DE69733968T2

DE69733968T2 - Norbornen- und norbornandiolen zur behandlung von pigmentierungsstörungen, neurodegenerativen erkrankungen oder proliferativen hauterkrankungen

Info

Publication number: DE69733968T2
Application number: DE69733968T
Authority: DE
Inventors: A. David BROWN; A. Alexander KHORLIN; Krystyna Lesiak; Yun Wu REN
Original assignee: Applied Genetics Inc
Current assignee: Applied Genetics Inc
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-09-19
Also published as: EP0957903A1; CA2266496A1; EP0957903B1; ES2245465T3; ATE301459T1; DE69733968D1; AU740783B2; EP0957903A4; DK0957903T3; AU4584297A; US5990177A; US6294585B1; WO1998011882A1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrrifft die Verwendung von Diolen von Norbornen oder Norbornan-Verbindungen in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung, Prävention oder Veränderung einer Erkrankung oder eines Zustandes, die (der) durch Mängel im NO/cGMP/PKG-Signaltransduktionsweg vermittelt werden, und die aus Hypopigmentierungsstörungen; proliferativen Hautstörungen oder Keratinisierungsstörungen; neurodegenerativen Störungen; Herzkrankheit, einschließlich stabiler Angina pectoris, instabiler Angina, Herzinfarkt, Herzversagen, das mit Herzischämie verbunden ist, Arteriosklerose, vaskulärer Hypertrophie und Thrombose, Hypertension, Schlaganfall, primärer pulmonarer Hypertension, chronisch obstruktiver Lungenkrankheit, Schocklunge, mikrovaskulären funktionellen Abnormalitäten bei Diabetes; hämostatischen Irregularitäten der glomerulären, vaskulären und tubulären Funktion; Störungen der Blasenfunktion und der Reflexrelaxation zur Blasenentleerung; Störungen der Neurotransmitterfreisetzung, Neuron-Morphogenese, synaptischer Plastizität und neuroendokriner Regulation; regionalem Schmerz, einschließlich Migräne-Kopfschmerz; benigner Analerkrankung; Impotenz, Hemmung des Tumorwachstums; oder Stimulation der Wundheilung ausgewählt ist.
2. Beschreibung des Stands der Technik
US-Patent Nr. 5 352 440 betrifft die Erhöhung der Melaninsynthese in Melanozyten und die Erhöhung der Pigmentierung durch Verabreichung bestimmter Diacylglycerol-Verbindungen.
US-Patent Nr. 5 532 001 betrifft die Erhöhung der Pigmentierung in der Säugetierhaut über eine Verabreichung bestimmter DNA-Fragmente.
US-Patent Nr. 5 554 359 betrifft die Erhöhung der Konzentrationen an Melanin in Melanozyten durch Verabreichung von lysosomotropen Mitteln.
Krieger (Arzneimittelforschung, Bd. 18, Nr. 3, 1968, Seiten 324–330) beschreibt die medizinische Verwendung von 5-Norbornen-2,2-dimethanol (Struktur XI-C) und von 2,6-Norbornandiol als Choleretika.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer oder mehrere Diole von Norbornan oder Norbornen-Verbindungen, wie unten definiert, in der Herstellung eines Medikamente zur Behandlung, Prävention bzw. Vorbeugung oder Veränderung einer Erkrankung oder eines Zustandes bereit, die durch Mängel im NO/cGMP/PKG-Signaltransduktionsweg vermittelt werden, ausgewählt aus Hypopigmentierungsstörungen; proliferativen Hautstörungen oder Störungen der Keratinisierung; neurodegenerativen Störungen; Herzkrankheit, einschließlich stabiler Angina Pectoris, instabiler Angina, Herzinfarkt, mit Herzischämie verbundenem Herzversagen, Atheriosklerose, vaskulärer Hypertrophie und Thrombose, Hypertension; Schlaganfall; primärer pulmonarer Hypertension, chronisch obstruktiver Lungenkrankheit, Schocklunge, mikrovaskulären funktionellen Abnormalitäten bei Diabetes; hämostatischen Irregularitäten der glomerulären, vaskulären und tubulären Funktion; Störungen der Blasenfunktion und der Reflexrelaxation zur Blasenentleerung; Störungen der Neurotransmitterfreisetzung, Neuron-Morphogenese, synaptischer Plastizität und neuroendokriner Regulation; regionalem Schmerz, einschließlich Migränekopfschmerz; benigner Analerkrankung; Impotenz; Hemmung des Tumorwachstums; und Stimulierung der Wundheilung ausgewählt ist:

wobei:
jedes R₆ unabhängig aus Wasserstoff; Halogen oder einer Gruppe, die von 1 Atom bis 20 Atome enthält, von denen eines Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ist; Hydroxyl, Hydroxymethyl,
-(CH₂)_nOH, -(CH₂)_nOR₁, -(CH₂)_n-CH(OH)-CHOH,
-(CH₂)_n-CH(OH)-CH(OH)R₁, -(CH₂)_n-CH(OH)-(CH₂)_n-CH₂(OH),
-(CH₂)_n-CH(OH)-(CH₂)_n-CH(OH)R₁ oder -CH₂OR₃ ausgewählt ist, wobei jedes n unabhängig 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 25 ist;
jedes R₁ unabhängig aus Wasserstoff; Halogen; oder einer Gruppe ausgewählt ist, die von einem Atom bis 20 Atome enthält, von denen eines Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ist; und
jedes R₃ unabhängig aus Wasserstoff oder einer Acyl- oder Aminoacylgruppe ausgewählt ist, die von 1 Atom bis 20 Atome enthält, von denen zumindest eines Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ist;
und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A bis 1D sind Ausdrucke eines Oncor Imaging System^TM von Fontana-Massongefärbten Meerschweinchen-Hautbiopsieproben, wie in Beispiel 5 beschrieben ist.
2 ist eine Serie von Balkendiagrammen, die die Struktur-Aktivitäts-Ergebnisse beschreiben, die in Beispiel 7 erzielt wurden.
Die 3A bis 3D sind Ausdrucke von normalen humanen epidermalen Melanozyten und Melanosomen, wie in Beispiel 8 beschrieben ist.
Die 4A bis 4B sind Ausdrucke, wie in Beispiel 10 beschrieben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf einer einzigartigen Beobachtung, dass bestimmte Verbindungen effektiv und effizient eine Melanogenese in Säugetierzellen induzieren, was mehrere Konsequenzen hat. Zunächst führt die Erhöhung der Melanogenese zu einer Erhöhung des Melaningehaltes der Melanozyten und resultiert daher in einer erhöhten Pigmentierung oder dunkleren Färbung der Haut, der Haare, der Wolle oder des Fells. Somit ist die vorliegende Erfindung bei der Behandlung von Hypopigmentierungsstörungen, wie beispielsweise des Albinismus, von Vitiligo etc. von Nutzen. Es wird ebenfalls angenommen, dass die Erhöhung der Pigmentierung der Haut gemäß der vorliegenden Erfindung eine solche Haut vor einer anschließenden UV-Lichtschädigung, Sonnenbrand, durch Licht verursachten Alterung und Entwicklung von Hautkrebs schützen wird. Weil zuletzt die hierin beschriebenen Zusammensetzungen die Differenzierung von Melanomzelllinien induzieren, kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, hyperproliferative Störungen wie beispielsweise aktinische Keratosen, Basalzellkarzinom, Plattenepithelzellkarzinom, fibröses Histiozytom, Dermatofibrosarcoma protuberans, Hämangiom, Nävus flammeus, Xanothom, Kaposi-Sarkom, Mastozytose, Mycosis fungoides, Lentigo, Nävuszellnävus, Lentigo maligna, Malignes Melanom und metastasierendes Karzinom, zu behandeln.
Die vorliegenden Zusammensetzungen sind ebenfalls bei der Behandlung von Erkrankungen von Nutzen, die durch Entzündung und Störung der Keratinisierung gekennzeichnet sind, einschließlich Psoriasis vulgaris, Psoriasis eosinophilia, Acne vulgaris, Acne conglobata, Acne fulminans, Osteoma cutis, nodulozystische Akne, und zystische Akne.
Die Verbindungen erhöhen ebenfalls effektiv und effizient die Differenzierung von neuronalen Zellen, einschließlich einer erhöhten neuronalen Dendrizität und einer neuronalen Tyrosin-Hydroxylase-Aktivität, was mehrere Konsequenzen nach sich zieht. Zunächst führt die Erhöhung der Dendrizität zu einer erhöhten neuronalen Kommunikation bzw. Verbindung, wodurch die neuronale Funktion und Leistung erhöht wird. Somit ist die vorliegende Erfindung zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen von Nutzen, die durch eine Reduktion der neuronalen Dendrizität und Funktion gekennzeichnet sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Parkinon'sche Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer Krankheit oder irgendeine andere neurodegenerative Erkrankung oder eine physikalische oder toxische Schädigung des Gehirns, von spinalen oder peripheren Nervenzellen. Weiterhin ist die vorliegende Erfindung zur Wiederherstellung oder Optimierung der neuronalen Kommunikation, Funktion oder Leistung von Nutzen.
Zweitens erhöht die Zunahme der Tyrosin-Hydroxylase-Aktivität direkt die Dopaminsynthese. Somit ist die vorliegende Erfindung besonders zur Behandlung der Parkinson-Krankheit von Nutzen, die insbesondere durch eine Depletion bzw. Abreicherung der Dopaminsynthese gekennzeichnet ist.
Drittens kehrt die Induktion der neuronalen Differenzierung neuronale proliferative Störungen um. Somit ist die vorliegende Erfindung zur Behandlung von neuronalen proliferativen, tumorösen oder kanzerösen Störungen von Nutzen oder von solchen Störungen in irgendeinem anderen Zelltyp, der in ähnlicher Weise betroffen sein mag.
Die vorliegende Erfindung ist zuletzt zur Behandlung zusätzlicher neurodegenerativer Erkrankungen oder Neuropathien, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, diffuse zerebrale kortikale Atrophie, Lewy-Body-Demenz, Pick-Syndrom bzw. Pick-Krankheit, mesolimbokortikale Demenz, Thalamusdegeneration, Chorea Huntington, kortikal-striatalspinale Degeneration, kortikal-basale Ganglion-Degeneration, zerebrozerebellare Degeneration, familiäre Demenz mit spastischer Paraparese, Polyglucosan-Körperkrankheit, Shy-Drager-Syndrom, olivopontozerebelläre Atrophie, progressive supranukleäre Lähmung, Dystonia musculorum deformans, Hallervorden-Spatz-Krankheit, Meige-Syndrom, familiär bedingtes Zittern, Gilles de la Tourette-Syndrom, akanthozytische Chorea, Friedreich-Ataxie, familiäre kortikale zerebelläre Holmes-Atrophie, Gerstmann-Straussler-Scheinker-Krankheit, progressive spinale Muskelatrophie, progressive Bulbärparalyse, primäre Lateralsklerose, erbliche Muskelatrophie, spastische Paraplegie, Peronäusmuskelatrophie, hypertrophe interstitielle Polyneuropathie, Heredopathia atactica polyneuritiformis, optische Neuropathie und Ophthalmoplegia.
Es hat sich ebenfalls herausgestellt, dass die vorliegende Klasse von Verbindungen eine Wirkung aufweist, die durch die Radikalfänger von Stickoxid (NO) und durch Inhibitoren von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) oder Inhibitoren von cGMP-aktivierter Proteinkinase (PKG) blockiert wird. Dies zeigt, dass diese Verbindungen über den NO/cGMP/PKG-Signaltransduktionsweg wirken. Anders als frühere Verbindungen wie Nitroglyzerin und Isosorbiddinitrat, die diesen Weg durch Freisetzung von NO nach Reaktion mit intrazellulären Sulfhydryl-Gruppen stimulieren (Smith und Reynard, 1992, Pharmacology, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA, Seiten 626–631), scheinen die in dieser Erfindung verwendeten Verbindungen durch direkte Stimulierung der Stickoxidsynthase (NOS)-Aktivität zu wirken und erzeugen somit NO de novo. Während die Depletion von intrazellulären Sulfhydryl-Gruppen rasch zu einer Toleranz und Unwirksamkeit von Nitroglyzerin und verwandten Verbindungen führt (Smith und Reynard, 1992), kann eine Toleranz gegenüber den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen nicht auftreten, weil diese das Vorhandensein von Sulfhydryl-Gruppen zur Erzeugung nicht erfordern. Es wird somit erwogen, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen ein bevorzugtes alternatives Behandlungsverfahren für Zustände bereitstellen, die gegenwärtig mit NO-Donoren behandelt werden.
Sowohl klinische Anwendung als auch Forschungsstudien haben demonstriert, dass die Stimulierung des NO/cGMP/PKG-Weges zur Behandlung von Folgendem von Nutzen ist:

