CN1330545A - 皮肤病的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了胡椒碱及其类似物或衍生物在恢复创伤后脱色素皮肤的色素沉着的治疗和诸如白癜风等皮肤病的治疗中的应用。所述胡椒碱及其类似物或衍生物也可用于美容以改善或加深皮肤的自然着色。
Description
本发明涉及皮肤病,更具体涉及那些需要刺激黑素细胞增生的皮肤病的治疗。本发明尤其适用于白癜风的治疗。
白癜风是一种常见的皮肤色素性疾病,其特征为发生斑片状脱色素性损伤。当前包括光敏剂(如补骨脂素)配合UVA照射(PUVA)、糖皮质激素的应用或皮肤移植等治疗措施的成功率均较低,并往往伴有令人不快的副作用。该病有损于人的外貌且缺乏合适的治疗措施,对于患者保持良好情绪是极为不利的。尽管现在并不认为白癜风斑片含有黑素细胞(色素产生细胞),但白癜风皮肤的毛囊却存在着黑素细胞群。因此,激活毛囊黑素细胞就成为使白癜风皮肤恢复色素沉着的关键步骤。
将某些植物药物,通常以草药或提取物的混合物形式应用,尤其是那些用于传统中医和印度Ayurvedic医学的药物,用于白癜风的治疗已有很长的历史,而且许多小规模研究的许多病例均获得了阳性结果。例如补骨脂(Psoralea corylifolia L.)和驱虫斑鸠菊(Vernoniaanthemintica Willd.)(=Centratherum anthelminticum Kuntze)等草药就以用于这种疾病的治疗而著称。用于在现代PUVA治疗中的补骨脂素和KUVA治疗中的呋喃并色酮(khellin)就源自传统的用于白癜风治疗的植物(分别为补骨脂和Ammi visnaga)。然而这些治疗法的有效性有赖于紫外光幅射的应用,而紫外光与皮肤癌的发病有关。
黑胡椒的果实((胡椒)Piper nigrum L.)和长胡椒的果实((荜拔)Piper longum L)都是Ayurvedic和Unani(传统印度)医学系统中的重要医用草药,其中的药物通常包含多种草药。黑胡椒的广泛医学用途包括在白斑病治疗中的应用,已由Kirtikar和Basu证实(Indian Medicinal Plants,第2版,第3卷,(1935)第2128-2135页)。还提示黑胡椒可能对Vernonia antherlimintica治疗白斑病有辅助作用(Indian Medicinal Journal,第1卷,第2版,(1982)第1267-1270页)。在许多传统的草药制备中,这两种植物作为成分之一有着广泛的应用,包括胃肠道和皮肤的疾病。已将含有黑胡椒、姜和pipali的组合物用于白癜风的治疗(Ancient Science of Life,第IX卷,第4期(1990)202-206);然而,在这种口服组合物中,黑胡椒的具体治疗作用至今仍未确定。
因此,需要更进一步的能刺激黑素细胞增生的化合物和组合物,优选本发明所述的化合物和组合物,能刺激黑素细胞增生同时又无明显的不良反应。本发明满足了这种需要。
本专利发明者采用细胞培养系统对30种传统用于白癜风治疗的草药提取物进行了筛选,以测定其是否具有直接刺激黑素细胞增殖的能力,惊奇地发现胡椒果实的成分有促进黑素细胞增殖的活性。具体地说,是发现了所述胡椒碱成分能显著地刺激产生黑素细胞。
据报道胡椒碱也存在于其它胡椒种属中,即P.acutislegmum、album、argyrophylum、attenuatum、aurantiacum、betle、callosum、chaba、cubeba、guineense、hancei、khasiana、longum、macropodum、nepalense、novae hollandiae、peepuloides、retrofractum、sylvaticum。已将含有胡椒碱的药用组合物用于结核病和麻风病的治疗(EP 0650728)。这也提示胡椒碱能提高药用组合物中的其它成分的生物利用度(WO96/25939)。
本发明的第一个方面提供胡椒碱或其活性类似物或衍生物在刺激黑素细胞增殖上的应用。所述胡椒碱可单独应用,但将其与载体或赋形剂以及任选与一种或多种其它活性成分合用会更合适。也可将其以植物提取物的形式应用,比如胡椒(Piper nigrum)的提取物。
刺激黑素细胞增殖可高效地促进脱色素的皮肤恢复色素沉着,这一点将得到人们的认同。可由于诸如烧伤或其它皮肤损伤等皮肤的创伤所造成的疤痕组织、或由于诸如白癜风等皮肤病引起皮肤的脱色素。因此可将含有胡椒碱或其活性类似物或衍生物的组合物用于创伤后脱色素皮肤的色素恢复以及白癜风等疾病的治疗。
