ES2207252T3 - Uso de piperina y sus derivados para tratar trastornos de pigmentacion de la piel y cancer de piel. - Google Patents
Uso de piperina y sus derivados para tratar trastornos de pigmentacion de la piel y cancer de piel.Info
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Abstract
Uso en la preparación de un medicamento para estimular la proliferación de melanocitos de un compuesto de fórmula (I) en la que (a) n es 0, 1 ó 2, m es 2, los dos R1 juntos representan un grupo 3¿-4¿-metilendioxi, R2 y R3, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n es 1 ó 2, R4 y R5, junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un doble enlace carbono-carbono y R6 es piperidino, o (b) n es 1 e (i) m es 3, dos R1 juntos representan 3¿-4¿-metilendioxi y el otro 6¿- metoxi; o (ii) m es 2, siendo los R1 3¿-hidroxi-4¿- metoxi; o (iii) m es 1 y el R1 es 4¿-hidroxi; y R2 a R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; o (c) n es 1, R6 es pirrolidino, isobutilamino o metoxi y los otros símbolos son como se ha definido en el caso (a) anteriormente, o (d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y o R2 y R3 también lo son o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los que están unidos, forman un dobleenlace carbono-carbono; y m, R1 y R6 son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; y en el caso (a), cuando n es 1, la molécula está en la configuración geométrica E, E, Z, Z, Z, E o E, Z, pero en caso contrario la molécula está en la configuración geométrica E, E o todos E.
Description
Uso de piperina y sus derivados para tratar
trastornos de pigmentación de la piel y cáncer de piel.
La presente invención trata de medios para el
tratamiento de trastornos de la piel y más particularmente de los
trastornos que requieren la estimulación de la proliferación de los
melanocitos. La invención es de aplicación especial en el
tratamiento del vitíligo.
El vitíligo es un frecuente trastorno de la
pigmentación de la piel que se caracteriza por el desarrollo de
lesiones parcheadas despigmentadas. Los tratamientos actuales, que
incluyen el uso de fotosensibilizadores (por ejemplo, psoralenos)
con radiación UVA (PUVA), corticoesteroides o injertos de piel,
tienen tasas de éxito muy bajas y generalmente se acompañan de
efectos secundarios desagradables. El vitíligo tiene un elevado
impacto perjudicial sobre el bienestar emocional del enfermo,
agravándose los efectos desfigurantes de la enfermedad por la
ausencia de un tratamiento adecuado. Aunque no se cree que los
parches producidos por el vitíligo contengan melanocitos (células
productoras de pigmento), existe un reservorio en los folículos
pilosos en la piel con vitíligo. Por tanto, la activación de los
melanocitos de los folículos pilosos es un procedimiento crucial en
la repigmentación de la piel con vitíligo.
Durante mucho tiempo se han empleado ciertos
remedios vegetales, por lo general administrados en forma de
mezclas de hierbas o extractos, particularmente aquéllas usadas en
la medicina tradicional china y en la medicina ayurvédica india,
para tratar el vitíligo y en muchos casos en estudios realizados a
pequeña escala han dado resultados positivos. Hierbas tales como
Psoralea corylifolia L. y Vernonia anthelmintica
Willd.(=Centratherum anthelminticum Kuntze) son bien
conocidas para su uso en esta enfermedad. Los psoralenos, que se
emplean en la PUVA moderna, y las quelinas, en el tratamiento KUVA,
en un principio derivaban de fuentes vegetales (Psoralea
corylifolia L y Ammi visnaga respectivamente) usadas en
los remedios tradicionales para el vitíligo. Sin embargo, estos
tratamientos dependen del uso de radiación UVA para su eficacia, que
está asociada con la etiología del cáncer de piel.
El fruto de la pimienta negra (Piper nigrum
L.) y la pimienta larga (Piper longum L.) son hierbas
medicinales importantes en los sistemas de medicina Ayurvédica y
Unani (tradicional india), en los que los remedios generalmente
consisten en mezclas de hierbas. Kirtikar y Basu (Indian Medicinal
Plants, 2ª Edición, Vol.3, (1935), páginas
2128-2135) han informado acerca de un amplio abanico
de usos medicinales de la pimienta negra, incluyendo su uso en el
tratamiento de la leucodermia. También se ha implicado a la
pimienta negra como un posible adyuvante de la Vermonia
anthelmintica en el tratamiento de la leucodermia (Indian
Medicinal journal, Vol.1, 3ª Edición, (1982),
1267-1270). Estas dos hierbas se usan como
constituyentes de muchas de las preparaciones de hierbas
tradicionales para una gran variedad de usos, incluyendo molestias
gastrointestinales y cutáneas. En el tratamiento del vitíligo se han
usado composiciones que comprenden pimienta negra, jengibre y
pimienta larga (Ancient Science of Life, Vol.IX, Nº 4 (1990)
202-206; sin embargo, no se ha establecido la acción
terapéutica específica de la pimienta negra en esta composición de
administración oral.