(i) Herzkrankheit, einschließlich stabiler Angina pectoris, instabiler Angina, Herzinfarkt, und Herzfehler, der mit Myocardischämie in Verbindung steht, Arteriosklerose, vaskulärer Hypertrophie und Thrombose (Cooe und Dzau, 1997, Annu. Rev. Med. 48: 489–509; Thadani, 1997, Cardiovasc. Drugs 10: 735);
(ii) Hypertension (Cooe und Dzau, 1997);
(iii) Schlaganfall (Samdani, et al., 1997, Stroke 28: 1283–1288);
(iv) primäre pulmonare Hypertension, chronische obstruktive Lungenkrankheit und Schocklunge (Adnot und Raffestin, 1996, Thorax 51: 762–764; Marriott und Higenbottam, 1997, Schweiz Med. Wochenschr. 127: 709–714);
(v) mikrovaskuläre funktionelle Abnormalitäten bei Diabetes, die die Insulin-Resistenz mit Hypertension, Thrombose und Arteriosklerose verbinden (Tooke et al., 1996, Diabetes Res. Clin. Pract. 31 Erg.: S127–5132; Baron, 1996, J. Investig. Med. 44: 406–412);
(vi) hämostatische Irregularitäten der glomerulären, vaskulären und tubulären Funktion mit Konsequenzen für die Entwicklung der Hypertension (Kone und Baylis, 1997, Am. J. Physiol. 10: F561–578; Am. J. Hypertens. 10: 129–140); Blasen
(vii) Störungen der Blasenfunktion und Reflexrelaxation zur Blasenentleerung (Andersoon, 1996, Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 8: 361–365);
(viii) Störungen der Neurotransmitterfreisetzung, Neuronmorphogenese, synaptischen Plastizität und neurnendokrinen Regulation (Dawson und Dawson, 1996, Neurochem, Int. 29: 97–110; Brann et al., 1997, Neurnendocrinology 65: 385–395);
(ix) regionaler Schmerz einschließlich von Migräne-Kopfschmerzen (Mashimo et al., 1997, J. Clin. Pharmacol. 37: 330–335; Packard und Ham, 1997, Mar. 37: 142–152);
(x) gastrointestinaler Schutz vor nicht-steroidalen antiinflammatorischen Arzneistoffen (Rishi, et al., 1996, Indian J. Physiol. Pharmacol. 40: 377–379);
(xi) benigne Analkrankheit (Gorfine, 1995, Dis. Colon Rectum 28: 453–456);
(xii) Impotenz (Andersson und Stief, 1997, World J. Urol. 15: 14–20);
(xiii) Regulation der Gewebsverletzung durch freie Radikale (Rubbo et al., 1996, Chem. Res. Toxicol. 9: 809–820); und
(xiv) Inhibition des Tumorwachstums, der Tumorapoptose, der Angingenese und Metastase (Pipili-Synetos, et al., 1995, Br. J. Pharmacol. 116: 1829–1834; Xie, et al., 1996, J. Leukoc, Biol. 59: 797–803); und
(xv) Stimulierung der Wundheilung einschließlich von Schnitten-Bänderverletzung und Verletzungen durch Wärme (Schaffer et al., 1996, J. Surg. Res. 63: 237–240; Murrell, et al., 1997, Inflamm. Res. 46: 19–27; Carter et al., 1994, Biochem. J. 304 (Pt 1): 201–04).