本发明的第二个方面提供胡椒碱或其活性类似物或衍生物在刺激黑素细胞的药物制备中的应用。这种药剂可以是固体粉末、糊剂、油剂或乳剂、片剂或胶囊、或溶液。可通过口服、局部用药、经静脉内或皮下(肌肉内)途径给予所述胡椒碱或其活性类似物或衍生物。优选在脱色素皮肤部位局部使用该药剂。
在本发明的第二个方面的第一个实施方案中,提供胡椒碱或其活性类似物或衍生物在治疗创伤后脱色素皮肤的色素恢复的药物的制备中的应用。术语“创伤后脱色素皮肤”应理解为发生在诸如烧伤或外伤等皮肤创伤后的愈合过程中形成的皮肤。
在本发明第二个方面的第二个优选实施方案中,提供胡椒碱或其活性类似物或衍生物在治疗白癜风的药物制备中的应用。尽管可口服给予该组合物,但优选局部给药。
本发明也提供了一种使脱色素皮肤恢复色素沉着或治疗白癜风的方法,包括对需要治疗的患者给予药学上可接受剂量的胡椒碱或其活性衍生物或类似物。
也可将刺激黑素细胞增殖用于提高或改善皮肤的自然着色,而且可将含胡椒碱或其活性类似物或衍生物的组合物用作晒黑剂(tanning agent)。加深皮肤天然颜色可用于预防皮肤疾病或美容的目的。本发明第二个方面的第三个实施方案提供了胡椒碱或其活性类似物或衍生物在提高或改善皮肤颜色的组合物的制备中的应用。
另外,本发明的第三个方面提供了用于美容性提高或增强皮肤着色的方法,包括给需要这种效果的人们给予美容有效量的胡椒碱或其活性类似物或衍生物。可通过口服或局部用药途径给予。
有一点将得到认同,即胡椒碱的某些活性类似物或衍生物此前还未被用于治疗的目的,而本发明的进一步方面提供胡椒碱的活性类似物或衍生物在刺激黑素细胞增殖中的应用。本发明同样提供了胡椒碱的活性类似物或衍生物在治疗上的应用。治疗上的应用包括恢复脱色素皮肤的色素沉着以及促进或提高皮肤的着色。
还发现胡椒碱可抑制黑素瘤细胞的增殖。还可将胡椒碱及其类似物或衍生物用于皮肤癌的治疗。本发明的第四方面提供了治疗或预防人或动物皮肤癌的方法,包括给予所述患者治疗有效量的胡椒碱或其活性类似物或衍生物。
本发明的进一步方面提供了胡椒碱或其活性类似物或衍生物在治疗皮肤癌的药物制备中的应用。
所述胡椒碱或其活性类似物或衍生物可通过口服或局部途径给予。合适的剂型可以是上述讨论的任何一种。
所述胡椒碱及其衍生物和类似物的结构如下:双键立体化学和链共轭程度的变化 结构比较
1(E,E) -胡椒碱
2(Z,Z) -佳味碱
3(Z,E) -异胡椒碱
4(E,Z) -异佳味碱
5 3,4-双氢胡椒碱-Piperanine
6 1,2,3,4-四氢胡椒碱环的间隔变化(共轭) 结构比较(均为E)
7n=1-Hepcimide
1n=2-胡椒碱
8n=3-piperettine氮原子取代基的变化 结构比较(均为E,E)
R=
1哌啶基 -胡椒碱
9氮戊环基 -Trichostachine
10异丁胺基 -Piperlonguminine
11甲氧基 -脱哌啶基甲氧基胡椒碱苯基取代基的变化 结构比较(均为E,E)
R=
1 3’,4’-亚甲基二氧基苯基 -胡椒碱
12 AsI+6’-甲氧基 -Wisanine
13 3’羟基4’甲氧基苯基 -4’-Methoxyisocumaperine
14 4’-羟苯基 -Coumaperine
15苯基 -脱亚甲基二氧基胡椒碱
16甲基 己二烯酰哌啶
天然化合物(包括胡椒碱)可从合适的植物资源中提取或用技术人员已知的方法合成(例如参见Chapman和Hall,组合化学词典(光盘版),版本1:1(1997);以及默克索引(1983),第10版,默克公司出版,Rahway,美国,1077-1078页(除化合物2和3外))。除化合物6、11、13、15和16外,其它化合物均可在胡椒和其它胡椒种属(10和12)中发现。
可用技术人员已知的方法从胡椒分离制备化合物2和3(例如参见Cleyn R De和Verzele M(1975),胡椒的成份,第七部分,胡椒碱及其同分异构体的光谱结构分析。Bulletin de la Societe ChimiqueBelgique,84,435-438)。
可用已知的方法经亚当斯催化剂对胡椒碱进行氢化反应制备化合物6(例如参见Banerji A,Bandyopadhyay D,Sarkar M等(1985),Piper retrofractum的酰胺化合物-retrofractamides的结构与合成研究。Phytochemistry,24,279-284)。
用甲醇钠对胡椒碱进行甲醇分解反应以制备化合物11。
采用类似于胡椒碱制备的方法分别以3-羟基-4-甲氧基苯甲醛和苯甲醛作为起始原料制备化合物13和15。
