DE69911210T2

DE69911210T2 - Verwendung von piperin und derivate davon zur behandlung von hautpigmentierungstörungen und hautkrebs

Info

Publication number: DE69911210T2
Application number: DE69911210T
Authority: DE
Inventors: Amala Southgate RAMAN; Zhixiu Balham LIN
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: OREGON HEALTH & SCIENCE UNIVERSITY, PORTLAND, OREG
Priority date: 1998-07-13
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-07-14
Also published as: AU757053B2; GB9815177D0; CA2735844C; US6346539B1; KR20010071872A; CA2735844A1; JP2002520275A; HK1033264A1; WO2000002544A3; CN1210029C; WO2000002544A2; EP1094813B1; DE69911210D1; CA2337205C; ATE249220T1; ES2207252T3; CA2337205A1; CN1330545A; EP1094813A2; ZA200004260B

Description

Diese Erfindung betrifft Mittel für die Behandlung von Hauterkrankungen und im besondereren diejenigen Erkrankungen, welche eine Stimulation der Proliferation von Melanozyten erfordern. Die Erfindung ist von einer besonderen Anwendung für die Behandlung von Vitiligo.
Vitiligo ist eine häufige Erkrankung der Hautpigmentierung, charakterisiert durch die Entwicklung von ungleichmäßigen depigmentierten Läsionen. Die gegenwärtigen Behandlungen, welche die Verwendung von Photosensibilisierern (z. B. Psoralene) mit UVA-Bestrahlung (PUVA), Cortikosteroiden oder Hauttransplantaten einschließen, haben niedrige Erfolgsraten und werden im allgemeinen durch unerfreuliche Nebenwirkungen begleitet. Vitiligo hat einen in hohem Maße nachteiligen Einfluß auf das emotionale Wohlbefinden des daran Leidenden, wobei die entstellenden Wirkungen der Erkrankung durch das Fehlen einer geeigneten Behandlung verschlimmert werden. Obwohl man nicht glaubt, daß die Flecken bei Vitiligo Melanozyten enthalten (Pigment erzeugende Zellen), existiert ein Reservoir in den Haarfolikeln in der Haut mit Vitiligo. Daher ist die Aktivierung der Melanozyten der Haarfolikel ein wesentliches Verfahren bei der Wiederpigmentierung der Haut mit Vitiligo.
Bestimmte Pflanzenheilmittel, gewöhnlich verabreicht als Mischungen von Kräutern oder Extrakten, insbesondere diejenigen, welche in der traditionellen chinesischen Medizin und indischen ajurvedischen Medizin verwendet wurden, wurden für die Behandlung von Vitilgo während einer langen Zeit verwendet und in vielen Fällen haben sie positive Ergebnisse in Studien in kleinem Umfang ergeben. Kräuter wie Psoralea cyrylifolia L. und Vernonia anthelmitica Will. (=Centratherum anthelminticum Kuntze) sind für ihre Verwendung bei dieser Erkrankung wohlbekannt. Psoralene, welche in der modernen PUVA- und Khellin in der KUVA-Therapie verwendet werden, stammen ursprünglich aus pflanzlichen Quellen (Psoralea corylifolia L. bzw. Ammi visnaga), welche in traditionellen Heilmitteln für Vitiligo verwendet werden. Diese Therapien hängen jedoch für ihre Effizienz von der Verwendung einer UV-Bestrahlung ab, welche mit der Ätiologie für Hautkrebs verbunden ist.
Die Frucht des schwarzen Pfeffers (Piper nigrum L.) und des langen Pfeffers (Piper longum L.) sind beide wichtige medizinische Kräuter in den ajurvedischen und Unani- (traditionellen Indischen) Medizinsystemen, in welchen Heilmittel im allgemeinen aus Mischungen aus Kräutern bestehen. Ein weiter Bereich der medizinischen Verwendungen von schwarzem Pfeffer wurde durch Kirtikar und Basu (Indian Medicinal Plants, 2. Ausg. Bnd. 3, (1935), S. 2128–2135) dokumentiert, einschließlich seiner Verwendung bei Leukoderma. Schwarzer Pfeffer wurde ebenfalls als ein mögliches Zusatzmittel zu Vernonia anthelmintica bei der Behandlung von Leucoderma in Verbindung gebracht (Indian Medicinal Journal Bnd. 1 3. Ausg. (1982) 1267– 1270). Diese zwei Kräuter werden verwendet als ein Bestandteil in vielen traditionellen Kräuterpräparationen für eine Vielfalt von Verwendungen einschließlich von gastrointestinalen und Hautkrankheiten. Zusammensetzungen, welche schwarzen Pfeffer, Ingwer und Pipali (Pipali) umfassen, wurden bei der Behandung von Vitiligo verwendet (Ancient Science of Life, Bnd IX, Nr. 4 (1990) 202–206); die spezifische therapeutische Wirkung von schwarzem Pfeffer in dieser oral verabreichten Zusammensetzung wurde jedoch nicht nachgewiesen.
Es gibt daher einen Bedarf an weiteren Verbindungen und Zusammensetzungen, welche in der Lage sind, die Proliferation von Melanozyten zu stimulieren. Bevorzugtermaßen sind die Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung in der Lage, die Proliferation von Melanozyten zu stimulieren ohne signifikante Nebenwirkungen. Die vorliegende Erfindung wendet sich diesem Bedarf zu.
Die Erfinder der vorlegenden Anmeldung haben 30 Extrakte von Kräutern überprüft, welche traditionell bei der Behandlung von Vitiligo verwendet wurden, unter Verwendung eines Zellkultursystems, um zu evaluieren, ob sie in der Lage sind, in einer direkten Weise die Proliferation von Melanozyten zu stimulieren. Man hat überraschenderweise gefunden, daß die Bestandteile der Frucht von Piper nigrum L. eine proliferative Aktivität für Melanozyten besitzt. Insbesondere hat man gefunden, daß der Bestandteil Piperin in der Lage ist, in einer signifikanten Weise die Produktion von Melanozyten zu stimulieren.
Es wurde ebenfalls berichtet, daß Piperin ebenfalls in anderen Piper-Spezies auftritt, d. h. P. acutisleginum, album, argyrophylum, attenuatum, aurantiacum, betle, callosum, chaba, cubeba, guineense, hancei, khasiana, longum, macropodum, nepalense, novae hollandiae, peepuloides retrofractum, sylvaticum. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Piperin enthalten, wurden bei der Behandlung von Tuberkulose und Lepra verwendet ( EP 0 650 728 ). Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, daß Piperin in der Lage sei, die Bioverfügbarkeit der anderen Bestandteile einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu erhöhen (WO 96/25 939).
