ES2245465T3 - Dioles de compuestos de norborneno y norbornano para el tratamiento de trastornos de la pigmentacion, enfermedades neurodegenerativas o enfermedades proliferativas de la piel. - Google Patents
Dioles de compuestos de norborneno y norbornano para el tratamiento de trastornos de la pigmentacion, enfermedades neurodegenerativas o enfermedades proliferativas de la piel.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS Y A UNAS COMPOSICIONES PARA REGULAR EL CONTENIDO DE MELANINA DE MELANOCITAS DE MAMIFEROS; DE REGULACION DE LA PIGMENTACION DE LA PIEL, DEL PELO, DE LA LANA O DE PIELES DE MAMIFEROS; DE TRATAMIENTO O PREVENCION DE VARIOS TRASTORNOS CUTANEOS Y PROLIFERANTES; DE INCREMENTO DE LA DIFERENCIACION DE LAS CELULAS DE LAS NEURONAS DE MAMIFEROS PARA TRATAR ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS O DE DETERIORO NERVIOSO Y DE ESTIMULACION DE LA SINTESIS DEL MONOXIDO DE NITROGENO (NO) CELULAR, DE LOS NIVELES DEL ACIDO GUANOSINA - MONOFOSFORICO (GMPC), DE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA QUINASA G (PKG) PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INDUCIDAS POR DEFICIENCIAS EN LA VIA DE TRANSDUCCION DE LA SEÑAL DE NO/GMPC/PKG. DICHOS PROCEDIMIENTOS CONSISTEN EN LA ADMINISTRACION DE VARIOS COMPUESTOS, QUE INCLUYEN ALCOHOLES, DIOLES Y/O TRIOLES Y SUS ANALOGOS.
Description
Dioles de compuestos de norborneno y norbornano
para el tratamiento de trastornos de la pigmentación, enfermedades
neurodegenerativas o enfermedades proliferativas de la piel.
La presente invención se refiere al uso de dioles
de compuestos de norborneno o norbornano en la preparación de un
medicamento para el tratamiento, prevención o alteración de una
enfermedad o afección mediada por deficiencias en la ruta de
transducción de señales NO/GMPc/PKG, la cual se selecciona de
trastornos de hipopigmentación; trastornos proliferativos de la piel
o trastornos de queratinización; trastornos neurodegenerativos;
enfermedad cardiaca, incluyendo angina de pecho estable, angina
inestable, infarto de miocardio, insuficiencia miocárdica asociada a
isquemia miocárdica, ateroesclerosis, hipertrofia vascular y
trombosis; hipertensión; apoplejía; hipertensión pulmonar primaria,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica y síndrome de insuficiencia
respiratoria en adultos; anomalías funcionales microvasculares en
diabetes; irregularidades hemostáticas de la función vascular
glomerular y tubular; trastornos de la función de la vejiga y
relajación del reflejo en la micción; trastornos de liberación de
neurotransmisores, morfogénesis neuronal, plasticidad sináptica y
regulación neuroendocrina; dolor regional, incluyendo dolores de
cabeza por migraña; enfermedad anal benigna; impotencia; inhibición
de crecimiento tumoral; y estimulación de la cicatrización de
heridas.
La patente de los EE.UU. 5.352.440 va dirigida a
aumentar la síntesis de melanina en melanocitos y a aumentar la
pigmentación por administración de ciertos compuestos de tipo
diacilglicerol.
La patente de los EE.UU. 5.532.001 va dirigida a
aumentar la pigmentación en la piel de mamíferos a través de la
administración de ciertos fragmentos de ADN.
La patente de los EE.UU. 5.554.359 va dirigida a
aumentar los niveles de melanina en melanocitos por administración
de agentes lisosomotrópicos.
Krieger (Azzneimittel-Forschung,
vol.18, nº 3, 1968, páginas 324-330) describe el uso
médico de
5-norbornen-2,2-dimetanol
(estructura XI-C) y
2,6-norbornanodiol como coleréticos.
La presente invención proporciona el uso de uno o
más dioles de compuestos de norbornano o norborneno tal y como se
define anteriormente, en la preparación de un medicamento para el
tratamiento, prevención o alteración de una enfermedad o afección
mediada por deficiencias en la ruta de transducción de la señal
NO/GMPc/PKG, la cual se selecciona de trastornos de
hipopigmentación; trastornos proliferativos de la piel o trastornos
de queratinización; trastornos neurodegenerativos; enfermedad
cardiaca, incluyendo angina de pecho estable, angina inestable,
infarto de miocardio, insuficiencia miocárdica asociada a isquemia
miocárdica, ateroesclerosis, hipertrofia vascular y trombosis;
hipertensión; apoplejía; hipertensión pulmonar primaria, enfermedad
pulmonar obstructiva crónica y síndrome de insuficiencia
respiratoria en adultos; anormalidades funcionales microvasculares
en diabetes; irregularidades hemostáticas de la función vascular
glomerular y tubular; trastornos de la función de la vejiga y
relajación del reflejo en la micción; trastornos de liberación de
neurotransmisores, morfogénesis neuronal, plasticidad sináptica y
regulación neuroendocrina; dolor regional, incluyendo dolores de
cabeza por migraña; enfermedad anal benigna; impotencia; inhibición
de crecimiento tumoral; y estimulación de la cicatrización de
heridas:
o
en los
que
cada R_{6} se selecciona independientemente de
hidrógeno; halógeno; o de un grupo que contiene de un átomo a veinte
átomos, uno de los cuales es carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre;
hidroxilo, hidroximetilo, -(CH_{2})_{n}OH,
-(CH_{2})_{n}OR_{1},
-(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CHOH, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CH(OH)R_{1}, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-(CH_{2})_{n}-CH_{2}(OH), -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-
(CH_{2})_{n}-CH(OH)R_{1} o -CH_{2}OR_{3}, en los que cada n es independientemente 0 o un número entero de 1 a 25;
-(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CHOH, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CH(OH)R_{1}, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-(CH_{2})_{n}-CH_{2}(OH), -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-
(CH_{2})_{n}-CH(OH)R_{1} o -CH_{2}OR_{3}, en los que cada n es independientemente 0 o un número entero de 1 a 25;
cada R_{1} se selecciona independientemente de
hidrógeno; halógeno; o de un grupo que contiene de un átomo a veinte
átomos, uno de los cuales es carbono, nitrógeno, oxígeno o
azufre;
cada R_{3} se selecciona independientemente de
hidrógeno o de un grupo acilo o aminoacilo que contiene de un átomo
a veinte átomos, al menos uno de los cuales es carbono, nitrógeno,
oxígeno o azufre;
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
Las Figuras 1A-1D son impresiones
de un sistema de creación de imágenes Oncor Imaging System^{TM} de
muestras de biopsia de piel de cobaya teñidas con
Fontana-Masson, tal y como se describen en el
Ejemplo 5.
La Figura 2 es una serie de gráficas de barras
que describen los resultados de actividad de la estructura obtenidos
en el Ejemplo 7.
Las Figuras 3A-3D son impresiones
de melanocitos y melanosomas epidérmicos humanos normales, tal y
como se describen en el Ejemplo 8.
Las Figuras 4A-4B son
impresiones, tal y como se describen en el Ejemplo 10.
La presente invención se basa en la única
observación singular de que ciertos compuestos inducen melanogénesis
de forma eficaz y eficiente en células de mamífero, lo que acarrea
varias consecuencias. En primer lugar, aumentar la melanogénesis
conduce a aumentar el contenido en melanina de los melanocitos y,
por lo tanto, da lugar a una mayor pigmentación o color oscurecido
de la piel, lana o pelaje. De esta forma, la presente invención es
útil en el tratamiento de trastornos de hipopigmentación, como por
ejemplo albinismo, vitiligo, etcétera. Se cree también que aumentar
la pigmentación de la piel según la presente invención protegerá
dicha piel de un daño posterior por luz ultravioleta, quemadura
solar, fotoenvejecimiento y desarrollo de cánceres de piel.
Finalmente, ya que las composiciones descritas en la presente
memoria descriptiva inducen la diferenciación de una línea celular
de melanoma, la presente invención puede usarse para tratar
trastornos hiperproliferativos como por ejemplo la queratosis
actínica, carcinoma de célula basal, carcinoma espinocelular,
histiocitoma fibroso, dermatofibrosarcoma protuberante, hemangioma,
nevus flammeus, xanotoma, sarcoma de Kaposi, mastocitosis, micosis
fúngicas, lentigo, nevus nevocelular, lentigo maligno, melanoma
maligno y carcinoma metastático.
Las presentes composiciones son útiles también en
el tratamiento de enfermedades caracterizadas por la inflamación e
interrupción de la queratinización, incluyendo la psoriasis común,
psoriasis asociada a eosinofilia, acné juvenil, acné conglobata,
acné fulminante, osteoma cutáneo, acné nodulocístico y acné
cístico.
Los compuestos aumentan también de forma eficaz y
eficiente la diferenciación de células neuronales, incluyendo la
formación y desarrollo de dendritas neuronales y la actividad
tirosina hidroxilasa neuronal, lo que conlleva varias consecuencias.
En primer lugar, aumentar la formación y desarrollo de dendritas
conduce a una mayor comunicación neuronal, aumentando por lo tanto
la función y el rendimiento neuronales. De esta forma, la presente
invención es útil a la hora de tratar enfermedades o trastornos
marcados por la reducción de la formación y desarrollo de dendritas
y función neuronales, incluyendo, pero no limitados a, la enfermedad
de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de
Alzheimer o cualquier otra enfermedad neurodegenerativa, o daño
físico o tóxico sobre las células de los nervios cerebrales,
espinales o periféricos. Además, la presente invención es útil a la
hora de restaurar u optimizar la comunicación, función y rendimiento
neuronales.
En segundo lugar, aumentar la actividad tirosina
hidroxilasa aumenta directamente la síntesis de dopamina. De esta
forma, la presente invención es particularmente útil a la hora de
tratar la enfermedad de Parkinson, la cual está especialmente
marcada por la supresión de síntesis de dopamina.
En tercer lugar, la inducción de diferenciación
neuronal revoca los trastornos proliferativos neuronales. De esta
forma, la presente invención es útil a la hora de tratar trastornos
neuronales proliferativos, tumorosos o cancerosos, o dichos
trastornos en cualquier otro tipo de célula que pueda estar afectada
de forma similar.
Finalmente, ya que las composiciones descritas en
la presente memoria descriptiva inducen la diferenciación, formación
y desarrollo de dendritas y actividad tirosina hidroxilasa en un
modelo de célula neuronal, la presente invención es útil a la hora
de tratar trastornos neurodegenerativos o neuropatías adicionales
incluyendo, pero no limitados a, atrofia cortical cerebral difusa,
demencia con cuerpos de Lewy, enfermedad de Pick, demencia
mesolimbocortical, degeneración del tálamo, corea de Huntington,
degeneración
cortical-estriada-espinal,
degeneración de los ganglios cortico-basales,
degeneración cerebrocerebelosa, demencia común con paraparesis
espasmódica, enfermedad con cuerpos de poliglucosano, síndrome de
Shy-Drager, atrofia olivopontocerebelosa, parálisis
supranuclear progresiva, distonia muscular deformante, enfermedad de
Hallervorden-Spatz, síndrome de Meige, temblores
comunes, síndrome de Pilles de la Tourette, corea acantocítica,
ataxia de Friederich, atrofia cerebelosa cortical familiar de
Holmes, enfermedad de
Gerstann-Straussler-Scheinker,
atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva,
esclerosis lateral primaria, atrofia muscular hereditaria,
paraplejía espasmódica, atrofia muscular peroneal, polineuropatía
intersticial hipertrófica, heredopatía atáctica polineuritiforme,
neuropatía óptica y oftalmoplejía.
Se ha descubierto también que la presente clase
de compuestos mantienen su acción bloqueada por eliminadores de
óxido nítrico (NO), y por inhibidores de guanosina monofosfato
cíclico (GMPc) o inhibidores de la proteína quinasa activada por
GMPc (PKG). Esto indica que estos compuestos actúan a través de la
ruta de transducción de señales NO/GMPc/PKG. A diferencia de
compuestos anteriores como nitroglicerina y dinitrato de isosorbida
que estimulan esta ruta liberando NO tras la reacción con grupos
sulfidrilo intracelulares (Smith y Reynard, 1992, Pharmacology, W.