通过胡椒碱与E,E-己二烯酰氯反应制备化合物16。
可将所述活性化合物配制成乳膏、软石蜡或洗剂形式以局部使用。含水乳膏BP和黄色软石蜡BP含所述活性化合物的适宜浓度为0.03-0.3mg%(W/W)或等量植物提取物。通常可用溶于纯净水的含20%甘油和80%乙醇制备含0.03-0.3mg%(W/W)所述活性物质的合适的洗剂。这些局部制剂也可含有渗透促进剂,如油酸、丙二醇、乙醇、尿素、月桂二乙醇胺或氮酮(azone)、二甲基亚砜、癸甲基亚砜或吡咯烷酮衍生物。也可应用脂质体释放系统。
用于口服制剂的组合物包括含1.5-150mg活性物质或等量植物提取物的片剂或胶囊。
图表和实施例
本发明将参考以下非-限制性的实施例及其中所附的图表加以说明:图1:不同培养基组合物中的melan-a生长曲线。每个点代表6个孔
的平均值和标准差。图2:用SRB法测定的不同接种密度的melan-a生长曲线。在培养基
中加入20nM TPA,在第4天更换保留板内的培养基。每个
点代表6重复样品的均数和标准差(SD)。图3:胡椒提取物对melan-a生长的影响。细胞培养8天。在第4天
用新鲜培养基和提取物更换培养基和提取物。除细胞对照组
的样品重复数为12外,其它各点均代表6个孔的均数和标准
差。图4:胡椒提取物和TPA对melan-a细胞系增殖的影响。除细胞对照
组为12孔外,其它各点均代表6个重复孔的均数和标准差。图5:在RO-31-8220存在下,胡椒碱和TPA对melan-a细胞生长的
影响。胡椒碱和TPA处理组的孔数n=6;单独用RO-31-8220
组的孔数n=12。图6:在ET3存在下,胡椒碱和TPA对人成黑素细胞生长的影响。*
与溶媒对照组比较P<0.05(单因素方差分析后,进行Dunnett’s
t检验)。图7:在ET1存在下,胡椒碱对人黑素细胞生长的影响。*与1nM ET1
处理组比较P<0.05 (单因素方差分析后,进行Dunnett’s t检
验)。
对这些实施例进行的各种改变对于本领域技术人员是显而易见的。实施例植物样品和提取物的制备
胡椒果实(黑胡椒,胡椒科),源自印度,购自the Food Centre,70Turnpike Lane,London N8,UK;其它草药由East-West Herbs,KinghamOxon,UK或Cipla Ltd,Mumbai,India提供。
在初筛过程中,以加热板作热源将溶于蒸馏水(100ml)的所述草药干粉(10g)加热煮沸10分钟。用滤纸(Whatman)真空滤除植物材料,并将该过滤物冷冻干燥。细胞培养实验微量培养板培养和sulforhodamine B测定法
小鼠melan-a细胞系(传代数18-24)是第一种已知的非致瘤性的有色素沉着的小鼠黑素细胞系,将该系细胞保持于用RPMI 1640(ICN,Costa,Mesa,CA,USA)作为基础培养基的培瓶(Costar,Cambridge,MA,USA)内。在微量培养板细胞增殖测定中,将亚融合的melan-a培养物用胰蛋白酶消化(0.25%胰酶37℃,5-10分钟)并用多头加样器(Finn pipette,Labsystems,Finland)将其接种在96孔微量滴定板(Costar,Cambridge,MA,USA)内。将该板置于37℃、10%CO2、90%湿润空气的环境中按指定时间长度孵育。孵育完毕后,用SRB法测定。简要地说,在生长培养基中加入终浓度为20%(W/V)的冷三氯醋酸(TCA,4℃,Aldrich,Dorset,UK)以固定粘附于所述板底的细胞。将该板置于4℃1小时后,用自来水轻柔洗涤5次。可用风干或用电吹风帮助加速干躁过程。然后在每孔中加入50μl溶于1%乙酸(用水配制)的4%(W/V)SRB溶液,放置30分钟。染色结束后,用1%乙酸洗涤4次去除未结合的SRB。将该板再次风干,并在每孔内加入150μl 10mM Tris碱(Sigma-Aldrich Co.Ltd,Irvine,UK)水溶液以溶解与细胞结合的染料。将该板在旋转振荡器上振摇15分钟后,在微板分光光度计(microplate spectrophotomer,Anthos LabtecHT3,version 1.06)上读取550nm处的光密度(OD)值。
实施例1培养条件的优化—FBS浓度和细胞接种密度