Por tanto, hay una necesidad de más compuestos y
composiciones que sean capaces de estimular la proliferación de
melanocitos. Preferiblemente, los compuestos y composiciones de la
invención son capaces de estimular la proliferación de melanocitos
sin producir significativos efectos secundarios adversos. La
presente invención está dirigida hacia esa necesidad.
Los presente inventores han investigado 30
extractos de hierbas que tradicionalmente se han usado en el
tratamiento del vitíligo, usando un sistema de cultivo celular para
evaluar si tienen la capacidad para estimular de forma directa la
proliferación de melanocitos. Sorprendentemente se ha encontrado que
componentes del fruto de Piper nigrum L. poseen actividad
proliferante de melanocitos. En particular, se ha encontrado que el
componente piperina puede estimular de forma significativa la
producción de melanocitos.
También se ha notificado que la piperina se
produce en otras especies de Piper, es decir P. acutisleginum,
album, argyrophylum, attenuatum, aurantiacum, betle, callosum,
chaba, cubeba, guineense, hancei, khasiana, longum, macropodum,
nepalense, novae hollandiae, peepuloides, retrofractum,
sylvaticum. En el tratamiento de la tuberculosis y la lepra
(documento EP 0650728) se han usado composiciones farmacéuticas que
contienen piperina. También se ha sugerido que la piperina puede
estimular la biodisponibilidad de los otros constituyentes de una
composición farmacéutica (documento WO 96/25939).
Un primer aspecto de la invención proporciona el
uso en la preparación de un medicamento para estimular la
proliferación de melanocitos de un compuesto de fórmula (I)
en la
que
(a) n es 0, 1 ó 2, m es 2, los dos R^{1} juntos
representan un grupo
3'-4'-metilendioxi, R^{2} y
R^{3} junto con los átomos de carbono a los que están unidos
forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n
es 1 ó 2, R^{4} y R^{5}, junto con los átomos de carbono a los
que están unidos, forman un doble enlace
carbono-carbono y R^{6} es piperidino, o
(b) n es 1 e (i) m es 3, los dos R^{1} juntos
representan 3'-4'-metilendioxi y el
otro 6'-metoxi; o (ii) m es 2, siendo el R^{1}
3'-hidroxi-4'-metoxi;
o (iii) m es 1 y el R^{1} es 4'-hidroxi; y
R^{2} a R^{6} son como se ha definido en el caso (a)
anteriormente;o
(c) n es 1, R^{6} es pirrolidino, isobutilamino
o metoxi y los otros símbolos son como se ha definido en el caso
(a) anteriormente, o
(d) n es 1, R^{4}y R^{5} representan átomos
de hidrógeno y o R^{2} y R^{3} también lo son o R^{2} y
R^{3} junto con los átomos de carbono a los que están unidos,
forman un doble enlace carbono-carbono; y m,
R^{1}y R^{6} son como se ha definido en el caso (a)
anteriormente;
y en el caso (a), cuando n es 1, la molécula está
en la configuración geométrica E,E, Z,Z, Z,E o E,Z, pero en caso
contrario la molécula está en la configuración geométrica E,E o
todos E. El compuesto de fórmula (I) puede usarse en forma aislada,
pero se usa de forma más adecuada en combinación con un vehículo o
excipiente y, opcionalmente, con uno o más ingredientes activos.
Cuando sea adecuado, el compuesto también puede usarse en forma de
un extracto vegetal, por ejemplo que derive de Piper
nigrum.
Debe apreciarse que la estimulación de la
proliferación de melanocitos facilita en gran medida la
repigmentación de la piel despigmentada. La despigmentación de la
piel puede producirse, por ejemplo, a partir de tejido cicatricial
formado como resultado de un traumatismo cutáneo tales como
quemaduras u otras lesiones cutáneas, o puede deberse a trastornos
de la piel como el vitíligo. Las composiciones que comprenden
piperina o un análogo activo o derivados de la misma pueden por
tanto usarse para volver a pigmentar la piel tras un traumatismo o
una despigmentación, así como por trastornos tal como vitíligo.
