DE69901082T2

DE69901082T2 - Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Hemmung von neoplastischen Veränderungen

Info

Publication number: DE69901082T2
Application number: DE69901082T
Authority: DE
Inventors: Han; Liu; Rifat Pamukeu; Gary A. Piazza; Joseph W. Thompson; Bing Zhu
Original assignee: Cell Pathways Inc
Current assignee: OSI Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: DK0997145T3; CA2284853A1; DE69901082D1; IL132366A0; TR199902578A3; CN1255379A; JP2000186047A; EP0997145B1; TWI239837B; TR199902578A2; AU5401099A; AU770308B2; EP1161943A2; ES2174573T3; NO994995L; NO994995D0; EP1161943A3; NO20062682L; ATE214920T1; CN100389829C

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von einer oder mehreren Formen von Phosphodiesterase Typ 2 ("PDE2") und von Phosphodiesterase Typ 5 ("PDE5") und/oder Proteinkinase G, um Verbindungen zu identifizieren, die für die Behandlung von und Vorbeugung gegen Krebsvorstufen und Krebsverletzungen bei Säugern geeignet sind:
Derzeit bringt die nicht-chirurgische Behandlung von Krebs für den Patienten die Verabreichung eines oder mehrerer, hochgiftiger Chemotherapeutika mit sich oder hormonelle Therapien, wenn der Krebs bis zu einem Punkt vorangeschritten ist, wo die therapeutischen Vorteile der Chemotherapie oder der hormonellen Therapie deren ernste Nebeneffekte aufwiegen. Solche Nebeneffekte sind jedem Onkologen bekannt, und sie variieren von Medikament zu Medikament. Andererseits werden Chemotherapeutika typischerweise nur über kurze Zeitintervalle hinweg eingesetzt, wobei oft zwischen Chemotherapie und behandlungsfreien Zeiten abgewechselt wird, um den Patienten nicht mit den Nebeneffekten der Medikamente zu überlasten. Bei der solchermaßen gegebenen Risiko-Vorteils-Abwägung schließen die Nebeneffekte üblicherweise einen Beginn der Chemotherapie aus, wenn Patienten Krebs-Vorstufen-Schädigungen zeigen, oder die Fortsetzung einer Chemotherapie oder einer hormonellen Therapie auf einer dauernden Basis als Versuch zur Vermeidung des Wiederauftretens nach dem Entfernen eines offenen Krebses.
Von einer unerwarteten Quelle begann vor etwa einer Dekade ein Hoffnungsschimmer aufzuleuchten: Den nicht steroiden, entzündungshemmenden Medikamenten ("NSAIDs"). Die Krebs- und Krebsvorstufenerforschung ist angefüllt mit Publikationen, weiche verschiedene, biochemische Moleküle beschreiben, die in neoplastischem Gewebe verstärkt exprimiert werden, und hinterläßt eine Gruppe nach der anderen zur Untersuchung, ob spezifische, verstärkt ausgeschiedene Moleküle verantwortlich für die Krankheit sind, und ob dann, wenn eine solche Über- Ausscheidung vermieden würde, die Neoplasie gelindert werden könnte. In Bezug auf familiär-hereditäre Adenopathie ("FAP") beispielsweise stellte Waddell im Jahr 1983 (Waddell, W. R. et al., "Sulindac for Polyposis of the Colon", Journal for Surgical Oncology, 24: 83-87, 1983) die Hypothese auf, dass nicht steroide, entzündungshemmende Medikamente ("NSAIDs") die Bedingungen lindern sollten, da bei diesen Polypen verstärkt Prostaglandine ausgeschieden werden, und weil NSAIDs die Wirkung der Prostaglandin-Synthetase (PGE&sub2;) hemmten. Deshalb verabreichte er verschiedenen FAP-Patienten das nicht steroide, entzündungshemmende Medikament ("NSAID") Sulindac (eine PGE&sub2; hemmende Substanz). Waddell entdeckte, dass die Polypen zurückgingen und dank dieser Therapie nicht wiederkehrten. Die PGE&sub2;-Hemmung resultiert aus der Hemmung der Cyclooxygenase (COX) durch NSAIDs. Der Erfolg von Waddell mit Sulindac und die PGEJCOX-Beziehung bestätigten anscheinend die Rolle von zwei anderen biochemischen Zielsubstanzen - PGE&sub2; und COX - bei der Karzinogenese, und die folgende Literatur bestärkte diese Sichtweise.
Der Hoffnungsschimmer für an Neoplasie leidende Patienten war, dass Sulindac tatsächlich viel weniger Nebeneffekte zeigte als herkömmliche Chemotherapeutika oder Hormone und die Möglichkeit zur Behandlung von Krebs in früheren Stadien der Krankheit eröffnete sowie für längere Zeitintervalle als im Vergleich mit herkömmlichen Chemotherapeutika. Im Hinblick auf die offene Frage, ob eine Verbindung wie Sulindac verwendet werden könnte, um freien Krebs zu behandeln, mußte eine derartige Hoffnung jedoch mit Rücksicht darauf, dass Waddell Sulindac nur an Patienten mit einem Vorkrebszustand, FAP, verabreicht hatte, gemäßigt werden.
Jene Hoffnung wurde auch gedämpft durch den NSAIDs eigenen Satz von Nebeneffekten. Wenn sie dauernd verabreicht werden, haben Sulindac und andere NSAIDs einen negativen Einfluß auf die Verdauung, wo PGE&sub2; eine Schutzrolle spielt. Wenn sie dauernd genommen werden, zeigen sie außerdem Nebeneffekte in Bezug auf die Nieren sowie eine Beeinträchtigung der Blutkoagulation. Wie Waddell unglücklicherweise feststellte, beendeten einige der Sulindac-Patienten die Medikamenteneinnahme aufgrund von Nebeneffekten (vgl. Waddell, W. R. et al., "Sulindac for Polyposis of the Colon", The American Journal of Surgery; 157 : 175-79, 1989), und meistens wandten diese sich zusätzlichen chirurgischen Maßnahmen zur Kontrolle der Polypenbildung zu. Somit stellen diese Medikamente für Neoplasie- Patienten keine praktische Dauerbehandlung dar, bspw. für FAP, sporadische Polypen oder Männer nach einer Prostatektomie mit steigenden PSA-Werten (ein steigender PSA-Wert bei solchen Männern deutet auf eine Rückkehr der Krankheit hin, die sich noch nicht als freier, sichtbarer Krebs zeigt). Diese Nebeneffekte begrenzen auch die Verwendung von NSAIDs für jede andere Neoplasie-Indikation, welche eine Langzeit-Medikamentenverabreichung erfordert. In jüngerer Zeit wurde von einigen vorgeschlagen, COX-2-spezifische NSAIDs wie bspw. Celecoxib zu verwenden. Jedoch glaubt man, dass die Nebeneffekte derartiger Verbindungen auf Nieren und andere Organe die Dosierung und Behandlungslänge mit derartigen Verbindungen für langfristige Anti-Neoplasie-Indikationen begrenzen. Weiterhin zeigen kürzlich veröffentlichte Daten, dass von Medikamenten wie Celecoxib sehr hohe Dosen benötigt werden, um eine geringe Wirkung auf Dickdarmpolypen nur in vorbestimmten Bereichen des Dickdarms zu erzielen. Für die Behandlung von Dickdarmkrebs ist vielleicht noch wichtiger, dass berichtet worden ist, dass bei bestimmten Dickdarm-Neoplasien (bspw. HCT-116) kein COX-2 ausgeschüttet wird' und dass derartige Inhibitoren wirkungslos gegenüber diesen Neoplasien sind (vgl. Sheng et al., "Inhibition of Human Colon Cancer Cell Growth By Selective Inhibition of Cyclooxygenase-2", J. Clin. Invest., 99 (9): 2254-9, 1997).
Jüngere Entdeckungen haben die Wissenschaftler von den COX/PGE&sub2;- Bestrebungen abgelenkt, da solche Zielsubstanzen nicht die primären (oder auch nur sekundäre Ziele) bei der erfolgreichen Behandlung von Neoplasiepatienten auf einer dauerhaften Basis sein könnten. Pamukcu et al. haben in dem US-Patent Nr. 5,401,774 offenbart, dass Sulfonylverbindungen, von denen berichtet wurde, dass sie in der Praxis keine Hemmungswirkungen auf PGE&sub2; und COX hätten (und demzufolge keine NSAIDs oder entzündungshemmende Substanzen sind), unerwarteterweise das Wachstum einer Vielzahl von neoplastischen Zellen hemmten, einschließlich der Zellen von Dickdarmpolypen. Diese Sulfonylderivate haben sich in Rattenmodellen der Dickdarm-Karzinogenese als wirkungsvoll erwiesen, und eine Variante (die nun als Exisulind bezeichnet wird), hat sich als effektiv bei menschlichen, klinischen Versuchen mit FAP-Patienten erwiesen, und hat - was noch bemerkenswerter ist - selbst bei einem offenem Krebs Wirkung gezeigt: Selbst bei Prostatakrebs, in einer kontrollierten, klinischen Studie, die im folgenden präsentiert wurde. Weiterhin haben kürzeste Forschungen überzeugend nachgewiesen, dass nicht bei allen Neoplasie-Erkrankungen COX I und COX II in nennenswertem Umfang ausgeschüttet werden, wodurch die Hoffnung gemindert wurde, dass ein COX I- oder COX II-spezifischer Inhibitor bei der Behandlung von Neoplasie in breitem Umfang therapeutisch nützlich sein würde (vgl. Lim et al., "Sulindac Derivates Inhibit Growth and Induce Apoptosis in Human Prostate Cancer Cell Lines", Biochem. Pharmacology, Vol. 58, pp. 1097-1107 (1999), im Druck).
Wie viele andere, bei Neoplasie in vermehrtem Umfang ausgeschütteten Proteinen, so könnte auch die PGE&sub2;/COX-Überexpression bei manchen Neoplasie- Erkrankungen nicht die Ursache sein, sondern eine Folge von diesen. Andererseits wirft jedoch die Verknüpfung dieser Entdeckungen die Frage auf, auf welchem Weg Verbindungen wie bspw. Exisulind (welche einen Wirkungsbereich gegenüber beiden, sowohl COX- als auch nicht-COX-exprimierenden Neoplasie-Erkrankungen haben) wirken? Was machen derartige Verbindungen mit neoplastischen Zellen.
Piazza et al. haben (in den U. S. -Patentanmeldungen Nr. 08/866,027 und 09/046,739) entdeckt, dass Verbindungen (wie bspw. Exisulind) die für zyklisches GMP spezifische Phosphodiesterase (bspw. PDE5) hemmten, und dass andere derartige Verbindungen unter Verwendung dieses Enzyms durchgekämmt werden könnten, was zur Entdeckung noch weiterer Verbindungen führen könnte, die entwickelt und zu anti-neoplastischen, pharmazeutischen Verbindungen formuliert werden könnten.
Solche pharmazeutischen Verbindungen können in hohem Grade anti-neoplastisch sein, und sie können praktisch frei sein von Nebenwirkungen, wie sie mit herkömmlichen Chemotherapeutika verbunden sind, oder selbst von den Nebenwirkungen der COX- und PGE&sub2;-Hemmung, wenn jemand diese Nebenwirkungen vermeiden möchte. Darüber hinaus können anti-neoplastische, cGMP-spezifische, PDE hemmende Verbindungen bei neoplastischen Zellen Apoptose (eine Form des programmierten Zelltods oder Suicids) auslösen, jedoch nicht bei normalen Zellen. Deshalb ist solchen neuen Verbindungen eine neue Klasse von Antineoplastika zugewiesen worden, die unter dem Namen selektive, apoptotische anti-neoplastische Medikamente ("SAANDs") bekannt ist. Dementsprechend haben SAANDs mehrere Erkenntnisse herkömmlicher Wissensgebiete in Frage gestellt: (1) Dass anti-neoplastische Verbindungen nicht wirksam sein können, ohne auch normale Zellen zu töten; (2) dass COXs verantwortlich für Neoplasie sind; und (3) dass die Vorbeugung gegenüber Dickdarm-Neoplasie durch NSAIDs wahrscheinlich durch die Hemmung eines oder beider Typen von COX vermittelt wird.
Eine im folgenden vorgestellte Untersuchung hat jedoch gezeigt, dass nicht alle Verbindungen, welche die klassische PDE5-Hemmungswirkung zeigen, in neoplastischen Zellen Apoptose auslösen. Beispielsweise lösen die gut bekannten PDE5-Inhibitoren Zaprinast und Sildenafil nicht allein Apoptose aus, oder hemmen in unseren Händen das neoplastische Zellwachstum. Da jedoch pro-apoptotische PDE5-Inhibitoren selektiv Apoptose auslösten (d. h., bei neoplastischen, nicht dagegen bei normalen Zellen), und dies ohne eine substantielle COX-Hemmung, wurde die Nützlichkeit von PDE5 als Durchsiebewerkzeug für erwünschte, antineoplastische Verbindungen in Frage gestellt.
Wie auch immer, eine Verbesserung des PDE5-Durchsiebeverfahrens ist wünschenswert, um anti-neoplastische, pro-apoptotische, aber sichere Verbindungen zu finden, so dass neue pharmazeutische Verbindungen formuliert werden können für therapeutische Anwendungen bei Neoplasie einschließlich Krebsvorstufen und Krebs.

Zusammenfassung der Erfindung

Im Verlaufe der Forschungen, warum einige Inhibitoren nur Apoptose auslösten, während andere dies nicht taten, entdeckten wir eine Form der auf zyklisches GMP spezifischen Phosphodiesterase-Aktivität, wie sie vorher noch nicht beschrieben worden war. Diese neue Phosphodiesterase-Aktivität war vorher noch nicht bestimmt worden. Ohne uns auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, glauben wir, dass diese neue PDE-Aktivität eine neue PDE2-Form sein könnte, der in erheblichem Umfang die Wirkung zur Hydrolisierung von cAMP fehlt, d. h., sie ist cGMPspezifisch. Klassische PDE2 ist nicht cGMP-spezifisch (sie hydrolisiert auch cAMP), klassische PDE2 findet sich auch in neoplastischen Zellen. Diese neue PDE und PDE2 ist nützlich bei dem Durchsieben pharmazeutischer Verbindungen auf erwünschte, anti-neoplastische Eigenschaften. Grundsätzlich verhält es sich so, dass im Endeffekt Apoptose auftritt, wenn in neoplastischen Zellen durch eine antineoplastische, PDE5-hemmende Verbindung die PDE5- und die PDE2-Aktivität (in ihrer neuartigen wie auch ihrer herkömmlichen Form) gehemmt werden. Wenn nur PDE5 gehemmt wird (nicht jedoch die verschiedenen Formen von PDE2), so tritt keine Apoptose auf.
In allgemeinster Hinsicht zeigt diese neue PDE-Form eine Aktivität, welche durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist:
(a) eine cGMP-Spezifizierung gegenüber cAMP
(b) ein positives, unterstützendes, kihetisches Verhalten in Gegenwart eines cGMP-Substrats;
(c) eine submikromolare Affinität für cGMP; und
(d) Unempfindlichkeit gegenüber einer Inkubation mit einer gereinigten, cGMPabhängigen Proteinkinase.
Andere Eigenschaften dieser neuartigen PDE umfassen: Sie hat eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber einer Hemmung durch Zaprinast und E4021, sie kann gegenüber der klassischen PDE5-Aktivität durch eine Anionen-Austausch- Chromatographie unterschieden werden, sie wird durch Calcium/Calmodulin nicht aktiviert, und sie ist unempfindlich gegenüber Rolipram, Vinpocetin und Indolidan.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt die Ermittlung, ob eine Verbindung eine Steigerung der Aktivität der cGMP-abhängigen Proteinkinase G ("PKG") verursacht und/oder eine Absenkung von β-Catenin in neoplastischen Zellen. Es stellte sich heraus, dass unerwartete Eigenschaften von SAANDs eine Erhöhung der PKG-Aktivität und eine Reduzierung von β-Catenin in neoplastischen, einem SAAND ausgesetzten Zellen umfassen. Wir glauben, dass die Erhöhung der PKG-Aktivität wenigstens zum Teil eine Folge der Steigerung des cGMP ist, welche wie oben beschrieben auf eine Hemmung geeigneter PDE5 durch SAANDs zurückzuführen ist. Andere Eigenschaften von SAANDs sind (1) Hemmung von PDE5, wie in dem obigen '694-Patent beschrieben, (2) Hemmung der neuartigen, cGMP-spezifischen PDE-Form, (3) Hemmung von PDE2, (4) die Tatsache, dass sie eine Steigerung des intrazellulären cGMPs in neoplastischen Zellen hervorrufen, und (5) die Tatsache, dass sie bei einigen Arten neoplastischer Zellen das cAMP-Niveau senken.
Somit besteht eine Form des neuartigen Verfahrens dieser Erfindung in der Ermittlung, ob die Verbindung eine Hebung der PKG-Aktivität in neoplastischen Zellen hervorruft, und ob die Verbindung PDE5 hemmt. Eine andere Form des neuartigen Duchsiebungsverfahrens der Erfindung besteht in der Ermittlung, ob eine Verbindung in neoplastischen Zellen eine Hebung der PKG-Aktivität hervorruft, und ob diese Verbindung die neuartige, oben beschriebene, cGMP-spezifische PDE und/oder PDE2 hemmt. Eine dritte Form wiederum umfaßt die Ermittlung, ob eine Verbindung in neoplastischen Zellen eine Hebung der PKG-Aktivität verursacht, und ob diese Verbindung in neoplastischen Zellen einen Anstieg des cGMP-Niveaus veranlaßt, und/oder eine Senkung des cAMP-Niveaus. Auf diese Art und Weise als erfolgreich eingestufte Verbindungen finden Anwendung als SAANDs.
Unter anderem bezieht sich die Erfindung auf neuartige in vitro- und in vivo- Verfahren zur Auswahl von Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur sicheren Behandlung und Vermeidung von Neoplasie, insbesondere von Krebsvorstufen- Schädigungen. Insbesondere enthält die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auswahl von Verbindungen, die zur Behandlung und Vermeidung von Neoplasie einschließlich Krebsvorstufen-Schädigungen verwendet werden können. Die solchermaßen identifizierten Verbindungen können minimale Nebeneffekte haben, die der COX-Hemmung und anderen unspezifischen Interaktionen zuzuschreiben sind, welche mit herkömmlichen Chemotherapeutika verknüpft sind. Die interessanten Verbindungen können getestet werden, indem die neuartige, oben beschriebene PDE diesen Verbindungen ausgesetzt wird, und wenn eine Verbindung diese neuartige PDE hemmt, so wird diese Verbindung anschließend weiter auf ihre anti-neoplastischen Eigenschaften untersucht (bspw. mit in vitro- oder in vivo-Tierversuchsmodellen oder mit Versuchen am Menschen).
Ein Gesichtspunkt der Erfindung umfaßt deshalb ein Aussiebungs- /Auswahlverfahren zur Identifikation einer bei der Behandlung von Neoplasie wirksamen Verbindung, das eine Ermittlung der Hemmungswirkung der Verbindung auf die neuartige PDE und/oder PDE2 und seiner Hemmung von COX umfaßt. Vorzugsweise umschließen die erfindungsgemäßen Aussiebungs- und Auswahlverfahren eine Bestimmung, ob die Verbindung das Wachstum von Tumorzellen in vitro oder in vivo hemmt.
Indem auf diese Art und Weise Verbindungen ausgewählt werden, können potentiell hilfreiche und verbesserte Verbindungen zur Behandlung von Neoplasie schneller und mit größerer Präzision identifiziert werden als dies in der Vergangenheit zu Zwecken der Entwicklung pharmazeutischer Zusammensetzungen für die therapeutische Behandlung von Neoplasie möglich war. Weitere Vorteile werden aus der folgenden, detaillierten Beschreibung ersichtlich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 enthält eine graphische Darstellung der cGMP-Wirkung der aus neoplastischen Zellen vom SW480-Typ gewonnenen cGMP- Phosphodiesterasen, wie sie aus dem Eluat einer DEAE-Trisacryl-M- Säule bestimmt worden ist.
Fig. 2 enthält eine graphische Darstellung der cGMP-Wirkung der aus neoplastischen Zellen vom SW480-Typ gewonnenen und umgefüllten cGMP-Phosphodiesterasen, wie sie aus dem Eluat einer DEAE- Trisacryl-M-Säule bestimmt worden ist.
Fig. 3 enthält eine graphische Darstellung des kinetischen Verhaltens der neuartigen PDE dieser Erfindung.
Fig. 4 illustriert die Wirkung der Sulfid-Derivate von Sulindac und der Sulfon- Derivate von Sulindac (bekannt als Exisulind) auf die Aktivität gereinigter Cyclooxygenase.
Fig. 5 illustriert die Wirkung von Testverbindungen B und E auf die COX- Hemmung.
Fig. 6 illustriert die hemmenden Wirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf PDE4 und PDE5, welche von kultivierten Tumorzellen ausgefiltert wurden.
Fig. 7 illustriert die Wirkungen von Sulindac-Sulfid auf das Niveau zyklischer Nukleotide in HT-29-Zellen.
Fig. 8 illustriert die Phosphodiesterase hemmende Wirkung der Verbindung B.
Fig. 9 illustriert die Phosphodiesterase hemmende Wirkung der Verbindung E.
Fig. 10 illustriert die Wirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf die Apoptose und Nekrose von HT-29-Zellen.
Fig. 11 illustriert die Wirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf die Hemmung des Wachstums von HT-29-Zellen und Apoptose-Auslösung, wie sie durch DNS-Fragmentierung festgestellt werden.
Fig. 12 illustriert die Apoptose auslösenden Eigenschaften der Verbindung E.
Fig. 13 illustriert die Apoptose auslösenden Eigenschaften der Verbindung B.
Fig. 14 illustriert die Wirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf das Wachstum von Tumorzellen.
Fig. 15 illustriert die wachstumshemmende und Apoptose auslösende Aktivität von Sulindac-Sulfid und einer Vergleichssubstanz (DMSO).
Fig. 16 illustriert die wachstumshemmende Aktivität der Verbindung E.
Fig. 17 illustriert die Hemmung von prämalignen, neoplastischen Schädigungen in einer Kultur eines Brustdrüsenorgans von Mäusen durch Sulindac-Metabolite.
Fig. 18A ist ein SDS-Protein-Gel der Lysate von SW480-Zellen aus mit Medikamenten behandelten Zell-Lysaten in Abwesenheit von zugefügtem cGMP, wobei die Zellen in der Kultur über 48 Stunden mit DMSO behandelt wurden (0,03%, Reihen 1 und 2), mit Exisulind (200; 400 und 600 uM; Reihen 3, 4, 5) und mit E4021 (0,1; 1 und 10 uM; Reihen 6, 7, 8).
Fig. 18B zeigt einen PKG-Test eines SDS-Gels (Röntgenfilmaufnahme) der Lysate von SW480-Zellen aus mit Medikamenten behandelten Zell- Lysaten in Gegenwart von zugefügtem cGMP, wobei die Zellen in der Kultur über 48 Stunden mit DMSO behandelt wurden (0,03%, Reihen 1 und 2), mit Exisulind (200; 400 und 600 uM; Reihen 3, 4, 5) und mit E4021 (0,1; 1 und 10 uM; Reihen 6, 7, 8).
Fig. 19 enthält ein Balkendiagramm der Ergebnisse eines Immunoblot- Nachweisexperiments der Wirkungen von Exisulind auf β-Catenin und PKG-Niveaus in neoplastischen Zellen gegenüber einer Vergleichssubstanz.
Fig. 20 enthält eine graphische Darstellung der Wirkungen der cGMPspezifischen Phosphodiesterasen, erhalten aus neoplastischen HTB- 26-Zellen, auf cGMP, nachgewiesen aus dem Eluat von einer DEAE- Trisacryl-M-Säule.
Fig. 21 enthält eine graphische Darstellung der Wirkungen der cGMPspezifischen Phosphodiesterasen, erhalten aus neoplastischen HTB- 26-Zellen, auf cGMP, nachgewiesen aus dem Eluat von einer DEAE- Trisacryl-M-Säule mit niedriger und hoher Substratkonzentration.
Fig. 22 enthält eine graphische Darstellung der Wirkungen der cGMPspezifischen Phosphodiesterasen, erhalten aus neoplastischen LnCAP- Zellen, auf cGMP, nachgewiesen aus dem Eluat von einer DEAE- Trisacryl-M-Säule.
Fig. 23 enthält eine graphische Darstellung der Wirkungen der cGMP- spezifischen Phosphodiesterasen, erhalten aus neoplastischen LnCAP- Zellen, auf cGMP, nachgewiesen aus dem Eluat von einer DEAE- Trisacryl-M-Säule mit niedriger und hoher Substratkonzentration.
Fig. 24 enthält ein Balkendiagramm zur Illustration der Bindungsspezifität der nicht katalytischen cGMP-Bindungsstellen von PDE5 für Analogstoffe der zyklischen Nukleotide und ausgewählte PDE5-Hemmstoffe.
Fig. 25 enthälteine graphische Darstellung der Wirkungen der cGMPspezifischen Phosphodiesterasen, erhalten aus neoplastischen SW480-Zellen, auf cGMP, nachgewiesen aus dem Eluat von einer DEAE-Trisacryl-M-Säule unter Verwendung von Ethylenglykol in der Pufferlösung.
Fig. 26 enthält eine graphische Darstellung der Wirkungen der cGMPspezifischen Phosphodiesterasen, erhalten aus neoplastischen, in Rollröhrchen gezüchteten SW480-Zellen, auf cGMP, nachgewiesen aus dem Eluat von einer DEAE-Trisacryl-M-Säule.
Fig. 27A zeigt einen zeitabhängigen Anstieg der Menge der an Histone gekoppelten, DNS-Fragmente in LNCaP-Zellkulturen nach einer Behandlung mit 50 uM einer Verbindung I.
Fig. 27B zeigt den Verlauf der Behandlung von PrEC-Prostatazellen mit der Verbindung I (50 uM), welche die DNS-Fragmentierung über bis zu 4 Behandlungstagen nicht beeinflußten.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

