TWI480057B - 咖啡酸醯胺衍生物之應用 - Google Patents

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Description

咖啡酸醯胺衍生物之應用
本發明係關於一種咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽之應用，尤其關於咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽於抗皮膚老化之應用，特別是用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)之活性、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化(mitogen-activated protein kinase，MAP Kinase)、促進膠原蛋白生成、抑制酪胺酸酶活性、抑制酪胺酸酶生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-1(Tyrosinase related protein-1)生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-2(Tyrosinase related protein-2)生成、及/或吸收波長210奈米至400奈米之紫外線。
膠原蛋白是維持皮膚與肌肉彈性的主要成份。目前已發現的動物膠原蛋白大致可分成二十一種型式，依不同組織而有不同的膠原蛋白，其中以第一型(Type I)膠原蛋白的含量最多，也是用途最廣的膠原蛋白。於皮膚組織中，第一型膠原蛋白約占 80%，而第三型(Type III)膠原蛋白約占20%。真皮層中的纖維母細胞主要係製造第一型膠原蛋白及第三型膠原蛋白供皮膚使用。
皮膚的構造由上而下，依次為表皮層(epidermis)、真皮層(dermis)及皮下組織(hypodermis)。一般人隨著年紀的增長，皮膚老化的表徵會漸漸出現，例如皮膚鬆弛、皺紋生成及膚色黯沉等。皮膚老化的原因可分為內因性及外因性。內因性之老化係指身體自然的老化過程，例如由於年紀增加、荷爾蒙減少及免疫力降低所造成的老化；外因性之老化則係因外在因素(例如日曬、污染、自由基傷害及抽菸)所造成的老化。
一般而言，內因性之老化與外因性之老化因素皆會促進有絲分裂原活化蛋白激酶途徑(MAPK pathway)之磷酸化作用而增加真皮層之MMP-1、MMP-3及MMP-9的含量。MMP-1、MMP-3及MMP-9會分解膠原蛋白，減少皮膚中的膠原蛋白含量。若皮膚缺少膠原蛋白的支撐，其外觀會變得鬆弛，並造成角質層過度增生，進而使皮膚變得黯沉，並產生皺紋。此外，細胞中的活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)，例如超氧陰離子、過氧化物和自由基之有機物和無機物亦會造成膠原蛋白之變性(denature)與功能喪失。
皮膚老化的另一特徵為皮膚中黑色素堆積，造成皮膚黯沉、或出現斑點。黑色素係由存在皮膚表皮層最下端的基底黑色素細胞(melanocyte)進行黑色素生成作用(melanogenesis)而形成。黑色素生成作用，主要起始於皮膚角質細胞所分泌的黑素細胞促素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)與黑色素細胞 上的黑色素皮質素接受器1(melanocortin 1 receptor，MC1R)結合，活化黑色素細胞內的環狀磷酸腺苷酸(cAMP)路徑，而使黑色素細胞內的酪胺酸酶(tyrosinase)活化並催化酪胺酸形成多巴醌(dopaquinone)。多巴醌會進一步在酪胺酸酶相關蛋白質-1(Tyrosinase related protein-1，TRP-1)以及酪胺酸酶相關蛋白質-2(Tyrosinase related protein-2，TRP-2)的催化下，透過一系列生化反應而轉化生成黑色素(melanin)。
於所有造成皮膚老化的因素中，損害皮膚最嚴重且最明顯加速皮膚老化的首要因素即為日光中之紫外線。紫外線依其波長可分為波長為320奈米至400奈米的長波紫外線(UVA)、波長為275奈米至320奈米的中波紫外線(UVB)、以及波長為200奈米至275奈米的短波紫外線(UVC)。一般日常生活中所接觸的紫外線，主要為長波紫外線及中波紫外線。長時間接觸長波紫外線及中波紫外線，有使皮膚產生紅斑及曬傷、傷害皮膚細胞之去氧核醣核酸、以及造成皮膚免疫系統異常及皮膚癌等風險。
紫外線所造成的老化現象稱為光老化，其會促進活性氧物質生成，且會活化細胞中如前述之MAPK途徑，造成MMP-1、MMP-3及MMP-9的含量增加，造成皮膚中膠原蛋白分解。此外，紫外線照射亦會促進黑色素細胞進行黑色素生成作用，造成皮膚中黑色素堆積。因此，若能阻斷照射皮膚的紫外線(例如，吸收照射到皮膚表皮層的紫外線，從而減少穿透皮膚表皮層的紫外線的量)，或能抑制細胞中之MAPK途徑、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之活性或生成、及/或抑制黑色素生成作用，即可達到改善 /增進膚質、抑制皮膚老化之功效。
過去研究發現，以70%乙醇萃取薔薇科植物地楡(Sanguisorba officinalis)之根部，所得之地榆糖(ziyuglycoside-I)可抑制基質金屬蛋白酶-1之表現；以甲醇萃取卷柏科植物萬年松(Selaginella tamariscina)，所得之蘇馬黃酮(sumaflavone)及穗花杉雙黃酮(amentoflavone)亦可抑制基質金屬蛋白酶-1之表現。然而，市面上對於可抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之活性、具更佳抗老化效果之成分，仍存在極大的需求。