El medicamento puede estar en forma de un polvo
sólido; una pasta, pomada o crema; un comprimido o cápsula; o una
solución. La piperina o un derivado o un análogo de la misma puede
administrase por vía oral, tópica, intravenosa o subcutánea
(intramuscular). Se prefiere que el medicamento se aplique
tópicamente en la zona de la piel despigmentada. También se
incluyen en el alcance de la invención composiciones farmacéuticas
usadas como medicamentos. Tales composiciones farmacéuticas
comprenden un compuesto de fórmula (Ia) y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de fórmula (Ia) son los
mismos que aquéllos de fórmula (I) pero excluyen piperina y sus
estereoisómeros Z, Z, Z, E y E, Z.
En una primera forma de realización de la
invención se proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) en
la preparación de un medicamento para volver a pigmentar la piel
despigmentada a causa de un traumatismo. Por el término "piel
despigmentada tras un traumatismo" se debe entender la piel
formada durante el proceso de cicatrización que se produce después
de un traumatismo de la piel, tal como una quemadura o una
lesión.
En una segunda forma preferida de realización de
la invención se proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I)
en la preparación de un medicamento para el tratamiento del
vitíligo. Aunque las composiciones pueden administrarse por vía
oral, se prefiere la administración tópica.
La estimulación de la proliferación de
melanocitos puede también usarse para aumentar o inducir la
coloración natural de la piel y composiciones que comprendan un
compuesto de fórmula I pueden usarse como agentes de pigmentación.
La potenciación del color natural de la piel puede usarse con
propósitos profilácticos o estéticos.
Además otro aspecto de la invención proporciona
un procedimiento para aumentar o inducir estéticamente la
coloración de la piel mediante la administración a una persona que
desee tal efecto una cantidad estéticamente eficaz de un compuesto
de fórmula (I). La administración puede ser por vía oral o
tópica.
Debe apreciarse que aquí, los compuestos de
fórmula (Ia) no se han usado con propósitos terapéuticos y otro
aspecto de la invención proporciona un compuesto de fórmula (Ia)
para usar en la estimulación de la proliferación de melanocitos.
Asimismo, la invención proporciona un compuesto de fórmula (Ia) para
usar en tratamiento. Entre los usos terapéuticos se incluyen la
repigmentación de la piel despigmentada así como la inducción o
aumento de la coloración de la piel.
También se ha descubierto que la piperina inhibe
la proliferación de células de melanoma. El compuesto de fórmula
(I) puede también usarse en el tratamiento del cáncer de piel. Otro
aspecto de la invención proporciona el uso de un compuesto de
fórmula (I) en la preparación de un medicamento para tratar o
prevenir el cáncer de piel en un paciente humano o no humano. El
tratamiento puede ejercer su efecto a través de la administración a
dicho paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto de fórmula (I).
\newpage
Otro aspecto de la invención proporciona el uso
de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento
para el tratamiento del cáncer de piel.
El compuesto de fórmula (I) puede administrarse
por vía oral o tópica. Las formas de dosificación adecuadas pueden
ser cualquiera de las comentadas anteriormente en la presente
invención.
La estructura de los compuestos que entran dentro
de la definición del compuesto de fórmula (I) se proporciona a
continuación
Los compuestos 15 y 16 no entran dentro del
alcance de la fórmula (I).
Los compuestos naturales (incluyendo la piperina)
pueden extraerse de fuentes vegetales adecuadas o sintetizarse
usando procedimientos conocidos para un experto (véase, por
ejemplo, Chapman y Hall, Combined Chemical Dictionary en
CD-rom, 1:1 (1997) y el Índice Merck (1983), 10ª
edición, Publ. Merck y Co., Rahway, EE.UU., págs.
1477-1078 (a excepción de los compuestos 2 y 3).
Todos los compuestos excepto el 6, el 11, el 13, el 15 y el 16 se
producen en P. nigrum o en otras especies de Piper
(10 y 12).
\newpage
Los compuestos 2 y 3 se preparan mediante
aislamiento de P. nigrum usando procedimientos conocidos
para un experto (véase por ejemplo Cleyn R De y Verzele M (1975).
Constituents of Peppers, parte VII. Spectroscopic Structure
Elucidation of Piperina and its isomers. Bulletin de la Societe
Chimique Belgique.84 435-438)
El compuesto 6 se prepara mediante hidrogenación
de la piperina sobre el catalizador Adams usando procedimientos
conocidos (véase por ejemplo Banerji A, Bandyopadhyay D, Sarkar M y
col., (1985). Structural and Synthetic studies on the
refractamides-amide constituents of Piper
retrofactum, Phytochemistry, 24, 279-284).
El compuesto 11 se prepara mediante metanólisis
de piperina usando metóxido sódico.