I. Die neuartige cGMP-spezifische Phosphodiesterase und PDE2 aus neoplastischen Zellen

A. Die Isolation der neuartigen PDE-Form

Die isolierte, cGMP-spezifische Phosphodiesterase (die eine neue Form der PDE2 zu sein scheint) wurde zunächst aus einer menschlichen Karzinom-Zell-Linie zubereitet, die üblicherweise als SW480 bezeichnet wird und von der Amerikanischen Gewebetyp-Sammlung in Rockville, Maryland, U. S. A. erhältlich ist. SW480 ist eine menschliche Dickdarm-Krebs-Zell-Linie, die ursprünglich von mäßig differenziertem Epithel-Adenokarzinom stammt. Wie im folgenden diskutiert wird, wurde eine gleichartige Form auch von einer Neoplasie der Brust (d. h., die HTB-26- Zell-Linie) und der Prostata (d. h., die LNCAP-Zell-Linie) isoliert.
Mit "isoliert" meinen wir (wie dies auch im Stand der Technik aufgefaßt wird) nicht nur isoliert von neoplastischen Zellen, sondern auch hergestellt durch rekombinante Verfahren (d. h., exprimiert von einer bakteriellen oder einer anderen, nicht menschlichen Wirts-Vektor-Zell-Linie). Jedoch glauben wir gegenwärtig, dass eine Isolation aus der menschlichen, neoplastischen Zell-Linie zu bevorzugen ist, da wir glauben, dass das so isolierte Ziel-Protein eine Struktur hat (d. h., eine Form oder Topographie), die einer der ursprünglichen Formen in den neoplastischen Zellen näher kommt, wenn es nicht sogar identisch ist. Diese Form hilft bei der Auswahl von anti-neoplastischen Verbindungen, welche das/die Ziel-Enzym(e) in vivo hemmen. Die neuartige PDE-Aktivität wurde zuerst bei SW480-Dickdarm-Krebs-Zell-Linien gefunden. Um die neuartige Phosphodiesterase von SW480 zu isolieren, wurden etwa vierhundert Millionen SW480-Zell-Linien gezüchtet, um zusammenzuwachsen, und sie wurden von Gewebekulturplatten mit einer Fläche von 150 cm² abgeschabt nach zwei Wäschen mit 10 ml kaltem PBS, und durch Zentrifugieren pelletiert. Die Zellen wurden abermals in einer Homogenisierungs-Pufferlösung dispergiert (20 ml TMPI-Äthylendiamintetraessigsäure-Triton pH 7,4 : 20 mM Tris-HOAc, 5 mM MgAc&sub2;, 0,1 mM EDTA, 0,8% Triton-100, 10 uM Benzamidin, 10 uM TLCK, 2000 U/ml Aprotinin, 2 uM Leupeptin, 2 uM Pepstatin A) und unter Verwendung eines Polytron- Gewebe-Homogenisators auf einem Eisbad homogenisiert (drei mal, 20 Sekunden/Puls). Das homogenisierte Material wurde für 60 Minuten in einer Beckman-L-Ultrazentrifuge bei 105.000 g sowie unter einer Temperatur von 4ºC zentrifugiert, und die obenaufschwimmende Substanz wurde mit TMPI- Äthylendiamintetraessigsäure (TMPI-EDTA) (60 ml) verdünnt und einer 10-Milliliter- DEAE-Trisacryl-M-Säule -zugeführt, die von einer TMPI- Äthylendiamintetraessigsäure-Pufferlösung im Gleichgewicht gehalten wurde. Die beladene Säule wurde mit 60 ml von TM-EDTA gewaschen, und die PDE-Menge wurde mit 120 ml eines linearen Gradienten von NaOAC (0-0,5 M) in TM- Äthylendiamintetraessigsäure herausgewaschen, bei einer Flußrate von 0,95 ml/Minute, 1,4 ml/Fraktion. 80 Fraktionen wurden gesammelt und unverzüglich (d. h., innerhalb von Minuten) hinsichtlich der cGMP-Hydrolyse untersucht. Fig. 1 zeigt das Elutionsprofil der Säule und offenbart zwei anfängliche Spitzen der cGMP-PDE- Aktivität; die Spitzen A und B, die durch 40-50 mM bzw. 70-80 mM NaOAC herausgewaschen wurden. Wie im folgenden erläutert wird, bezieht sich die Spitze A auf PDE5, während Spitze B eine neuartige cGMP-spezifische Phosphodiesterase- Aktivität darstellt.
Die PDE-Aktivitat auf zyklische Nukleotide wurde für jede Fraktion ermittelt unter Verwendung des modifizierten, zweistufigen Radioisotopen-Verfahrens von Thompson et al. (Thömpson W. J., et al., Adv. Cyclic Nucleotide Res. 10 : 69-92, 1979), wie im folgenden weiter ausgeführt wird. Die Reaktion fand statt in 400 ul, welche Tris-HCl (40 mM; pH 8,0) enthielt, ferner MgCl&sub2; (5 mM), 2-Mercaptoethanol (4 mM), Ochsenserum Albumin (30 ug), cGMP (0,25 uM - 5 uM) mit einem konstant tritierten Substrat (200.000 cpm). Die Inkubationszeit wurde so eingestellt, dass sich weniger als 15% Hydrolyse ergab. Die Mischung wurde bei 30ºC bebrütet und im folgenden für 45 Sekunden gekocht, um die Reaktion zu stoppen. Sodann wurde die Mischung gekühlt, Schlangengift (50 ug) wurde hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 30ºC für 10 Minuten bebrütet. MeOH (1 ml) wurde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen, und die Mischung wurde auf eine Anionen-Austausch-Säule (Dowex 1-X8, 0,25 ml Harz) übertragen. Das Eluat wurde mit einem zweiten ml von MeOH kombiniert, dem Harz hinzugegeben, und nach Zugabe von 6 ml Szintillationsflüssigkeit wurde die Tritium-Aktivität unter Verwendung eines Beckman LS 6500 für eine Minute gemessen.
Um die hydrolytisch auf cGMP wirkenden Spitzen A und B weiter zu fraktionieren, wurden die Fraktionen 15 bis 30 der ursprünglichen 80 abermals in die DEAE- Trisacral-M-Säule geladen und mit einem linearen Gradienten von NaOAC (0-0,5 M) in TM-EDTA eluiert. Wieder wurden die Fraktionen unverzüglich auf die cGMP- Hydrolyse hin untersucht (unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens mit 0,2; 2; 5 uM Substrat), wobei die Ergebnisse in Fig. 2 graphisch wiedergegeben sind. Eine Beobachtung zu der in Fig. 2 dargestellten Spitze B besteht darin, dass im Gegensatz zu der Spitze A eine Erhöhung der Substrafikonzentration von cGMP die Aktivität dramatisch steigerte. Während diese Beobachtung konsistent ist mit der Tatsache, dass es sich um eine PDE2 handelt, läßt die Tatsache, dass das in Fig. 2 gekennzeichnete Enzym cGMP-spezifisch ist (vgl. das folgende), vermuten, dass es sich gegenüber der klassischen, in der Literatur abgehandelten PDE2 um eine neuartige Form handelt. Die Spitze A zeigt eine offensichtliche Substratsättigung an den katalytischen Stellen mit einer hohen Affinität.

B. Die Isolation der klassischen PDE2 von SW480

Es wurden zwei Verfahren gefunden, welche eine Isolation der "Spitze B" von SW 480 erlaubten, so dass das Enzym die klassische PDE2-Aktivität hatte (d. h., es war nicht cGMP-spezifisch, aber durch cGMP stimuliert). Das erste Verfahren umfaßte die Züchtung von SW 480 in 850 cm² Corning-Rollröhrchen anstelle von 150 cm² Gewebekulturgläsern. SW 480 wurden in den Rollröhrchen bei 0,5 Umdrehungen pro Minute gezüchtet, wobei jedes Röhrchen 200 ml von RPMI 1640 enthielt, ferner 2 mM Glutamin und 25 mM HEPES. Die Zellen wurden nach dem folgenden Verfahren geerntet. PBS-Medium wurde für mindestens 15 Minuten auf 37ºC aufgewärmt. 200 ml eines vollständigen Mediums von 5% FBS/RPMI 1640 wurde zubereitet und 5 ml Glutamin wurden hinzugefügt. 5 ml eines Antibiotikums/Antimykotikums wurden ebenfalls hinzugefügt.
70 ml der PBS-Lösung wurden zu 10 ml von 4X-Pankreatin hinzugefügt. Die Mischung wurde auf Zimmertemperatur gehalten. Das Medium wurde entfernt und die Gläser wurden mit 4 ml von PBS ausgespült, wobei sichergestellt wurde, dass der Glasboden bedeckt war. Die gesamte Lösung wurde mit einer Pipette entfernt. 4 ml des verdünnten Pankreatins wurden dem Glas hinzugefügt, und das Glas wurde bewegt, damit der Boden bedeckt war. Das Glas wurde bei 37ºC für 8 bis 10 Minuten bebrütet. Nach dieser Inkubation wurde das Glas rasch unter einem invertierenden Mikroskop untersucht, um sicherzustellen, dass alle Zellen rund waren. Das Glas wurde sorgfältig mehrmals an seiner Seite angestoßen, um das Ablösen der Zellen zu unterstützen. 10 ml des kalten, vollständigen Mediums wurden dem Glas hinzugefügt, um die Pankreatin-Proteolyse zu stoppen. Die Lösung wurde oberhalb des Bodens gerührt, um die Zellen zu sammeln. Das Medium wurde unter Verwendung einer 25 ml-Pipette entfernt, und die Zellen wurden in 50 ml- Zentrifugenröhrchen auf Eis gegeben. Die Röhrchen wurden mit 1.000 Umdrehungen pro Minute bei 4ºC für 5 Minuten in einer Klinik-Zentrifuge geschleudert, um die Zellen zu pelletieren. Das Obenaufschwimmende wurde weggegossen und jedes Pellet wurde mit flüssigem Stickstoff für 15 Sekunden gefroren. Die solchermaßen geernteten Zellen können in einem Gefriergerät bei -70 ºC aufbewahrt werden.
Die von den SW 480-Zellen geernteten Phosphodiesterasen wurden unter Verwendung eines FPLC-Verfahrens isoliert. Ein Pharmazie-AKTA-FPLC wurde verwendet, um das Einfüllen und Eluieren der Probe in einer 18 ml-DEAE-Trisacryl- M-Säule zu kontrollieren. Ungefähr 600 Millionen Zellen von 5 W 480 wurden für die Profile verwendet. Nach dem abermaligen Suspendieren der Zellen in der Homogenisations-Pufferlösung (20 ml TMPI-EDTA-Triton pH-Wert 7,4; "= Mm Tris- HOAc; 5 mM MgAc&sub2;; 0,1 mM EDTA; 0,8% Triton-100; 10 uM Benzamidin; 10 uM TLCK; 2000 U/ml Aprotinin; 2 uM Leupeptin; 2 uM Pepstatin A) wurden die Proben manuell homogenisiert. Die FPLC-Pufferlösung A umfaßte 8 mM TRIS-Azetat; 5 mM Mg-Azetat; 0,1 mM EDTA; pH-Wert 7,5; und die Pufferlösung B umfaßte 8 mM TRIS- Azetat; 5 mM Mg-Azetat; 0,1 mM EDTA; 1 M Na-Azetat; pH-Wert 7,5. Die obenaufschwimmenden Substanzen wurden mit 1 ml pro Minute in die Säule geladen, gefolgt von einer Wäsche mit 60 ml der Pufferlösung A mit 1 ml pro Minute. Ein Gradient wurde eingestellt von 0-15% Pufferlösung B in 60 ml; 15-50% Pufferlösung B in 60 ml; sowie 50-100% Pufferlösung B in 16 ml. Während dieses Gradienten wurden Fraktionen in einer Menge von 1,5 ml gesammelt.
Das erhaltene Profil (Fig. 26) war ähnlich dem oben erhaltenen Profil für die neuartige PDE-Aktivität (vgl. bspw. Fig. 1); mit der Ausnahme, dass die auf diesem Weg isolierte Spitze B eine cAMP hydrolysierende Aktivität bei 0,25 uM Substrat zeigte, die durch 5 uM cGMP auf das 2- bis 3-fache aktiviert werden konnte.
Ein zweites Verfahren zur Isolation klassischer Phosphodiesterase 2 aus SW480 wurde durchgeführt unter Verwendung eines Nicht-FPLC-DEAE- Säulenchromatographie-Verfahrens wie oben beschrieben (vgl. Abschnitt IA) mit der Modifikation, dass die Pufferlösungen 30% Ethylenglykol sowie 10 mM TLCK und 3,6 mM β-Mercaptoethanol. Das Hinzufügen dieser Reagentien zu den Pufferlösungen verursacht eine Verschiebung in dem Elutionsprofil (vgl. Fig. 25) von niedrigem zu hohem Natriumazetatgehalt, so dass die Spitze A von 40 zu 150 mM wandert, Spitze B von 75 nach 280 mM, und Spitze C von 200 zu 500 mM Na-Azetat (vgl. Fig. 25). Spitze B in Fig. 25 wurde mit 2 uM cAMP nachgewiesen und zeigte eine zweifache Aktivierung durch 5 uM cGMP (vgl. Figur -Y). Bei dieser Spitze B hemmte der selektive PDE2-Inhibitor EHNA 2 uM cGMP-PDE-Aktivität mit einem 1050-Wert von 1,6 uM, sowie 2,0 uM cAMP-PDE-Aktivität mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 3,8 uM (und einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 2,5 uM bei Zufügen von 10 uM Rolipram).

C. Die cGMP-Spezifität der Phosphodiesterase aus Spitze A und die neuartige Aktivität der Spitze B

Jede Fraktion der DEAE-Säule aus Abschnitt IA wurde ebenfalls untersucht hinsichtlich der cGMP hydrolysierenden Aktivität (0,25 uM cGMP) in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus;, oder von Ca&spplus;&spplus;-CaM und/oder EGTA, sowie hinsichtlich der cAMP hydrolysierenden Aktivität (0,25 uM cAMP) in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 uM cGMP. Weder die PDE-Spitze A noch Spitze B (Fraktionen 5-22, vgl. Fig. 1) hydrolysierten cAMP in nennenswertem Umfang, wodurch nachgewiesen wurde, dass keine die Wirkung einer klassischen, cAMP hydrolysierenden PDE-Familie (d. h. PDE 1, 2, 3) hatte.
Ca&spplus;&spplus; (mit oder ohne Calmodulin) gelang es nicht, eine hydrolysierende Wirkung der Spitzen A oder B auf cAMP oder cGMP zu aktivieren, und cGMP gelang es nicht, die cAMP-Hydrolyse zu aktivieren oder zu hemmen. Solche Ergebnisse zeigen, dass die Spitzen A und B cGMP-spezifische PDE-Aktivitäten aufweisen, aber nicht die Aktivitäten der klassischen oder bereits bekannten Phosphodiesterasen PDE1, PDE2, PDE3 oder PDE4.
Für die neuartige PDE-Spitze B aktivierte zyklisches GMP die cGMP hydrolysierende Wirkung des Enzyms, aber es aktivierte keinerlei cAMP hydrolysierende Wirkung (im Gegensatz zu der Spitze B aus dem obigen Abschnitt IB). Dies verrät, dass die neuartige PDE-Spitze B - die neuartige, erfindungsgemäße Phosphodiesterase - nicht eine durch cGMP stimulierte cAMP-Hydrolyse ("cGS") darstellt oder unter die klassischen oder bereits bekannten Wirkungen der PDE2-Aktivitäten einzuordnen ist, da die bekannten Isoformen von PDE2 sowohl cGMP als auch cAMP hydrolysieren.

D. Spitze A ist eine klassische PDE5, aber die neuartige Spitze B - eine neue, cGMP-spezifische PDE - nicht

Um eine PDE-Isoform zu kennzeichnen, sollten das kinetische Verhalten und die Substratvorlieben abgeschätzt werden.
Die Spitze A zeigte typische "PDE5"-Eigenschaften. Beispielsweise lag der Km-Wert des Enzyms für cGMP bei 1,07 uM, und Vmax war 0,16 nmol/min/mg. Wie weiter unten diskutiert werden wird, hemmten darüber hinaus Zaprinast (IC&sub5;&sub0; 1,37 uM) und E4021 (IC&sub5;&sub0; = 3 nM) und Sildenafil die Aktivität der Spitze A. Ferner zeigte Zaprinast eine Hemmungswirkung auf die cGMP hydrolysierende Wirkung von Spitze A, was in Übereinstimmung mit den in der Literatur berichteten Ergebnissen ist.
Die PDE-Spitze B aus Abschnitt IA zeigte erheblich abweichende kinetische Eigenschaften im Vergleich zu der PDE-Spitze A. Beispielsweise zeigt die Hydrolyse von zyklischem GMP in "Eadie-Hofstee"-Grafik-Ausdrucken der Spitze A eine einzelne Linie mit einer negativen Steigung bei ansteigenden Substratkonzentrationen, was auf ein kinetischewVerhalten von der "Michaelis- Menten"-Art hindeutet. Spitze B zeigt jedoch bei der cGMP-Hydrolyse in Abwesenheit von cAMP in "Eadie-Hofstee"-Grafik-Ausdrucken die neuartige Eigenschaft einer zunächst abfallenden (offensichtlich ist Km = 8,4) und dann ansteigenden Steigung (Km < 1) bei ansteigendem cGMP-Substrat (vgl. Fig. 3). Damit bestätigt dies die submikromolare Affinität der Spitze B für cGMP (d. h., wo Km < 1).
Übereinstimmend mit den kinetischen Studien (insbesondere Fig. 3) und dem positiv-zusammenwirkenden kinetischen Verhalten in der Gegenwart von cGMP-Substrat war die gesteigerte cGMP hydrolysierende Wirkung in Gegenwart erhöhter Konzentrationen des cGMP-Substrats. Dies wurde entdeckt durch Vergleichen von 0,25 uM-, 2 uM- und 5 uM-Konzentrationen von cGMP in Gegenwart der PDE-Spitze B nach einer zweiten DEAE- Trennung, um die cAMP-Hydrolyse auszuschließen, und um auszuschließen, dass dieses neue Enzym eine bereits identifizierte PDE5 ist. Wie in Fig. 2 dargestellt, riefen höhere cGMP-Konzentrationen eine überproportional größere cGMP-Hydrolyse bei der PDE-Spitze B hervor.
Diese Beobachtungen legen nahe, dass die cGMP-Anlagerung an dem Enzym der Spitze B eine entsprechende Änderung in diesem Enzym hervorruft. Dies bestätigt den Vorteil der Verwendung des in neoplastischen Zellen natürlich vorkommenden Enzyms, aber diese Erfindung ist nicht auf die natürliche Form des Enzyms begrenzt, welches die oben dargelegten Eigenschaften hat.

E. Unempfindlichkeit der PDE-Spitze B gegenüber Zaprinast und Sildenafil im Verhältnis zu der Spitze A, und deren Wirkungen auf andere PDE-Inhibitoren

Unterschiedliche PDE-Inhibitoren wurden studiert unter Verwendung von zwölf Wirkstoffkonzentrationen von 0,01 bis 100 uM und einer Substratkonzentration von 0,25 uM ³H-cGMP. IC&sub5;&sub0;-Werte wurden berechnet anhand von passenden, S- förmigen Kurven mit variabler Steigung unter Verwendung eines Prism 2.01 (Grafik- Tablett). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Während die Verbindungen E4021 und Zaprinast die Spitze A hemmten, sind (bei hohen Affinitäten) die berechneten IC&sub5;&sub0;-Werte gegenüber der neuartigen PDE-Aktivität in der Spitze B (Abschnitt IA) erheblich gesteigert (> 50-fach). Dies bestätigt, dass es sich bei Spitze A um PDE5 handelt. Diese Daten illustrieren ferner, dass die neuartige PDE-Aktivität dieser Erfindung für alle praktischen Anwendungsfälle unempfindlich ist gegenüber Zaprinast sowie unempfindlich gegenüber E4021. Tabelle 1 Vergleich von PDE-Inhibitoren gegenüber der Spitze A und gegenüber der Spitze B gemäß Abschnitt IA (cGMP-Hydrolyse)
Im Vergleich hemmten Sulindac-Sulfid und die Verbindung E die beiden Phosphodiesterase-Spitzen A und B im Wettbewerb mit der selben Stärke (IC&sub5;&sub0; = 0,38 uM für PDE-Spitze A; IC&sub5;&sub0; = 0,37 uM für PDE-Spitze 8).
Es liegt eine Bedeutung für die Behandlung von Neoplasie und für die Auswahl einer tauglichen Verbindung für eine solche Behandlung in der Tatsache, dass die Spitze B (jede ihrer Formen) unempfindlich gegenüber Zaprinast ist, während beide Spitzen A und B empfindlich gegenüber Sulindac-Sulfid und gegenüber der Verbindung E sind. Wir haben Zaprinast, E4021 und Sildenafil getestet, um zu ermitteln, ob sie Apoptose auslösen oder das Wachstum neoplastischer Zellen hemmen, und haben dasselbe mit der Verbindung E angestellt. Wie im folgenden erläutert wird, zeigt Zaprinast für sich genommen keine nennenswerte Apoptose auslösende oder wachstumshemmende Eigenschaften, während Sulindac-Sulfid und die Verbindung E sich genau entgegengesetzt verhalten. Mit anderen Worten, die Fähigkeit einer Verbindung zur Hemmung beider PDE-Spitzen A und B ist korreliert mit ihrer Fähigkeit zur Auslösung von Apoptose in neoplastischen Zellen, während eine Verbindung (bspw. Zaprinast) mit einer ausschließlichen Spezifität für die PDE- Spitze A für sich genommen keine Apoptose auslösen wird.