本案發明人研究後發現，本發明式(I)化合物具有優異之抗氧化、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之活性及生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、促進膠原蛋白生成、抑制酪胺酸酶活性及生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-1生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-2生成、及/或吸收波長210奈米至400奈米的紫外線的功效，可有效減緩/免除膠原蛋白的分解及/或變性、抑制黑色素生成，故可用於抗皮膚老化。
本發明之一目的在於提供一種使用式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽於製造藥劑之用途： 其中，當A為氫或烷基時，B為-[CH2 ]m -，m為0至10之一整數， 且R1為氫、經取代或未經取代之苯基或吡啶基、羥基、或甲氧基；或者，N、A、B、以及R1一起形成一經取代或未經取代之吡咯基或哌啶基；以及其中該藥劑係用於抗皮膚老化。
本發明之另一目的在於提供一種使用式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽於製造護膚產品之用途，其中該護膚產品係用於改善、調理及/或修補皮膚。
本發明之又一目的在於提供一種於一個體中抗皮膚老化的方法，其係包含於一有該需求之個體投予有效量之式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之技術內容。
第1(a)圖及第1(b)圖所示為本發明咖啡酸醯胺衍生物對DPPH自由基之清除效率的統計直條圖；第2(a)圖及第2(b)圖所示為本發明咖啡酸醯胺衍生物對ROS自由基之清除效果的螢光染色圖；第3(a)圖及第3(b)圖所示為人類纖維母細胞Hs68之基質金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-3及MMP-9)的西方點墨試驗照片；第4(a)圖及第4(b)圖所示為人類纖維母細胞Hs68之未磷酸化及磷酸化有絲分裂原活化蛋白激酶(JNK、ERK及p38)的西 方點墨試驗照片；第5(a)圖及第5(b)圖所示為人類纖維母細胞Hs68之活化子蛋白質-1基因轉錄因子(c-Fos、p-c-Jun、c-Jun)的西方點墨試驗照片；第6(a)圖及第6(b)圖所示為人類纖維母細胞Hs68之前膠原蛋白-1、Smad3蛋白質、及Smad7蛋白質的西方點墨試驗照片；第7(a)圖至第7(k)圖所示為本發明咖啡酸醯胺衍生物抑制B16細胞表現黑色素的統計直條圖；第8(a)圖及第8(b)圖所示為本發明咖啡酸醯胺衍生物抑制B16細胞中酪胺酸酶活性的統計直條圖；第9(a)圖及第9(d)圖所示為本發明咖啡酸醯胺衍生物抑制B16細胞表現與黑色素生成路徑相關之蛋白質(MC1R、TRP-1、TRP-2、MITF、及酪胺酸酶)的統計直條圖；第10(a)圖及第10(b)圖所示為人類纖維母細胞Hs68之細胞存活率的統計直條圖；第11(a)圖至第11(d)圖所示為皮膚一次性刺激性試驗之大白兔皮膚變化的照片；以及第12(a)圖至第12(d)圖所示為皮膚一次性刺激性試驗之大白兔皮膚變化的照片。
以下將具體地描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態 樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之狀況的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。
如上述，引發皮膚老化之主要作用機制包括：(1)有絲分裂原活化蛋白激酶途徑之磷酸化作用過度活化，其會增加真皮層之MMP-1、MMP-3及MMP-9的含量，造成膠原蛋白變性或分解，導致皮膚出現皺紋、鬆弛等現象；以及(2)黑色素生成作用過度活化，使皮膚中黑色素過度堆積，造成皮膚黯沉或出現斑點。目前已知紫外線照射為活化前述皮膚老化相關機制的最主要因素，因此，若能阻斷照射到皮膚表皮層的紫外線穿透進入到皮膚真皮層，或可抑制真皮層中之MMP-1、MMP-3及MMP-9的含量或活性(如抑制有絲分裂原活化蛋白激酶途徑之磷酸化作用)或抑制黑色素生成作用，則可減緩皮膚老化、改善皮膚外觀。
本案發明人發現，下式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽具有抗氧化(例如，抑制活性氧物質生成)、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之活性、及/或抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之生成的功效，因此可防止或減緩膠原蛋白被破壞： 其中，當A為氫或烷基時，B為-[CH2 ]m -，m為0至10之一整數，且R1為氫、經取代或未經取代之苯基或吡啶基、羥基、或甲氧基；或者，N、A、B、以及R1一起形成一經取代或未經取代之吡咯基或哌啶基。
較佳地，於式(I)咖啡酸醯胺衍生物中，A為氫或C1-C6直鏈烷基；B為-[CH2 ]m -；m為0至8之一整數；且R1為未經取代或經一或二個選自以下基團取代之苯基：鹵素、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、羥基、硝基，更佳為未經取代或經一或二個選自以下基團取代之苯基：氟、溴、甲氧基、羥基、硝基。