Los compuestos 13 y 15 se preparan a partir de
3-hidroxi-4-metoxibenzaldehído
y benzaldehído respectivamente como materiales de partida, usando
procedimientos análogos a los usados para la preparación de
piperina.
El compuesto 16 se prepara a partir de la
reacción entre piperidina y cloruro de
E,E-hexadienoilo.
Los compuestos activos pueden formularse para su
uso tópico en forma de cremas, parafina blanda o lociones. La crema
BP acuosa o la parafina blanda amarilla BP pueden contener
adecuadamente el material activo a 0,03-3,0 mg % en
p/p o una cantidad equivalente de extracto vegetal. Una loción
adecuada se prepara típicamente a partir de glicerol al 20% y
etanol 1l 80% en agua purificada y contiene 0,03-3,0
mg % en p/p del material activo. Estas formulaciones tópicas pueden
también contener estimuladores de la penetración, tales como ácido
oleico, propilenglicol, etanol, urea, dietanolamida láurica o
azona, dimetil sulfóxido decimetil sulfóxido o derivados de
pirrolidona. También se pueden usar sistemas de liberación mediante
liposomas.
Entre las composiciones para la formulación oral
se incluyen comprimidos o cápsulas que contienen
1,5-150 mg de material activo o una cantidad
equivalente de extracto vegetal.
Ahora se describirá la invención en referencia a
los siguientes ejemplos no limitantes, en referencia a las tablas y
figuras que los acompañan en las cuales:
Figura 1: Curvas de crecimiento de
melan-a en medios de diferente composición. Cada
punto representa la media y la desviación estándar de 6
pocillos.
Figura 2: Curvas de crecimiento de
melan-a de diferentes densidades iniciales de
cultivo en placas detectado con ensayo SRB. El medio se complementó
con TPA 20 nM. El medio de las placas restantes de reemplazó al
cuarto día. Cada punto muestra la media y la DE de 6 muestras
repetidas.
Figura 3: Efecto de extracto de P. nigrum
sobre el crecimiento de células de melan-a. El
cultivo se mantuvo durante 8 días. El medio y el extracto se
reemplazaron con medio y extracto frescos al cuarto día. Cada punto
designa la media y la DE de 6 pocillos, a excepción de 12 muestras
repetidas sólo para células.
Figura 4: Efecto de extracto de P. nigrum
y TPA sobre la proliferación de la línea celular de
melan-a. Cada punto muestra la media y la DE de 6
muestras repetidas a excepción de 12 pocillos usados solo para
células.
Figura 5: Efectos de piperina y TPA sobre el
crecimiento de células melan-a en presencia de
RO-31-8220, n = 6, para los pocillos
tratados con piperina y TPA, mientras que n = 12 para
RO-31-8220 solo.
Figura 6: Efectos de piperina y TPA sobre el
crecimiento de melanoblastos humanos en presencia de ET3, *P<
0,05 cuando se compara con el control con vehículo (ANOVA de un
factor seguido por el test de Dunnett).
Figura 7: Efectos de piperina sobre el
crecimiento de melanocitos humanos en presencia de ET1, *P< 0,05
cuando se compara con el tratamiento con ET1 1 nM (ANOVA de un
factor seguido por el test de Dunnett).
Para aquellos expertos en la técnica serán
evidentes las variaciones de estos ejemplos.
El fruto de Piper nigrum L. (pimienta
negra, Piperaceae), originariamente de India, se obtuvo de
Food Centre, 70 Turnpike Lane, Londres N8, GB. El resto de las
hierbas fueron suministradas por East-West Herbs,
Kingham, Oxon, GB o por Cipla Ltd., Mumbai, India.
Para el programa de selección preliminar, se
calentó la hierba seca en polvo (10 g) hasta ebullición en agua
destilada (100 ml) y se dejó hervir durante 10 minutos usando una
placa caliente como fuente de calor. Se filtró el material vegetal
al vacío mediante papel de filtro (Whatman) y el filtrado se secó
en frío.
Células de ratón de línea celular
melan-a (pasos números 18-24), una
de las primeras líneas conocidas de melanocitos de ratón
pigmentados no tumorogénicos, se mantuvieron en un matraz usando
RPMI 1640 (ICN, Costa, Mesa, CA, EE.UU.) como medio básico. Para los
ensayos de proliferación en microplacas se añadió tripsina (0,25%
de tripsina a 37ºC durante 5-10 minutos) a los
cultivos subconfluentes de melan-a y se inocularon
con una pipeta repetidora (Finn pipette, Labsystems, Finlandia) en
placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA,
EE.UU.). Las placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera con 10% de
CO_{2} y 90% de humedad en aire durante el periodo de tiempo
programado. Al final de la incubación, se realizó un ensayo con SRB.