B. Saunders Co., Filadelfia, PA, pp. 626-31), los
compuestos usados en esta invención parecen actuar por estimulación
directa de la actividad óxido nítrico sintasa (NOS, nitric oxide
synthase), generando de esta forma NO de novo. Mientras que
la depleción de grupos sulfidrilo intracelulares conduce rápidamente
a tolerancia e ineficacia de la nitroglicerina y compuestos
relacionados (Smith y Reynard, 1992), no se adquirirá tolerancia a
los compuestos usados en la presente invención ya que no requieren
la presencia de grupos sulfidrilo para su generación. De esta forma
se contempla que los compuestos usados en la presente invención
proporcionarán un procedimiento de tratamiento alternativo preferido
para afecciones tratadas actualmente con donantes de NO.
Tanto los estudios de aplicación clínica como los
de investigación han demostrado que la estimulación de la ruta
NO/GMPc/PKG es útil para el tratamiento de:
(i) enfermedad cardiaca, incluyendo angina de
pecho estable, angina inestable, infarto de miocardio e
insuficiencia miocárdica asociada a isquemia miocárdica,
ateroesclerosis, hipertrofia vascular y trombosis (Cooe y Dzau,
1997, Annu. Rev. Med. 48:489-509; Thadani,
1997, Cardiovasc. Drugs 10: 735);
(ii) hipertensión (Cooe y Dzau, 1997);
(iii) apoplejía (Samdani et al., 1997,
Stroke 28: 1283-1288);
(iv) hipertensión pulmonar primaria, enfermedad
pulmonar obstructiva crónica y síndrome de insuficiencia
respiratoria en adultos (Adnot y Raffestin, 1996, Thorax
51:762-764; Marriot y Higenbottam, 1997, Schweiz
Med. Wochenschr. 127: 709-714);
(v) anomalías funcionales microvasculares en
diabetes que se relacionan la resistencia a insulina con
hipertensión, trombosis y ateroesclerosis (Tooke et al.,
1996, Diabetes Res. Clin. Pract. 31 Suppl:
S127-S132; Baron, 1996, J. Investig. Med. 44:
406-412);
(vi) irregularidades hemostáticas de la función
vascular glomerular y tubular con consecuencias para el desarrollo
de hipertensión (Kone y Baylis, 1997, Am. J. Physiol. 10:
F561-578; Am. J. Hypertens. 10:
129-140);
(vii) trastornos de la función de la vejiga y
relajación del reflejo en la micción (Andersson, 1996, Curr.
Opin. Obstet. Gynecol. 8: 361-365);
(viii) trastornos de liberación de
neurotransmisores, morfogénesis neuronal, plasticidad sináptica, y
regulación neuroendocrina (Dawson y Dawson, 1996, Neurochem.
Int. 29: 97-110; Brann, et al., 1997,
Neuroendocrinology 65: 385-395);
(ix) dolor regional, incluyendo dolores de cabeza
por migraña (Máshimo, et al., 1997, J. Clin.
Pharmacol. 37: 330-335; Packard y Ham, 1997,
Mar. 37: 142-152);
(x) protección gastrointestinal frente a fármacos
anti-inflamatorios no esteroideos (Rishi, et
al., 1996, Indian J. Physiol. Pharmacol. 40:
377-379);
(xi) enfermedad anal benigna (Gorfine, 1995,
Dis. Colon Rectum 38: 453-456);
(xii) impotencia (Andersson y Stief, 1997,
World J. Urol. 15: 14-20);
(xiii) regulación del daño tisular por radicales
libres (Rubbo, et al., 1996, Chem. Res. Toxicol. 9:
809-820); e
(xiv) inhibición de crecimiento tumoral,
apoptosis tumoral, angiogénesis y metástasis
(Pipili-Synetos, et al., 1995, Br. J.
Pharmacol. 116: 1829-1834; Xie, et al.,
1996, J. Leukoc. Biol. 59:797-803); y
(xv) estimulación de la cicatrización de heridas
incluyendo cortes, daño en tendones y daño térmico (Schaffer, et
al., 1996, J. Surg. Res. 63: 237-240;
Murrell, et al., 1997, Inflamm. Res.
46:19-27; Carter et al., 1994, Biochem.
J. 304 (Pt 1): 201-04).
Además, la ruta NO/GMPc/PKG media la
melanogénesis inducida por luz ultravioleta
(Romero-Graillet, et al., 1996, J. Biol.
Chem. 271: 28052-28056;
Romero-Graillet, et al., 1997, J. Clin.
Invest. 99:635-642) y por dioles alifáticos y
alicíclicos (solicitud de patente de los EE.UU. s. n., titulada
"Dermatological Compositions and Methods", publicada de forma
adjunta).
Los compuestos activos usados en la presente
invención tienen las estructuras descritas anteriormente. Más
preferiblemente cada R_{1} se selecciona independientemente de
hidrógeno; fluoro; cloro; o alquilo
C_{1}-C_{20}, alquenilo
C_{2}-C_{20}, alquinilo
C_{2}-C_{20}, aralquilo
C_{7}-C_{20}, aralquenilo
C_{8}-C_{20}, aralquinilo
C_{8}-C_{20} o arilo
C_{6}-C_{20}, cada uno de los cuales puede
contener uno o más heteroátomos diferentes o heteroátomos del mismo
tipo, o carboxilo, carboxamido, carbalcoxi, sulfamido, sulfonamido;
hidroxilo, o amino. Más preferiblemente cada R_{3} se selecciona
independientemente de hidrógeno o acilo
C_{1}-C_{18}, el cual puede contener uno o más
heteroátomos diferentes o heteroátomos del mismo tipo.
La preparación de los presentes compuestos
quedaría clara para los expertos en la técnica y muchos de ellos
están disponibles en el mercado. Los compuestos representativos
preferidos incluyen, pero no se limitan a:
5-norbornen-2,2-dimetanol
norbornan-2,2-dimetanol
2,3-norbornanodiol (exo o endo o
cis o trans)
2,3-cis-exo-norbornanodiol
2-endo-hexadecilamino-5-norbornen-2,3-exo-dimetanol
2-(propil-1,2-diol)-norbornano
Los compuestos particularmente preferidos usados
en esta invención
5-norbornen-2,2-dimetanol;
norbornan-2,2-dimetanol;
2,3-cis-exo-norbornanodiol,
2-(propil-1,2-diol)-norbornano.
Las composiciones usadas en la presente invención
contemplan el uso de uno o más de los compuestos mencionados
anteriormente como ingrediente activo para diversos usos. En una
realización preferida, el/los ingredientes acti-
vo(s) se combina(n) con un vehículo aceptable para formar una formulación tópica que puede situarse sobre la piel para usos dermatológicos. Las formulaciones tópicas pueden incluir pomadas, lociones, pastas, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos, champúes, polvos y parches transdérmicos. Pueden usarse espesantes, diluyentes, emulsionantes, ayudas dispersantes y aglutinantes tal y como resulte necesario. Preferiblemente, una función del vehículo es potenciar la penetración en la piel del/de los ingrediente(s) activo(s), y debería ser capaz de suministrar el/los ingrediente(s) activo(s) a los melanocitos en condiciones in vivo. Los expertos en la técnica conocen bien los vehículos adecuados, e incluyen liposomas, etanol, dimetilsulfóxido (DMSO), gelatina de petróleo (vaselina), aceite mineral (vaselina líquida), agua, dimetilformamida, decaoxietilen-oleiléter, ácido oleico, 2-pirrolidona y potenciador de penetración marca Azone® (Upjohn). Una composición particularmente preferida incluye un/unos ingrediente(s) activo(s) tal y como se ha descrito anteriormente, con uno de 2-pirrolidona, ácido oleico y/o Azone® como potenciador de penetración, solubilizado(s) en una base de agua, etanol, propanol y/o propilenglicol (el último componente que tenga propiedades de un vehículo, potenciador de penetración y un ingrediente activo tal y como se ha descrito en la presente memoria descriptiva). Dependiendo de la aplicación específica, las composiciones de la presente invención pueden incluir también otros ingredientes activos, así como ingredientes inertes o inactivos.
vo(s) se combina(n) con un vehículo aceptable para formar una formulación tópica que puede situarse sobre la piel para usos dermatológicos. Las formulaciones tópicas pueden incluir pomadas, lociones, pastas, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos, champúes, polvos y parches transdérmicos. Pueden usarse espesantes, diluyentes, emulsionantes, ayudas dispersantes y aglutinantes tal y como resulte necesario. Preferiblemente, una función del vehículo es potenciar la penetración en la piel del/de los ingrediente(s) activo(s), y debería ser capaz de suministrar el/los ingrediente(s) activo(s) a los melanocitos en condiciones in vivo. Los expertos en la técnica conocen bien los vehículos adecuados, e incluyen liposomas, etanol, dimetilsulfóxido (DMSO), gelatina de petróleo (vaselina), aceite mineral (vaselina líquida), agua, dimetilformamida, decaoxietilen-oleiléter, ácido oleico, 2-pirrolidona y potenciador de penetración marca Azone® (Upjohn). Una composición particularmente preferida incluye un/unos ingrediente(s) activo(s) tal y como se ha descrito anteriormente, con uno de 2-pirrolidona, ácido oleico y/o Azone® como potenciador de penetración, solubilizado(s) en una base de agua, etanol, propanol y/o propilenglicol (el último componente que tenga propiedades de un vehículo, potenciador de penetración y un ingrediente activo tal y como se ha descrito en la presente memoria descriptiva). Dependiendo de la aplicación específica, las composiciones de la presente invención pueden incluir también otros ingredientes activos, así como ingredientes inertes o inactivos.
El régimen de dosis dependerá de un número de
factores que se pueden determinar fácilmente, como por ejemplo la
gravedad y capacidad de respuesta de la afección que se va a tratar,
pero serán normalmente una o más dosis por día, con una duración de
tratamiento que dure de varios días a varios meses, o hasta que se
lleve a cabo una cura o se alcance una disminución del estado de la
enfermedad, o se alcance un grado deseado de melanogénesis
(bronceado) desde el punto de vista cosmético, dependiendo de la
aplicación. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las
dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de
repetición. En general, se contempla que las formulaciones tópicas
(como por ejemplo cremas, lociones, soluciones, etcétera) tendrán
una concentración de ingrediente activo desde aproximadamente un
0,01% a aproximadamente un 50%, preferiblemente desde
aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 10%. En general, se
contempla que las composiciones en forma de dosificación unitaria
según la presente invención contendrán desde aproximadamente 0,01 mg
a aproximadamente 100 mg de ingrediente activo, preferiblemente
aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg de ingrediente
activo.
Otro aspecto de la presente invención se basa en
la observación de que los compuestos objeto que estimulan la
producción de melanina actúan a través de la ruta óxido
nítrico/guanosina monofosfato cíclico/proteína quinasa G
("NO/GMPc/PKG"). De esta forma, la presente invención incluye
los compuestos descritos anteriormente, los cuales actúan a través
de la ruta NO/GMPc/PKG para estimular la síntesis de melanina
aumentando la producción celular de NO, GMPc o PKG. A la inversa,
los agentes que disminuyen la producción celular de NO, GMPc o PKG
disminuirán o suprimirán la producción de melanina y la pigmentación
en la piel, pelo, pelaje o lana de mamífero. Esto es útil en, por
ejemplo, el aclarado de la piel, pelo, lana o pelaje con fines
cosméticos, o el tratamiento de hiperpigmentación o trastornos de
pigmentación desigual como por ejemplo el vitiligo, melanocitosis
dérmica, síndrome de Franceschetti-Jadassohn,
etcétera. Para tales aplicaciones de despigmentación, la formulación
y dosificación sería tal y como se ha descrito anteriormente con
respecto a la aplicaciones de pigmentación.