F. Unempfindlichkeit der neuartigen PDE-Spitze B gegenüber einer Inkubation mit einer cGMP-abhängigen Proteinkinase G

Weitere Unterschiede zwischen der PDE-Spitze A und der neuartigen Spitze B (Abschnitt IA) wurden hinsichtlich ihrer cGMP hydrolysierenden Aktivitäten in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen der cGMP-abhängigen Proteinkinase G beobachtet (welche typische PDE5 phosphoryliert). Insbesondere wurden Fraktionen der Spitze A und der Spitze B gemäß Abschnitt IA mit verschiedenen Konzentrationen der Proteinkinase G bei 30ºC über 30 Minuten hinweg bebrütet. Nachdem eine Phosphorylierung versucht worden war, wurde die zyklisches GMP hydrolysierende Wirkung beider Spitzen untersucht. In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Informationen über PDE5 zeigte die Spitze A eine gesteigerte cGMP hydrolysierende Wirkung als Reaktion auf die Inkubation mit der Proteinkinase G und zeigte damit an, dass die Spitze A phosphoryliert worden war. Spitze B blieb jedoch unverändert (d. h., sie wurde nicht phosphoryliert und war unempfindlich gegenüber einer Inkubation mit cGMPabhängiger Proteinkinase G). Mit diesen Daten verträglich ist, dass Spitze A eine Isoform der bekannten PDE5-Familie ist, und dass Spitze B aus Abschnitt IA eine neuartige cGMP-spezifische PDE-Aktivität darstellt:

G. Die neuartige Spitze B bei Prostata- und Brustkrebs-Zell-Linien

Die neuartige Spitze B wurde aIso von zwei anderen neoplastischen Zell-Linien isoliert, einer Bruskrebs-Zell-Linie, HTB-26, und einer Prostatakrebs-Zelf-Linie, LnCAP, durch ein Verfahren ähnlich dem oben für die Isolation dieser Substanz aus SW480 verwendeten. Das Protokoll wurde in mehrfacher Hinsicht modifiziert. Für eine bessere Reproduzierbarkeit zum Zweck eines Vergleichs zwischen verschiedenen Zell-Linien wurde ein Pharmazie-AKTA-FPLC verwendet, um die Beschickung einer 18 ml-DEAE-TrisAcryl-M-Säule mit Proben sowie die Elution zu steuern. SW480 wurde anhand dieses selben Verfahrens mehrere Male durchgemessen, um eine Referenz für die Spitze B zu schaffen. 200-400 Millionen Zellen von SW480 wurden für diese Profile verwendet. 70 Millionen Zellen von LnCAP wurden für ein Profil verwendet (vgl. Fig. 22 und 23), und in einem eigenen Experiment wurden 32 Millionen Zellen von HTB-26 für ein Profil verwendet (vgl. Fig. 20 und 21). Nach abermaligem Suspendieren von Zellen in einer Homogenisations-Pufferlösung wurden die Proben manuell homogenisiert. Die FPLC-Pufferlösung A war 8 mM TRIS-Azetat, 5 mM Mg-Azetat, 0,1 mM EDTA, mit einem pH-Wert von 7,5; und die Pufferlösung B war 8 mM TRIS-Azetat, 5 mM Mg- Azetat, 0,1 mM EDTA, 1 M Na-Azetat, mit einem pH-Wert von 7,5. Die obenaufschwimmenden Substanzen wurden mit /ml pro Minute auf die Säule geladen, gefolgt von einer Wäsche mit 60 mi Pufferlösung A mit 1 ml pro Minute. Ein Gradient wurde eingestellt von 0-15% Pufferlösung B in 60 ml; 15-50% Pufferlösung B in 60 ml; sowie 50-100% Pufferlösung B in 16 ml. Während dieses Gradienten wurden Fraktionen in einer Menge von 1,5 ml gesammelt. Die Spitzen der cGMP-PDE-Aktivität wurden im Bereich der Fraktion 65 herausgewaschen, d. h., bei 400 mM Na-Azetat (vgl. Fig. 20-23). Diese Aktivität wurde gemessen bei 0,25 uM cGMP (was auf eine submikromolare Affinität für cGMP hindeutet). Rölipram, eine PDE4-spezifische Substanz, hemmte den größten Anteil der cAMP- PDE-Aktivität (d. h., die cAMP-Aktivität war eine Folge der PDE4), was darauf hindeutet, dass die cGMP-Aktivität der Spitze B spezifisch für cGMP war gegenüber cAMP. Alle drei B-Spitzen (von SW480, HTB-26 und LnCAP) zeigten keine Stimulation durch Calcium/Calmodulin und waren resistent gegenüber 100 nM E4021, einem spezifischen PDE5-Inhibitor wie Zaprinast (vgl. Fig. 20 und 22). Die B-Spitzen zeigten demnach einen dramatischen Anstieg in der Aktivität, wenn das Substrat von 0,25 uM bis zu 5 uM cGMP konzentriert wurde (was eine positive, zusammenwirkende Kinetik nahelegt) (vgl. Fig. 21 und 23). Auch zeigten alle drei Spitzen eine ähnliche Hemmung durch Exisulind und die folgende Verbindung I.

II. Beteiligung von Proteinkinase G und von β-Catenin - Allgemeines

Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um zu ermitteln, welche Auswirkung, wenn überhaupt, ein antineoplastischer, cGMP-spezifischer PDE- Inhibitor wie bspw. Exisulind auf die cGMP-abhängige Protein-Kinase G ("PKG") in neoplastischen Zellen hat, welche entweder den Adenomatose-Polyposis-Coli-Gen- Defekt ("APC-Gen") oder einen Defekt in dem Gen-Code für β-Catenin haben. Wie im folgenden erläutert, verursacht ein derartiger Inhibitor bei solchen neoplastischen Zellen eine Steigerung der PKG-Aktivität. Eine derartige Aktivitätssteigerung war nicht nur eine Folge einer erhöhten Aktivierung der PKG in Zellen mit einem von diesen Defekten, sondern auch eine Folge der gesteigerten Expression von PKG in Zellen mit dem APC-Defekt. Wenn PKG aus neoplastischen Zellen mit einem dieser Defekte durch Immunkomplexe ausgefällt wird, so wird sie mit β-Catenin ausgefällt.
β-Catenin wurde mit einer Vielzahl verschiedener Krebsarten in Verbindung gebracht, weil Forscher erhöhte Spiegel davon bei Patienten mit Neoplasie- Erkrankungen gefunden haben, welche Mutationen in dem APC-Tumor-Hemmungs- Gen enthielten. Menschen mit angeborenen Mutationen in diesem Gen entwickeln Tausende von kleinen Tumoren in der Auskleidung ihres Dickdarms. Wenn es richtig funktioniert, kodiert das APC-Gen ein normales APC-Protein, von dem man annimmt, dass es β-Catenin bindet und reguliert. Die Entdeckung, dass PKG in neoplastischen Zellen, welche entweder den APC-Gen-Defekt oder den β-Catenin- Defekt aufweisen, an β-Catenin gebunden ist, bringen PKG tatsächlich in starkem Maße in Verbindung mit einer der wichtigsten Zell-Entwicklungen, die zu Krebs führen. Aufgrund der Beziehung zwischen der cGMP-spezifischen Hemmung und dem PKG-Anstieg anläßlich einer Behandlung mit SAANDs wird cGMP außerdem mit den PKG-/β-Catenin-/APC-Defekten in diesen Zellen verknüpft.
Diese letztere Verknüpfung wird ferner gestützt durch die Beobachtung, dass β- Catenin selbst reduziert wird, wenn neoplastische Zellen mit einem APC-Defekt oder mit einem β-Catenin-Defekt einem SAAND ausgesetzt werden. Diese Reduzierung des β-Catenins wird durch die PKG selbst ausgelöst. PKG pfosphoryliert β-Catenin- was eine weitere, neuartige und mit dieser Erfindung verknüpfte Beobachtung darstellt. Die Phosphorylierung von β-Catenin erlaubt es β-Catenin, durch das Ubiquitin-Proteasomal-System abgebaut zu werden.
Diese Phosphorylierung des β-Catenins durch PKG ist für neoplastische Zellen wichtig, da sie die Wirkung der APC- und β-Catenin-Mutationen umgeht. Das mutierte APC-Protein beeinflußt die Anlagerung der β-Catenin-Verbindung an das Mutations-APC-Protein, und von einer derartigen Veränderung in der Bindung hat man bislang angenommen, dass sie die Phosphorylierung des β-Catenins durch die GSK-3b-Kinase verhindert. In dem Fall des mutierten β-Catenins erlaubt es ein Anstieg der PKG-Aktivität auch dem mutierten β-Catenin, phosphoryliert zu werden. Durch Anheben der PKG-Aktivität bei einer Neoplasie mit cGMP-PDE-Hemmung wird die Phosphorylierung des β-Catenins in neoplastischen Zellen mit einem derartigen Mutationstyp ermöglicht (was zu dessen Abbau führt).
Kurz gesagt, diese Erkenntnisse führen nicht nur zu neuen, pharmazeutischen Aussiebungsverfahren, um weitere Kandidaten für SAAND-Verbindungen zu identifizieren, sondern stützen auch die Rolle der cGMP-spezifischen PDE- Hemmung bei einem therapeutischen Zugang zu Neoplasie. Diese Beobachtung kann auch den unerwartet breiten Bereich von durch SAANDs hemmbaren Neoplasie-Formen erklären, da sowohl Neoplasie-Formen mit als auch solche ohne den APC-Defekt behandelt werden können, wie oben erläutert wurde.

III. Durchsieben pharmazeutischer Zusammensetzungen unter Verwendung von Phosphodiesterasen

A. Allgemeines

Die neuartige, erfindungsgemäße PDE als auch PDE2 sind zusammen mit oder ohne PDE5 nützlich zur Identifizierung von Verbindungen, welche zur Behandlung oder Vermeidung von Neoplasien verwendet werden können, und welche sich nicht durch ernstzunehmende Nebeneffekte auszeichnen.
Krebs und Krebsvorstufen können als Krankheiten aufgefaßt werden, die ein ungeregeltes Zeliwachstum mit sich bringen. Das Zeliwachstum umfaßt eine Anzahl verschiedener Faktoren. Ein Faktor ist, wie schnell die Gewebswucherung der Zellen ist, und ein anderer Faktor hängt damit zusammen, wie schnell die Zellen sterben. Zellen können sowohl entweder durch Nekrose sterben oder durch Apoptose, abhängig von der Art der Umgebungsreize. Die Zell-Differenzierung ist ein noch anderer Faktor, der die Tumor-Wachstums-Kinetik beeinflußt. Eine Erklärung, welche der vielen Aspekte des Zellwachstums durch eine Verbindung beeinflußt werden, ist wichtig für die Entdeckung eines wichtigen Ziels der pharmazeutischen Therapie. Aussiebungstests auf der Basis dieser Technologie können mit anderen Tests kombiniert werden, um Verbindungen auszuwählen, welche wachstumshemmende und pro-apoptotische Aktivitäten haben.
Die Erfindung ist das Produkt mehrerer wichtiger Entdeckungen. Zunächst entdeckten die jetzigen Erfinder, dass erwünschte Inhibitoren des Tumorzellwachstums den vorzeitigen Tod von Krebszellen durch Apoptose auslösen (vgl. Piazza, G. A., et al., Cancer Research, 55 (14), 3110-16, 1995).Als zweites entdeckten mehrere der jetzigen Erfinder unerwartetermaßen, dass Verbindungen, welche ohne nennenswerte COX-Hemmung selektiv Apoptose auslösen, auch PDE5 hemmen. Insbesondere und im Gegensatz zu führenden wissenschaftlichen Studien hemmen für die Behandlung neoplastischer Schädigungen wünschenswerte Verbindungen PDE5 (EC 3.1.4.17). PDE5 ist eine von mindestens zehn Gen- Familien von Phosphodiesterasen. PDE5 und die neuartige PDE nach dieser Erfindung sind dahingehend einzigartig, dass sie zyklische GMP selektiv abbauen, nicht dagegen cAMP, während die anderen PDE-Familien entweder cAMP selektiv abbauen/hydrolysieren und nicht cGMP, oder wahllos sowohl cGMP als auch cAMP abbauen. Vorzugsweise hemmen für die Behandlung von Neoplasie erwünschte Verbindungen nicht wahllos wirkende oder cAMP abbauende Phosphodiesterasetypen.

B. COX-Durchsiebung

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Ermittlung der Zyklooxygenase hemmenden Aktivität einer gegebenen Verbindung, und die Bestimmung der cGMP-spezifischen PDE-Hemmungsaktivität der Verbindung. Die Testverbindungen werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Behandlung neoplastischer Schädigungen eingeschätzt, entweder direkt oder aber indirekt durch Vergleich ihrer Aktivitäten mit bekannten, für die Behandlung neoplastischer Schädigungen geeigneten Verbindungen. Eine dafür bekannte Standardverbindung, zur Behandlung neoplastischer Schädigungen wirksam zu sein, ohne Irritationen des Magens zu verursachen, ist 5-Fluor-2-Methyl-1-(p- Methylsulfonylbenzoliden)-3- Indenylessigsäure ("Exisulind"). Andere, für vergleichbare Zwecke geeignete Verbindungen sind diejenigen, die für die Hemmung von COX bekannt sind, wie bspw. Indomethacin und der Sulfid-Metabolit von Sulindac: 5-Fluor-2-Methyl-1-(p- Methylsulfinylbenzoliden)-3-Indenylessigsäure ("Sulindac-Sulfid"). Andere, für vergleichbare Zwecke geeignete Verbindungen umfassen solche, welche für die Hemmung cGMP-spezifischer Phosphodiesterasen bekannt sind, wie bspw. 1-(3- Chloranilin)-4-Phenyphthalazin ("MY5445").
In dem hier verwendeten Sinn umfaßt der Begriff "Krebsvorstufen-Schädigung" die sich in abnormalen neoplastischen, einschließlich dysplastischen, Gewebeveränderungen äußernden Syndrome. Beispiele umfassen das dysplastische Wachstum in Dickdarm-, Brust-, Prostata- oder Lungengewebe, oder solche Zustände wie das dysplastische Nävus-Syndrom, ein Vorzeichen für ein bösartiges Melanom der Haut. Beispiele umfassen auch, neben den dysplastischen Nävus-Syndromen, das Polyposis-Syndrom, Dickdarm-Polypen, Krebsvorstufenschädigungen des Halses (bspw. Zervikal-Dysplasie), der Speiseröhre oder Lunge, Prostata-Dysplasie, Prostata-Intraneoplasie, der Brust und/oder Haut sowie damit zusammenhängende Zustände (bspw. Keratitis actinica), unabhängig davon, ob die Schäden klinisch identifizierbar sind oder nicht.
In dem hier verwendeten Sinn umfassen die Begriffe "Karzinom" oder "Krebs" Schädigungen, die krebsartig sind. Beispiele umfassen maligne Melanome, Bustkrebs, Prostatakrebs und Darmkrebs. In dem hier verwendeten Sinn umfassen die Begriffe "Neoplasie" und "Neoplasmen" sowohl krebsartige als auch Krebsvorstufen-Schädigungen.
In dem hier verwendeten Sinn bedeutet die Abkürzung PG Prostaglandin; PS bedeutet Prostaglandin-Synthetase; PGE&sub2; bedeutet Prostaglandin E&sub2;; PDE bedeutet Phosphodiesterase; COX bedeutet Zyklooxygenase; zyklisches Nukleotid; RIA bedeutet Radio-Immunoassay.
Die COX-Hemmung durch eine Verbindung kann anhand eines von zwei Verfahren bestimmt werden. Ein Verfahren umfaßt die Messung der PGE&sub2; Absonderung durch intakte HL-60-Zellen, nachdem diese der zu beurteilenden Verbindung ausgesetzt wurden. Das andere Verfahren umfaßt die Messung der Aktivität gereinigter Zyklooxygenasen (COXs) in Gegenwart der Verbindung. Beide Verfahren umfassen in der Literatur bereits beschriebene Protokolle, aber bevorzugte Protokolle werden im folgenden dargelegt.
Durch Messung von PGE&sub2; können Verbindungen bewertet werden, um festzustellen, ob sie die Produktion von Prostaglandin E&sub2; ("PGE&sub2;") hemmen. Unter Verwendung einer Enzym-Immunoassay(EIA)-Ausrüstung für PGE&sub2;, wie sie bspw. bei Amersham, Arlington Heights, Illinois, U. S. A., erhältlich ist. Geeignete Zellen umfassen jene, welche einen Überfluß von PG haben, wie bspw. HL-60-Zellen. HL-60-Zellen sind menschliche Promyelozyten, weiche mit DMSO in reife Granulozyten differenziert wurden (vgl. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E. und Gallo, R. C., "Normal Functional Characteristics of Cultured Human Promyelocytic Leukemia Cells (HL-60) After Induction of Differentiation By Dimethylsulfoxide", J. Exp. Med., 149 : 969-974, 1979). Diese differenzierten Zellen produzieren PGE&sub2; nach Stimulation mit einem Calcium-Ionen-Träger, A23187 (vgl. Kargman, S., Prasit, P. und Evans, J. F., ' "Translocation of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase", J. Biol. Chem., 266 : 23745-23752, 1991). HL-60-Zellen sind erhältlich von der Amerikanischen Gewebetyp-Sammlung (ATCC: CCL240). Sie können gezüchtet werden in einem RPMI-1640-Medium, das ergänzt wird durch 20% hitze-deaktiviertes, fötales Rinderserum, 50 U/ml Penizillin und 50 ug/ml Streptomycin in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; bei 37ºC. Um eine Myeloid-Differenzierung auszulösen, werden Zellen über 9 Tage hinweg 1,3%-igem Dimethylsulfoxid ausgesetzt und sodann gewaschen und abermals in Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung bei einer Konzentration von 3 · 10&sup6; Zellen/ml suspendiert.
Die differenzierten HL-60-Zellen (3 · 10&sup6; Zellen/ml) werden in Gegenwart der zu testenden Verbindungen in der gewünschten Konzentration für 15 Minuten bei 37ºC bebrütet. Sodann werden die Zellen für 15 Minuten durch A23187 (5 · 10&sup6; M) stimuliert. Wie oben beschrieben wird das in das externe Medium abgesonderte PGE&sub2; gemessen.
Wie oben angedeutet, liegt ein zweites Verfahren zum Abschätzen der COX- Hemmung einer Verbindung in der Messung der COX-Aktivität in Gegenwart einer Testverbindung. Von zwei verschiedenen Formen der Zyklooxygenase (COX-I und COX-2) wird in der Literatur berichtet, dass sie die Prostaglandin-Synthese regulieren. COX-2 stellt die induzierbare COX-Form dar, während COX-I eine grundlegende Form repräsentiert. Die COX-I-Aktivität kann unter Verwendung des durch Mitchell et al. beschriebenen Verfahrens ("Selectivity of Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs a5 Inhibitors of Constitutive and Inducible Cyclooxygenase", Proc. Natl. Acad. Set USA., 90 : 11693-11697, 1993, welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen wird) gemessen werden anhand der gereinigten COX-l von Schafbock-Spermabläschen, wie dies von Boopathy & Balasubramanian beschrieben wird, "Purification And Characterization Of Sheep Platelet Cyclooxygenase" (Biochem. J., 239 : 371-377, 1988). Die COX-2-Aktivität kann gemessen werden anhand der gereinigten COX-2 von Schaf-Plazenta, wie dies von Mitchell et al., 1993, oben, beschrieben wird
Die Zyklooxygenase hemmende Aktivität eines Präparats kann anhand aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise beschrieben Boopathy & Balasubramanian, 1988, oben, ein Verfahren, bei dem Prostaglandin-H-Synthase 1 (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan) für 20 Minuten bei 37ºC bebrütet wird mit 100 uM Arachidonsäure (Sigma Chemical Co.), Kofaktoren (wie bspw. 1,0 mM Glutathion, 1,0 mM Hydrochinon, 0,625 uM Hämoglobin und 1,25 CaCl&sub2; in 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4) und mit der zu testenden Substanz. Im Anschluß an die Inkubation kann die Reaktion mit Trichloressigsäure gestoppt werden. Nach Stoppen der Reaktion durch Hinzugabe von Thiobarbitursäure und Malonaldehyd kann sodann die enzymatische Aktivität spektrometrisch bei 530 nm gemessen werden.
Offensichtlich kann eine Verbindung, die eine niedrigere COX-1- oder COX-2- Hemmungsaktivität zeigt im Verhältnis zu ihren größeren kombinierten Hemmungsaktivitäten gegenüber PDE5/neuartiger PDE/PDE2, eine wünschenswerte Verbindung sein.
Der Umfang der COX-Hemmung wird ermittelt durch Vergleich der Aktivität der Zyklooxygenase in Gegenwart und Absenz der Testverbindung. Eine restliche (bspw. weniger als 25%) oder gar keine COX-Hemmungsaktivität bei einer Konzentration von ungefähr 100 uM zeigt an, dass die Verbindung im Hinblick auf ihre Eignung für die Behandlung von Neoplasie weiter untersucht werden sollte.