於根據本發明之具體實施態樣中，式(I)咖啡酸醯胺衍生物較佳係一選自以下群組之化合物： 以及
基質金屬蛋白酶主要可分為膠原蛋白酶(collagenase)、基質酶(stromelysin)、膠質酶(gelatinase)、基酶(matrilysin)、及膜型基質金屬蛋白酶(transmembrane type-MMP)等類型。常見之基質金屬蛋白酶包括基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)、基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶-10(MMP-10)、基質金屬蛋白酶-11(MMP-11)、基質金屬蛋白酶-12(MMP-12)、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)、及基質金屬蛋白酶-14(MMP-14)等。本文所述之咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽，尤其可有效抑制基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶-3及/或基質金屬蛋白酶 -9之活性與生成。
如上述，有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化會增加真皮層之MMP-1、MMP-3及MMP-9的量，進而增加膠原蛋白被分解的機會，使皮膚中的膠原蛋白含量減少，致使皮膚變得黯沉、甚至產生皺紋。本文所述之咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽，除了具有抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9的活性及/或生成之功效之外，亦具有抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化之功效，尤其可抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)、細胞外訊息調控蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)及p38蛋白質之磷酸化，從而避免膠原蛋白被破壞。
本文所述之咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽，另具有抑制酪胺酸酶活性、抑制酪胺酸酶生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-1生成、及/或抑制酪胺酸酶相關蛋白質-2生成之功效。酪胺酸酶、酪胺酸酶相關蛋白質-1、以及酪胺酸酶相關蛋白質-2皆為黑色素細胞(melanocyte)中參與黑色素生成作用的蛋白質，由於本文所述之咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽可抑制該等蛋白質之活性或生成，故可提供抑制黑色素生成之效益。
除了藉由前述抑制膠原蛋白分解以及抑制黑色素生成作用而達到抗皮膚老化之功效之外，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽另可吸收波長為210奈米至400奈米的紫外線，尤其可吸收波長為280奈米至335奈米的紫外線(即， UVA及UVB)。因此，可使用本文所述之咖啡酸醯胺衍生物以阻擋紫外線、減少穿透至皮膚真皮層中的紫外線的量，從而降低紫外線對皮膚的傷害。
由於本文所述之咖啡酸醯胺衍生物可同時提供(1)抗氧化；(2)直接抑制基質金屬蛋白酶活性及/或生成；(3)藉由抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化，進而抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之生成；(4)抑制黑色素生成作用；以及(5)吸收波長210奈米至400奈米的紫外線的功效，故可大幅降低皮膚中膠原蛋白被分解或變性的機會，並可抑制黑色素生成，進而有效改善、調理及/或修補皮膚，例如用於抗皮膚老化，尤其可達到抗皮膚光老化、減少皮膚皺紋、改善膚質及皮膚鬆弛現象、美白、減少皮膚黯沉、及斑點等美白護膚效果。
本文所述之式(I)咖啡酸醯胺衍生物可經由咖啡酸與一對應之胺類化合物(amine)進行縮合反應而提供。舉例言之，於本發明之一具體實施態樣中，可採用如下方法以合成本文所述之咖啡酸醯胺衍生物。首先，混合適量咖啡酸、二甲基甲醯胺(DMF)、三乙胺(Et3 N)、以及一對應之胺類化合物。接著，將混合物置於0℃冰浴，添加含有六氟磷酸鹽(BOP)之二氯甲烷(CH2 Cl2 )混合溶液進行反應約30分鐘，再移至於室溫下攪拌反應約12小時，抽除樣品中的二氯甲烷與二甲基甲醯胺。其後，使用水與乙酸乙酯(AcOEt)進行分配萃取，再將粗產物進一步進行管柱層析，最後將產物以乙酸乙酯再結晶純化，提供本文所述之咖啡酸醯胺衍生物。