El descubrimiento de la ruta a través de la que
los compuestos presentes actúan conduce también a procedimientos
para rastrear compuestos para ver la actividad y potencia
melanogénicas, o para ver su capacidad para reducir o suprimir la
melanogénesis, basados en la medida de generación de óxido nítrico
(NO) o en la medida de la actividad de síntesis de óxido nítrico
(NOS). Los procedimientos para la medida de NO o NOS incluyen, pero
no se limitan a, los siguientes procedimientos bien conocidos. La
medida de NO se basa normalmente en el hecho de que el NO se
descompone rápidamente a nitrato y nitrito en solución acuosa. La
nitrato-reductasa se añade a los medios de cultivo o
extractos celulares para asegurar una conversión completa de nitrato
a nitrito. Los reactivos de Griess (sulfanilamida y
N-[1-naftil]-etilendiamina) se
añaden entonces para convertir el nitrito en un compuesto azo
púrpura intenso que absorbe a un máximo de 540 nm (Schmidt, et
al., 1995, Biochemica 2: 22). Las reacciones se llevan a
cabo típicamente en un formato de 96 pocillos con lectura de
absorbancias en un lector de placas de microtitulación. De forma
alternativa, después de la conversión de nitrato a nitrito tal y
como se ha descrito anteriormente, se añade el reactivo DAN
(2,3-diaminonaftaleno) seguido de NaOH que convierte
el nitrito en el compuesto fluorescente
1(H)-naftotriazol. Éste se mide
fluorimétricamente con excitación a 365 nm y emisión a 450 nm,
típicamente en un formato de 96 pocillos (Miles, et al.,
1995, Methods 7:40). La actividad NOS se mide añadiendo
[^{3}H]-arginina a tejidos intactos o extractos
proteicos, y midiendo la liberación del tritio resultante de la
conversión de arginina a citrulina durante la formación enzimática
de NO por NOS (Baudouin y Tachon, 1996, J. Invest. Dermatol.
106: 428-431). De forma alternativa, la producción
de GMPc o actividad de PKG puede usarse como herramienta de rastreo.
El GMPc puede medirse por inmunoensayo disponible en el mercado
(véase Romero-Graillet, et al., 1996, J.
Biol. Chem. 271: 28052-28056). PKG puede medirse
por quitación dependiente de GMP cíclico de una histona primaria
diana (véase Hidaka, et al., Biochemistry 1984, 23,
5036-5041).
El uso de y las características útiles y
novedosas de las presentes composiciones se entenderán aún más a la
vista de los siguientes ejemplos no limitantes.
(No forma parte de la
invención)
La línea celular de melanoma de ratón Cloudman
S91 se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC,
American Type Culture Collection). Se hizo un cultivo de células en
un medio de Eagles modificado según Dulbecco (DMEM, Dulbecco's
Modified Eagles Medium) que contenía suero fetal bovino al 10%,
L-glutamina 2 mM, 10 U de penicilina/ml y 10 \mug
de estreptomicina/ml según un protocolo publicado previamente
(Eller, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:
1087-92, 1996). Para ensayar con propilenglicol y
análogos para inducir melanogénesis, se colocaron en placas células
S91 a razón de 10^{5} células/placa de 35 mm en suero fetal bovino
al 10%. Un día después de la colocación en placas, se retiraron los
medios y se reemplazaron con medios que contenían suero fetal bovino
al 2% y compuestos de ensayo (Eller, et al., 1996). Las
células se cultivaron durante 6 días a 37ºC en CO_{2} al 5% en una
incubadora humidificada. Después de este período de tratamiento, las
células se examinaron microscópicamente y se estimó la parte de
células desdiferenciadas y diferenciadas. Estudios previos han
mostrado que las células S91 desdiferenciadas tienen un aspecto
redondeado, alargado mientras que la células S91 diferenciadas
tienen un aspecto aplanado, en forma de cubo, multipolar y
dendrítico (Orlow, et al., Exp. Cell Res. 191:
209-218,
1990).
1990).
Después de este examen microscópico, las células
se separaron de las placas con tripsina. El tiempo requerido para la
separación con tripsina se registró como un indicador adicional de
los efectos fenotípicos de los compuestos de ensayo. Para cada
tratamiento, se hizo un recuento de una submuestra de células para
determinar los efectos de los compuestos de tratamiento sobre la
proliferación celular. El sobrante celular se usó para una
determinación del contenido en melanina. La melanina se extrajo de
células agitando en vórtex durante 15 minutos en NaOH 1 N. Los
patrones se prepararon disolviendo melanina (Sigma) en NaOH 1 N
(Eller, et al., 1996). La absorbancia de los patrones y las
muestras se midió a 475 nm. La melanina de expresó como pg de
melanina/célula.
Las Tablas 1 y 2 a continuación muestran los
resultados obtenidos cuando se ensayan las formulaciones que
contienen diversas concentraciones de
1,2-propanodiol como ingrediente activo. En el
control, no se añadió compuesto de ensayo al medio.
\vskip1.000000\baselineskip
| Concentración | Células (x10^{6}) | \mug de melanina | pg de melanina/célula |
| Control | 0,48 | 2,52 | 5,3 |
| 1% (136 mM) | 0,52 | 4,88 | 9,4 |
| 2% (272 mM) | 0,50 | 6,24 | 12,5 |
| 3% (408 mM) | 0,20 | 4,03 | 20,2 |
| 4% (544 mM) | 0,10 | 4,01 | 40,1 |
| 5% (680 mM) | 0,08 | 2,31 | 28,9 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Concentración | Redondeadas alargadas | Aplanadas con forma | Tiempo de separación |
| de cubo | por tripsinización | ||
| Control | 100% | \leq 3 min | |
| 1% (136 mM) | 90% | 10% | \leq 6 min |
| 2% (272 mM) | 70% | 30% | \leq 9 min |
| 3% (408 mM) | 40% | 60% | \leq 12 min |
| 4% (544 mM) | 15% | 85% | \leq 15 min |
| 5% (680 mM) | 100% | \leq 15 min |
(No forma parte de la
invención)
Se siguió el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 1, excepto en que se usaron etanol e isómeros de propanodiol
y butanodiol como compuestos de ensayo los resultados se exponen a
continuación en las Tablas 3 y 4. Los resultados demuestran que
varios isómeros de propanodiol y butanodiol inducen melanogénesis y
diferenciación de células de melanoma S91. Tanto el propanodiol 50
mM (PG) como el butanodiol 50 mM (BD) dieron lugar a un aumento
aproximado de la melanogénesis de 1,5 veces, mientras que 150 mM dio
lugar a aproximadamente un aumento de 2 veces después de un solo
tratamiento. Mientras que el 1,2-propanodiol
(PG-1,2) y el
(S)-(+)-1,2-propanodiol
(PG-S-1,2) no dieron lugar a una reducción de la
proliferación celular a los niveles usados en este experimento,
1,3-propanodiol (PG-1,3),
2,3-butanodiol (BD-2,3) o
1,3-butanodiol (BD-1,3) dieron lugar
a una reducción de los números de células en una tercera parte.
Además, los butanodioles parecían dar lugar a una mayor
diferenciación de células S91 que los propanodioles, tal y como
evidenciaban unos cambios morfológicos más prematuros y mayores, y
en el caso de BD-2,3, un fenotipo más adherente. El
etanol (EtOH) no tuvo efecto sobre las células a 340 nm pero resultó
tóxico ala concentración de 850 mM tal y como indica la baja
supervivencia celular. El etanol no indujo melanogénesis a ninguna
concentración ensayada. El glicerol (G) sólo tuvo un ligero efecto
sobre la melanogénesis y diferenciación a las concentraciones
ensayadas en este experimento, lo que indica que los trioles pueden
ser inductores de estos fenotipos menos eficaces que los dioles.
| Células (x10^{6}) | \mug de melanina | pg de melanina/célula | |
| Control | 0,100 | 1,17 | 11,7 |
| EtOH^{1} al 1,0% | 0,104 | 1,14 | 11,0 |
| EtOH^{2} al 2,0% | 0,100 | 1,25 | 12,5 |
| EtOH^{3} al 5,0% | 0,032 | 0,17 | 5,3 |
| PG-1,2 50 mM | 0,084 | 1,31 | 15,6 |
| PG-1,2 150 mM | 0,072 | 1,73 | 24,0 |
| PG-S-1,2 50 mM | 0,088 | 1,51 | 17,1 |
| PG-S-1,2 150 mM | 0,080 | 2,04 | 25,5 |
| PG-1,3 50 mM | 0,064 | 1,31 | 20,4 |
| PG-1,3 150 mM | 0,044 | 1,04 | 23,6 |
| G 50 mM | 0,092 | 1,03 | 11,2 |
| G 150 mM | 0,084 | 1,09 | 13,0 |
| BD-2,3 50 mM | 0,072 | 1,12 | 15,6 |
| BD-2,3 150 mM | 0,040 | 0,95 | 23,8 |
| BD-1,3 50 mM | 0,064 | 0,99 | 15,5 |
| BD-1,3 150 mM | 0,048 | 0,87 | 18,1 |
| ^{1}170 mM | |||
| ^{2}340 mM | |||
| ^{3}850 mM |
\vskip1.000000\baselineskip
| Redondeadas alargadas | Aplanadas con forma | Tiempo de separación | |
| de cubo | por tripsinización | ||
| Control | 100% | 3 min | |
| EtOH al 1,0% | 100% | 3 min | |
| EtOH al 2,0% | 100% | 3 min | |
| EtOH al 5,0% | 100% | 3 min | |
| PG-1,2 50 mM | 75% | 25% | 3 min |
| PG-1,2 150 mM | 50% | 50% | 6 min |
| PG-S -1,2 50 mM | 75% | 25% | 3 min |
| PG-S -1,2 150 mM | 50% | 50% | 6 min |
| PG-1,3 50 mM | 75% | 25% | 3 min |
| PG-1,3 150 mM | 50% | 50% | 6 min |
| G 50 mM | 100% | 3 min | |
| G 150 mM | 75% | 25% | 3 min |
| BD-2,3 50 mM | 25% | 75% | 3 min |
| BD-2,3 150 mM | 100% | 9 min | |
| BD-1,3 50 mM | 25% | 75% | 3 min |
| BD-1,3 150 mM | 100% | 6 min |
La melanogénesis es el rasgo más característico
de la diferenciación de melanocitos (J. Cell Sci. 107:
1095-1103, 1994) y, se correlaciona de forma inversa
con la tasa de proliferación en las líneas celulares de melanoma
(Neoplasia 31: 545-9, 1984; Biochem.
Biophys. Res. Commun. 177: 545-50, 1991;
Exp. Dermatol. 4: 192-198, 1995). Como norma
general, una proliferación aumentada que corresponde a la
proliferación es una señal de un rápido avance tumoral y una pobre
prognosis, mientras que una proliferación y diferenciación
disminuidas son indicativas de una supervivencia más a largo plazo
(Introduction to the Cellular and Mollecular Biology of
Cancer, L. M. Franks y N. Teich, 1987, Oxford University Press).
De esta forma, la capacidad de los presentes compuestos para inducir
melanogénesis y ralentizar el crecimiento celular es indicativa de
su capacidad para actuar como agentes quimioterapéuticos. La
inducción de melanogénesis combinada con una tasa reducida de
proliferación celular es indicativa de inducción de diferenciación
en células S91. Además, el cambio de morfología celular de un
aspecto redondeado alargado es una indicación más de diferenciación
en células S91 (Exp. Cell Res. 191: 209-218,
1990). De esta forma, los compuestos de la presente invención no son
solamente agentes bronceadores, sino que también son agentes
quimioterapéuticos capaces de retrasar el avance tumoral y de
aumentar la supervivencia a largo plazo.
Se debería apreciar que los efectos del
propilenglicol (Ejemplo 1) y de dioles y trioles relacionados
(Ejemplos 1 & 2) sobre células S91 son idénticos a aquellos que
resultan del tratamiento de células S91 con retinoides; eso es,
inducción de melanogénesis, inducción de diferenciación, adherencia
aumentada e inhibición de proliferación (Laukharanta, et al.,
Arch. Dermatol. Res. 277: 147-150, 1985).
Dada esta similitud de respuestas biológicas, se cree que los
agentes descritos en la presente memoria descriptiva son eficaces a
la hora de tratar aquellos trastornos tratados actualmente con los
retinoides, incluyendo una serie de formas como por ejemplo la
psoriasis, acné y dermatosis.