Brevemente, las células ligadas al fondo de la placa se fijaron
mediante adición de ácido tricloroacético frío (TCA, 4ºC, Aldrich,
Dorset, GB) en la superficie del medio de crecimiento (TCA final
20% p/v). La placa se colocó a 4ºC durante 1 hora antes de lavarla
suavemente cinco veces con agua corriente. Se la dejó secar al aire
o se usó un secador de pelo para acelerar el proceso de secado.
después a cada pocillo se añadieron 50 \mul de SRB al 4% p/v
disuelta en ácido acético y agua durante 30 minutos. Al final del
periodo de tinción, se eliminó la SRB sin unir lavando cuatro veces
con ácido acético al 1%. La placa se dejó secar al aire otra vez y
a cada pocillo se añadieron 150 \mul de base Tris acuosa 10 mM
(Sigma-Aldrich Co. Ltd, Irvine, GB) para solubilizar
la unión colorante-célula. Se procedió a agitar la
placa durante 15 minutos en un agitador giratorio y después se
procedió a la lectura de la densidad óptica (DO) a 550 nm en un
espectrofotómetro de microplacas (Anthos Labtec HT3, versión
1.06).
Antes de probar los extractos de hierbas, se
establecieron las condiciones óptimas de cultivo. Los factores
variables en relación con las condiciones de incubación incluyen la
concentración de suero bovino fetal (SBF), la densidad inicial de la
siembra de células y el periodo de incubación. Para determinar la
concentración óptima de SBF, se usó SBF al 1%, 2% y 5% para
cultivar la línea celular melan-a, el patrón de
crecimiento de cada concentración de SBF se monitorizó mediante
ensayo con SRB. Para determinar la densidad óptima de la siembra de
células, se sembraron en placas de 96 pocillos con medio de cultivo
complementado con SBF al 5% y acetato de tetradecanoilforbol (TPA)
20 nM una serie de densidad de siembra de 0,15 a 1,2 x 10^{4}
células por pocillo de células melan-a. El patrón
de crecimiento se monitorizó mediante ensayo con SRB a intervalos
diarios. El cultivo se extendió durante 8 días; al cuarto día, se
reemplazó el medio de las placas restantes.
La concentración óptima para un control del
experimento negativo es que las células no crezcan demasiado rápido
ni disminuyan forma espectacular. Un crecimiento rápido podría
enmascarar cualquier efecto estimulador sutil producido por los
extractos de hierbas, mientras que una disminución espectacular en
el número de células indica condiciones de cultivo desfavorables
para la supervivencia de las células, lo que podría conducir a daño
celular. La figura 1 muestra las curvas de crecimiento de la línea
celular melan-a a tres concentraciones de SBF
diferente. Ni el medio complementado con SBF al 1% ni con SBF al 2%
fue capaz de mantener la supervivencia de las células; el número de
células disminuyó significativamente en 4 días de cultivo. Sin
embargo, el SBF al 5% fue capaz de mantener viva la línea celular
melan-a con solo un pequeño incremento en el número
de células, observado durante 4 días. El TPA (20 nM) fue capaz de
producir más proliferación en presencia de SBF al 5%, lo que es
indicativo de que las células podían responder a estímulos
mitogénicos en presencia de SBF al 5%. Las observaciones
morfológicas con microscopio revelaron que con el medio
complementado con SBF al 1% y al 2%, los cuerpos celulares eran
redondos, ligeramente pigmentados con pocos procesos dendríticos y
el cultivo exhibió un patrón de crecimiento envejecido. Sin embargo,
en presencia de SBF al 5%, las células poseían más melanosomas y
algunas dendritas cortas sin aspecto envejecido. Por tanto, el SBF
al 5% fue la concentración usada en todos los experimentos de
selección de hierbas.
En la figura 2 se representaron curvas de
crecimiento durante 8 días con un número inicial de células
diferente, para deducir el patrón de crecimiento de la línea
celular melan-a en placas de 96 pocillos en
presencia de SBF al 5% y TPA 20 nM. Se determinaron la densidad de
células en la placa óptima inicial y el tiempo de recogida adecuado.