C. Bestimmung der Phosphodiesterase hemmenden Aktivität

Verbindungen können hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die Aktivität der neuartigen, erfindungsgemäßen Phosphodiesterase durchgesiebt werden unter Verwendung des wie oben beschrieben isolierten Enzyms, einer rekombinanten Version, oder unter Verwendung der neuartigen PDE und/oder PDE2 zusammen mit PDE5. Alternativ dazu werden zyklische Nukleotide in ganzen Zellen mittels RIA gemessen und mit unbehandelten Zellen sowie mit durch Zaprinast behandelten Zellen verglichen.
Die Phosphodiesterase-Aktivität kann anhand aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren ermittelt werden, wie bspw. einem Verfahren unter Verwendung von radioaktivem, zyklischem 3H-GMP (cGMP)(zyklischem 3',5'-Guanosinmonophosphat) als Substrat für das PDE-Enzym (Thompson, W. J., Teraski, W. L., Epstein, P. M., Strada, S. J., Advances in Cychlc Nucleotide Research, 10: 69-92, 1979, welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen wird). Kurz gesagt, eine Lösung von definierter Substrat ³H-cGMP-spezifischer Aktivität (0,2 uM; 100.000 cpm; enthaltend Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 5 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml BSA) wird mit dem zu testenden Präparat in einem Gesamtvolumen von 400 ul vermischt. Die Mischung wird für 10 Minuten bei 30ºC mit der isolierten, erfindungsgemäßen PDE bebrütet. Die Reaktion wird gestoppt, bspw. durch Kochen der Reaktionsmischung für 75 Sekunden. Nach Abkühlung auf Eis werden 100 ul von 0,5 mg/ml Schlangengift (O. Hanna-Gift, erhältlich von Sigma) hinzugefügt, und es findet für 10 Minuten bei 30ºC eine Inkubation statt. Diese Reaktion wird sodann gestoppt durch Zufügen eines Alkohols, bspw. 1 ml von 100%igem Methanol. Mit den Untersuchungsproben wird wird eine 1 ml-Dowex-1-X8-Säule beschickt; und mit 1ml von 100%igem Methanol gewaschen. Die Menge der Radioaktivität in dem Durchbruch und in der Auswaschung der Säule kombiniert und mit einem Szintillationszähler gemessen. Der Grad der Phosphodiesterase-Hemmung wird ermittelt durch Berechnung der Menge der Radioaktivität bei Reaktionen mit dem Präparat und durch Vergleich derselben mit einer Vergleichsprobe (einer Reaktionsmischung ohne die zu testende Verbindung, aber mit dem Lösungsmittel).
Alternativ dazu wird die Hemmungsfähigkeit wünschenswerter Verbindungen gegenüber erfindungsgemäßen Phosphodiesterasen anhand eines cGMP-Anstiegs in neoplastischen Zeilen erwogen, welche der zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt wurden. Die Menge der PDE-Aktivität kann ermittelt werden durch Untersuchen der Menge des zyklischen GMP's in dem Extrakt behandelter Zellen mittels eines Radio-Immunoassays (RIA). Bei diesem Verfahren werden HT-29- oder SW-480-Zellen auf Platten gegeben und bis zum Zusammenfließen gezüchtet. Wie oben angedeutet, enthält SW-480 sowohl PDE5 als auch die neuartige, erfindungsgemäße PDE, so dass bei der Bestimmung der PDE-Aktivität auf diesem Weg gleichzeitig eine kombinierte cGMP hydrolysierende Aktivität untersucht wird. Die Testverbindung wird sodann mit der Zellkultur inkubiert bei einer Konzentration der Verbindung zwischen etwa 200 uM und etwa 200 pM. Ungefähr 24 bis 48 Stunden später wird das Kulturmedium von den Zellen entfernt, und die Zellen werden aufgeschlossen. Die Reaktion wird mit 0,2 N HCl/50% MeOH gestoppt. Eine Probe wird für eine Proteinuntersuchung entnommen. Mittels der Anionen- Austausch-Chromatographie wird zyklisches GMP von den Säure-/Alkohol-Extrakten der Zellen gereinigt, bspw. unter Verwendung einer Dowex-Säule. Das cGMP wird getrocknet, entsprechend der veröffentlichten Verfahren acetyliert, bspw. unter Verwendung von Essigsäureanhydrid in Triethylamin (Steiner, A. L., Parker, C. W., Kipnis, D. M., J. Biol Chem., 247 4: 1106-13, 1971). Das acetylierte cGMP wird quantitativ analysiert unter Verwendung von Radio-Immunoassay-Verfahren (Harper, J., Brooker, G., Advances in Nucleotide Research, 10: 1-33, 1979). Jodierte Liganden (Tyrosin-Methyl-Ester) von abgeleitetem, zyklischem GMP werden in Gegenwart von Antiseren und geeigneten Pufferlösungen mit Standardsubstanzen oder unbekannten Substanzen inkubiert. Das Antiserum kann hergestellt werden unter Verwendung von auf Halbantigene zyklischer Nukleotide gerichtete Verfahren. Das Antiserum stammt von Schafen, die mit Konjugaten von Succinyl-cGMP- Albumin injiziert wurden, und im Verhältnis 1/20.000 verdünnt. Die Mengeninterpolation und Fehleranalyse für Standardkurven wird angewandt wie bereits beschrieben (Seibert, A. F., Thompson, W. J., Taylor, A., Wilboum, W. H., Bamard, J. und Haynes, J., J. Applied PhysioL, 72 : 389-395, 1992).
Zusätzlich kann das Kulturmedium gesäuert, gefroren (-70ºC) und ebenfalls auf eGMP und cAMP analysiert werden.
Neben der Beobachtung des durch wünschenswerte Verbindungen verursachten, ansteigenden Gehalts von cGMP in neoplastischen Zellen sind ebenfalls Abnahmen des Gehalts von cAMP beobachtet worden. Es wurde beobachtet, dass eine besonders wünschenswerte Verbindung (d. h. eine solche, die Apoptose selektiv in neoplastischen Zellen auslöst, jedoch nicht in nennenswertem Umfang in normalen Zellen) einem zeitlichen Verlauf folgt, der mit einer cGMP-spezifischen PDE- Hemmung als anfänglicher Aktion in Einklang steht, die innerhalb von Minuten zu einem gesteigerten cGMP-Gehalt führt. Zweitens führt eine Behandlung neoplastischer Zellen mit einer wünschenswerten, anti-neoplastischen Verbindung innerhalb von 24 Stunden zu einem verringerten cAMP-Gehalt. Die intrazellulären Ziele der Medikamentenwirkungen werden weiter studiert, aber aktuelle Daten stützen ein Konzept, wobei der anfängliche Anstieg des cGMP-Gehalts und der anschließende Abfall des cAMP-Gehalts der Apoptose in neoplastischen Zellen vorausgeht, welche den erwünschten Verbindungen vorangeht.
Die Änderung in dem Verhältnis der zwei Nukleotide kann ein präziseres Werkzeug sein zur Ermittlung wünschenswerter, cGMP-spezifischer Phosphodiesterase- Hemmungsaktivität von Testverbindungen, als die alleinige Messung des absoluten Werts von cGMP, die alleinige Messung der cGMP-spezifischen Phosphodiesterase- Hemmung oder die alleinige Messung des Grads der cGMP-Hydrolyse. In neoplastischen Zellen, die nicht mit anti-neoplastischen Verbindungen behandelt worden sind, liegt das Verhältniss von cGMP-Gehalt/cAMP-Gehalt in dem Bereich von 0,03 bis 0,05 (d. h., 300-500 fmol/mg cGMP-Protein-Gehalt gegenüber 6000- 8000 fmol/mg cAMP-Protein-Gehalt). Nach dem Einwirken wünschenswerter antineoplastischer Verbindungen erhöht sich das Verhältnis auf ein Mehrfaches (vorzugsweise mindestens ein dreifacher Anstieg) als Ergebnis eines anfänglichen Anstiegs des zyklischen GMP und der späteren Abnahme des zyklischen AMP.
Insbesondere ist beobachtet worden, dass besonders wünschenswerte Verbindungen einen anfänglichen Anstieg des cGMP-Gehalts in behandelten neoplastischen Zellen zuwege bringen auf ein cGMP-Niveau von mehr als 500 fmol/mg Protein. Außerdem verursachen besonders wünschenswerte Verbindungen die spätere Abnahme des cAMP-Gehalts in behandelten neoplastischen Zellen auf ein cAMP-Niveau von weniger als 4000 fmol/mg Protein.
Um den Gehalt des zyklischen AMP zu bestimmen, werden Radio-Immunoassay- Technologien verwendet ähnlich den oben für cGMP beschriebenen. Den Ausgangspunkt bildet die Reinigung von Säuren-/Alkohol-Extrakten aus Zellen unter Verwendung der Anionen-Austausch-Chromatographie, gefolgt von einer Trocknung, einer Azetylierung gemäß veröffentlichter Verfahren sowie einer quantitativen Bestimmung unter Verwendung von Radio-Immunoassay-Verfahren. Jodierte Liganden von abgeleitetem, zyklischem AMP werden in Gegenwart von spezifischen Antiseren und geeigneten Pufferlösungen mit Standardsubstanzen oder unbekannten Substanzen inkubiert.
Eine Verifikation des Gehalts zyklischer Nukleotide kann erreicht werden durch Bestimmen des Umschlagens oder der Ansammlung zyklischer Nukleotide innerhalb intakter Zellen. Um die cAMP in intakten Zellen zu messen, wird eine ³H-Adenin- Vormarkierung verwendet entsprechend veröffentlichter Verfahren (Whalin, M. E., Garrett Jr., R. L., Thompson, W. J. und Strada, S. J. "Correlation of cell-free brain cyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay in intact brain slices", Sec. Mess. And Phos. Protein Research, 12: 311-325, 1989). Das Verfahren mißt den Fluß von markeirter ATP zu zyklischer AMP und kann verwendet werden, um die Aktivitäten von Adenylatcyclase oder zyklischer Nukleotid-Phosphodiesterase intakter Zellen in Abhängigkeit von dem spezifischen Protokoll abzuschätzen. Die Ansammlung zyklischer GMP war zu gering für eine Untersuchung mittels einer Vormarkierung intakter Zellen entsprechend veröffentlichter Verfahren (Reynolds, P. E., S. J. Strada und W. J. Thompson, "Cyclic GMP Accumulation In Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Measured By Intact Cell Prelabeling," Life Sci., 60: 909-918, 1997).
Die PDE-Hemmungswirkung einer Verbindung kann auch anhand einer Gewebeprobe bestimmt werden. Biopsie-Proben des menschlichen Gewebes oder des Gewebes von narkotisierten Tieren werden von Subjekten entnommen, welche der Testverbindung ausgesetzt waren. Kurz gesagt, eine Gewebeprobe wird in 500 ul von 6-prozentiger Zitronensäure homogenisiert. Eine bekannte Menge des Homogenisats wird zur Proteinanalyse entnommen. Dem verbleibenden Homogenisat wird erlaubt, sich innerhalb von 20 Minuten auf Eis zu setzen, damit das Protein ausfällen kann. Als nächstes wird das Homogenisat bei 4ºC für 30 Minuten mit 15.000 g zentrifugiert. Das Obenaufschwimmende wird zurückgewonnen, und die Pellets werden zurückgewonnen. Das Obenaufschwimmende wird 4 mal gewaschen mit 5 Volumina von durch Wasser gesättigtem Diethylehter. Zwischen jeder Wäsche wird die obere Ether-Schicht entfernt. Das wässrige Ether-Extrakt wird in einem "speed vac" getrocknet. Nach der Trocknung kann die Probe zu zukünftigen Verwendung eingefroren oder unverzüglich verwendet werden. Das getrocknete Extrakt wird in 500 ul einer Untersuchungs-Pufferlösung aufgelöst. Der Grad der cGMP-spezifischen Hemmung wird bestimmt durch Untersuchung der Menge zyklischer Nukleotide anhand der oben beschriebenen Radio-Immunoassay-Verfahren.
Der Grad der Hemmung wird bestimmt durch Vergleich der Aktivität der neuartigen PDE (oder PDE2) in Gegenwart und Abwesenheit der Verbindung. Die Hemmung der Aktivität der neuartigen PDE (oder PDE2) zeigt an, dass die Verbindung für die Behandlung von Neoplasie geeignet ist. Eine deutliche Hemmungswirkung, größer als diejenige der Bezugsmarke, Exisulind, vorzugsweise mehr als 50% bei einer Konzentration von 10 uM oder weniger, zeigt an, dass die Verbindung weiter auf ihre antineoplastischen Eigenschaften untersucht werden sollte. Für eine Verbindung, die auf ihre potentielle Verwendbarkeit weiter untersucht werden soll, sollte der IC&sub5;&sub0;-Wert für die Hemmung der neuartigen PDE vorzugsweise kleiner sein als 50 uM.

D. Bestimmung, ob eine Verbindung das Tumorzellwachstum reduziert

Bei einer alternativen Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die weitere Bestimmung, ob die Verbindung das Wachstum von Tumorzellen reduziert. In Abhängigkeit von dem zu testenden Gewebe können zur Untersuchung verschiedene Zell-Linien verwendet werden. Beispielsweise umfassen diese Zell- Linien: SW-480 - Dickdarm-Adenokarzinom; HT-20 - Dickdarm-Adenokarzinom; A- 427 - Lungen-Adenokarzinom -Karzinom; MCF-7 - Brust-Adenokarzinom; und UACC-375 -Melanom-Linie; sowie DU145 - Prostata-Kazinom. Unter Verwendung dieser Zell-Linien erhaltene, zytotoxische Daten weisen auf eine neoplastische Schädigungen hemmende Wirkung hin. Diese Zell-Linien sind gut gekennzeichnet und werden durch das United States National Cancer Institute bei dessen Auswahlprogramm für neue Anti-Krebs-Medikamente verwendet.
Die Fähigkeit einer Verbindung zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen kann anhand der vom ATCC erhältlichen, menschlichen Dickdarm-Karzinom-Zell- Linie HT-29 gemessen werden. HT-29-Zellen sind zuvor bereits als ein relevantes Kulturmodell für Dickdarm-Tumorzeilen gekennzeichnet worden (Fogh, J., und Trempe, G. In: Human Tumor Cells in Vitro, J. Fogh (Ed.), Plenum Press, New York, pp. 115-159, 1975). Ht-29-Zellen werden erhalten in RPMI-Medium, das durch 5% fötalem Rinderkalbsserum (Gemini Bioproducts, Inc., Carlsbad, CA) ergänzt ist sowie durch 2 mm Glutamin und durch 1% Antibiotikum-Antimyotikum in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO&sub2; bei 37ºC. Kurz gesagt, HT- 29-Zellen werden auf Platten gegeben mit einer Dichte von 500 Zellen/Vertiefung in 96 Vertiefungs-Mikrotiter-Platten, und sie werden vor Hinzufügen der Verbindung über 24 Stunden hinweg bei 37ºC bebrütet. Jede Bestimmung der Zellenzahl umfaßte sechs Wiederholungen. Nach sechs Tagen Kultivierung werden die Zellen fixiert durch Hinzufügen von kalter Trichloressigsäurebis auf eine abschließende Konzentration von 10%, und die Protein-Niveaus werden gemessen unter Verwendung des kolorimetrischen Schwefel-Rhodamin-B(SRB)-Proteinflecken- Assays, weiches zuvor von Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J. T., Bokesch, H., Kenney, S., und Boyd, M. R: beschrieben wurde: "New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screenirig," J. Nafl. Cancer Inst. 82 : 1107-1112, 1990.
Zusätzlich zu dem SRB-Assay steht eine Anzahl weiterer Verfahren zur Verfügung, um die Wachstumshemmung zu messen, welche anstelle des SRB-Assays eingesetzt werden könnten. Diese Verfahren umfassen das Zählen lebensfähiger Zellen im Anschluß an eine Färbung mit Naphthylaminblau, Markieren derjenigen Zellen, welche zur DNS-Synthese in der Lage sind, mit BrdU oder einem radiomarkierten Thymidin, neutrales Rotfärben lebensfähiger Zellen, oder MTT- Färben lebensfähiger Zellen.
Eine erhebliche Hemmung des Tumorzellenwachstums von mehr als 50% bei einer Dosis von 100 uM oder weniger deutet ferner darauf hin, dass die Verbindung bei der Behandlung neoplastischer Schädigungen nützlich ist. Vorzugsweise wird ein IC&sub5;&sub0;-Wert bestimmt und für Vergleichszwecke verwendet. Dieser Wert ist diejenige Konzentration des Medikaments, welche erforderlich ist, um das Tumorzellenwachstum um 50% gegenüber einem Vergleichswert zu hemmen. Sofern eine Verbindung für einen potentiellen Einsatz bei der Behandlung neoplastischer Schädigungen weiter in Betracht gezogen werden soll, so sollte ihr IC&sub5;&sub0;-Wert vorzugsweise unterhalb von 100 uM liegen.

E. Ermittlung, ob eine Verbindung Apoptose auslöst

Bei einer zweiten alternativen Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Aussiebungsverfahren ferner die Bestimmung, ob die Verbindung in Kulturen von Tumorzellen Apoptose auslöst.
Zwei unterschiedliche Formen des Zeiltodes können anhand morphologischer und biochemischer Kriterien beschrieben werden: Nekrose und Apoptose. Nekrose wird begleitet von einer erhöhten Durchlässigkeit der Plasmamembran; die Zellen schwellen an und die Plasmamembran platzt innerhalb von Minuten. Apoptose ist gekennzeichnet durch Bläschenbildung der Membran, Kondensation des Zytoplasmas und die Aktivierung innerer Endonukleasen.
Apoptose tritt in natürlicher Form während des normalen Gewebeumsatzes auf sowie während der embryonalen Entwicklung von Organen und Gliedern. Apoptose wird auch durch zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen ausgelöst, durch ionisierende Strahlung und durch gewisse chemotherapeutische Medikamente. Es wird angenommen, dass eine ungeeignete Regulierung der Apoptose eine wichtige Rolle bei vielen pathologischen Zuständen spielt einschließlich Krebs, AIDS oder der Alzheimerkrankheit, etc. Hinsichtlich der Auslösung von Apoptose ist ein Aussieben von Verbindungen anhand von Tumorzellkulturen möglich, welche unter den oben beschriebenen Zuständen erhalten wurden. Die Behandlung von Zellen mit Testverbindungen erfordert Kulturen entweder vor oder nach dem Zusammenfließen und umfaßt eine zwei- bis siebentägige Behandlung bei verschiedenen Konzentrationen. Apoptotische Zellen werden sowohl in den festhaftenden als auch in den "schwimmenden" Kulturbereichen gemessen. Beide Bereiche werden gesammelt durch Entfernen des Obenaufschwimmenden, Behandlung der anhaftenden Zellen mit Trypsin, und Kombinieren beider Zubereitungen, gefolgt von einem Zentrifugen-Wasch-Schritt (10 Minuten, 2.000 Umdrehungen pro Minute). Das Protokoll für die Behandlung von Tumorzellkulturen mit Sulindac und entsprechenden Verbindungen, um Apoptose in einem nennenswerten Umfang zu erhalten, ist in der Literatur beschrieben worden (vgl. Piazza, G. A., et al., Cancer Research, 55: 3110-16, 1995). Die neuartigen Merkmale umfassen das Sammeln beider ZeiIsorten, sowohl der schwimmenden als auch der anhaftenden Zellen, die Erkennung optimaler Behandlungszeiten und Dosierungsbereiche zur Beobachtung von Apoptose, sowie die Erkennung optimaler Bedingungen der Zellkulturen.
Nach Behandlung mit einer Verbindung können die Kulturen auf Apoptose und Nekrose untersucht werden mittels der Fluoreszenzmikroskopie nach Markierung mit Acridinorange und mit 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridin-bromid. Das Verfahren zur Messung der Anzahl apoptotischer Zellen ist zuvor bereits von Duke & Cohen beschrieben worden in: "Morphological And Biochemical Assays Of Apoptosis," Current Protocols In Immunology, Coligan et al., Ed. 3.17.1-3.17.16 (1992).
Beispielsweise können schwimmende und festhaftende Zellen gesammelt werden durch Behandlung mit Trypsin, und sie werden dreimal in PBS gewaschen. Repräsentative Zellen werden können zentrifugiert werden. Der dabei entstehende Bodensatz wird sodann abermals suspendiert in einem Medium und einer Farbmischung aus Acridinorange und 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridinbromid, in PBS aufbereitet und sanft vermischt. Die Mischung wird sodann auf einen Objektträger eines Mikroskops gegeben und im Hinblick auf morphologische Merkmale und auf Apoptose untersucht.
Eine quantitative Erfassung der Apoptose ist auch möglich durch Messen eines Anstiegs der DNS-Fragmentierung in Zellen, welche mit Testverbindungen behandelt worden sind. Kommerzielle, photometrische Enzym-Immunoasssays zur quantitativen in-vitro-Bestimmung histongebundener DNS-Fragmente des Zytoplasmas (Mono- und Oligonucleosome) erhältlich (Cell Death Detection ELISAokys, Kat. Nr. 1,774,425, Boehringer Mannheim). Das Boehringer Mannheim- Assay basiert auf einem Sandwich-Enzym-Immunoassay-Prinzip unter Verwendung monoklonaler Antikörper von Mäusen, welche gegen DNS bzw. Histone gerichtet sind. Dies erlaubt die spezifische Bestimmung von Mono- und Oligonucleosomen in der zytoplasmischen Fraktion von Zell-Lysaten.
Nach Angaben des Verkäufers wird Apoptose auf die folgende Art gemessen. Die Probe (Zell-Lysat) wird auf ein mit Streptavidin überzogenes Mikrotiterplättchen ("MTP") gegeben. Anschließend wird eine Mischung aus einem Anti-Histon-Biotin und einem Anti-DNS-Peroxidase-Konjugat hinzugefügt und eine zweistündige Inkubation vorgenommen. Während der Inkubationsphase lagert sich der Anti- Histon-Antikörper an der Histonkomponente der Nucleosomen an und fixiert gleichzeitig mit Hilfe seiner Biotin-Reaktion den Immunkomplex an dem mit Streptavidin überzogenen MTP. Zusätzlich reagiert der Anti-DNS-Peroxidas- Antikörper mit der DNS-Komponente der Nucleosomen. Nach Entfernung der ungebundenen Antikörper mittels eines Wasch-Schritts wird die Nucleosomen- Menge anhand der in dem Immunkomplex bewahrten Peroxidase quantitativ bestimmt. Die Peroxidase wird photometrisch ermittelt unter Verwendung von ABTS7 (2,2'-Azido-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat]) als Substrat.
Beispielsweise werden SW-480-Dickdarm-Adenokarzinom-Zellen auf ein Mikrotiterplättchen mit 96-Vertiefungen in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung gegeben. Sodann werden die Zellen mit der Testverbindung behandelt, und man läßt sie für 48 Stunden bei 37ºC brüten. Nach der Inkubation wird das Mikrotiterplättchen zentrifugiert, und das Obenaufschwimmende wird entfernt. Sodann wird der Zell-Bodensatz in jeder Vertiefung abermals für 30 Minuten in einer Lyse-Pufferlösung suspendiert. Die Lysate werden anschließend zentrifugiert, und ein repräsentativer Teil des Obenaufschwimmenden (d. h., die zytoplasmische Fraktion) wird auf ein mit Streptavidin überzogenes Mikrotiterplättchen übertragen. Es wird Sorgfalt darauf verwandt, die aufgelösten Pellets (d. h., Zellkerne mit hohem Molekulargewicht, nicht fragmentierte DNS) in dem Mikrotiterplättchen nicht zu schütteln. Sodann werden die Proben analysiert.
Das Stimulationsverhältnis FS (Fold stimulation FS = ODmax/ODträger), ein Indikator für eine apoptotische Antwort, wird für jede Testverbindung bei einer gegebenen Konzentration bestimmt. EC&sub5;&sub0;-Werte können auch bestimmt werden durch Ermittlung einer Reihe von Konzentrationen der Testverbindung.
Deutliche, statistische Apoptose-Steigerungen (d. h., mehr als die 2-fache Stimulation bei einer Konzentration von 100 uM) deuten ferner darauf hin, dass die Verbindung für den Einsatz bei der Behandlung neoplastischer Schädigungen nützlich ist. Sofern eine Verbindung für einen potentiellen Einsatz bei der Behandlung neoplastischer Schädigungen weiter in Betracht gezogen werden soll, so sollte ihr EC&sub5;&sub0;-Wert für die apoptotische Aktivität vorzugsweise unterhalb von 100 uM liegen. Hierbei ist der EC&sub5;&sub0;-Wert definiert als diejenige Konzentration, welche gegenüber einer Behandlung mit dem reinen Träger 50% Apoptose-Auslösung hervorruft.

F. Tests mit einem Kulturmodell des Brustdrüsenorgans

Anhand der oben beschriebenen Verfahren erkannte Testverbindungen können auf ihre antineoplastische Aktivität untersucht werden anhand ihrer Fähigkeit, das Auftreten prä-neoplastischer Schädigungen in einem Kulturmodell des Brustdrüsenorgans zu hemmen. Diese Technik mit einer Kultur des Brustdrüsenorgans von Mäusen ist von anderen Forschern erfolgreich angewandt worden, uni die Wirkungen bekannter antineoplastischer Mittel zu studieren wie bspw. gewisser NSAIDs, Retinoiden, Tamoxifen, Selen und bestimmten Naturprodukten, und sie ist nützlich für den Gültigkeitsnachweis des erfindungsgemäßen Auswahlverfahrens.
Beispielsweise können weibliche BALB/c-Mäuse täglich mit einer Kombination von Östradiol und Progesteron behandelt werden, um die Drüsen in vitro für eine Hormon-Empfindlichkeit zu sensibilisieren. Die Tiere werden geopfert, und die thorakalen Brustdrüsen werden aseptisch herausgeschnitten und über zehn Tage hinweg in einem Wachstumsmedium bebrütet, welchem Insulin, Prolaktin, Hydrokortison und Aldosteron hinzugefügt wurde. Dem Medium wird DMBA (7,12- Dimethylbenz(a)anthrazen) hinzugefügt, um die Bildung prämaligner Schädigungen auszulösen. Die voll entwickelten Drüsen werden sodann des Prolaktins beraubt, des Hydrokortisons und Aldosterons, was in einem Rückgang der Drüsen resultiert, aber nicht in einem Rückgang der prämalignen Schädigungen.
Die Testverbindung wird in Dimethylsulfoxid gelöst und für die Dauer der Kulturperiode dem Kulturmedium hinzugefügt. Am Ende der Kulturperiode werden die Drüsen in 10% Formalin fixiert, mit Alaunkarmin betupft und auf gläsernen Objektträgern montiert. Das Auftreten der Bildung von Brustdrüsenschädigungen ist das Verhältnis von Drüsen mit Brustschädigungen gegenüber Drüsen ohne Schädigungen. Das Auftreten von Brustschädigungen bei mit der Testverbindung behandelten Drüsen wird mit dem von unbehandelten Drüsen verglichen.
Der Umfang des von den Brustgewebeschädigungen eingenommenen Bereichs kann quantitativ erfaßt werden, indem ein Bild der Drüse auf ein Digitalisiertablett projiziert wird. Der von der Drüse bedeckte Bereich wird auf dem Tablett umfahren und als 100% des Bereichs betrachtet. Der von jeder der nicht zurückgebildeten Strukturen bedeckte Bereich wird auf dem Digitalisiertablett umrissen und von einem Computer quantitativ bestimmt.

Versuchsergebnisse

Eine Anzahl von Verbindungen wurde mit verschiedenen Protokollen untersucht und auf ihre potentielle Eignung für die Behandlung von Neoplasie durchgesiebt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden weiter unten wiedergegeben. Im folgenden werden die Testverbindungen mit einem Buchstabencode bezeichnet, der mit dem folgenden korrespondiert:
A - Rac-threo-(E)-1-(N,N'-diethylaminoethanethio)-1-(butan-1',4'-olido)[3',4' : 1,2]- 6-fluor-2-methyl-3-(p-methylsulfonylbenzyliden)-indan;
B - (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(3,4,5-trimethoxybenzyliden)-3-essigsäure;
C - (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(p-chiorbenzyliden)-3-essigsäure;
D - Rac-(E)-1-(butan-1',4'-olido)-[3',4' : 1,2]-6-fluor-2-methyl-3-(pmethylsulfonylbenzyliden)-1S-indanyl-N-acetylcystein;
E - (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(3,4,5-trimethoxybenzyliden)-3-indenylacetamid, benzyl;
F - (Z)-5-Fluor-2-methyl-1-(p-methylsulfonylbenzyliden)-3-indenylacetamid,N,N'- dizyklohexyl;
G - Ribo-(E)-1-Triazolo-[2',3' : 1",3"]-1-(butan-1',4'-olido)-[3',4' : 1,2]-6-fluor-2- methyl-3-(p-methylsulfonylbenzyliden)-indan; sowie
H - Rac-(E)-1-(butan-1',4'-olido)-[3',4' : 1,2]-6-fluor-2-methyl-3-(pmethylsulfonylbenzyliden)-1S-indanyl-glutathion).