Se siguieron los mismos procedimientos que en los
Ejemplos 1 y 2 para examinar el efecto de compuestos adicionales
sobre la melanogénesis en células S91. Los resultados descritos en
la Tabla 5 muestran la concentración de un número de compuestos
requeridos para inducir una melanización dos veces mayor o superior
en células S91. Muchos compuestos son más potentes que aquellos
descritos en los Ejemplos 1 y 2. Por ejemplo,
2,3-piridinodiol fue potente a 100 \muM;
1,4-dioxan-2,3-diol
y \beta-estradiol a 500 \muM;
5-norbornen-2,2-dimetanol
a 5 mM;
3,3-dimetil-1,2-butanodiol
y 1,2-cis-ciclopentanodiol a 10 mM; y
2,3-dimetil-2,3-butanodiol
a 25 mM. Todos los compuestos recogidos en la Tabla 5, excepto el
1,4-dioxan-2,3-diol,
indujeron la transformación de células S91 de una morfología
redondeada bipolar a una morfología aplanada en forma de cubo
multipolar relacionada con la inducción de melanogénesis; esto
indica su utilidad potencial como agentes quimioterapéuticos que
actúan induciendo la diferenciación de células tumorales. Todos los
compuestos recogidos en la Tabla 5, excepto el
5-norbornen-2,2-dimetanol,
\beta-estradiol y
2,3-piridinodiol, indujeron un tiempo de
tripsinización aumentado relacionado con la inducción de
melanogénesis; las alteraciones de las propiedades de adherencia
están relacionadas con cambios del potencial metastático de células
tumorales.
| Compuesto | Concentración requerida para una inducción | |
| de melanina en células S91 \geq2 veces | ||
| 2,3-piridinodiol* | 100 \muM | |
| 1,4-dioxan-2,3-diol* | 500 \muM | |
| \beta-estradiol* | 500 \muM | |
| 5-norbornen-2,2-dimetanol | 5 mM | |
| 1,2-cis-ciclopentanodiol* | 10 mM | |
| 3,3-dimetil-1,2-butanodiol* | 10 mM | |
| 2,3-dimetil-2,3-butanodiol* | 25 mM | |
| 1,2-trans-ciclopentanodiol* | 50 mM | |
| 2-metil-1,3-propanodiol* | 50 mM | |
| 2,3-butanodiol* | 100 mM | |
| 1,2-propanodiol* | 150 mM | |
| *Compuestos comparativos |
Los compuestos comparativos, además de aquellos
descritos en los Ejemplos 1 y 2, que no indujeron una melanogénesis
significativa (aumento de 2 o más veces) en células S91 cuando se
ensayaron a lo largo de un intervalo de concentraciones hasta una
dosis tóxica, incluían: 1-propanol;
2-propanol; ácido oleico;
2-fenil-1,2-propanodiol;
1,3-ciclohexanodiol; ácido tartárico, ácido
ascórbico; Azone®, 2-pirrolidona;
D-ribosa;
2-desoxi-D-ribosa;
N-metil-D-glutamina;
hidroximetiluracilo; y cloruro de tetrabutilamonio. De estos
ejemplos, solamente la 2-pirrolidona dio lugar a una
profunda diferenciación morfológica de células S91, lo que indica
que puede aumentar la melanogénesis y/o ejercer actividad
antitumorigénica en ausencia de melanogénesis.
Los inhibidores H7 de PKC
(1-[5-isoquinolinil-sulfonil]-2-metil-piperazina)
y D-esfingosina indujeron también melanogénesis en
células S91. Además, estos inhibidores de PKC potenciaron la
melanogénesis inducida por propilenglicol en células S91. Estos
resultados indican que el propilenglicol no induce melanogénesis por
inducción de PKC, o que requiere PKC para la inducción de
melanogénesis.
Se examinaron melanocitos epidérmicos humanos
normales (MEHN) para ver la inducción de melanogénesis usando
células y medios procedentes de Clonetics Corporation (San Diego,
California).las células se cultivaron exactamente tal y como
especificaba el suministrador. En base a una inducción de un aumento
de melanina en MEHN de 1,5 veces, el componente más potente
examinado fue el 2,3-piridinediol a 200 \muM,
seguido por
5-norbornen-2,2-dimetanol
a \leq 5 mM,
3,3-dimetil-1,2-butanodiol
a 12,5 mM y
2,3-dimetil-2,3-butanodiol
y 1,2-cis-ciclopentanodiol a 50 mM (Tabla 6). La
D-ribosa resultó inactiva en MEHN cuando se
ensayaron a lo largo de un intervalo de concentraciones hasta una
dosis tóxica. Estos resultados muestran que los compuestos de la
presente invención que muestran actividad en células S91, muestran
también actividad en melanocitos humanos normales.
| Compuesto | Concentración requerida para una inducción | |
| de melanina en MEHN S91 \geq 1,5 veces | ||
| 2,3-piridinediol* | 200 \muM | |
| 5-norbornen-2,2-dimetanol | 5 mM | |
| 3,3-dimetil-1,2-butanodiol* | 12,5 mM | |
| 1,2-cis-ciclopentanodiol* | 50 mM | |
| 2,3-dimetil-2,3-butanodiol* | 50 mM | |
| 1,2-propanodiol* | 150 mM | |
| *Compuestos comparativos |
Los compuestos se ensayaron para ver la actividad
melanogénica in vivo por aplicación a cobayas americanas de
pelo corto. Los lugares de tratamiento se crearon por eliminación de
pelaje usando un depilatorio marca Nair®. Los compuestos se
aplicaron en volúmenes de 25 \mul dos veces al día durante 5 días
a cada lugar de tratamiento tal y como se indica en la Tabla 7. En
la Tabla, los números presentados son la tasa relativa de
melanogénesis (media \pm DE) y se ordenan según la localización
relativa en el animal, estando la cabeza a la izquierda y la cola a
la derecha. Propilenglicol (PG = 13,6 M),
2,3-butanodiol (2,3-BD = 10,95 M) y
1,2-cis-ciclopentanodiol (1,2-cis-CPD = 10,7 M) se
aplicaron como soluciones con todos sus complementos.
3,3-dimetil-1,2-butanodiol
(3,3-M-1,2-BD) se
aplicó como una solución 4M disuelta en etanol. Dos semanas después
de la finalización de los tratamientos, se tasó de forma subjetiva
el grado de pigmentación según la siguiente escala:
| 0 | sin cambios |
| 0,5 | ligero oscurecimiento, no fácilmente apreciable |
| 1 | ligero oscurecimiento, fácilmente apreciable |
| 2 | oscurecimiento uniforme moderado |
| 3 | oscurecimiento uniforme importante |
| 4 | oscurecimiento uniforme profundo |
Los resultados presentados a continuación
mostraron que se daba una disminución progresiva de respuesta a los
agentes bronceadores desde la cabeza a las colas de los animales. La
magnitud de esta respuesta disminuida fue de 3 a 4 veces. De esta
forma, las comparaciones entre los compuestos del tratamiento se
hicieron de forma relativa a las localizaciones similares sobre el
cuerpo de cobayas. El propilenglicol dio lugar a una melanogénesis
significativa relativa a los controles tratados con depilatorio
localizados en la misma posición relativa del cuerpo. El
2-metil-1,3-propilenglicol
y el 2,3-butanodiol resultaron sólo ligeramente
mejores agentes melanogénicos que el propilenglicol. Sin embargo, el
3,3-dimetil-1,2-butanodiol
y 1,2-cis-ciclopentanodiol dieron lugar a una melanogénesis
4,5 veces y 5,5 veces mayor que PG aplicado en localizaciones
similares del cuerpo.
| (no forma parte de la invención) | |||
| Tratamiento | |||
| PG, 5 días (n = 6): | |||
| 1,04 \pm 0,21 | 0,83 \pm 0,17 | 0,25 \pm 0,09^{1} | 0,33 \pm 0,1 |
| 5 días (n = 3): | |||
| 2-M-PG | 2,3-BD | 2-M-PG | 2,3-BD |
| 1,25 \pm 0,52 | 1,33 \pm 0,17^{2} | 0,58 \pm 0,08^{2} | 0,25 \pm 0,14 |
| 5 días (n = 3): | |||
| Nair | PG | 3,3-M-1,2-BD | 1,2- cis -CPD |
| 0^{2} | 0,50 \pm 0,25 | 1,16\pm 0,66^{2} | 1,83 \pm 0,33^{2} |
| ^{1}P < 0,05 relativo a la cabeza más cercana al lugar tratado con PG en la primera fila | |||
| ^{2}P \begin{minipage}[t]{145mm} < 0,05 relativo al lugar tratado con PG en la primera fila que está localizado en la misma posición relativa a la cabeza y cola.\end{minipage} |
Con el fin de minimizar los efectos de
disminución de respuesta desde la cabeza a las colas de los
animales, todos los experimentos venideros se hicieron usando
solamente los lugares de experimento localizados hacia las colas de
los animales. Considerado como adicionalmente beneficioso, en esta
región del animal las diferencias de capacidad de respuesta a
inductores de pigmentación fuertes y débiles, tal y como se deduce
del cultivo celular, fueron las mayores. La comparación de las tasas
de pigmentación de estos lugares de tratamiento mostró el siguiente
orden descendiente de inducción: 1,2-cis-ciclopentanodiol
(1,2-cis-CPD) 8,7 M >
3,3-dimetil-1,2-butanodiol
4 M (3,3-M-1,2 BD) > una mezcla
de 1,2-propilenglicol (1,2-PG) 8,5
M/5-norbornen-2,2-dimetanol
(5-NBen-2,2-DM) 1
M/2-pirrolidona al 2% (2-P; un
potenciador de penetración) >
5-NBen-2,2-DM
1M/2-P al 2% >
2-metil-1,3-propilenglicol
(2-M-1,3-PG) 11,3 M
(Tabla 8; Figura 1A: no tratada; 1B: 1,2-PG 10,6
M/2-P al 2%; 1C: 1,2-cis-CPD 8,7 M; 1D:
5-NBen-2,2-DM
1M/1,2-PG 8,5 M/2-P al 2%). En esta
región de los animales, las respuestas a 1,2-PG
13,61 M; 1,2-PG 10,6 M/2-P al 2% y
a
2,3-dimetil-2,3-butanodiol
11 M no fueron significativamente diferentes de los lugares control
(tratados con Fair o 2-P al 2%). Las tasas de
pigmentación se corrigieron para conservar unos antecedentes
(lugares de tratamiento control), normalizadas respecto a 1 M para
justificar las cantidades diferentes de cada agente aplicado, y
normalizadas después respecto a los resultados para
1,2-PG (Tabla 8). Esta comparación mostró que el
orden decreciente de inducción fue
5-NBen-2,2-DM >
1,2-cis-CPD >
2-M-1,3-PG, y, que
el usar 1,2-PG como vehículo para
5-NBen-2,2-DM
(Figura 1D) aumentó la capacidad de respuesta de este compuesto. Se
anticipa que mejoras adicionales en la formulación mejorarán
adicionalmente la capacidad de respuesta respecto a
5-NBen-2,2-DM y a
otros compuestos en esta invención. Los resultados de las biopsias
(Figura 1) mostraron que la inducción de melanogénesis se marcó por
el depósito de melanina en los queratinocitos, en algunos casos con
formación de "depósitos supranucleares" (flechas, Figuras 1C
& 1D) indicativas de la inducción de una verdadera melanogénesis
natural protectora de luz UV (Gates, R. R., y A. A. Zimmermann, 1953
J. Invest. Dermatol. 21:339-348), y una
ausencia completa de inflamación, fibrosis o cualquier otra forma de
daño tisular.