Todos los números iniciales de células sembradas en la placa
mostraron un crecimiento neto en presencia de medio complementado
con TPA y de SBF al 5%, aunque la densidad de las placas más
elevada de 1,2 x 10^{4} células/pocillo agotó el medio de cultivo
al tercer día del cultivo y las células pararon de crecer hasta que
se reemplazó el medio. Con las menores densidades de las placas
(2-4 x 10^{3} células/pocillo), las lecturas de DO
en el ensayo con SRB permanecieron relativamente bajas tras 8 días
de cultivo. La densidad inicial de las placas de 6 x 10^{3}
células/pocillo exhibió un crecimiento exponencial y, tras 4 días
de cultivo, la lectura de densidad óptica aumentó hasta un valor de
alrededor de 0,4. Dado que los valores de DO más elevados están
asociados con una mayor precisión y exactitud, se determinó que la
inoculación inicial de 6 x 10^{3} células/pocillo fuera la
densidad óptima para los experimentos de prueba de hierbas. Para
simplificar el experimento, el momento de recogida fue al cuarto
día, ya que las células en este estadio no eran confluentes y
después de 4 días, el medio de cultivo tendía a agotarse y era
necesario reemplazarlo para obtener más crecimiento.
Las células melan-a se sembraron
a una densidad de 6 x 10^{3}/100\mul/pocillo en medio estándar
complementado con TPA 0 nM y SBF al 5%. Tras 4 horas de incubación,
a cada pocillo se añadieron diferentes concentraciones de extractos
de hierbas, reconstituidos en medio de crecimiento y esterilizados
mediante filtración (tamaño de poro 0,2 \mum). Las
concentraciones finales del extracto vegetal fueron 0 (control
negativo), 10, 100 y 1.000 \mug de extracto seco por ml. Para
concentración probada se usaron 6 pocillos replicados. El control
negativo (12 pocillos), el control positivo (6 pocillos con TPA 20
nM) y los pocillos a probar se encontraban todos en la misma placa
de 96 pocillos. El cultivo finalizó tras 4 días y el ensayo con SRB
se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos
anteriormente.
La tabla 1 muestra los resultados de una
selección preliminar de 30 extractos de hierbas acuosos sobre la
proliferación de la línea célula melan-a. Se observó
que los extractos brutos de Astragalus membranaceous
(Fisch.) Bunge, de Citrus reticulata Blanco verde,
Dictamnus dasycarpus Turcz., Ophiopogon japonicus
(Thunb.) Kergawe, Piper nigrum L., Poria cocos (Schw)
Wolf y Tribulus terestris L. estimulaban la proliferación de
melanocitos, en ocasiones incluso a los niveles de dosis más bajos
de 10 \mug/ml. Otros extractos o bien no tuvieron efectos
significativos o bien eran citotóxicos. Entre estas respuestas
positivas, la más pronunciada era la del extracto de Piper nigrum
L. a 0,01 y 0,1 mg/ml. El extracto de Piper nigrum a
estas dos concentraciones no solo estimulo de forma sorprendente en
crecimiento celular, sino que también alteró la morfología de las
células. En presencia de extracto de Piper nigrum, los
cuerpos celulares eran más pequeños, con procesos bipolares o
polidendríticos más numerosos y más largos y efectos similares a
los observados con TPA.
Se probó un extracto de fruto de Piper
nigrum de nueva preparación sobre un lote nuevo de línea
celular melan-a, extendiendo el cultivo en
microplacas hasta 8 días. Los efectos del extracto de Piper
nigrum sobre el crecimiento de la línea celular
melan-a se evaluaron mediante ensayo con SRB.
A la luz de los resultados positivos obtenidos en
el experimento preliminar, se llevaron a cabo más investigaciones
con el extracto de Piper nigrum. La figura 3 muestra que el
resultado de la existencia de un efecto proliferante significativo
producido por el extracto de Piper nigrum fue todavía más
marcado al extender el periodo de incubación hasta 8 días de
cultivo, el crecimiento fue el 272% del control (solo células).
Microscópicamente, la morfología de las células se alteró como se
observó en los experimentos preliminares.
Las células melan-a se cultivaron
en placas de petri (\diameter de 35 mm, Nuncion, Dinamarca) con
una densidad de cultivo en placas de 2 x 10^{4}/ml con extracto
de Piper nigrum a concentraciones de 0,01 y 0,1 mg/ml. También se
prepararon un cultivo negativo (solo células en medio) y TPA
positivo (20 nM). Tras 4 días, se recogieron las células de cada
placa y se procedió a su recuento con un hemocitómetro.
El ensayo con SRB estima de forma indirecta el
número de células través de tinción de las proteínas y medidas
espectrofotométricas. Para confirmar si el extracto de Piper nigrum
estimula la proliferación de células melan-a se
empleó un recuento celular directo don un hemocitómetro. La tabla 3
muestra el número de células en presencia de extracto de Piper
nigrum y TPA 20 nM. El número de células bajo la influencia del
extracto de Piper nigrum a 0,01 y 0,1 mg/ml aumento
significativamente en comparación con el control, pero menos de lo
que lo hizo con TPA 20 nM. Este resultado es consistente con el
hallazgo en las microplacas de 96 pocillo en el ensayo con SRB.