Ein erster Aspekt der Erfindung sieht die Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren der Proliferation von Melanozyten einer Verbindung der Formel (I) vor:
worin:

(a) n 0, 1 oder 2 ist, m 2 ist, die zwei R¹ zusammen für eine 3', 4'-Methylendioxygruppe stehen, R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und, wenn n 1 oder 2 ist, R⁴ und R⁵ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und R⁶ Piperidino ist, oder
(b) n 1 ist und (i) m 3 ist, wobei zwei R¹ zusammen für 3',4'-Methylendioxy stehen und das andere für 6'-Methoxy steht; oder (ii) m 2 ist, wobei die R¹ 3'-Hydroxy-4'-methoxy sind; oder (iii) m 1 ist und R' 4'-Hydroxy ist; und R² bis R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind; oder
(c) n 1 ist, R⁶ Pyrrolidino, Isobutylamino oder Methoxy ist und alle anderen Symbole wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind, oder
(d) n 1 ist, R⁴ und R⁵ für Wasserstoffatome stehen und jedes von R² und R³ ebenfalls oder R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden; und m, R¹ und R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind;

Es ist ersichtlich, daß die Stimulation der Proliferation der Melanozyten in großem Maß die Wiederpigmentierung der depigmentierten Haut erleichtert. Die Depigmentierung der Haut kann zum Beispiel von Narbengewebe, welches als das Ergebnis eines Traumas der Haut wie einer Verbrennung oder einer Läsion gebildet wurde, stammen, oder kann von Zuständen der Haut wie Vitiligo stammen. Zusammensetzungen, welche Piperin oder ein aktives Analogon oder ein Derivat davon umfassen, können daher verwendet werden, um die posttraumatisiert depigmentierte Haut wieder zu pigmentieren, sowie Zustände wie Vitiligo.
Das Medikaments kann in der Form eines festen Pulvers, einer Paste, einer Salbe oder Creme, einer Tablette oder Kapsel oder einer Lösung sein. Das Piperin oder das aktive Derivat oder Analogon davon kann verabreicht werden über orale, lokale, intravenöse oder subkutane (intramuskuläre) Wege. Es wird bevorzugt, daß das Medikament lokal an dem depigmentierten Bereich der Haut angewendet wird. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als Medikamente verwendet werden, sind ebenfalls in dem Umfang der Erfindung eingeschlossen. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen eine Verbindung der Formeln (Ia) und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Verbindungen der Formel (Ia) sind dieselben, wie diejenigen der Formel (I), aber Piperin und seine Z, Z-, Z, E-, und E, Z- Stereoisomere sind ausgeschlossen.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikamentes zur Wiederpigmentierung von nach einem Träume depigmentierter Haut bereit gestellt. Unter dem Begriff „posttraumatisiert depigmentierte Haut" muß man verstehen, daß er die Haut meint, welche während des Heilungsprozesses gebildet wird, welcher nach einem Trauma der Haut wie einer Verbrennung oder Läsion auftritt.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Vitiligo bereit gestellt.
Obwohl die Zusammensetzungen oral verabreicht werden können, wird eine lokale Verabreichung bevorzugt.
Die Stimulation der Proliferation von Melanozyten kann ebenfalls verwendet werden, um die natürliche Färbung der Haut zu erhöhen oder zu fördern und Zusammensetzungen, welche eine Verbindung der Formel (I) enthalten, können als Bräunungsmittel verwendet werden. Diese Stärkung der natürlichen Farbe der Haut kann verwendet werden für prophylaktische oder kosmetische Zwecke.
Zusätzlich sorgt ein weiterer Aspekt der Erfindung für ein Verfahren zur Verstärkung oder zur Förderung der Färbung der Haut in einer kosmetischen Weise, umfassend die Verabreichung an eine Person, welche eine solche Wirkung wünscht von einer kosmetisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I). Die Verabreichung kann über orale oder lokale Wege erfolgen.
Es ist ersichtlich, daß die Verbindungen der Formel (Ia) zuvor nicht hierzu verwendet wurden für therapeutische Zwecke und ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Verbindung der Formel (Ia) bereit zur Verwendung bei der Stimulation der Proliferation von Melanozyten. Die Erfindung stellt ebenfalls eine Verbindung der Formel (Ia) zur Verwendung bei der Therapie bereit. Die therapeutischen Verwendungen schließen die Wiederpigmentierung von depigmentierter Haut, sowie die Verstärkung oder Förderung der Hautfärbung ein.
Man hat gefunden, daß Piperin die Proliferation von Melanomzellen inhibiert. Die Verbindung der Formel (I) kann ebenfalls bei der Behandlung von Hautkrebs verwendet werden. Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder zur Prävention von Hautkrebs in einem Menschen oder einem nicht-menschlichen Patienten bereit. Die Behandlung kann durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an den Patienten einer Verbindung der Formel (I) bewirkt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sorgt für die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikamentes bei der Behandlung von Hautkrebs.
Die Verbindung der Formel (I) kann über orale oder lokale Wege verabreicht werden. Geeignete Dosierungsformen können jedwede der hierin vorausstehend diskutierten sein.
Die Struktur der Verbindungen, welche innerhalb der Definition der Verbindung der Formel (I) fallen ist nachstehend gegeben.
Die Verbindungen 15 und 16 fallen nicht in den Umfang der Formel (I).
Die natürlicherweise auftretenden Verbindungen (einschließlich von Piperin) können aus geeigneten Pflanzenquellen extrahiert oder unter Verwendung von Verfahren, welche einem Fachmann bekannt sind, synthetisiert werden (siehe zum Beispiel Chapman und Hall, Combined Chemical Dictionary auf CD-ROM, erschienen 1 : 1 (1997) und The Merck Index (1983), 10. Ausg. Verl. Merck and Co, Rahway, USA. S. 1077–1078 (außer den Verbindungen 2 und 3)). Alle Verbindungen außer 6, 11, 13, 15 und 16 treten in P. nigrum oder anderen Piper-Spezies (10 und 12) auf.
Die Verbindungen 2 und 3 werden durch die Isolation aus P. nigrum durch Verfahren, welche einem Fachmann bekannt sind, hergestellt (siehe zum Beispiel Cleyn R De und Verzele M (1975). Constituents of Peppers. Teil VII Spectroscopic Structure Elucidation of Piperin and its Isomers. Bulletin de la Societé Chimique Belgique, 84, 435–438).