| Tratamiento | Tasa de | Antecedentes | Normalizado | Normalizado |
| pigmentación | corregidos | respecto a 1 | respecto a | |
| M | 1,2-PG | |||
| No potenciador de penetración | ||||
| Nair | 0,08 \pm 0,05 | 0 | ||
| (n = 6) | ||||
| 1,2-PG 13,61 | 0,29 \pm 0,09 | 0,21 \pm 0,03 | 0,015 \pm 0,002 | 1,0 \pm 0,1 |
| M** | (n = 12) | |||
| 2,3-M-2,3-BD | 0,25 \pm 0,14 | 0,17\pm 0,09 | 0,015 \pm 0,008 | 1,0 \pm 0,6 |
| 11,0 M** | (n = 3) | |||
| 2-M-1,3-PG | 0,58 \pm 0,08* | 0,50 \pm 0,07 | 0,044 \pm 0,006 | 2,9 \pm 0,4 |
| 11,3 M** | (n = 3) | |||
| 1,2-cis-CPD | 1,89 \pm 0,27* | 1,75 \pm 0,25 | 0,202 \pm 0,029 | 13,5 \pm 1,9 |
| 8,7 M** | (n = 9) |
| Tratamiento | Tasa de | Antecedentes | Normalizado | Normalizado |
| pigmentación | corregidos | respecto a 1 | respecto a | |
| M | 1,2-PG | |||
| No potenciador de penetración | ||||
| 3,3-M-1,2-BD | 1,17 \pm 0,44* | 1,09 \pm 0,41 | 0,272 \pm 0,102 | 18,1 \pm 6,8 |
| 4,0 M** | (n = 3) | |||
| 2-pirrolidona la 2% como potenciador de penetración | ||||
| 2P | 0,17 \pm 0,08 | 0 | ||
| (n = 6) | ||||
| 1,2-PG10,6 | 0,33 \pm 0,05 | 0,16 \pm 0,02 | 0,015 \pm 0,002 | 1,0 \pm 0,15 |
| M/2P** | (n = 6) | |||
| 5-NBen-2,2 | 0,66 \pm 0,05* | 0,49 \pm 0,04 | 0,490 \pm 0,037 | 32,7 \pm 2,5 |
| DM 1,0 M/2P | (n = 6) | |||
| 1,2-PG 8,5 | 1,00 \pm 0,13* | 0,83 \pm 0,11 | 0,670 \pm | 44,7 \pm 5,8 |
| M/2P/5- | (n = 6) | 0,087^{1} | ||
| NBen-2,2-DM | ||||
| 1,0 M | ||||
| *P < 0,05; prueba de la t de Students | ||||
| **Compuestos comparativos | ||||
| ^{1} Antecedentes adicionales corregidos para pigmentación inducida por 1,2-PG/2P (0,16). |
Se examinaron los compuestos para ver su
capacidad para inducir actividad tirosinasa en células de melanoma
de ratón S91. La tirosinasa es la enzima limitante de la velocidad
en la ruta melanogénica. Su medida proporciona una indicación
altamente específica y sensible del grado de inducción de
melanogénesis por los compuestos de ensayo. Todas las condiciones de
cultivo celular y tratamientos fueron tal y como se describe
anteriormente en los Ejemplos 1-3. Siguiendo a los
tratamientos, las células se tripsinizaron, se contaron en un
Coulter, se sedimentaron por centrifugación a 1000 x g y se
analizaron para ver la actividad tirosinasa usando modificaciones de
procedimientos previamente descritos (Pomerantz, S. H., 1966, J.
Biol. Chem. 241: 161-168; Jara, et al.,
1988, Pigment Cell Res. 1: 332-339).
Brevemente, los sedimentos celulares se solubilizaron sonicando
durante 5 segundos en 600 \mul de tampón fosfato 50 mM a pH 6,8
que contenía un 0,5% Triton-X100, seguido de
agitación en vórtex, incubación en hielo durante 30 minutos, y
después vuelta a agitar en vórtex. A partir de esto, se combinaron
alícuotas de 200 \mul con 200 \mul de mezcla de reacción que
contenía tirosina 75 \muM, L-Dopa 75 \muM y
L-[3,5-^{3}H]tirosina 2 \mu Ci en
NaPO_{4} a pH 6,8 (L-Dopa +), o tirosina 75 \muM
y L-[3,5-^{3}H]tirosina 2 \mu Ci en
NaPO_{4} a pH 6,8 (L-Dopa -) y se incubaron 1 hora
a 37ºC. Las reacciones se pararon por adición de 400 \mul de
carbón vegetal activado al 10% en HCl 0,1 N e incubación en hielo
durante 15 minutos. Esta mezcla se centrifugó a 17.300 x g durante 5
minutos, y entonces se filtraron 400 \mul de sobrenadante a través
de una unidad de filtración centífuga GV Durapore de 0,22 \muM
(Millipore) centrifugando a 17.300 x g durante 5 minutos. El
filtrado se añadió a 4 ml de fluido de centelleo Fisher Plus y se
hizo un recuento en un contador de centelleo Hewlett Packard. La
actividad tirosinasa se calculó como dpm/hora/\mug de proteína y
dpm/hora/10^{3} células. Cada muestra se analizó con y sin
L-Dopa, un cofactor necesario para la tirosinasa
(Pomerantz, S. H., 1996, J. Biol. Chem. 241:
161-168; McLane, et al., 1987, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 145: 719-725). Todos los
valores recogidos e tirosinasa son exclusivos de cuentas que se dan
en blancos de tampón y alícuotas negativas de
L-Dopa. La proteína se determinó en alícuotas de
lisado celular, lisado de partículas extracelulares o medios por el
procedimiento Bradford con Azul de Coomassie (Bradford, 1967,
Anal. Biochem. 72: 248-254) usando un equipo
de ensayo I para proteínas Bio-Rad.
Los resultados (Tabla 9; media \pm DE) muestran
que el
3,3-dimetil-1,2-butanodiol
(3,3-M-1,2-BD) y el
5-norbornen-2,2-dimetanol
(5-NBen-2,2-DM) dan
lugar a la mayor inducción de tirosinasa en una base celular y
proteica. Aunque el 2,3-piridinediol
(2,3-Pyd) 100 \muM indujo incrementos de dos veces
de melanina (Ejemplo 3, Tabla 5), incluso 2,3-Pyd
500 \muM indijo solamente bajos niveles de tirosinasa en relación
a aquel inducido por
5-NBen-2,2-DM o
3,3-M-1,2-BD 5 mM,
niveles más elevados de 2,3-Pyd resultaban tóxicos.
5-norbornen-2,2-DM y
3,3-M-1,2-BD no
resultaron tóxicos a concentraciones que inducen niveles mucho más
elevados de tirosinasa y, de esta forma, son agentes preferidos para
la inducción de melanogénesis en esta realización. Ya que el
5-NBen-2,2-DM induce
niveles casi equivalentes de tirosinasa a concentraciones 5 veces
más bajas que el
3,3-M-1,2-BD,
resulta particularmente preferido. Los expertos en la técnica
conocen bien el IBMX
(3-isobutil-1-metilxantina)
como un potente inductor de melanogénesis y tirosinasa, y se
proporciona como un control positivo.
| Muestra #/tratamiento | dpm/hora/10^{3} células | dpm/hora/\mug de proteína |
| Control (n = 4) | 40 \pm 6 | 184 \pm 27 |
| PG-1,2* 300 mM (n = 4) | 292 \pm 104 | 1003 \pm 370 |
| 3,3-M-1,2-BD* 25 mM (n = 2) | 1211 \pm 38 | 1746 \pm 220 |
| 1,2-cis-CPD* 50 mM (n = 2) | 276 \pm 16 | 925 \pm 53 |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 4) | 707 \pm 54 | 1643 \pm 105 |
| 2,3-Pyd* 0,5 mM (n = 2) | 142 \pm 8 | 160 \pm 19 |
| IBMX* 0,1 mM (n = 2) | 765 \pm 53 | 2161 \pm 41 |
| *Compuestos comparativos |
Los estudios de actividad estructural con
5-NBen-2,2-DM y
compuestos relacionados indican que el
norbornan-2,2-dimetanol
(NBan-2,2-DM) tiene una potencia
equivalente para la inducción de tirosinasa en células S91 (Figura
2). De esta forma, se prefiere el
NBan-2,2-DM de forma equivalente con
el 5-NBen-2,2-DM. El
2-norbornan-metanol
(2-NBanM), 2,3-cis/exo norbornanodiol
(2,3-c/e-NBanoD), \alpha-norborneol
(\alpha-NBan-ol) y norbornano
(NBano) indujeron una menor inducción de tirosinasa en células S91
en orden descendente. Ya que incluso el NBano da lugar a una
inducción 2 veces mayor de tirosinasa en relación a las células
control S91 no tratadas o tratadas con etanol (ETOH), se incluye
como un componente de esta invención. Además, ya que el NBano induce
melanogénesis, se contempla que todos los compuestos que contienen
NBano como componente de su estructura puedan inducir melanogénesis.
Además, se espera que los compuestos que contienen Norborneno
(NBeno) o cualquier otro compuestos insaturado derivado del
norbornano induzcan melanogénesis. De esta forma, cualquier
compuesto saturado o insaturado derivado del norbornano se incluye
como un componente de esta invención, incluyendo, pero no limitado
a, compuestos derivados del borneol, canfeno y alcanfor.
Ni el inhibidor H-89 altamente
específico de la proteína quinasa A (PKA)
(N-[2-(p-bromocinamilamino)-etil]-5-isoquinolinsulfinamida.2HCl;
Chijiwa, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:
5267-5272), ni el inhibidor GF109203X altamente
específico de la proteína quinasa A (PKA) (Bisindolilmaleimida;
Toullec, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:
15771-15781) inhibieron la inducción de tirosinasa
por 5-NBen-2,2-DM
(Tabla 10). De esta forma, de un modo similar a los resultados
descritos para el 1,2-propanodiol en el Ejemplo 3,
es improbable que el
5-NBen-2,2-DM y
compuestos relacionados actúen a través de la activación de las
rutas de PKC, las cuales se han descrito como importantes para la
inducción de melanogénesis por diacilgliceroles (Allan, et
al., 1995, J. Invest. Dermatol. 105:
687-692; Gilchrest, et al., 1996,
Photochem. Photobiol. 63: 1-10). No resulta
probable que el
5-NBen-2,2-DM y
compuestos relacionados actúen a través de la activación de las
rutas de PKA, descritas como importantes para la inducción de
melanogénesis por IBMX (Fuller, et al., 1993, Ann. NY
Acad. Sci. 690: 302-319; Fuller, et al.,
1996, Pigment Cell Res. S5:65). Además, la adición de
catalasa a los medios de cultivo celulares no inhibió la acción del
5-NBen-2,2-DM, lo
que indica que a diferencia de L-Dopa y Dopac, es
improbable que éste y compuestos relacionados induzcan melanogénesis
a través de la generación de peróxido de hidrógeno u otras especie
oxigenada reactiva (Karg, et al., 1989, Acta Derm.
Venereol. 69: 521-524; Karg, et al.,
1991, J. Invest. Dermatol. 96: 224-227; Karg,
et al., 1993, J. Invest. Dermatol. 100:
209S-213S).
| dpm de tirosinasa/hora/\mug | En relación al | |
| de proteína | control | |
| Control | 398 | 1 |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM | 3273 | 8,2X |
| H-89 1 \muM* | 507 | 1,3X |
| H-89 10 \muM* | 1236 | 3,1X |
| H-89 1 \mu M/5-NBen-2,2-DM 5 mM | 4624 | 11,6X |
| H-89 10 \mu M/5-NBen-2,2-DM 5 mM | 3093 | 7,8X |
| GF109203X 0,1 \muM* | 1025 | 2,6 |
| GF109203X 1 \muM* | 2407 | 6,1X |
| GF109203X 0,1 \mu M/5-NBen-2,2-DM 5 mM | 4679 | 11,8X |
| GF109203X 1 \mu M/5-NBen-2,2-DM 5 mM | 6531 | 16,4X |
| dpm de tirosinasa/hora/\mug | En relación al | |
| de proteína | control | |
| 500 unidades de catalasa*/ml | 745 | 1,9X |
| 1000 unidades de catalasa*/ml | 691 | 1,7X |
| 500 unidades de catalasa/ml/5-NBen-2,2-DM 5 mM | 2796 | 7,0X |
| 1000 unidades de catalasa/ml/5-NBen-2,2-DM 5 mM | 4778 | 12,0X |
| *Compuestos comparativos |
Se midió la tirosinasa en melanocitos epidérmicos
humanos normales (MEHN) usando procedimientos idénticos a aquellos
descritos para células S91 (Ejemplo 6), excepto que los medios de
períodos de tratamiento de 5 días se guardaron y se centrifugaron a
200 x g, 1600 x g o 17.300 x g para llevar a cabo un análisis de
actividad tirosinasa en la fracción de partículas melanosomales
exportadas extracelulares, y en la fracción de los sobrenadantes de
los medios resultantes. En algunos casos (Tabla 11), la tirosinasa
se midió también por un ensayo in situ, en el que se añadió
tirosinasa marcada con radioisótopos directamente a los medios
repuestos recién preparados de MEHN durante un período de 24 horas
que sigue a un período de tratamiento de 5 días
(Andel-Malek, et al., 1992, J. Cell.
