102
基、硫杂氮杂
Figure BDA0001454033950000103
基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、吡唑啉基、二硫杂环己烷基、二硫杂环戊烷基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己基、3-氮杂二环[4.1.0]庚基、氮杂二环[2.2.2]己基、3H-吲哚基、喹嗪基和N-吡啶基脲。螺环杂环基也包括在该定义的范围内。螺环杂环基的实例包括氮杂螺[2.5]辛基和氮杂螺[2.4]庚基。其中环原子被氧代(＝O)取代的杂环基的实例是嘧啶酮基和1,1-二氧代硫吗啉基。本申请杂环基团任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代。
术语“杂芳基”是指5、6或7元环的一价的芳族基团且包括具有5-20个原子的稠合环系(其中至少一个环是芳族的)，所述芳族基团和稠合环系含有一个或多个独立选自氮、氧和硫的杂原子。杂芳基的实例是吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。杂芳基任选独立被本申请所述的一个或多个取代基取代。
杂环或杂芳基在可能的情况下可为经碳键合(经碳连接)或经氮键合(经氮连接)的。作为实例而非限制，经碳键合的杂环或杂芳基在以下位置成键：吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、噻吩、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮丙啶的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位；喹啉的2、3、4、5、6、7或8位；或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。
作为实例而非限制，经氮键合的杂环或杂芳基在以下位置成键：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉的2位；吗啉的4位；及咔唑或β-咔啉的9位。
术语“治疗”是指治疗性处置，其目的是减缓(减轻)不期望的生理学变化或病症例如关节炎或癌症的形成或扩散。出于本申请目的，有益或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、降低疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态及减退(无论是部分还是完全缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可指与在不接受治疗的情况下所预期的存活时间相比延长的存活时间。需要治疗的那些对象包括患有病症或障碍的那些对象。
短语“治疗有效量”是指本申请化合物的以下量，其(i)治疗本申请所述特定疾病、病症或障碍、(ii)减轻、改善或消除本申请所述特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状或(iii)预防或延迟本申请所述特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发作。对于癌症，治疗有效量的药物可减小癌细胞数目；减小肿瘤尺寸；抑制(即在一定程度上减缓且优选终止)癌细胞侵润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓且优选终止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。若药物可防止现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞，则其可能是细胞抑制性和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，效力可例如通过评估疾病进展时间(TTP)和/或确定应答率(RR)来度量。
术语“癌症”是指或描述哺乳动物中以不受调节的细胞生长为典型特征的生理状况。“肿瘤”包括一种或多种癌细胞。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。所述癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺瘤和肺鳞癌在内的肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌在内的胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌及头颈癌。
“血液学恶性肿瘤”是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。由于这三者通过免疫系统密切相关，影响这三者之一的疾病通常也将影响其它两者：尽管淋巴瘤是一种淋巴结疾病，但它常常扩散到骨髓从而影响血液。血液学恶性肿瘤是恶性肿瘤(“癌症”)且通常由血液学和/或肿瘤学专家治疗。“血液学/肿瘤学”在一些中心是内科医学下的一个亚专科，而在其它中心被认为是单独的部门(其中也有外科和放射肿瘤学家)。不是所有血液学疾病都是恶性(“癌性”)的；这些其它血液疾病也可由血液学家处置。血液学恶性肿瘤可源于两个主要血细胞谱系：骨髓样和淋巴样细胞系。骨髓样细胞系通常产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴样细胞系产生B细胞、T细胞、NK细胞和浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤来自淋巴样细胞系，而急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病源于骨髓样细胞。白血病包括急性成淋巴细胞性白血病
(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AMOL)和小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)。淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(所有四种亚型)和非霍奇金淋巴瘤(NHL,所有亚型)。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物，无论作用机制如何。化学治疗剂的类别包括但不限于：烷化剂、抗代谢物、纺锤体毒素植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化学治疗剂包括用于“靶向疗法”和常规化学疗法的化合物。化学治疗剂的实例包括：依鲁替尼(IMBRUVICATM,APCI-32765,Pharmacyclics Inc./Janssen Biotech Inc.；CAS号936563-96-1,US 7514444)、艾代拉利司(以前称为CAL-101,GS 1101,GS-1101,Gilead Sciences Inc.；CAS号1146702-54-6)、厄洛替尼(
Figure BDA0001454033950000131
Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(
Figure BDA0001454033950000132
Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶,5-氟尿嘧啶,CAS号51-21-8)、吉西他滨(
Figure BDA0001454033950000133
Lilly)、PD-0325901(CAS号391210-10-9,Pfizer)、顺铂(
Figure BDA0001454033950000134
(SP-4-2)-二胺二氯化铂(II),顺二胺二氯化铂(II),CAS号15663-27-1、卡铂(CAS号41575-94-4)、紫杉醇(
Figure BDA0001454033950000135
Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥单抗(
Figure BDA0001454033950000136
Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂二环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺,CAS号85622-93-1,
Figure BDA0001454033950000137
Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺,
Figure BDA0001454033950000138
Figure BDA0001454033950000139
)、多柔比星(
Figure BDA00014540339500001310
CAS号23214-92-8)、Akti-1/2、HPPD和雷帕霉素。
化学治疗剂包括B细胞受体靶标的抑制剂例如BTK、Bcl-2和JAK抑制剂。
化学治疗剂的其它实例包括：奥沙利铂(
Figure BDA00014540339500001311
Sanofi)、硼替佐米(
Figure BDA00014540339500001312
Millennium Pharm.)、舒尼替尼(
Figure BDA00014540339500001313
SU11248,Pfizer)、来曲唑(
Figure BDA00014540339500001314
Novartis)、甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA00014540339500001315
Novartis)、XL-518(Mek抑制剂,Exelixis,WO2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂,AZD6244,Array BioPharma,AstraZeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂,Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂,Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂,Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(
Figure BDA0001454033950000141
AstraZeneca)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司,
Figure BDA0001454033950000142
Wyeth)、拉帕替尼(
Figure BDA0001454033950000143
GSK572016,Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASARTM,SCH 66336,Schering Plough)、索拉非尼(
Figure BDA0001454033950000144
BAY43-9006,BayerLabs)、吉非替尼(
Figure BDA0001454033950000145
AstraZeneca)、伊立替康(
Figure BDA0001454033950000146
CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM,Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米微粒制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡德他尼(rINN,ZD6474,
Figure BDA0001454033950000147
AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU5271；Sugen)、替西罗莫司(
Figure BDA0001454033950000148
Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(
Figure BDA0001454033950000149
Telik)、塞替派和环磷酰胺
Figure BDA00014540339500001410
磺酸烷基酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙撑亚胺和甲基氨基吖啶，包括六甲蜜胺、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成性类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成性类似物)；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成性类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如刺孢霉素、刺孢霉素γ1I、刺孢霉素ωI1(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；蒽环类抗生素，dynemicin A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；新抑癌蛋白生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团，aclacinomysin、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉子基-多柔比星和去氧多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、奈莫柔比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨喋呤、喋罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮鸟苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、伊诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；伊达曲杀；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；根瘤菌剂；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；
Figure BDA0001454033950000156
多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢菌毒素(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨
Figure BDA0001454033950000151
诺消灵；替尼泊苷；伊达曲杀；柔红霉素；氨基喋呤；卡培他滨(
Figure BDA0001454033950000152
Roche)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；及以上任何物质的药用盐、酸和衍生物。
还包括在“化学治疗剂”的定义中的为：(i)用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药物，例如抗雌激素药物和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括
Figure BDA0001454033950000153
枸橼酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奥那司酮和
Figure BDA0001454033950000154
(枸橼酸托米芬)和选择性雌激素受体调节剂(SERD)例如氟维司群(
Figure BDA0001454033950000155
Astra Zeneca)；(ii)抑制芳香酶(其调节肾上腺中的雌激素产生)的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、
Figure BDA0001454033950000161
(醋酸甲地孕酮)、
Figure BDA0001454033950000162
(依西美坦；Pfizer)、formestanie、法倔唑、
Figure BDA0001454033950000163
(伏氯唑)、
Figure BDA0001454033950000164
(来曲唑；Novartis)和
Figure BDA0001454033950000165
(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素药物，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂，例如MEK抑制剂例如考比替尼(WO2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂，例如taselisib(GDC-0032,Genentech Inc.)；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖所涉及的信号传导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，例如PKC-α、Raf和H-Ras例如oblimersen(
Figure BDA0001454033950000166
Genta Inc.)；(vii)核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如
Figure BDA0001454033950000167
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，例如基因疗法疫苗例如
Figure BDA0001454033950000168
和
Figure BDA0001454033950000169
Figure BDA00014540339500001610
rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，例如
Figure BDA00014540339500001611
Figure BDA00014540339500001612
rmRH；(ix)抗血管生成药物，例如贝伐珠单抗(
Figure BDA00014540339500001613
Genentech)；及以上任何物质的药用盐、酸和衍生物。
还包括在“化学治疗剂”的定义中的为治疗性抗体例如阿仑珠单抗(Campath)、贝伐珠单抗(
Figure BDA00014540339500001614
Genentech)；西妥昔单抗(
Figure BDA00014540339500001615
Imclone)；帕木单抗(
Figure BDA00014540339500001616
Amgen)、利妥昔单抗(
Figure BDA00014540339500001617
Genentech/Biogen Idec)、培妥珠单抗(PERJETATM,2C4,Genentech)、曲妥珠单抗(
Figure BDA00014540339500001618
Genentech)、曲妥珠单抗依酯(
Figure BDA00014540339500001619
Genentech Inc.)和托西莫单抗(BEXXAR,Corixia)。
“代谢物”是通过具体化合物或其盐在体内的代谢而产生的产物。可使用本领域已知的常规技术鉴定化合物的代谢物并使用例如本申请所述的测试确定它们的活性。所述产物可源自例如所给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶促裂解等。因此，本申请包括本申请化合物的代谢物，包括由以下方法产生的化合物，所述方法包括使本申请式I化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的一段时间。
术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗产品的市售包装中的说明书，其含有关于使用所述治疗产品所涉及的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或注意事项的信息。
术语“手性”是指具有镜像配对体不可重叠性的分子，而术语“非手性”是指可与其镜像配对体重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成但原子或基团在空间中的排列是不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质例如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可通过高分辨分析操作例如电泳和色谱来分离。
“对映异构体”是指化合物的互为不可重叠镜像的两种立体异构体。
本申请使用的立体化学定义和常规用语大体上遵循S.P.Parker编辑,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；和Eliel,E.和Wilen,S.,“Stereochemistry of Organic Compounds”,John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。本申请化合物可含有不对称或手性中心且因此以不同的立体异构形式存在。本申请化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体及其混合物例如外消旋混合物，构成本申请一部分。多种有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。在描述光学活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)作为符号用于表示平面偏振光由化合物引起的旋转，其中(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体除互为镜像外都是相同的。具体的立体异构体也可称为对映异构体且所述异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，这可出现在化学反应或方法没有立体选择性或立体特异性的情况下。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种对映异构物质的等摩尔混合物，其没有光学活性。对映异构体可通过手性分离方法例如超临界流体色谱法(SFC)而由外消旋混合物分离。经分离的对映异构体中手性中心处的构型指定可为暂定的且出于说明目的在表1结构中描述，而立体化学例如通过x-射线晶体学数据最终确定。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒而互相转化的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括通过质子迁移而进行的互相转化，例如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体包括通过一些成键电子的重组而进行的互相转化。
术语“药用盐”表示在生物学上或在其它情况下不是不期望的盐。药用盐包括酸和碱加成盐。短语“药用”表明物质或组合物必须与制剂包含的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物在化学和/或毒理学上是相容的。
术语“药用酸加成盐”表示与以下酸形成的那些药用盐：无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸及选自脂肪族、环脂族、芳香族、芳脂族、杂环羧酸和磺酸类有机酸的有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、枸橼酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、氨茴酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、双羟萘酸、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。
术语“药用碱加成盐”表示与有机或无机碱形成的那些药用盐。可接受的无机碱的实例包括钠、钾、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝盐。衍生自药用有机无毒碱的盐包括以下物质的盐：伯胺、仲胺和叔胺、包括天然的经取代的胺在内的经取代的胺、环状胺及碱性离子交换树脂例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、三甲胺、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺树脂。
“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本申请化合物的缔合物或络合物。形成溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
术语“EC50”是半数最大有效浓度并表示在体内获得特定效应的最大值的50％所需要的特定化合物的血浆浓度。
术语“Ki”是抑制常数并表示特定抑制剂对受体的绝对结合亲和力。其使用竞争结合测定来测量且等于当特定抑制剂在不存在竞争性配体(例如放射性配体)的情况下占据50％受体时的浓度。Ki值可按对数方式换算为pKi值(-log Ki)，其中较高的值以指数表示较大的效力。
术语“IC50”是半数最大抑制浓度并表示在体外获得对生物过程的50％抑制所需要的特定化合物的浓度。IC50值可按对数方式换算为pIC50值(-log IC50)，其中较高的值以指数表示较大的效力。IC50值不是绝对值，而是取决于实验条件例如所使用的浓度并可使用Cheng-Prusoff方程而换算为绝对抑制常数(Ki)(Biochem.Pharmacol.(1973)22:3099)。可计算其它百分比抑制参数例如IC70、IC90等。
术语“本申请化合物”和“式I化合物”包括式I化合物及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物和药用盐及前药。
本申请给出的任何式或结构(包括式I化合物)也意在表示所述化合物的水合物、溶剂化物和多晶型物及其混合物。
本申请给出的任何式或结构(包括式I化合物)也意在表示所述化合物未经标记的形式及经同位素标记的形式。经同位素标记的化合物具有本申请给出的结构式所描述的结构，但是一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子代替。可引入到本申请化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素例如但不限于2H(氘、D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl和125I。各种经同位素标记的本申请化合物为例如其中引入有放射性同位素例如3H、13C和14C的那些本申请化合物。所述经同位素标记的化合物可用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术例如正电子发射断层扫描术(PET)或单光子发射计算机断层扫描术(SPECT)(包括药物或底物组织分布测定)或对患者进行的放射治疗。经氘标记或取代的本申请治疗性化合物可具有改善的涉及分布、代谢和排泄(ADME)的DMPK(药物代谢和药代动力学)性质。用较重的同位素例如氘进行的取代可由于较大的代谢稳定性而得到一些治疗益处例如延长的体内半衰期或减小的剂量需求。经18F标记的化合物可用于PET或SPECT研究。经同位素标记的本申请化合物及其前药通常可如下制备：用容易获得的经同位素标记的试剂代替未经同位素标记的试剂来进行在下述方案或实施例和制备中公开的流程。另外，用较重的同位素特别是氘(即2H或D)进行的取代可由于较大的代谢稳定性而得到一些治疗益处例如延长的体内半衰期或减小的剂量需求或改善的治疗指数。应该理解的是，该上下文中的氘被认为是式(I)化合物中的取代基。所述较重的同位素(特别是氘)的浓度可通过同位素富集因子来定义。在本申请化合物中，未被具体指定为特定同位素的原子意在表示该原子的任何稳定同位素。除非另有说明，当一处位置被具体指定为“H”或“氢”时，所述位置应该被理解为具有呈天然丰度同位素组成的氢。因此，在本申请化合物中，被具体指定为氘(D)的任何原子意在表示氘。
2-氨基吡啶化合物