Die Verbindung 6 wird hergestellt durch die Hydrierung von Piperin über einem Adams-Katalysator unter Verwendung bekannter Verfahren (siehe zum Beispiel Banerji A., Bandyopadhyay D., Sarkar M., et al., (1985). Structural and synthetic studies on the retrofractamides – amide constituents of Piper retrofractum, Phytochemistry 24, 279–284).
Die Verbindung 11 wird hergestellt durch die Methanolyse von Piperin unter Verwendung von Natriummethoxid.
Die Verbindungen 13 und 15 werden hergestellt aus 3-Hydroxy-4-methoxybenzaldehyd bzw. Benzaldehyd als den Ausgangsmaterialien unter Verwendung von Verfahren, welche analog zu denjenigen sind, welche zur Herstellung von Piperin verwendet werden.
Die Verbindung 16 wird hergestellt aus der Reaktion zwischen Piperidin und E,E-Hexadienoylchlorid.
Die aktiven Verbindungen können formuliert werden für eine lokale Verwendung in der Form von Cremes, Weichparaffin oder Lotionen. Wäßrige Crem BP oder Gelbe Weichparaffin BP (Yellow Soft Paraffin BP) können geeigneterweise das aktive Mittel mit 0,03 bis 3,0 mg % Gew.- /Gew. oder eine äquivalente Menge von Pflanzenextrakt enthalten. Eine geeignete Lotion wird typischerweise hergestellt aus 20% Glycerol und 80% Ethanol in gereinigtem Wasser und enthält 0,03 bis 3,0 mg %Gew./Gew. des aktiven Materials. Diese lokalen Formulierungen können ebenfalls Penetrationsverstärker wie Oleinsäure, Propylenglycol, Ethanol, Harnstoff, Laurindiethanolamid oder -azon, Dimethylsulfoxid, Decylmethylsulfoxid oder Pyrrolidonderivate enthalten. Liposomale Zuführsysteme können ebenfalls verwendet werden.
Zusammensetzungen für orale Formulierungen schließen Tabletten oder Kapseln ein, welche 1,5 –150 mg des wirksamen Stoffes oder eine äquivalente Menge eines Pflanzenextraktes enthalten.
Figuren und Beipiele
Die Erfindung wird nun unter Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben werden unter Bezug auf die begleitenden Tabellen und Zeichnungen in welchen:
1: Wachstumskurven von Melan-a unter verschiedenen Mediumzusammensetzungen. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert und die Standardabweichung von 6 Wells bzw. Vertiefungen.
2: Wachstumskurven von Melan-a verschiedener Ausgangsplattierungsdichten, nachgewiesen mit dem SRB-Assay. Das Medium war supplementiert mit 20 nM TPA. Am Tag 4 wurde das Medium in den verbleibenden Platten ersetzt. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert und die Standardabweichung von 6 Replikaten.
3: Die Wirkung von Extrakt von P. nigrum auf das Wachstum von Melan-a-Zellen. Die Kultur wurde während 8 Tagen aufrechterhalten. Das Medium und der Extrakt wurden mit frischen an Tag 4 ersetzt. Jeder Punkt zeigt den Mittelwert und die Standardabweichung von 6 Wells außer 12 Replikaten für Zellen allein.
4: Die Wirkungen von Extrakt von P. nigrum auf die Proliferation einer Melan-a-Zelllinie. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert und die Standardabweichung von 6 Replikaten außer 12 Wells, welche für Zellen allein verwendet wurden.
5: Die Wirkung von Piperin und TPA auf das Wachstum von Melan-a-Zellen in Gegenwart von RO-31-8220. n = 6 für Piperin und mit TPA behandelte Wells, wohingegen n = 12 für RO-31-8220 allein.
6: Die Wirkungen von Piperin und TPA auf das Wachstum von humanen Melanoblasten in Gegenwart von ET3. *P < 0,05, wenn mit der Vehikelkontrolle verglichen (Ein-Weg-Anova, gefolgt von t-Test nach Dunnett).
7: Die Wirkungen von Piperin auf das Wachstum von humanen Melanozyten in der Gegenwart von ET1. *P < 0,05, wenn mit einer Behandlung mit 1 nM ET1 verglichen (Ein-Weg-Anova, gefolgt von t-Test nach Dunnett).
Variationen von diesen Beispielen werden einem Fachmann ersichtlich sein.
Beispiele
Pflanzenproben und Herstellung der Extrakte
Die Frucht von Piper nigrum L. (schwarzer Pfeffer, Piperaceae), ursprünglich aus Indien, wurde von dem Food Center, 70 Turnpike Lane, London, N8, GB erworben. Der Rest der Kräuter wurde entweder durch East-West Herbs, Kingham, Oxon, GB oder durch Cipla Ltd, Mumbai, Indien geliefert.
Für das vorläufige Überprüfungs-Programm wurde das pulverisierte trockene Kraut (10 g) bis zum Kochen in destilliertem Wasser (100 ml) erwärmt und 10 min kochen gelassen, unter Verwendung einer heißen Platte als Hitzequelle. Das Pflanzenmaterial wurde unter Vakuum durch ein Filterpapier (Whatman) abfiltriert, und das Filtrat wurde gefriergetrocknet.
Zellkulturexperimente
Mikroplattenkultur und Sulforhodamin B (SRB) Assay
Zellen einer Maus-Melan-a-Zelllinie (Passagennummer 18–24) eine zuerst bekannte Linie von keinen Tumor erzeugenden pigmentierten Melanozyten der Maus wurden in einer Flasche gehalten (Costar, Cambridge, MA, USA) unter Verwendung von RPMI 1640 (ICN, Costa, Mesa, CA, USA) als einem Basismedium. Für die Mikroplatten-Proliferationsassays wurde subkonfluente Melan-a-Kulturen trypsinisiert (0,25% Trypsin bei 37°C während 5–10 min) und mit einem Wiederholungspipettus (repeater-pipettor) (Finn pipette, Lab Systems, Finnland) in 96-Well-Mikrotiterplatten inokuliert. Die Platten wurden bei 37°C in einer 10% CO₂, 90% Luftfeuchtigkeit enthaltenden Atmosphäre während der Dauer der angegebenen Zeit inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde ein SRB-Assay durchführt. Kurz gesagt, wurden die am Boden der Platte anhaftenden Zellen durch die Zugabe von kalter Trichloressigsäure (TCA, 4°C, Aldrich, Dorset, GB) auf das Wachstumsmedium (End-TCA 20% Gew./Vol) fixiert Die Platte wurde bei 4°C eine Stunde lang plaziert, bevor sie sanft 5 Mal mit Leitungswasser gewaschen wurde. Sie wurde in der Luft trocknen gelassen oder mit einem Haartrockner unterstützt, um den Trocknungsprozeß zu beschleunigen, dann wurden 50 μl von 4%-igem Gew./Vol SRB, gelöst in 1%-iger Essigsäure zu einem jeden Well 30 min lang hinzu gegeben. Am Ende der Färbeperiode wurde ungebundenes SRB durch viermaliges Waschen mit 1%-iger Essigsäure entfernt. Die Platte wurde wiederum luftgetrocknet und 150 μl von 10 mM wäßriger Tris-Base (Sigma-Aldrich, Co., Ltd, Irvine , GB) wurden zu jeden Well hinzu gegeben, um den zellgebundenen Farbstoff zu solubilisieren. Die Platte wurde 15 min lang auf einem Taumelschüttler geschüttelt, gefolgt vom Lesen der optischen Dichte (OD) bei 550 nm in einem Spektrophotometer für Mikroplatten (Anthos Labtec HT3, Version 1.06).