Physiol. 150:416-425). Los resultados mostraron
que el 5-NBen-2,2-DM
5 mM indujo tirosinasa en mayor grado en el ensayo in situ,
en células, en fracciones melanosomales de partículas extracelulares
y en los medios de MEHN que lo que lo hizo el
3,3-M-1,2-BD 25 mM
(Tabla 11). Ambos,
5-NBen-2,2-DM 5 mM y
3,3-M-1,2-BD 25 mM,
indujeron más tirosinasa en cada uno de estos ensayos y fracciones
que lo que lo que lo hizo el 1,2-PG. IBMX
(3-isobutil-1-metil-xantina),
proporcionado como control positivo, indujo tanta tirosinasa como el
5-NBen-2,2-DM 5 mM
en el ensayo in situ, pero menos que en las fracciones de
partículas extracelulares y de medios (Tabla 11).
| dpm de tirosinasa/hora/10^{3} células | |||||
| In situ | Celular | Partículas a | Partículas a | Medios** | |
| 200 g | 17.300 g* | ||||
| Control | 16,8 | 10259 | 244 | 97 | 1457 |
| EtOH*** 85 mM | 15,0 | 10201 | 442 | 132 | 1654 |
| (1,00X) | (1,00X) | (1,00X) | (1,00X) | (1,00X) | |
| 1,2-PG*** 300 mM | 16,8 | 10247 | 433 | 102 | 1864 |
| 1,2-PG 300 mM*** | 17,2 | 10875 | 923 | 241 | 2123 |
| (1,07X) | (1,03X) | (1,98X) | (1,50X) | (1,28X) | |
| 3,3-M-1,2- | 20,5 | 11728 | 1646 | 536 | 5495 |
| BD*** 25 mM | |||||
| 3,3-M-1,2- | 21,0 | 11730 | 2226 | 425 | 3056 |
| BD*** 25 mM | (1,31X) | (1,15X) | (5,64X) | (4,20X) | (2,75X) |
| 5-NBen-2,2-DM | 24,5 | 13838 | 6447 | 493 | 4164 |
| 5 mM | |||||
| 5-NBen-2,2-DM | 25,4 | 14716 | 6291 | 473 | 4639 |
| 5 mM | (1,57X) | (1,40X) | (18,6X) | (4,22X) | (2,83X) |
| IBMX*** 0,1 mM | 25,3 | 10910 | 2189 | 220 | 2698 |
| IBMX*** 0,1 mM | 26,1 | 11737 | 1834 | 260 | 2935 |
| (1,62X) | (1,11X) | (5,86X) | (2,10X) | (1,81X) | |
| * Después de 200 x g | |||||
| ** Después de 17.300 x g | |||||
| *** Compuestos comparativos |
Estudios adicionales usando MEHN demostraron que,
de un modo similar a los resultados para células S91 (Figura 2), los
compuestos relacionados con el
5-NBen-2,2-DM pueden
ser inductores de tirosinasa (Tabla 12). Por ejemplo, el
2-norbornan-metanol
(2-NBanM) dio lugar a inducción de tirosinasa a
niveles equivalentes al
5-NBen-2,2-DM en
MEHN a partir de un donante adulto blanco y de un donante recién
nacido negro (Tabla 12). De esta forma, de un modo similar a las
células S91 (Ejemplo 6), se considera que todos los compuestos
relacionados con el norbornano inducen tirosinasa en MEHN y por lo
tanto se incorporan en esta invención.
| MEHN de adulto blanco | dpm de tirosinasa/hora/10^{3} células | ||
| In situ | Celular | Medios^{1} | |
| Control | 5,56 (1,00X) | 13992(1,00X) | 36,3 (1,00X) |
| 5-NBen-2,2-DM 1 mM | 6,27 (1,13X) | 12740 (0,91X) | 29,9 (0,82X) |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM | 5,81 (1,04X) | 18467 (1,32X) | 53,1 (1,46X) |
| 2-NBanM* 1 mM | 7,05 (1,27X) | 15257 (1,09X) | 29,2 (1,11X) |
| 2-NBanM* 5 mM | 6,18 (1,11X) | 16077 (1,15X) | 48,1 (1,33X) |
| MEHN de recién nacido negro | dpm/hora/10^{3} células | ||
| In situ | Celular | Medios | |
| Control | 12,5 (1,00X) | 9856 (1,00X) | 11,1 (1,00X) |
| 5-NBen-2,2-DM 1 mM | 13,9 (1,11X) | 10679 (1,08X) | 26,8 (2,41X) |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM | 14,1 (1,13X) | 15398 (1,56X) | 33,2 (2,99X) |
| 2-NBanM* 1 mM | 12,1 (0,97X) | 10863 (1,10X) | 18,7 (1,68X) |
| 2-NBanM* 5 mM | 12,8 (1,02X) | 17397 (1,77X) | 37,3 (3,36X) |
| ^{1} \begin{minipage}[t]{145mm} A diferencia de la Tabla 10, en la que los medios procedían de un período de tratamiento de 5 días, los medios en la Tabla 11 procedían de un período de tratamiento de 1 día.\end{minipage} | |||
| *Compuestos comparativos |
De un modo similar a los resultados para células
S91 tratadas con dioles (Ejemplos 1 y 2), el tratamiento de
melanocitos epidérmicos humanos normales (MEHN) con
5-NBen-2,2-DM 5 mM
dio lugar a cambios morfológicos indicativos de diferenciación. En
el caso de MEHN, la inducción de diferenciación se marcó por
conversión de células de un fenotipo bipolar a un fenotipo
multidendrítico (compárese MEHN no tratados en la Figura 3A con MEHN
tratados con
5-NBen-2,2-DM 5 mM
en la Figura 3B). De forma adicional, la longitud de la dendritas
aumentó aproximadamente de 2 a 3 veces después del tratamiento con
5-NBen-2,2-DM 5 mM,
y se dio un aumento en el número de vesícula secretoras en los
extremos terminales de las dendritas (flechas en las Figuras 3A y
3B). El análisis por microscopía electrónica indicó que la fracción
de partículas extracelulares secretadas en los medios de MEHN
comprendía casi exclusivamente melanosomas de etapa III y IV (las
flechas muestran una vista longitudinal y las puntas de flecha
muestran una vista de sección transversal en las Figuras 3C y 3D).
La secreción aumentada de melanosomas resultante del tratamiento con
5-NBen-2,2-DM 5 mM
se reflejó en una actividad tirosinasa aumentada de partículas
extracelulares (Ejemplo 7, Tabla 11).
Es bien conocido que la irradiación ultravioleta
de la piel da lugar a formación y desarrollo aumentados de dendritas
de melanocitos y a un transporte aumentado de melanosomas desde los
finales de los procesos dendríticos hasta los queratinocitos vecinos
(Jimbow, et al., Biology of Melanocites, pp.
261-289, en: Dermatology in General Medicine, eds:
Fitzpatrick, et al., McGraw Hill, 1994). De esta forma, la
secreción de melanosomas de melanocitos tratados con
5-NBen-2,2-DM parece
ser comparable a los procesos fisiológicos inducidos por la luz del
sol en la piel.
Los inhibidores altamente específicos de las
rutas del AMPc/PKA (proteína quinasa A) o de PKC (proteína quinasa
C) no inhiben la inducción de melanogénesis por
5-NBen-2,2-DM en
células S91 (Ejemplo 6, Tabla 10). Sin embargo, cada uno de los
eliminadores de óxido nítrico (NO) PTIO
(2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-óxido),
el inhibidor LY83583
(6-anilino-5,8-quinolinquinona)
del guanosina monofosfato cíclico (GMPc) y el inhibidor KT58223 de
la PKG (proteína quinasa G) reduce la inducción de melanogénesis por
5-NBen-2,2-DM en
células S91 (Tabla 13). Estos resultados demuestran que la inducción
de melanogénesis por
5-NBen-2,2-DM
transcurre por la ruta NO/GMPc/PKG. Además, los resultados son
similares a aquellos obtenidos para radiación ultravioleta en los
que la inducción de melanogénesis no transcurría a través de las
rutas AMPc/PKA o PKC (Friemann y Gilchrest, 1987, J. Cell.
Physiol. 133: 88-94; Carsberg, et al.,
J. Cell. Sci. 107: 2591-2597), pero que si
transcurría a través de la ruta NO/GMPc/PKG
(Romero-Graillet, et al., 1996, J. Biol.
Chem. 271: 28052-28056;
Romero-Graillet, et al., 1997 J. Clin.
Invest. 99: 635-642). Además, a diferencia del
IBMX
(3-isobutil-1-metilxantina)
y del MSH (hormona estimulante de melanocitos, melanocite
stimulating hormone) que inducen melanogénesis por la ruta de
AMPc/PKA (Wintzen y Gilchrest, 1996, J. Invest. Dermatol.
106: 3-10; Fuller, et al., 1993, Ann. NY
Acad. Sci. 690: 302-319), y DAG
(diacilglicerol), que induce melanogénesis por la ruta de PKC
(Allan, et al., 1995, J. Invest. Dermatol. 105:
687-692),
5-NBen-2,2-DM induce
melanogénesis por la ruta NO/GMPc/PKG de un modo similar a la
radiación ultravioleta.
| Inhibidores de NO/PKG - Experimento 1 | ||
| dpm /hora/10^{3} células | % de 5-NBen-2,2-DM | |
| Inducción | ||
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 4) | 5018 \pm 415^{1} | 100% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/PTIO^{2} 20 \muM (n = 2) | 3703 \pm 262 | 74% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/KT5823^{3} | 1528 \pm 190 | 31% |
| 0,5 \muM (n = 2) | ||
| ^{1}X \pm DE | ||
| ^{2}PTIO: eliminadorde óxido nítrico | ||
| ^{3}KT5823: inhibidor de PKG | ||
| Inhibidores de NO/PKG - Experimento 2 | ||
| dpm /hora/10^{3} células | % de 5-NBen-2,2-DM | |
| Inducción | ||
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 4) | 5640 \pm 323 | 100% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/PTIO^{2} 20 \muM (n = 2) | 4078 \pm 429 | 72% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/PTIO 40 \muM (n = 2) | 3351 \pm 994 | 59% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/KT5823^{3} 0,5 \muM (n = 2) | 2940 \pm 261 | 52% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/KT5823 1,0 \muM (n = 2) | 1688 \pm 324 | 30% |
| ^{2}PTIO: eliminador de óxido nítrico | ||
| ^{3}KT5823: inhibidor de PKG | ||
| Inhibidor de GMPc - Experimento 3 | ||
| dpm /hora/10^{3} células | % de 5-NBen-2,2-DM | |
| Inducción | ||
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 4) | 6388 \pm 460^{1} | 100% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/LY83583 0,1 \muM (n = 2) | 1389 \pm 64 | 22% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/LY83583 0,2 \muM (n = 2) | 300 \pm 84 | 5% |
\newpage
La línea celular PC12 de feocromocitoma de rata
se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo
(ATCC). Las células se cultivaron en medio con un 85% de RPMI 1640,
un 10% de suero de caballo (inactivado por calor a 56ºC durante 30
minutos), un 5% de suero fetal bovino, 25 U/ml de penicilina y 25
\mug/ml de estreptomicina (Greene, et al., 1991,
"Methodologies for the culture and experimental use of the rat
PC12 rat pheochromocytoma cells line", pp.
207-225, En: Culturing Nerve Cells, The MIT Press,
Cambridge, Massachussets). Las células se cultivaron directamente
sobre placas de plástico a 37ºC en CO_{2} al 5% en una incubadora
humidificada.