本申请提供了式I(包括式Ia-If)的2-氨基吡啶化合物及其药物制剂，其可强效地用于治疗由USP7调节的疾病、病状和/或病症。泛素蛋白酶体系统(UPS)的失调与疾病发病机理有关，包括几种类型的癌症。具体地，泛素特异性蛋白酶7(USP7)即一种属于脱泛素酶(DUB)家族的半胱氨酸蛋白酶已被证实是p53的关键调节物。
调节USP7的化合物可通过实施例907的NMR片段筛选方法学鉴定和评估。利用通过NMR进行的基于片段的筛选通过X射线晶体学证实式I的2-氨基吡啶化合物结合至酶活性位点。使用基于形状的现实筛选结合NMR位点描绘发现式I化合物结合至称为Palm位点的相邻位点。通过晶体学指导的设计得到新颖的抑制剂，其相比于其它DUB对USP7具有选择性，在多种肿瘤细胞系中显示出活性并显示出预期的p53/Mdm2生物学。
式I化合物或其立体异构体、互变异构体或药用盐，所述化合物具有以下结构：
Figure BDA0001454033950000201
其中
R1选自C6-C20芳基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基和C1-C20杂芳基；
R2选自-CN、-OCH3、C1-C3烷基、C1-C3氟烷基和环丙基；
R3选自F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH(OH)CH(CH3)2、-C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2SO2CH3、-CH2OP(O)(OH)2、-CH2F、-CHF2、-CH2NH2、-CH2NHSO2CH3、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CF3、-CH2CF3、-CH2CHF2、-CH(CH3)CN、-C(CH3)2CN、-CH2CN、-CO2H、-COCH3、-CO2CH3、-CO2C(CH3)3、-COCH(OH)CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CONHCH2CH3、-CONHCH(CH3)2、-CON(CH3)2、-C(CH3)2CONH2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-N(CH3)COCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、-NO2、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2N(CH3)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、-S(O)3H、环丙基、环丙基酰胺基团、氧杂环丁基、氮杂环丁基、1-甲基氮杂环丁-3-基)氧基、N-甲基-N-氧杂环丁-3-基氨基、氮杂环丁-1-基甲基、苄基氧基苯基、吡咯烷-1-基、吡咯烷-1-基-甲酮基团、哌嗪-1-基、吗啉代甲基、吗啉代-甲酮基团和吗啉代；
n选自0、1、2和3；且
R4选自H、C1-C3烷基、C1-C3氟烷基、环丙基和环丙基甲基；
其中芳基、碳环基、杂环基和杂芳基任选取代有一个或多个独立选自以下的基团：F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH(OH)CH(CH3)2、-C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2SO2CH3、-CH2OP(O)(OH)2、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CH2CF3、-CH2CHF2、-CH(CH3)CN、-C(CH3)2CN、-CH2CN、-CH2NH2、-CH2NHSO2CH3、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CO2H、-COCH3、-CO2CH3、-CO2C(CH3)3、-COCH(OH)CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-C(CH3)2CONH2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-N(CH3)COCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、-NO2、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2N(CH3)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、-S(O)3H、环丙基、环丙基酰胺基团、氧杂环丁基、氮杂环丁基、1-甲基氮杂环丁-3-基)氧基、N-甲基-N-氧杂环丁-3-基氨基、氮杂环丁-1-基甲基、苄基氧基苯基、吡咯烷-1-基、吡咯烷-1-基-甲酮基团、哌嗪-1-基、吗啉代甲基、吗啉代-甲酮基团和吗啉代。
式I化合物的示例性实施方案包括其中R1为任选取代的C6-C20芳基。
式I化合物的示例性实施方案包括其中R1为4-苯酚基团。
式I化合物的示例性实施方案包括其中R1为任选取代的C1-C20杂芳基。
式I化合物的示例性实施方案包括其中R1选自1H-吲唑-5-基、1H-吲唑-6-基、2-甲基吲唑-4-基、1H-苯并咪唑-5-基、2-噻吩基、嘧啶-5-基、3-吡啶基、4-吡啶基和1H-吡啶-2-酮基团。
式I化合物的示例性实施方案包括其中R2为-CH2CH3。
式I化合物的示例性实施方案包括其中R3为-OH且n为1。
式I化合物的示例性实施方案包括其中R4为H。
式I化合物的示例性实施方案包括式Ia-f化合物：
Figure BDA0001454033950000221
式I化合物的示例性实施方案包括表1中的化合物。
本申请式I化合物可含有不对称或手性中心且因此以不同的立体异构形式存在。本申请化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体及其混合物例如外消旋混合物，构成本申请一部分。在一些情况下，立体化学尚未确定或已暂时归属。
此外，本申请包括所有非对映异构体，包括顺式-反式(几何)和构象异构体。例如，若式I化合物包含双键或稠环，则顺式和反式形式及其混合物包括在本申请范围内。
在本申请所示的结构中，若未指定任何特定手性原子的立体化学，则本申请化合物意在包括所有立体异构体。若立体化学通过表示特定构型的实心楔形线或虚线指定，则该立体异构体如此指定和定义。
本申请化合物可按非溶剂化及与药用溶剂例如水、乙醇等的溶剂化形式存在且本申请意在包括溶剂化和非溶剂化形式。
本申请化合物也可按不同的互变异构形式存在且所有这些形式都包括在本申请范围内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒而互相转化的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括通过质子迁移而进行的互相转化，例如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体包括通过一些成键电子的重组而进行的互相转化。
生物学评价
式I化合物作为酶活性(或其它生物活性)的抑制剂的相对效力可如下确定：确定每种化合物将活性抑制至预定程度的浓度，然后比较结果。通常，优选的确定是在生化测定中抑制50％活性的浓度即50％抑制浓度或“IC50”。可使用本领域已知的常规技术确定IC50值。通常，IC50可通过在所研究的一定浓度范围的抑制剂存在下测量给定酶的活性来确定。然后将实验获得的酶活性值相对于所用的抑制剂浓度作图。显示50％酶活性(与不存在任何抑制剂的情况下的活性相比)的抑制剂浓度作为IC50值。类似地，可通过适当的活性确定来定义其它抑制浓度。例如，在一些情况下，可能需要确定90％抑制浓度即IC90等。
根据实施例901的方法克隆泛素-内含肽-His6表达载体以提供泛素-罗丹明110-甘氨酸用于筛选本申请化合物
通过标准生化USP7酶测定法(实施例902)测试式I化合物。
实施例903测量脱泛素酶(DUB)的基于活性的富集。
实施例904测量凝胶内胰蛋白酶消化和质谱分析。
实施例905提供用于数据分析的方法学和生物信息学。
实施例903-905共同用于评价化合物对在基于活性的分布测定中检测的内源性DUB的活性进行拮抗的选择性。
实施例906提供细胞数据方法：对参与由USP7调节的信号传导途径的蛋白质进行的细胞活力测定(Incucyte,Cell Titer Glo)、MDM2周转和免疫印迹共同用于评价USP7拮抗剂的分子和细胞作用机制。
所述方法阐明了抑制USP7催化活性的独特机制，其可适用于拮抗其它脱泛素酶。
式I化合物对DUB的活性和特异性可通过MALDI-TOF质谱来筛选(Ritorto,M.S.等人(2014)Nature Communications 5:4763；doi:10.1038)。
式I化合物的细胞增殖、细胞毒性和细胞活力可通过CellTiter-
Figure BDA0001454033950000231
发光细胞活力测定(Promega Corp.)来测量。CellTiter-
Figure BDA0001454033950000232
发光细胞活力测定是基于对存在的ATP(代谢活性细胞的一种指示物)进行定量来确定培养物中活细胞数量的均匀化方法。CellTiter-
Figure BDA0001454033950000233
测定被设计成使用多孔模式，这使其适于自动化高通量筛选(HTS)、细胞增殖和细胞毒性测定。均匀化测定操作涉及将单一试剂(CellTiter-
Figure BDA0001454033950000241
试剂)直接加到在补充有血清的培养基中培养的细胞中。洗涤细胞、除去培养基和多次移液步骤不是必需的。在添加试剂和混合后10分钟内，系统以384孔模式检测到少至15个细胞/孔。
图1A显示了化合物25、89和45在HCT116结肠癌细胞中的细胞增殖和半胱天冬酶活性(
Figure BDA0001454033950000242
,Essen BioScience)数据。
图1B显示了化合物88和92在HCT116结肠癌细胞中的细胞增殖和半胱天冬酶活性(
Figure BDA0001454033950000243
,Essen BioScience)数据。
图2A显示了Western印迹数据，其表明活性Palm化合物25、88、92而非化合物45和89在同基因HCT116结肠癌细胞系(分别为野生型、无USP7型和无p53型)中以p53依赖性和USP7依赖性方式稳定p53和p21。
图2B显示了用化合物45、25、88、92、89处理的HCT116结肠癌细胞系(野生型和无USP7型)中p53/微管蛋白变化的曲线图。
图2C显示了用化合物45、25、88、92、89处理的HCT116结肠癌细胞系(野生型和无USP7型)中p21/微管蛋白变化的曲线图。
图3A显示了Western印迹数据，其表明活性化合物88与活性较低的化合物89(15μM)在MCF7乳腺癌细胞中对MDM2、微管蛋白、USP7、p53和p21的不稳定作用。
图3B显示了用化合物88和89处理的细胞中MDM2/微管蛋白的曲线图。
图4显示了化合物88和89以USP7依赖性方式影响HCT116细胞(野生型和无USP7型)的细胞活力的曲线图，其表明活力的USP7依赖性降低。
图5显示了基于活性的分布的Western印迹数据，其显示与USP7对应的HA-探针缀合条带在用化合物88处理的裂解物中是降低的，其表明88具有选择性DUB抑制作用。
图6显示了基于活性的分布的Western印迹数据，其显示通过Western印迹评价，仅Palm结合化合物88而非89与其它DUB相比选择性拮抗内源性USP7，其表明88具有选择性DUB抑制作用。
图7显示了基于活性的分布的曲线图，其显示通过质谱法评价，活性Palm结合化合物与其它DUB相比选择性拮抗内源性USP7，其表明所述活性化合物具有选择性DUB抑制作用。
图8A显示了对相对于正常骨髓样本在多发性骨髓瘤样本中升高的USP7表达进行的免疫组织化学分析。
图8B显示了对相对于正常乳腺样本在乳腺癌样本中升高的USP7表达进行的免疫组织化学分析。
图9显示了CellTiter-
Figure BDA0001454033950000251
(Promega Corp.)数据，其表明当用palm结合化合物88相对于化合物89处理时，含有野生型p53的肿瘤细胞系具有降低的活力，但是匹配的正常细胞系及匹配的相同组织来源的无p53细胞系没有显示出类似的细胞活力降低，其表明与正常细胞相比对肿瘤的潜在治疗指数和肿瘤细胞活力降低的p53依赖性。
图10显示了来自实施例906的细胞增殖和半胱天冬酶活性数据(
Figure BDA0001454033950000252
EssenBioScience)，其表明与MDA-MB157无p53细胞相比，活性palm位点化合物88与89相比降低MCF-7p53WT乳腺癌细胞的细胞活力。
图11显示了来自实施例906的细胞增殖和半胱天冬酶活性数据(
Figure BDA0001454033950000253
EssenBioScience)，其表明与SaOs无p53细胞相比，活性palm位点化合物88与89相比降低U2Osp53WT骨肉瘤细胞的细胞活力。
图12A显示了Western印迹数据，其表明活性化合物88与89相比增加p53野生型乳腺癌和骨肉瘤细胞但不是正常细胞中的p53和p21水平。
图12B显示了用化合物88和89处理的p53野生型乳腺癌和骨肉瘤细胞但不是正常细胞中p53/微管蛋白变化的曲线图。
图12C显示了用化合物88和89处理的p53野生型乳腺癌和骨肉瘤细胞但不是正常细胞中p21/微管蛋白变化的曲线图。
图12D显示了用化合物88和89处理的p53野生型乳腺癌和骨肉瘤细胞但不是正常细胞中MDM2/微管蛋白变化的曲线图。
图13A显示了细胞活力数据，其表明活性化合物88与89相比降低Cell Titer Glo信号，其表明KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中细胞活力的降低。
图13B显示了Western印迹数据，其表明活性化合物88与89相比增加KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中的p21水平。
图13C显示了用化合物88和89处理的KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中p53/微管蛋白变化的曲线图。
图13D显示了用化合物88和89处理的KMS-21BM和KMS-28PE多发性骨髓瘤细胞中p21/微管蛋白变化的曲线图。
图14A显示了Western印迹数据，其表明palm结合化合物88和89在宫颈癌细胞系RKO、RKO-E6、Vibo和SiHA中使p53和p21稳定并使MDM2和E6AP不稳定。
图14B显示了用化合物88和89处理的宫颈癌细胞系RKO、RKO-E6、Vibo和SiHA中E6AP/微管蛋白变化的曲线图。
图14C显示了用化合物88和89处理的宫颈癌细胞系RKO、RKO-E6、Vibo和SiHA中MDM2/微管蛋白变化的曲线图。
图15显示了细胞增殖(
Figure BDA0001454033950000262
Essen BioScience)数据，其表明活性化合物88但不是化合物89降低宫颈癌细胞系RKO、RKO-E6、Vibo和SiHA的细胞活力。
图16显示了顺铂(1μM)、化合物88和89(15μM)或88+顺铂和89+顺铂的组合在U2Os(骨肉瘤)细胞中的细胞增殖(
Figure BDA0001454033950000263
Essen BioScience)和半胱天冬酶活性数据。88+顺铂的组合治疗最有效地减少细胞增殖并提高半胱天冬酶活性。
图17显示了多柔比星(0.1μM)、化合物88和89(15μM)或88+多柔比星和89+多柔比星的组合在MCF7(乳腺癌)细胞中的细胞增殖(
Figure BDA0001454033950000264
Essen BioScience)和半胱天冬酶活性数据。88+多柔比星的组合治疗最有效地减少细胞增殖并提高半胱天冬酶活性。
根据本申请方法制备和表征了表1中的示例性I化合物并测试了其与USP7的结合且所述化合物具有以下结构、相应名称(ChemBioDraw,12.0.2版,CambridgeSoft Corp.,Cambridge MA)和生物学活性。若多于一个名称与式I化合物或中间体相关，则化合物应以化学结构定义。
表1
Figure BDA0001454033950000261
Figure BDA0001454033950000271
Figure BDA0001454033950000281
Figure BDA0001454033950000291
Figure BDA0001454033950000301
Figure BDA0001454033950000311
Figure BDA0001454033950000321
Figure BDA0001454033950000331
Figure BDA0001454033950000341
Figure BDA0001454033950000351
Figure BDA0001454033950000361
式I化合物的施用
本申请化合物可通过适于待治疗的病状的任何途径来给药。合适的途径包括口服、胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内、皮内、鞘内和硬膜外)、经皮、直肠、经鼻、局部(包括含服和舌下)、阴道、腹膜内、肺内和鼻内。对于局部免疫抑制治疗，所述化合物可通过病灶内给药(包括灌注或在移植前使移植物与抑制剂接触)来给药。应该理解的是，优选的途径可随例如接受者的情况而变化。当所述化合物口服给药时，可将其与药用载体或赋形剂一起配制成丸剂、胶囊剂、片剂等。当所述化合物胃肠外给药时，可如下所述将其与药用胃肠外媒介物一起配制且配制成单位剂量注射形式。
治疗人类患者的剂量可为约10mg至约1000mg式I化合物。典型的剂量可为约100mg至约300mg所述化合物。剂量可每日给药一次(QID)、每日给药两次(BID)或更频繁地给药，这取决于具体化合物的药物动力学性质和药效学性质，包括吸收、分布、代谢和排泄。另外，毒性因素可影响剂量和给药方案。当口服给药时，丸剂、胶囊剂或片剂可每日或以更低的频率服用所指定的一段时间。方案可重复多个治疗周期。
使用式I化合物的治疗方法
本申请式I化合物可用于治疗患有由于与USP7相关的异常细胞生长、功能或行为而引起的疾病或病症例如免疫病症、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌病症或神经学病症的人类或动物患者，因此可通过包括对其施用如上文所定义的本申请化合物的方法来治疗。患有癌症的人类或动物患者也可通过包括对其施用如上文所定义的本申请化合物的方法来治疗。所述患者的状况可因此得以改善或缓解。
本申请方法还包括治疗癌症，所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、食道癌、喉癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞癌、肺腺癌、骨癌、结肠癌、腺瘤、胰腺癌、腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌和胆道癌、肾癌、胰腺癌、骨髓样病症、淋巴瘤、毛细胞癌、口腔癌、鼻咽癌、咽癌、唇癌、舌癌、口癌、小肠癌、结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑癌和中枢神经系统癌症、霍奇金癌、白血病、支气管癌、甲状腺癌、肝癌和肝内胆管癌、肝细胞癌、胃癌、胶质瘤/成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌和肾盂癌、膀胱癌、子宫体癌、子宫颈癌、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、骨髓性白血病，口腔癌和咽癌、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤和绒毛结肠腺瘤。
基于表达分析、免疫组织化学分析和细胞系分布，结肠、乳腺、子宫颈、胃、肺的恶性肿瘤和多发性骨髓瘤最有可能对USP7拮抗剂具有响应。
药物制剂
为了使用本申请化合物以对哺乳动物(包括人类)进行治疗性处置，通常根据标准药学实践将其配制为药物组合物。本申请该方面提供药物组合物，其包含本申请化合物及药用稀释剂或载体。
典型的制剂通过将本申请化合物与载体、稀释剂或赋形剂混合来制备。合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员已知的且包括例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可溶胀性聚合物、亲水性或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等物质。所使用的具体载体、稀释剂或赋形剂将取决于施用本申请化合物的方式和目的。溶剂通常基于本领域技术人员认为就给予哺乳动物而言是安全的溶剂(GRAS)来选择。通常，安全溶剂为无毒含水溶剂例如水和可在水中溶解或混溶的其它无毒溶剂。合适的含水溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG 400、PEG 300)等及其混合物。制剂还可包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、矫味剂和其它已知添加剂以使药物(即本申请化合物或其药物组合物)具有优质外观或有助于制造药物产品(即药品)。
制剂可使用常规溶出和混合操作来制备。例如，将大批药物物质(即本申请化合物或所述化合物的稳定化形式(例如与环糊精衍生物或其它已知复合剂的复合物))在一种或多种上述赋形剂存在下溶于合适的溶剂中。通常将本申请化合物配制成药物剂型以提供可容易控制的药物剂量且使患者能够依从所开具的方案。
用于施用的药物组合物(或制剂)可取决于给药药物的方法而以多种方式包装。通常，用于分配的制品包括其中存放有呈合适形式的药物制剂的容器。合适的容器是本领域技术人员已知的且包括例如瓶(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属筒等物品。容器还可包括防撬装置以阻止不慎取得包装内含物。另外，在容器上具有描述容器内含物的标签。标签还可包括合适的警告信息。
可制备本申请化合物的药物制剂用于各种给药途径和类型。例如，具有所需纯度的式I化合物可任选与药用稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合成冻干制剂、研磨粉末或水溶液形式(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)第16版,Osol,A.编辑)。配制可如下进行：在环境温度在合适的pH以合适的纯度与生理学上可接受的载体即在所使用的剂量和浓度对接受者是无毒的载体混合。制剂的pH主要取决于具体用途和化合物浓度，但是可为约3至约8。在pH为5的乙酸盐缓冲液中的制剂是合适的实施方案。
化合物通常可按固体组合物、冻干制剂或水溶液形式贮存。
本申请药物组合物将以与良好医学实践一致的方式(即给药量、浓度、时间安排、疗程、媒介物和途径)来配制、确定剂量和给药。在此背景下需要考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床情况、病症的原因、递送药物的部位、给药的方法、给药的时间安排和医学实践者已知的其它因素。待给药的化合物的“治疗有效量”将取决于所考虑的上述因素且是改善或治疗过度增殖性病症所需要的最小量。
作为一般性建议，每剂胃肠外给药的初始药物有效量的抑制剂将为每日约0.01-100mg/kg即约0.1-20mg/kg患者体重，所使用的化合物的典型初始范围为0.3至15mg/kg/日。
可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所使用的剂量和浓度对接受者是无毒的且包括缓冲剂，例如磷酸盐、枸橼酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯胺；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。活性药物成分也可包埋在通过例如凝聚技术或界面聚合来制备的微囊中，例如分别为羟基甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒和纳米囊)或巨乳液中。上述技术参见Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。
可制备式I化合物的持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有式I化合物的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质呈成形物品例如膜或微囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US3773919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-羟乙酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的注射用微球)和聚D-(-)-3-羟基丁酸。
制剂包括适于本申请所述给药途径的那些制剂。制剂可适宜地以单位剂量形式来提供并可通过药学领域已知的任何方法来制备。技术和制剂通常参见Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.,Easton,PA)。上述方法包括使活性成分与作为一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂如下制备：使活性成分与液体载体或微细分散的固体载体或这两者均匀和紧密的结合，然后按需对产品进行成型。
可将适于口服给药的式I化合物的制剂制备为离散的单位例如各自含有预定量的式I化合物的丸剂、胶囊剂、扁囊剂或片剂。压制片可如下制备：在合适的机器中对呈自由流动形式例如粉末或颗粒且任选混合有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂的活性成分进行压制。模制片可如下制备：在合适的机器中对用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物进行模制。可任选对片剂进行包衣或刻痕并任选进行配制以使活性成分从其中缓慢或受控释放。可制备片剂、含片剂、糖锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉末剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂例如明胶胶囊剂、糖浆剂或酏剂以供口服。意在口服的式I化合物的制剂可根据制备药物组合物的领域已知的任何方法来制备且上述组合物可含有一种或多种包括甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂在内的物质以提供适口的制剂。含有与适于制备片剂的无毒的生理学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂是可接受的。这些赋形剂可为例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可为未包衣的或可通过包括微囊化在内的已知技术来包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收且由此在较长的时段内提供持续的作用。例如，可使用时间延迟物质例如单独或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
对于治疗眼部或其它外部组织例如口和皮肤，制剂可优选以局部用软膏剂或乳膏剂形式来施用，其含有的活性成分的量为例如0.075至20％w/w。当配制成软膏剂时，活性成分可与石蜡性或水混溶性软膏基质一起使用。可选择地，活性成分可与水包油型乳膏基质一起配制成乳膏剂。若需要，则乳膏基质的水相可包含多元醇即具有两个或更多个羟基的醇例如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)及其混合物。局部用制剂可按需包含使活性成分通过皮肤或其它作用区域的吸收或渗透得以增强的化合物。上述皮肤渗透增强剂的实例包括二甲基亚砜和相关类似物。本申请乳剂的油相可由已知成分以已知方式构成。当所述相可仅包含乳化剂时，其按需包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。优选地，与亲脂性乳化剂一起包含的亲水性乳化剂作为稳定剂。还优选的是包含油和脂肪两者。同时，含有或不含有稳定剂的乳化剂构成所谓的乳化蜡且所述蜡与油和脂肪一起构成所谓的乳化乳膏基质，其形成乳膏剂的油性分散相。适用于本申请制剂的乳化剂和乳化稳定剂包括
Figure BDA0001454033950000411
60、
Figure BDA0001454033950000412