Se disolvió Piperina
(Sigma-Aldrich Co. Ltd, Irvine, GB) en MeOH,
esterilizada mediante filtración a través de una membrana (tamaño de
poro de 0,2 \mum) y diluida con medio de crecimiento estándar.
Las concentraciones finales en el cultivo fueron de 0,1 y 1 \muM.
En otro experimento (datos no mostrados) se mostró que la
concentración de MeOH presente en estos experimentos fue atóxica o
proliferante para estas células.
El efecto de este compuesto sobre la línea
celular melan-a se muestra en la figura 4. La
piperina, a las dos concentraciones probadas, estimuló de forma
significativa la proliferación de melan-a. Este
compuesto produjo cambios morfológicos en las células
melan-a, con cuerpos celulares más pequeños, más y
más largas dendritas celulares, similares a las alteraciones
inducidas por el extracto de Piper nigrum y el TPA.
Esto indica que la piperina es un principio activo responsable del
efecto proliferante observado de Piper nigrum.
Para determinar la especificidad de la piperina
se usó una serie de diferentes tipos celulares para facilitar esta
investigación. Entre estas se incluyeron líneas celulares
melan-a, melan-c, SVK14, CSM, XB2,
SC1, B16F10, OM9, CACO2, 3T3 Suiza y linfocitos humanos normales.
También se probó TPA (20 nM) en estas células. La tabla 3 muestra
el origen biológico de las células y esboza los protocolos del
cultivo celular.
En la tabla 4 se puede observar que la piperina
tiene un efecto altamente selectivo sobre el crecimiento de una
serie de tipos celulares, ya que a la concentración probada sólo
estimula las líneas celulares melanocitos de ratón
(melan-a, melan-c), melanoblastos
humanos (FM21E), melanocitos humanos fetales (FM21E) y fibroblastos
de ratón SC1. La línea celular SC1 puede tener una particular
sensibilidad al TPA debido al modo por el que ha derivado, es decir
se ha cultivado en presencia de TPA. Sin embargo, sobre otras
células la piperina o no tiene efecto o éste es citotóxico. Este
resultado implica que la piperina puede tener un índice de
especificidad deseable para la proliferación de melanocitos en
cultivo y no es un mitógeno general. En nuestro sistema de
experimentos, el TPA, un activador de la PKC bien conocido y un
agente inductor de tumores, tenía efectos similares a la piperina
en todos los tipos celulares probados, a excepción de que el TPA
estimuló de forma llamativa la proliferación de linfocitos humanos y
de fibroblastos 3T3, mientras que la piperina obviamente carecía de
tal actividad. Parece ser que la piperina es un estimulante menos
potente que la TPA.
Modo de
acción
En una placa de 96 pocillos se colocaron células
melan-a cultivadas con piperina 1 \muM y TPA 20
nM de forma separada, en los pocillos se introdujo con una
microjeringuilla 1 \mul de diferentes concentraciones de
RO-31-8220
(Calbiochem-Novabiochem) en DMSO, para alcanzar las
concentraciones finales de
RO-31-8220 de 0 (control), 0,1, 1,
5, 10, 100 nM, con unas concentraciones finales de DMSO inferiores
a 0,01% v/v, a las que el DMSO no mostró ni efectos proliferantes ni
tóxicos en las células en un experimento distinto (datos no
mostrados). Para cada concentración se usaron 6 pocillos de
replicación. El cultivo se incubó durante 4 días antes de
interrumpirlo y procesarlo con un ensayo con SRB para evaluar el
crecimiento de células melan-a.
Modo de
acción
La figura 5 muestra el efecto de
RO-31-8220 sobre la supervivencia y
crecimiento de la línea celular melan-a en presencia
o ausencia de piperina y TPA. El
Ro-31-8220 solo no tuvo ningún
efecto citotóxico significativo en las células alas concentraciones
de hasta 100 nM. Sin embargo, los efectos proliferantes de la
piperina y del TPA (como indican los valores representados en el
eje Y) sobre las células melan-a fueron inhibidos de
forma eficaz por la presencia de
RO-31-8220 a las concentraciones de
0,1-100 nM. Por tanto, parece ser que la piperina y
el TPA ejercen sus efectos proliferantes a través de la activación
de la ruta de señalización celular de la PKC.