Se considera que las células PC12 de
feocromocitoma de rata son un modelo excelente para células
neuronales porque responden al tratamiento con el factor de
crecimiento de nervios (NGF, nerve growth factor) por adquisición de
una serie de propiedades de neuronas que incluyen el cese de
proliferación, extensión de neuronas, adquisición de excitabilidad
eléctrica y síntesis aumentada de neurotransmisores (Greene, et
al., 1991, y referencias en la misma). Además, las células PC12
se usan como modelo para estudios de prevención o cura de
enfermedades neurodegenerativas ya que proporcionan un rastreo
eficaz para agentes que mantienen la supervivencia neuronal y
previenen la muerte de células neuronales en medios libres de suero
(Rukenstein, et al., 1991, J. Neurosci. 11:
255-2563). Se considera que los agentes son
potencialmente útiles para el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos si no sólo promueven la supervivencia de células
PC12, sino que también aumentan el crecimiento externo de neuronas
(Rukenstein, et al., 1991). Se considera que los agentes son
particularmente útiles para el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos si promueven la supervivencia de células PC12 y
el crecimiento externo de neuronas en ausencia de "cebamiento"
con NGF (Rukenstein, et al., 1991). Debido a su capacidad
para expresar tirosina hidroxilasa y, por lo tanto, sintetizar
dopamina, se considera que las células PC12 son un modelo
especialmente bueno para estudios de enfermedad de Parkinson
(Michel, et al., 1994, Europ. J. Neurosci. Assoc. 6:
577-586 y referencias en la misma). Además, el
crecimiento externo de neuronas en células PC12 se ha usado para
identificar agentes que estimulan la regeneración de axones
neuronales dañados en los nervios periféricos de mamíferos adultos
(Sandrock, A. W. y Matthew, W. D., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 84: 6934-6938). Además, las células PC12
se han usado como modelo para estudiar aspectos de la enfermedad de
Alzheimer (Shen, et al., 1995, Brain Res. 671:
282-292), esclerosis amiotrófica lateral (Durham,
et al., 1995, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22:
366-67), síndrome de Down (Groner, et al.,
1994, Biomed. Pharmacother. 48: 231-240) y
neurodegeneración relacionada con la edad (Taglialatela, et
al., 1996, J. Neurochem. 66:
1826-1835).
Para ensayar compuestos para ver la inducción de
formación y desarrollo dendríticos (crecimiento externo de neuronas)
y actividad tirosina hidroxilasa en esta invención, las células se
colocaron en placas a razón de 15.000 células/placa de 35 mm. Dos
días después de la colocación en placas, los medios de cultivo
celular se repusieron con aquel que contenía los tratamientos. Una
semana más tarde, los medios y tratamientos se repusieron con medios
y tratamientos recién preparados. Dos semanas después de los
tratamientos iniciales, las células se examinaron microscópicamente
y se estimó la parte de células que mostraba formación y desarrollo
dendríticos. Las células se recuperaron por tripsinización y se hizo
un recuento por un Contador Coulter. Las células se sedimentaron por
centrifugación a 200 x g, y los sedimentos celulares se lisaron en
600 \mul de Tris 50 mM/Acetato a pH 6,0/Triton
X-100 al 0,2% agitando en vórtex, sonicando 5
segundos, incubndo en hielo durante 30 minutos seguido de una nueva
agitación en vórtex. La proteína se determinó en alícuotas de lisado
celular por el procedimiento Bradford con Azul de Coomassie
(Bradford, 1967, Anal. Biochem. 72: 248-254)
usando un equipo de ensayo I para proteínas Bio-Rad.
La actividad tirosina hidroxilasa se determinó incubando 100 \mul
de la siguiente mezcla de reacción a 37ºC durante 15 minutos:
acetato de sodio 200 mM a pH 6,0, tirosina 50 \muM, 2000 U de
catalizador/ml, 50 mU de dihidropteridina reductasa/ml, NADH 0,1 mM
final, 200.000 cpm de ^{3}H-tirosina/100 \mul,
NSD1015 (3-hidroxibencilhidrazina) 0,1 mM y
tetrahidrobiopterina (BH_{4}) 100 \muM (Nagatsu, et al.,
1969, Anal. Biochem. 9: 122-126; Ribeiro,
et al., 1991, J. Biol. Chem.
16207-16211). Las reacciones se pararon por adición
de 200 \mul de carbón vegetal activado al 10% en HCl 0,1 N e
incubación en hielo durante 15 minutos. Esta mezcla se centrifugó a
17.300 x g durante 5 minutos, y entonces se filtraron 200 \mul de
sobrenadante a través de una unidad de filtración centrífuga GV
Durapore 0,22 \muM (Millipore) centrifugando a 17.300 x g durante
5 minutos. El filtrado se añadió a 4 ml de fluido de centelleo
Fisher Plus y se hizo un recuento en un contador de centelleo
Hewlett Packard. La actividad tirosina hidroxilasa se calculó como
dpm/\mug de proteína y dpm/10^{3} células por hora.
El examen microscópico mostró que una gran parte
de las células PC12 tratadas con
5-norbornen-2,2-dimetanol
(5-NBen-2,2-DM)
adquirieron procesos dendríticos (Tabla 14, y compárense células
PC12 no tratadas en la Figura 4A con células PC12 tratadas con
5-NBen-2,2-DM en la
Figura 4B). Se observaron aumentos más pequeños de procesos
dendríticos después del tratamiento con
3,3-dimetil-1,2-butanodiol
(3,3-M-1,2-BD) o
1,2-propilenglicol (1,2-PG) (Tabla
14). Los aumentos más importantes de actividad tirosina hidroxilasa
resultaron del tratamiento con
3,3-M-1,2-BD 25 mM y
5-NBen-2,2-DM 5 mM
(Tabla 14). El tratamiento con 1,2-PG,
3,3-M-1,2-BD y
5-NBen-2,2-DM
aumentó la cantidad de proteína por célula, una característica a
menudo asociada a la inducción de diferenciación. Los aumentos de
proteína por célula se manifestaron morfológicamente como un aumento
en el tamaño celular (compárense células PC12 no tratadas en la
Figura 4A con células PC12 tratadas con
5-NBen-2,2-DM en la
Figura 4B). El examen de los datos en la Tabla 14 muestra que
aumentos de tirosina hidroxilasa por célula como resultado del
tratamiento con 1,2-PG,
3,3-M-1,2-BD o
5-NBen-2,2-DM,
fueron en parte, como resultado de aumentos de la cantidad de
proteína por célula. El etanol (EtOH), usado como disolvente para
3,3-M-1,2-BD y
5-NBen-2,2-DM, e
IBMX
(3-isobutil-1-metilxantina),
que incrementa los niveles de AMPc celular, dieron lugar solamente a
efectos sin importancia en relación a los agentes de esta
invención.
\newpage
Los reducidos números de células resultantes del
tratamiento con 1,2-PG,
3,3-M-1,2-BD o
5-NBen-2,2-DM son,
en parte, indicativos del proceso de diferenciación inducido por los
tratamientos. Sin embargo, en el caso del tratamiento con
3,3-M-1,2-BD 25 mM y
5-NBen-2,2-DM 10
mM, algunas células se separaron de forma concomitante con la
adquisición de la formación y desarrollo de dendritas que se
produjeron más temprano que para otros tratamientos. Este fenómeno
de separación se ha observado previamente para células PC12
recubriendo placas de tratamiento con colágeno (revisado en Greene,
et al., 1991). El tratamiento con colágeno acorta también el
tiempo requerido para la formación de dendritas y aumenta de forma
considerable la extensión de la formación de dendritas en respuesta
al tratamiento con NGF (revisado en Greene, et al., 1991). De
esta forma, se contempla que los compuestos de esta invención
demostrarán que muestran más actividad cuando se ensayan sobre
placas recubiertas de colágeno.
La inducción de diferenciación tal y como indica
la inducción de formación y desarrollo de dendritas, inducción de
actividad tirosina hidroxilasa, aumentó los niveles de proteína
celular y la inducción de la detención del ciclo celular tal y como
indica un crecimiento reducido, indican que los compuestos de esta
invención pueden actuar como agentes quimioterapéuticos para el
tratamiento de tumores neuronales y trastornos cancerosos y
trastornos proliferativos neuronales adicionales. Además, se
contempla que los compuestos de esta invención tratarán trastornos
tumorales, cancerosos y proliferativos que surgen de tipos celulares
adicionales.
Se debería observar de forma particular que los
compuestos de esta invención indujeron formación y desarrollo de
dendritas y actividad tirosina hidroxilasa en ausencia de cebamiento
con NGF, un requisito previo para la inducción de extensión neuronal
por otros muchos agentes probados en células PC12 (Steiner, et
al., 1997, Nature Medicine 3: 421-428;
Rukenstein, et al., 1991, J. Neurosci. 11:
2552-2563). Varios agentes considerados como
tratamientos para enfermedades neurodegenerativas no promueven la
extensión neuronal incluso en células PC12 cebadas con NGF (por
ejemplo IGF-I e IGF-II; Rukenstein,
et al., 1991, y referencias en la misma). Además, muchos
agentes considerados para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas, incluyendo GDNF (factor neurotrófico derivados
de células gliales, glial cell-derived neurotrophic
factor) que se está desarrollando para el tratamiento de la
enfermedad de Parkinson, son péptidos neurotróficos que no pueden
cruzar la barrera hematoencefálica, y por lo tanto requieren
implantación de terapia génica en el lugar de acción (Haase, et
al., 1997, Nature Medicine 3: 429-436).
Además, la L-Dopa, que actualmente se usa para el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson, es tóxica (Yahr, M. D.
1993, Adv. Neurol. 60: 11-17), en parte, por
la generación de dopamina formada periféricamente (Riederer, et
al., 1993, Adv. Neurol. 60: 626-635) y,
en parte, debido a su capacidad para formar semiquinonas y quinonas
altamente reactivas a través de autooxidación (Karg, et al.,
1989, Acta Derm. Venereol. 69: 521-524). Dado
que los agentes de la presente invención: (i) actúan directamente
sin un requerimiento de NGF; (ii) inducen diferenciación neuronal,
poniendo en marcha por lo tanto una reprogramación celular hacia el
fenotipo adecuado; (iii) inducen tirosina hidroxilasa, la enzima
limitante de la velocidad en la síntesis de dopamina; (iv) son
pequeños fármacos moleculares que es probable que crucen la barrera
hematoencefálica; y (v) no tienen capacidad conocida para formar
semiquinonas, quinonas u otros intermedios tóxicos, se contempla que
los agentes de esta invención resultarán particularmente ventajosos
para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas incluyendo,
pero no limitado a, la enfermedad de Parkinson.
Se obtuvieron células de melanoma de ratón
Cloudman S91 de la ATCC y se cultivaron en MEM (BioWhittaker) con
suero fetal bovino al 10% (BioWhittaker o Hyclone). Las células se
colocaron en placas a razón de 10^{5} células/pocillo en placas de
96 pocillos el día antes de los tratamientos, en medios que
contenían suero fetal bovino al 10%. Los medios se cambiaron a MEM
con suero fetal bovino al 2% concomitante con la adición de
tratamientos (Eller, et al., 1996, Proc. Natl. Acad.
Sci. 93: 1087-1092). Seis días más tarde, se
retiraron los medios y las células S91 se lavaron 2 veces con 2 ml
de PBS (BioWhittaker), se añadió 1 ml de tripsina al 0,05%/AEDT
(BioWhittaker) y las células se incubaron a 37ºC hasta que se
separaron de las placas de plástico. Se añadieron cuatro ml de
medios que contenían suero fetal bovino al 10%, las células se
mezclaron por acción de pipeta hasta que no quedaron grumos de
células y se hizo un recuento en 5 ml en un contador Coulter.