於前述合成過程中，所採用之胺類化合物係與所欲之咖啡酸醯胺衍生物對應，其選用視該咖啡酸醯胺衍生物之結構上的取代基變化而定。舉例言之，於根據本發明之具體實施態樣中，係採用以下胺類化合物，以合成本文所述之式(1)至式(21)咖啡酸醯胺衍生物：苯乙胺(phenethylamine)、4-溴苯乙胺(4-bromophenethylamine)、3,4-二甲氧基苯乙胺(3,4-dimethoxyphenethylamine)、3-氟苯乙胺(3-fluorophenethylamine)、4-甲氧基苯甲胺(4-methoxybenzylamine)、3-氟苯甲胺(3-fluorobenzylamine)、苯胺(phenylamine)、4-溴苯胺(4-bromophenylamine)、4-甲氧基苯胺(4-methoxyphenylamine)、吡啶-4-基胺(pyridin-4-yl-amine)、吡咯-1-基胺(pyrrolidin-1-yl-amine)、丁胺(butylamine)、辛胺(octylamine)、苯甲胺(benzylamine)、戊胺(pentylamine)、己胺(hexylamine)、庚胺(heptylamine)、3-苯基丙胺(3-phenylpropylamine)、4-羥基苯乙胺(4-hydroxyphenethylamine)、4-羥基苯胺(4-hydroxyphenylamine)、哌啶-1-基胺、(piperidin-1-yl-amine)。
由於式(I)咖啡酸醯胺衍生物具有抑制膠原蛋白分解以及抑制黑色素生成之功效，可用於抗皮膚老化，本發明提供一種使用式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽於製造用於抗皮膚老化之藥劑的用途。其中，式(I)咖啡酸醯胺衍生物之取代基以及較佳實施態樣係如上文所述。
於本發明中，式(I)咖啡酸醯胺衍生物之醫藥可接 受鹽的例子，包括但不限於：鹼金屬鹽類，如鈉鹽及鉀鹽；鹼土金屬鹽類，如鈣鹽、鎂鹽及鋇鹽；過渡金屬鹽類，如鋅鹽、銅鹽、鐵鹽、鈷鹽、鈦鹽、釩鹽；鋁鹽；錫鹽；烷醇胺鹽類如二乙醇胺鹽、2-胺基-2-乙基-1,3-丙二醇鹽、及三乙醇胺鹽；雜環胺鹽類如嗎福林鹽(morpholine salts)、哌嗪鹽(piperazine salts)、及哌啶鹽(piperidine salts)；以及鹼胺鹽類如銨鹽、精胺酸鹽、離胺酸鹽、及組胺酸鹽等。
使用本文所述之式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽所製造之藥劑，可用於抗皮膚老化，尤其是用於抗皮膚之光老化，特別是透過抗氧化、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之活性、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、促進膠原蛋白生成、抑制酪胺酸酶活性、抑制酪胺酸酶生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-1生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-2生成、及/或吸收波長210奈米至400奈米的紫外線(尤其波長280奈米至335奈米的紫外線)而免除皮膚中膠原蛋白(尤其第一型膠原蛋白)之分解或變性，以及抑制黑色素生成。舉例言之，使用式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽所製造之藥劑，可透過前述作用機制，治療及/或延緩由UV照射所引起的相關皮膚老化疾病，例如皮膚鬆弛、皺紋、膚色黯沉、雀斑、黑斑、曬斑、老人斑等。
使用本文所述之式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽所製造之藥劑，可呈任何合宜的形式，端視所欲用途而定，並無特殊的限制。舉例言之，可呈供直接外用之軟膏、 霜劑或凝膠形式，亦可呈一般常見之藥劑形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、酊劑、靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑及乾粉懸液注射劑等等。
根據本發明，使用式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽所製造之藥劑之用量，可依所施用對象之年紀及施用目的(例如減少皮膚皺紋、或減少皮膚斑點)而加以調整，亦可視需要調整使用頻率。該藥劑亦可含有其它成分，端視藥劑之最終形式而定。舉例言之，當製備皮膚用之外用藥劑時，可添加任何合宜且適量的乳化劑、香料及其它可改善膚質之活性成分等。原則上，只要所添加的其它成分之種類及含量，不會對式(I)咖啡酸醯胺衍生物之功效有不利的影響即可。
本發明另關於一種使用式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽於製造護膚產品之用途，其中式(I)咖啡酸醯胺衍生物之取代基以及較佳實施態樣係如上文所述，且該護膚產品係用於改善、調理及/或修補皮膚，尤其可用於抗皮膚老化、抗皮膚之光老化、減少皮膚皺紋、緊實皮膚、防曬、美白、減少皮膚黯沉及斑點等。
根據本發明，使用式(I)咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽所製造之護膚產品可呈任何合宜的形式，並無特殊的限制。舉例言之，可呈供直接外用之乳液、乳霜、凝膠、防曬乳、防曬噴霧形式。或者，可將其製備成可供吞食或飲用的食品形式，例如健康食品、美容飲品等。
根據本發明，該護膚產品之用量，可依照所施用對象之年紀及施用目的(例如緊實皮膚、或美白)而加以調整，亦可視需要調整使用頻率。至於該護膚產品中之其它成分及其含量，端視護膚產品之最終形式而定。舉例言之，當製備美白之護膚產品時，可添加任何合宜且適量的乳化劑、香料及其它可美白之活性成分(例如，熊果素)等。
本發明另關於一種於一個體中抗皮膚老化的方法，其係包含於一有該需求之個體投予有效量之式(I)咖啡酸醯胺衍生物。其中，式(I)咖啡酸醯胺衍生物之取代基以及較佳實施態樣係如上文所述。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
[實施例] 實施例1：製備咖啡酸醯胺衍生物