在测试植物提取物之前,先建立优化的培养条件。有关培养条件的变化因素包括胎牛血清(FBS)浓度、细胞的起始接种密度和培养时间。为确定FBS的最佳浓度,用1%、2%和5%FBS培养该melan-a细胞系,均用SRB法测定每种FBS浓度的细胞生长情况。为测定最佳的细胞接种密度,将0.15~1.2×104细胞/孔的系列melan-a细胞的起始接种密度接种在96孔板中,该板中含有5%FBS和20 nM十四烷酰乙酸佛波醇酯(TPA)的生长培养基。用SRB法隔日测定该细胞的生长情况。培养时间延长为8天,在第4天,更换平板内的培养基。结果FBS浓度对melan-a生长的影响
对于阴性实验对照的所述最佳条件是保持细胞既不生长过快也不急剧减少。快速生长会掩盖所述草药提取物引起的细微刺激效果,而细胞数急剧减少说明培养条件不适宜于细胞生长,这将对细胞造成损害。图1显示了melan-a细胞系在三种不同浓度的FBS时的生长曲线。添加1%和2%FBS的培养基均不能维持细胞的存活;细胞数在第4天显著下降。而经4天观察,5%的FBS能保持melan-a细胞系存活并且细胞数有少量增加。在5%FBS存在时,TPA(20nM)能引起细胞进一步增殖,说明细胞在5%FBS时能够对丝裂原刺激作出反应。显微镜下的形态学观察揭示在含1%和2%FBS的培养基中细胞体呈圆形,有轻微色素沉着,很少有树突形成,而且该培养物表现出衰老的生长特征。而在5%FBS时,细胞有较多的黑素小体并有一些短树突出现,并且没有细胞衰老的表现。因而在草药的整个筛选实验过程中选用5%FBS。不同接种密度的melan-a细胞系的生长曲线
图2是对不同起始细胞数培养8天所作的生长曲线,阐明了在5%FBS和20nM TPA存在下,melan-a细胞系在96孔板中的生长情况。确定了最佳的起始接种密度和合适的收集时间。在加有TPA和5%FBS的培养基存在时,所有起始接种密度的细胞均呈增殖状态,尽管高接种密度(1.2×104细胞/孔)在培养第3天会耗竭所述生长培养基,并且细胞停止生长直至更换培养基后才可恢复增长。低接种密度(2~4×103细胞/孔)经8天培养后,用SRB法读取的OD值保持在相对较低水平。起始接种密度为6×103细胞/孔时呈指数增长,在培养4天后,其读取的OD值升至约0.4。由于较高的OD值其精确度和准确度更高,因此,确定6×103细胞/孔的起始接种密度为草药筛选实验的最佳密度。为简化实验,将收集时间定为第4天,因为在此阶段所述细胞尚未融合,而4天后,生长培养基趋于耗竭,对于进一步的生长必须更换培养基。
实施例2草药的初筛实验
将melan-a细胞以6×103个/100μl/孔的浓度接种在含0nM TPA和5%FBS的标准培养基中。培养4小时后,每孔加入用生长培养基配制并过滤灭菌(孔径0.2μm)的不同浓度的草药提取物。植物提取物的终浓度为0(阴性对照)、10、100和1000μg(提取物干重)/ml,每种浓度设6个复孔。所述阴性对照(12个孔)、阳性对照(20nMTPA,6个孔)和测试孔均在同一块96孔板上。将该细胞培养4天后结束,并按上述方法进行SRB法测定。结果30种草药提取物对melan-a细胞增殖系的影响
表1显示了30种草药提取物水溶液对melan-a细胞系增殖的初筛结果。观察到黄芪膜荚黄芪(Astragalus membranaceous(Fisch)Bunge)、未成熟的桔(Citrus reticulata Blanco)、白鲜(Dictamnusdasycarpus Turcz)、Ophiopogon japomcus(Thunb.)Kergawe、胡椒、茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)和刺蒺藜((Tribulus)terestris L.)的粗提物可刺激黑素细胞的增殖,有时甚至在最低浓度10μg/ml的水平也有效。其它提取物不是无明显的效果,就是有细胞毒性。在这些阳性反应中,以0.01和0.1mg/ml的胡椒提取物的效果最为突出。这两种浓度的胡椒提取物不仅显著地促进细胞生长,而且这种提取物还改变了细胞的形态。有胡椒提取物存在时,细胞体积变小,出现更多和更长的双极性的或多树突状的变化,这与TPA组观察的效果相似。
实施例3重复测定胡椒提取物对melan-a细胞的作用
用新制备的胡椒果实的提取物测试其对新一批melan-a细胞系的作用,将该细胞在微量板中培养的时间延长至8天。胡椒提取物对melan-a细胞系生长的影响用SRB法测定。结果重复测定胡椒提取物对melan-a细胞的作用
根据初筛实验的阳性结果,对胡椒提取物进行了进一步的研究。图3显示将细胞培养时间延长至8天,由胡椒提取物引起显著增殖作用的结果甚至更显著,其生长为细胞对照组的272%。显微镜观察该细胞的形态学变化与初筛实验的结果一致。实施例4通过血球计数器计数证实胡椒的促进增殖作用