Se analizó la tirosinasa usando procedimientos
previamente descritos (Pomerantz, 1966, J. Biol. Chem. 241:
161-168). Las células se solubilizaron sonicando
durante 5 segundos en 600 \mul de tampón fosfato 50 mM a pH 6,8
que contenía un 0,5% Triton-X100, seguido de
agitación en vórtex, incubación en hielo durante 30 minutos, y
después vuelta a agitar en vórtex. A partir de esto, se combinaron
alícuotas de 200 \mul con 200 \mul de mezcla de reacción que
contenía tirosina 75 \muM, L-Dopa 75 \muM y
L-[3,5-^{3}H]tirosina 2 \mu Ci en
NaPO_{4} a pH 6,8 (L-Dopa +), o tirosina 75
\muM y L-[3,5-^{3}H]tirosina 2 \mu Ci
en NaPO_{4} a pH 6,8 (L-Dopa -) y se incubaron 1
hora a 37ºC. Las reacciones se pararon por adición de 400 \mul de
carbón vegetal activado al 10% en HCl 0,1 N e incubación en hielo
durante 15 minutos. Esta mezcla se centrifugó a 17.300 x g durante 5
minutos, y entonces se filtraron 400 \mul de sobrenadante a través
de una unidad de filtración centífuga GV Durapore de 0,22 \mu m
(Millipore) centrifugando a 17.300 x g durante 5 minutos. El
filtrado se añadió a 4 ml de fluido de centelleo Fisher Plus y se
hizo un recuento en un contador de centelleo de 2000 A Hewlett
Packard. La actividad tirosinasa se calculó como dpm/10^{3}
células. Cada muestra se analizó con y sin L-Dopa,
un cofactor necesario para la tirosinasa (Pomerantz, 1996). Todos
los valores recogidos de tirosinasa son exclusivos de cuentas que se
dan en blancos de tampón y alícuotas negativas de
L-Dopa.
Se ha demostrado previamente que una serie de
dioles alifáticos y alicíclicos, que incluyen
5-norbornen-2,2-dimetanol
(5-NBen-2,2-DM),
inducen melanogénesis en células S91. Los resultados presentados en
la Tabla 15 muestran que la inducción de tirosinasa (la enzima
limitante de la velocidad en la melanogénesis) por
5-NBen-2,2-DM no
queda bloqueada por inhibidores altamente específicos de las rutas
de PKC y PKA. De hecho, el tratamiento de células S91 tanto con el
inhibidor H-89 altamente específico de PKA (Chijiwa,
et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:
5267-5272), como con el inhibidor GF109203X
altamente específico de la PKA (Toullec, et al., 1991, J.
Biol. Chem. 266: 15771-15781) dio lugar a un
aumento de los niveles de tirosinasa basal e inducido por
5-NBen-2,2-DM (Tabla
15). De esta forma, el
5-NBen-2,2-DM no
parece actuar a través de las rutas de PKC o PKA.
En contraste, el eliminador de de óxido nítrico
(NO) PTIO
(2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-óxido),
el inhibidor LY83583
(6-anilino-5,8-quinolinquinona)
del guanosina monofosfato cíclico (GMPc) y el inhibidor
KT5823 de la PKG (proteína quinasa activada por GMPc) redujeron la inducción de melanogénesis por 5-NBen-2,2-DM en células S91 (Tabla 16). Estos resultados demuestran que la inducción de melanogénesis por 5-NBen-2,2-DM transcurre por la ruta NO/GMPc/PKG.
KT5823 de la PKG (proteína quinasa activada por GMPc) redujeron la inducción de melanogénesis por 5-NBen-2,2-DM en células S91 (Tabla 16). Estos resultados demuestran que la inducción de melanogénesis por 5-NBen-2,2-DM transcurre por la ruta NO/GMPc/PKG.
Previamente, se ha demostrado que los donantes de
NO pueden estimular melanogénesis en melanocitos humanos normales
(Romero-Graillet, et al., 1996, J. Biol.
Chem. 271). Los resultados presentados aquí demuestran que el
5-NBen-2,2-DM puede
estimular melanogénesis con una potencia equivalente o mayor que
aquella de los donantes de NO, incluso aunque el
5-NBen-2,2-DM no
tenga capacidad para donar NO. Ya que la inducción de melanogénesis
por 5-NBen-2,2-DM
transcurre a través de la ruta NO/GMPc/PKG, el
5-NBen-2,2-DM debe
estimular directamente la síntesis de NO.
Estos resultados demuestran que la estimulación
de la síntesis de NO y de la ruta GMPc/PKG por
5-NBen-2,2-DM
proporciona una alternativa eficaz para la estimulación de esta ruta
por donantes de NO. De esta forma, el
5-NBen-2,2-DM y
compuestos relacionados descritos en esta invención servirán como
agentes terapéuticos alternativos para el tratamiento de una serie
de enfermedades mediadas por perturbaciones de la ruta
NO/GMPc/PKG.
| dpm /hora/10^{3} células | % de inducción por | |
| 5-NBen-2,2-DM | ||
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 2) | 2142 \pm 185^{1} | 100% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/H-89^{2} 1 \muM (n = 1) | 3255 | 152% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/H-89 10 \muM (n = 1) | 2428 | 113% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/GF109203X^{3} 0,1 \muM (n = 1) | 2700 | 126% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/GF109203X 1,0 \muM (n = 1) | 5055 | 236% |
| dpm /hora/10^{3} células | % de control | |
| Control no tratado (n = 2) | 128 \pm 4 | 100% |
| H-89^{2} 1 \muM (n = 1) | 177 | 138% |
| H-89^{2} 10 \muM (n = 1) | 765 | 598% |
| GF109203X^{3} 0,1 \muM (n = 1) | 270 | 211% |
| GF109203X 1,0 \muM (n = 1) | 650 | 508% |
| ^{1}X \pm DE | ||
| ^{2}H-89: inhibidor de PKA | ||
| ^{3}GF109203X: inhibidor de PKC |
| Inhibidores de NO/PKG - Experimento 1 | ||
| dpm /hora/10^{3} células | % reinducción por | |
| 5-NBen-2,2-DM | ||
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 4) | 5018 \pm 415^{1} | 100% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/PTIO^{4} 20 \muM (n = 2) | 3703 \pm 262 | 74% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/KT5823^{5} 0,5 \muM (n = 2) | 1528 \pm 190 | 31% |
| ^{1}X \pm DE | ||
| ^{4}PTIO: eliminador de óxido nítrico | ||
| ^{5}KT5823: inhibidor de PKG | ||
| Inhibidores de NO/PKG - Experimento 2 | ||
| dpm /hora/10^{3} células | % de inducción por | |
| 5-NBen-2,2-DM | ||
| Inducción | ||
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 4) | 5640 \pm 323 | 100% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/PTIO^{4} 20\muM (n = 2) | 4078 \pm 429 | 72% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/PTIO 40 \muM (n = 2) | 3351 \pm 994 | 59% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/KT5823^{5} 0,5 \muM (n = 2) | 2940 \pm 261 | 52% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/KT5823 1,0 \muM (n = 2) | 1688 \pm 324 | 30% |
| ^{4}PTIO: eliminador de óxido nítrico | ||
| ^{5}KT5823: inhibidor de PKG | ||
| Inhibidor de GMPc - Experimento 3 | ||
| dpm /hora/10^{3} células | % de inducción por | |
| 5-NBen-2,2-DM | ||
| Inducción | ||
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM (n = 4) | 6388 \pm 460^{1} | 100% |
| 5-NBen-2,2-DM 5 mM/LY83583^{6} 0,1 \muM (n = 2) | 1389 \pm 64 | 22% |
| 5-Nben-2,2-DM 5 mM/LY83583 0,2 \muM (n = 2) | 300 \pm 84 | 5% |
| ^{6}LY83583: inhibidor de GMPc |
Claims (7)
1. Uso de uno o más compuestos definidos a
continuación en la preparación de un medicamento para el
tratamiento, prevención o alteración de una enfermedad o afección
mediada por deficiencias en la ruta de transducción de señales
NO/GMPc/PKG, la cual se selecciona de trastornos de
hipopigmentación; trastornos proliferativos de la piel o trastornos
de queratinización; trastornos neurodegenerativos; enfermedad
cardiaca, incluyendo angina de pecho estable, angina inestable,
infarto de miocardio, insuficiencia miocárdica asociada a isquemia
miocárdica, ateroesclerosis, hipertrofia vascular y trombosis;
hipertensión; apoplejía; hipertensión pulmonar primaria, enfermedad
pulmonar obstructiva crónica y síndrome de insuficiencia
respiratoria en adultos; anomalías funcionales microvasculares en
diabetes; irregularidades hemostáticas de la función vascular
glomerular y tubular; trastornos de la función de la vejiga y
relajación del reflejo en la micción; trastornos de liberación de
neurotransmisores, morfogénesis neuronal, plasticidad sináptica y
regulación neuroendocrina; dolor regional, incluyendo dolores de
cabeza por migraña; enfermedad anal benigna; impotencia; inhibición
de crecimiento tumoral; y estimulación de la cicatrización de
heridas:
(i) dioles que tienen la estructura:
(ii) dioles que tienen la estructura:
(iii) sales farmacéuticamente aceptables de (i);
y
(iv) sales farmacéuticamente aceptables de (ii);
en los que:
cada R_{6} se selecciona independientemente de
hidrógeno; halógeno; o de un grupo que contiene de un átomo a veinte
átomos, uno de los cuales es carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre;
hidroxilo, hidroximetilo, -(CH_{2})_{n}OH,
-(CH_{2})_{n}OR_{1},
-(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CHOH, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CH(OH)R_{1}, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-(CH_{2})_{n}-CH_{2}(OH), -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-
(CH_{2})_{n}-CH(OH)R_{1} o -CH_{2}OR_{3}, en los que cada n es independientemente 0 o un número entero de 1 a 25;
-(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CHOH, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-CH(OH)R_{1}, -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-(CH_{2})_{n}-CH_{2}(OH), -(CH_{2})_{n}-CH(OH)-
(CH_{2})_{n}-CH(OH)R_{1} o -CH_{2}OR_{3}, en los que cada n es independientemente 0 o un número entero de 1 a 25;
cada R_{1} se selecciona independientemente de
hidrógeno; halógeno; o de un grupo que contiene de un átomo a veinte
átomos, uno de los cuales es carbono, nitrógeno, oxígeno o
azufre;
y
cada R_{3} se selecciona independientemente de
hidrógeno o de un grupo acilo o aminoacilo que contiene de un átomo
a veinte átomos, al menos uno de los cuales es carbono, nitrógeno,
oxígeno o azufre.
2. Un uso reivindicado en la reivindicación 1, en
el que el uno o más compuestos se selecciona(n) de:
2-(propil-1,2-diol)-norbornano,
5-norbornen-2,2-dimetanol,
norbornan-2,2-dimetanol,
2,3-norbornanodiol (exo o endo o cis o
trans), 2,3-cis-exo-norbornanodiol y
2-endo-hexadecilamino-5-norbornen-2,3-exo-dimetanol.
3. Un uso reivindicado en la reivindicación 1, en
el que el uno o más compuestos se selecciona(n) de:
2-(propil-1,2-diol)-norbornano,
5-norbornen-2,2-dimetanol;
norbornan-2,2-dimetanol; y
2,3-cis-exo-norbornanodiol.
4. Un uso reivindicado en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que también está presente un vehículo
adecuado.
5. Un uso reivindicado en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la enfermedad o afección se
selecciona de enfermedad cardiaca, incluyendo angina de pecho
estable, angina inestable, infarto de miocardio, insuficiencia
miocárdica asociada a isquemia miocárdica, ateroesclerosis,
hipertrofia vascular y trombosis; hipertensión; apoplejía;
hipertensión pulmonar primaria, enfermedad pulmonar obstructiva
crónica y síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos;
anomalías funcionales microvasculares en diabetes; impotencia;
estimulación de la cicatrización de heridas; y trastornos de
hipopigmentación.
6. Un uso reivindicado en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la enfermedad o afección se
selecciona de trastornos de liberación de neurotransmisores,
morfogénesis neuronal, plasticidad sináptica y regulación
neuroendocrina; dolor regional, incluyendo dolores de cabeza por
migraña; inhibición de crecimiento tumoral; trastornos
proliferativos de la piel o trastornos de queratinización; y
trastornos neurodegenerativos.
7. Un uso reivindicado en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la enfermedad o afección se
selecciona de irregularidades hemostáticas de la función vascular
glomerular y tubular; trastornos de la función de la vejiga y
relajación del reflejo en la micción; y enfermedad anal benigna.
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