Zusätzlich vermittelt der NO/cGMP/PKG-Weg die Melanogenese, die durch UV-Licht (Romero-Graillet, et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 28052–28056; Romero-Graillet, et al., 1997, J. Clin. Invest. 99: 635–642) und die durch aliphatische und alizyklische Diole induziert wird (US-Patentanmeldung S. N. mit dein Titel „Dermatological Compositions and Methods", gleichzeitig hiermit eingereicht).
Die aktiven Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weisen die oben beschriebenen Strukturen auf. Insbesondere ist jedes R₁ unabhängig aus Wasserstoff; Fluor; Chlor; oder C₁-C₂₀ Alkyl, C₂-C₂₀ Alkenyl, C₂-C₂₀ Alkinyl, C₇-C₂₀ Aralkyl, C₈-C₂₀-Alkenyl, C₈-C₂₀ Aralkinyl oder C₆-C₂₀ Aryl ausgewählt, von denen jedes ein oder mehrere unterschiedliche Heteroatome oder Heteroatome desselben Typs oder Carboxyl, Carboxymido, Carbalkoxy, Sulfamido, Sulfonamido; Hydroxyl oder Amino enthalten kann. Besonders bevorzugt ist jedes von R₃ unabhängig aus Wasserstoff oder C₁-C₁₈ Acyl ausgewählt, was eine oder mehrere unterschiedliche Heteroatome oder Heteroatome desselben Typs enthalten kann.
Die Herstellung der vorliegenden Verbindung ist für den Durchschnittsfachmann offensichtlich und viele von diesen sind kommerziell erhältlich. Repräsentative bevorzugte Verbindungen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf:
5-Norbornen-2,2-dimethanol
Norbornan-2,2-dimethanol
2,3-Norbonandiol (exo oder endo oder cis oder trans)
2,3-cis-exo-Norbornandiol
2-Endohexadecylamino-5-norbornan-2,3-exo-dimethanol
2-(Propyl-1,2-diol)-norbornan.
Besonders bevorzugte Verbindungen, die in dieser Erfindung verwendet werden, sind 5-Norbornen-2,2-dimethanol; Norbornan-2,2-dimethanol; 2,3-cis-exo-Norbornandiol, 2-(Propyl-1,2-diol)-norbornan.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzungen ziehen die Verwendung einer oder mehrerer der oben erwähnten Verbindungen als aktive Inhaltsstoffe für verschiedene Anwendungszwecke in Betracht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der aktive Inhaltsstoff (die aktiven Inhaltsstoffe) mit einem akzeptablen Träger kombiniert, so dass sich eine topische Zubereitung ergibt, die auf der Haut zu dermatologischen Zwecken angeordnet werden kann. Topische Zubereitungen können Salben, Lotionen, Pasten, Cremes, Gele, Tropfen, Suppositorien, Sprays, Flüssigkeiten, Shampoos, Puder oder transdermale Pflaster einschließen. Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispergierhilfen oder Bindemittel können nach Bedarf verwendet werden. Vorzugsweise besteht eine Funktion der Träger darin, die Hautpenetration des aktiven Inhaltsstoffes (der aktiven Inhaltsstoffe) zu erhöhen, und sollte dazu in der Lage sein, den aktiven Wirkstoffe) an Melanozyten unter in vivo-Bedingungen zu liefern. Geeignete Träger sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt und schließen Liposome, Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Vaseline (Petrolatum), Mineralöl (flüssige Vaseline), Wasser, Dimethylformamid, Dekaoxyethylen-oleylether, Oleinsäure, 2-Pyrrolidon und Azone^®-Markenpenetrationsverstärker (Upjohn) ein. Eine besonders bevorzugte Zusammensetzung schließt einen aktiven Inhaltstoff(e) wie oben beschrieben ein, mit einem 2-Pyrrolidon, Ölsäure und/oder Azone^® als Penetrationsverstärker, solubilisiert in einer Grundlage aus Wasser, Ethanol, Propanol und/oder Propylenglycol (der letztere Bestandteil hat die Eigenschaften eines Trägers, Penetrationsverstärkers und eines aktiven Inhaltsstoffs, wie hierin beschrieben). Abhängig von der spezifischen Anwendung können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weitere aktive Inhaltsstoffe einschließen, ebenso wie inerte oder inaktive Inhaltsstoffe.
Die Dosierungsvorschrift hängt von mehreren Faktoren ab, die leicht bestimmt werden können, wie beispielsweise Schweregrad und Ansprechbarkeit des zu behandelnden Zustandes, wird jedoch normalerweise ein oder mehrere Dosen pro Tag sein, wobei der Behandlungsverlauf von mehreren Tagen bis mehrere Monate dauert oder bis eine Heilung bewirkt wird, oder eine Verringerung des Erkrankungszustandes erreicht wird oder bis ein kosmetisch erwünschter Grad der Melanogenese (Bräunung) erreicht wird, abhängig von der Anwendungsart. Der Durchschnittsfachmann kann in einfacher Weise optimale Dosierungen, Dosierungsmethodologien und Wiederholungsraten bzw. Geschwindigkeiten bestimmen. Es wird im Allgemeinen ins Auge gefasst, dass topische Zubereitungen (beispielsweise Cremes, Lotionen, Lösungen etc.) eine Konzentration an aktivem Inhaltsstoff von ungefähr 0,01% bis ungefähr 50%, vorzugsweise von ungefähr 0,1% bis ungefähr 10%, aufweisen werden. Es wird im Allgemeinen ins Auge gefasst, dass die Einzeldosisform-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung von ungefähr 0,01 mg bis ungefähr 100 mg aktiven Inhaltsstoff, vorzugsweise von ungefähr 0,1 mg bis ungefähr 10 mg aktiven Inhaltsstoff enthalten werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass die gegenständlichen Verbindungen, die die Melaninproduktion stimulieren, über den Stickoxid/zyklischen Guanosinmonophosphat/Proteinkinase G („NO/cGMP/PKG") Weg wirken. Somit schließt die vorliegende Erfindung die oben beschriebenen Verbindungen ein, die über den NO/cGMP/PKG-Weg wirken, um die Melaninsynthese durch Erhöhung der zellulären Produktion von NO, cGMP oder PKG zu stimulieren. Umgekehrt werden Mittel, die die zelluläre Produktion an NO, cGMP oder PKG senken, die Melaninproduktion und Pigmentierung in Säugetierhaut, Haare, Fell oder Wolle senken oder unterdrücken. Dies ist beispielsweise nützlich bei der Aufhellung der Haut, des Haares, der Wolle oder des Fells für kosmetische Zwecke oder für die Behandlung der Hyperpigmentierung oder ungleichmäßigen Pigmentierungsstörungen, wie beispielsweise Vitiligo, dermale Melanozytose, Franceschetti- Jadassohn-Syndrom etc. Für solche Depigmentierungsanwendungen würde die Formulierung und Dosierung bezüglich der Pigmentierungsanwendungen wie oben beschrieben sein.
Die Entdeckung des Weges, durch den die vorliegenden Verbindungen funktionieren, führt ebenfalls zu Verfahren zum Screening von Verbindungen mit einer melanogenen Aktivität und Wirksamkeit oder nach deren Fähigkeit, die Melanogenese zu reduzieren oder zu unterdrücken, auf Grundlage der Messung der Erzeugung von Stickoxid (NO) oder der Messung der Stickoxidsynthese (NOS)-Aktivität. Verfahren zur Messung von NO oder NOS schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, die folgenden wohl bekannten Verfahren. Die Messung von NO basiert üblicherweise auf der Tatsache, das sich NO in wässrigen Lösungen rasch zu Nitrat und Nitrit versetzt. Die Nitrat-Reduktase wird dem Kulturmedium oder den Zellextrakten zugesetzt, um die vollständige Umwandlung von Nitrat zu Nitrit sicherzustellen. Griess-Reagenzien (Sulfanilamid und N-[1-Naphthyl]-ethylendiamin) werden darauf zugesetzt, um Nitrit in einen dunkelviolettfarbenen Azo-Farbstoff umzuwandeln, der maximal bei 540 nm absorbiert (Schmidt, et al., 1995, Biochemica 2: 22). Die Reaktionen werden typischerweise in einem 96-Well-Format mit Extinktionen durchgeführt, die auf einem Mikrotiterplattenlesegerät abgelesen werden. Alternativ wird im Anschluss an die Umwandlung von Nitrat zu Nitrit wie oben beschrieben DAN-Reagenz (2,3-Diaminonaphthalin), gefolgt von NaOH, zugesetzt, das Nitrit in die fluoreszierende Verbindung 1(H)-Naphthotriazol umwandelt. Dies wird fluorimetrisch unter Anregung bei 365 nm und Emission bei 450 nm typischerweise in einem 96-Well-Format gemessen (Miles et al., 1995, Methods 7: 40). Die NOS-Aktivität wird durch Zusetzen von [³H]-Arginin zu intakten Geweben oder Proteinextrakten gemessen und durch Messen der Freisetzung von 3H, die sich aus der Umwandlung von Arginin zu Citrullin während der enzymatischen Bildung von NO durch NOS ergibt (Baudouin und Tachon, 1996, J. Invest. Dermatol. 106: 428–431). Alternativ kann die Produktion von cGMP oder die Aktivität von PKG als Screeningwerkzeug verwendet werden. cGMP kann durch kommerziell erhältlichen Immunassay (siehe Romero-Graillet, et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 28052–28056) gemessen werden. PKG kann durch zyklische GMP-abhängige Kination eines primären Histon-Targets gemessen werden (siehe Hidaka, et al., Biochemistry 1984, 23, 5036–5041).
Die Verwendung und Nützlichkeit und neue Merkmale der vorliegenden Zusammensetzungen werden bezüglich der nachfolgenden nicht einschränkenden Beispiele klarer werden.
Beispiel 1 (nicht Bestandteil der Erfindung)
Die Cloudman-S91-Mausmelanom-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) gemäß eines kürzlich veröffentlichten Protokolls kultiviert, das 10% Kalbsserumn, Z mM L-Glutamin, 10 U Penizillin/ml und 10 μg Streptomycin/ml enthielt (Eller, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1087–92, 1996). Zum Testen wurden Propylenglycol und Analoge zur Induktion der Melanogenese, S91-Zellen zu 10⁵ Zellen/35 mm Schale in 10% Kalbsserum ausplattiert. Ein Tag nach dem Ausplattieren wurden die Medien entfernt und mit Medien ersetzt, die 2% Kalbsserum und Testverbindungen enthielten (Eller, et al., 1996). Die Zellen wurden für 6 Tage bei 37°C in 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator kultiviert. Im Anschluss an diese Behandlungsperiode wurden die Zellen mikroskopisch überprüft und der Anteil der undifferenzierten und differenzierten Zellen wurde eingeschätzt. Frühere Studien haben gezeigt, dass dedifferenzierte S91-Zellen eine runde, spindelförmige Erscheinung aufweisen, während differenzierte S91-Zellen eine abgeflachte, quaderförmige, multipolare und dendritische Erscheinung aufweisen (Orlow et al., Exp. Cell Res. 191: 209–218, 1990).
Im Anschluss an diese mikroskopische Überprüfung wurden die Zellen von den Schalen durch Typsin abgelöst. Die zur Ablösung durch Typsin erforderliche Zeit wurde als zusätzlicher Indikator für die phänotypischen Wirkungen der Testverbindungen aufgezeichnet. Für jede Behandlung wurde eine Unterprobe von Zellen gezählt, um die Wirkungen der Behandlungs-Verbindungen auf die zelluläre Proliferation zu bestimmen. Der Rest der Zellen wurde zur Bestimmung des Melanin-Gehaltes verwendet. Melanin wurde aus den Zellen durch vortexen für 15 Minuten in 1 N NaOH extrahiert. Standards wurden durch Lösen von Melanin (Sigma) in 1 N NaOH (Eller et al., 1996) hergestellt. Die Extinktion der Standards und der Proben wurde bei 475 nm gemessen. Melanin wurde als pg Melanin/Zelle exprimiert.
Die Tabellen 1 und 2 unten zeigen die Ergebnisse, die erzielt wurden, wenn Formulierungen getestet wurden, die verschiedene Konzentrationen an 1,2-Propandiol als wirksamen Inhaltsstoff enthielten. In der Kontrolle wurde keine Testverbindung dem Medium zugesetzt.
Tabelle 1
Tabelle 2
Beispiel 2 (stellt keinen Teil der Erfindung dar)
Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde befolgt, außer dass Ethanol und Isomere von Propandiol und Butandiol als Testverbindungen verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 dargelegt. Die Daten zeigen, dass mehrere Isomere von Propandiol und Butandiol eine Melanogenese und eine Differenzierung von S91-Melanomzellen induzieren. Sowohl 50 mM Propandiol (PG) oder Butandiol (BD) hatten eine 1,5fache Zunahme der Melanogenese zur Folge, während 150 mM eine ungefähr 2fache Zunahme im Anschluss an eine einzelne Behandlung zur Folge hatten. Während 1,2-Propandiol (PG-1,2) und (S)-(+)-1,2-Propandiol (PG-S-1,2) keine Reduktion der Zellproliferation bei denen in diesem Experiment verwendeten Konzentrationen zur Folge hatten, hätten 150 mM 1,3-Propandiol (PG-1,3), 2,3-Butandiol (BD-2,3) oder 1,3-Butandiol (BD-1,3) eine Reduktion der Zellzahlen um ein Drittel zur Folge. Zusätzlich schienen die Butandiole eine größere Differenzierung von S91-Zellen als Propandiole aufzuweisen, wie es durch frühere und größere morphologische Veränderungen bewiesen wurde und im Falle von BD-2,3 einen adhärenteren Phänotyp. Ethanol (EtOH) wies keine Wirkung auf Zellen bei 340 mM auf, war jedoch bei 850 mM toxisch, wie es durch das geringe Zellüberleben angezeigt wird. Ethanol induziert die Melanogenese bei keiner getesteten Konzentration. Glycerol (G) wies nur eine geringe Wirkung auf die Melanogenese und Differenzierung in den Konzentrationen auf, die in diesem Experiment getestet wurden, was anzeigt, dass Triole weniger wirksame Induktoren dieser Phänotypen als Diole sein können. Tabelle 3