Beipiel 1
Optimierung der Inkubationsbedingungen – FKS-Konzentrationen und der Zellaussaatdichte
Vor dem Testen der Kräuterextrakte wurden optimale Kulturbedingungen etabliert. Die variablen Faktoren betreffen die Inkubationsbedingungen, schließen die Konzentration von fötalem Käl- berserum (FKS bzw. FBS), Die Ausgangszellaussaatdichte und die Inkubationsperiode ein. Um die optimale Konzentration von FKS zu bestimmen, wurden 1, 2 und 5% FKS verwendet, um die Melan-a-Zelllinie zu kultivieren, wobei das Wachstumsmuster mit jeder Konzentration von FKS durch einen SRB-Assay überwacht wurde. Zur Bestimmung der optimalen Zellaussaatdichte wurde eine Serie Ausgangsaussaatdichten von 0,15 bis 1,2 × 10⁴ Zellen/Well von Melan-a-Zellen in 96-Well-Platten plattiert mit 5% FKS und 20 nM Tetradecanoylphorbolacetat (TPA) supplementiertem Wachstumsmedium. Das Wachstumsmuster wurde mit einem SRB-Assay in täglichen Intervallen überwacht. Die Kultur wurde auf 8 Tage ausgedehnt, wobei an Tag 4 das Medium in den verbleibenden Platten ersetzt wurde.
Ergebnisse
Die Wirkung der Konzentrationen von FKS auf das Wachstum von Melan-a
Die optimale Bedingung für die experimentelle Negativkontrolle ist, daß die Zellen weder zu schnell wachsen, noch daß sie in einer dramatischen Weise abnehmen. Schnelles Wachstum kann jedwede subtile stimulierende Wirkung maskieren, welche durch die Kräuterextrakte hervorgebracht wird, während ein dramatisches Abnehmen der Zellzahlen ungünstige Kulturbedingungen für das Überleben der Zellen anzeigt, was zu Zellschädigungen führen kann. Die 1 zeigt die Wachstumskurven einer Melan-a-Zelllinie bei 3 unterschiedlichen Konzentrationen von FKS. Weder mit 1% noch 2% FKS supplementiertes Medium war in der Lage das Überleben der Zellen aufrecht zu erhalten, die Zellzahlen nahmen in einer signifikanten Weise in vier Tagen der Kultur ab. 5% FKS war jedoch in der Lage eine Melan-a Zelllinie am Leben zu erhalten, mit nur einem geringen Anstieg bei den Zellzahlen, beobachtet über vier Tage. TPA (20 nM) war in der Lage eine weitere Proliferation in Gegenwart von 5% FKS zu verursachen, was anzeigte, daß die Zellen in der Lage waren, auf mitogene Stimuli bei 5% FKS zu antworten. Die morphologischen Beobachtungen unter einem Mikroskop enthüllten, daß mit 1% und 2% supplementiertem Medium die Zellkörper rund waren, in leichtem Maße pigmentiert mit wenigen dendritischen Fortsätzen, und die Kultur zeigte ein alterndes Wachstumsmuster. In 5% FKS besaßen die Zellen jedoch mehr Melanosomen und einige kurze Dendriten ohne ein alterndes Aussehen. Daher wurde 5% FKS in den Experimenten zum Überprüfen der Kräuter die ganze Zeit hindurch verwendet.
Wachstumskurven von einer Melan-a-Zelllinie mit unterschiedlichen Aussaatdichten.
In der 2 wurden Wachstumskurven über 8 Tage mit unterschiedlichen Ausgangszellzahlen geplottet, um das Wachstumsmuster der Melan-a-Zelllinie in 96-Well-Platten in Gegenwart von 5% FKS und 20 nM TPA zu erhellen. Die optimale Ausgangsplattierungsdichte zusammen mit einer geeigneten Erntezeit wurde bestimmt. Alle von den Ausgangsplattierungszahlen von Zellen zeigten ein Nettowachstum in Gegenwart von dem mit TPA und 5% FKS supplementierten Medium, obwohl die höhere Plattierungsdichte von 1,2 × 10⁴ Zellen/Well das Wachstumsmedium an Tag 3 der Kultur depletierte und die Zellen aufhörten zu wachsen, bis das Medium ersetzt wurde. Mit den niedrigeren Plattierungsdichten (2–4 × 10³ Zellen/Well) bleiben die gelesenen OD des SRB-Assays relativ niedrig nach einer Kultur von 8 Tagen. Die Ausgangsplattierungsdichte von 6 × 10³ Zellen pro Well wies ein exponentielles Wachstum auf und nach 4 Tagen der Kultur stieg die Lesung der OD auf einen Wert von etwa 0,4 an. Da die höheren Werte der OD mit einer größeren Präzision und Genauigkeit assoziiert sind, wurde bestimmt, daß die Ausgangsinokulation von 6 × 10³ Zellen/Well die optimale Dichte für das Experiment des Kräutertests war. Für die Einfachheit des Experimentes war die Erntezeit der Tag 4, da die Zellen in diesem Stadium nicht konfluent waren und nach 4 Tagen das Wachstumsmedium die Tendenz aufwies, erschöpft zu sein, und ein Ersetzen für das weitere Wachstum notwendig war.