80、鲸蜡硬脂醇、苄醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。
式I化合物的水性混悬剂含有活性物质与适于制备水性混悬剂的赋形剂的混合物。上述赋形剂包括助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；及分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、氧化烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七亚乙氧基鲸蜡醇)、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。
式I化合物的药物组合物可呈无菌注射剂例如无菌注射用水性或油性混悬剂形式。该混悬剂可使用上述那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂根据本领域已知方法来配制。无菌注射剂还可为在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射用溶液剂或混悬剂例如在1,3-丁二醇中的溶液剂或被制备为冻干粉末剂。可使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格溶液和等张氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或混悬介质。出于该目的，可使用任何温和不挥发性油，包括合成性甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸也可用于制备注射剂。
可与载体物质组合以制备单一剂量形式的活性成分的量将取决于所治疗的宿主和具体的给药模式而变化。例如，意在对人类口服给药的定时释放制剂可含有约1至1000mg活性物质化合物及合适和适宜量的可占总组合物的约5至约95％(重量:重量)的载体物质。可制备药物组合物以提供可容易测量的给药量。例如，意在静脉内输注的水性溶液剂可含有约3至500μg活性成分/毫升溶液，从而使合适体积的输注能够以约30mL/hr的速率进行。
适于胃肠外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等张的溶质；及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含助悬剂和增稠剂。
适于局部给药至眼部的制剂还包括滴眼剂，其中将活性成分溶于或混悬于合适的载体(尤其是针对活性成分的水性溶剂)中。活性成分在上述制剂中存在的浓度优选为约0.5至20％w/w，例如约0.5至10％w/w，例如约1.5％w/w。
适于在口中局部给药的制剂包括糖锭剂，其包含于矫味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中的活性成分；锭剂，其包含于惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成分；及漱口剂，其包含于合适液体载体中的活性成分。
适于直肠给药的制剂可呈现为栓剂形式，其具有包含例如可可脂或水杨酸酯的合适基质。
适于肺内或经鼻给药的制剂具有例如0.1至500微米的粒度(包括在0.1和500微米之间且增量为例如0.5、1、30、35微米等的粒度)，其如下给药：快速吸入通过鼻道或吸入通过口以到达肺泡囊。合适的制剂包括活性成分的水性或油性溶液剂。适于气雾或干粉给药的制剂可根据常规方法来制备并可与其它治疗剂例如迄今用于治疗或预防下述病症的化合物一起递送。
适于阴道给药的制剂可呈现为阴道栓剂、塞剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂形式，其除活性成分外还含有本领域已知的合适载体。
制剂可包装在单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿或小瓶中且可储存在冷冻干燥(冻干)状态下，其仅需要在使用前即刻加入无菌液体载体例如水以供注射。即时注射溶液剂和混悬剂由上述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选的单位剂量制剂是含有本申请上述日剂量或单位日亚剂量或其合适分数的活性成分的那些制剂。
本申请还提供兽用组合物，其由此包含上述至少一种活性成分及兽用载体。兽用载体是可用于给药所述组合物目的的物质并可为固体、液体或气体物质，其在兽医领域中是惰性或可接受的且与活性成分相容。这些兽用组合物可胃肠外、口服或经任何其它所需途径给药。
组合疗法
式I化合物可单独或与用于治疗本申请所述疾病或病症例如炎症或过度增殖性病症(例如癌症)的其它治疗剂组合使用。在一些实施方案中，将式I化合物与具有抗炎或抗过度增殖性质或可用于治疗炎症、免疫应答障碍或过度增殖性病症(例如癌症)的额外的第二治疗性化合物组合在药物组合制剂或作为组合疗法的给药方案中。额外的治疗剂可为Bcl-2抑制剂、JAK抑制剂、抗炎剂、免疫调节剂、化学治疗剂、凋亡增强剂、神经营养因子、心血管疾病治疗剂、肝病治疗剂、抗病毒剂、血液病症治疗剂、糖尿病治疗剂和免疫缺陷障碍治疗剂。第二治疗剂可为NSAID抗炎剂。第二治疗剂可为化学治疗剂。药物组合制剂或给药方案的第二化合物优选具有与式I化合物互补的活性，从而使它们不会相互不利地影响。上述化合物合适地以就所预期的目的而言是有效的量组合存在。在一个实施方案中，本申请组合物包含式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或药用盐或前药与治疗剂例如NSAID的组合。
组合疗法可按同时或先后方案来给药。当先后给药时，组合可按两次或更多次给药来给药。组合给药包括使用分开的制剂或单一的药物制剂共给药和以任何顺序先后给药，其中优选的是存在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的一段时间。
任何上述共给药的药物的合适剂量是目前所使用的那些剂量且可由于新鉴定的药物和其它治疗剂或处置措施的组合作用(协同作用)而降低。
联合疗法可提供“协同作用”且被证实是“协同的”，即当活性成分一起使用时实现的作用大于分别使用所述化合物所实现的作用的总和。当活性成分：(1)在组合单位剂量制剂中共配制且同时给药或递送；(2)以分开的制剂交替或平行递送；或(3)通过一些其它方案来给药时，可实现协同作用。当以交替疗法递送时，当化合物例如通过以不同的注射器分开注射、分开的丸剂或胶囊剂或分开的输注剂而先后给药或递送时，可实现协同作用。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分先后即顺次给药，而在组合疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起给药。
在疗法的具体实施方案中，式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或药用盐或前药可与其它治疗剂、激素药物或抗体药物例如本申请所述那些药物组合及与外科疗法和放射疗法组合。本申请组合疗法由此包括给药至少一种式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或药用盐或前药及使用至少一种其它癌症治疗方法。式I化合物和其它药物活性治疗剂的量及相关的给药时间安排将被选择，从而实现所期望的组合治疗作用。
式I化合物的代谢物
本申请所述式I的体内代谢产物也落入本申请范围内。上述产物可源于例如所给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶促裂解等。因此，本申请包括式I化合物的代谢物，包括由以下方法产生的化合物，所述方法包括使本申请化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的一段时间。
代谢产物通常如下鉴定：制备本申请化合物的经放射性标记的(例如14C或3H)同位素，将其以可检测的剂量(例如大于约0.5mg/kg)胃肠外给药至动物例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或给药至人类，允许足以发生代谢的时间(通常约30秒至30小时)且将其转化产物与尿、血液或其它生物样品分离。这些产物是容易分离的，这是因为它们是经标记的(其它通过使用能够与在代谢物中存活的抗原表位结合的抗体来分离)。代谢物结构以常规方式例如通过MS、LC/MS或NMR分析来确定。通常，对代谢物的分析以与本领域技术人员已知的常规药物代谢研究相同的方式来进行。代谢产物可用于对本申请化合物的治疗剂量进行诊断性测定，只要它们不是在体内另外存在的。
制品
本申请另一个实施方案提供含有可用于治疗上述疾病和病症的物质的制品或“试剂盒”。在一个实施方案中，试剂盒包含含有式I化合物或其立体异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物或药用盐或前药的容器。试剂盒还可包含在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗产品的市售包装中的说明书，其含有关于使用上述治疗产品所涉及的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或注意事项的信息。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可由多种材料例如玻璃或塑料来形成。容器可容纳可有效治疗病症的式I化合物或其制剂并可具有无菌接口(例如容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是式I化合物。标签或包装说明书指示组合物用于治疗所选择的病症例如癌症。另外，标签或包装说明书可指示待治疗的患者是患有病症例如过度增殖性病症、神经变性、心脏肥大、疼痛、偏头痛或神经创伤性疾病或事件的患者。在一个实施方案中，标签或包装说明书指示包含式I化合物的组合物可用于治疗起因于异常细胞生长的病症。标签或包装说明书还可指示组合物可用于治疗其它病症。可选择或额外地，制品还可包含第二容器，其包含药用缓冲液例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。其还可包含从商业和使用者角度来看所期望的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒还可包含关于给药式I化合物及第二药物制剂(若存在)的说明。例如，若试剂盒包含含有式I化合物的第一组合物和第二药物制剂，则试剂盒还可包含关于将第一和第二药物组合物同时、先后或分开给予有此需要的患者的说明。
在另一个实施方案中，试剂盒适于递送式I化合物的固体口服形式例如片剂或胶囊剂。上述试剂盒优选包含多个单位剂量。上述试剂盒可包含具有以其所预期的使用顺序而排列的剂量的卡片状物。上述试剂盒的一个实例是“泡罩包装”。泡罩包装在包装工业中是已知的且广泛用于包装药物单位剂量形式。可按需提供记忆辅助装置，其例如呈数字、字母或其它标记形式或具有指出在治疗安排中可进行给药的那些天的日历说明书。
根据一个实施方案，试剂盒可包含(a)在其中含有式I化合物的第一容器；及任选包含(b)在其中含有第二药物制剂的第二容器，其中第二药物制剂包含具有抗过度增殖活性的第二化合物。可选择或额外地，试剂盒还可包含第三容器，其包含药用缓冲液例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。其还可包含从商业和使用者角度来看所期望的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
在试剂盒包含式I组合物和第二治疗剂的一些其它实施方案中，试剂盒可包含用于容纳分开的组合物的容器例如分开的瓶或分开的箔包装，然而分开的组合物也可包含在单一的未分开的容器中。典型地，试剂盒包含给药分开的组分的指导。当分开的组分优选以不同的剂量形式(例如口服和胃肠外)或以不同的剂量间隔来给药时或当主治医师需要对所组合的各个组分进行滴定时，试剂盒形式是特别有利的。
式I化合物的制备
式I化合物可通过以下合成途径来合成，所述合成途径包括与化学领域已知且尤其是借鉴本申请说明书的那些方法及用于其它杂环的那些方法类似的方法，所述其它方法参见：Comprehensive Heterocyclic Chemistry II,Katritzky和Rees编辑,Elsevier,1997,例如第3卷；Liebigs Annalen der Chemie,(9):1910-16,(1985)；HelveticaChimica Acta,41:1052-60,(1958)；Arzneimittel-Forschung,40(12):1328-31,(1990)，将其各自明确地引入作为参考。原料通常可由商业来源例如Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)得到或使用本领域技术人员已知的方法来容易地制备(例如通过在LouisF.Fieser和Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis,v.1-23,Wiley,N.Y.(1967-2006版)或Beilsteins Handbuch der organischen Chemie,4,Aufl.ed.Springer-Verlag,Berlin(包括增补)(也可由Beilstein在线数据库得到)中概述的方法来制备)。
可用于合成式I化合物的合成化学转化和保护基方法学(保护和脱保护)及必要的试剂和中间体是本领域已知的并参见例如R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groupsin Organic Synthesis,第3版,John Wiley and Sons(1999)；和L.Paquette编辑,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)及其后续版本。
式I化合物可单独制备或以包含至少2种例如5至1,000种或10至100种化合物的化合物库形式制备。式I化合物库可通过本领域技术人员已知的操作通过组合的“分裂和混合”措施或通过使用溶液相或固相化学的多平行合成来制备。因此，本申请另一个方面提供包含至少2种化合物或其药用盐的化合物库。
实施例提供了制备式I化合物的示例性方法。本领域技术人员将认识到其它合成途径可用于合成式I化合物。尽管在附图和实施例中描述并讨论了具体的原料和试剂，但是可容易地替换为其它原料和试剂以提供多种衍生物和/或反应条件。另外，由所述方法制备的多种示例性化合物可在本公开的基础上使用本领域技术人员已知的常规化学方法来进一步修饰。
当制备式I化合物时，可能需要对中间体的远距离官能团(例如伯胺或仲胺)进行保护。对上述保护的需要将随着远距离官能团的性质和制备方法的条件而变化。合适的氨基保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苄基氧基羰基(CBz)和9-芴基亚甲基氧基羰基(Fmoc)。对上述保护的需要由本领域技术人员容易地确定。关于保护基及其使用的一般描述参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991。
在制备式I化合物的方法中，可能有利的是将反应产物彼此和/或与原料分离。通过本领域常规技术将每步或多步的所需产物分离和/或纯化至所需要的均匀度。通常，上述分离涉及多相萃取、从溶剂或溶剂混合物中结晶、蒸馏、升华或色谱法。色谱法可涉及多种方法，包括例如：反相和正相色谱法；尺寸排阻色谱法；离子交换色谱法；高、中和低压液相色谱法和装置；小规模分析型色谱法；模拟移动床(SMB)和制备型薄层或厚层色谱法及小规模薄层和快速色谱法。
另一类分离方法涉及用所选择的试剂对混合物进行处理以与所需产物、未反应的原料、反应副产物等结合或以其它方式使所需产物、未反应的原料、反应副产物等是可分离的。上述试剂包括吸附剂或吸收剂例如活性炭、分子筛、离子交换介质等。可选择地，所述试剂可为酸(在碱性物质的情况下)、碱(在酸性物质的情况下)、结合剂例如抗体、结合蛋白、选择性螯合剂例如冠醚、液/液离子萃取试剂(LIX)等。对适当分离方法的选择取决于所涉及的物质的性质例如沸点和分子量(在蒸馏和升华中)、存在或不存在极性官能团(在色谱法中)、物质在酸性和碱性介质中的稳定性(在多相萃取中)等。
非对映异构体混合物可基于其物理化学差异通过本领域技术人员已知的方法例如色谱法和/或分级结晶被分离成其单独的非对映异构体。对映异构体可如下分离：对映异构体混合物通过与具有适当光学活性的化合物(例如手性助剂例如手性醇或Mosher’s酰氯)反应而转化为非对映异构体混合物，分离非对映异构体，然后将单独的非对映异构体转化(例如水解)为相应的纯的对映异构体。另外，一些本申请化合物可为阻转异构体(例如取代的联芳基化合物)且被认为是本申请一部分。对映异构体还可通过使用手性HPLC柱来分离。
基本上不含有其立体异构体的单一立体异构体例如对映异构体可通过对外消旋混合物进行拆分来得到，所述拆分所使用的方法为例如使用具有光学活性的拆分剂来形成非对映异构体(Eliel,E.和Wilen,S.“Stereochemistry of Organic Compounds”,JohnWiley&Sons,Inc.,New York,1994；Lochmuller,C.H.,(1975)J.Chromatogr.,113(3):283-302)。本申请手性化合物的外消旋混合物可通过任何合适的方法来分离，所述方法包括：(1)与手性化合物形成离子性非对映异构盐且通过分级结晶或其它方法来分离；(2)与手性衍生试剂形成非对映异构化合物，分离非对映异构体且转化为纯的立体异构体；和(3)在手性条件下直接分离基本上纯的或富集的立体异构体。参见“Drug Stereochemistry,Analytical Methods and Pharmacology”,Irving W.Wainer编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York(1993)
在方法(1)中，非对映异构盐可如下形成：使对映异构体纯的手性碱例如马钱子碱、奎宁、麻黄碱、番木鳖碱、α-甲基-β-苯基乙基胺(安非他明)等与带有酸性官能团的不对称化合物例如羧酸和磺酸反应。可通过分级结晶或离子色谱法使非对映异构盐得以分离。为了分离氨基化合物的光学异构体，加入手性羧酸或磺酸例如樟脑磺酸、酒石酸、扁桃酸或乳酸可使非对映异构盐得以形成。
可选择地，通过方法(2)使待拆分的底物与手性化合物的一种对映异构体反应以形成非对映异构体对(E.和Wilen,S.“Stereochemistry of OrganicCompounds”,JohnWiley&Sons,Inc.,1994,p.322)。非对映异构化合物可如下形成：使不对称化合物与对映异构体纯的手性衍生试剂例如薄荷基衍生物反应，接着分离非对映异构体且水解，得到纯的或富集的对映异构体。确定光学纯度的方法涉及制备外消旋混合物的手性酯[例如在碱存在下制备薄荷基酯例如(-)氯甲酸薄荷基酯或制备Mosher酯即乙酸α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯基酯(Jacob III.J.Org.Chem.(1982)47:4165)]且就两种阻转异构性对映异构体或非对映异构体的存在分析1H NMR谱。阻转异构性化合物的稳定非对映异构体可遵循用于分离阻转异构性萘基-异喹啉类化合物的方法(WO1996/15111)通过正相和反相色谱法来分离。通过方法(3)，两种对映异构体的外消旋混合物可通过使用手性固定相的色谱法来分离(“Chiral Liquid Chromatography”(1989)W.J.Lough编辑,Chapman and Hall,New York；Okamoto,J.Chromatogr.,(1990)513:375-378)。富集的或纯化的对映异构体可通过用于区分具有不对称碳原子的其它手性分子的方法例如旋光或圆二色性来区分。
实施例
实施例1：4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-甲基-3-吡啶基]苯酚1
遵循实施例5-7的操作制备1。LCMS:(0-60,AB,2min),0.927min,MS＝293.1[M+1]。1HNMR(400MHz,MeOD-d4)δ9.55-9.37(br,2H),8.14(s,1H),7.08(d,J＝8.4Hz,4H),7.03(d,J＝8.8Hz,2H),6.88(d,J＝8.8Hz,2H),6.78(d,J＝8.8Hz,2H),4.96(br,2H),1.80(s,3H)。
实施例2：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚2
遵循实施例5-7和15的操作制备2。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.694min,MS＝306.9[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.27(s,1H),7.62(s,1H),7.15-7.09(m,4H),6.95(d,J＝9.2Hz,2H),6.83(d,J＝8.8Hz,2H),2.39(q,2H),0.70(t,J＝7.2Hz,3H)
实施例3：4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-异丙基-3-吡啶基]苯酚3
遵循实施例5-7的操作制备3。LCMS:(10-80,AB,2min),0.923min,MS＝321.1[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ9.54-9.41(br,2H),8.14(s,1H),7.58(s,1H),7.05-7.00(m,4H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),6.76(d,J＝8.4Hz,2H),4.78(s,2H),2.90-2.82(m,1H),0.78(t,J＝7.2Hz,6H)。
实施例4：4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-甲氧基-3-吡啶基]苯酚4
遵循实施例5-7的操作制备4。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),9.39(d,J＝13.4Hz,1H),7.82(s,1H),7.29-7.21(m,2H),7.17-7.08(m,2H),6.90-6.75(m,4H),5.18(s,2H),3.09(s,3H)。M+H(m/z)309。
实施例5：4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-(三氟甲基)-3-吡啶基]苯酚5
Figure BDA0001454033950000491
在室温向4-(三氟甲基)吡啶-2-胺5a(1.0g,6.17mmol)于DMF(20mL)中的溶液中添加NBS(2.31g,12.95mmol)。将混合物在55℃搅拌过夜后，将其倾入水(50mL)中并用DCM(50mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤并以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝5:1至3:1)进行纯化，得到3,5-二溴-4-(三氟甲基)吡啶-2-胺5b(1.2g,产率61％)。
向5b(100mg,0.32mmol)于二噁烷(10mL)/H2O(2mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(108mg,0.78mmol)、Na2CO3(331mg,3.13mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(32.9mg,0.047mmol)。将混合物在90-100℃搅拌3h并倾入水(10mL)中。所得混合物用EtOAc(10mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤并以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到5(58.48mg,54％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.718min,MS＝346.8[M+1]。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.82-9.55(br,2H),7.96(s,1H),7.13-7.10(m,4H),6.91(d,J＝8.8Hz,2H),6.81(d,J＝8.8Hz,2H)。
实施例6：4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-丙基-3-吡啶基]苯酚6
Figure BDA0001454033950000501
在室温向4-丙基吡啶-2-胺6a(500mg,3.67mmol)于CCl4(10mL)中的溶液中添加NBS(1.37g,7.71mmol)。将混合物在室温搅拌过夜后，将其倾入水(20mL)中并用DCM(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤并以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝5:1至3:1)进行纯化，得到3,5-二溴-4-丙基吡啶-2-胺6b(800mg,产率74％)。
向6b(100mg,0.34mmol)于二噁烷(10mL)/H2O(2mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(103mg,0.75mmol)、Na2CO3(360mg,3.4mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(35.8mg,0.051mmol)。将混合物在90-100℃搅拌3小时(h)后，将其倾入水(10mL)中。所得混合物用EtOAc(10mL×2)萃取。将合并的有机层用饱和NaCl(10mL)洗涤并以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到6(22.7mg,21％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.716min,MS＝320.9[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.60(s,1H),7.18-7.12(m,4H),6.99-6.97(m,2H),6.87-6.85(m,2H),2.40-2.36(m,2H),1.17-1.11(m,2H),0.53-0.49(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例7：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-3-氟-苯酚7
Figure BDA0001454033950000511
在室温(r.t.)向4-乙基吡啶-2-胺7a(1.0g,8.19mmol)于CCl4(20mL)中的溶液中添加N-溴琥珀酰亚胺(NBS,3.06g,17.19mmol)。将混合物搅拌过夜后，将其倾入水(50mL)中并用DCM(50mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝5:1至3:1)进行纯化，得到3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-胺7b(1.5g,产率65.5％)。
向7b(600mg,2.14mmol)于二噁烷(10mL)/H2O(2mL)中的溶液中添加(2-氟-4-甲氧基苯基)硼酸(327.8mg,1.93mmol)、Na2CO3(681.45mg,6.43mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(150.43mg,0.214mmol)。然后将混合物在90-100℃搅拌3h并倾入水(20mL)中。混合物用EtOAc(50mL×2)萃取。将合并的有机层用饱和NaCl(30mL)洗涤并以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝3:1至1:1)进行纯化，得到3-溴-4-乙基-5-(2-氟-4-甲氧基苯基)吡啶-2-胺7c(300mg,产率63％)。