将melan-a细胞以2×104细胞/ml的接种密度接种在培养皿(φ35mm,Nunclon,Denmark)内,胡椒提取物浓度为0.01和0.1mg/ml。同样设立培养基中仅有细胞的阴性对照组和TPA(20nM)阳性对照组。4天后收集各培养皿的细胞并用血球计数器计数该细胞。结果通过血球计数器计数证实胡椒的促进增殖作用
SRB测定法是通过蛋白质染色和分光光度测定间接估算细胞数。为确定胡椒提取物是否刺激melan-a细胞增殖,采用血球计数器方法直接计数细胞。表2显示了在胡椒提取物和20nM TPA存在时的细胞数。与对照组比较,在0.01和0.1mg/ml的胡椒提取物的影响下细胞数明显升高,但比20nM TPA的作用弱。这一结果与96孔微量板SRB法发现的结果是相符的。
实施例5胡椒碱对melan-a细胞系生长的影响
将胡椒碱(Sigma-Aldrich Co.Ltd,Irvine,UK)溶于甲醇,通过滤膜(孔径0.2μm)过滤灭菌并用标准生长培养基稀释。培养物的终浓度为0.1和1μM。另有单独的实验(未附数据)表明用于这些实验中的甲醇的浓度对细胞没有毒性作用或促增殖作用。结果胡椒碱对melan-a细胞系增殖的影响
这种化合物对melan-a细胞系的作用如图4所示。测试的两种浓度的胡椒碱均可显著刺激melan-a细胞增殖。这种化合物引起melan-a细胞的形态学改变,细胞体积变小,细胞树突增多和变长,与胡椒提取物和TPA引起的改变相似。说明胡椒碱是用胡椒观察到的促进增殖作用的活性成份。
实施例6用不同类型的细胞测定胡椒碱作用的特异性
为确定胡椒碱的特异性,本实验选用了一组不同细胞类型进行研究。这些细胞包括melan-a、melan-c、SVK14、CSM、XB2、SC1、B16F10、IM9、CACO2、Swiss 3T3细胞系和正常人淋巴细胞。将TPA(20nM)也同样用于这些细胞的测试。表3显示这些细胞的生物学来源和细胞培养方法的要点。结果胡椒碱和TPA对一组细胞类型的生长的影响
从表4可看出,胡椒碱对于一组细胞类型的生长的影响具有高度选择性。因其在本实验浓度下,仅刺激小鼠黑素细胞(melan-a、melan-c)、人成黑素细胞(FM21E)、人胎儿黑素细胞(FM21E)和小鼠成纤维细胞系SC1。SC1细胞可能对TPA尤为敏感,因为其产生来源,即SC1培养于TPA存在的条件下。然而,胡椒碱对其它细胞无效或有细胞毒性作用。此结果暗示胡椒碱对培养的黑素细胞的增殖作用可能具有所期望的特异性指数,而不是普通的促细胞分裂原。在我们的实验体系中,TPA作为一种熟知的PKC激动剂和促瘤因子,对所有细胞类型的作用与胡椒碱均是相似的,例外的是TPA对人淋巴细胞和3T3成纤维细胞的增殖具有显著刺激作用,显然胡椒碱缺乏这种作用。胡椒碱的刺激作用似乎弱于TPA。
实施例7作用方式:RO-31-8220与胡椒碱和TPA对melan-a细胞生长的影响
将melan-a细胞系分别与1μM胡椒碱和20nM TPA培养于设好的96孔板中,用微量注射器在各孔内加入1μl用DMSO配制的不同浓度的RO-31-8220(Calbiochem-Novabiochem),使RO-31-8220的终浓度为0(对照)、0.1、1、5、10、100nM,而DMSO的终浓度小于0.01%(V/V),其中另有实验表明所述DMSO对细胞既无毒性也无促增殖作用(未附数据)。每种浓度组设6个复孔。将该细胞培养4天后,用SRB法测定melan-a细胞的生长情况。结果作用方式:RO-31-8220与胡椒碱和TPA对melan-a细胞生长的影响
图5显示了在有或无胡椒碱和TPA存在时,RO-31-8220对melan-a细胞系的存活和生长的影响。RO-31-8220本身即使在浓度达100nM时对细胞也无明显的细胞毒性作用。然而,浓度为0.1-100nM的RO-31-8220的存在可有效地抑制胡椒碱和TPA对melan-a细胞的增殖作用(如Y轴数值所示)。因此表明胡椒碱和TPA都是通过激活细胞PKC信号通路而发挥其增殖效应的。
也进行了胡椒碱对一组细胞类型的生长的作用选择性的测试。发现胡椒碱对黑素细胞具有较高的特异性和选择性,因为它显刺激培养的melan-a、melan-c和FM21E成黑素细胞以及FM21E黑素细胞的生长,而对其它所有细胞(除外一种对TPA敏感的成纤维细胞系)均无刺激作用。据观察,胡椒碱对与melan-a细胞同源的B16小鼠黑素瘤细胞系有抑制作用。因此,胡椒碱可能成为白斑皮肤的特异性促黑素细胞增殖的刺激剂,而没有刺激黑素瘤细胞的危险。
实施例9培养的人成黑素细胞实验