Beispiel 1 - Untersuchung der COX-Hemmung

Referenz- und Testverbindungen wurden gemäß dem obigen Protokoll für die COX- Untersuchung im Hinblick auf ihre COX hemmende Aktivität analysiert. Fig. 4 zeigt den Effekt verschiedener Konzentrationen von Sulindac-Sulfid oder Exisulind auf die Aktivität gereinigter Zyklooxygenase (Typ 1). Die Aktivität der Zyklooxygenase wurde bestimmt unter Verwendung gereinigter Zyklooxygenase von Schafbock- Spermabläschen; wie dies bereits beschrieben worden ist (Mitchell et al. oben). Der IC&sub5;&sub0;-Wert für Sulindac-Sulfid wurde auf etwa 1,76 uM berechnet, während derjenige für Exisulind größer war als 10.000 uM. Diese Daten zeigen, dass Sulindac-Sulfid, nicht jedoch Exisulind, ein COX-I-Inhibitor ist. Ähnliche Daten erhielt man für das COX-2-Isoenzym (Thompson et al. "Journal of the National Cancer Institute, 87: 1259-1260, 1995).
Fig. 5 zeigt den Effekt der Test-Verbindungen B und E auf die COX-Hemmung. Die COX-Aktivität wurde bestimmt wie für die Verbindungen aus Fig. 4. Die Daten zeigen, dass weder die Testverbindung B noch E COX-I in nennenswertem Umfang hemmen.

Tabelle 2

Die Zyklooxygenase hemmende Aktivität einer Reihe von Verbindungen

Referenzverbindungen % Hemmung bei 100 uM

Indomethacin 95
MY5445 94
Sulindac-Sulfid 97
Exisulind < 25

Testverbindungen % Hemmung bei 100 uM

A < 25
B < 25
C 87
D < 25
E < 25
Wie in der obigen Tabelle 2 berichtet, wurden die Verbindungen A bis E entsprechend dem obigen Protokoll hinsichtlich ihrer COX hemmenden Aktivität bewertet. Es stellte sich heraus, dass COX durch die Verbindung C bei einer Dosis von 100 uM um mehr als 25% gehemmt wurde, und deshalb für eine weitere Aussiebung nicht ausgewählt würde.

Beispiel 2 - Untersuchung der cGMP-PDE-Hemmung

Referenzverbindungen und Testverbindungen wurden entsprechend dem Protokoll für die oben beschriebene Untersuchung im Hinblick auf ihre eGMP-PDE hemmende Aktivität analysiert. Fig. 6 zeigt die Auswirkung verschiedener Konzentrationen von Sulindac-Sulfid und Exisulind, einerseits auf PDE4-Aktivität und andererseits auf die Aktivität von cGMP-PDE, welche wie bereits beschrieben von kultivierten Tumorzellen HT-29 aus dem menschlichen Dickdarm extrahiert worden waren (W. J.
Thompson et al., oben). Der IC&sub5;&sub0;-Wert von Sulindac-Sulfid für die Hemmung von PDE4 lag bei 41 uM, und für die Hemmung von cGMP-PDE bei 17 uM. Der IC&sub5;&sub0;-Wert von Exisulind für die Hemmung von PDE4 lag bei 181 uM, und für die Hemmung von cGMP-PDE bei 56 uM.
Diese Daten zeigen, dass sowohl Sulindac-Sulfid als auch Exisulind die Aktivität der Phosphodiesterase hemmen. Beide Verbindungen zeigen eine Selektivität für die cGMP- PDE-Isoenzym-Formen gegenüber den PDE4-Isoformen.
Fig. 7 zeigt die Auswirkungen von Sulindac-Sulfid auf die cGMP- oder cAMP-Produktion, wie dies bei kultivierten HT-29-Zellen gemäß der oben beschriebenen Untersuchung ermittelt wurde. HT-29-Zellen wurden über einen Zeitraum von 30 Minuten mit Sulindac-Sulfid behandelt, und cGMP oder cAMP wurden mit einem herkömmlichen Radio-Immunoassay- Verfahren gemessen. Wie angedeutet steigert Sulindac-Sulfid bei einem EC&sub5;&sub0;-Wert von 7,3 uM die cGMP-Spiegel um mehr als 50% (Fig. 7A). Die cAMP-Spiegel blieben von der Behandlung unbeeinflußt, obwohl ein bekannter PDE4-Inhibitor, nämlich Rolipram, cAMP steigerte (Fig. 7B). Die Daten demonstrieren die pharmakologische Bedeutung der Hemmung von cGMP-PDE gegenüber PDE4.
Fig. 8 zeigt die Auswirkung der angezeigten Dosis der Testverbindung B auf cGMP-PDE- oder PDE4-Isoenzyme der Phosphodiesterase. Der berechnete IC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 18 uM für cGMP-PDE und bei 58 uM für PDE4.
Fig. 9 zeigt die Auswirkung der angezeigten Dosis der Testverbindung E auf PDE4 oder cGMP-PDE. Der berechnete IC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 0,08 uM für cGMP-PDE und bei mehr als 25 uM für PDE4.

Tabelle 3

Die cGMP-PDE hemmende Aktivität einer Reihe von Verbindungen

Referenzverbindungen % Hemmung bei 10 uM

Indomethazin 34
MY5445 86
Sulindac-Sulfid 97
Exisulind 39

Testverbindungen % Hemmung bei 10 uM

A < 25
B < 25
C < 25
D 36
E 75
Wie in dem obigen Protokoll beschrieben wurden die obigen Verbindungen aus Tabelle 3 auf ihre PDE hemmende Aktivität bewertet. Unter den Verbindungen ohne COX-Hemmung fand man, dass nur die Verbindung E bei 10 uM eine Hemmung von mehr als 50% verursachte. Wie in Fig. 8 angemerkt, zeigte die Verbindung B eine Hemmung von mehr als 50% bei einer Dosis von 20 uM. Deshalb können in Abhängigkeit von dem bei einem einzigen Dosierungstest verwendeten Dosierungsniveau einige Verbindungen ausgesiebt werden, die anderenfalls bei geringfügig erhöhter Dosierung aktiv sein können. Die verwendete Dosierung ist subjektiv und kann abgesenkt werden, nachdem bei bestimmten Niveaus aktive Verbindungen gefunden wurden, um noch mächtigere Verbindungen zu identifizieren.

Beispiel 3 - Untersuchung der Apoptose

Referenzverbindungen und Testverbindungen wurden entsprechend dem obigen Untersuchungs-Protokoll im Hinblick auf ihre hemmende Aktivität gegenüber der neuartigen PDE analysiert. In Übereinstimmung mit diesen Protokollen zeigt Fig. 10 die Auswirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf den apoptotischen und nekrotischen Zelltod. HT-29-Zellen wurden über sechs Tage hinweg mit der angezeigten Dosis von Sulindac-Sulfid oder Exisulind behandelt. Der apoptotische und nekrotische Zelltod wurde zuvor bereits untersucht (Duke und Cohen in: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992). Die Daten zeigen, dass sowohl Sulindac-Sulfid als auch Exisulind in der Lage sind, einen apoptotischen Zelltod zu verursachen, ohne Nekrose auszulösen. Alle Daten stammen von dem selben Experiment.
Fig. 11 zeigt die Auswirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf die Hemmung des Tumorwachstums und auf die Auslösung von Apoptose, wie diese durch DNS- Fragmentierung ermittelt worden sind. Obere Figur (11A): Hemmung des Wachstums (offene Symbole, linke Achse) und DNS-Fragmentierung (geschlossene Symbole, rechte Achse) durch Exisulind. Untere Figur (11 B): Hemmung des Wachstums (offene Symbole) und DNS-Fragmentierung (geschlossene Symbole) durch Sulindac-Sulfid. Die Wachstumshemmung wurde nach sechs Behandlungstagen anhand einer SRB-Untersuchung ermittelt. Die DNS- Fragmentierung wurde nach einer 48-stündigen Behandlung ermittelt. Alle Daten wurden dem selben Experiment entnommen.
Fig. 12 zeigt die Apoptose auslösenden Eigenschaften der Verbindung E. Dickdarm- Adenokarzinom-Zellen HT-29 wurden mit der angezeigten Konzentration der Verbindung E über 48 Stunden hinweg behandelt, und die Apoptose wurde ermittelt durch eine DNS-Fragmentierungs-Untersuchung. Der berechnete EC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 0,05 uM.
Fig. 13 zeigt die Apoptose auslösenden Eigenschaften der Verbindung B. Dickdarm- Adenokarzinom-Zellen HT-29 wurden mit der angezeigten Konzentration der Verbindung E über 48 Stunden hinweg behandelt, und die Apoptose wurde ermittelt durch eine DNS-Fragmentierungs-Untersuchung. Der berechnete EC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 175 uM.

Tabelle 4

Die Apoptose auslösende Aktivität einer Reihe von Verbindungen

Referenzverbindungen Vielfache Auslösung bei 100 uM

Indomethacin < 2,0
MY5445 4,7
Sulindac-Sulfid 7,9
Exisulind < 2,0
E4021 < 2,0
Zaprinast < 2,0
Sildenafil < 2,0
EHNA < 2,0

Testverbindungen Vielfache Auslösung bei 100 uM

A < 2,0
B 3,4
C 5,6
D < 2,0
E 4,6
Entsprechend dem obigen Protokoll für die x-fache Auslösung wurden die Verbindungen A bis E hinsichtlich ihrer Apoptose auslösenden Aktivitäten untersucht, wie in der obigen Tabelle 4 berichtet wird. Die Verbindungen B, G und E zeigten bei einer Dosis von 100 uM eine deutliche, Apoptose auslösende Aktivität, mehr als das 2-fache. Von diesen drei Verbindungen gelang es bei dieser Dosis nur B und E nicht, COX zu hemmen, während sie gleichzeitig cGMP-spezifische PDE hemmten.
Die Apoptose auslösende Aktivität einer Reihe von Phösphodiesterasen wurde bestimmt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle 5 wiedergegeben. HT-29-Zellen wurden über 6 Tage hinweg mit verschiedenen Phosphodiesterase-Inhibitoren behandelt. Nach einer Markierung mit Acridinorange und mit 3,8-Diamino-5-ethyl-6- phenyl-phenanthridin-bromid entsprechend dem oben beschriebenen Testverfahren wurden Apoptose und Nekrose morphologisch bestimmt. Die Daten zeigen, dass die neuartige, cGMP-spezifische PDE für das Durchsieben von derartigen Verbindungen nützlich ist, welche bei HT-29-Zellen Apoptose auslösen.

Tabelle 5

Daten von PDE-Inhibitoren hinsichtlich der Auslösung von Apoptose

Beispiel 4 - Untersuchung der Hemmung des Wachstums

Gemäß dem obigen Testprotokoll wurden Referenzverbindungen und Testverbindungen auf ihre PDE5 hemmende Aktivität analysiert. Fig. 14 zeigt den hemmenden Effekt verschiedener Konzentrationen von Sulindac-Sulfid und von Exisulind auf das Wachstum von HT-29-Zellen. Wie angedeutet wurden HT-29- Zellen über sechs Tage hinweg mit verschiedenen Dosen von Exisulind (Dreiecke) und Sulindac-Sulfid (Quadrate) behandelt. Die Zellenanzahl wurde mit einem Schwefel-Rhodamin-Test gemessen, wie bereits beschrieben (Piazza et al., Cancer Research, 55 : 3110-3116, 1995). Der IC&sub5;&sub0;-Wert für Sulindac-Sulfid lag bei etwa 45 uM und bei 200 uM für Exisulind. Die Daten zeigen, dass sowohl Sulindac-Sulfid als auch Exisulind in der Lage sind, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen.
Fig. 15 zeigt die wachstumshemmende und Apoptose auslösende Aktivität von Sulindac-Sulfid. Dargestellt ist der Zeitverlauf eines Experiments mit HT-29-Zellen, welche entweder mit dem Träger, mit 0,1% Dimethylsulfoxid (offene Symbole) oder mit 120 uM Sulindac-Sulfid (geschlossene Symbole) behandelt wurden. Die Wachstumshemmung (Fig. 15A, oben) wurde durch Zählen lebensfähiger Zellen nach Einfärben mit Naphthylaminblau gemessen. Die Apoptose (Fig. 15B, unten) wurde im Anschluß an eine Färbung mit Acridinorange und mit 3,8-Diamino-5-ethyl- 6-phenyl-phenanthridin-bromid durch eine morphologische Bestimmung gemessen, wie bereits beschrieben (Duke und Cohen, in: Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.17.16, New York, John Wiley and Sons, 1992). Die Daten zeigen, dass Sulindac-Sulfid in der Lage ist, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen, und dass der Effekt von einer Steigerung der Apoptose begleitet ist. Alle Daten wurden dem selben Experiment entnommen.
Fig. 16 zeigt die wachstumshemmende Aktivität der Testverbindung E. Dickdarm- Adenokarzinom-Zellen HT-29 wurden mit der angezeigten Konzentration der Verbindung E über sechs Tage hinweg behandelt, und die Zellenanzahl wurde mit einem SRB-Test bestimmt. Der berechnete IC&sub5;&sub0;-Wert lag bei 0,04 uM.

Tabelle 6

Die wachstumshemmende Aktivität einer Reihe von Verbindungen

Referenzverbindungen % Hemmung bei 100 uM

Indomethacin 75
MY5445 88
Sulindac-Sulfid 88
Exisulind < 50
E4021 < 50
Sildenafil < 50
Zaprinast < 50

Testverbindungen % Hemmung bei 100 uM

A 68
B 77
C 80
D 78
E 62
Gemäß dem obigen Aussiebungsprotokoll wurden die Verbindungen A bis E auf ihre wachstumshemmende Aktivität untersucht, wie dies in der obigen Tabelle 6 berichtet wird. Affe Testverbindungen zeigten eine den Einzeldosistest mit 100 uM überschreitende Aktivität.
Die wachstumshemmenden Aktivitäten einer Reihe von Phosphodiesterase- Inhibitoren wurden ermittelt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt. HT-29-Zellen wurden über 6 Tage hinweg mit verschiedenen Phosphodiesterase-Inhibitoren behandelt. Das Zeliwachstum wurde anhand des oben beschriebenen SRB-Tests bestimmt. Die folgenden Daten zeigen in Verbindung mit den obigen Ergebnissen, dass Inhibitoren der neuartigen PDE bei der Hemmung des Wachstums von Tumorzellen wirksam waren. Tabelle 7 Die wachstumshemmenden Daten von PDE-Inhibitoren
Um die Effektivität dieses Aussiebungsverfahrens für verschiedene Formen von Neoplasie aufzuzeigen, wurden Verbindungen anhand einer Vielzahl von Zell-Linien untersucht. Die Auswirkungen von Sulindac-Sulfid und Exisulind auf verschiedene Zell-Linien wurden ermittelt. Die Daten sind in der folgenden Tabelle 8 wiedergegeben. Die IC&sub5;&sub0;-Werte wurden anhand des SRB-Tests bestimmt. Die Daten zeigen die breite Wirksamkeit dieser Verbindungen auf einen weiten Bereich von Neoplasieformen, wobei die Wirksamkeit auf vergleichbare Dosierungsbereiche bezogen ist. Deshalb sollten erfindungsgemäß erkannte und ausgewählte Verbindungen bei der Behandlung vielfältiger Neoplasie-Formen nützlich sein. Tabelle 8 Die wachstumshemmenden Daten verschiedener Zell-Linien
*Bestimmt mit dem Neutral-Rot-Test wie von Schmid et al. beschrieben in Proc. AACR, Band 39, Seite 195 (1998).

Beispiel 5 - Aktivität in dem Kulturmodell des Brustdrüsenorgans

Fig. 17 zeigt die Hemmung prämaligner Schädigungen durch Sulindac-Metaboliten in einer Brustdrüsenorgankultur. Das Experiment mit der Brustdrüsenorgankultur wurde wie bereits beschrieben durchgeführt (Mehta und Moon, Cancer Research, 46: 5832- 5835, 1986). Die Ergebnisse zeigen, dass Sulindac und Exisulind die Bildung prämaligner Schädigungen hemmen, während Sulindac-Sulfid inaktiv war. Die Daten stützen die Hypothese, dass die Hemmung der Zyklooxygenase für die anti-neoplastischen Eigenschaften erwünschter Verbindungen nicht notwendig ist.

ANALYSE

Die Erfindung bietet eine rationale Grundlage für die Auswahl von Verbindungen zur Behandlung von Neoplasie anhand eines Vergleichs experimentell nach unterschiedlichen Protokollen gewonnener Daten der Testverbindungen. Im Rahmen der Erfindung können Testverbindungen im Hinblick auf ihre potentielle Nützlichkeit für die Behandlung der Neoplasie bei Menschen eingeordnet werden. Derartige Verbindungen mit wünschenswerten Effekten können für zusätzliche Tests und den anschließenden Einsatz beim Menschen ausgewählt werden.
Qualitative Daten verschiedener Testverbindungen und die verschiedenen Protokolle sind in der folgenden Tabelle 9 wiedergegeben. Die Daten zeigen, dass Exisulind, die Verbindung B und die Verbindung E die geeigneten Eigenschaften haben, um das vier Tests umfassende Sieb zu passieren: MangeInde COX-Hemmung, und das Vorliegen einer wirksamen Hemmung cGMP-spezifischer PDE, Wachstumshemmung und Auslösung von Apoptose. Die Aktivität dieser Verbindungen bei der Brustdrüsenorgankultur bestätigt die Effizienz dieser Erfindung. Die qualitativen Werte der Aussiebungsprotokolle ordnen die Verbindung E als beste ein, gefolgt von der Verbindung B, und schließlich Exisulind. Tabelle 9 Das Aktivitätsprofil verschiedener Verbindungen
Legende zu Tabelle 9: Aktivität von Verbindungen basierend auf der Bewertung von Experimenten mit Tests zur maximalen Aktivität und Fähigkeit.
- Nicht aktiv
+ Leicht aktiv
++ Mäßig aktiv
+++ Stark aktiv
++++ Hochgradig aktiv
Es wird auch eine neuartige Untersuchung hinsichtlich der PKG-Aktivität offenbart, die bei den erfindungsgemäßen Aussiebungsverfahren verwendet wird, aber eine weitaus allgemeinere Anwendbarkeit bei der Untersuchung der PKG-Aktivität für andere Zwecke hat (bspw. für das Studium der Rolle der PKG bei der normalen Zellenfunktion). Vor Erläuterung der Nützlichkeit der PKG-Aktivität bei der Beurteilung eines Medikaments hinsichtlich der Feststellung, ob eine Verbindung für die Behandlung von Neoplasie potentiell nützlich ist, ist es für ein besseres Verständnis förderlich, zunächst das PKG-Untersuchungsverfahren zu beschreiben.

Das neuartige PKG-Untersuchungsverfahren

Das neuartige, erfindungsgemäße PKG-Untersuchungsverfahren umfaßt die Anlagerung mehrerer Aminosäuresequenzen an eine feste Phase, wobei jede dieser Sequenzen mindestens einen cGMP bindenden Bereich enthält sowie eine Phosphorylierungsstelle der Phosphodiesterase Typ 5 ("PDE5"). Diese Sequenz ist bekannt und in der folgenden Literatur beschrieben. Vorzugsweise enthält die PDE5- Anlagerungssequenz nicht den katalytischen Bereich der PDE5, wie im folgenden beschrieben. Eine Möglichkeit, um die PDE5-Sequenzen an eine feste Phase zu binden, besteht darin, jene Sequenzen als Fusionsprotein der PDE5-Sequenz und eines Teils eines Aminosäure-Bindungspaares zu exprimieren und den anderen Teil dieses Aminosäure-Bindungspaares mit einer festen Phase (bspw. Kügelchen) zu verknüpfen. Ein verwendbares Bindungspaar ist Glutathion-S-Transferase ("GST") und Glutathion ("GSH"), wobei die GST als Fusionsprotein zusammen mit der oben beschriebenen PDE5-Sequenz exprimiert wird, und das GSH wird kovalent mit der festen Phase verbunden. Auf diese Art kann das PDE5-Sequenz/GSI- Fusionsprotein einfach dadurch an eine feste Phase angelagert werden, dass eine das Fusionsprotein enthaltende Lösung über die feste Phase geleitet wird, wie dies im folgenden beschrieben wird.
Ein RT-PCR-Verfahren wird verwendet, um den cGB-Bereich der PDE5 mit Vorwärts- und Rückwärts-Startern zu erhalten, welche aus der PDESA-cDNS- Sequenz von Rindern entwickelt worden sind (McAllister-Lucas L. M. et al., J. Biol. Chem. 268, 22863-22873, 1993), und die Auswahl unter den PDE 1-10-Familien. 5'- 3', Inc. -Sets für die gesamte RNS, gefolgt von einer oligo-(dT)-Säulenreinigung der mRNS werden in Verbindung mit HT-29-Zellen verwendet. Ein Vorwärts-Starter (GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G, 203-227) und ein Rückwärts-Starter (CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 1664-1686) werden verwendet, um das 1484 bp-Fragment zu synthetisieren, das die Phosphorylierungsstelle und sowohl die cGMP-Bindungsstelle mit hoher als auch die mit niedriger Affinität für menschliche PDESA kodiert (203-1686 bp, cGB-PDE5). Das synthetisierte cGB-PDE5-Nukleotid-Fragment kodiert für 494 Aminosäuren mit 97% Ähnlichkeit mit Rinder-PDESA. Diese wird sodann zu einem pGEX-5X-3-Glutathion- S-Transferase(GST)-Fusionsvektor (Pharmacia Biotech) geklont mit einem tac- Promotor sowie Eco R1- und Xho1-Schnittstellen. Der Fusionsvektor wird sodann in E. Coli-Bakterien BL21 (DE3) transfiziert (Invitrogen). Die transfizierten BL21- Bakterien werden bis zu der Phase mit logarithmischer Vermehrung gezüchtet, und sodann wird IPTG als Auslöser hinzugefügt. Die Induktion findet statt bei 20ºC über 24 Stunden hinweg. Die Bakterien werden geerntet und aufgelöst. Das lösliche Zell- Lysat wird mit GSH-konjugierter Sepharose 4B (GSH-Sepharose 4B) inkubiert. Das GST-cGB-PDE5-Fusionsprotein kann sich an die GSH-Sepharose-Kügelchen anlagern, und andere Proteine werden von den Kügelchen mit übermäßigem, kalten PBS weggewaschen.
Das exprimierte GST-cGB-PDE5-Fusionsprotein wird auf einem 7,5%-SDS-PAGE- Gel als ein 85 Kd-Protein dargestellt. Es ist gekennzeichnet durch seine cGMP- Bindungsstellen und eine Phosphorylierung durch Proteinkinasen G und A. Es zeigt zwei cGMP-Bindungsstellen, und der Kd-Wert liegt bei 1,6 ± 0,2 uM und damit nahe bei dem Kd-Wert von 1,3 uM der natürlichen Rinder-PDE5. Die GST-cGB-PDE5 auf GSH-konjugierten Sepharose-Kügelchen kann durch cGMP-abhängige Proteinkinase und cAMP-abhängige Proteinkinase A in vitro phosphoryliert werden. Der Km-Wert der GST-cGB-PDE5-Phosphorylierung mittels PKG liegt bei 2,7 uM und Vmax bei 2,8 uM, während der Km Wert der BPDE-Spül-Phosphorylierung (BPDEtide phosphorylation) 68 uM beträgt. Die Phosphorylierung mit PKG zeigt ein Verhältnis von einem molekularen Phosphat eingebaut in ein GST-cGB-PDE5-Protein.
Um eine Flüssigkeitsprobe, von der man glaubt, dass sie PKG enthalte, unter Verwendung der oben beschriebenen, an PDE5 gebundenen festen Phase zu untersuchen, wird die Probe und die feste Phase mit einer Phosphorylierungs- Pufferlösung vermischt, welche ³²P-γ-ATP enthält. Die Lösung wird für 30 Minuten bei 30ºC bebrütet, um der PDE5-Sequenz eine Phosphorylierung durch PKG zu ermöglichen, falls PKG vorliegt. Sodann wird die feste Phase von der Lösung getrennt (bspw. durch Zentrifugierung oder Filterung) und mit einer phosphatgepufferten Salzlösung ("PBS") gewaschen, um jegliche Lösungsreste zu entfernen und sämtliches, nicht reagiertes ³²P-γ-ATP zu entfernen.
Sodann kann die feste Phase direkt untersucht werden (bspw. mit einem Flüssigkeits-Szintillations-Zähler), um festzustellen, ob 32P enthalten ist. Wenn es sich so erweist, so zeigt dies an, dass die Probe PKG enthielt, da PDE5 von PKG phosphoryliert wird. Falls die PDE5 wie oben beschrieben durch das Fusionsprotein gebunden ist, kann das PDE5 enthaltende Fusionsprotein von der festen Phase mit einer SDS-Pufferlösung eluiert werden, und das Elutionsmittel kann auf einen ³²P- Gehalt untersucht werden. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn eine Möglichkeit besteht, dass aridere Proteine existieren, da das Elutionsmittel aufbereitet werden kann (bspw. durch Gel-Trennung), um verschiedene Proteine voneinander zu trennen, so dass die Fusionsprotein-Fraktion auf den ³²P-Gehalt untersucht werden kann. Das phosphorylierte Fusionsprotein kann mit einer SDS- Pufferlösung von der festen Phase eluiert und durch Elektrophorese weiter aufgelöst werden. Wenn eine Gel-Trennung vorgenommen wird, kann man die Proteine färben, um die Position(en) der Proteine zu ersehen, und die ³²P-Phosphorylierung des PDE5-Bereichs des Fusionsproteins durch PKG kann durch Röntgenfilmbelichtung des Gels gemessen werden. Wenn ³²P auf dem Röntgenfilm sichtbar wird, so zeigt dies, dass PKG in der ursprünglichen Probe vorlag, welches den PDE5-Bereich des Fusionsproteins phosphoryliert hat, welches von der festen Phase eluiert wurde.
Bei der Untersuchung sollte man der Test-Pufferlösung vorzugsweise einen Überschuß (bspw. das Hundertfache) eines Proteinkinase-Inhibitors ("PKI") hinzufügen, der die Proteinkinase A ("PKA") spezifisch und wirksam hemmt, ohne PKG zu hemmen. Eine Hemmung der PKA ist wünschenswert, da diese zu der Phosphorylierung des PKG-Substrats (bspw. PDE5) beitragen könnte. Durch Hinzufügen von PKI wird jeglicher Beitrag der PKA zu der Phosphorylierung eliminiert, und jede festgestellte Phosphorylierung ist mit hoher Wahrscheinlichkeit allein auf PKG zurückzuführen.
Für die erfindungsgemäße Untersuchung kann ein Set zusammengestellt werden, der die folgenden, abgepackten Reagentien in getrennten Behältnissen enthält:
1. Zell-Lyse-Pufferlösung: 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na&sub3;VO&sub4;, 1 mM NaF, 500 uM IBMX, Proteinase-Inhibitoren.
2. Festphasensubstrat für Proteinkinase G: Rekombinante GST-cGB-PDE5, gebunden an Sepharose 4B (50% Brei).
3. 2x Phosphorylierungs-Pufferlösung: ³²P-γ-ATP (3000 mCi/mmol, 510 uCi/Test), 10 mM KH&sub2;PO&sub4;, 10 mM K&sub2;HPO&sub4;, 200 uM ATP, 5 mM MgCl&sub2;.
4. PKA-Proteinkinase-Inhibitor.
In dem Set können auch vorbereitete Behälter od. dgl. vorgesehen sein, in welchen die obigen Reaktionen durchgeführt werden können.
Aufgrund der obigen Erläuterungen wird ein mit Analysetechniken vertrauter Fachmann schnell verschiedene Möglichkeiten ins Auge fassen, um die beschriebenen Testformen auf andere Formen zu übertragen. Kurz gesagt, anhand wenigstens einer PDE5-Portion (oder irgendeines anderen Proteins, das durch PKG selektiv phosphoryliert werden kann) läßt sich durch Bewertung der Phosphorylierung des phosphorylierbaren Proteins unter Verwendung eines markierten Phosphorylierungsmittels das Vorliegen und die relative Menge (im Vergleich zu einem Relativwert) von PKG bestimmen.