向7c(300mg,0.92mmol)于二噁烷(10mL)/H2O(2mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(191mg,1.38mmol)、Na2CO3(293mg,2.77mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(65mg,0.092mmol)。将混合物在90-100℃搅拌3h后，将其倾入水(20mL)中。混合物用EtOAc(50mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝3:1至1:1)进行纯化，得到4-(2-氨基-4-乙基-5-(2-氟-4-甲氧基苯基)吡啶-3-基)苯酚7d(200mg,产率64％)。
在0℃伴随搅拌向7d(200mg,0.59mmol)于DCM(10mL)中的溶液中逐滴添加BBr3(0.5mL)。将混合物在室温搅拌2h后，通过添加甲醇(10mL)将其淬灭。用氢氧化铵调节pH至约7。残余物通过制备型HPLC纯化，得到7(64.2mg,产率34％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.709min,MS＝324.9[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.66(s,1H),7.17-7.12(m,3H),7.00-6.97(m,2H),6.72-6.70(m,1H),6.65-6.61(m,1H),2.35(q,2H),0.73-0.70(t,J＝7.6Hz,3H)。
实施例8：N-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]乙酰胺8
遵循实施例5-7的操作制备8。M+H(m/z)348。
实施例9：4-[6-氨基-4-环丙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚9
Figure BDA0001454033950000521
将4-溴吡啶-2-胺9a(2.0g,11.6mmol)、环丙基硼酸(1.5g,17.4mmol)、Pd(dppf)2Cl2(85mg,0.12mmol)和K2CO3(3.2g,23.2mmol)于二噁烷/水(20mL/4mL)中的混合物在90℃在N2下搅拌4h。将其冷却至室温后，将混合物用EtOAc(200mL×3)萃取，用盐水(200mL)洗涤，干燥，浓缩并通过柱进行纯化，得到4-环丙基吡啶-2-胺9b，其为固体(650mg,产率42％)。LCMS:(0-60,AB,2.0min),0.810min,MS＝135.2[M+1]。
向9b(650mg,4.8mmol)于MeCN(20mL)中的溶液中添加NBS(1.71g,9.6mmol)。将混合物在室温在N2下搅拌4h后，将其用EtOAc(100mL×3)萃取，用盐水(200mL)洗涤，干燥，浓缩并通过柱进行纯化，得到3,5-二溴-4-环丙基吡啶-2-胺9c，其为固体(1.0g,产率71％)。LCMS:(0-60,AB,2.0min),0.810min,MS＝290.9[M+1]。
向9c(100mg,0.34mmol)于二噁烷/水(5mL/1mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(100mg,0.68mmol)、Pd(dppf)2Cl2(40mg,0.05mmol)和K2CO3(145mg,1.03mmol)。将混合物在100℃在N2下搅拌4h后，将其冷却至室温。将混合物用EtOAc(20mL×3)萃取，用盐水洗涤(20mL)，干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到9(3.3mg,产率3％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.810min,MS＝318.9[M+1]。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.68(s,1H),7.29-7.22(m,4H),7.00(d,J＝8.8,2H),6.88(d,J＝8.8,2H),1.91-1.84(m,1H),0.48-0.43(m,2H),0.04-0.00(m,2H)
实施例10：4-[6-氨基-4-乙基-5-(2-氟-4-甲氧基-苯基)-3-吡啶基]苯酚10
遵循实施例11的操作制备10。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.744min,MS＝338.8[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.67(s,1H),7.28-7.18(m,3H),6.99-6.87(m,4H),3.88(s,3H),2.50-2.38(m,2H),0.74-0.71(t,J＝7.4Hz,3H)
实施例11：4-[6-氨基-4-乙基-5-(2-氟-4-甲氧基-苯基)-3-吡啶基]苯酚11
Figure BDA0001454033950000531
遵循实施例7在室温向4-乙基吡啶-2-胺7a(1.0g,8.19mmol)于CCl4(20mL)中的溶液中添加NBS(3.06g,17.19mmol)。将混合物搅拌过夜后，将其倾入水(50mL)中并用DCM(50mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝5:1至3:1)进行纯化，得到3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-胺7b(1.6g,产率70％)。
向7b(1.6g,5.76mmol)于二噁烷(15mL)/H2O(3mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(709mg,5.14mmol)、Na2CO3(1.82g,17.15mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(401mg,0.57mmol)。将混合物在90-100℃搅拌3h后，将其倾入水(20mL)中。所得混合物用EtOAc(50mL×2)萃取。将合并的有机层用饱和NaCl(30mL)洗涤并以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到4-(6-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚11a(380mg,产率22％)。
向11a(380mg,1.3mmol)于二噁烷(4mL)/H2O(0.5mL)中的溶液中添加(2-氟-4-甲氧基苯基)硼酸(330mg,1.94mmol)、Na2CO3(412mg,3.89mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(91mg,0.061mmol)。将混合物吹扫并在微波辐射下在120℃加热30min后，将其倾入水(20mL)中。所得混合物用EtOAc(30mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝3:1至1:1)进行纯化，得到4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-3-氟-苯酚10(150mg,产率34％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.744min,MS＝338.8[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.67(s,1H),7.28-7.18(m,3H),6.99-6.87(m,4H),3.88(s,3H),2.50-2.38(m,2H),0.74-0.71(t,J＝7.4Hz,3H)。
在0℃伴随搅拌向10(50mg,0.15mmol)于DCM(6mL)中的溶液中添加BBr3(0.3mL)。将混合物在室温搅拌2h后，用甲醇(10mL)将其淬灭。用NH3/H2O(氢氧化铵)调节pH至约7。残余物通过制备型HPLC纯化，得到11(28mg,产率60％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.702min,MS＝324.8[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.65(s,1H),7.20-7.12(m,3H),6.89-6.71(m,4H),2.50-2.38(m,2H),0.74-0.70(t,J＝7.6Hz,3H)
实施例12：4-[2-氨基-5-[3-[(二甲基氨基)甲基]苯基]-4-乙基-3-吡啶基]苯酚12
遵循实施例5-7的操作制备12。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)9.57(s,1H),7.74(s,1H),7.49(d,J＝5.6Hz,3H),7.08-7.01(m,2H),6.94-6.86(m,2H),5.07(s,2H),4.21(s,2H),2.64(s,6H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)348
实施例13：N-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(2-噻吩基)-3-吡啶基]苯基]乙酰胺13
Figure BDA0001454033950000541
遵循实施例7在室温向4-乙基吡啶-2-胺7a(4.0g,32.7mmol)于CCl4(100mL)中的溶液中添加NBS(12.2g,68.8mmol)。将混合物在室温搅拌过夜后，将其倾入水(50mL)中，用DCM(100mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝5:1至3:1)进行纯化，得到3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-胺7b(7.6g,产率83％)。
向7b(6.9g 24.7mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加DMAP(3.01g,24.7mmol)和(Boc)2O(16.1g,73.9mmol)。将混合物在室温搅拌5h后，将其倾入水中(100mL)。将其用EtOAc(100mL×2)萃取并将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝50:1至10:1)进行纯化，得到3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-(二叔丁基氧基羰基)胺13a(10g,产率85％)。
向13a(600mg,1.25mmol)于二噁烷(10mL)/H2O(2mL)中的溶液中添加(3-乙酰氨基苯基)硼酸13b(224mg,1.25mmol)、Na2CO3(397mg,3.75mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(87.7mg,0.12mmol)。将混合物在90-100℃在N2下搅拌3h后，将其倾入水(10mL)中并用EtOAc(20mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤并以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝3:1至1:1)进行纯化，得到N-(3-(6-(二叔丁基氧基羰基)氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯基)乙酰胺13c(370mg,产率55％)。
在室温向化合物13c(370mg,0.69mmol)于DCM(10mL)中的溶液中添加HCl-EtOAc(5mL)。将混合物在室温搅拌1h后，将其浓缩，得到粗N-(3-(6-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯基)乙酰胺13d，其直接用于下一步(200mg,87％)
在室温向13d(100mg,0.3mmol)于二噁烷/H2O(3mL)中的溶液中添加噻吩-2-基硼酸13e(76.6mg,0.6mmol)、Na2CO3(159,1.5mmol)、PdCl2(PPh3)2(21mg,0.03mmol)。将其吹扫并在微波辐射下在120℃加热30min。将反应混合物倾入水(10mL)中并用EtOAc(15mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到13(23mg,产率24％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.735min,MS＝337.8[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.75-7.73(m,3H),7.53-7.50(m,1H),7.44-7.40(m,1H),7.28-7.26(m,1H),7.20-7.19(m,1H),7.12-7.10(m,1H),2.56-2.51(m,2H),2.13(s,3H),0.82(t,J＝7.6Hz,3H)。
实施例14：N-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯基]乙酰胺14
遵循实施例13的操作制备14。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.731min,MS＝371.9[M+1]。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.21(s,1H),8.02(d,J＝8.4Hz,1H),7.83(s,1H),7.76(s,1H),7.61(s,1H),7.48-7.41(m,2H),7.15-7.10(m,2H),2.51-2.44(m,2H),2.14(s,3H),0.75(t,J＝7.6Hz,3H)
实施例15：4-[4-乙基-5-(4-羟基苯基)-6-(丙基氨基)-3-吡啶基]苯酚15
Figure BDA0001454033950000561
在N2下向3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-胺7b(600mg,2.14mmol)于二噁烷/H2O(15mL/5mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(621mg,4.50mmol)、Na2CO3(1.80g,17.2mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(150mg,0.21mmol)。将反应混合物在100℃在N2下搅拌5h后，将其浓缩并倾入水中。将其用EtOAc(20mL×3)萃取。蒸发有机层并通过硅胶柱色谱(PE:EtOAc＝3:1)进行纯化，得到4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚2(450mg,产率69％)。
向2(50mg,0.16mmol)于DCE(3.0mL)中的搅拌的溶液中添加丙醛(10.4mg0.179mmol)。将反应混合物在40℃搅拌16h后，添加NaBH(OAc)3(69.18mg,0.326mmol)。将反应混合物在40℃搅拌0.5h并浓缩，通过制备型HPLC进行纯化，得到15(3.0mg,产率5％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.753min,MS＝348.9[M+1]。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.53(s,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,2H),7.19(d,J＝8.4Hz,2H),7.01(d,J＝8.8Hz,2H),6.89(d,J＝8.4Hz,2H),3.31-3.29(m,2H),2.45-2.39(m,2H),1.64-1.59(m,2H),0.96-0.92(t,J＝5.2Hz,3H),0.74-0.70(t,J＝7.6Hz,3H)。
实施例16：4-(6-氨基-4-乙基-5-苯基-3-吡啶基)苯酚16
Figure BDA0001454033950000571
将4-乙基-吡啶-2-胺7a(10g,82mmol)于300ml THF中的溶液冷却至0℃并加入N-溴琥珀酰亚胺(14.7g,82mmol)。然后将混合物在0℃再搅拌15分钟。然后浓缩混合物并通过硅胶色谱(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到5-溴-4-乙基吡啶-2-胺16a(12g,72％产率)。M+H(m/z)＝201。
向16a(1.0g,5.0mmol)于12ml乙腈中的溶液中加入4-甲氧基苯基硼酸(907mg,6.0mmol)、[二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(364mg,0.5mmol)和12ml 1M碳酸钾。然后将混合物在120℃加热5分钟。然后混合物用乙酸乙酯和水稀释。分出水层并将有机层用水洗涤一次，以Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。然后残余物通过硅胶色谱(1-15％MeOH/DCM)纯化，得到4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)吡啶-2-胺16b(900mg,3.9mmol)。M+H(m/z)＝229。
向16b(9.5g,42mmol)于100ml THF中的溶液中加入N-溴琥珀酰亚胺(7.5g,42mmol)并在室温搅拌15分钟。然后真空浓缩混合物并通过硅胶色谱(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到3-溴-2-乙基-4’-甲氧基联苯-4-胺16c(8.6g,67％产率)。M+H(m/z)＝306。
向16c(6.6g,21mmol)于40ml THF中的溶液中加入64ml 1M三溴化硼/DCM。在室温搅拌15分钟后，将混合物冷却至0℃并加入100ml饱和碳酸钠。分开两层并将有机层以MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到4-(6-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚16d(5.7g,90％产率)。M+H(m/z)＝293。
向16d(59mg,0.2mmol)于0.5ml 1,4-二噁烷中的溶液中加入苯基硼酸(36mg,0.3mmol)、[二(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(14mg,0.02mmol)和0.5ml 1M K2CO3。然后将混合物在120℃加热5分钟。然后混合物用乙酸乙酯和水稀释。分开两层并将有机层用水洗涤一次，以Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。然后残余物通过反相制备型HPLC纯化，得到16(29mg,50％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),7.70(s,1H),7.56-7.46(m,2H),7.46-7.35(m,1H),7.30-7.22(m,2H),7.14-7.06(m,2H),6.84-6.75(m,2H),4.90(s,2H),2.22(q,J＝7.5Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)＝291。
实施例17：4-[6-氨基-4-乙基-5-(间甲苯基)-3-吡啶基]苯酚17
遵循实施例16的操作制备17。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),7.69(s,1H),7.39(t,J＝7.6Hz,1H),7.26-7.18(m,1H),7.14-7.01(m,4H),6.84-6.75(m,2H),4.89(s,2H),2.36(s,3H),2.28-2.17(m,2H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)305。
实施例18：4-[6-氨基-5-(3,4二氟苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚18
遵循实施例16的操作制备18。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),7.70(s,1H),7.53(dt,J＝10.9,8.5Hz,1H),7.36(ddd,J＝11.4,7.9,2.1Hz,1H),7.14-7.04(m,3H),6.84-6.75(m,2H),5.17(s,2H),2.22(q,J＝7.5Hz,2H),0.63(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)327。
实施例19：3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲腈19
遵循实施例16的操作制备19。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),7.87(dt,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.77-7.63(m,3H),7.60(dt,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.14-7.05(m,2H),6.85-6.76(m,2H),5.16(s,2H),2.18(q,J＝7.5Hz,2H),0.60(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)316。
实施例20：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-甲基磺酰基苯基)-3-吡啶基]苯酚20
遵循实施例16的操作制备20。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.41(s,1H),8.03(d,J＝8.3Hz,2H),7.74(s,1H),7.55(d,J＝8.3Hz,2H),7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.84-6.77(m,2H),5.11(d,J＝5.3Hz,2H),2.21(q,J＝7.5Hz,2H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)369。
实施例21：N-[4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]氨基甲酸叔丁酯21
遵循实施例16的操作制备21。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.44(s,1H),9.38(s,1H),7.67(s,1H),7.61-7.41(m,3H),7.17-7.04(m,4H),6.79(d,J＝8.5Hz,2H),4.90(s,2H),3.27(s,1H),2.23(q,J＝7.4Hz,2H),1.48(d,J＝8.3Hz,9H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)406。
实施例22：4-[6-氨基-4-乙基-5-(3-吗啉代苯基)-3-吡啶基]苯酚22
遵循实施例16的操作制备22。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.38(s,1H),7.68(s,1H),7.35(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.13-7.06(m,2H),6.97(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),6.85-6.75(m,3H),6.68(dt,J＝7.4,1.1Hz,1H),4.89(s,2H),3.73(t,J＝4.8Hz,5H),3.21-3.05(m,3H),2.32-2.18(m,2H),0.64(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)376。
实施例23：N-[[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲基]氨基甲酸叔丁酯23
遵循实施例16的操作制备23。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),7.69(s,1H),7.45(t,J＝7.5Hz,1H),7.36(s,1H),7.33-7.19(m,1H),7.16-7.05(m,4H),6.80(d,J＝8.4Hz,2H),4.91(s,2H),4.18(d,J＝6.0Hz,2H),2.22(q,J＝7.3Hz,2H),1.37(s,9H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)421。
实施例24：4-[6-氨基-4-乙基-5-[3-(甲氧基甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚24
遵循实施例16的操作制备24。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),7.70(s,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),7.36(dt,J＝7.6,1.4Hz,1H),7.19(s,1H),7.22-7.15(m,1H),7.14-7.06(m,2H),6.84-6.75(m,2H),4.90(s,2H),4.47(s,2H),3.29(d,J＝13.5Hz,3H),2.22(qd,J＝7.5,1.9Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)335。
实施例25：4-[6-氨基-4-乙基-5-[4-(甲氧基甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚25
遵循实施例16的操作制备25。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),7.69(s,1H),7.44(d,J＝8.1Hz,2H),7.24(d,J＝8.0Hz,2H),7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.83-6.76(m,2H),4.90(s,2H),4.48(s,2H),3.31(d,J＝27.5Hz,3H),2.22(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)335。
实施例26：4-[6-氨基-4-乙基-5-[3-(吗啉代甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚26
遵循实施例16的操作制备26。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),7.70(s,1H),7.46(t,J＝7.5Hz,1H),7.34(dt,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.22-7.05(m,4H),6.83-6.76(m,2H),4.91(s,2H),3.60-3.46(m,6H),2.37(t,J＝4.5Hz,2H),2.21(dt,J＝8.2,6.4Hz,2H),0.60(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)390。
实施例27：2-[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]乙腈27
遵循实施例16的操作制备27。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),7.71(s,1H),7.54(t,J＝7.8Hz,1H),7.40(dt,J＝7.6,1.3Hz,1H),7.23(dq,J＝4.2,1.5Hz,2H),7.14-7.07(m,2H),6.84-6.76(m,2H),4.97(s,2H),4.10(s,2H),2.21(q,J＝7.5Hz,2H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)330。
实施例28：N-[4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯28