Beispiel 2
Vorläufige Experimente zur Überprüfung der Kräuter
Die Melan-a-Zellen wurden mit einer Dichte von 6 × 10³ Zellen/100 μl/well in Standardmedium, supplementiert mit 0 nM TPA und 5% FKS ausgesät. Nach einer Inkubation von 4 Stunden wurden die Kräuterextrakte, welche in dem Wachstumsmedium rekonstituiert worden waren und durch Filtration (Porengröße 0,2 μm) sterilisiert worden waren, mit verschiedenen Konzentrationen zu jedem Well hinzu gegeben. Die Endkonzentrationen der Pflanzenextrakte waren 0 (Negativkontrolle), 10, 100 und 1000 μg Trockenextrakt/ml. Replikate von 6 Wells wurden für jede getestete Konzentration verwendet. Die Negativkontrolle (12 Wells), die Positivkontrolle (20 nM TPA 6 Wells) und die Test-Wells waren alle in derselben 96-Well-Platte. Die Kultur wurde nach 4 Tagen beendet und ein SRB-Assay wurde gemäß den vorausstehend gegebenen Methoden durchgeführt.
Ergebnisse
Die Wirkung von 30 Kräuterextrakten auf die Proliferation einer Melan-a-Zelllinie
Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der vorläufigen Überprüfung von 30 wäßrigen Kräuterextrakten auf die Proliferation einer Melan-a-Zelllinie. Rohextrakte von Astragalus membranceous (Fisch.) Bunge, unreife Citrus reticulata Blanco, Dictamnus dasycarpus Turcz., Ophiopogon japonicus (Thunb.) Kergawe, Piper nigrum L., Poria cocos (Schw.) Wolf und Tribulus terestris L. wurden beobachtet, um die Proliferation der Melanozyten zu stimulieren, manchmal selbst im niedrigsten Dosisniveau von 10 μg/ml. Andere Extrakte hatten entweder keine signifikante Wirkung oder waren cytotoxisch. Unter diesen positiven Antworten war diejenige des Extraktes von Piper nigrum L. bei 0,01 und 0,1 mg/ml der deutlichste. Der Extrakt von Piper nigrum bei diesen beiden Konzentrationen verstärkte nicht nur erstaunlicherweise das Zellwachstum, sondern dieser Extrakt veränderte ebenfalls die Zellmorphologie. In der Gegenwart von Extrakt von Piper nigrum waren die Zellkörper kleiner, mit mehr und längeren bipolaren oder polydendritischen – Fortsätzen, eine Wirkung, ähnlich zu dem mit TPA beobachteten.
Beipiel 3
Wiederholungen der Tests mit Extrakten von Piper nigrum an den Melan a-Zellen
Ein neu hergestellter Extrakt der Frucht von Piper nigrum wurde an einer neuen Charge einer Melan-a-Zelllinie getestet, wobei die Kultur in Mikroplatten auf 8 Tage ausgedehnt wurde. Die Wirkungen des Extraktes auf das Wachstum der Melan-a-Zellinie wurden durch einen SRB-Assay evaluiert.
Ergebnisse
Wiederholungen der Tests mit Extrakten von Piper nigrum an den Melan a-Zellen
Im Licht der positiven Ergebnisse von dem vorläufigen Experiment wurden weitere Untersuchungen an dem Extrakt von Piper nigrum durchgeführt. Die 3 zeigt, daß das Ergebnis des signifikanten proliferativen Effektes, welcher durch den Extrakt von Piper nigrum hervorgerufen wurde noch deutlicher ausgeprägt war bei der Ausdehnung der Inkubationsperiode auf 8 Kulturtage, wobei das Wachstum 27% der Kontrolle (Zellen allein) war. Mikroskopisch war die Morphologoie der Zellen verändert wie bei denjenigen, die in den vorläufigen Experimenten gesehen wurden.
Beispiel 4
Bestätigung des proliferative Effektes von Piper nigrum durch das Zählen im Haemocytometer
Melan-a-Zellen wurden in Petrischalen (Ø 35 mm, Nunclon, Dänemark) mit einer Plattierungsdichte von 2 × 10⁴/ml plattiert und Extrakt von Piper nigrum mit Konzentrationen von 0,01 und 0,1 mg/ml. Eine Negativkontrolle (Zellen in Medium allein) und eine positive TPA-Kontrolle (20 nM) wurden ebenfalls angesetzt. Nach 4 Tagen wurden die Zellen in jeder Schale geerntet und mit einem Haemocytometer gezählt.
Ergebnisse
Bestätigung des proliferative Effektes von Piper nigrum durch das Zählen im Haemocytometer
Der SRB-Assay schätzt in einer indirekten Weise die Zellzahl durch das Färben von Protein und eine spektrophotometrische Messung ab. Um zu bestätigen, daß Extrakt von Piper nigrum die Proliferation von Melan-a-Zellen stimuliert, wurde ein direktes Zellzählen durch das Verfahren des Zellzählens mit dem Haemocytometer verwendet. Die Tabelle 2 zeigt die Zellzahlen in Gegenwart von Extrakt von Piper nigrum und 20 nM TPA. Die Zellzahl unter dem Einfluß von Extrakt von Piper nigrum bei 0,01 und 0,1 mg/ml waren in einer signifikanten Weise im Vergleich zu der Kontrolle erhöht, aber weniger als mit 20 nM TPA. Dieses Ergebnis ist konsistent mit dem Befund in dem 96-Well-Mikroplatten-SRB-Assay.
Beispiel 5
Wirkung von Piperin auf das Wachstum von Melan-a-Zelllinie
Piperin (Sigma-Aldrich, Co, Ltd, Irvine, GB) wurde in MeOH gelöst, sterilisiert durch eine Filtration über eine Membran (Porengröße 0,2 μm) und mit Standardwachstumsmedium verdünnt. Die Endkonzentrationen in der Kultur waren 0,1 und 1 μM. Ein getrenntes Experiment (Daten nicht gezeigt) zeigte, daß die Konzentration des MeOH, welche in diesen Experimenten vorhanden war, nicht toxisch oder proliferativ für die Zelle war.
Ergebnisse
Wirkung von Piperin auf das Wachstum von Melan-a-Zelllinie
Die Wirkung dieser Verbindung auf die Melan-a-Zelllinie ist in der 4 gezeigt. Das Piperin stimulierte in den zwei getesteten Konzentrationen in einer signifikanten Weise die Proliferation von Melan-a. Diese Verbindung brachte morphologische Veränderungen bei Melan-a-Zellen hervor mit kleineren Zellkörpern, mehr und längeren zellulären Dendriten, welche diesen Veränderungen, welche durch Extrakt von Piper nigrum und TPA induziert wurden, ähnelten. Dies zeigt an, daß Piperin ein aktiver Wirkstoff ist, welches für den beobachteten Effekt von Piper nigrum verantwortlich ist.
Beispiel 6
Test von Piperin an verschiedenen Zelltypen, um seine Spezifität zu bestimmen.