SAANDs steigern die PKG-Aktivität in neoplastischen Zellen

Unter Verwendung der oben beschriebenen PFG-Untersuchung wurden die folgenden Experimente durchgeführt, um nachzuweisen, dass SAANDs die PKG- Aktivität in neoplastischen Zellen steigern, welche mit einem SAAND behandelt wurden, entweder infolge einer gesteigerten PKG-Expression oder infolge eines Anstiegs der cGMP-Spiegel (oder beides).

Testverfahren

Zwei verschiedene Arten von PDE-Inhibitoren wurden im Hinblick auf ihre Wirkungen auf PKG in neoplastischen Zellen bewertet. Ein SAAND, Exisulind, wurde bewertet, da es anti-neoplastische Eigenschaften hat. Auch ein klassischer PDE5-Inhibitor, der jedoch kein SAAND ist, nämlich E4021, wurde bewertet, um festzustellen, ob der PKG-Anstieg einfach eine Folge der klassischen PDE5-Hemmung war, oder ob der PKG-Anstieg mit dem pro-apoptotischen Effekt in Verbindung stand, den SAANDs bei der Hemmung von PDE5 und der neuartigen, in der am 15. Oktober 1998 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 091173,375 von Liu offenbarten PDE haben.
Um die Wirkung der cGMP-spezifischen Hemmung von Neoplasie mit APC-Mutation zu untersuchen, wurden Dickdarm-Krebs-Zellen SW480 verwendet. SW 480 ist bekannt für die APC-Mutation. Ungefähr 5 Millionen SW480-Zellen in einem RPMI- 5%-Serum werden zu einer jeden von acht Schüsseln hinzugefügt:
2 · 10 cm-Schüsseln --- 30 ul Dimethylsulfoxid-Träger (ohne Präparat) z. Vergleich, 3 · 10 cm-Schüsseln --- 200 uM, 400 uM, 600 uM Exisulind in Dimethylsulfoxid, und 3 · 10 cm-Schüsseln --- E4021; 0,1 uM, 1 uM und 10 uM in Dimethylsulfat.
Diese Schüsseln wurden über 48 Stunden hinweg bei 37ºC in einem 5%-CO&sub2; Inhibitor bebrütet:
Die flüssigen Medien werden von den Schüsseln abgezogen (die Zellen werden sich selbst an den Schüsseln festlegen. Die festhaftenden Zellen werden in jeder Schüssel mit kaltem PBS gewaschen, und 200 ul Zell-Lyse-Pufferlösung (d. h., 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na&sub3;VO&sub4;, 1 mM NaF, 500 uM IBMX mit Proteinase-Inhibitoren) werden jeder Schüssel hinzugefügt. Unverzüglich nach dem Zufügen der Zell-Lyse-Pufferlösung werden die lysierten Zellen durch Abkratzen der Zellen von jeder Schüssel gesammelt. Das Zelf-Lysat von jeder Schüssel wird auf ein Mikro-Zentrifugen-Röhrchen übertragen, und die Mikro-Zentrifugen-Röhrchen werden über 15 Minuten hinweg bei 4ºC bebrütet, die Mikro-Zentrifugen-Röhrchen sanft bewegt werden, um den Zellen ein vollständiges Auflösen zu ermöglichen. Nachdem die Lyse abgeschlossen ist, werden die Mikro- Zentrifugen-Röhrchen über 15 Minuten hinweg mit der vollen Geschwindigkeit zentrifugiert (14.0000 Umdrehungen pro Minute). Das Obenaufschwimmende aus jedem Mikro-Zentrifugen-Röhrchen wird auf ein frisches Mikro-Zentrifugen-Röhrchen übertragen.
Sodann wird eine Protein-Untersuchung des Inhalts jedes Mikro-Zentrifugen- Röhrchens durchgeführt, weil die Menge des gesamten Proteins in der Vergleichslösung größer sein wird als in den mit einem Medikament behandelten Proben, falls das Medikament das Zellwachstum hemmt. Wenn das Medikament seine Arbeit verrichtet, sollte die gesamte Proteinmenge in den mit einem Medikament behandelten Proben offensichtlich virtuell genauso groß sein wie bei der Vergleichslösung. In der obigen Situation erforderten die Mikro-Zentrifugen- Röhrchen mit der Vergleichslösung und, dem E-4021 eine Verdünnung, um sie gegenüber den mit hohen Dosen von Exisulind behandelten Proben zu normalisieren (die niedriger dosierten Gruppen von Exisulind mußten gegenüber der Probe mit der höchsten Exisulind-Dosis normalisiert werden). Nachdem die Protein- Untersuchungen durchgeführt worden sind, muß die gesamte Proteinkonzentration der verschiedenen Proben normalisiert werden (bspw. durch Verdünnung).
Für jede Medikamentenkonzentration und für die Vergleichslösung werden zwei PKG-Untersuchungen durchgeführt, eine unter Zufügen von cGMP und eine ohne Zufügen von cGMP, wie im folgenden ausführlich beschrieben wird. Der Grund für die Durchführung dieser zwei verschiedenen PKG-Untersuchungen liegt darin, dass cGMP spezifisch PKG aktiviert. Wenn die PKG-Aktivität unter Verwendung des neuartigen, erfindungsgemäßen PKG-Testverfahrens untersucht wird, kann man nicht feststellen, ob ein Anstieg der PKG-Aktivität eine Folge de Anstiegs von cGMP in den Zellen ist (was durch eine cGMP-spezifische PDE-Hemmung verursacht sein könnte) oder ob das PKG-Aktivitäts-Niveau eine Folge der gesteigerten Expression des PKG-Proteins ist. Durch Ermittlung der PKG-Aktivität in der Probe sowohl mit als auch ohne zugefügtem cGMP kann man feststellen, ob der Anstieg der PKG- Aktivität, falls ein solcher vorliegt, aus einer gesteigerten PKG-Expression folgt. Sofern ein anti-neoplastisches Medikament die PKG-Aktivität gegenüber einem Vergleichswert anhebt, kann man solchermaßen feststellen, wenn der durch das Medikament ausgelöste Anstieg eine Folge der gesteigerten PKG-Protein- Expression in der mit dem Medikament behandelten Probe ist (im Gegensatz zu einer Aktivierung), falls (1) die mit dem Medikament behandelte Probe mit zusätzlichem cGMP eine größere PKG-Aktivität zeigt als die Vergleichsprobe mit zusätzlichem cGMP, und falls (2) die mit dem Medikament behandelte Probe ohne zusätzliches cGMP eine größere PKG-Aktivität als die Vergleichsprobe zeigt.
Anschließend werden parallele Proben mit und ohne cGMP zubereitet, 50 ul eines jeden Zell-Lysats werden zu 20 ul des oben beschriebenen Breis des PDE5/GST- Festphasensubstrats zugefügt. Für jede, zu bewertende Vergleichsprobe oder Zell- Lysat-Probe wird die Reaktion gestartet, indem jeder Mischung eine Phosphorylierungspufferlösung mit 10 uCl ³²P-γ-ATP-Lösung (200 uM ATP, 4,5 mM MgCI, 5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 5 mM K&sub2;HPO&sub4;) hinzugefügt wird. Die resultierenden Mischungen werden über 30 Minuten hinweg bei 30ºC bebrütet. Sodann werden die Mischungen zentrifugiert, um die feste Phase abzutrennen, und das Obenaufschwimmende wird weggeschüttet. Die feste Phase in jedem Röhrchen wird mit 700 ul kaltem PBS gewaschen. Zu der festen Phase wird eine Laemmli-Proben- Pufferlösung (Bio-Rad) (30 ul) hinzugefügt. Die Mischungen werden für 5 Minuten gekocht und auf 7,5% SDS-PAGE geladen. Das Gel wird über eine Stunde hinweg 150 V ausgesetzt. Die erhaltenen Bänder werden mit Commassie-Blau gefärbt, um die 85Kd-GST-PDE5-Fusionsproeiri-Bänder sichtbar zu machen, falls solche vorliegen. Das Gel wird getrocknet und auf einen Röntgenfilm gelegt, der ein entsprechendes, dunkles Band zeigen wird, falls die PDE5 phosphoryliert ist. Die Dunkelfärbung jedes Bandes steht in einer Beziehung zu dem Phosphorylierungsgrad.
Wie in den Fig. 18A und 18B dargestellt, verursacht das SAAND Exisulind einen Anstieg der PKG-Aktivität in dosisabhängiger Weise in beiden Proben mit und ohne zugefügtem cGMP gegenüber den Vergleichsproben mit und ohne zugefügtem cGMP. Dies ist ersichtlich aus dem dunkleren Erscheinungsbild der 85Kd-Bänder in beiden der mit dem Medikament behandelten Proben. Zusätzlich zeigen die mit Exisulind behandelten SW480-Proben eine größere Phosphorylierungsaktivität bei der Untersuchung mit zugefügtem cGMP gegenüber den Proben, welche allein mit Exisulind behandelt worden sind (d. h., ohne Zufügen von cGMP). Somit ist der Anstieg der PKG-Aktivität bei mit dem Medikament behandelten Proben nicht nur eine Folge der PKG-Aktivierung durch den Anstieg in dem zellulären cGMP, wenn das SAAND die cGMP-spezifische PDE hemmt, sondern der Anstieg der PKG- Aktivität bei einer die APC-Mutation aufweisenden Neoplasie ist auch eine Folge einer gesteigerten PKG-Expression.
Auch die Tatsache, dass die mit E4021 behandelten SW480-Proben gegenüber der Vergleichsprobe keine PKG-Aktivierung erkennen lassen (vgl. Fig. 18A und 18B), zeigt, dass die von den SAANDs bei Neoplasie mit der APC-Mutation hervorgerufene Steigerung der PKG-Aktivität nicht einfach eine Folge der Hemmung klassischer PDE5 ist.
Als Analysetechnik zur Bewertung der PKG-Aktivierung kann anstelle der oben beschriebenen Röntgenfilmbelichtung das 85Kd-Band von dem SDS-PAGE hinsichtlich des Phosphorylierungsgrades ausgewertet werden, indem das Band von dem Gel abgeschnitten wird, und sämtliches in dem entfernten Band enthaltene ³²P kann mit einem Szintillations-(Beta)-Zähler in dem ³²P-Fenster gezählt werden.
Um die Wirkung der Hemmung cGMP-spezifischer PDE bei Neoplasie mit der β- Catenin-Mutation zu testen, wurden Dickdarm-Krebs-Zellen HCT116 verwendet. Es ist bekannt, dass HCT116 die β-Catenin-Mutation enthält, jedoch nicht die APC- Mutation.
Zur Züchtung der HCT16-Zellen wird das selbe Verfahren verwendet wie bei dem oben beschriebenen SW480-Verfahren. Bei diesem Experiment wurden nur Exisulind und Vergleichslösungen verwendet. Die mit Exisulind behandelten Zellen lieferten PKG, die in einem größeren Ausmaß phosphoryliert war als die entsprechenden Vergleichswerte, was darauf hindeutet, dass in den mit Medikamenten behandelten Zellen eine von der APC-Mutation unabhängige PKG- Aktivierung auftrat.
Dabei beziehen wir uns für erfindungsgemäße Zwecke in den Ansprüchen auf "β- Catenin reduzierend", um wilde Arten und/oder mutante Formen dieses Proteins einzubeziehen.

Bestätigung einer gesteigerten PKG-Expression und eines verringerten β-Catenin- Spiegels bei SW480 mittels eines Immunoblots

Wie oben demonstriert, verursachen SAANDs eine Steigerung der PKG-Expression und einen Anstieg des cGMP-Spiegels, und diese beiden Effekte verursachen einen Anstieg der PKG-Aktivität bei mit SAANDs behandelten, neoplastischen Zellen. Dieser Anstieg der PKG-Protein-Expression wurde weiter verifiziert durch einen bedingt quantitativen Immunoblot, wie im folgenden beschrieben wird.
Mit Exisulind wie zuvor beschrieben behandelte SW480-Zellen werden von den Mikro-Zentrifugen-Röhrchen geerntet durch einmaliges Abspülen mit eiskaltem PBS. Die Zellen werden unter Bewegung über 15 Minuten hinweg durch eine modifizierte RIPA-Pufferlösung lysiert. Das Zell-Lysat wird in einem kalten Raum auszentrifugiert. Die obenauf schwimmenden Substanzen werden sofort nach dem Schleudern in frische Mikro-Zentrifugen-Röhrchen übertragen. Ein BioRad-DC-Protein-Test (Temecula, CA) wird durchgeführt, um die Protinkonzentrationen in den Proben festzustellen. Die Proben werden wie oben beschrieben hinsichtlich ihrer Proteinkonzentration normalisiert.
50 ug von jeder Probe werden auf ein 10%-SDS-Gel geladen. Eine SDS-PAGE- Analyse wird durchgeführt, und die Proteine werden sodann auf eine Nitrozellulose- Membran übertragen. Die befleckte Nitrozellulose-Membran wird über eine Stünde hinweg bei Zimmertemperatur in frisch zubereitetem TBST mit fünfprozentiger, fettarmer Trockenmilch unter konstanter Bewegung blockiert.
Ein von Ziegen stammender, primärer Anti-PKG-Antikörper wird in frischem TBST/fünfprozentiger, fettarmer Trockenmilch auf die empfohlene Konzentration/Verdünnung verdünnt. Die Nitrozellulose-Membran wird in der Lösung mit den primären Antikörpern plaziert und eine Stunde lang bei Zimmertemperatur unter Bewegung inkubiert. Die Nitrozellulose-Membran wird dreimal für jeweils 10 Minuten mit TBST gewaschen. Die Nitrozellulose-Membran wird in einer Lösung mit einem von Kaninchen stammendem, sekundären, POD-konjugierten Anti-Ziegen- Antikörper eine Stunde lang bei Zimmertemperatur unter Bewegung inkubiert. Die Nitrozellulose-Membran wird dreimal für jeweils 10 Minuten mit TBST gewaschen. Die Ermittlung wird mit einem BM-Blau-POD-Substrat von Boehringer Mannheim durchgeführt.
Wie in Fig. 19 graphisch dargestellt, verursacht Exisulind einen Abfall des β-Catenins und einen Anstieg von PKG; diese Daten erhielt man durch einen Immunoblot. SW480-Zellen wurden über 48 Stunden hinweg mit Exisulind oder einem Träger (0,1% Dimethylsulfoxid) behandelt. 50 ug des Obenaufschwimmenden von jedem Zell-Lysat wurde auf ein 10%-SDS-Gel geladen und auf eine Nitrozellulose-Membran abgezogen, und die Membran wurde mit von Kaninchen stammenden Anti-β- Catenin- und Anti-PKG-Antikörpern getestet.

SAANDs reduzieren die β-Catenin-Spiegel in neoplastischen Zellen

Diese Beobachtung wurde gemacht durch Kultivieren von SW480-Zellen mit entweder 299, 499 oder 600 uM Exisulind oder mit einem Träger (0,1% Dimethylsulfoxid). Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Behandlung geerntet und für ein Immunoblot-Verfahren aufbereitet. Ein immuno-reaktives Protein kann durch einen Immunoblot erkannt werden. Eine Immunoblot-Analyse zeigte, dass die Expression von β-Catenin bei den mit Exisulind behandelten Zellen um 50% gegenüber dem Vergleichswert reduziert war. Diese Ergebnisse deuten an, dass β- Catenin durch eine Behandlung mit SAANDs reduziert wird. Zusammen mit den obigen Ergebnissen, die nachweisen, dass bei einer derartigen Behandlung die PKG-Aktivität gesteigert wird, und mit den weiter unten folgenden Ergebnissen, die zeigen, dass die Reduktion von β-Catenin durch PKG phosphoryliert wird, läßt sich aus diesen Ergenissen schließen, dass die Reduzierung von β-Catenin in neoplastischen Zellen durch eine Aktivierung der PKG ausgelöst wird. Somit ist die Verwendung der PKG-Aktivität bei Neoplasie als Ausiebungswerkzeug zur Auswahl von Verbindungen als Antineoplastika nützlich.

Die Phosphorylierung von β-Catenin durch PKG

In vitro wird β-Catenin durch PKG phosphoryliert. Dies wird durch ein Experiment nachgewiesen, welches die Immunpräzipitation des β-Catenin enthaltenden Komplexes von (nicht mit einem Medikament behandelten) SW480-Zellen auf eine Weise umfaßt, die weiter unten als "β-Catenin-Immunpräzipitation" beschrieben ist. Noch während der durch Immunpräzipitation ausgefällte Komplex an der festen Phase (bspw. Kügelchen) gebunden ist, wird er mit ³²P-γ-ATP und mit reiner PKG (100 Einheiten) vermischt. Entsprechende Vergleichslösungen ohne Hinzufügung von PKG werden zubereitet.
Das Protein wird mittels einer SDS-Pufferlösung von der festen Phase gelöst, und die Protein enthaltende Mischung wird auf ein 7,5%-SDS-PAGE-Gel gegeben. Das Laufen der Mischung auf dem Gel entfernt ³²P-γ-ATP aus der Mischung. Aus diesem Grund ist sämtliches, in dem 93Kd-β-Catenin-Band gefundene ³²P-γ-ATP eine Folge der Phosphorylierung des β-Catenins. Ein jeglicher Anstieg des in dem mit zusätzlicher PKG behandelten 93Kd-β-Catenin-Band gefundenen ³²P-γ-ATPs gegenüber dem Vergleichswert ohne PKG ist eine Folge der Phosphorylierung des β-Catenins in dem behandelten Band durch die zusätzliche PKG.
Die von uns erhaltenen Ergebnisse waren, dass es bei der Phosphorylierung in dem mit PKG behandelten Band einen bemerkenswerten Anstieg gegenüber dem Vergleichswert gibt, was eine minimale, virtuell nicht erkennbare Phosphorylierung erkennen ließ. Dieses Ergebnis zeigt, dass β-Catenin durch PKG phosphoryliert werden kann.

Die Phosphorylierung von mutantem β-Catenin durch PKG

Das selbe, in dem unmittelbar vorangehenden Abschnitt beschriebene Verfahren wurde auf HCT116-Zellen angewandt, die keine APC-Mutation enthielten, jedoch eine β-Catenin-Mutation. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass auch mutantes β-Catenin durch PKG phosphoryliert wird.
Aus diesem Grund verstehen wir den in den Ansprüchen gebrauchten Begriff "Phosphorylierung von β-Catenin" für die Zwecke der vorliegenden Erfindung so, dass er die Phosphorylierung der wilden Formen und/oder der mutanten Formen dieses Proteins betrifft.

β-Catenin wird mit PKG ausgefällt

Die obenauf schwimmenden Substanzen der Zell-Lysate von SW480 und HCT116 werden auf dieselbe Weise präpariert wie oben bei den Immunoblot-Experimenten beschrieben. Das Zell-Lysat wird vorgeklärt durch Zufügen von 150 ul eines Breies mit Protein-A-Sepharose-Kügelchen (50%) pro 500 ug Zell-Lysat und durch Inkubieren bei 4ºC für 10 Minuten in einem Röhrchen-Schwenker. Die Protein-A- Kügelchen werden durch Zentrifugieren mit 14.000 · g bei 4ºC für 10 Minuten entfernt. Die obenauf schwimmenden Substanzen werden in ein frisches Zentrifugen-Röhrchen übertragen. 10 ug des polyklonalen Anti-β-Catenin- Antikörpers von Kaninchen (Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York) wurden zu 500 ug des Zell-Lysats hinzugefügt. Die Zell-Lysat/Antikörper-Mischung wird 2 Stunden lang bei 4ºC in einem Röhrchen-Schwenker sanft gemischt. Der Immunkomplex wird durch Zufügen von 150 ul eines Breies mit Protein-A- Sepharose-Kügelchen (75 ul dicht gepackte Kügelchen) und durch sanftes Schütteln der Mischung in einem Röhrchen-Schwenker bei 4ºC über Nacht festgelegt. Die Sepharose-Kügeichen werden durch stoßweises Zentrifugieren (5 Sekunden in der Mikr-Zentrifuge bei 14.000 Umdrehungen pro Minute) gesammelt. Die obenauf schwimmende Fraktion wird weggegossen, und die Kügelchen werden 3 mal mit 800 ul einer eiskalten PBS-Pufferlösung gewaschen. Die Sepharose-Kügelchen werden abermals in 150 ul einer 2-fachen Probe-Pufferlösung suspendiert und sanft gemischt. Die Sepharose-Kügelchen werden 5 Minuten gekocht, um die Immunkomplexe von den Kügelchen zu trennen. Die Kügelchen werden durch Zentrifugieren gesammelt und das Obenaufschwimmende wird einer SDS-PAGE- Untersuchung unterzogen.
Von dem Obenaufschwimmenden wird ein Immunoblot erstellt, und sodann wird die Membran mit einem Anti-β-Catenin-Antikörper von Kaninchen untersucht. Daraufhin wird die Membran 3 mal für jeweils 10 Minuten mit TBST gewaschen, um überschüssige Anti-β-Catenin-Antikörper zu entfernen. Ein von Ziegen stammender und mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper wird hinzugefügt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur. Nachdem dies geschehen ist, kann man die Anwesenheit von β-Catenin mit einem Meerrettich-Peroxidase-Substrat sichtbar machen. Bei diesem Experiment konnten wir die Anwesenheit von β-Catenin klar sichtbar machen.
Um auf der selben Membran PKG zu entdecken, wird zunächst das Anti-β-Catenin- Antikörper-Konjugat von der Membran gestreift durch halbstündiges Einwirken einer 62 mM einer Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 7,6) mit 2% SDS sowie 100 uM 253- Mercaptoethanol in einem 55ºC warmen Wasserbad. Die abgestreifte Membran wird sodann in TBST mit fünfprozentiger, fettarmer Trockenmilch eine Stunde lang bei Raumtemperatur sowie unter Bewegen der Membran blockiert. Anschließend wird die blockierte, abgestreifte Membran mit einem polyklonalen Anti-PKG-Antikörper von Kaninchen (Calbiochem, LaJolla, CA) untersucht, der mit einem von Ziegen stammenden, sekundären und mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Anti- Kaninchen-Antikörper erkannt wird. Die Anwesenheit von PKG auf der befleckten Membran wird mit einem Meerrettich-Peroxidase-Substrat sichtbar gemacht. Bei diesem Experiment wurde PKG in der Tat sichtbar gemacht. Setzt man voraus, dass die einzigen Proteine auf der Membran diejenigen sind, welche mit β-Catenin durch Immunpräzipitation aus den obenauf schwimmenden Zell-Substanzen ausgefällt wurden, so zeigt dieses Ergebnis ganz deutlich, dass PKG physisch an den Proteinkomplex geknüpft war, welcher das β-Catenin in den obenauf schwimmenden Zell-Substanzen enthielt.
Die selbe Immunblot-Membran wurde auch nach Abstreifen mit einem Anti-GSK3-β- Antikörper untersucht, um festzustellen, ob er ebenfalls mit β-Catenin zusammen ausgefällt wurde. Bei diesem Experiment entdeckten wir auch GSK3-β auf der Membran, was darauf hindeutete, dass GSK3-β zusammen mit β-Catenin und PKG ausgefällt wurde, und was nahelegte, dass die drei Proteine ein Teil des selben Komplexes sein könnten. Da GSK3-β und β-Catenin einen Teil des APC-Komplexes in normalen Zellen bilden, so legt dies nahe, dass PKG ein Teil des selben Komplexes sein und an der Phosphorylierung des β-Catenins als Teil jenes Komplexes beteiligt sein könnte.