遵循实施例16的操作制备28。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),7.70(s,1H),7.53(s,2H),7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.10(d,J＝8.0Hz,2H),6.80(d,J＝8.0Hz,2H),4.92(s,2H),3.26(d,J＝12.4Hz,3H),2.27-2.19(m,2H),1.41(s,9H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)421。
实施例29：5-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]吡啶-3-甲腈29
遵循实施例16的操作制备29。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,1H),9.04(d,J＝2.0Hz,1H),8.73(d,J＝2.1Hz,1H),8.33-8.27(m,1H),7.76(s,1H),7.14-7.05(m,2H),6.85-6.76(m,2H),5.43(s,2H),2.17(q,J＝7.5Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)317。
实施例30：N-[4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲磺酰胺30
遵循实施例16的操作制备30。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.81(s,1H),9.39(s,1H),7.68(s,1H),7.32(d,J＝8.6Hz,2H),7.26-7.18(m,2H),7.12-7.05(m,2H),6.83-6.76(m,2H),4.99(s,2H),3.04(s,3H),2.23(q,J＝7.3Hz,2H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)384。
实施例31：N-[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]氨基甲酸叔丁酯31
遵循实施例16的操作制备31。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.41(d,J＝17.0Hz,2H),7.69(s,1H),7.60-7.44(m,2H),7.50(s,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.82(dd,J＝18.5,8.0Hz,2H),4.92(s,2H),2.22(q,J＝7.4Hz,2H),1.47(s,9H),0.64(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)406。
实施例32：4-(2-氨基-4-乙基-5-嘧啶-5-基-3-吡啶基)苯酚32
遵循实施例89的操作制备32。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),7.59(s,1H),7.33-7.17(m,3H),7.18-7.05(m,2H),7.05(dt,J＝9.2,2.0Hz,2H),6.92-6.85(m,2H),4.93(s,2H),3.27(s,3H),2.07(s,3H),1.99-1.85(m,1H),0.55(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)293。
实施例33：4-[2-氨基-4-乙基-5-(邻甲苯基)-3-吡啶基]苯酚33
遵循实施例89的操作制备33。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),7.59(s,1H),7.33-7.17(m,3H),7.18-7.05(m,2H),7.05(dt,J＝9.2,2.0Hz,2H),6.92-6.85(m,2H),4.93(s,2H),3.27(s,3H),2.07(s,3H),0.55(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)305。
实施例34：4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-氟苯基)-3-吡啶基]苯酚34
遵循实施例89的操作制备34。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),7.69(s,1H),7.39-7.30(m,2H),7.28-7.18(m,2H),7.09-7.01(m,2H),6.92-6.85(m,2H),4.99(s,2H),3.27(s,2H),2.23(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)309。
实施例35：4-[2-氨基-4-乙基-5-(6-甲基-3-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚35
遵循实施例89的操作制备35。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),8.38(d,J＝2.2Hz,1H),7.70(s,1H),7.64(dd,J＝7.9,2.4Hz,1H),7.29(d,J＝7.9Hz,1H),7.11-7.01(m,2H),6.93-6.84(m,2H),5.05(s,2H),3.27(s,3H),2.23(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)306。
实施例36：4-[2-氨基-4-乙基-5-(对甲苯基)-3-吡啶基]苯酚36
遵循实施例89的操作制备36。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),7.67(s,1H),7.26-7.11(m,4H),7.13-7.01(m,2H),6.92-6.84(m,2H),4.97(s,2H),3.27(s,1H),2.34(s,3H),2.25(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)305。
实施例37：4-(2-氨基-4-乙基-5-苯基-3-吡啶基)苯酚37
遵循实施例89的操作制备37。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),7.70(s,1H),7.46-7.27(m,5H),7.06(d,J＝8.5Hz,2H),6.92-6.85(m,2H),5.01(s,2H),3.27(s,2H),2.26(q,J＝7.5Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)291。
实施例38：4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚38
遵循实施例89的操作制备38。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(d,J＝12.2Hz,1H),8.62-8.56(m,1H),7.75(s,1H),7.40-7.33(m,1H),7.13-6.95(m,2H),6.93-6.77(m,2H),5.16(s,2H),2.25(dq,J＝32.3,7.5Hz,2H),0.95(t,J＝7.5Hz,1H),0.63(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)292。
实施例39：4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚39
遵循实施例89的操作制备39。M+H(m/z)292。
实施例40：4-[6-(环丙基甲基氨基)-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚40
Figure BDA0001454033950000611
向4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚2(50mg,0.163mmol)于DCE(3.0mL)中的搅拌的溶液中添加环丙烷甲醛(22.9mg 0.36mmol)。将反应混合物在40℃搅拌16h后，添加NaBH(OAc)3(69.2mg,0.33mmol)。将反应混合物在40℃搅拌0.5h后，将其浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到40(7.1mg,产率12％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.747min,MS＝360.9[M+1]。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.54(s,1H),7.20-7.13(m,4H),7.01(d,J＝8.4Hz,2H),6.88(d,J＝8.4Hz,2H),3.24(d,J＝6.8Hz,2H),2.46-2.40(m,2H),1.14-1.11(m,1H),0.74-0.70(t,J＝7.6Hz,3H),0.57-0.52(m,2H),0.27-0.25(m,2H)。
实施例41：N-[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲磺酰胺41
遵循实施例16的操作制备41。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.80(s,1H),9.37(d,J＝13.9Hz,1H),7.70(s,1H),7.46(t,J＝7.9Hz,2H),7.25(ddd,J＝8.2,2.4,1.0Hz,2H),7.18-6.95(m,2H),6.79(dd,J＝8.5,6.5Hz,2H),5.73(d,J＝14.3Hz,1H),3.00(d,J＝4.6Hz,3H),2.22(q,J＝7.5Hz,2H),0.73-0.59(m,3H)。M+H(m/z)384。
实施例42：4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-哌嗪-1-基苯基)-3-吡啶基]苯酚42
Figure BDA0001454033950000621
将3-溴苯胺42a(5.0g,28.0mmol)和二(氯甲基)胺盐酸盐(4.82g,28.01mmol)于n-BuOH(60mL)中的混合物在118℃加热48h。将其冷却至25℃后，将含有1-(3-溴苯基)哌嗪42b的反应混合物直接用于下一步。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.608min,MS＝240.7[M+1]。
向42b(6.25g,25.9mmol)于THF-H2O(1:1,40mL)中的溶液中添加Na2CO3直至碱性。添加Boc2O(6.79g,31.1mmol)并将反应混合物在25℃搅拌10h。向反应混合物中添加水(15mL)并将其用EtOAc(3×20mL)萃取，以Na2SO4干燥并通过柱(PE:EtOAc＝30:1)进行纯化，得到4-(3-溴苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯42c(1.94g,产率21.9％)。
向42c(0.94g,2.75mmol)于二噁烷(30mL)中的溶液中添加4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-八甲基-2,2’-联(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(1.40g,5.51mmol)、KOAc(811mg,8.26mmol)、Pd(dppf)Cl2(0.27mmol)和二噁烷(15mL)。将反应体系吹扫并在110℃搅拌5h。将反应混合物冷却至25℃并倾入水(15mL),中，用EtOAc(20mL×3)萃取。将有机层以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝15:1-10:1)进行纯化，得到4-(3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯42d(0.89g,产率83.2％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),1.015min,MS＝388.8[M+1]。
向42d(400mg,1.03mmol)于二噁烷-H2O(5mL)中的溶液中添加(3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯42e(391mg,1.0mmol)、K2CO3(427mg,3.09mmol)和Pd(dppf)Cl2(45mg)。将反应混合物用N2吹扫并用微波辐射在120℃加热50min。将反应混合物冷却至25℃，然后倾入水(15mL)中。将其用EtOAc(3×20mL)萃取并将有机层以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(PE:EtOAc＝20:1-5:1)进行纯化，得到4-(3-(5-溴-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-乙基吡啶-3-基)苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯42f(250mg,产率43.2％)。
向42f(250mg,0.445mmol)于EtOAc(5mL)中的混合物中添加HCl/EtOAc(10mL)并在25℃搅拌3h。将其浓缩，得到3-溴-4-乙基-5-(3-(哌嗪-1-基)苯基)吡啶-2-胺42g，其直接用于下一步。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.673min,MS＝362.7[M+1]。
向42g(140mg,0.387mol)于二噁烷-H2O(5:1,2.5mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(53mg,0.387mmol)、Na2CO3(205mg,1.94mmol)和Pd(dppf)Cl2(35mg)。将混合物用氮气吹扫并在微波辐射下在120℃加热50min。将混合物冷却至25℃并加到水(20mL)中。将其用EtOAc(30mL×3)萃取，以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到42(48mg,产率33.1％)，其为白色固体。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.669min,MS＝374.9[M+1]。1H NMR(400MHz、CD3OD):δ7.67(s,1H),7.39-7.36(m,2H),7.12-7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.97-6.96(m,1H),6.96-6.94(m,3H),6.91-6.90(d,J＝4.0Hz,1H),3.45-3.36(m,4H),3.31(s,4H),2.42-2.36(m,2H),0.73-0.70(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例43：4-[4-乙基-5-(4-羟基苯基)-6-(甲基氨基)-3-吡啶基]苯酚43
Figure BDA0001454033950000641
将4-乙基吡啶-2-胺7a(600mg,4.92mmol)、甲醛即HCHO(590mg,19.67mmol)、甲醇钠即NaOMe(1.3g,24.6mmol)于甲醇即MeOH(30ml)中的溶液加热至回流且保持2h。用冰浴将混合物冷却至0℃并添加NaBH4(747mg,19.7mmol)。将混合物加热回流2h并倾入碎冰中。将混合物用EtOAc(20mL×3)萃取并用水洗涤。将合并的萃取物用盐水洗涤，以Na2SO4干燥并真空浓缩，得到4-乙基-N-甲基吡啶-2-胺43a(420mg,产率63％)，其为固体且直接用于下一步。
向43a(320mg,2.36mmol)于MeCN(20mL)中的溶液中添加NBS(1.6g,9.4mmol)。将反应混合物在室温在N2下搅拌4h。将混合物用EtOAc(30mL×3)萃取。将合并的萃取物用盐水(30mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱进行纯化，得到3,5-二溴-4-乙基-N-甲基吡啶-2-胺43b(EtOAc/PE＝1:40)(420mg,44％)。
向43b(100mg,0.34mmol)于二噁烷/H2O(10ml/1mL)中的溶液中添加(4-羟基苯基)硼酸(57mg,0.41mmol)、Pd(dppf)Cl2(5mg,0.0068mmol)和K2CO3(95mg,0.68mmol)。将反应混合物在90℃在N2下搅拌5h。将混合物用EtOAc(15×3)萃取，用盐水(20mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到43(52.1mg,47％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),
0.724min,MS＝320.9[M+1]。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.56(s,1H),7.19(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(d,J＝8.4Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,2H),6.90(d,J＝8.4Hz,2H),2.97(s,3H),2.46-2.40(m,2H),0.72(t,J＝7.6Hz,3H)。
实施例44：4-[2-氨基-5-(4-氯-3-甲基-苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚44
遵循实施例89的操作制备44。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.69(s,1H),7.43(d,J＝8.2Hz,1H),7.30(d,J＝2.5Hz,1H),7.16(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),7.09-7.00(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.01(s,2H),2.36(s,3H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)340。
实施例45：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲酰胺45
遵循实施例89的操作制备45。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.97(s,1H),7.91(d,J＝8.3Hz,2H),7.72(s,1H),7.39(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(s,1H),7.10-7.02(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.04(s,2H),2.27(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)334。
实施例46：3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲酰胺46
遵循实施例89的操作制备46。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.99(s,1H),7.84(dtd,J＝7.1,3.6,1.9Hz,2H),7.73(s,1H),7.54-7.45(m,2H),7.35(s,1H),7.13-6.94(m,2H),6.93-6.74(m,2H),5.02(s,2H),2.23(dq,J＝20.9,7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)334。
实施例47：4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-异丙基苯基)-3-吡啶基]苯酚47
遵循实施例89的操作制备47。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),7.70(s,1H),7.32(t,J＝7.6Hz,1H),7.25-7.13(m,2H),7.14-7.01(m,3H),6.93-6.84(m,2H),4.94(s,2H),2.92(hept,J＝6.9Hz,1H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),1.22(d,J＝6.9Hz,6H),0.63(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)333。
实施例48：4-[2-氨基-5-(3,4二氟苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚48
遵循实施例89的操作制备48。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.71(s,1H),7.57-7.42(m,1H),7.46-7.36(m,1H),7.21-7.12(m,1H),7.12-7.00(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.06(s,2H),2.25(q,J＝7.4Hz,2H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)327。
实施例49：3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲腈49
遵循实施例89的操作制备49。M+H(m/z)316。
实施例50：4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-氟苯基)-3-吡啶基]苯酚50
遵循实施例89的操作制备50。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.69(s,1H),7.47-7.22(m,4H),7.10-7.02(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.06(s,2H),2.14(q,J＝7.4Hz,2H),0.59(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)333。
实施例51：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲腈51
遵循实施例89的操作制备51。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),7.87(d,J＝8.2Hz,2H),7.73(s,1H),7.58-7.51(m,2H),7.11-7.02(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.14(s,2H),2.26(q,J＝7.5Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)316。
实施例52：4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚52
遵循实施例89的操作制备52。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),7.73-7.52(m,1H),7.37-7.28(m,1H),7.09-7.02(m,2H),6.95-6.76(m,5H),4.96(s,2H),3.77(s,3H),2.27(q,J＝7.5Hz,2H),0.64(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)321。
实施例53：4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚53
遵循实施例89的操作制备53。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),7.67(s,1H),7.25-7.18(m,2H),7.09-7.01(m,2H),7.01-6.93(m,2H),6.92-6.84(m,2H),4.91(s,2H),3.78(s,3H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)321。
实施例54：3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N,N-二甲基-苯甲酰胺54
遵循实施例89的操作制备54。M+H(m/z)362。
实施例55：4-[2-氨基-4-乙基-5-[4-(羟基甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚55
遵循实施例89的操作制备55。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(d,J＝8.5Hz,1H),7.68(s,1H),7.48-7.32(m,2H),7.29-7.18(m,2H),7.13-6.76(m,3H),5.17(t,J＝5.7Hz,2H),4.95(s,1H),4.53(d,J＝5.7Hz,2H),2.23(dq,J＝20.9,7.5Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)321。
实施例56：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N,N-二甲基-苯甲酰胺56
遵循实施例89的操作制备56。M+H(m/z)362。
实施例57：4-[2-氨基-4-乙基-5-(间甲苯基)-3-吡啶基]苯酚57
遵循实施例89的操作制备57。M+H(m/z)305
实施例58：5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-1H-吡啶-2-酮58
Figure BDA0001454033950000671
将3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-胺7b(1.0g,3.57mmol)、Boc2O(1.6g,7.14mmol)、DMAP(1.1g,8.93mmol)、TEA(1g,10.71mmol)于DCM(30mL)中的溶液在室温搅拌5h。用水稀释混合物并在EtOAc(30mL×3)中萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(ETOAc/PE＝1:50)进行纯化，得到3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-(二叔丁基氧基羰基)胺13a，其为固体(1.5g,产率63％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.50(s,1H),3.10-3.04(m,2H),18(s,18H),1.19(t,3H)。
将13a(500mg,1.04mmol)、(6-甲氧基吡啶-3-基)硼酸58a(185mg,1.25mmol)、Pd(dppf)Cl2(15mg,0.02mmol)和K2CO3(290mg,2.08mmol)于二噁烷/水(40mL/8mL)中的溶液在90℃在N2下搅拌5h。将混合物冷却至室温，用EtOAc(30mL×3)萃取，用盐水(20mL)洗涤，以Na2SO4干燥并真空浓缩，得到粗产物，通过柱(EtOAc/PE＝1:10)将其纯化，得到5-溴-4-乙基-6’-甲氧基-[3,3’-联吡啶]-6-(二叔丁氧基羰基)胺58b，其为固体(450mg,产率85％)。
在0℃向58b(400mg,0.79mmol)于DCM(20mL)中的溶液中逐滴添加BBr3(0.6mL)。将混合物在15℃-18℃搅拌2h。浓缩含有5-溴-4-乙基-6’-甲氧基-[3,3’-联吡啶]-6-胺58c的混合物并用于下一步(400mg,100％)。