¹ 170 mM
² 340 mM
³850 mM

Tabelle 4
Beispiel 3
Dieselben Verfahren wie in den Beispielen 1 und 2 wurden befolgt, um die Wirkung zusätzlicher Verbindungen auf die Melanogenese in S91-Zellen zu überprüfen. Die in Tabelle 5 beschriebenen Ergebnisse zeigen die Konzentration von mehreren Verbindungen, die dazu erforderlich ist, eine zweifache oder größere Melanisierung in S91-Zellen zu induzieren. Viele Verbindungen sind wirksamer als solche, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden. Beispielsweise war 2,3-Pyridindiol bei 100 μm wirksam; 1,4-Dioxan-2,3-diol und β-Östradiol bei 500 μm; 5-Norbornen-2,2-dimethanol bei 5 mM; 3,3-Dimethyl-1,2-butandiol und 1,2-cis- Cyclopentandiol bei 10 mM; und 2,3-Dimethyl-2,3-butandiol bei 25 mM. Alle der in Tabelle 5 aufgelisteten Verbindungen außer 1,4-Dioxan-2,3-diol induzierten die Transformation von S91-Zellen von einer abgerundeten bipolaren Morphologie hin zu einer abgeflachten quaderförmigen multipolaren Morphologie gleichzeitig mit einer Induktion der Melanogenese; dies zeigt ihre potentielle Nützlichkeit als chemotherapeutische Mittel, die durch Induzieren der Differenzierung von Tumorzellen wirken. Alle der in Tabelle 5 aufgelisteten Verbindungen außer 5-Norbornen-2,2-dimethanol, β-Östradiol und 2,3-Pyridindiol induzierten eine erhöhte Trypsinisierungszeit gleichzeitig mit der Induktion der Melanogenese; Veränderungen der Adhärenzeigenschaften betreffen Veränderungen des metastatischen Potentials von Tumorzellen. Tabelle 5

* Vergleichsverbindungen

Vergleichsverbindungen zusätzlich zu denen, die in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden, die in S91-Zellen keine signifikante (≥ 2fache Zunahme) Melanogenese induzieren, wenn sie über einen Bereich von Konzentrationen bis hin zu einer toxischen Dosis getestet wurden, schlossen folgende ein: 1-Propanol; 2-Propanol; Ölsäure; 2-Phenyl-1,2-propandiol; 1,3-Cyclohexandiol; Weinsäure; Ascorbinsäure; Azone^®, 2-Pyrrolidon; D-Ribose, 2-Desoxy- D-ribose; N-Methyl-D-glukamin; Hydroxymethyluracil; und Tetrabutylammoniumchlorid. Von diesen Verbindungen hatte nur 2-Pyrrolidon eine tiefgreifende morphologische Differenzierung von S91-Zellen zur Folge, was darauf hinweist, dass es die Melanogenese fördern kann und/oder eine antitumorigene Wirksamkeit in Abwesenheit einer Melanogenese zeigen kann.
Die PKC-Inhibitoren H7 (1-[5-Isochinolinyl-sulfonyl]-2-piperazin) und D-Sphingosin induzierten ebenfalls die Melanogenese in S91-Zellen. Zusätzlich erhöhten diese PKC-Inhibitoren die Melanogenese, die durch Propylenglycol in S91-Zellen induziert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Propylenglycol die Melanogenese durch Induktion von PKC nicht induziert oder PKC zur Induktion der Melanogenese.
Beispiel 4
Normale humane epidermale Melanocyten (Normal Human Epidermal Melanocytes = NHEMs) wurden bezüglich der Induktion der Melanogenese unter Verwendung von Zellen und Medien überprüft, die von Clonetics Corporation (San Diego, Kalifornien) bezogen wurden. Die Zellen wurden exakt wie es vom Lieferanten spezifiziert war, kultiviert. Auf Grundlage einer Induktion einer 1,5fachen Zunahme an Melanin in NHEMs waren die wirksamsten Verbindungen, die überprüft wurden, 2,3-Pyridindiol bei 200 μm, gefolgt von 5-Norbornen-2,2-dimethanol bei ≤ 5 mM, 3,3-Dimethyl-1,2-butandiol bei 12,5 mM und 2,3-Dimethyl-2,3-butandiol und 1,2-cis-Cyclopentandiol bei 50 mM (Tabelle 6). D-Ribose war in NHEMs inaktiv, wenn sie über einen Konzentrationsbereich bis zu einer toxischen Dosis getestet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die eine Aktivität in S91-Zellen zeigen, ebenfalls eine Aktivität in normalen humanen Melanocyten zeigen. Tabelle 6

* Vergleichsverbindungen

Beispiel 5
Die Verbindungen wurden bezüglich einer melanogenen Aktivität in vivo durch Verabreichung an amerikanische Kurzhaarmeerschweinchen getestet. Die Behandlungsstellen wurden durch Entfernung von Fell unter Verwendung des Enthaarungsmittels Nair^® erzeugt. Die Verbindungen wurden in Volumina von 25 μl zweimal pro Tag für 5 Tage zu jedem Behandlungspunkt, wie in Tabelle 7 angezeigt, verabreicht. In der Tabelle sind die angegebenen Zahlen die relative Melanogeneserate (Durchschnitt ± Standardabweichung) und sind gemäß der relativen Lokalisierung am Tier angeordnet, wobei der Kopf zur linken und der Schwanz zur rechten angeordnet ist. Propylenglycol (PG = 13,6 M), 2,3-Butandiol (2,3-BD = 10,95 M) und 1,2-cis-Cyclopentandiol (1,2-cs-CPD = 10,7 M) wurden als Lösungen mit voller Stärke verabreicht. 3,3-Dimethyl-1,2-butandiol (3,3-M-1,2-BD) wurden als 4 M Lösung aufgebracht, gelöst in Ethanol. Zwei Wochen im Anschluss an die Beendigung der Behandlungen wurde der Grad der Pigmentierung subjektiv gemäß der nachfolgenden Skala eingeordnet:
Die unten angegebenen Ergebnisse zeigten, dass eine progressive Verminderung einer Reaktion auf Bräunungsmittel vom Kopf zum Schwanz der Tiere hin existierte. Die Magnitude bzw. Größenordnung dieser verringerten Reaktion war 3- bis 4fach. Somit wurden Vergleiche zwischen den Behandlungs-Verbindungen bezüglich ähnlicher Orte am Körper der Meerschweinchen durchgeführt. Propylenglycol hatte eine signifikante Melanogenese bezüglich der mit Enthaarungsmittel behandelten Kontrollen zur Folge, die an derselben relativen Körperposition angeordnet waren. 2-Methyl-1,3-propylenglycol und 2,3-Butandiol waren nur ein wenig bessere melanogene Mittel als Propylenglycol. Jedoch hatten 3,3-Dimethyl-1,2-butandiol und 1,2-cis-Cyclopentandiol eine 4,5fache und 5,5fach größere Melanogenese als PG zur Folge, das auf ähnliche Orte am Körper aufgebracht wurde. Tabelle 7

¹ P < 0,05 bezüglich des PG-behandelten Ortes, befindlich dem Kopf am nächsten in der ersten Reihe
² P < 0,05 bezüglich eines PG-behandelten Ortes in der ersten Reihe, der sich in derselben Position bezüglich Kopf und Schwanz befindet

Um die Wirkungen der Verhinderung der Reaktion von Kopf zu Schwanz der Tiere zu minimieren, wurden alle weiteren zukünftigen Experimente unter Verwendung von lediglich Behandlungs-Spots bzw. -Flecken durchgeführt, die sich hin zum Schwanz der Tiere befanden. Es wurde zusätzlich als vorteilhaft erachtet, dass in diesem Areal des Tieres Unterschiede der Ansprechbarkeit gegenüber starken und schwachen Induktoren der Pigmentierung, wie aus der Zellkultur abgeleitet wurde, am größten waren. Ein Vergleich der Pigmentierungseinordnungen dieser Behandlungs-Spots zeigte die folgende absteigende Reihenfolge der Induktion: 8,7 M 1,2-cis-Cyclopentandiol (1,2-cs-CPD) > 4 M 3,3-dimethyl-1,2-butandiol (3,3-M-1,2-BD) > ein Gemisch aus 8,5 M 1,2-Propylenglycol (1,2-PG)/1 M 5-Norbornen-2,2-dimethanol (5-NBen-2,2-DM)/2% 2-Pyrrolidon (2-P; ein Penetrationsverstärker) > 1 M 5-NBen-2,2-DM/2% 2 P, > 11,3 M 2-Methyl-1,3-propylenglycol (2-M-1,2-PG) (Tabelle 8; 1A: unbehandelt; 1B: 10,6 M 1,2-PG/2% 2-P; 1C: 8,7 M 1,2-cs-CPD; 1D: 1 M SNBen-2,2-DM/8,5 M 1,2-PG/2% 2-P). In diesem Bereich der Tiere waren die Reaktionen auf 13,61 M 1,2-PG; 10,6 M 1,2-PG/2% 2P, und 11 M 2,3-Dimethyl-2,3-butandiol von den Kontrollen nicht signifikant verschieden (Nair oder 2% 2P-behandelten) Flecken. Die Pigmentierungseinordnungen wurden bezüglich Hintergrund korrigiert (kontrollierte Behandlungsspots), gegen 1 M normalisiert, um den unterschiedlichen Mengen jedes Mittels, die aufgebracht wurden, Rechnung zu tragen, und dann auf Resultate für 1,2-PG (Tabelle 8) normalisiert. Dieser Vergleich zeigte, dass die absteigende Reihenfolge der Induktion 5 NBen-2,2-DM > 1,2-cs-CPD > 2 M 1,3-PG waren, und dass unter Verwendung von 1,2-PG als Träger für 5-NBen-2,2-DM (siehe 1D) die Ansprechbarkeit gegenüber dieser Verbindung erhöht wurde. Es wird angenommen, dass weitere Verbesserungen in der Formulierung zusätzlich die Ansprechbarkeit gegenüber 5 NBen-2,2-DM und weitere Verbindungen in dieser Erfindung verbessern werden. Biopsieergebnisse (1) zeigten, dass die Induktion der Melanogenese durch eine Ablagerung von Melanin in Keratinocyten, in einigen Fällen unter Bildung von „supranukleären Deckeln" (Pfeile, 1C und 1D) gekennzeichnet waren, die auf eine Induktion von echter natürlicher UV-protektiver Melanogenese hinweist (Gates, R. R., und A. A. Zimmermann, 1953, J. Invest. Dermatol. 21: 339–348) und durch eine vollständige Abwesenheit von Entzündung, Fibrose und irgendeiner anderen Form der Gewebsschädigung gekennzeichnet war. Tabelle 8

* P < 0,05; Student-T-Test
** Vergleichsverbindungen
¹ Weiterer Hintergrund korrigiert bezüglich der Pigmentierung, die durch 1,2-PG/2P (0,16) induziert wurde.