依如下表1，視所欲之咖啡酸醯胺衍生物，選用對應之胺類化合物以進行相關製備。將100毫克咖啡酸溶解於含有1毫升二甲基甲醯胺、1毫升三乙胺、及1.2當量(N)胺類化合物的反應瓶中。接著，將反應瓶置於0℃冰浴，添加5毫升包含1.2當量濃度之六氟磷酸鹽(BOP)的二氯甲烷(CH2 Cl2 )混合溶液，攪拌30分鐘，移開冰浴，再於室溫攪拌12小時後，將反應瓶內的二氯甲烷與二甲基甲醯胺抽除。接著，使用水與乙酸乙酯(AcOEt)進行分配萃取，取乙酸乙酯層，依序以3當量濃度鹽酸水溶液酸洗、10%碳酸 鈉水溶液鹼洗、並以硫酸鎂除去多餘水，最後將乙酸乙酯溶劑抽除。接著，將粗產物進一步進行管柱層析，以二氯甲烷與乙酸乙酯比例為1：1之混合溶液進行流析純化，最後將產物以乙酸乙酯再結晶純化，以獲得咖啡酸醯胺衍生物。所製得之咖啡酸醯胺衍生物(式(1)至式(21))的結構式顯示於下表1。
實施例2：抗氧化試驗
(1)DPPH自由基清除試驗
以DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)作為自由基來源，檢測實施例1製備之咖啡酸醯胺衍生物清除自由基的能力。於一96微孔盤中，分別加入100微升不同濃度(1至50微莫耳濃度)之式(1)或式(2)化合物與100微升200微莫耳濃度DPPH溶液(溶於水中)，均勻混和後，於室溫下避光靜置30分鐘，再以一酵素免疫分析儀測定波長517奈米之吸光值。此試驗以50體積%丙二醇取代萃取物作為對照組，以抗壞血酸(維他命C)作為正對照組，並以甲醇取代DPPH作為背景值。以如下公式計算咖啡酸醯胺衍生物清除自由基的能力，結果顯示於表2、第1(a)圖及第1(b)圖。
表2、第1(a)圖及第1(b)圖之結果顯示，式(1)化合物可清除DPPH自由基，且具濃度依存性。其中，於式(1)化合物濃度25微莫耳濃度時，與同濃度抗壞血酸之清除率相當，於濃度50微莫耳濃度時之清除率更勝同濃度抗壞血酸之清除率，其SC50 為22.1±1.3微莫耳濃度。式(2)化合物對清除DPPH自由基亦具濃度依存性，其清除率於濃度25微莫耳濃度及50微莫耳濃度時均優於同濃度抗壞血酸之清除率，其SC50 為20.0±1.0抗壞血酸。
(2)ROS自由基清除試驗
首先，以劑量80毫焦耳/平方公分之UVB照射人 類纖維母細胞Hs68歷時30秒，使其細胞內ROS提升1.3倍。接著，添加50微升不同濃度(0至25微莫耳濃度)之實施例1所製備之式(1)或式(2)化合物至含有人類纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種104 個細胞)。於37℃、含有體積5%二氧化碳的培養箱中培養24小時後，檢測ROS的含量。實驗結果顯示於下表3、第2圖(a)圖及第2(b)圖。
表3、第2圖(a)圖及第2(b)圖之結果顯示，經式(1)化合物處理後，能清除細胞內的ROS，並具有濃度依存性。在式(1)化合物濃度為10微莫耳濃度時，細胞內ROS和未經咖啡酸醯胺衍生物處理之組別相當，且在濃度為25微莫耳濃度時，細胞內ROS降至0.8倍；經式(2)化合物處理後，在式(2)化合物濃度為5微莫耳濃度時，細胞內ROS和未照射組別相當，且在濃度為10微莫耳濃度和25微莫耳濃度時，細胞內ROS分別降至0.9及0.8倍。
實施例3：抑制基質金屬蛋白酶活性試驗
計數5×105 個人類纖維母細胞Hs68(生物資源保存 及研究中心(BCRC)編號：60038，購自食品工業發展研究所)，並培養於直徑10公分之培養皿(培養皿成分為以4毫莫耳濃度之L-麩醯胺調整至含有1.5公克/公升碳酸氫鈉、4.5公克/公升葡萄糖及10%胎牛血清的90% Dulbecco's modified Eagle's medium)中，待人類纖維母細胞Hs68生長至八分滿之密度後，移除培養液，再以5毫升磷酸鹽緩衝溶液潤洗細胞一次。接著，添加3毫升含有不同濃度(0至25微莫耳濃度)之實施例1所製備之式(1)或式(2)化合物之無血清(phenol red-free)培養液至培養皿中，作用1小時後，將細胞置於紫外線燈源(40毫焦耳/平方公分之UVB)下照射15秒。之後，依序添加含有不同濃度(0至25微莫耳濃度)之實施例1所製備之式(1)或式(2)化合物之無血清培養液至培養皿中，再置於37℃、含有5體積%之二氧化碳的培養箱中培養48小時後收取細胞。
以破碎緩衝溶液(包含100毫莫耳濃度正釩酸鈉(Na3 VO4 )、100毫克/毫升苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSFL)、20毫克/毫升亮肽素(Leupeptin)、50毫莫耳濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，pH 7.4)、37.5毫莫耳濃度氯化鈉、250毫莫耳濃度DL-二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol)、3毫莫耳濃度去氧膽酸鈉(Sodium deoxycholate)、1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)及1% IgepalTM CA-630(Sigma-Aldrich))處理收取之細胞，並輔以物理性震盪，使細胞膜破裂，再以離心方式沉澱細胞胞器及碎片，並收集上清液部分，上清液含有位於細胞質之蛋白質。接著，以膠片電泳法 (SDS-PAGE)分離獲得之蛋白質，並利用西方點墨法(western blotting)將其轉漬至一膜上，再利用抗原-抗體之原理，以抗體辨識標的蛋白，包括基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)及肌動蛋白(actin)，再以冷光顯影技術搭配分析軟體，利用LAS-4000(FUJIFILM)紀錄影像，並以multi Gauge V2.2(Steware Technology Inc.)進行定量分析，以測量標的蛋白之表現量變化。