将58c(250mg,0.81mmol)、(4-羟基苯基)硼酸(135mg,0.98mmol)、Pd(dppf)Cl2(12mg,0.02mmol)和K2CO3(225mg,1.62mmol)于二噁烷/水(20mL/4mL)中的溶液在90℃在N2下搅拌5h。将混合物冷却至室温并用EtOAc(30mL×3)萃取，用盐水(20mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(EtOAc/PE＝1:1)进行纯化，得到4-(6-氨基-4-乙基-6’-甲氧基-[3,3’-联吡啶]-5-基)苯酚58d(100mg,42％)。
将58d(100mg,0.31mmol)于HBr/HOAc(5mL)中的溶液在70℃搅拌8h。减压浓缩反应混合物并通过制备型HPLC进行纯化，得到58(39.2mg,产率41％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.10-8.02(m,2H),7.83(s,1H),7.17(d,J＝8.8Hz,2H),7.07-7.00(m,3H),2.47-2.42(m,2H),0.80(t,3H)。
实施例59：4-[6-氨基-4-乙基-5-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚59
Figure BDA0001454033950000681
向4-(6-二(叔丁氧基羰基)氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚59a(1.45g,2.94mmol)于EtOAc(15mL)中的溶液中添加HCl/EtOAc(15mL)并将混合物在25℃搅拌3h。除去溶剂并添加水(10mL)。用NaHCO3调节pH至9并用EtOAc(15mL×3)萃取，以Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到4-(6-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚11a(1.02g)。
将含有11a(80.0mg,0.272mmol)、(3-甲基-1H-吲唑-5-基)硼酸59b(48.0mg,0.27mmol)、K2CO3(188mg,1.36mmol)、二噁烷-H2O(5:1,2.5mL)和Pd(dppf)Cl2(25.00mg)的微波反应罐用氮气吹扫并在微波辐射下在120℃加热50min。将其冷却至25℃，添加水(5mL)。将其用EtOAc(15mL×3)萃取，以Na2SO4干燥。将其浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到59(42.5mg,产率45％)，其为白色固体。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.713min,MS＝344.9[M+1]。1H NMR(400MHz、CD3OD)δ8.30(br,1H),7.69(s,2H),7.66-7.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.30-7.27(m,1H),7.18-7.16(d,J＝8.0Hz,2H),6.87-6.86(d,J＝8.0Hz,2H),2.59(s,3H),2.46-2.37(m,2H),0.73-0.69(t,J＝7.6Hz,3H)。
实施例60：[4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]-吗啉代-甲酮60
遵循实施例89的操作制备60。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),7.72(s,1H),7.45(d,J＝8.3Hz,2H),7.42-7.31(m,2H),7.12-7.02(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.03(s,2H),3.62(s,4H),2.27(q,J＝7.5Hz,2H),0.63(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)404。
实施例61：4-[2-氨基-5-(3-苄基氧基苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚61
遵循实施例89的操作制备61。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),7.69(s,1H),7.52-7.37(m,4H),7.41-7.27(m,4H),7.10-6.93(m,3H),6.95-6.84(m,4H),5.14(s,2H),4.96(s,2H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),0.59(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)397。
实施例62：5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]吡啶-2-甲腈62
遵循实施例89的操作制备62。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.56(s,1H),8.75(dd,J＝2.1,1.1Hz,1H),8.14-8.02(m,2H),7.79(s,1H),7.13-7.01(m,2H),6.94-6.86(m,2H),5.26(s,2H),2.26(q,J＝7.5Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)317。
实施例63：5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]吡啶-3-甲腈63
遵循实施例89的操作制备63。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.56(s,1H),8.84(d,J＝2.2Hz,1H),8.35(t,J＝2.1Hz,1H),7.78(s,1H),7.11-6.95(m,2H),6.94-6.83(m,2H),5.22(s,2H),2.22(dq,J＝15.3,7.5Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)317。
实施例64：[3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]-吡咯烷-1-基-甲酮64
遵循实施例89的操作制备64。M+H(m/z)388。
实施例65：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-环丙基-苯甲酰胺65
遵循实施例89的操作制备65。M+H(m/z)374。
实施例66：2-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]乙腈66
遵循实施例89的操作制备66。M+H(m/z)330。
实施例67：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-氟-苯甲腈67
遵循实施例89的操作制备67。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),7.99-7.91(m,1H),7.76(s,1H),7.55(dd,J＝10.6,1.5Hz,1H),7.40(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.10-7.00(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.21(s,2H),3.27(s,2H),2.29(q,J＝7.7Hz,2H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)334。
实施例68：4-[2-氨基-4-乙基-5-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚68
遵循实施例89的操作制备68。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.10(d,J＝1.8Hz,1H),7.73-7.64(m,2H),7.08-7.01(m,2H),6.95-6.76(m,2H),5.02(s,2H),3.88(s,3H),2.22(q,J＝7.5Hz,2H),0.63(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)322。
实施例69：3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-异丙基-苯甲酰胺69
遵循实施例89的操作制备69。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.86-7.77(m,2H),7.74(s,1H),7.53-7.42(m,2H),7.09-7.02(m,2H),6.93-6.86(m,2H),5.02(s,2H),4.18-4.04(m,1H),2.25(q,J＝7.4Hz,2H),1.17(d,J＝6.6Hz,6H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)376。
实施例70：N-[[4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲基]甲磺酰胺70
遵循实施例89的操作制备70。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),7.68(s,1H),7.56(s,2H),7.47-7.35(m,3H),7.09-7.02(m,2H),6.92-6.85(m,2H),4.97(s,2H),4.20(d,J＝5.8Hz,2H),2.88(d,J＝3.1Hz,3H),2.25(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)398。
实施例71：4-[2-氨基-4-乙基-5-(1-异丁基吡唑-4-基)-3-吡啶基]苯酚71
遵循实施例89的操作制备71。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),7.82-7.74(m,2H),7.08-6.96(m,2H),6.92-6.84(m,2H),4.88(s,2H),3.93(d,J＝7.2Hz,2H),2.13(hept,J＝6.9Hz,1H),0.84(d,J＝6.7Hz,6H),0.74(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)337。
实施例72：5-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-羟基-苯甲腈72
遵循实施例16的操作制备72。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.11(s,1H),9.39(s,1H),7.68(s,1H),7.46(d,J＝2.2Hz,1H),7.35(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.15-7.04(m,2H),6.84-6.75(m,2H),5.11(s,2H),2.21(q,J＝7.4Hz,2H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)332。
实施例73：4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基-4-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚73
遵循实施例89的操作制备73。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.45(d,J＝5.0Hz,1H),7.72(s,1H),7.25-7.19(m,1H),7.15(dd,J＝5.0,1.8Hz,1H),7.12-7.01(m,2H),6.93-6.83(m,2H),5.12(s,2H),3.27(s,3H),2.28(q,J＝7.5Hz,2H),0.63(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)306。
实施例74：4-[2-氨基-5-[3-(二氟甲基)苯基]-4-乙基-3-吡啶基]苯酚74
遵循实施例89的操作制备74。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.72(s,1H),7.68-7.52(m,2H),7.50(dd,J＝4.6,3.1Hz,2H),7.14-7.02(m,3H),6.95-6.85(m,2H),5.04(s,2H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)341。
实施例75：N-[5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-吡啶基]乙酰胺75
遵循实施例89的操作制备75。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.50(s,1H),9.51(d,J＝15.1Hz,1H),8.23(dd,J＝2.5,0.9Hz,1H),8.10(d,J＝8.5Hz,1H),7.78-7.68(m,1H),7.13-7.01(m,2H),6.93-6.74(m,2H),5.05(s,2H),2.22(dq,J＝15.1,7.4Hz,2H),2.11(s,3H),0.63(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)349。
实施例76：4-[2-氨基-5-(3,5二氟苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚76
遵循实施例89的操作制备76。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),7.74(s,1H),7.21(tt,J＝9.4,2.4Hz,1H),7.13-7.00(m,4H),6.93-6.85(m,2H),5.11(s,2H),2.28(q,J＝7.5Hz,2H),0.63(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)327。
实施例77：4-[2-氨基-5-(3-氯苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚77
遵循实施例89的操作制备77。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),7.72(s,1H),7.51-7.33(m,3H),7.29(dt,J＝7.1,1.6Hz,1H),7.13-7.01(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.09(s,2H),2.25(q,J＝7.5Hz,2H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)326。
实施例78：4-[2-氨基-5-(2-氯苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚78
遵循实施例89的操作制备78。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.56(s,1H),7.62(s,1H),7.60-7.51(m,1H),7.45-7.33(m,3H),7.10-7.00(m,2H),6.93-6.85(m,2H),5.05(s,2H),2.10-1.95(m,2H),0.58(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)326。
实施例79：4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-氟-3-甲基-苯基)-3-吡啶基]苯酚79
遵循实施例89的操作制备79。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),8.13(s,1H),7.68(s,1H),7.22(dd,J＝7.7,1.9Hz,1H),7.21-7.11(m,2H),7.15-7.00(m,2H),6.93-6.84(m,2H),4.97(s,2H),2.31-2.18(m,5H),0.62(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)323。
实施例80：4-[2-氨基-5-(4-氯苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚80
遵循实施例89的操作制备80。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.53(s,1H),8.15(s,1H),7.70(s,1H),7.51-7.42(m,2H),7.13-7.01(m,2H),6.93-6.84(m,2H),5.02(s,2H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)326。
实施例81：4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-甲基-苯甲酰胺81
遵循实施例89的操作制备81。M+H(m/z)348。
实施例82：4-[2-氨基-4-乙基-5-[3-(吗啉代甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚82
遵循实施例89的操作制备82。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),7.70(s,1H),7.37(t,J＝7.5Hz,1H),7.30-7.13(m,3H),7.09-7.02(m,2H),6.88(d,J＝8.5Hz,2H),4.96(s,2H),3.60-3.48(m,6H),2.36(s,3H),2.36(d,J＝9.5Hz,1H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),0.61(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)390。
实施例83：4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲氧基嘧啶-5-基)-3-吡啶基]苯酚83
遵循实施例89的操作制备83。M+H(m/z)323。
实施例84：4-[2-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯酚84
遵循实施例89的操作制备84。M+H(m/z)331。
实施例85：4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基吲唑-4-基)-3-吡啶基]苯酚85
遵循实施例89的操作制备85。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),8.10(d,J＝16.8Hz,1H),7.81-7.73(m,2H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.43-7.23(m,3H),7.14-7.02(m,2H),6.93-6.86(m,2H),5.01(d,J＝14.3Hz,2H),4.15(d,J＝15.6Hz,3H),2.32-2.17(m,2H),0.54(t,J＝7.5Hz,3H)。M+H(m/z)345。
实施例86：4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚86
Figure BDA0001454033950000731
将5-溴-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑86a(200mg,0.95mmol)、Boc2O(415mg,1.90mmol)、DMAP(232mg,1.90mmol)于DCM(20mL)中的溶液在室温搅拌5h。将混合物用水洗涤并在DCM(20mL×2)中萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(EtOAc/PE＝1:20)进行纯化，得到5-溴-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-甲酸叔丁酯86b，其为固体(300mg,产率97％)。
将86b(300mg,0.97mmol)、4,4,4’,4’,5,5,5’,5’-八甲基-2,2’-联(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(465mg,1.94mmol)、Pd(dppf)Cl2(68mg,0.1mmol)和KOAc(190mg,1.94mmol)于二噁烷(20mL)中的混合物进行吹扫并在90℃在N2下搅拌5h。将混合物冷却至室温，用EtOAc(20mL×2)萃取，用盐水(20mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(EtOAc/PE＝1:8)进行纯化，得到2-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-1-甲酸叔丁酯86c，其为固体(200mg,产率62％)。
将3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-胺7b(320mg,1.14mmol)、(Boc)2O(500mg,2.29mmol)、DMAP(286mg,2.86mmol)、TEA(420mg,3.43mmol)于DCM(30mL)中的溶液在室温搅拌5h。将混合物用水稀释并在EtOAc(20mL×3)中萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过柱(EtOAc/PE＝1:40)进行纯化，得到3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-(二叔丁基氧基羰基)胺13a，其为固体(580mg,产率100％)。
将13a(140mg,0.29mmol)、86c(125mg,0.35mmol)、Pd(dppf)Cl2(5mg,0.006mmol)和K2CO3(85mg,0.58mmol)于二噁烷/水(15mL/3mL)中的混合物进行吹扫并在90℃在N2下搅拌5h。将混合物冷却至室温并用EtOAc(15mL×3)萃取，用盐水(15mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩，得到粗3-溴-4-乙基-5-(2-甲基-1H-(叔丁氧基羰基)苯并[d]咪唑-5-基)吡啶-2-(二叔丁氧基羰基)胺86d(120mg,产率65％)，其用于下一步。
在0℃向86d(120mg,0.19mmol)于DCM(20mL)中的搅拌的溶液中添加HCl-EtOAc(3mL)。将反应混合物在室温搅拌3h后，将其浓缩并通过柱(EtOAc/PE＝1:10)进行纯化，得到3-溴-4-乙基-5-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)吡啶-2-胺86e，其为固体(60mg,产率85％)。
将86e(60mg,0.18mmol)、(4-羟基苯基)硼酸(30mg,0.22mmol)、Pd(dppf)Cl2(2mg,0.004mmol)和K2CO3(50mg,0.26mmol)于二噁烷/水(10mL/2mL)中的混合物进行吹扫并在90℃在N2下搅拌5h。将混合物冷却至室温并用EtOAc(10mL×3)萃取。将其用盐水(10mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC进行纯化，得到86(14.1mg,产率23％)。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.628min,MS＝344.9[M+1]。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.87-7.79(m,3H),7.61(d,J＝8.4Hz,1H),7.19(d,J＝8.4Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,2H),2.87(s,3H),2.49-2.43(m,2H),0.700(t,J＝7.6Hz,3H)。
实施例87：4-[6-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚87
Figure BDA0001454033950000741
向4-(6-二(叔丁氧基羰基)氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚59a(1.45g,2.94mmol)于EtOAc(15mL)中的溶液中添加HCl/EtOAc(15mL)。将反应混合物在25℃搅拌3h。将其冷却并添加水(10mL)。用NaHCO3调节pH至9。将其用EtOAc(3×20mL)萃取，以Na2SO4干燥并浓缩，得到粗4-(6-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚11a。
将含有11a(80mg,0.273mmol)、5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)-1H-吲唑-1-甲酸叔丁酯87a(94mg,0.273mmol)、K2CO3(189mg,1.36mmol)、二噁烷-H2O(5:1,2.3mL)和Pd(dppf)Cl2(25.00mg)的微波管用N2吹扫并在微波辐射下在120℃加热45min。将混合物冷却至25℃并添加水(15mL)。将其用EtOAc(20mL×3)萃取，以Na2SO4干燥并浓缩，得到5-(2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)吡啶-3-基)-1H-吲唑-1-甲酸叔丁酯87b(155mg)，其为棕色固体。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.695min,MS＝330.9[M-100]；0.786min,MS＝431.0[M+1]。
向87b(100mg,0.239mmol)于EtOAc(5mL)中的混合物中添加HCl/EtOAc(7mL)并将反应混合物在25℃搅拌2h。除去溶剂并将其通过制备型HPLC进行纯化，得到87(20mg,产率26.1％)，其为白色固体。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.702min,MS＝330.9[M+1]。1H NMR(400MHz、CD3OD)δ8.28(s,1H),8.13(s,1H),7.76-7.72(m,2H),7.69(s,1H),7.32-7.29(d,J＝12.0Hz,1H),7.18-7.16(m,2H),6.87-6.85(d,J＝8.8Hz,2H),2.46-2.35(m,2H),0.73-0.69(t,J＝7.6Hz,3H)。
实施例88：4-[2-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚88
Figure BDA0001454033950000751
向吹扫并保持惰性氮气气氛的250mL 3颈圆底烧中加入4-(2-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚89d(1.0g,3.41mmol,1.00当量)、(2H-吲唑-6-基)硼酸88a(663mg,4.09mmol,1.20当量)、K2CO3(3.3g,23.70mmol,6.95当量)、水(25mL)、1,4-二噁烷(25mL)和Pd(dppf)Cl2(0.2g,0.1当量)。将所得溶液在80℃搅拌8h，然后用3×30mL乙酸乙酯萃取。合并有机层并真空浓缩。残余物在用DCM/CH3OH(20/1-10/1)洗脱的硅胶柱上纯化。粗产物从比例为1:1的EtOH/H2O中重结晶，得到251mg(22％)88，其为白色固体。LC-MS:(ES,m/z):331[M+H]+。H-NMR:(300MHz,DMSO,ppm):δ13.05(s,1H),9.56(s,1H),8.09(s,1H),7.76-7.79(m,2H),7.41(s,1H),7.04-7.09(m,3H),6.88-6.91(d,J＝8.7Hz,2H),5.12(s,2H),2.27-2.30(q,2H),0.59-0.64(t,3H)。