Beispiel 6
Die Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit hin überprüft, eine Thyrosinase-Aktivität in S91-Mausmelanomzellen zu induzieren. Die Tyrosinase ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym im Melanogenen Stoffwechselweg. Ihre Messung stellt einen hoch spezifischen und empfindlichen Hinweis auf den Induktionsgrad der Melanogenese durch Testverbindungen bereit. Alle Zellkulturbedingungen und -behandlungen waren wie oben in Beispiel 1 bis 3 beschrieben. Im Anschluss an die Behandlungen wurden die Zellen typsinisiert, durch Coulter gezählt, durch Zentrifugation bei 1 000 × g pelletiert und bezüglich einer Tyrosinase-Aktivität unter Verwendung von Modifikationen kürzlich beschriebener Verfahren analysiert (Pomerantz, S. H., 1966, J. Biol. Chem. 241: 161–168; Jara, et al., 1988, Pigment Cell Res. 1: 332–339). Kurz gesagt, wurden die Zellpellets durch Beschallung für 5 Sekunden in 600 μl 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, der 0,5% Triton-X100 enthielt, gefolgt von Vortexen, Inkubation auf Eis für 30 Minuten solubilisiert und dann erneut gevortext. Hieraus wurden 200 μl Teilmengen mit 200 μl Reaktionsgemisch kombiniert, das entweder 75 μm Tyrosin, 75 μm L-Dopa und 2 μCi L-[3,5-³H]Tyrosin in 50 mM NaPO₄, pH 6,8 (L-Dopa +) oder 75 μm Tyrosin und 2 μCi L[3,5-³H]Tyrosin in 50 mM NaPO₄ pH 6,8 (L-Dopa –) enthielt und wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 400 μl 10% Aktivkohle in 0,1 N HCl und durch Inkubation auf Eis für 15 Minuten gestoppt. Dieses Gemisch wurde bei 17.300 × g für 5 Minuten zentrifugiert und 400 μl Überstand wurden darauf durch 0.22 μm GV Durapore Zentrifugenfiltereinheit (Millipore) durch Zentrifugieren bei 17.300 × g für 5 Minuten filtriert. Das Filtrat wurde zu 4 ml Fisher Plus Szintillationsflüssigkeit hinzugefügt und auf einem Hewlett Packard Szintillationszähler ausgezählt. Die Tyrusinase-Aktivität wurde als dpm/Stunde/μg Protein und dpm/Stunde/10³ Zellen berechnet. Jede Probe wurde mit oder ohne L-Dopa analysiert, einem notwendigen Cofaktor für Tyrosinase (Pomerantz, S. H., 1966, J. Biol. Chem. 241: 161–168; McLane, et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 719–725). Alle berichteten Tyrosinase-Werte sind exklusiv für Zählungen, die in Pufferleerlösungen und L-Dopa-negativen Teilmengen auftraten. Das Protein wurde als Teilmengen von Zelllysat, extrazellulärem Teilchenlysat oder Medien durch das Bradford Coomassie Blue Verfahren (Bradford, 1967, Anal. Biochem. 72: 248–254) unter Verwendung eines Bio-Rad Protein Assay Kits I bestimmt.
Die Ergebnisse (Tabelle 9; Durchschnitt ± Standardabweichung) zeigen, dass 3,3-Dimethyl-1,2-butandiol (3,3-M-1,2-BD) und 5-Norbornen-2,2-dimethanol (5-NBen-2,2-DM) die größte Induktion von Tyrosinase sowohl auf zellulärer als auch Proteinbasis zur Folge hatten. Obwohl 100 μm 2,3-Pyridindiol (2,3-Pyd) zweifache Zunahmen an Melanin induzierten (Beispiel 3, Tabelle 5), induzierten sogar 500 μm 2,3-Pyd nur geringe Konzentrationen an Tyrosinase bezüglich derjenigen, die durch 5 mM 5-NBen-2,2-DM oder 3,3-M-1,2-BD induziert wurden und höhere Konzentrationen an 2,3-Pyd waren toxisch. 5-NBen-2,2-DM und 3,3-M-1,2-BD sind in Konzentrationen nicht toxisch, die viel höhere Konzentrationen an Tyrosinase induzieren, und sind somit zur Induktion der Melanogenese in dieser Ausführungsform bevorzugte Mittel. Weil 5-NBen-2,2-DM nahezu äquivalente Konzentrationen an Tyrosinase bei fünffach niedrigeren Konzentrationen als 3,3-M-1,2-BD induziert, ist dies besonders bevorzugt. IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) ist dem Fachmann auf dem Gebiet als kraftvoller Induktor der Melanogenese und Tyrosinase bekannt und wird als Positivkontrolle bereitgestellt. Tabelle 9

* Vergleichsverbindungen

Strukturaktivitätsstudie mit 5-NBen-2,2-DM und verwandten Verbindungen zeigen, dass Norbornan-2,2-dimethanol (NBan-2,2-DM) eine gleichwertige Wirkstärke zur Induktion der Tyrosinase in S91-Zellen aufweist (2). Somit ist NBan-2,2-DM gleichermaßen 5-NBen-2,2-DM bevorzugt. Eine geringere Induktion der Tyrosinase in S91-Zellen wurde in absteigender Reihenfolge durch 2-Norbornanmethanol (2-NBanM), 2,3-cis/exo-Norbornandiol (2,3-c/e-NBanD), α-Norborneol (α-NBan-ol) und Norbornan (NBan) induziert. Weil sogar NBan eine zweifache Induktion der Tyrosinase bezüglich unbehandelter oder Ethanol (ETOH)-behandelter Kontroll-S91-Zellen zur Folge hatte, wird geschlossen, dass diese eine Verbindung der vorliegenden Erfindung ist. Weil NBan zusätzlich die Melanogenese induziert, wird erwogen, dass alle Verbindungen, die NBan als Bestandteil ihrer Struktur enthalten, die Melanogenese induzieren können. Zusätzlich wird erwartet, dass Verbindungen, die Norbornen (NBen) oder irgendeine andere angesättigte Verbindung enthalten, die von Norbornan abgeleitet ist, die Melanogenese induzieren können. Somit wird jede gesättigte oder ungesättigte Verbindung, die von Norbornan abgeleitet ist, als Bestandteil dieser Erfindung eingeschlossen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Verbindungen, die von Borneol, Camphen und Campher abgeleitet sind.
Weder der hochspezifische Proteinkinase-A(PKA)-Inhibitor H-89 (N-[2-(p-Bromcinnamylamino)-ethyl]-5-isochinnlinsulfinamid·2HCl; Chijiwa, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 5267–5272), noch der hochspezifische Proteinkinase-C(PKC)-Inhibitor GF109203x (Bisindolylmaleimid; Toullec, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15771–15781) hemmten die Induktion von Tyrosinase durch 5-NBen-2,2-DM (Tabelle 10). Es ist somit unwahrscheinlich, dass, ähnlich zu den Ergebnissen, die für 1,2-Propandiol in Beispiel 3 beschrieben wurden, 5-NBen-2,2-DM und verwandte Verbindungen über eine Aktivierung der PKC-Stoffwechselwege funktionieren, die für die Induktion der Melanogenese durch Diacylgerole als wichtig beschrieben wurde (Allan, et al., 1995, J. Invest. Dermatol. 105: 687–692; Gilchrest, et al., 1996, Photochem. Photobiol. 63: 1–10). Noch ist es wahrscheinlich, dass 5-NBen-2,2-DM oder verwandte Verbindungen über eine Aktivierung der PKA-Stuffwechselwege funktionieren, wie es als wichtig für die Induktion der Melanogenese durch IBMX beschrieben wurde (Fuller, et al., 1993, Ann. NY Acad. Sci. 690: 302–319; Fuller, et al., 1996, Pigment Cell Res. S5: 65). Weiterhin hemmte der Zusatz von Katalase zu den Zellkulturmedien die Wirkung von 5-NBen-2,2-DM nicht, was darauf hinweist, dass anders als bei L-Dopa und Dopac diese und verwandte Verbindungen die Melanogenese über die Erzeugung von Wasserstoffperoxid oder andere reaktive Sauerstoffspezies wahrscheinlich nicht induzieren (Karg, et al, 1989; Acta Denn. Venereol. 69: 521–524; Karg, et al., 1991, J. Invest. Dermatol. 96: 224–227; Karg, et al., 1993, J. Invest. Dermatol. 100: 209S–213S). Tabelle 10

* Vergleichsverbindungen

Beispiel 7
Tyrosinase wurde in normalen humanen epidermalen Melanocyten (NHEM) unter Verwendung von Verfahren gemessen, die mit denjenigen identisch waren, die für S91-Zellen (Beispiel 6) beschrieben wurden, außer dass die Medien aus den 5 Tage Behandlungsperioden zurückgehalten und bei 200 × g, 1.600 × g oder 17.300 × g zur Analyse der Tyrosinase-Aktivität in der extrazellulären exportierten melanosomalen Teilchenfraktion und in der sich ergebenden überstehenden Medienfraktion zentrifugiert wurden. In einigen Fällen (Tabelle 1 1) wurde Tyrosinase ebenfalls durch einen in situ-Assay gemessen, wobei radioaktiv markiertes Tyrosin direkt zu frisch ersetzten Medien von NHEM für eine Zeitspanne von 24 Stunden im Anschluss an eine 5-tätige Behandlungsperiode zugesetzt wurden (Abdel-Malek, et al., 1992, J. Cell. Physiol. 150: 416–425). Die Ergebnisse zeigten, dass 5 mM 5-NBen-2,2-DM Tyrosinase in einem größeren Umfang im in situ-Assay in extrazellulären teilchenförmigen melanosomalen Fraktionen und in den NHEM-Medien induzierte als es 25 mM 3,3-M-1,2-BD (Tabelle 12) taten. Sowohl 5 mM 5-NBen-2,2-DM als auch 25 mM 3,3-M-1,2-BD induzierten mehr Tyrosinase in jedem dieser Assays und Fraktionen als es 1,2-PG tat. IBMX (3-lsobutyl-1-methyl-xanthin), das als positive Kontrolle bereitgestellt wurde, induzierte genauso viel Tyrosinase wie 5 mM 5-NBen-2,2-DM im In-situ-Assay, jedoch weniger in den zellulären, extrazellulären Teilchen- und Medienfraktionen (Tabelle 11). Tabelle 11