Um die Spezifität von Piperin zu bestimmen, wurde ein Panel bzw. eine Reihe verschiedener Zelltypen verwendet, um diese Untersuchung zu erleichtern. Dies schloß Melan-a, Melan-c, SVK14, CSM, XB2, SC1, B16F10, IM9, CACO2, Swiss 3T3 Zelllinien und normale humane Lymphozyten ein. TPA (20 nM ) wurde ebenfalls an diesen Zellen getestet. Die Tabelle 3 zeigt den biologischen Ursprung der Zellen und einen Überblick über die Zellkulturprotokolle.
Ergebnisse
Die Wirkungen von Piperin und TPA auf das Wachstum von einem Panel von Zelltypen
Aus der Tabelle 4 ist ersichtlich, daß Piperin eine in hohem Maße selektive Wirkung auf das Wachstum eines Panels von Zelltypen hat, da es nur die Mausmelanozyen (Melan-a, Melan-c), humane Melanoblasten (FM21E), humane fötale Melanozyten (FM 21E) und die Mäusefibroblasten SC1 -Zelllinien bei den getesteten Konzentrationen stimuliert. Die Zelllinie SC1 kann eine besondere Sensibilität gegenüber von TPA aufgrund der Weise haben, auf die sie abgeleitet wurde, d. h. sie wurde in Gegenwart von TPA kultiviert. Piperin hatte jedoch entweder keine Wirkung oder eine cytotoxische Wirkung auf andere Zellen. Dieses Ergebnis impliziert, daß Piperin einen wünschenswerten Spezifitätsindex für die Proliferation von Melanozyten in Kultur haben kann und kein allgemeines Mitogen ist. In unserem experimentellen System hatte TPA, ein wohlbekannter Aktivator von PKC und ein Tumor förderndes Mittel, ähnliche Wirkungen wie Piperin auf alle getesteten Zelltypen, außer daß TPA die Proliferation von humanen Lyphozyten und 3T3-Fibroblasten auffallend stimulierte, während Piperin offensichtlich eine solche Aktivität fehlte. Piperin scheint ein weniger potentes Stimulationsmittel zu sein als TPA.
Beispiel 7
Wirkungsweise: Wirkung von RO-31-8220 auf das Wachstum von Melan-a-Zellen mit Piperin und TPA
Die Melan-a-Zelllinie, die mit Piperin 1 μM und TPA 20 nM getrennt kultiviert wurde, wurde in einer 96-Well-Platte angesetzt, 1 μl unterschiedlicher Konzentrationen von RO 31-8220 (Calbiochem-Novabiochem) in DMSO wurde mit einer Mikrospritze in die Wells eingeführt, um die Endkonzentrationen von RO-31-8220 von 0 (Kontrolle), 0,1, 1, 5, 10, 100 nM zu erstellen, mit Endkonzentrationen von DMSO geringer als 0,01% Vol/Vol, bei welchen das DMSO weder einen cytotoxischen noch einen proliferativen Effekt auf die Zellen in einem getrennten Experiment zeigte (Daten nicht gezeigt). Replikate von 6 Wells wurden für jede Konzentration verwendet. Die Kultur wurde 4 Tage lang inkubiert, bevor sie beendet und mit dem SRB-Assay prozessiert wurde, um das Wachstum der Melan-a-Zellen zu bewerten.
Ergebnisse
Wirkungsweise: Wirkung von RO-31-8220 auf das Wachstum von Melan-a-Zellen mit Piperin und TPA
Die 5 zeigt die Wirkung von RO-31-8220 auf das Überleben und das Wachstum der Me-lan-a-Zelllinie in Gegenwart und Abwesenheit von Piperin und TPA. RO-31-8220 alleine hatte keinen signifikanten cytotoxischen Effekt auf die Zellen bei den Konzentrationen bis zu 100 nM. Die proliferativen Wirkungen von Piperin und TPA, wie angezeigt durch die Werte auf der y-Achse, auf die Melan-a-Zellen wurden in einer wirksamen Weise durch die Gegenwart von RO-31-8220 bei den Konzentrationen von 0,1 bis 100 nM gehemmt. Es scheint daher, daß Piperin und TPA ihre proliferativen Wirkungen über die Aktivierung des PKC-Zellsignalübertragungsweges ausüben.
Die Selektivität von Piperin auf das Wachstum eines Panels von Zelltypen wurde ebenfalls getestet. Man fand, daß Piperin eine ziemlich hohe Spezifität und Selektivität gegenüber Melanozyten besaß, da es in einer signifikanten Weise das Wachstum von Melan-a, Melan-c und FM21E Melanoblasten und FM21E Melanozyten in Kultur stimulierte, wohingegen es alle anderen Zellen, abgesehen von einer TPA-sensitiven Fibroblastenzelllinie nicht stimulierte. Man beobachtete, daß Piperin hemmende Wirkungen auf eine B16-Maus-Melanomzelllinie hat, welche syngen mit Melan-a-Zellen ist. Auf diese Weise kann Piperin ein spezifisches Stimulationsmittel für die Proliferation von Melanozyten in der Haut mit Vitiligo sein, ohne das Risiko, Melanomzellen zu stimulieren.
Beispiel 9
Experimente an humanen Melanoblasten in Kultur
Die humanen Melanoblasten in Kultur in diesem Experiment wurden aus fötaler humaner Haut etabliert. Subkonfluente Melanoblasten, die in MCDB 153 Medium, supplementiert mit 10% FKS, 10 ng/ml Stammzellfaktor (SCF) und 1 nM Endothelin 3 gehalten wurden, wurden subkultiviert und in 96-Well-Mikroplatten mit 6 × 10³ Zellen/100 μl/Well inokuliert. Nach einer Inkubation in der befeuchteten Atmosphäre mit 10% CO₂, bei 37°C während 3 bis 4 Stunden, um das Anhaften der Zellen an die Platten zu gestatten, wurde Piperin gelöst in MeOH und Wasser zu den Wells hinzu gegeben. Die Endkonzentrationen von Piperin waren 1, 5, 10, 100 μM, mit TPA (20 nM) als einer Positivkontrolle. 6 Replikate wurden in jeder Behandlungsgruppe verwendet, mit 12 Wells, die für die Vehikelkontrolle verwendet wurden. Die Inkubation wurde 5 Tage lang durchgeführt, bevor die Zellen durch Fixieren mit kalter Trichloressigsäure (TCA bei 4°C, Endkonzentration 20% Vol/Vol) geerntet wurden, und auf die Zellzahl hin evaluiert unter Verwendung eines SRB-Assays. Enweg ANOVA und T-Test nach Dunnett wurden verwendet, um die Signifikanz jedweder Unterschiede zwischen der Behandlungsgruppe und der Vehikelkontrolle zu testen. Das Wachstum in Gegenwart von Piperin und TPA wurde ausgedrückt als % der Kontrollinkubationen, welche kein Piperin oder TPA enthielten. Die Experimente wurden wiederholt unter Verwendung von Melanoblasten von drei verschiedenen Spendern.