Antineoplastische pharmazeutische Verbindungen mit cGMP-PDE-Inhibitoren

Wie oben erläutert, ist Exisulind eine Verbindung, die wünschenswerte, antineoplastische Eigenschaften aufweist. Seine Effektivität und Verwendung als Antineoplastikum wurde entdeckt, bevor erkannt wurde, dass die Verbindung durch Hemmung cGMP-spezifischer PDE-Aktivität in neoplastischen Zellen wirkte.
Die Bestätigung, dass das erfindungsgemäße Auswahlverfahren verwendet werden könnte, um Verbindungen für die Behandlung von Menschen auszuwählen, erhielt man u. a. aus klinischen Versuchen mit menschlichen Neoplasie-Patienten. Nach Verständnis der Tatsache, dass Exisulind (in vitro) antineoplastisch ist, dass es das Profil einer wünschenswerten Verbindung hat, welche die erfindungsgemäßen Auswahlkriterien erfüllt, bestätigt der Erfolg der Verbindung bei zwei humanmedizinischen, klinischen Tests, dass andere Verbindungen ausgewählt werden können, welche die erfindungsgemäßen Auswahlkriterien erfüllen.
Wie oben dargelegt, weisen eine Reihe von Neoplasien die APC-Mutation auf U.a. wurde der Nachweis für das erfindungsgemäße Auswahlverfahren in humanmedizinischen, klinischen Tests mit Patienten erbracht, deren Neoplasie die APC- Mutation aufwies.
Die APC-Mutation wurde zuerst bei Patienten mit hereditärer Neoplasie, der adenomatischen Dickdarmpolypose ("APC") entdeckt. Die adenomatische Dickdarmpolypose ist gekennzeichnet durch das Auftreten von Hunderten bis Tausenden von Polypen im Dickdarm während des Teenageralters, und die übliche Therapie besteht in der chirurgischen Entfernung des Dickdarms vor dem Alter von 20.
Der erste klinische Test umfaßte die Behandlung von Patienten unter Verwendung von Exisulind. Bei jenen Studien war bei allen Patienten der Dickdarm bereits entfernt, mit Ausnahme eines kleinen, an das Rektum angrenzenden Abschnitts des Dickdarms (wo das kleine Darmstück festgelegt war), um die Funktionsfähigkeit des Rektums zu erhalten. Im allgemeinen bildet ein solcher Patient jedoch Polypen in dem kleinen, verbleibenden Darmabschnitt, und diese Polypen erfordern eine periodische Entfernung (bspw. durch elektrisches Ausbrennen).
Der Versuch, bei dem Exisulind ausgewählt wurde, war ein Verhütungsversuch, der entwickelt worden war, um die antineoplastischen Eigenschaften des Medikaments durch Vergleich der Häufungszahl der in einem Zeitraum von zwölf Monaten neu gebildeten Polypen bei Gruppen mit dem Medikament und mit einem Plazebo zu bewerten. Annehmbare Patienten waren jene, die zwischen 9 und 44 Polypen pro Jahr bildeten. Bei den Patienten fand eine vollständige Ablatio (Entfernung aller Polypen) zum Beginn der Studien statt, am Ende von 6 Monaten und am Ende von 12 Monaten. Die Studie umfaßte 34 annehmbare Patienten. Exisulind war klinisch und statistisch deutlich besser als das Plazebo im Hinblick auf die Senkung des geschätzten Mittelwerts der jährlichen Polypen-Bildungsrate, die bei den Patienten mit adenomatischer Dickdarmpolypose historisch 9 bis 44 Polypen betragen hatte. Bezogen auf den Mittelwert der in den ersten sechs Monaten der Untersuchung produzierten Polypen entwickelten mit Exisulind behandelte Patienten etwa ein Drittel der Polypen der mit einem Plazebo behandelten Patienten (Mittelwerte 9 Polypen/Jahr bzw. 26 Polypen/Jahr; p = 0,013). Bezogen auf den Mittelwert der in den gesamten zwölf Monaten der Untersuchung produzierten Polypen entwickelten mit Exisulind behandelte Patienten etwa die Hälfte der Polypen der mit einem Plazebo behandelten Patienten (Mittelwerte 18 Polypen/Jahr bzw. 38 Polypen/Jahr; p = 0,020).
Ein getrennter klinischer Test wurde mit männlichen Patienten durchgeführt, die Prostatakrebs hatten, und denen infolgedessen ihre Prostata entfernt worden war. Die Studie wurde bei Patienten mit erkennbaren PSA-Spiegeln (prostataspezifisches Antigen) durchgeführt, welche im Anschluß an eine Prostataexstirpation stiegen und damit eine Rückkehr des Prostatakrebses anzeigten.
96 Patienten wurden in die Prostatakrebs-Untersuchung aufgenommen: Ein Doppelblindversuch mit einem Plazebo für Vergleichszwecke und mit mehreren Zentren, wobei den Medikamente empfangenden Patienten Exisulind in einer Dosierung von 500 mg/Tag verabreicht wurde. Wie weiter unten wiedergegeben, zeigen die Daten eine statistisch deutliche Differenz der PSA-Spiegel zwischen der mit Exisulind behandelten Gruppe und der mit Plazebo behandelten Gruppe. Die PSA-Spiegel bei der mit Exisulind behandelten Gruppe wurden deutlich reduziert im Vergleich zu den PSA-Spiegeln der mit Plazebo behandelten Gruppe. Obwohl ein ansteigender PSA-Spiegel nicht selbst einen Krankheitszustand darstellt, wird er in der Medizinergemeinschaft weithin als ein Ersatzsignal angesehen, das bei solchen Männern das gegenwärtige Wiederauftreten des Prostatakrebses anzeigt.
Zusätzlich zur Durchführung einer Abschätzung anhand der Unterschiede bei den mittleren PSA-Spiegeln zwischen der Exisulind- und der Plazebo-Gruppe als Ganzes umfaßte die Zwischenanalyse eine Untergruppenanalyse. Die Patienten in der Studie wurden in Gruppen mit hohem, mittleren und geringem Risiko eingestuft hinsichtlich ihres Risikos der Entwicklung von Metastasen. Die Klassifikation wurde durchgeführt unter Verwendung der in dem Journal of the American Medical Association (JAMA, 5. Mai 1999, Seiten 1591-97) veröffentlichten Methodenlehre. Um festzustellen, welche Patientenin welche Risikogruppe fielen, wurden einem Forscher historische Medizindaten vorgelegt, dem nicht bekannt war, ob Patienten mit dem Medikament oder einem Plazebo behandelt wurden; er wies die Studienpatienten gemäß der oben erwähnten, veröffentlichten Methode den geeigneten Risikogruppen zu. Die statistische Analyse enthüllte statistisch bedeutsame Unterschiede der mittleren PSA-Spiegel zwischen Exisulind- und Plazebo-Patienten sowohl in der hohen als auch in der mittleren Risikogruppe. Die Daten aus der Prostatastudie sind die folgenden: Tabelle 10 Wirkung von Exisulind auf den mittleren PSA-Spiegel bei Männern nach der Prostataexstirpation mit steigendem PSA
Bei diesen Exisulind-Versuchen und bei verschiedenen anderen Versuchen mit dem Medikament bei anderen Indikationen wurde die Zuverlässigkeit abgeschätzt durch Überwachen widriger Ereignisse (adverse events AEs), klinische Labortests (Hämatologie, Serumchemie und Urinanalyse), Lebenszeichen (Blutdruck, Puls, Atmungsrate, Temperatur und Gewicht), physikalische Untersuchung und obere Endoskopie.
Bei den mit Exisulind durchgeführten klinischen Tests an mehr als 400 Patienten sind bislang keine ausstehenden Sicherheitsanzeigen bekanntgeworden. Exisulind zeigte keinerlei Blutdyskrasie, dosisbegrenzende Übelkeit, oder neurologische oder renale Toxizität, Nebeneffekte, die mit herkömmlichen Chemotherapeutika verbunden sind. Es verursachte auch keinerlei klinisch bedeutsame Änderungen der Lebensfunktionen. In der Tat stellte sich bei paarweisen Biopsie-Untersuchungen von Polypen und normalem Dickdarmgewebe von APC-Patienten heraus, dass Exisulind die Apoptoserate bei Polypen erhöhte, jedoch nicht bei normalem Dickdarmgewebe, was auf minimale Auswirkungen auf das normale Gewebe hindeutet.
Bei Dosen oberhalb der maximal tolerierten Dosis (MTD = 600 mg bei Patienten mit subtotaler Kolektomie; 400 mg bei Patienten mit intaktem Dickdarm; 350 mg bei pädiatrischen Patienten) sind die einzigen festgestellten dosisbegrenzenden, gegenteiligen Ereignisse Anstiege bei den Leberfunktionstests (LFTs), die in einem frühen Behandlungsstadium sichtbar werden. Sobald sie festgestellt werden, sind LFT-Steigerungen schnell reversibel und treten nicht wieder auf, wenn die Dosis abgesenkt wurde. Andere Ereignisse (bspw. gelegentliche Bauchschmerzen) sind typischerweise von kurzer Dauer und von milder und mäßiger Intensität und erfordern kein Unterbrechen oder Herabsetzen der Exisulind-Dosis.
Kurz gesagt, diese Versuche demonstrierten, dass Exisulind eine wirkungsvolle, gut verträgliche, chronische Therapie für die klinische Handhabung von Neoplasie darstellt. Somit illustrieren diese Ergebnisse, dass die Auswahl einer zusätzlichen Verbindung, die u. a. die cGMP-spezifische PDE-Aktivität hemmt (und auch die anderen Auswahlkriterien dieser Erfindung erfüllt), zu einem therapeutisch in vivo wirksamen Medikament führen kann.
Ein zweites Medikament, das ebenfalls erfunden wurde, bevor sich herausstellte, dass sein Wirkungsmechanismus die cGMP-Hemmung umfaßt, und bevor bekannt war, dass es das Auswahlkriterium dieser Erfindung erfüllt, ist (Z)-5-Fluor-2-methyl- (4-pyridyliden)-3-(N-benzyl)indenylessigsäure-hydrochlorid (Verbindung I). Dieses Medikament hat sich bei in vitro- und in vivo-Untersuchungen als Antineoplastikum erwiesen mit Aktivitäten gegen einen weiten Bereich von Neoplasien. Es ist auch zuverlässig bei Tierversuchen und bei einem einzelnen Humanversuch mit eskalierender Dosierung.
Wie ein Fachmann aus den obigen Daten entnehmen kann, läßt sich die Verbindung I bei Tieren sicher in Dosen verabreichen, die weit jenseits der tolerierbaren (und in vielen Fällen toxischen) Dosen herkömmlicher Chemotherapeutika oder antineoplastischer NSAIDs liegen. Beispielsweise führten in einer Untersuchung zur akuten Toxizität bei Ratten einzelne, oral verabreichte Dosen der Verbindung I in einer Menge von 2000 mg/kg (in einem 0,5%-Carboxy-methylzellulose-Träger zu keinerlei beobachtbaren Anzeichen einer Toxizität. Bei 4000 mg/kg wurden die Körpergewichtsfaktoren (body weight gains) leicht reduziert. Eine einzelne, intraperitoneal verabreichte Dosis von 1000 mg/kg führte zu einem reduzierten Körpergewichtsfaktor, wobei einige Tiere aus dieser Gruppe bei der Obduktion Adhäsionen im Bereich des Mesenteriums zeigten.
Bei Hunden führte die Verabreichung der Verbindung I in Kapseln bei 1000 mg/kg zu keinerlei Anzeichen von Toxizität bei der einzigen Gruppe von zwei männlichen und zwei weiblichen Hunden. Infolge der Natur der Kapseln mit der Verbindung I erforderten diese Dosen die Verwendung von 13 Kapseln pro Tier, was als die maximale Anzahl beurteilt wurde, ohne die Tiere Stress auszusetzen. Aus diesem Grund wurden diesen Hunden sieben aufeinanderfolgende Dosen 1000 mg/kg/Tag verabreicht. Zu keinem Zeitpunkt wurden während irgendeiner Dosierungsphase offensichtliche Anzeichen von medikamentenbezogenen Wirkungen beobachtet.
Somit ist die Verbindung I auf der Basis einzelner Dosen nicht akut toxisch. Anhand der Ergebnisse dieser Untersuchungen wurde die orale Letaldosis LD&sub5;&sub0; der Verbindung I größer eingestuft als 1000 mg/kg bei Hunden und 4000 mg/kg bei Ratten, und die intraperitoneale Letaldosis LD&sub5;&sub0; wurde größer eingestuft als 1000 mg/kg in Ratten.
Eine siebentägige Untersuchung bei Ratten zum Auffinden des Dosierungsbereichs, wobei die Verbindung I im Hinblick auf ihre Verabreichung in Dosen von 0, 50, 500 oder 2000 mg/kg/Tag bewertet wurde, ergab keinerlei beobachtbare Toxizitätsanzeichen bei 50 mg/kg/Tag. Bei 500 mg/kg/Tag waren die behandlungsbedingten Effekte begrenzt auf einen Anstieg des absoluten und relativen Lebergewichts bei weiblichen Ratten. Bei 2000 mg/kg/Tag umfaßten die Auswirkungen mühsames Atmen und/oder abnormale Atmungsgeräusche, abnehmende Gewichtsfaktoren und Lebensmittelaufnahme bei männlichen Ratten sowie erhöhte Lebergewichte bei weiblichen Ratten. Weder hämatologische oder chemische Änderungen des Blutes noch irgendwelche mikroskopischen, krankhaften Veränderungen wurden bei irgendeinem Dosierungsniveau beobachtet.
Darüber hinaus wurde bei Ratten ein 28-tägiger Versuch mit 0, 50, 500 und 2000 mg/kg/Tag durchgeführt. Es gab keine abnormalen, auf CP-461 zurückzuführenden, klinischen Beobachtungen, und Änderungen des Körpergewichts, opthalmologische Untersuchungen, hämatologische und chemische Blutwerte und Urinanalysewerte waren unauffällig. Bei der Obduktion konnte man keine makroskopischen Gewebeveränderungen feststellen. Die Organgewichtsdaten enthüllten einen statistisch bemerkenswerten Anstieg des Lebergewichts bei 2000 mg/kg/Tag, und einen statistisch bemerkenswerten Anstieg des Schilddrüsengewichts bei der Gruppe mit 2000 mg/kg/Tag. Die leichten Anstiege bei niedrigeren Dosen waren statistisch nicht bedeutsam. Eine histopathologische Bewertung des Gewebes zeigte das Vorliegen von Spuren follikulärer Zell-Hypertrophie, einer gesteigerten Anzahl von Mitoseerscheinungen(welche auf eine mögliche Zellwucherung hinweisen) in der Schilddrüse und einer gemäßigten zentrilobulären Hypertrophie in der Leber. Diese Veränderungen waren im allgemeinen auf eine kleine Anzahl von Tieren bei der 2000 mg/kg/Tag-Dosis begrenzt, obwohl ein Weibchen bei 500 mg/kg/Tag gesteigerte Mitoseerscheinungen in der Schilddrüse hatte. Die Leberbefunde können auf eine sehr mäßige Stimulation mikrosomaler Enzyme hindeuten, was zu einem erhöhten Metabolismus der Schilddrüsenhormone führt, was wiederum in einer Schilddrüsenstimulierung resultiert. Daraus werden Fachleute erkennen, dass diese Effekte extrem minimal sind im Verhältnis zu denen, die bei vergleichbaren Dosen herkömmlicher Chemotherapeutika oder NSAIDs zu erwarten wären.
Um ferner ein Sicherheitsprofil der Verbindung I zu errichten, wurde eine Untersuchung vorgenommen, um festzustellen, ob die von der Verbindung I ausgelöste Apoptose bei Prostata-Tumorzell-Linien vergleichbar mit ihren Effekten auf von dem normalen Gewebe stammende Prostata-Epithelzellen war. Die für Androgene empfindliche Prostata-Tumorzell-Linie LNCaP (von der Amerikanischen Gewebetyp-Sammlung (Rockville, MD)) wurde unter Standardbedingungen fortgepflanzt unter Verwendung eines RPMI-160-Mediums mit 5% fötalem Kalbsserum und 2 mM Glutamin. Primäre Prostata-Epithelzellkulturen (PrEC) von einer normalen Prostata (von Clonetics Inc. (San Diego, CA)) wurden unter den selben Bedingungen gezüchtet wie die Tumorzell-Linie mit der Ausnahme, dass ein serumfreies, für das Wachstum dieser Zellen optimiertes Medium (Clonetics Inc.) verwendet wurde. Für die Experimente wurden LNCaP- und PrEC-Zellen auf Plättchen mit 96 Vertiefungen ausgesät in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung. Nach 24 Stunden wurden die Zellen entweder mit einem Träger (0,1% Dimethylsulfoxid) behandelt oder mit 50 uM der Verbindung I (freie Basis), gelöst in Dimethylsulfoxid. Nach verschiedenen Einwirkungszeiten des Medikaments (4, 24, 48, 72 oder 99 Stunden) wurden die Zellen aufgelöst und für eine Messung der an Histone angelagerten DNS als Anzeichen für einen apoptotischen Zelltod vorbereitet (vgl. Piazza et al., Cancer Research 57: 2452-2459, 1997).
Fig. 27 zeigt einen zeitabhängigen Anstieg bei der Menge der an Histone angelagerten, fragmentierten DNS in LNCaP-Zellkulturen im Anschluß an eine Behandlung mit 50 uM der Verbindung 1 (freie Basis). Im Gegensatz dazu beeinflußte eine Behandlung von PrEC-Zellen ("normale" Prostatazellen) mit der Verbindung I (50 uM) die DNS-Fragmentierung für bis zu 4 Behandlungstage nicht. Diese Ergebnisse belegen eine selektive Auslösung der Apoptose in neoplastischen Zellen gegenüber normalen Zellen. Dies steht in einem markanten Kontrast zu herkömmlichen Therapeutika, welche Apoptose oder Nekrose in schnell wachsenden normalen und neoplastischen Zellen gleichermaßen auslösen.
Abschließend zum Sicherheitsaspekt produzierte die Verbindung I bei einem humanmedizinischen, klinischen Test mit einzelnen, eskalierenden Dosen im Rahmen einer humanmedizinischen Sicherheitsuntersuchung, wobei das Medikament oral eingenommen wurde, keine bedeutsamen Nebenwirkungen bei irgendeiner Dosis, einschließlich von Dosen oberhalb desjenigen Niveaus, das für die Erzeugung von Anti-Krebs-Wirkungen als notwendig vorhergesagt worden war.
Wie oben angedeutet, zeigt die Verbindung I potentielle antineoplastische Eigenschaften. Der für die Verbindung I erhaltene Wachstumshemmungswert IC&sub5;&sub0; lag für die SW-480-Zell-Linie bei 0,7 uM. Dieses Ergebnis wurde bestätigt durch Bewerten der Verbindung I bei Nagetieren anhand aberrierender Kryptenherde (aberrant crypt foci, "ACF") als Hinweiszeichen auf Karzinogenese (vgl. Bird, Cancer Lett. 37: 147-151, 1987). Dieses etablierte Nagetiermodell der von Azoxymethan ("AOM") ausgelösten Karzinogenese wurde verwendet, um die Wirkungen der Verbindung I (freie Basis und Salz) auf die Entwicklung von Darmkrebs in vivo einzuschätzen. ACF sind Vorzeichen für Darmtumore, und die ACF-Hemmung dient als Voraussage der chemo-präventiven Wirksamkeit.
Bei den Ratten aus diesem Experiment wurde die ACF-Auslösung herbeigeführt nach Injektionen des Karzinogens über zwei aufeinanderfolgende Wochen hinweg. Die Verbindung I wurde eine Woche vor der ACF-Auslösung verabreicht und für die gesamte Dauer des Experiments. Die ACFs wurden nach 5 Behandlungswochen gezählt. Die Verbindung I wurde männlichen Ratten der Gattung "Fisher 344" mit der Rattennahrung oral verabreicht. Die tägliche Nahrungsaufnahme (mg/kg Körpergewicht) variierte während des Untersuchungsverlaufs, und deshalb wurde die Verbindung I in Gramm pro kg der Nahrung bezeichnet, um eine Vergleichsbasis zwischen den Dosen zu ermöglichen. Um festzustellen, ob die Verbindung I einen nachteiligen Effekt auf das Wachstum oder das Fütterverhalten hatte, wurde das Körpergewicht während des Verlaufs des Experiments ermittelt. Die Experimentalgruppen erhielten ein geringeres Gewicht als die Vergleichsgruppen, was auf eine biologische Verfügbarkeit hindeutete. Jedenfalls lagen die Gewichtsdifferenzen unterhalb von 10% und werden nicht als ursächlich für die ACF-Bildung angesehen.
Die freie Basis der Verbindung I hemmte die ACF-Bildung, wie dies durch eine Reduzierung der Krypten pro Darm gemessen wurde. Die Daten sind in Tabelle 11 zusammengefaßt. Mit Ausnahme der Gruppe mit niedrigen Dosen (nur 0,5 g/kg Nahrung) waren die Unterschiede zwischen den Behandlungs- und Vergleichsgruppen erheblich und statistisch bedeutsam bei den 1,0- und 2,0g/kg- Nahrung-Gruppen. Tabelle 11 Die Hemmung aberrierender Kryptenherde durch die Verindung I
Darüber hinaus erfüllte die Verbindung I rückblickend das erfindungsgemäße Auswahlkriterium und war eine der Verbindungen, welche zur Bestätigung der Gültigkeit dieses Auswahlkriteriums verwendet wurden. Beispielsweise zeigt sich bei Anwendung der oben beschriebenen Protokolle auf cGMP-spezifische PDE von HT29-Zellextrakten, dass die Verbindung I einen LC&sub5;&sub0; Wert der Hemmung cGMPspezifischer PDE von 0,68 uM hatte. Seine COX I-Hemmung war (bei 100 uM) kleiner als 25%.
Da sie pro-apoptotisch ist, lag der EC&sub5;&sub0; Wert der DNS-Fragmentierung der Verbindung I bei 15 uM. Zusätzlich ist die prozentuale Apoptose bei SW-480 für die Verbindung I in Tabelle 12 für verschiedene Medikamentenkonzentrationen wiedergegeben. Tabelle 12 Die Auslösung der Apoptose bei HT-29-Zellen von SW-480-Dickdarm- Adenokarzinom-Zellen durch die Verbindung I, morphologisch ermittelt
Die Aktivität der Verbindung I ist nicht begrenzt auf die Aktivität gegen Darmkrebszell-Linien oder Tiermodelle von Darmkrebs. Sie hat einen breiten Bereich von antineoplastischen Wirkungen bei verschiedenen neoplastischen Zell-Linien. Verschiedene Arten menschlicher Krebszell-Linien wurden unter sterilen Bedingungen in einem RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L- Glutamin und doppeltkohlensaurem Natrium vermehrt. Um die wachstumshemmenden Wirkungen der Verbindung I zu ermitteln, wurden die Zellen in Plättchen mit 96 Vertiefungen ausgesät mit einer Dichte von 1000 Zellen Pro Vertiefung. 24 Stunden nach dem Aufgeben auf die Plättchen wurden den Zellen verschiedene Konzentrationen der freien Basis der in Dimethylsulfoxid gelösten Verbindung I (endgültige Konzentration 0,1%) zugeteilt. Die Wirkung des Medikaments auf das Wachstum von Tumorzellen wurde bestimmt unter Verwendung des Neutral-Rot-Zytotoxizitäts-Tests im Anschluß an fünf Tage kontinuierlicher Behandlung. Neutral-Rot ist ein Farbstoff, der über einen ATPabhängigen Transportmechanismus selektiv von lebensfähigen Zellen aufgenommen wird.
Wie in Tabelle 13 zusammengefaßt, zeigte die Verbindung I (freie Basis) eine potentielle, wachstumshemmende Eigenschaft, wenn sie gegenüber einem Plättchen kultivierter menschlicher Zell-Linien von verschiedenen Gewebequellen bewertet wurde. Die Verbindung I zeigte vergleichbare wachstumshemmende Wirkungen unabhängig von der Histogenese des Tumors, von welchem die Zell-Linien stammten. Der GI&sub5;&sub0;-Wachstumshemmungswert (diejenige Konzentration des Medikaments, welche das Wachstum gegenüber der Vergleichsprobe um 50% hemmt) wurde für alle Zell-Linien zu 1-2 uM berechnet.
Zusätzlich zu den in der unten folgenden Tabelle eingetragenen Daten beobachteten wir eine vergleichbare Sensibilität bei menschlichen Leukämie-Zell-Linien (CCRF- CEM, K562 und Molt-4), einer Myelom-Zell-Linie (RPM18226), einer Bauchspeicheldrüsen-Tumor-Zell-Linie (PAN-1) und einer Eierstock-Tumor-Zell-Linie (OVCAR-3) gegenüber der Verbindung I (HCl-Salz). Tabelle 13 Die Wachstumshemmung verschiedener menschlicher Tumor-Zell-Linien durch die Verbindung I
* Wo nicht durch ein Sternchen angezeigt wird, dass der Test mit dem HCl-Salz durchgeführt wurde, wurde der Test mit der freien Basis der Verbindung durchgeführt.
Wenn die tierischen und menschlichen Sicherheitscharakteristika und die Wirksamkeit der Verbindung I bei Tieren und sehr weitgestreuten Zellkulturen gegeben sind, so ist klar, dass Verbindungen, welche die erfindungsgemäßen Auswahlkriterien erfüllen (einschließlich der Hemmung cGMP-spezifischer PDE), nützliche antineoplastische Therapeutika darstellen.
Um zusätzliche, cGMP-spezifische PDE hemmende Verbindungen strukturell zu identifizieren, die als Antineoplastika therapeutisch wirksam sein können, findet der Fachmann in der hiesigen Offenbarung eine Anzahl nützlicher Modellverbindungen (wie auch deren durch Bezugnahme eingeschlossenen Analogsubstanzen), die auf einem Computer als Basis für die Bildung von Modellen zusätzlicher Verbindungen mit den selben Entsprechungen, jedoch chemischen Abweichungen verwendet werden können. Bspw. enthält eine Software wie bspw. die von Molecular Simulations Inc. Herausgegebenen Programme WebLab® ViewerProTM Möglichkeiten zur molekularen Visualisierung und chemische Verbindungsmöglichkeiten. Eine solche Software enthält eine Funktionalität einschließlich der 3D-Darstellung bekannter, aktiver Verbindungen, um entworfene oder importierte chemische Strukturen auf ihre Gültigkeit genau zu überprüfen. Zusätzlich erlaubt diese Software die Überlagerung von Strukturen anhand vom Anwender definierter Merkmale, und der Anwender kann Entfernungen, Winkel oder Flächenwinkel messen.
Da die Strukturen oder anderen, aktiven Verbindungen oben offenbart sind, kann man mit dieser Software in dieser Situation Techniken der Clusteranalyse sowie 2D- und 3D-Suchfunktionen einsetzen, um potentiell neue, zusätzliche Verbindungen zu identifizieren, die sodann anhand der erfindungsgemäßen Auswahlkriterien durchgekämmt und ausgewählt werden können. Diese Software-Verfahren bauen auf das Prinzip, dass Verbindungen, die ähnlich aussehen oder ähnliche Eigenschaften haben, mit größerer Wahrscheinlichkeit eine ähnliche Aktivität entfalten, was anhand des erlindungsgemäßen Auswahlkriteriums bestätigt werden kann.
Wenn solche Verbindungen auf einem Computer modelliert werden, können in ähnlicher Form viele solche Verbindungen und Abwandlungen davon synthetisiert werden unter Verwendung bekannter, kombinatorischer Chemie-Technologien, die von Fachleuten der Pharmaindustrie üblicherweise verwendet werden. Beispiele einiger Mietdienstleistungen für kombinatorische Chemie umfassen die von den folgenden Firmen angebotenen: New Chemical Entities, Inc. von Bothell Washington; Protogene Laboratories, Inc. aus Palo Alto; Axys, Inc. aus San Francisco Süd, Kalifornien; Nanosyn, Inc. aus Tucson, Arizona; Trega, Inc. aus San Diego, Kalifornien und RBI, Inc. aus Natick, Massachusetts. Es gibt eine Reihe weiterer Mietfirmen. Eine Anzahl großer pharmazeutischer Firmen haben ähnliche, wenn nicht sogar überlegene Möglichkeiten im Hause. Kurz gesagt, ein Fachmann kann schnell viele Verbindungen erzeugen für ein Aussiebeverfahren, anhand dessen vielversprechende Verbindungen für die Behandlung von Neoplasie ausgewählt werden können, und welche die Attribute der hier offenbarten Verbindungen haben. Für eine weitere Hilfestellung bei der Identifikation von Verbindungen, die durchgekämmt und sodann anhand des erfindungsgemäßen Kriteriums ausgewählt werden können, ist die Kenntnis der Bindung der ausgewählten, antineoplastischen Verbindungen an das PDE5-Protein von Interesse. Durch die oben beschriebenen Verfahren wurde gefunden, dass zu bevorzugende, erwünschte Verbindungen, welche das erfindungsgemäße Auswahlkriterium erfüllen, sich an dem cGMP-katalytischen Bereich der PDE5 anlagern.
Um dies nachzuweisen, wurde eine Verbindung verwendet, die den katalytischen Bereich nicht enthielt. Ein weg zur Erzeugung einer derartigen Sequenz ist, jene Sequenz als Fusionsprotein zu exprimieren, vorzugsweise mit Glutathion-S- Transferase ("GST"), aus Gründen, die noch ersichtlich werden.
Ein RT-PCR-Verfahren wird verwendet, um den cGB-Bereich der PDE5 mit Vorwärts- und Rückwärts-Startern zu erhalten, welche aus der PDESA-cDNS- Sequenz von Rindern entwickelt worden sind (McAllister-Lucas L. M. et al., J. Biol. Chem. 268, 22863-22873, 1993), und die Auswahl unter den PDE 1-10-Familien. 5'- 3', Inc. -Sets für die gesamte RNS, gefolgt von einer oligo-(dT)-Säulenreinigung der mRNS werden in Verbindung mit HT-29-Zellen verwendet. Ein Vorwärts-Starter (GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G, 203-227) und ein Rückwärts-Starter (CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 1664-1686) werden verwendet, um das 1484 bp-Fragment zu synthetisieren, das die Phosphorylierungsstelle und sowohl die cGMP-Bindungsstelle mit hoher als auch die mit niedriger Affinität für menschliche PDESA kodiert (203-1686 bp, cGB-PDE5). Das synthetisierte cGB-PDE5-Nukleotid-Fragment kodiert für 494 Aminosäuren mit 97% Ähnlichkeit mit Rinder-PDESA. Diese wird sodann zu einem pGEX-5X-3-Glutathion- S-Transferase(GST)-Fusionsvektor (Pharmacia Biotech) geklont mit einem tac- Promotor sowie Eco R1- und Xho1-Schnittstellen. Der Fusionsvektor wird sodann in E. Coli-Bakterien BL21 (DE3) transfiziert (Invitrogen). Die transfizierten BL21- Bakterien werden bis zu der Phase mit logarithmischer Vermehrung gezüchtet, und sodann wird IPTG als Auslöser hinzugefügt. Die Induktion findet statt bei 20ºC über 24 Stunden hinweg. Die Bakterien werden geerntet und aufgelöst. Das lösliche Zell- Lysat wird mit GSH-konjugierter Sepharose 4B (GSH-Sepharose 4B) inkubiert. Das GST-cGB-PDE5-Fusionsprotein kann sich an die GSH-Sepharose-Kügelchen anlagern, und andere Proteine werden von den Kügelchen mit übermäßigem, kalten PBS weggewaschen.
Das exprimierte GS T -cGB-PDE5-Fusionsprotein wird auf einem 7,5%-SDS-PAGE- Gel als ein 85 Kd-Protein dargestellt. Es ist gekennzeichnet durch seine cGMP- Bindungsstellen und eine Phosphorylierung durch Proteinkinasen G und A. Es zeigt zwei cGMP-Bindungsstellen, und der Kd-Wert liegt bei 1,6 ± 0,2 uM und damit nahe bei dem Kd-Wert von 1,3 uM der natürlichen Rinder-PDE5. Die GST-cGB-PDE5 auf GSH-konjugierten Sepharose-Kügelchen kann durch cGMP-abhängige Proteinkinase und cAMP-abhängige Proteinkinase A in vitro phosphoryliert werden. Der Km-Wert der GST-cGB-PDE5-Phosphorylierung mittels PKG liegt bei 2,7 uM und Vmax bei 2,8 uM, während der Km-Wert der BPDE-Spül-Phosphorylierung (BPDEtide phosphorylation) 68 uM beträgt. Die Phosphorylierung mit PKG zeigt, dass das molekulare Phosphat in dem GST-cGB-PDE5-Protein in einem 1 : 1-Verhältnis eingebaut ist.
Interessante Verbindungen werden einem cGMP-Bindungs-Test (Francis S. H. et al.; J. Biol. Chem. 255, 620-626, 1980) unterzogen in einem Gesamtvolumen von 100 ul mit 5 mM einer Natriumphosphat-Pufferlösung (pH = 6,8), 1 mM EDTA, 0,25 mg/ml BSA, H³-cGMP (2uM, NEN) und dem GST-cGB-PDE5-Fusionsprotein (30 ug/Test). Jede zu testende Verbindung wird zur selben Zeit hinzugefügt wie das ³H-cGMP- Substrat, und die Mischung wird eine Stunde lang bei 22ºC inkubiert. Sodann wird die Mischung auf ein Brandel MB-24-Zell-Erntegerät mit GFIB als Filtermembran übertragen, gefolgt von 2 Wäschen mit 10 ml einer kalten 5mM-Kalium-Pufferlösung (pH-Wert 6,8). Daraufhin werden die Membranen herausgeschnitten und in Szintillations-Glasfläschchen übertragen, gefolgt von dem Zufügen von 1 ml H&sub2;O und 6 ml Ready-SafeTM-Flüssigkeits-Szintillations-Cocktail zu jedem Glasfläschchen. Die Glasfläschchen werden auf einem Beckman-LS-6500-Szintillationszähler gezählt.
Für die Berechnung werden Nullproben angefertigt durch Kochen des Bindeproteins für 5 Minuten, und die Bindungen zählen < 1% im Vergleich zu dem ungekochten Protein. Das Abschrecken durch die Filtermembran und andere Partikel wird ebenso geeicht.
PDE5-Inhibitoren, Sulfid, Exisulind, Verbindung B, Verbindung E, E4021 und Zaprinast sowie Analogstoffe von zyklischen Nukleotiden, cAMP, zyklisches IMP, 8- Brom-cGMP, zyklisches UMP, zyklisches CMP, 8-Brom-cAMP, 2'-O-Butyl-cGMP und 2'-O-Butyl-cAMP werden ausgewählt, um zu untersuchen, ob sie sich im Wettbewerb an die cGMP-Bindungsstellen des GST-cGB-PDE5-Proteins anlagern können. Die Ergebnisse sind in Fig. 24 dargestellt. cGMP bindet das GST-cGB-PDE5-Protein spezifisch. Zyklisches AMP, cUMP, cCMP, 8-Brom-cAMP, 2'-O-Butyl-cAMP und 2'- O-Butyl-cGMP traten bei der Bindung nicht in Wettbewerb mit cGMP. Zyklisches IMP und 8-Brom-cGMP in hoher Konzentration (100 uM) können partiell mit der Bindung von cGMP (2 uM) konkurrieren. Keiner der PDE5-Inhibitoren zeigte irgendein Wettbewerbsverhalten mit cGMP bei der Bindung an GST-cGB-PDE5. Deshalb lagern sie sich nicht an die cGMP-Bindungsstellen der PDE5 an.
Verbindung E bindet sich jedoch konkurrierend (mit cGMP) an PDE5 (d. h., Spitze A). (Die Verbindung E bindet sich auch konkurrierend (mit cGMP) an die PDE-Spitze B.) Vorausgesetzt, dass sich Verbindung E nicht an der cGMP-Bindungsstelle der PDE5 anlagert, bedeutet die Tatsache, dass es eine konkurrierende Bindungen zwischen E und cGMP gibt, dass wünschenswerte Verbindungen wie die Verbindung E sich an der cGMP-Katalysestelle der PDE5 anlagern, eine Information, die von einem Fachmann schnell gewonnen wird (anhand von Experimenten mit konkurrierenden Bindungen), die einem Fachmann jedoch dabei behilflich sein kann, schnell andere Verbindungen zu modellieren. Demnach kann ein Fachmann anhand der hier offenbarten chemischen Strukturen erwünschter Verbindungen und mit der Information über die cGMP-Bindungsstelle andere chemische Verbindungen für die Verwendung als Therapeutika modellieren, identifizieren und auswählen (unter Verwendung der erfindungsgemäßen Auswahlkriterien).