* Nach 200 × g
** Nach 17.300 × g
*** Vergleichsverbindungen

Weitere Studien unter Verwendung von NHEM zeigen, dass ähnlich zu den Ergebnissen für S91-Zellen (2) die Verbindungen, die mit 5-NBen-2,2-DM verwandt sind, Induktoren der Tyrosinase sein können (Tabelle 12). Beispielsweise hatte 2-Norbornanmethanol (2-NBanM) eine Induktion von Tyrosinase in Konzentrationen zur Folge, die 5-NBen-2,2-DM in NHEM äquivalent waren, sowohl von einem weißen erwachsenen Spender als auch von einem schwarzen neugeborenen Spender (Tabelle 12). Es wird somit angenommen, dass ähnlich zu den S91-Zellen (Beispiel 6) alle Norbornan-verwandten Verbindungen Tyrosinase in NHEM induzieren und werden deswegen von dieser Erfindung mit umfasst. Tabelle 12

¹ Anders als in Tabelle 10, worin die Medien aus einer 5-tägigen Behandlungszeitspanne stammten, stammten die Medien in Tabelle 11 von einer 1-tägigen Behandlungszeitspanne.
* Vergleichsverbindung

* Vergleichsverbindung

Beispiel 8
Ähnlich zu den Ergebnissen für S91-Zellen, die mit Diolen behandelt wurden (Beispiele 1 und 2) hatte die Behandlung von normalen humanen epidermalen Melanocyten (NHEM) mit 5 mM 5-NBen-2,2-DM morphologische Veränderungen zur Folge, die auf eine Differenzierung hinweisen. Im Falle von NHEM war die Induktion der Differenzierung durch Umwandlung von Zellen aus einem bipolaren Phänotyp zu einem multidendritischen Phänotyp gekennzeichnet (man vergleiche unbehandelte NHEM in 3A mit 5 mM 5-NBen-2,2-DM behandeltem NHEM in 3B). Zusätzlich wurde die Länge der Dendriten ungefähr um das Zwei- bis Dreifache im Anschluss an eine Behandlung mit 5 mM 5-NBen-2,2-DM erhöht, und es existiert eine Zunahme in der Anzahl sekretorischer Vesikeln an den Termini der Dendriten (Pfeile in den 3A und 3B). Eine elektronenmikroskopische Analyse zeigte, dass die extrazelluläre Teilchenfraktion, die in die Medien aus NHEM sezerniert wurde, fast ausschließlich Stadium III und IV Melanosomen umfasste (die Pfeile zeigen eine Längsansicht und die Pfeilspitzen zeigen eine Querschnittansicht in den 3C und 3D). Eine erhöhte Sekretion von Melanosomen, die sich aus einer Behandlung mit 5 mM 5-NBen-2,2-DM ergab, wurde in der erhöhten extrazellulären Teilchentyrosinase-Aktivität widergespiegelt (Beispiel 7, Tabelle 11).
Es ist wohl bekannt, dass eine Ultraviolettbestrahlung der Haut eine erhöhte Dendrizität von Melanocyten und einen erhöhten Transport von Melanosomen aus den Enden der dendritischen Vorsprünge zu benachbarten Keratinozyten zur Folge hat (Jimbow, et al., Biology of Melanocytes, Seiten 261–289, In: Dermatology in General Medicine, Hsg.: Fitzpatrick, et al., McGraw-Hill, 1994). Somit scheint eine Sekretion von Metanosomen aus Melanocyten, die mit 5-NBen-2,2-DM behandelt wurden, mit den physiologischen Prozessen parallel zu laufen, die durch Sonnenlicht in der Haut induziert werden.
Beispiel 9
Inhibitoren der cAMP/PKA (Proteinkinase A) oder PKC (Proteinkinase C) Stoffwechselwege hemmen die Induktion der Melanogenese durch 5-NBen-2,2-DM in S91-Zellen nicht (Beispiel 6, Tabelle 10). Jedoch reduziert der Stickoxid (NO)-Radikalfänger PTIO (2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid), der zyklische Guanosin-Monophosphat(cGMP)-Inhibitor LY83583 (6-Anilin-5,8-Chinolinchinon) und der PKG (Proteinkinase G)-Inhibitor KT58223 die Induktion der Melanogenese durch 5-NBen-2,2-DM in S91-Zellen (Tabelle 13). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Induktion der Melanogenese durch 5-NBen-2,2-DM durch den NO/cGMP/PKG-Weg eintritt. Darüber hinaus sind die Ergebnisse solchen ähnlich, die für die Ultraviolettstrahlung erzielt wurden, wobei die Induktion der Melanogenese weder über die cAMP/PKA- noch über die PKC-Stoffwechselwege eintrat (Friedmann und Gilchrest, 1987, J. Cell. Physiol. 133: 88–94; Carsberg et al., J. Cell. Sci. 107: 2591–2597), sondern trat eher über den NO/cGMP/PKG-Stoffwechselweg auf (Romero-Graillet, et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 28052–28056; Romero-Graillet, et al., 1997, J. Clin. Invest. 99: 635–642). Darüber hinaus induziert 5-NBen-2,2-DM, anders als IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin) und MSH (Melanocytenstimulierendes Hormon), das die Melanogenese durch den cAMP/PKA-Stoffwechselweg induziert (Wintzem und Gilchrest, 1996, J. Invest. Dermatol. 106: 3–10; Fuller, et al., 1993, Ann. NY Acad. Sci. 690: 302–319) und DAG (Diacyglycerol), das die Melanogenese durch den PKC-Stoffwechselweg induziert (Allan, et al., 1995, J. Invest. Dermatol. 105: 697–692), die Melanogenese durch den NO/cGMP/PKG-Stoffwechselweg ähnlich wie ultraviolette Strahlung. Tabelle 13