Ergebnisse
Die 6 zeigt die Wirkung von Piperin auf das Wachstum von humanen Melanoblasten in vitro. Man fand, daß Piperin bei den Konzentrationen von 1, 10, 100 μM eine signifikante Stimulation bei humanen Melanoblasten in der Weise einer Dosis-Antwort verursachte, mit einem Ertrag von 34% mehr Zellen im Vergleich zur Vehikelkontrolle, wenn die Kultur 100 μM Piperin in Kultur während 5 Tagen ausgesetzt worden war. TPA, ein wohlbekanntes, das Wachstum von Melanozyten stimulierendes Mittel, war ebenfalls in der Lage, ein signifikantes Zellwachstum bei den getesteten Konzentrationen zu verursachen, wobei ein über 50% höherer Zellertrag beobachtet wurde, wenn die Kultur 20 nM während 5 Tagen ausgesetzt war. In den anderen wiederholten Experimenten beobachtete man in einer übereinstimmenden Weise, daß Piperin ein signifikantes Zellwachstum bei den Konzentrationen in dem Bereich von 5–100 μM induzierte; diese stimulatorischen Wirkungen waren im allgemeinen geringer als die von TPA. Morphologisch erschienen in der Gegenwart von Piperin die Melanoblasten dendritischer zu sein, und die Zellkörper waren flacher und kleiner.
Beispiel 10
Experimente an humanen Melanozyten in Kultur
Die in diesem Experiment verwendeten Melanozyten stammten von der induzierten Differenzierung von humanen fötalen Melanoblasten. Die Schlüsseleigenschaft humaner Melanozyten, welche von ihren Vorläufermelanoblasten verschieden ist, ist ihre Fähigkeit, Melanin zu synthetisieren. Melanin ist ein valider Marker für Melanozyten. Das Zellpellet humaner Melanozyten weist eine charakteristische braune bis schwarze Farbe auf, wohingegen humane Melanoblasten kein Melanin produzieren und ihnen daher die braune oder schwarze Farbe im Zellpellet fehlt.
Zwei Protokolle wurden für die Experimente an humanen Melanozyten in Kultur verwendet. Das erste verwendete 24-Well-Platten und bewertete die Zellanzahl mit einem SRB-Assay. Das zweite verwendete Petrischalen und die Zellzahl wurde mit einer Haemocytometerkammer gezählt.
Für das erste Protokoll wurden subkonfluente humane Melanozyten, die in einer Petrischale Ø 100 mm gehalten wurden, in zwei 24-Well-Platten (Falcon) unter Verwendung von Basiskulturmedium RPMI 1640, supplementiert mit FKS (10%), bFGF (100 pM) CT (100 nM), und Endothelin 1 (1 nM) subkultiviert. Die Ausgangsplattierungsdichte war 20 000 Zellen/cm² (38200 Zellen/Well), wobei jedes Well 1000 μl Medium enthielt. Nach einer Inkubation in einer befeuchteten Atmosphäre mit 10% CO₂, bei 37°C während 2 bis 3 Stunden, um das Anhaften der Zellen zu gestatten, wurde Piperin in 500 μl Medium zu den Wells hinzu gegeben, um Endkonzentrationen von 0, 1, 5, 10 und 100 μM zu ergeben. Zellen in dem Medium allein mit dem vorausstehenden Supplement, welchem Endothelin 1 fehlte, wurden ebenfalls als eine Negativkontrolle angesetzt. 6 Replikate wurden in jeder Behandlungsgruppe verwendet, und die Kultur wurde 5 Tage lang inkubiert, bevor die Zellen durch Fixieren mit kalter TCA (Endkonzentration 20%) geerntet wurden und mit einem SRB-Assay prozessiert wurden. Die solubilisierte SRB-Färbelösung wurde in eine 96-Well-Platte zum Lesen der optischen Dichte transferiert.
Für das zweite Protokoll wurden subkonfluente humane Melanozyten in Petrischalen mit einem Durchmesser von 60 mm (28 cm², Falkon) mit RPMI 1640 Basismedium subkultiviert, supplementiert mit FKS (10%), CT (1 nM), bFGF (100 pM) und Endothelin 1 (1 nM). Die Ausgangsplatierungsdichte war 10 000 Zellen/cm² mit 5 ml Medium pro Schale. Die Zellen wurden 2 bis 3 Stunden lang in befeuchteter Atmosphäre mit 10% CO₂ bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Piperinlösung in die Schalen, was die Endkonzentrationen von 0, 1, 5, 10 und 100 μM herstellte. Die Zellen in dem vorausstehenden supplementierten Medium, welchem Endothelin 1 fehlte, wurden ebenfalls als eine Negativkontrolle angesetzt. 3 Schalen wurden für jede Behandlung verwendet und die Kultur wurde 5 Tage gehalten, bevor die Zellen mit Trypsinisierung geerntet und mit einer Haemocytometerkammer gezählt wurden. Für das Melanin-Produktionsexperiment wurden die geernteten Zellen zentrifugiert und pelletiert. Nach dem sorgfältigen Entfernen des Mediums wurde NaOH (1 M) verwendet, um die Zellpellets zu solubilisieren und die optische Dichte wurde bei 475 nm in einem Perkin-Elmer UV Spektrophotometer (Modell UV/VIS Lambda 2) gelesen. Der Melaningehalt wurde berechnet durch das Verwenden einer Regressionsgleichung y = 0,005 + 0,005x, was der Kalibrierungskurve für synthetisches Melanin entsprach.
Ergebnisse
Die 7 beschreibt die Wirkungen von Piperin auf das Wachstum von humanen Melanozyten, kultiviert in einer 24-Well-Platte. Piperin stimuliert bei den Konzentrationen von 5 und 10 μM in einer merklichen Weise das Wachstum dieser pigmentierten Zellen, wobei 36% mehr Zellen erhalten wurden, wenn die Kultur unter dem Einfluß von 10 μM Piperin während 5 Tagen stand. Bei 100 μM übt Piperin jedoch einen Hemmenden Einfluß auf das Wachstum dieser Zellen aus. Zusätzlich war TPA bei 20 nM in Gegenwart von 1 nM Endothelin 1 nicht in der Lage, das Wachstum in unserem Kultursystem zu stimulieren, ein Ergebnis, welches einen großen Unterschied zu dem mit humanen Melanoblasten beobachteten zeigt.