Claims

1. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung zur Behandlung von Neoplasie, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

- Bestimmung der Cyclooxygenase (COX) hemmenden Wirkung der Verbindung;

- Bestimmung der PDE2-Hemmungswirkung der Verbindung; und

- Auswahl derjenigen Verbindung zur Behandlung von Neoplasie, deren COX hemmende Wirkung niedriger ist als die PDE2- Hemmungswirkung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswahl der Verbindung weiterhin festgestellt wird, ob die Verbindung das Tumorzellenwachstum in einer Kultur neoplastischer Zelten hemmt; und Auswahl derjenigen Verbindung, bei der eine Hemmung des Wachstums neoplastischer Zellen auftritt, zur Behandlung von Neoplasie.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bewertung der Hemmung des Wachstums ermittelt wird, ob die Verbindung Apoptosis hervorruft.

4. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung zur Behandlung von Neoplasie, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

- Bestimmung der das Wachstum neoplastischer Zellen hemmenden Wirkung der Verbindung;

- Bestimmung der PDE2-Hemmungswirkung der Verbindung; und

- Auswahl derjenigen Verbindung, die eine das Wachstum neoplastischer Zellen hemmende Wirkung und eine PDE- Hemmungswirkung zeigt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, ferner gekennzeichnet durch die Untersuchung, ob die Erfindung bei neoplastischen Zeilen Apoptosis hervorruft; und Auswahl derjenigen Verbindung, die Apoptosis hervorruft.

6. Verfahren nach Anspruch 5, ferner gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Bestimmung der Cyclooxygenase (COX) hemmenden Wirkung der Verbindung; und Auswahl derjenigen Verbindung, bei welcher die COX hemmende Wirkung niedriger ist als die PDE hemmende Wirkung der Verbindung.

7. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung zur Behandlung von Neoplasie, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: Bestimmung der PDE2 hemmenden Wirkung der Verbindung und Auswahl der Verbindung mit einer derartigen Hemmungwirkung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auswahl ferner untersucht wird, ob die Verbindung in einer neoplastischen Zelle Apoptosis hervorruft, und Auswahl der Verbindung mit einer Apoptosis hervorrufenden Wirkung.

9. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung für die Behandlung von Neoplasie, umfassend die Untersuchung der Cyclooxygenase (COX) hemmenden Wirkung der Verbindung; und Ermittlung der PDE- Hemmungswirkung der Verbindung, wobei die PDE gekennzeichnet ist durch:

a) Spezifität für zyklisches GMP gegenüber zyklischem AMP;

b) positives gemeinsames kinetisches Verhalten in Gegenwart eines Substrats aus zyklischen GMP;

c) submicromolekulare Affinität für zyklisches GMP; und

d) Unempfindlichkeit gegenüber einer Inkubation mit einer gereinigten, von zyklischem GMP abhängigen Protein-Kinase;

und Auswahl derjenigen Verbindung, deren COX hemmende Wirkung niedriger ist als ihre die betreffende PDE hemmende Wirkung.

10. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Untersuchung, ob die Verbindung das Tumorzellenwachstum in einer Kultur hemmt; und Auswahl derjenigen Verbindung für die Behandlung von Neoplasie, welche das Tumorzellenwachstum hemmt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Untersuchung, ob die Verbindung bei einer Tumorzelle Apoptosis auslöst; und

b) Auswahl derjenigen Verbindung zur Behandlung von Neoplasie, welche Apoptosis auslöst.

12. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung für die Behandlung von Neoplasie, umfassend die Untersuchung der wachstumshemmenden Wirkung der Verbindung; und Ermittlung der PDE-Hemmungswirkung der Verbindung, wobei die PDE gekennzeichnet ist durch:

a) Spezifität für zyklisches GMP gegenüber zyklischem AMP;

c) submicromolekulare Affinität für zyklisches GMP; und

und Auswahl derjenigen Verbindung, die sowohl eine wachstumshemmende Wirkung als auch eine die betreffende PDE hemmende Wirkung zeigt.

13. Verfahren zum Aussieben einer zur Behandlung von Neoplasie geeigneten Verbindung, umfassend die Untersuchung der PDE hemmenden Wirkung einer Testverbindung, wobei die PDE gekennzeichnet ist durch:

a) Spezifität für zyklisches GMP gegenüber zyklischem AMP;

c) submicromolekulare Affinität für zyklisches GMP; und

und Auswahl derjenigen Verbindung mit einer solchen Hemmungswirkung.

14. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch die Untersuchung, ob die Verbindung in einer Zelte Apoptosis auslöst, und Auswahl der Verbindung mit Apoptosis auslösender Wirkung.

15. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch die Untersuchung, ob die ausgewählte Verbindung die Prostaglandinsynthese hemmt, sowie weitere Auswahl derjenigen Verbindung mit unerheblicher Hemmungswirkung auf die Bildung von Prostaglandin.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkung auf PDE festgestellt wird durch Isolieren der cGMP-spezifischen PDE-Menge von einer Zelllinie neoplastischer Zellen, welche eine PDE5 sowie die neue PDE enthält, Hemmen der PDE5-Wirkung, indem das kombinierte PDE-Isolat einem PDE5-Inhibitor ausgesetzt wird bei einer Konzentration, welche die neue PDE nicht hemmt, und Ermittlung der Hemmungswirkung der Testverbindung gegenüber der verbleibenden cGMP-Wirkung, wodurch die Hemmungswirkung der Testverbindung gegenüber der neuen PDE festgestellt wird.

17. Isolierte Phosphodiesterase, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

a) Spezifiät für zyklisches GMP gegenüber zyklischem AMP;

c) submicromolekulare Affinität für zyklisches GMP; und

d) Unempfindlichkeit gegenüber einer Inkubation mit einer gereinigten, von zyklischem GMP abhängigen Protein-Kinase.

18. Isolierte Phosphodiesterase nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einer Aktivitätsmenge klassischer PDE5 durch Anionenaus-auschtChromatographie abgetrennt wird.

19. Isolierte Phosphodiesterase nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie nicht in erheblichem Umfang durch Calcium/Calmodulin aktiviert wird.

20. Isolierte Phosphodiesterase nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie unempfindlich istgegenüber Rolipram, Vinpocetin und Indolidan.

21. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung für die Behandlung einer zu heilenden Neoplasie, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Bewertung der anti-neoplastischen Wirkung der Verbindung gegenüber dem zu behandelnden Neoplasma;

b) Bewertung, ob die Verbindung die Aktiviät der Protein-Kinase G (PKG) in dem zu behandeInden Neoplasma erhöht; und

c) Auswahl derjenigen Verbindung, die sowohl eine anti-neoplastische Aktiviät zeigt als auch die Fähigkeit, eine Erhöhung der PKG-Aktivität in dem zu behandeInden Neoplasma hervorzurufen.

22. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrensschritt einer Abschätzung, ob die Verbindung PDE5 hemmt, und Auswahl derjenigen Verbindung, welche PDE5 hemmt.

23. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrensschritt einer Abschätzung, ob die Verbindung den b-Catenin-Anteil in dem zu behandeInden Neoplasma reduziert, und Auswahl derjenigen Verbindung, welche den b-Catenin-Anteil reduziert.

24. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrensschritt einer Abschätzung, ob die Verbindung die cGMPspezifische Phosphodiesterase ("PDE") hemmt, und Auswahl derjenigen Verbindung, welche PDE hemmt.

25. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrensschritt einer Abschätzung, ob die Verbindung zu einem gesteigerten Exprimieren von PKG führt, und Auswahl einer Verbindung, sofern diese das Exprimieren von PKG steigert.

26. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrensschritt einer Abschätzung, ob die Verbindung zu einer gesteigerten Aktivierung von PKG führt, und Auswahl einer Verbindung, sofern diese die Aktivierung von PKG fördert.

27. Verfahren nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrensschritt einer Abschätzung, ob die Verbindung PDE2 hemmt, und Auswahl derjenigen Verbindung, welche PDE2 hemmt.

28. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung für die Behandlung einer zu heilenden Neoplasie, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Bewertung, ob die Verbindung die PKG-Aktivität in intakten neoplastischen Zetlen des zu behandeInden Neoplasmas erhöht;

b) Abschätzung, ob die Verbindung den b-Catenin-Anteil in neoplastischen Zellen reduziert; und

c) Auswahl derjenigen Verbindung, welche eine Steigerung der PKG- Aktivität in intakten neoplastischen Zellen hervorruft sowie eine Absenkung des b-Catenin-Anteils in dem zu behandeInden Neoplasma.

29. Verfahren zur Identifizierung einer zur Behandlung von Neoplasie geeigneten Verbindung, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

- Auswahl einer Verbindung, welche die PKG-Aktiviät in dem Neoplasma steigert;

- Bewertung der das Wachstum des Neoplasmas hemmenden Wirkung der Verbindung;

wobei eine Verbindung, welche die PKG-Aktivität steigert und eine das Neoplasma-Wachstum hemmende Wirkung hat, die Fähigkeit hat, die Neoplasie zu hemmen, ohne das Wachstum normaler Zeilen zu beeinträchtigen.

30. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung mit der Fähigkeit zur Behandlung von Neoplasie, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

- Bestimmung der Cyclooxygenase (COX) hemmenden Wirkung der Verbindung;

- Feststellung, ob die Verbindung die PKG-Aktivität in neoplastischen Zellen steigert;

wobei eine niedrige COX-Hemmungswirkung und eine Steigerung der PKG- Aktivität anzeigt, dass die Verbindung die Fähigkeit zur Behandlung von Neoplasie hat.

31. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung für die Behandlung von Neoplasie, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

- Bestimmung der das Wachstum neoplastischer Zeilen hemmenden Wirkung der Verbindung;

- Feststellung, ob die Verbindung die PKG-Aktivität in neoplastischen Zeilen steigert;

- Auswahl derjenigen Verbindung, welche eine das. Wachstum neoplastischer Zellen hemmende Wirkung hat und eine Steigerung der PKG-Aktivität in neoplastischen Zellen hervorruft.

32. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung für die Behandlung einer zu heilenden Neoplasie, gekennzeichnet durch die Abschätzung, ob PKG eine Phosphorylierung des β-Catenins in dem mit der Verbindung zu behandeInden Neoplasma hervorruft, und Auswahl derjenigen Verbindung, welche die PKG veranlaßt, β-Catenin zu phosphorylieren, als Verbindung für die Behandlung der zu heilenden Neoplasie.