第3(a)圖所示為經式(1)化合物處理後細胞之基質金屬蛋白酶的含量變化。於紫外線照射後，人類纖維母細胞之MMP-1、MMP-3、及MMP-9之表現量分別增加1.5、1.6及1.6倍。於經紫外線照射，再以實施例1所製備之式(1)化合物處理後，對細胞中經UVB誘導之MMPs蛋白質表現量具抑制效果，且有濃度依存性。其中，於式(1)化合物濃度為5微莫耳濃度時，能有效抑制MMP-1及MMP-3至1.0倍，且於濃度為25微莫耳濃度時能有效抑制MMP-9至0.7倍。
第3(b)圖所示為經式(2)化合物處理後細胞之基質金屬蛋白酶的含量變化。於紫外線照射後，Hs68人類纖維母細胞之MMP-1、MMP-3、及MMP-9之表現量分別增加1.4、1.7及2.1倍。於經紫外線照射，再以實施例1所製備之式(2)化合物處理後，對細胞中經UVB誘導之MMPs蛋白質表現量具抑制效果，且有濃度依存性。其中，於式(2)化合物濃度為5微莫耳濃度時，能有效抑制MMP-1至1.1倍，於濃度為25微莫耳濃度時能有效抑制MMP-3至1.0倍，且於濃度為10微莫耳濃度時能有效抑 制MMP-9至0.7倍。
實施例4：抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化試驗
由於紫外線所造成的皮膚光老化，會經由有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化作用而增加真皮層之基質金屬蛋白酶含量，故於此實驗中，使用西方點墨法分析咖啡酸醯胺衍生物對細胞內有絲分裂原活化蛋白激酶之磷酸化的影響，結果顯示於第4(a)圖及第4(b)圖。
如第4(a)所示，Hs68人類纖維母細胞在40毫焦耳/平方公分之UVB照射15秒後，三種有絲分裂原活化蛋白激酶(即，c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外訊息調控蛋白激酶(ERK)及p38)之磷酸化蛋白質的表現量分別增加2.2、1.7及1.6倍。但在收集細胞前，以實施例1所製備之式(1)化合物處理1小時，則可抑制磷酸化JNK、ERK及p38之表現，且有濃度依存性。於式(1)化合物濃度為10微莫耳濃度能有效抑制p-ERK、p-JNK及p-p38至1.2倍，且於濃度25微莫耳濃度時分別抑制p-ERK、p-JNK及p-p38至1.3、0.8及1.0倍。
如第4(b)所示，Hs68人類纖維母細胞在40毫焦耳/平方公分之UVB照射15秒後，JNK、ERK及p38之磷酸化蛋白質的表現量分別增加至1.4、1.6及1.3倍，在給予實施例1所製備之式(2)化合物後對UVB誘導之MAPKs蛋白質表現量具抑制效果，且有濃度依存性。於式(2)化合物濃度為10微莫耳濃度能有效抑制p-ERK至1.1倍，並於濃度5微莫耳濃度時分別抑制p-JNK及p-p38至1.1倍。
此試驗說明，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物，可經由抑制有絲分裂原活化蛋白激酶途徑來抑制基質金屬蛋白酶之生成，進而避免膠原蛋白分解。
實施例5：抑制活化子蛋白質-1基因轉錄因子試驗
紫外光照射細胞誘導JNK、p38活化c-Jun進入細胞核後，c-Fos會受ERK及p38之調控而進入核內，兩次單元c-Jun及c-Fos結合成活化子蛋白質-1(AP-1，activator protein 1)基因轉錄因子並參與基因表達，且促進基質金屬蛋白酶-1之訊息RNA(mRNA)之轉錄增加，另一方面也可以減少前膠原蛋白-Iα1(procollagen α1 of Type I collagen)的基因表現。因此，於此實驗中，使用西方點墨法進一步分析細胞核內活化子蛋白質-1蛋白質的表現，結果顯示於第5(a)圖及第5(b)圖。
如第5(a)圖所示，Hs68人類纖維母細胞在40毫焦耳/平方公分之UVB照射後24小時後，細胞核內c-Fos、p-c-Jun、c-Jun之蛋白質表現量分別提升至1.4、2.0及1.5倍，但在給予實施例1所製備之式(1)化合物後對UVB誘導之c-Fos、p-c-Jun及c-Jun蛋白質表現量具抑制效果，且有濃度依存性。於式(1)化合物濃度為5微莫耳濃度能有效抑制c-Fos至1.1倍，於濃度25微莫耳濃度時能有效抑制p-c-Jun至1.2倍，且於濃度10微莫耳濃度能有效抑制c-Jun至1.1倍。
如第5(b)圖所示，Hs68人類纖維母細胞在40毫焦耳/平方公分之UVB照射後24小時後，細胞核內c-Fos、p-c-Jun、c-Jun之蛋白質表現量分別提升至1.8、1.6及1.7倍，但在給予實 施例1所製備之式(2)化合物後對UVB誘導之c-Fos、p-c-Jun及c-Jun蛋白質表現量具抑制效果，且有濃度依存性。於式(2)化合物濃度為10微莫耳濃度能有效抑制c-Fos至1.1倍，於濃度25微莫耳濃度時能分別抑制p-c-Jun及c-Jun至1.1倍及1.2倍。
此試驗說明，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物，可藉由抑制紫外光誘導之有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化來影響活化子蛋白質-1進入細胞核內，從而抑制基質金屬蛋白酶-1與前膠原蛋白-Iα1的基因轉錄，避免膠原蛋白分解。
實施例6：促進膠原蛋白生成試驗
已知細胞中Smad3蛋白質可促進膠原蛋白-1(procollagen-1)表現，而Smad7蛋白質則會抑制Smad3蛋白質活化。當以紫外光照射細胞後，其前膠原蛋白-1及Smad3蛋白質的表現量會減少，且Smad7蛋白質的表現量則會增加。因此，於此實驗中，使用西方點墨法進一步分析細胞內前膠原蛋白-1、Smad3蛋白質及Smad7蛋白質的表現量，結果顯示於第6(a)圖及第6(b)圖。