本实验培养的人成黑素细胞来源于人胎儿皮肤。将亚融合的成黑素细胞保持于含10%FBS、10ng/ml干细胞因子(SCF)和1nM内皮素-3的MCDB153培养基中进行传代培养,并以6×103细胞/100μl/孔接种在96孔微量板中。在37℃、10%CO2的湿润空气中孵育3~4小时使细胞粘附于该板后,在各孔内加入溶于甲醇和水的胡椒碱。胡椒碱的终浓度为1、5、10、100μM,以TPA(20nM)作为阳性对照。每个处理组设6个复孔,溶媒对照为12个孔。细胞孵育5天后,用冷三氯醋酸(TCA,4℃,终浓度为20%(V/V))固定收集该细胞,并用SRB法测定细胞数。采用单因素方差分析和Dunnett’s t-检验检验处理组和溶媒对照组之间的显著性差异。在胡椒碱和TPA存在下的细胞生长率以不含胡椒碱或TPA的培养对照组的百分数(%)表示。用3个不同供体的成黑素细胞重复进行本实验。结果
图6显示胡椒碱对人成黑素细胞体外生长的影响。发现终浓度为1、10、100μM的胡椒碱可以剂量依赖性方式显著刺激人成黑素细胞。与溶媒对照比较,当将所述培养物置于100μM的胡椒碱中培养培养5天时,细胞数升高了34%。作为熟知的黑素细胞生长刺激剂,TPA在受试浓度能引起显著的细胞生长,当将所述培养物置于20nM TPA中培养5天时,细胞数提高了50%以上。在其它的重复实验中,观察到浓度范围为5~100μM的胡椒碱可一致引起显著的细胞生长;这些刺激作用一般较TPA弱。形态学观察发现,在胡椒碱存在下成黑素细胞表现为有更多的树突,并且所述细胞体变平、变小。
实施例10培养的人黑素细胞实验
本实验所用的人黑素细胞是从人胎儿成黑素细胞诱导分化而来。人黑素细胞有别于其前体成黑素细胞的主要特征在于它们具有合成黑色素的能力。黑色素是黑素细胞的有效标志。人黑素细胞的细胞小体(cell pellet)表现出特征性的由棕色至黑色的颜色,而人成黑素细胞不能产生黑色素,因而细胞小体缺乏棕色或黑色的颜色。
本实验对培养的人黑素细胞采用了两种实验方案。第一种用24孔板,并以SRB法测定细胞数。第二种用培养皿,并采用血球计数器计数细胞数。
在第一种方案中,将保持在φ100mm培养皿的亚融合的人黑素细胞转入两块24孔板(Falcon)中,用含FBS(10%)、bFGF(100pM)、CT(1nM)和内皮素-1(1nM)的RPMI1640基础培养基传代培养。所述起始接种密度为20,000细胞/cm2(38,200细胞/孔),每孔含1000μl培养基。在37℃、10%CO2的湿润空气下孵育2~3小时,使该细胞粘附于板壁后,在各孔内加入溶于500μl培养基胡椒碱,其终浓度分别为0、1、5、10和100μM。同样将培养于仅含上述添加剂而缺乏内皮素-1的培养基中的细胞设为阴性对照。每个处理组设6个复孔。将该细胞培养5天后,用冷TCA(终浓度为20%)固定收集细胞,并用SRB法测定细胞数。将溶解的SRB染料溶液加入96孔板进行光密度测定。
在第二种方案中,将亚融合的人黑素细胞在φ60mm培养皿(28cm2,Falcon)中,用含FBS(10%)、CT(1nM)、bFGF(100pM)和内皮素-1(1nM)的RPMil640基础培养基传代培养。所述起始接种密度为10,000细胞/cm2,每个平皿含5ml培养基。将细胞置于37℃、10%CO2的湿润空气下孵育2~3小时后,在平皿内加入胡椒碱溶液,使其终浓度分别为0、1、5、10和100μM。将培养于仅含上述添加剂而缺乏内皮素-1的培养基中的细胞设为阴性对照。每个处理组的样品用3个平皿,培养5天后,用胰蛋白酶消化收集细胞,并用血球计数器计数。在黑色素生成实验中,将所述收集的细胞离心沉淀。在小心去除培养液后,用NaOH(1M)溶解沉积的细胞,并在Perkin-Elmer紫外分光光度计(型号:UV/VIS Lambda 2)上读取475nm处的光密度值。用相当于合成黑色素的校正曲线的回归方程y=0.005+0.005x计算黑色素含量。结果
图7示意胡椒碱对培养在24孔板的人黑素细胞生长的影响。浓度为5和10μM的胡椒碱显著刺激这些色素沉着细胞的生长,当该细胞在10μM的胡椒碱作用5天后,细胞数升高了36%。然而,100μM的胡椒碱则对这些细胞的生长产生抑制作用。另外,在我们的培养体系中,有1nM内皮素-1存在时,20nM TPA并不能刺激细胞的生长,这一结果与观察到的人成黑素细胞的结果有很大的区别。
表5显示了胡椒碱对培养在培养皿的人黑素细胞生长的影响。显然,在1nM ET1存在下,浓度为5和10μM的胡椒碱显著地刺激人黑素细胞的生长,当将这种黑素细胞型置于5μM胡椒碱中作用5天后,细胞数比ET1(1nM)对照组的细胞数高2倍多。此结果与从24孔板实验获得的结果是一致的,并进一步证实了SRB法测定发现的刺激作用确实是由于细胞数量的增多,而不是单纯由于蛋白质合成增加所致。表格表1. 30种草药水提物对melan-a细胞增殖影响的初筛实验结果(细胞培养4天,SRB法测定)