Die Tabelle 5 zeigt die Wirkungen von Piperin auf das Wachstum von humanen Melanozyten, kultiviert in Petrischalen. Es ist unübersehbar, daß in Gegenwart von ET1 (1 nM) Piperin bei den Konzentrationen von 5 und 10 μM in einer signifikanten Weise das Wachstum von humanen Melanozyten stimulierte, mit einer Zellzahl, die mehr als zweimal so hoch war wie diejenige der Kontrolle mit ET1 (1 nM), wenn dieser Melanozytenzelltyp 5 μM Piperin während 5 Tagen ausgesetzt war. Dieses Ergebnis stimmte mit demjenigen überein, welches aus den Ergebnissen mit der 24-Well-Platte erhalten worden war und es diente dazu, zu bestätigen, daß die stimulierenden Wirkungen, die in dem SRB-Assay beobachtet wurden, in der Tat von der erhöhten Zellzahl herstammten anstatt von einer Erhöhung allein der Proteinproduktion.
Tabellen Tabelle 1 Vorläufige Überprüfung von 30 wäßrigen Kräuterextrakten auf die Proliferation einer Melan-a-Zelllinie, nachgewiesen mit einem SRB-Assay nach 4 Tagen Kultur
Tabelle 2 Wirkungen von Extrakt von Piper nigrum auf die Proliferation von Melan-a-Zellen, gezählt mit einem Haemocytometer.
Tabelle 3: Biologischer Ursprung und die Kulturbedingungen eines Panels von verschiedenen Zellarten, welche in dem Selektivitäts-Experiment verwendet wurden
Tabelle 4: Wirkungen von Piperin und TPA auf das Wachstum eines Panels von Zelltypen. (Siehe Tabelle 3 wegen Details der Zellen)
Tabelle 5: Wirkungen von Piperin auf die Proliferation und die Melaninproduktion von humanen Melanozyten, kultiviert in Petrischalen

Claims

Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren der Proliferation von Melanozyten einer Verbindung der Formel (I):
worin: (a) n 0, 1 oder 2 ist, m 2 ist, die zwei R¹ zusammen für eine 3',4'-Methylendioxygruppe stehen, R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und, wenn n 1 oder 2 ist, R⁴ und R⁵ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und R⁶ Piperidino ist, oder (b) n 1 ist und (i) m 3 ist, wobei zwei R¹ zusammen für 3',4'-Methylendioxy stehen und das andere für 6'-Methoxy steht; oder (ii) m 2 ist, wobei die R¹ 3'-Hydroxy-4'-methoxy sind; oder (iii) m 1 ist und R' 4'-Hydroxy ist; und R² bis R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind; oder (c) n 1 ist, R⁶ Pyrrolidino, Isobutylamino oder Methoxy ist und alle anderen Symbole wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind, oder (d) n 1 ist, R⁴ und R⁵ für Wasserstoffatome stehen und jedes von R² und R³ ebenfalls oder R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden; und m, R¹ und R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind; und im Fall (a), wenn n 1 ist, das Molekül sich in der geometrischen E, E-, Z, Z-, Z, E- oder E, Z-Konfiguration befindet, aber ansonsten das Molekül sich in der geometrischen E, E- oder in der Ganz-E-Konfiguration befindet.
Verwendung gemäß Anspruch 1 einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikaments für die Repigmentierung depigmentierter Haut.
Verwendung nach Anspruch 2, in welchem die depigmentierte Haut posttraumatisierte depigmentierte Haut ist.
Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 einer Verbindung der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Vitiligo.
Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Hautkrebs einer Verbindung der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert.
Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung der Formel (I) in der Form eines Pflanzenextrakts vorliegt.
Verbindung der Formel (Ia):
worin: (a) n 0 oder 2 ist, m 2 ist, die zwei R¹ zusammen für eine 3',4'-Methylendioxygruppe stehen, R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und, wenn n 1 oder 2 ist, R⁴ und R⁵ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und R⁶ Piperidino ist, oder (b) n 1 ist und (i) m 3 ist, wobei zwei R¹ zusammen für 3',4'-Methylendioxy stehen und das andere für 6'-Methoxy steht; oder (ii) m 2 ist, wobei die R¹ 3'-Hydroxy-4'-methoxy sind; oder (iii) m 1 ist und R' 4'-Hydroxy ist; und R² bis R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind; oder (c) n 1 ist, R⁶ Pyrrolidino, Isobutylamino oder Methoxy ist und alle anderen Symbole wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind, oder (d) n 1 ist, R⁴ und R⁵ für Wasserstoffatome stehen und jedes von R² und R³ ebenfalls oder R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche: sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden; und m, R¹ und R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind; und das Molekül sich in der geometrischen E, E- oder in der Ganz-E-Konfiguration befindet, zur Verwendung in der Therapie.
Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 7 zur Repigmentierung depigmentierter Haut.
Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 8, bei der die depigmentierte Haut posttraumatisierte depigmentierte Haut ist.
Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 7 oder 8 zur Behandlung von Vitiligo.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch zulässigen Träger und eine pharmazeutisch annehmbare Menge einer Verbindung der Formel (Ia)
worin: (a) n 0 oder 2 ist, m 2 ist, die zwei R¹ zusammen für eine 3',4'-Methylendioxygruppe stehen, R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und, wenn n 1 oder 2 ist, R⁴ und R⁵ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden und R⁶ Piperidino ist, oder (b) n 1 ist und (i) m 3 ist, wobei zwei R¹ zusammen für 3',4'-Methylendioxy stehen und das andere für 6'-Methoxy steht; oder (ii) m 2 ist, wobei die R¹ 3'-Hydroxy-4'-methoxy sind; oder (iii) m 1 ist und R' 4'-Hydroxy ist; und R² bis R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind; oder (c) n 1 ist, R⁶ Pyrrolidino, Isobutylamino oder Methoxy ist und alle anderen Symbole wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind, oder (d) n 1 ist, R⁴ und R⁵ für Wasserstoffatome stehen und jedes von R² und R³ ebenfalls oder R² und R³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an welche sie gebunden sind, eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden; und m, R¹ und R⁶ wie im oben stehenden Fall (a) definiert sind; und das Molekül sich in der geometrischen E, E- oder in der Ganz-E-Konfiguration befindet.
Verfahren zur kosmetischen Verbesserung der Farbe der Haut, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, an einen Empfänger, der eine verbesserte Hautfarbe wünscht.