¹ x ± Standardabweichung
² PTIO: Stickoxid-Radikalfänger
³ KT5823: PKG-Inhibitor

Beispiel 10
Die PC12-Rattenphäochromocytom-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Die Zellen wurden 85% RPMI 1640 Medium, 10% Pferdeserum (hitzeinaktiviert bei 56°C für 30 Minuten, 5% fötalem Rinderserum, 25 U/ml Penicillin und 25 μg/ml Streptomycin kultiviert (Green, et al., 1991, „Methodologies for the culture and experimental use of the rat PC12 rat Pheochromocytoma cells line", Seiten 207–225, In: Culturing Nerve Cells, The MIT Press, Cambridge, Massachusetts). Die Zellen wurden direkt auf Plastikschalen bei 37°C in 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator kultiviert.
Es wird angenommen, dass PC12-Ratten Pheochromocytom-Zellen ein ausgezeichnetes Modell für neuronale bzw. Nerven-Zellen sind, weil diese auf eine Behandlung mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) durch Akquirieren von mehreren Eigenschaften der Neuronen reagieren, einschließlich einer Beendigung der Proliferation, einer Verlängerung der Neuronen, einer Akquirierung einer elektrischen Anregbarkeit und einer erhöhten Neurotransmittersynthese (Greene, et al., 1991 und die darin genannten Bezugnahmen). Zusätzlich werden PC12-Zellen als Modell für Studien der Prävention oder Heilung von neurodegenerativen Erkrankungen verwendet, weil diese ein robustes Screening nach Mitteln bereitstellen, die das Nervenzellüberleben aufrechterhalten, und einen Nervenzelltod in Serum-freien Medien vorbeugen (Rukenstein, et al., 1991, J. Neurosci. 11: 255–2563). Mittel werden als potentiell zur Behandlung von neurodegenerativen Störungen aus nützlich erachtet, wenn sie nicht nur PC12-Zellüberleben fördern, sondern auch das Neuriten-Wachstum (Rukenstein, et al., 1991). Mittel werden insbesondere zur Behandlung neurodegenerativer Störungen als nützlich betrachtet, wenn diese das PC12-Zellüberleben oder das Neurit-Wachstum in Abwesenheit eines „Primings" mit NGF fördern (Rukenstein, et al., 1991). Mittels ihrer Fähigkeit, Tyrosinhydroxylase zu exprimieren und dadurch Dopamin zu synthetisieren, werden PC12-Zellen als besonders gutes Modell für Studien der Parkinson Krankheit (Michel, et al., 1994, Europ. J. Neurosci. Assoc. 6: 577–586 und die darin genannten Literaturstellen) angesehen. Zusätzlich wurde das Neuriten-Wachstum in PC12-Zellen dazu verwendet, Mittel zu identifizieren, die die Regeneration von abgetrennten neuronalen Axons in den peripheren Nerven von adulten Säugetieren stimulieren (Sandrock, A. W. und Matthew, W. D., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 6934–6938). Darüber hinaus wurden PC12-Zellen als ein Modell zur Studie von Aspekten der Alzheimen Krankheit verwendet (Shen, et al., 1995, Brain Res. 671: 282–292), der amyotrophen Lateralsklerose (Durham, et al., 1995, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22: 366–67), des Down Syndroms (Groner, et al., 1994, Biomed. Pharmacother. 48: 231–240) und der altersbezogenen Neurodegeneration (Taglialatela, et al., 1996, J. Neurochem. 66: 1826–1835).
Zum Testen von Verbindungen bezüglich einer Induktion der Dendrizität (Neurit-Wachstum) und der Tyrosinhydroxylase-Aktivität in dieser Erfindung wurden Zellen zu 15.000 Zellen/35 mm Schale ausplattiert. Zwei Tage im Anschluss an die Plattierung wurden die Zellkulturmedien durch solche ergänzt, die Behandlungen enthielten. Eine Woche später wurden Medien und Behandlungen mit frischen Medien und Behandlungen ersetzt. Zwei Wochen im Anschluss an die initialen Behandlungen wurden die Zellen mikroskopisch überprüft, und der Anteil an Zellen, der eine Dendrizität zeigt, wurde geschätzt. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet und durch Coulter Counter gezählt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation zu 200 × g pelletiert und die Zellpellets wurden in 600 μl 50 mM Tris/Acetat pH 6,0/0,2% Triton X-100 durch Vortexen, durch Beschallen für 5 Sekunden, durch Inkubieren auf Eis für 30 Minuten, gefolgt von wieder Vortexen, lysiert. Das Protein wurde in Teilmengen des Zelllysates durch das Bradford Coomassie Blau Verfahren (Bradford, 1967, Anal. Biochem. 72: 248–254) unter Verwendung des Bio-Rad Protein Assay Kit I bestimmt. Die Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde durch Inkubieren von 100 μl PC12-Zelllysat mit 100 μl des nachfolgenden Reaktionsgemisches bei 37°C für 15 Minuten bestimmt: 200 mM Natriumacetat pH 6,0, 50 μM Tyrosin, 2000 U Cat/ml, 50 mU Dihydropteridinreduktase/ml, 0,1 mM NADH final, 200.000 cpm 3H Tyrosin/100 μl, 0,1 mM NSD1015 (3-Hydroxybenzylhydrazin), und 100 μM Tetrahydrobiopterin (BH4) (Nagatsu, et al., 1969, Anal. Biochem. 9: 122–126; Ribeiro, et al., 1991, J. Biol. Chem. 16207–16211). Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 200 μl 10% Aktivkohle in 0,1 N HCl und Inkubation auf Eis für 15 Minuten gestoppt. Dieses Gemisch wurde bei 17.300 × g für 5 Minuten zentrifugiert, und 200 μl Überstand wurde darauf durch eine 0,22 μM GV Durapore Zentrifugenfiltereinheit (Millipore) durch Zentrifugieren bei 17.300 × g für 5 Minuten filtriert. Das Filtrat wurde zu 4 ml Fisher Plus Szintillationsflüssigkeit zugesetzt und auf einem Hewlett Packard Szintillationszähler gezählt. Die Tyrosinhydroxylase-Aktivität wurde als Tritium-Freisetzung gemessen und wurde als dpm/μg Protein und dpm/10³ Zellen pro Stunde berechnet.
Eine mikroskopische Überprüfung zeigte, dass ein großer Anteil an PC12-Zellen die mit 5 mM 5-Norbornen-2,2-dimethanol (5-NBen-2,2-DM) behandelt wurde, dendritische Fortsätze zeigte (Tabelle 14, und im Vergleich mit unbehandelten PC12-Zellen in 4A mit 5-NBen-2,2-DM-behandelten PC12-Zellen in 4B). Geringere Zunahmen der dendritischen Fortsätze wurden im Anschluss an eine Behandlung mit 3,3-Dimethyl-1,2-butandiol (3,3-M-1,2-BD) oder 1,2-Propylenglycol (1,2-PG) (Tabelle 14) bemerkt. Die erwähnenswertesten Zunahmen der Tyrosinhydroxylase-Aktivität ergab sich aus einer Behandlung mit 25 mM 3,3-M-1,2-BD und 5 mM 5-NBen-2,2-DM (Tabelle 14). Die Behandlung mit 1,2-PG. 3,3-M-1,2-BD und 5-NBen-2,2-DM erhöhte die Menge an Protein pro Zellen, ein Merkmal, das oft mit der Induktion der Differenzierung assoziiert ist. Die Zunahmen von Protein pro Zelle wurde morphologisch als Zunahme der Zellgröße manifestiert (man vergleiche unbehandelte PC12-Zellen in 4A mit 5-NBen-2,2-DM-behandelten PC12-Zellen in 4B). Eine Überprüfung der Daten in Tabelle 14 zeigt, dass Zunahmen der Tyrosinhydroxylase pro Zelle als Folge einer Behandlung mit 1,2-PG, 3,3-M-1,2-BD oder 5-NBen-2,2-DM teilweise das Ergebnis von Zunahmen der Menge an Protein pro Zelle waren. Ethanol (ETOH), das als Lösungsmittel für 3,3-M-1,2-BD und 5-NBen-2,2-DM verwendet wurde und IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin), das die zellulären cAMP-Konzentrationen erhöht, hatten nur geringe Wirkungen bezüglich der Mittel dieser Erfindung.
Die reduzierten Zellzahlen, die sich aus einer Behandlung mit 1,2-PG, 3,3-M-1,2-BD oder 5-NBen-2,2-DM ergaben, sind teilweise ein Hinweis auf den Differenzierungsprozess, der durch die Behandlungen induziert wurde. Es wurden jedoch im Falle der Behandlung mit 25 mM 3,3-M-1,2-BD und 10 mM 5-NBen-2,2-DM einige Zellen gleichzeitig mit der Akquirierung einer Dendrizität abgelöst, die früher als bei anderen Behandlungen eintrat. Dieses Ablösungsphänomen wurde kürzlich für PC12-Zellen beobachtet, die so induziert wurden, dass sie mit NGF differenzieren, und kann durch eine Beschichtungsbehandlung der Schalen mit Kollagen vermieden werden (Überblick in Greene, et al., 1991). Eine Behandlung mit Kollagen verkürzt ebenfalls die Zeit, die für die Dendriten-Bildung erforderlich ist, und erhöht den Umfang der Dendriten-Bildung in Reaktion auf eine Behandlung mit NGF in großem Maße (Überblick in Greene, et al., 1991). Es wird somit ins Auge gefasst, dass die Verbindungen dieser Erfindung eine größere Aktivität zeigen werden, wenn sie auf Kollagenbeschichteten Schalen getestet werden.
Die Induktion einer Differenzierung, wie durch Induktion der Dendrzität angezeigt, die Induktion einer Tyrosinhydroxylase-Aktivität, erhöhte zelluläre Proteinkonzentrationen und die Induktion des Zellzyklus-Stopps, wie angezeigt durch das reduzierte Wachstum, zeigen, dass die Verbindungen dieser Erfindung als chemotherapeutische Mittel zur Behandlung neuroneuraler tumoröser und kanzeröser Störungen und zusätzlicher neuraler proliferativer Störungen dienen können. Es wird zusätzlich ins Auge gefasst, dass die Verbindungen dieser Erfindung tumoröse, kanzeröse und proliferative Störungen behandeln werden können, die sich aus zusätzlichen Zelltypen ergeben.
Es sollte insbesondere erwähnt werden, dass die Verbindungen dieser Erfindung eine Dendrizität und Tyrosinhydroxylase-Aktivität in Abwesenheit des Primings mit NGF induzierten, eine Voraussetzung für die Induktion einer Neurit-Extension durch viele andere Mittel, die auf PC12-Zellen getestet wurden (Steiner, et al., 1997, Nature Medicine 3: 421–428; Rukenstein, et al., 1991, J. Neurosci. 11: 2552–2563). Mehrere Mittel unter der Betrachtung als Behandlung für neurodegenerative Erkrankungen fördern die Neuritverlängerung sogar in NGF-geprimten PC12-Zellen nicht (beispielsweise IGF-I und IGF-II; Rukenstein, et al., 1991 und die darin genannten Entgegenhaltungen bzw. Bezugnahmen). Darüber hinaus sind viele Mittel, die zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen in Erwägung gezogen werden, einschließlich GDNF (Glial Cell-derived Neurotrophic Faktor), die zur Behandlung der Parkinson Krankheit entwickelt wurden, neurotrophe Peptide, die die Blut-Hirn-Schranke nicht überwinden können und deswegen eine Gentherapieimplantation am Ort der Wirkung erfordern (Haase, et al., 1997, Nature Medicine 3: 429–436). Darüber hinaus ist L-Dopa, das gegenwärtig zur Behandlung der Parkinson Krankheit verwendet wird, toxisch (Yahr, M. D., 1993, Adv. Neurol. 60: 11–17), teilweise durch Erzeugung von peripher gebildetem Dopamin (Riederer, et al., 1993, Adv. Neurol. 60: 626–635) und teilweise mittels seiner Fähigkeit, hoch reaktives Semichinon und Chinone über eine Autooxidation zu bilden (Karg, et al., 1989, Acta Derm. Venereol. 69: 521–524). Unter der Maßgabe, dass die Mittel der vorliegenden Erfindung (i) direkt ohne Erfordernis nach NGF wirken; (ii) eine neuronale Differenzierung induzieren, wodurch eine zelluläre Umprogrammierung zum erwünschten Phänotyp in Bewegung gesetzt wird; (iii) Tyrosinhydroxylase induzieren, das Geschwindigkeits-bestimmende Enzym in der Dopamin-Synthese; (iv) kleine Molekül-Arzneistoffe bzw. Small Molecule Drugs sind, die wahrscheinlich die Blut-Hirn-Schranke durchqueren; und (v) keine bekannte Fähigkeit zur Bildung von Semichinon, Chinon oder anderen toxischen Zwischenprodukten aufweisen, wird angenommen, dass die Mittel dieser Erfindung zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Parkinson Krankheit, besonders vorteilhaft sein werden.
Beispiel 11
Cloudman-S91-Mausmelanomzellen wurden von der ATCC bezogen und in MEM (BioWhittaker) mit 10% Kalbsserum (BioWhittaker oder Hyclone) kultiviert. Die Zellen wurden zu 10⁵ Zellen/Well in 6-Well-Platten am Tag vor den Behandlungen in Medien ausplattiert, die 10% Kalbsserum enthielten. Die Medien wurden zu MEM mit 2% Kalbsserum gleichzeitig mit der Zugabe von Behandlungen ausgetauscht (Eller, et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1087–1092). Sechs Tage später wurden die Medien entfernt und S91-Zellen wurden zweimal mit 2 ml 1 × PBS (BioWhittaker) gewaschen, 1 ml 0,05% Trypsin/EDTA (BioWhittaker) wurde zugesetzt, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert, bis sie von den Plastikschalen bzw. Kunststoffschalen abgelöst waren. 4-ml-Medien, die 10% Kalbsserum enthielten, wurden zugesetzt, die Zellen wurden mit Pipettenwirkung vermischt, bis keine Zellklumpen zurückblieben, und 0,5 ml wurden auf einem Coulter Counter gezählt.
Die Tyrosinase wurde unter Verwendung von kürzlich beschriebenen Verfahren analysiert (Pomerantz, 1966, J. Biol. Chem. 241: 161–168). Die Zellen wurden durch Beschallung für 5 Sekunden in 600 μl 50 mM Phosphatpuffer pH 6,8, der 0,5% Triton-X100 enthielt, solubilisiert, gefolgt von Vortexen, Inkubation auf Eis für 30 Minuten und danach erneutes Vortexen. Aus diesen wurden 200 μl Teilmengen mit 200 μl Reaktionsgemisch kombiniert, das entweder 75 μm Tyrosin, 75 μm L-Dopa und 2 μCi L-[3,5-³H]Tyrosin in 50 mM NaPO₄ pH 6,8 (L-Dopa +) oder 75 μm Tyrosin und 2 μCi L-[3,5-³H]Tyrosin in 50 mM NaPO₄, pH 6,8 (L-Dopa –) enthielten und wurden darauf 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 400 μl 10% Aktivkohle in 0,1 N HCl und durch Inkubation auf Eis für 15 Minuten gestoppt. Dieses Gemisch wurde bei 17.300 × g für 5 Minuten zentrifugiert und 400 μl Überstand wurden danach durch eine 0,42 μm GV Durapore Zentrifugenfiltereinheit (Millipore) durch Zentrifugieren bei 17.300 × g für 5 Minuten filtriert. Das Filtrat wurde einer 4 ml Fisher Plus Szintillationsflüssigkeit zugesetzt und auf einem Hewlett Packard 2000A Szintillationszähler gezählt. Die Tyrosinase-Aktivität wurde als dpm/10³ Zellen berechnet. Jede Probe wurde mit und ohne L-Dopa analysiert, einem notwendigen Cofaktor für Tyrosinase (Pomerantz, 1966). Alle berichteten Tyrosinase-Werte stammen ausschließlich aus Zählungen, die in Pufferleerlösungen und L-Dopa-negativen Teilmengen auftraten.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass eine Vielzahl von aliphatischen und alizyklischen Diolen, einschließlich 5-Norbornen-2,2-dimethanol (5-NBen, 2,2-DM) eine Melanogenese in 591-Zellen induzieren. Die in Tabelle 15 präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die Induktion von Tyrosinase (das Geschwindigkeits-bestimmende Enzym in der Melanogenese) durch 5-NBen-2,2-DM nicht durch hoch spezifische Inhibitoren der PKC- und PKA-Wege blockiert wird. Tatsächlich hatte die Behandlung von S91-Zellen entweder mit dem hoch spezifischen PKA-Inhibitor H-89 (Chijiwa, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 5267–5272) oder dein hoch spezifischen PKC-Inhibitor GF109203X (Toullec, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15771–15781) eine Zunahme der basalen und 5-NBen-2,2-DM-induzierten Tyrosinase-Konzentrationen zur Folge (Tabelle 15). Somit scheint 5-NBen-2,2-DM nicht entweder über die PKC- oder PKA-Wege zu wirken.
Im Gegensatz hierzu reduzierten sowohl der Stickstoffstickoxid (NO)-Radikalfänger PTIO (2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid), der zyklische Guanosinmonophosphat(cGMP)-Inhibitor LY83583 (6-Anilino-5,8-Chinolinchinon) und der PKG (cGMP-aktivierte Proteinkinase)-Inhibitor KT5823 die Induktion der Melanogenese durch 5-NBen- 2,2-DM in S91-Zellen (Tabelle 16). Die Ergebnisse demonstrieren, dass eine Induktion der Melanogenese durch 5-NBen-2,2-DM durch den NO/cGMP/PKG-Weg auftritt.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass NO-Donoren die Melanogenese in normalen humanen Melanocyten stimulieren können (Romero-Graillet, et al., 1996, J. Biol. Chem. 271). Die hierin präsentierten Ergebnisse zeigen, dass 5-NBen-2,2-DM eine Melanogenese mit einer Wirkstärke simulieren kann, die derjenigen der NO-Donoren äquivalent oder sogar größer als diese ist, obwohl 5-NBen-2,2-DM keine Fähigkeit zur Gabe von NO aufweist. Weil die Induktion der Melanogenese durch 5-NBen-2,2-DM durch den NO/cGMP/PKG-Weg auftritt, muss 5-NBen-2,2-DM direkt die NO-Synthese stimulieren.
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Stimulation der NO-Synthese und des cGMP/PGK-Weges durch 5-NBen-2,2-DM eine effiziente Alternative zur Simulierung dieses Stoffwechselweges durch NO-Donoren bereitstellt. Somit werden 5-NBen-2,2-DM und verwandte Verbindungen, die in dieser Erfindung beschrieben sind, als alternative Therapeutika zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen dienen, die durch Störungen des NO/cGMP/PKG-Weges vermittelt werden. Tabelle 15