实施例89：4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯酚89
Figure BDA0001454033950000761
在0℃向吹扫并保持惰性氮气气氛的500mL 3颈圆底烧中加入4-乙基吡啶-2-胺7a(10g,81.85mmol,1.00当量)、四氢呋喃(200mL)和NBS(29g,162.94mmol,2.00当量)。将所得溶液在室温搅拌15min，然后真空浓缩。残余物在用DCM/MeOH(100:1-20:1)洗脱的硅胶柱上纯化，得到18g(79％)3,5-二溴-4-乙基吡啶-2-胺7b，其为白色固体。
向吹扫并保持惰性氮气气氛的500mL 3颈圆底烧中加入7b(18g,64.29mmol,1.00当量)于四氢呋喃(360mL)中的溶液。在-78℃向其中添加n-BuLi溶液(于己烷中)(58mL,2.00当量,2.2mol/L)。将所得溶液在-78℃搅拌1h，通过添加450mL NH4Cl进行淬灭并用2×500mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用2×500mL盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥并真空浓缩。粗产物通过快速制备型HPLC纯化，得到12g(93％)3-溴-4-乙基吡啶-2-胺89a，其为白色固体。
向吹扫并保持惰性氮气气氛的500mL 3颈圆底烧中加入89a(12g,59.68mmol,1.00当量)于CH3CN(100mL)中的溶液、(4-甲氧基苯基)硼酸(11g,72.39mmol,1.20当量)、Na2CO3(120mL,饱和的)和Pd(dppf)Cl2(1.2g,1.64mmol,0.03当量)。将所得溶液在110℃搅拌1h，用500mL EA稀释，然后用2×500mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用3×200mL盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥并真空浓缩。残余物在用乙酸乙酯/石油醚(1:100-1:10)洗脱的硅胶柱上纯化，得到10g(73％)4-乙基-3-(4-甲氧基苯基)吡啶-2-胺89b，其为白色固体。
在0℃向吹扫并保持惰性氮气气氛的250mL 3颈圆底烧中加入89b(10g,43.80mmol,1.00当量)、四氢呋喃(100mL)，接着加入NBS(7.8g,43.83mmol,1.00当量)。将所得溶液在室温搅拌15min，用500mL EtOAc和500mL H2O稀释。所得溶液用2×500mL乙酸乙酯萃取。合并有机层，用2×500mL盐水洗涤并真空浓缩。残余物在用乙酸乙酯/石油醚(1:20-1:10)洗脱的硅胶柱上纯化，得到8g(59％)5-溴-4-乙基-3-(4-甲氧基苯基)吡啶-2-胺89c，其为白色固体。
在0℃向吹扫并保持惰性氮气气氛的250mL 3颈圆底烧中加入89c(8g,26.04mmol,1.00当量)、二氯甲烷(100mL)，接着加入三溴硼烷(19.6g,78.24mmol,3.00当量)。将所得溶液在室温搅拌1h，然后通过在0℃添加100mL NaHCO3(1M)进行淬灭。通过过滤收集固体，然后用1×100mL H2O和1×300mL EA/PE(1:1)洗涤，得到6.3g(83％)4-(2-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚89d，其为白色固体。
向吹扫并保持惰性氮气气氛的250mL 3颈圆底烧中加入89d(1.0g,3.41mmol,1.00当量)、2-甲基-6-(四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)-2H-吲唑89e(880mg,3.41mmol,1.00当量)、碳酸钾(3.3g,23.88mmol,7.00当量)、水(30mL)、1,4-二噁烷(25mL)和Pd(dppf)Cl2(200mg,0.3mmol,0.1当量)。将所得溶液在80℃搅拌16h，用500mL H2O和500mL乙酸乙酯稀释。将有机层用2×250mL盐水洗涤并真空浓缩。残余物在用DCM/CH3OH(20:1-10:1)洗脱的硅胶柱上纯化。粗产物从比例为1:1的MeOH/H2O中重结晶，得到327mg(28％)89，其为白色固体。LC-MS:(ES,m/z):345[M+H]+。H-NMR:(300MHz,DMSO,ppm):δ9.54(s,1H),8.34(s,1H),7.76(s,1H),7.68-7.71(d,J＝9.0Hz,1H),7.44-7.45(d,J＝0.9Hz,1H),7.06-7.09(d,J＝8.4Hz,2H),6.95-6.99(m,1H),6.87-6.90(d,J＝8.4Hz,2H),4.99(s,2H),4.17(s,3H),2.25-2.32(m,2H),0.59-0.64(m,3H)。
实施例90：4-[2-氨基-5-(3-氨基苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚90
遵循实施例89的操作制备90。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),7.65(s,1H),7.09-6.98(m,3H),6.92-6.83(m,2H),6.56-6.46(m,2H),6.41(dt,J＝7.4,1.3Hz,1H),5.06(s,2H),4.87(d,J＝6.4Hz,2H),2.27(q,J＝7.4Hz,2H),0.65(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)306。
实施例91：4-[2-氨基-5-(4-氨基苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚91
遵循实施例89的操作制备91。M+H(m/z)306。
实施例92：5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺92
Figure BDA0001454033950000781
向吹扫并保持惰性氮气气氛的100mL 3颈圆底烧中加入4-(2-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚89d(800mg,2.73mmol,1.00当量)、[6-(甲基氨甲酰基)吡啶-3-基]硼酸92a(540mg,3.00mmol,1.10当量)、碳酸钾(2.9g,20.83mmol,7.00当量)、1,4-二噁烷(21mL)、水(21mL)和Pd(dppf)Cl2(160mg)。将所得溶液在80℃搅拌16h，冷却并用3×20mL乙酸乙酯萃取。合并有机层并真空浓缩。残余物在用DCM/CH3OH(20/1-10/1)洗脱的硅胶柱上纯化。粗产物从比例为1:1的MeOH/H2O中重结晶，得到270mg(28％)92，其为灰白色固体。LC-MS:(ES,m/z):349[M+H]+。H-NMR(300MHz,DMSO,ppm):δ9.56(s,1H),8.78-8.81(m,1H),8.58-8.59(d,J＝3.0Hz,1H),8.04-8.07(m,1H),7.94-7.98(m,1H),7.78(s,1H),7.04-7.07(d,J＝8.4Hz,2H),6.87-6.90(d,J＝8.7Hz,2H),5.20(s,2H),2.83-2.84(d,J＝3.0Hz,3H),2.22-2.29(m,2H),0.58-0.63(m,3H)。
实施例93：4-[6-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯酚93
Figure BDA0001454033950000782
将4-(6-氨基-5-溴-4-乙基吡啶-3-基)苯酚11a(60mg,0.20mmol)、(1H-吲唑-6-基)硼酸93a(40mg,0.24mmol)、Pd(dppf)Cl2(4mg,0.004mmol)和K2CO3(57mg,0.40mmol)于二噁烷/水(10mL/2mL)中的溶液用N2吹扫并在90℃在N2下搅拌5h。将混合物冷却至室温并用EtOAc(10mL×3)萃取，用盐水(10mL)洗涤，以Na2SO4干燥，浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到93(5.8mg,产率10％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.24(s,1H),8.03(m,1H),7.70(s,1H),7.13(d,J＝6.0Hz,1H),7.23(d,J＝8.8Hz,2H),6.91-6.87(d,J＝7.2Hz,1H),6.91-6.87(m,2H),2.47(t,2H),0.77-0.70(m,3H)。
实施例94：5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-羟基-苯甲腈94
遵循实施例89的操作制备94：M+H(m/z)332。
实施例95：5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-羟基-苯甲酰胺95
遵循实施例89的操作制备95：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.04(s,1H),9.52(s,1H),8.38(s,1H),7.89-7.78(m,2H),7.71(s,1H),7.35(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.09-6.99(m,2H),6.95-6.85(m,3H),4.96(s,2H),2.24(q,J＝7.4Hz,2H),0.62(t,J＝7.4Hz,3H)。M+H(m/z)350。
实施例901：泛素-罗丹明110-甘氨酸表达、纯化和制备
为了克隆泛素-内含肽-His6表达载体，通过PCR用合适的引物扩增针对人泛素氨基酸1-75的编码区，用于然后克隆到表达载体pTYB2中。如Hassiepen,U.等人(2007)Anal.Biochem.371:138-143所述但有以下不同来表达并纯化泛素-内含肽-His6。在镍螯合亲和培养基(Amersham)上分批纯化泛素内含肽并通过在22℃添加100mM巯基乙磺酸钠(MES)且保持5小时来释放泛素-MES。用4倍柱体积的20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸,pH 6.5,100mM NaCl洗脱泛素-MES。将洗脱的物质通过超滤(Vivaspin 6,5-kDa截留)浓缩至小于5ml并在37℃用10当量N-羟基琥珀酰亚胺(Fluka 56480)、10当量可力丁(sym-collidine)(Fluka 27690)和15当量双甘氨酰-罗丹明110进行补充且保持24小时。为了纯化，将反应混合物在HiPrep Sephadex G-25 26/10柱(GE healthcare)上脱盐到20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸,pH 6.5中，然后加载于Source 15S HR 10/10柱(GE healthcare)，其用0-1NaCl梯度展开。合并最终的泛素-罗丹明110-Gly级分，透析到50mM Tris,pH 7.5中，然后浓缩至1mg/ml。Ub-Rho110-Gly可从Boston Biochem商购获得。
在荧光测定中将在40mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)、5mM DTT和0.05mg/ml BSA中的0.5mM泛素-罗丹明110-Gly在30℃与0.05-5ng/ml各份DUB一起温育60分钟。样品一式三份制备并使用
Figure BDA0001454033950000801
2104多标签读数器(Perkin Elmer)在激发/发射为485/535nm的情况下对96孔板进行分析(Hassiepen,U.等人(2007)Anal.Biochem.371:138-143；Ritorto,M.S.等人(2014)Nature Communications 5:4763；doi:10.1038)。
实施例902：Ub-Rho110(USP7_Ub-Rho preInc(IC50)μmol和USP7_Ub-Rho110Fluor(IC50)μmol)
使用泛素-Rho110作为底物进行生化USP7测定：最终测定条件如下：反应缓冲液由以下构成：50mM Tris(pH 7.5)、0.01％(v/v)Triton X-100、2.5mM二硫苏糖醇。0.1％(w/v)牛γ球蛋白(Sigma目录号G5009-25G)；USP7，全长天然C末端，0.2nM；底物即泛素-Rho110(Boston Biochem目录号U-555)，1μM。反应在室温在黑色20μL体积聚苯乙烯ProxiPlate384F
Figure BDA0001454033950000802
(PerkinElmer目录号6008260)中进行1小时。
在384孔透明V形底聚丙烯板(Greiner目录号781280)中将测试化合物(包括对照USP7抑制剂(Ub-醛,Boston Biochem目录号U-201)在DMSO中连续稀释。将DMSO中的化合物以10倍稀释到反应缓冲液中达到最终所需浓度的3倍。以3μM(最终浓度的3倍)准备底物即泛素-Rho110(Boston Biochem目录号U-555)并将5μl分配到反应板中。将5μl化合物(在反应缓冲液中以最终浓度的3倍稀释)转移到反应板中。将5μl 0.6nM USP7(在反应缓冲液中以最终浓度的3倍稀释)转移到反应板中以引发反应。在室温温育1小时后，反应通过添加5μl 400mM乙酸淬灭。酶促产物如下测量：使用在485nm激发和在535nm发射对所裂解的罗丹明110的荧光信号进行定量。当需要将USP7与化合物预温育时，修改试剂添加顺序以在添加底物和开始反应时段前使化合物与USP7预温育(温育1小时)。相对于无酶对照和未抑制酶对照对百分比抑制值进行计算。使用Genedata Screener软件进行曲线拟合和IC50计算。
palm结合位点(palm位点)是由palm配体的0.5nm距离内的USP7催化结构域中的残基所限定的区域。这包括残基V296、Q297、C300、R301、L304、D305、E308、I320、P321、F324、Y348、D349、H403、Q405和M515。
表2显示对palm位点片段化合物的化学优化增强了生化效力并保留了USP7选择性。通过测量对USP7和USP7催化结构域的抑制作用来测量效力。通过测量对USP47和USP5的抑制作用来反映选择性。因此，这些数据表明USP7拮抗剂化合物88、45和81是USP7催化活性的选择性拮抗剂，但是无活性对照化合物89和25在拮抗所评价的任何DUB的活性中是无效的。
表2.Ub-Rho110IC50(μM)
化合物编号 USP7 USP7催化结构域 USP47 USP5
88 0.98 0.43 >200 18.63
89 >63.3 >200 >200 >200
45 2.9 1.3 >200 >200
81 1.4 0.53 >200 >200
25 >63.3 >63.3 >200 >200
实施例903：基于活性对脱泛素酶进行富集
通过用10ml PBS将板冲洗一次且然后刮擦来收获80％融汇的293T细胞。细胞通过在4℃以350g将其旋转3分钟来清理并将团块在液氮中快速冷冻且储存在-80℃直至用于裂解。冷冻的细胞通过将其在缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 7.5、250mM蔗糖、5mM TCEP、2mMATP、50μM苯甲磺酰氟(PMSF)、120mM NaCl、5mM MgCl2)中快速解冻来裂解且裂解物通过在4℃以18,000g旋转离心来清理。将蛋白质浓度调节至5mg/ml并一式两份将1.25mg、2.5mg或5mg该细胞裂解物与15μM化合物88(总共2个单独的经USP7拮抗剂处理的样品)或15μM化合物89(总共2个经对照化合物处理的样品)在Thermomixer(Eppendorf,Hauppage,NY)中在25℃以900rpm温育20分钟。然后将4个样品都与6.6μg/ml以下基于活性的DUB探针(探针对于4个样品中的每个都是相同的)中的任何一个一起在25℃以1200rpm温育1小时：经HA标记的泛素乙烯基砜(Boston Biochem,Cambridge,MA)、经HA标记的泛素炔丙基胺(UbiQ Bio BV,Amsterdam,The Netherlands)或经HA标记的泛素乙烯基甲基酯(UbiQ Bio BV,Amsterdam,The Netherlands)。反应如下终止：在室温添加20％SDS溶液至最终浓度为0.4％且保持至少30分钟且旋转。然后将经反应的裂解物用缓冲液B(50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Mannheim,Germany)、50μM PMSF、0.5％NP-40)稀释10倍。取决于预平衡的抗HA亲和基质(Roche,Mannheim,Germany)的输入蛋白量而添加60-100μl浆液且经HA标记的蛋白质用该基质通过在4℃旋转样品过夜进行免疫纯化。翌日珠粒用以下缓冲液依次洗涤：三次冰冷的缓冲液B、一次冰冷的不含NP-40的缓冲液B和三次冰冷的15mM TEAB pH8.5。在各次洗涤之间在4℃以2000g进行旋转。
为了洗脱经免疫纯化的物质，添加35μl缓冲液C(1mg/ml HA肽(ThermoScientific,Waltham,MA)、15mM TEAB pH 8、0.02％
Figure BDA0001454033950000821
(Waters,Milford,MA)并将样品在Eppendorf
Figure BDA0001454033950000822
(Eppendorf AG)中在37℃以1000rpm振荡温育30分钟。所洗脱的物质通过添加300μl 15mM TEAB并以2600g旋转与珠粒分离。将所分离的物质储存在-80℃直至进一步处理。
实施例904：凝胶内胰蛋白酶消化和质谱分析
洗脱的样品在4-12％Bis.Tris凝胶(Life Technologies,Carlsbad,CA)上以160V分离30分钟。使用Simply
Figure BDA0001454033950000823
染色溶液(Life Technologies,Carlsbad)将蛋白质条带可视化1小时并在Milli-Q水中脱色过夜。将条带从凝胶的顶部至底部切成10个凝胶区域。将凝胶条带进一步在50mM碳酸氢铵/50％乙腈(ACN)溶液中脱色30分钟，然后在100％ACN中脱水10分钟。将胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)溶液以0.02μg/μL加至凝胶条并在冰上冷却1小时。除去过量的胰蛋白酶溶液并在37℃在25mM碳酸氢铵中进行胰蛋白酶消化过夜。肽用10％ACN/0.1％三氟乙酸(TFA)萃取并在
Figure BDA0001454033950000824
真空蒸发器中完全干燥。将肽在2％ACN/0.1％甲酸(FA)中复溶并通过质谱分析。
通过自动进样器注射样品以通过反相色谱在
Figure BDA0001454033950000825
UPLC系统(Waters,Dublin,CA)上分离。将肽加载到C18柱(1.7μm BEH-130,0.1×100mm,Waters,Dublin,CA)上，流速为1μL/分钟且梯度为35分钟2％溶剂B至25％溶剂B(其中溶剂A为0.1％甲酸/2％ACN/水且溶剂B为0.1％FA/2％水/ACN)。将肽直接洗脱到LTQ Orbitrap
Figure BDA0001454033950000827
质谱仪(ThermoFisher,San Jose,CA)中。在FTMS中以60,000分辨率分析前体离子。使用以数据依赖性模式操作的仪器在离子阱中进行MS/MS，其中前15个丰度最大的离子经受碎片化。
实施例905：数据分析和生物信息学
MS/MS数据使用
Figure BDA0001454033950000826
检索算法(Matrix Sciences,London,UK)来检索。检索标准包括50ppm的完全MS公差、0.8Da的MS/MS公差，甲硫氨酸的氧化作为可变修饰，最多2个遗漏酶切位点。针对由反向蛋白质序列构成的Uniprot数据库的人类和污染物亚组检索数据。然后使用线性判别分析(LDA)在肽水平以5％FDR过滤数据并使用蛋白质FDR工具以5％FDR进一步过滤(Huttlin等人(2010)Cell 143(7):1174-1189)。然后使用Vista对所有肽进行曲线下峰面积(AUC)定量(Bakalarski等人(2008)J Proteome Res7(11):4756-4765)。
实施例906：细胞数据方法
细胞系：除非另有说明，所有细胞均得自American Type Culture Collection(ATCC),10801University Boulevard Manassas,VA 20110USA。HCT WT(人结肠直肠癌,野生型)亲代、HCT USP7null(Horizon；HD R02-028)、HCT p53null(Horizon；HD 104-001)、MCF-7、MDA-MB157、U2Os、SaOs、正常乳腺细胞(Life Technologies；HMEC A10565)、正常成骨细胞(Lonza；CC-2538)、KMS-21BM、KMS-28PE(Japanese Collection of ResearchBioresources Cell Bank)、RKO、RKO-E6、Vibo、SiHA。
抗体：USP7(Abcam；ab84098)、MDM2(Santa Cruz；sc-965)、微管蛋白(Licor；926-42211)、p53(Thermo Scientific；MS738-P1)、p21(Millipore；05-655)、E6AP(Santa Cruz；sc-25509)。
化合物：式I化合物、顺铂、多柔比星。
细胞活力测定：
将2,500-5,000个细胞接种在96孔板(Corning；3904)的1个孔中。翌日将培养基由正常(10％)培养基变为含有媒介物(DMSO)或化合物的低血清(0.5％)培养基。16-24小时后，将FBS加到各孔中以使血清水平恢复正常(10％)。然后使细胞生长2天。所有处理一式三份进行。
a)IncuCyteTM(细胞密度和半胱天冬酶活性)
在细胞接种后第二天将培养基更换为含有2μM CellEvent半胱天冬酶3/7试剂(Life Technologies；C10423)和化合物的低血清培养基。将板放置在IncuCyte(EssenBioscience,Inc.)活细胞成像仪中并在15-20分钟后开始扫描。IncuCyteTMZOOM通过定制成像方案促进活细胞监测。使用10×物镜每2小时拍摄一次图像且保持至少3天。使用相位对比来测量细胞融汇/密度同时使用绿色荧光来测量半胱天冬酶活性。使用IncuCyte软件(基本分析参数)分析图像并确定半胱天冬酶活性与细胞密度的比例。
b)CellTitre-Glo(Promega；G7570)
在添加化合物后72小时遵循制造商(Promega)提供的方案添加CellTitre Glo(CTG)试剂。在测试化合物对USP7依赖性的实验中，鉴于无USP7细胞的增殖较慢，每孔接种多3倍的无USP7细胞(7,500个无USP7细胞与2,500个野生型(WT)细胞)。对于多发性骨髓瘤实验，将细胞接种在低血清培养基中并立即用化合物处理。24小时后，添加血清恢复正常水平。24小时后即在添加化合物后48小时而不是72小时后，进行针对粘附细胞的CTG测定。
MDM2周转：在24孔板中用DMSO或化合物(15μM)将0.15×106个MCF-7细胞处理总计8小时。在该8小时期间在收获前以指定次数添加放线菌酮(CHX)。
Western印迹：在24孔板中在低血清培养基中在裂解前分别用15μM或2.5μM化合物将0.10-0.15×106个(粘附)或0.5×106个(悬浮)细胞处理24小时，用于Western印迹分析。
细胞泛素化MDM2测定方案：在96孔黑色透明底经TC处理的板(Greiner,目录号655090)中以150,000个细胞/孔的密度在90ml(RPMI 1640培养基,10％FBS,1×GlutaMAXTM,Gibco)中接种HCT116结肠癌细胞或SJSA-1骨肉瘤细胞并在组织培养箱中在37℃和5％CO2温育2小时。在96孔聚丙烯V形底培养板(Greiner,目录号651261)中以200×最终所需浓度将化合物连续稀释在DMSO中，然后在RPMI组织培养基中以1:20稀释并将10ml转移到细胞板的每个孔中。将细胞板在37℃和5％CO2温育过夜20小时。将蛋白酶体抑制剂MG132(CaymanChemical,目录号10012628)的20ml120mM原液(在RPMI中)加到各孔中。将细胞在37℃和5％CO2温育1小时。使用Ub/Total MDM2全细胞裂解试剂盒(MSD,目录号K15168D-2)对泛素化MDM2进行定量。通过向每个孔中添加15ml 5×MSD裂解缓冲液(含有添加剂：10mM NaF、10mMβ-甘油磷酸、1.5mM Na3VO4、蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,P8340))来裂解细胞并在4℃在振荡下温育30分钟。将100ml裂解物转移到MSD 96孔板的每个孔中，在室温在振荡(650RPM)下避光温育1小时。使用Biotek EL405洗板器将MSD板在Tris缓冲盐水(50mM Tris-Cl,pH7.5,150mM NaCl)中洗涤3次。每板制备3ml检测抗体溶液(1ml阻断缓冲液A、1.82ml 1×Tris洗涤缓冲液、150μl 2％阻断剂DM、30μl 10％阻断剂D-R、60μl 50×抗全MDM2抗体)。每孔添加25ml检测抗体溶液并在室温(650RPM)避光温育1小时。使用Biotek EL405洗板器将板在Tris缓冲盐水中洗涤3次。根据制造商的说明书制备MSD读数缓冲液并每孔添加150ml。使用MSD Sector Reader对板进行读数。最终测量值是泛素化MDM2/总MDM2的比例。使用Genedata Screener软件相对于DMSO对照对泛素化MDM2的增加百分比进行计算。
化合物88在低血清条件下引起SJSA-1细胞中泛素化MDM2的增加(EC50＝2微摩尔浓度)。在HCT116结肠癌细胞、乳腺癌细胞和骨肉瘤细胞中，完整Palm位点3化合物活性需要p53表达。式I化合物活性需要USP7表达。低MDM2表达损害了Palm位点3化合物活性。
式I化合物使p53和p21增加而没有使MDM2稳定并可与标准护理化学疗法组合。式I化合物使MDM2不稳定并选择性抑制内源性USP7DUB活性。
实施例907：初级NMR筛选
使用NMR进行初级片段筛选用于直接结合检测。使用饱和差谱法(Mayer,M.；MeyerB.Angew.Chem.,Int.Ed.,38,1784-1788(1999))来鉴定文库中与靶标蛋白相互作用的化合物。筛选文库由分子量平均约250道尔顿的4862个“片段”构成。在第一步，5个片段的混合物在USP7催化结构域存在下测量且显示出结合的化合物单独重复。作为初级结合剂的化合物基于混合物的STD谱中的信噪比(SINO)>5和来自确认测量结果的SINO>10来选择。在初级筛选中鉴定并确认了片段结合剂，然后向经2H/13C/15N同位素标记的USP7蛋白中添加初级结合剂且观察和分类TROSY-HSQC谱中的15N位移扰动(Pervushin,K.,Riek,R.,Wider,G.&Wüthrich,K.(1997)Proc NatlAcad Sci USA 94:12366-12371)。位移扰动允许基于所涉及的氨基酸和USP7晶体结构将支架分组至特异性结合位点。15N TROSY重叠显示了与USP7的“palm位点”结合的片段的化学位移扰动特征。
虽然出于清楚理解的目的通过说明和实施例对上述发明进行了详细描述，但是所述说明和实施例不应被解释为限制本申请范围。因此，所有合适的修改和等同形式都可被认为落入所附权利要求书所限定的本申请范围内。本申请引用的所有专利和科学文献所公开的内容通过引用明确地并入本申请。

Claims (97)

1.一种化合物或其药用盐，所述化合物选自式I：
Figure FDA0003469837460000011
其中
R1为4-苯酚基团；
R2选自-CN、-OCH3、C1-C3烷基、C1-C3氟烷基和环丙基；