以以下不同浓度提取液培养4天的草药名称 取材部位 细胞数(相对于对照的%):
1mg·ml-1 0.1mg·ml-1 0.01mg·ml-1有显著刺激作用的植物黄芪膜荚黄芪 根 163.2* 123.6* 105.6桔(青皮-未成熟) 皮 16.0 138.5* 127.6*白鲜 根皮 105.0 159.4* 98.0Ophiopogon japomcus(Thunb.)Kergawe 根 127.8* 126.5* 108.4胡椒 果实 11.5 215.4* 151.3*茯苓 菌核 79.0 134.6* 128.8*刺蒺藜 果实 80.7 136.1* 142.2*无显著刺激作用的植物Angelica dahurica(Fisch)Benth. & Hook. 根 50.4 118.3 107.0贴梗木瓜 果实 57.1 74.5 99.0桔(陈皮-成熟) 皮 34.6 101.1 81.1Corydais bulbosa D.C. 根 91.8 101.2 92.9姜黄 根 84.1 104.8 108.3香附子 根茎 27.5 52.8 55.8山茱萸 果实 30.4 92.1 101.6龙胆 根 42.2 107.4 108.6女贞 果实 97.6 58.1 98.4紫草 根 43.8 103.8 111.3羌活 根/根茎 18.1 97.4 94.8芍药 根 31.8 62.2 100.7牡丹 根 53.2 72.0 132.8Picrorhiza kurroa Royle ex.Benth 根茎 42.5 77.5 90.0桔梗 根 35.1 94.1 96.8白雪花 根 30.2 103.9 114.1远志 根 12.7 43.7 79.6Ramulusmari(昆虫) 全虫 41.1 87.1 89.4Siesgesbeckia pubescens Makino 全草 17.0 40.8 51.7Spirodela polyrrhiza(L.)Scheid 全草 100 79.3 96.6Trichosanthes kirilowii Maxim 根 112.9 108.1 116.1Tripterygium wilfordii Hook. 根 89.8 36.7 63.3Zingibero fficinale Roscoe 根茎 7.9 105.8 90.6*与溶媒对照组比较P<0.01(单因素方差分析后,进行Dunnett’s检验)表2.胡椒提取物对melan-a细胞增殖影响(血球计法测定)
对细胞的处理 细胞数(×104/ml)
对照 2.02
20nM TPA 5.0*
0.01mG/ml胡椒提取物 3.06*
0.1mg/ml胡椒提取物 3.13* *与溶媒处理组比较P<0.01(单因素方差分析后,进行Dunnett’s检验)表3.选择性实验中不同类型细胞的生物来源和培养条件细胞名称 生物来源 最适培养条件
FBS 培养基 培养Melan-a 近亲交配的C57BL小鼠胚胎的正常 5% RPMIl640 37℃,10%CO2
上皮成黑素细胞Melan-c 远系杂交的LAC-MF品系小鼠的白 10% RPMIl640 37℃,10%CO2
化胚胎FM21E成黑素 人胎儿表皮的成黑素细胞(细胞株21) 10% MCDBl53 37℃,10%CO2细胞FM21E黑素细 来源于人FM21E成黑素细胞的黑素 RPMI1640 37℃,10%CO2胞 细胞SVK14 人角质细胞 10% DMEM 37℃,10%CO2CSM14.1.4 大鼠中脑神经元细胞 10% DMEM 34℃,5%CO2SC1 新生小鼠皮肤的类成纤维母细胞 10% DMEM 37℃,10%CO2XB2 小鼠角质细胞 10% DMEM 37℃,10%CO2B6F10 小鼠黑素瘤 5% RPMI1640 37℃,10%CO2CACO2 人结肠癌 10% RPMI1640 37℃,10%CO2IM9 人B类淋巴母细胞 10% RPMI1640 37℃,5%CO2Swiss 3T3 小鼠成纤维细胞 10% DMEM 37℃,5%CO2人淋巴细胞 健康人血 10% DMEM 37℃,5%CO2表4.胡椒碱和TPA对各型细胞生长的影响(细胞的详细资料见表3)
细胞数(相对于对照的%)细胞类型 胡椒碱浓度(uM) TPA浓度(nM)