如第6(a)圖所示，Hs68人類纖維母細胞在40毫焦耳/平方公分之UVB照射後24小時後，細胞內前膠原蛋白-1及Smad3蛋白質之表現量分別受抑制至0.1及0.3倍，Smad7蛋白質的表現量則增加至1.5倍，但在給予實施例1所製備之式(1)化合物後，於式(1)化合物濃度為25微莫耳濃度時可回復經UVB抑制之前膠原蛋白-1蛋白質表現量至0.7倍，對於Smad3之蛋白質表現量則無影響，但能有效抑制經UVB誘導之Smad7，並具濃 度依存性，於濃度5微莫耳濃度時能抑制Smad7至1.2倍，並於濃度10微莫耳濃度及25微莫耳濃度抑制Smad7至0.7倍。
如第6(b)圖所示，Hs68人類纖維母細胞在40毫焦耳/平方公分之UVB照射後24小時後，細胞內前膠原蛋白-1及Smad3蛋白質之表現量分別受抑制至0.06及0.3倍，Smad7蛋白質的表現量則增加至2.0倍，但在給予實施例1所製備之式(2)化合物後，於式(2)化合物濃度為25微莫耳濃度時可分別回復經UVB抑制之前膠原蛋白-1及Smad3蛋白質表現量至0.4倍及0.5倍，且能有效抑制經UVB誘導之Smad7，並具濃度依存性，於式(2)化合物濃度為25微莫耳濃度時抑制Smad7至1.1倍。
此試驗說明，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物可藉由增加前膠原蛋白-1及Smad3蛋白質的表現量，並抑制Smad7蛋白質的表現量，進而提高膠原蛋白的含量。
實施例7：抑制黑色素生成試驗
(1)黑色素含量分析
以5當量濃度NH4 Cl或0.5微莫耳濃度α-MSH刺激小鼠黑色素腫瘤細胞B16細胞(NH4 Cl處理組別：2×105 個細胞，處理24小時；α-MSH處理組別：7×104 個細胞，處理48小時)，以誘導黑色素生成。接著，再分別給予不同濃度(1微莫耳濃度至50微莫耳濃度)實施例1所製備之式(1)、式(2)、式(4)、式(6)、式(8)、式(9)、式(12)、式(13)、式(19)之咖啡酸醯胺衍生物處理經NH4 Cl或α-MSH刺激之B16細胞，以抑制黑色素生成。接著，以西方點墨法分析細胞內黑色素的含量，實驗以熊果 素(arbutin)作為正對照組，結果如第7(a)圖至第7(k)圖所示。
第7(a)圖至第7(i)圖所示依序為經NH4 Cl刺激並經本發明式(1)、式(13)、式(4)、式(8)、式(12)、式(19)、式(9)、式(2)、或式(6)化合物處理之B16細胞內黑色素的含量；第7(j)圖至第7(k)圖所示為經α-MSH刺激並經本發明式(9)或式(2)化合物處理之B16細胞內黑色素的含量。由第7(a)圖至第7(k)圖所示之實驗結果可知，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物可有效抑制細胞表現黑色素，具有美白功效。
(2)酪胺酸酶活性分析
已知酪胺酸酶為參與黑色素生成作用的主要蛋白質之一。本實驗以不同濃度(5微莫耳濃度至125微莫耳濃度)實施例1所製備之式(9)或式(2)化合物處理B16細胞(1.5×104 個)48小時，再以西方點墨法分析細胞內酪胺酸酶的活性。
第8圖(a)圖之結果顯示，經式(9)化合物處理後，能抑制細胞內酪胺酸酶的活性，且具有濃度依存性；第8(b)圖之結果顯示，經式(2)化合物處理後，能抑制細胞內酪胺酸酶的活性。此實驗結果顯示本文所述之咖啡酸醯胺衍生物可經由抑制酪胺酸酶的活性而抑制黑色素生成，提供美白效益。
(3)酪胺酸酶表現量分析
於黑色素生成路徑中，除了酪胺酸酶為參與黑色素生成的主要蛋白質之外，已知黑色素皮質素接受器1(MC1R)、酪胺酸酶相關蛋白質-1(TRP-1)、酪胺酸酶相關蛋白質-2(TRP-2)、及 小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)亦為參與黑色素生成路徑的相關蛋白質。本實驗以0.5微莫耳濃度α-MSH刺激B16細胞(5×105 個)24小時，以誘導黑色素生成。接著，再分別給予不同濃度(0微莫耳濃度至50微莫耳濃度)之實施例1所製備之式(1)、式(6)、式(9)、或式(2)之咖啡酸醯胺衍生物處理經α-MSH刺激之B16細胞，以抑制黑色素生成。接著，以西方點墨法分析細胞內MC1R、TRP-1、TRP-2、MITF、以及酪胺酸酶的蛋白質表現量，實驗以熊果素作為正對照組。
第9圖(a)圖至9圖(d)圖分別顯示經式(1)、式(6)、式(9)、或式(2)之化合物處理之B16細胞進行西方點墨法分析的結果。此實驗結果顯示本文所述之咖啡酸醯胺衍生物可抑制B16細胞中受α-MSH誘導之MC1R、TRP-1、TRP-2、MITF、以及酪胺酸酶的蛋白質表現量，因此可有效抑制黑色素生成。
實施例8：紫外線吸收試驗
本實驗分別將2毫克實施例1所製備之式(1)、式(6)、式(9)、式(2)、式(8)、或式(5)化合物溶於100毫升甲醇中，並測試其於215奈米至400奈米紫外線波長內的最大吸收波長(λmax)(單位為奈米)以及莫耳吸收係數ε之對數值(logε)，結果如下表4所示。
表4之試驗結果顯示本文所述之咖啡酸醯胺衍生物可吸收215奈米至335奈米波長之紫外線，且其ε值亦超過10000(即，logε大於3)，為良好的UVB阻斷劑。
實施例9：安全性評估試驗
(1)細胞毒性評估
以MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)測定法觀察本文所述之咖啡酸醯胺衍生物之細胞毒性。首先，分別將不同濃度(0至100微莫耳濃度)之本發明實施例1所製備之式(1)或式(2)化合物加入至含有人類纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種104 個細胞)。於37℃、含有5體積%之二氧化碳的培養箱中培養24小時後，添加15微升之MTT溶液(5毫克/毫升，溶於磷酸鹽緩衝溶液中)，再將人類纖維母細胞Hs68培養3小時。接著，添加75微升之十二基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液(10%之SDS溶於0.01當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中，並於24小時後，以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值。最後，利用以下公式計算細胞存活率，以觀察萃取物之細胞毒性。結果係顯示於下表 5、第10(a)圖、及第10(b)圖。
細胞存活率(%)=實驗組之吸光值/控制組之吸光值×100
如表5、第10(a)圖、及第10(b)圖所示，以100微莫耳濃度之高濃度本發明之咖啡酸醯胺衍生物處理人類纖維母細胞Hs68後，仍不具有細胞毒性，此實驗說明，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物對細胞不具毒性。
(2)皮膚一次性刺激性試驗
首先，分別將20毫克(低劑量)及80或100毫克(高劑量)之實施例1所製備之式(1)或式(2)化合物溶於1毫升之40% PEG-400溶液中。接著，將紐西蘭大白兔固定於兔架上，剃除其背毛，以色筆畫出每格2.5公分x 2.5公分之塗抹範圍，共6格，分為角質層完整組(intact)及角質層磨損組(abraded)。角質磨損組以無菌針頭在大白兔皮膚上之格子內輕劃四條平行線，破壞其角質層，但不可見血。分別將低劑量及高劑量之式(1)或式 (2)化合物均勻塗抹於格內。24小時後，以生理食鹽水輕拭大白兔皮膚以移除式(1)或式(2)化合物，並於24小時及72小時兩個時間點分別觀察刺激程度並求出皮膚刺激指數(Primary Irritation Index，PII)，若有產生刺激性則延長觀察時間。刺激程度及皮膚刺激指數之評分標準係如以下表6所示。
此試驗之統計方法係以ANOVA(變異數分析)及Student’s t-test進行數據分析，若p<0.05則表示於統計上有顯著差異。各實驗係進行三次以上，實驗結果係以平均±標準誤差表示。實驗結果係顯示於表7A、表7B、第11(a)圖至第11(d)圖、及第12(a)圖至第12(d)圖。
如表7A、表7B、第11圖、及第12圖所示，無論於低劑量(20毫克)或高劑量(80毫克或100毫克)下，處理24小時及72小時後，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物對完整或受損之皮膚並無產生任何刺激，其皮膚刺激指數皆為「0.0」，屬於「無刺激(non-irritation)」之刺激範圍。此試驗顯示，本文所述之咖啡酸醯胺衍生物不會對皮膚產生刺激性。
以上實施例顯示本文所述之咖啡酸醯胺衍生物具有抗氧化、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之活性、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸化、 促進膠原蛋白生成、抑制酪胺酸酶活性、抑制酪胺酸酶生成、抑制酪胺酸酵酶相關蛋白質-1生成、抑制酪胺酸酵酶相關蛋白質-2生成、及吸收波長210奈米至400奈米的紫外線的功效，可用於改善、調理及/或修補皮膚，尤其可用於抗皮膚之光老化及美白。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後附申請專利範圍所界定者。

Claims (7)

  1. 一種使用一咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽於製造藥劑之用途，其中，該咖啡酸醯胺衍生物係一選自以下群組之化合物： 以及；以及其中該藥劑係用於抗皮膚老化。
  2. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於抗皮膚之光老化。
  3. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於抗氧化、抑制基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)及基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)之活性、抑制MMP-1、MMP-3及MMP-9之生成、抑制有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAP Kinase)磷酸化、促進膠原蛋白生成、抑制酪胺酸酶活性、抑制酪胺酸酶生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-1(Tyrosinase related protein-1)生成、抑制酪胺酸酶相關蛋白質-2(Tyrosinase related protein-2)生成、及/或吸收波長210奈米至400奈米的紫外線。
  4. 如請求項3之用途，其中該藥劑係用於促進第一型膠原蛋白生成、及/或抑制黑色素生成。
  5. 如請求項1至4任一項之用途，其中該藥劑係用於吸收波長280奈米至335奈米的紫外線。
  6. 一種使用一咖啡酸醯胺衍生物及/或其醫藥上可接受的鹽於製造護膚產品之用途，其中，該咖啡酸醯胺衍生物係一選自以下群組之化合物： 以及；以及其中該護膚產品係用於改善、調理及/或修補皮膚。
  7. 如請求項6之用途，其中該護膚產品係用於抗皮膚之光老化及/或美白。
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