R3选自F、Cl、Br、I、-CN、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH(OH)CH(CH3)2、-C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2SO2CH3、-CH2OP(O)(OH)2、-CH2F、-CHF2、-CH2NH2、-CH2NHSO2CH3、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CF3、-CH2CF3、-CH2CHF2、-CH(CH3)CN、-C(CH3)2CN、-CH2CN、-CO2H、-COCH3、-CO2CH3、-CO2C(CH3)3、-COCH(OH)CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CONHCH2CH3、-CONHCH(CH3)2、-CON(CH3)2、-C(CH3)2CONH2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-N(CH3)COCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、-NO2、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2OCH3、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2N(CH3)2、-OP(O)(OH)2、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、-S(O)3H、环丙基、环丙基酰胺基团、氧杂环丁基、氮杂环丁基、(1-甲基氮杂环丁-3-基)氧基、N-甲基-N-氧杂环丁-3-基氨基、氮杂环丁-1-基甲基、苄基氧基苯基、吡咯烷-1-基、吡咯烷-1-基-甲酮基团、哌嗪-1-基、吗啉代甲基、吗啉代-甲酮基团和吗啉代；
n选自0、1、2和3；且
R4选自H、C1-C3烷基、C1-C3氟烷基、环丙基和环丙基甲基。
2.权利要求1的化合物或其药用盐，其中R2为-CH2CH3。
3.权利要求1或2的化合物或其药用盐，其中R3为-OH且n为1。
4.权利要求1或2的化合物或其药用盐，其中R4为H。
5.权利要求1的化合物或其药用盐，所述化合物选自式Ia：
Figure FDA0003469837460000021
6.权利要求1的化合物或其药用盐，所述化合物选自式Ib：
Figure FDA0003469837460000022
7.权利要求1的化合物或其药用盐，所述化合物选自式Ic：
Figure FDA0003469837460000023
8.权利要求1的化合物或其药用盐，所述化合物选自式Id：
Figure FDA0003469837460000024
9.权利要求1的化合物或其药用盐，所述化合物选自式Ie：
Figure FDA0003469837460000025
10.一种化合物或其药用盐，所述化合物选自：
4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-甲基-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-异丙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-甲氧基-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-(三氟甲基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-5-(4-羟基苯基)-4-丙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-3-氟-苯酚；
N-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]乙酰胺；
4-[6-氨基-4-环丙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(2-氟-4-甲氧基-苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-3-氟-苯酚；
4-[2-氨基-5-[3-[(二甲基氨基)甲基]苯基]-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
N-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(2-噻吩基)-3-吡啶基]苯基]乙酰胺；
N-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯基]乙酰胺；
4-[4-乙基-5-(4-羟基苯基)-6-(丙基氨基)-3-吡啶基]苯酚；
4-(6-氨基-4-乙基-5-苯基-3-吡啶基)苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(间甲苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-5-(3,4二氟苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲腈；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-甲基磺酰基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
N-[4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]氨基甲酸叔丁酯；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(3-吗啉代苯基)-3-吡啶基]苯酚；
N-[[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲基]氨基甲酸叔丁酯；
4-[6-氨基-4-乙基-5-[3-(甲氧基甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-[4-(甲氧基甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-[3-(吗啉代甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚；
2-[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]乙腈；
N-[4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]-N-甲基-氨基甲酸叔丁酯；
5-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]吡啶-3-甲腈；
N-[4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲磺酰胺；
N-[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]氨基甲酸叔丁酯；
4-(2-氨基-4-乙基-5-嘧啶-5-基-3-吡啶基)苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(邻甲苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-氟苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(6-甲基-3-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(对甲苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-(2-氨基-4-乙基-5-苯基-3-吡啶基)苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-(环丙基甲基氨基)-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
N-[3-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲磺酰胺；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-哌嗪-1-基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[4-乙基-5-(4-羟基苯基)-6-(甲基氨基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-(4-氯-3-甲基-苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲酰胺；
3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲酰胺；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-异丙基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-(3,4二氟苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲腈；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-氟苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯甲腈；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(3-甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚；
3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N,N-二甲基-苯甲酰胺；
4-[2-氨基-4-乙基-5-[4-(羟基甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N,N-二甲基-苯甲酰胺；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(间甲苯基)-3-吡啶基]苯酚；
5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-1H-吡啶-2-酮；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚；
[4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]-吗啉代-甲酮；
4-[2-氨基-5-(3-苄基氧基苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]吡啶-2-甲腈；
5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]吡啶-3-甲腈；
[3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]-吡咯烷-1-基-甲酮；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-环丙基-苯甲酰胺；
2-[3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]乙腈；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-氟-苯甲腈；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚；
3-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-异丙基-苯甲酰胺；
N-[[4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]苯基]甲基]甲磺酰胺；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(1-异丁基吡唑-4-基)-3-吡啶基]苯酚；
5-[2-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-羟基-苯甲腈；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基-4-吡啶基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-[3-(二氟甲基)苯基]-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
N-[5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-吡啶基]乙酰胺；
4-[2-氨基-5-(3,5二氟苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-(3-氯苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-(2-氯苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(4-氟-3-甲基-苯基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-(4-氯苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-甲基-苯甲酰胺；
4-[2-氨基-4-乙基-5-[3-(吗啉代甲基)苯基]-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲氧基嘧啶-5-基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基吲唑-4-基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-5-基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-4-乙基-5-(2-甲基吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-(3-氨基苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
4-[2-氨基-5-(4-氨基苯基)-4-乙基-3-吡啶基]苯酚；
5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺；
4-[6-氨基-4-乙基-5-(1H-吲唑-6-基)-3-吡啶基]苯酚；
5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-羟基-苯甲腈；
5-[6-氨基-4-乙基-5-(4-羟基苯基)-3-吡啶基]-2-羟基-苯甲酰胺。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的化合物或其药用盐和药用赋形剂。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的化合物或其药用盐和药用载体、助流剂或稀释剂。
13.权利要求11或12的药物组合物，其还包含治疗剂。
14.制备药物组合物的方法，其包括将权利要求1至10中任一项的化合物或其药用盐与药用赋形剂组合。
15.制备药物组合物的方法，其包括将权利要求1至10中任一项的化合物或其药用盐与药用载体、助流剂或稀释剂组合。
16.权利要求11或12的药物组合物在制备用于治疗由Bruton酪氨酸激酶介导的疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自免疫病症、癌症、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌功能障碍和神经学病症。
17.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为选自以下的癌症：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、食道癌、喉癌、角化棘皮瘤、大细胞癌、小细胞癌、骨癌、胰腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、肉瘤、膀胱癌、肾癌、毛细胞癌、鼻咽癌、唇癌、舌癌、口癌、小肠癌、支气管癌、胃癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾盂癌和绒毛结肠腺瘤。
18.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为宫颈癌。
19.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为子宫体癌。
20.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为子宫颈癌。
21.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为胶质瘤。
22.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为成胶质细胞瘤。
23.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为成神经细胞瘤。
24.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为皮肤癌。
25.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为表皮样癌。
26.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为肝癌。
27.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为肝细胞癌。
28.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为骨髓样病症。
29.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为骨髓性白血病。
30.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为急性骨髓性白血病。
31.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为慢性骨髓性白血病。
32.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为脑癌。
33.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为中枢神经系统癌症。
34.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为多发性骨髓瘤。
35.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为肺癌。
36.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为非小细胞肺癌(NSCLC)。
37.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为肺腺癌。
38.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为结肠癌。
39.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为结肠-直肠癌。
40.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为淋巴瘤。
41.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为霍奇金癌。
42.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为非霍奇金淋巴瘤。
43.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为淋巴细胞性白血病。
44.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
45.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为胆道癌。
46.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为肝内胆管癌。
47.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为白血病。
48.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为腺癌。
49.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为腺瘤。
50.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为大肠癌。
51.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为直肠癌。
52.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为咽癌。
53.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为口腔癌。
54.权利要求16的用途，其中所述疾病或病症为血液学恶性肿瘤。
55.权利要求54的用途，其中所述血液学恶性肿瘤为白血病或淋巴瘤。
56.权利要求16的用途，其中所述药物组合物进一步包含其它治疗剂，所述其它治疗剂选自抗炎剂、免疫调节剂、化学治疗剂、凋亡增强剂、神经营养因子、心血管疾病治疗剂、肝病治疗剂、抗病毒剂、血液病症治疗剂、糖尿病治疗剂和免疫缺陷障碍治疗剂。
57.用于治疗由USP7介导的疾病的试剂盒，其包含：
a)权利要求11或12的药物组合物；和
b)使用说明书。
58.权利要求1至10中任一项的化合物或其药用盐在制备用于治疗或预防由Bruton酪氨酸激酶介导的疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自免疫病症、癌症、心血管疾病、病毒感染、炎症、代谢/内分泌功能障碍和神经学病症。
59.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为选自以下的癌症：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、食道癌、喉癌、角化棘皮瘤、大细胞癌、小细胞癌、骨癌、胰腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、肉瘤、膀胱癌、肾癌、毛细胞癌、鼻咽癌、唇癌、舌癌、口癌、小肠癌、支气管癌、胃癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾盂癌和绒毛结肠腺瘤。
60.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为宫颈癌。
61.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为子宫体癌。
62.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为子宫颈癌。
63.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为胶质瘤。
64.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为成胶质细胞瘤。
65.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为成神经细胞瘤。
66.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为皮肤癌。
67.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为表皮样癌。
68.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为肝癌。
69.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为肝细胞癌。
70.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为骨髓样病症。
71.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为骨髓性白血病。
72.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为急性骨髓性白血病。
73.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为慢性骨髓性白血病。
74.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为脑癌。
75.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为中枢神经系统癌症。
76.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为多发性骨髓瘤。
77.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为肺癌。
78.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为非小细胞肺癌(NSCLC)。
79.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为肺腺癌。
80.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为结肠癌。
81.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为结肠-直肠癌。
82.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为淋巴瘤。
83.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为霍奇金癌。
84.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为非霍奇金淋巴瘤。
85.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为淋巴细胞性白血病。
86.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
87.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为胆道癌。
88.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为肝内胆管癌。
89.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为白血病。
90.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为腺癌。
91.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为腺瘤。
92.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为大肠癌。
93.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为直肠癌。
94.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为咽癌。
95.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为口腔癌。
96.权利要求58的用途，其中所述疾病或病症为血液学恶性肿瘤。
97.权利要求96的用途，其中所述血液学恶性肿瘤为白血病或淋巴瘤。
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