¹ X ± Standardabweichung
² H-89: PKA-Inhibitor
³ GF 109203X: PKC-Inhibitor

¹ X ± Standardabweichung
⁴ PTIO: Stickoxid-Radikalfänger
⁵ KT5823: PKG-Inhibitor
⁶ LY85583: cGMP-Inhibitor

Claims

Verwendung einer oder mehrerer Verbindung wie unten definiert in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung, Vorbeugung oder Veränderung einer Erkrankung oder eines Zustandes, vermittelt durch Mängel im NO/cGMP/PKG Signaltransduktionsweg, die aus Hypopigmentierungsstörungen, proliferativen Hautstörungen oder Störungen der Keratinisierung, neurodegenerativen Störungen, Herzkrankheit, einschließlich stabiler Angina Pectoris, instabiler Angina, Herzinfarkt, mit Herzischämie verbundenem Herzversagen, Atheriosklerose, vaskulärer Hypertrophie und Thrombose, Hypertension; Schlaganfall; primärer pulmonarer Hypertension, chronisch obstruktiver Lungenkrankheit, Schocklunge, mikrovaskulären funktionellen Abnormalitäten bei Diabetes; hämostatischen Irregularitäten der glomerulären, vaskulären und tubulären Funktion; Störungen der Blasenfunktion und der Reflexrelaxation zur Blasenentleerung; Störungen der Neurotransmitterfreisetzung, Neuron-Morphogenese, synaptischer Plastizität und neuroendokriner Regulation; regionalem Schmerz, einschließlich Migränekopfschmerz; benigner Analerkrankung; Impotenz; Hemmung des Tumorwachstums; und Stimulierung der Wundheilung ausgewählt ist: (i) Diole mit der Struktur:
(ii) Diole mit der Struktur:
(iii) pharmazeutisch akzeptable Salze von (i); und (iv) pharmazeutisch akzeptable Salze von (ii); wobei: jedes R₆ unabhängig aus Wasserstoff; Halogen oder einer Gruppe, die von 1 Atom bis 20 Atome enthält, von denen eines Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ist; Hydroxyl, Hydroxymethyl, -(CH₂)_nOH, -(CH₂)_nOR₁, -(CH₂)_n-CH(OH)-CHOH, -(CH₂)_n-CH(OH)-CH(OH)R₁, -(CH₂)_n-CH(OH)-(CH₂)_n-CH₂(OH), -(CH₂)_n-CH(OH)-(CH₂)_n-CH(OH)R₁ oder -CH₂OR₃ ausgewählt ist, wobei jedes n unabhängig O oder eine ganze Zahl von 1 bis 25 ist; jedes R₁ unabhängig aus Wasserstoff; Halogen; oder eine Gruppe ausgewählt ist, die von einem Atom bis 20 Atome enthält, von denen eines Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ist; und jedes R₃ unabhängig aus Wasserstoff oder einer Acyl- oder Aminoacylgruppe ausgewählt ist, die von 1 Atom bis 20 Atome enthält, von denen zumindest eines Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die ein oder mehreren Verbindungen aus folgendem ausgewählt ist/sind: 2-(Propyl-1,2-diol)-norbornan, 2-Norbornen-2,2-dimethanol, Norbornan-2,2-dimethanol, 2,3-Norbornandiol (exo oder endo oder cis oder trans), 2,3-cis-exo-Norbornandiol und 2-endo-Hexadecylamino-5-norbonen-2,3-exo-dimethanol.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die ein oder mehreren Verbindungen aus folgendem ausgewählt ist/sind: 2-(Propyl-1,2-diol)-norbornan, 5-Norbornen-2,2-dimethanol; Norbornan-2,2-dimethanol; und 2,3-cis-exo-Norbornandiol.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei auch ein geeigneter Träger vorhanden ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erkrankung oder der Zustand aus Herzkrankheit, einschließlich stabiler Angina Pectoris, instabiler Angina, Herzinfarkt, mit Herzischämie verbundenem Herzversagen, Atheriosklerose, vaskulärer Hypertrophie und Thrombose, Hypertension; Schlaganfall; primärer pulmonarer Hypertension, chronisch obstruktiver Lungenkrankheit und Schocklunge; mikrovaskulären funktionellen Abnormalitäten bei Diabetes; Impotenz; Stimulierung der Wundheilung; und Hypopigmentierungsstörungen ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erkrankung oder der Zustand aus Störungen der Neurotransmitterfreisetzung, Neuron-Morphogenese, synaptischer Plastizität und neuroendokriner Regulation; regionalem Schmerz, einschließlich Migränekopfschmerz; Hemmung des Tumorwachstums; proliferativen Hautstörungen oder Störungen der Keratinisierung, neurodegenerativen Störungen ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erkrankung oder der Zustand aus hämostatischen Irregularitäten der glomerulären, vaskulären und tubulären Funktion; Störungen der Blasenfunktion und der Reflexrelaxation zur Blasenentleerung; und benigner Analerkrankung ausgewählt ist.