0.01 0.1 1 10 100 20 200Melan-a ND 130* 169* 153* ND 295* NDMelan-c 109 208* 198* 119* 137* 186* 222*FM21E ND 101 101 119* 134* 153* ND成黑素细胞FM21E ND ND 98 143* 75* 98 102人黑素细胞SVK14 97 101 92 84* 23* 71* 66*CSM14.1.4 93 94 95 89 64* 85* 76*SC1 191* 178* 175* 204* 190* 178* 199*XB2 80 90 86 90 42* 96 99B16F10 71* 64* 47* 33* 0* 35* 55*CACO2 103 99 102 81* 34* 95 90IM9 ND 101 103 69* ND ND NDSwiss 3T3 113 104 106 102 51* 185* 207*人淋巴细胞 ND 93 93 ND ND 282* ND*与溶媒对照比较P<0.05(单因素方差分析后,进行Dunnett’s检验);ND:未测定。所有数值的相对标准差均小于平均值的10%。表5.胡椒碱对培养皿培养的人黑素细胞的增殖和黑色素产生的影响
与ETl(1nM)对照比较P<0.05(单因素方差分析后,进行Dunnett’s检验)。
处理 | 培养5天后的细胞数(×104)±SD | 相对于对照的%(ETl 1nM) | 475 nm处的OD值±SD | 黑色素含量/104细胞 |
单纯细胞 | 17.71±6.16* | 49.1 | 0.026±0.0049+ | 0.23±0.001ug |
ETl(1nM) | 36.04±6.16 | 100.0 | 0.087±0.044 | 0.46±0.01ug |
ETl(1nM)+胡椒碱(1uM) | 60.83±16.78 | 168.8 | 0.134±0.014+ | 0.42±0.03ug |
ETl(1nM)+胡椒碱(5uM) | 78.96±5.63* | 219.1 | 0.137±0.0085+ | 0.334±0.01ug |
ETl(1nM)+胡椒碱(10uM) | 64.79±13.47* | 179.8 | 0.139±0.028+ | 0.41±0.07ug |
ETl(1nM)+胡椒碱(100uM) | 61.04±10.04 | 169.4 | 0.144±0.0046+ | 0.46±0.001ug |
Claims (20)
1.胡椒碱或其活性类似物或衍生物在刺激黑素细胞增殖中的用途。
2.胡椒碱或其活性类似物或衍生物在使脱色素皮肤恢复色素沉着的药物制备中的用途。
3.根据权利要求2的用途,其中所述脱色素皮肤指创伤后的脱色素皮肤。
4.胡椒碱或其活性类似物或衍生物在治疗白癜风药物的制备中的用途。
5.胡椒碱或其活性类似物或衍生物在提高或改善所述皮肤着色的药剂制备中的用途。
6.刺激黑素细胞增殖的胡椒碱的活性类似物或衍生物。
7.使脱色素皮肤恢复色素沉着的胡椒碱的活性类似物或衍生物。
8.治疗白癜风的胡椒碱的活性类似物或衍生物。
9.提高或改善所述皮肤着色的胡椒碱的活性类似物或衍生物。
10.根据权利要求6至9中任何一项的胡椒碱或其活性类似物或衍生物,其中所述活性类似物或衍生物存在于植物提取物中。
11.用于美容的加深皮肤颜色的方法,包含给予希望加深皮肤颜色的接受者美容学有效量的胡椒碱或其活性类似物或衍生物。
12.根据权利要求11的方法,其中所述美容性加深皮肤颜色的方法是一种促使皮肤晒呈褐色(tanning)的方法。
13.使脱色素皮肤恢复色素沉着的方法,包含给予需要所述恢复色素沉着的患者药学上有效量的胡椒碱或其活性类似物或衍生物。
14.根据权利要求13的方法,其中所述脱色素皮肤是创伤后的脱色素皮肤。
15.根据权利要求13的方法,该方法是治疗或预防白癜风的方法。
16.根据权利要求11至15的任何一种方法,其中所述胡椒碱或其活性类似物或衍生物是局部应用的。
17.根据权利要求6至10的任何一项的用途或根据权利要求11或12的任何一项的方法,其中所述胡椒碱或其活性衍生物或类似物是植物提取物的形式。
18.包含胡椒碱的活性类似物或衍生物与药学上可接受的载体的药用组合物。
19.治疗或预防人或非人类患者皮肤癌的方法,包含给予所述患者有效治疗量的胡椒碱或其活性类似物或衍生物。
20.胡椒碱或其活性类似物或衍生物在治疗皮肤癌的药物制备中的用途。
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