También se ha probado la selectividad de la
piperina sobre el crecimiento de una serie de tipos celulares. Se
ha encontrado que la piperina poseía una especificidad y
selectividad bastante elevada para los melanocitos, ya que estimuló
de forma significativa el crecimiento de células
melan-a, melan-c y melanoblastos
FM21E y melanocitos FM21E en cultivo, mientras que no estimuló las
otras células, aparte de una línea de células fibroblastos
sensibles al TPA. Se observó que la piperina tenía efectos
inhibitorios sobre la línea de células de melanoma, que es
singeneica con las células melan-a. Por tanto, ña
piperina puede ser un estimulante específico de la proliferación de
melanocitos en piel con vitíligo sin el riesgo de estimular las
células de melanoma.
Los melanoblastos humanos en cultivo de este
experimento se obtuvieron de piel humana fetal. Melanoblastos
subconfluentes mantenidos en medio MCDB 153 complementado con 10% de
SBF, 10 ng/ml de factor de las células madre (FCM) y endotelina 3 1
nM se subcultivaron e inocularon en microplacas de 96 pocillos con
6 x 10^{3} células/100 \mul/pocillo. Tras incubación en
atmósfera húmeda con un 10% de CO_{2}, a 37ºC durante
3-4 horas para permitir la fijación de las células a
la placa se añadió a los pocillos piperina disuelta en MeOH y agua.
Las concentraciones finales de piperina fueron 1, 5, 10, 100
\muM, con TPA (20 nM) como control positivo. En cada grupo de
tratamiento se usaron 6 replicados, con 12 pocillos usados para el
control con vehículo. La incubación se llevó a cabo durante 5 días
antes de recoger las células fijándolas con ácido tricloroacético
frío (TCA, a 4ºC, concentración final de 20% v/v) y evaluarlas para
determinar el número de células usando un ensayo con SRB. Para
determinar la significación de cualquier diferencia entre los grupos
de tratamiento y el control con vehículo se usaron ANOVA de un
factor y el test de Dunnett. El crecimiento en presencia de
piperina y TPA se expresó en forma de % de incubaciones control que
no contienen ni piperina ni TPA. Los experimentos se repitieron
usando melanoblastos procedentes de 3 donantes diferentes.
La figura 6 muestra el efecto de la piperina
sobre el crecimiento in vitro de melanoblastos humanos. Se
descubrió que la piperina alas concentraciones de 1, 10, 100 \muM
causaba estimulación significativa en melanoblastos humanos en
respuesta a dosis, con un rendimiento celular de 34% frente al
control con vehículo cuando el cultivo se expuso a piperina 100
\muM en cultivo durante 5 días. El TPA, un agentes estimulador
del crecimiento melanocítico bien conocido, también fue capaz de
causar crecimiento celular significativo a las concentraciones
probadas, con un rendimiento celular de más de 50% observado cuando
el cultivo se expuso a 20 nM durante 5 días. En otros experimentos
repetidos, se observó de forma constante que la piperina inducía
crecimiento celular significativo a concentraciones que oscilan
entre 5-100 \muM; generalmente estos efectos
estimuladores fueron inferiores a los del TPA. Morfológicamente, en
presencia de piperina, los melanoblastos parecían ser más
dendríticos y los cuerpos celulares fueron más planos y más
pequeños.
Los melanocitos humanos usados en este
experimento derivaban de la diferenciación inducida de
melanoblastos humanos fetales. La característica clave de los
melanocitos humanos que les diferencia de sus melanoblastos
precursores es su capacidad para sintetizar melanina. La melanina
es un marcador válido de melanocitos. El precipitado celular de
melanocitos humanos exhibe un color de marrón a negro
característico, mientras que los melanoblastos humanos no pueden
producir melanina, por tanto están desprovistos de ese color marrón
o negro en el precipitado celular.
Para los experimentos con melanocitos humanos en
cultivo se usaron dos protocolos. El primero empleaba placas de 24
pocillos y evaluó el número de células con un ensayo con SRB. El
segundo usaba placas petri y el número de células se contó con una
cámara de hemocitómetro.
En el primer protocolo, en dos placas de 24
pocillos (Falcon) se subcultivaron melanocitos humanos
subconfluentes mantenidos en una placa petri de \diameter de 100
mm usando un medio de cultivo básico de RPMI 1640 complementado con
SBF (10%), bFGF (100 pM), CT (1 nM) y endotelina 1 (1 nM). La
densidad inicial en las placas fue de 20.000 células/cm^{2}
(38.200 células/pocillo), conteniendo cada pocillo 1000 \mul de
medio. Tras la incubación en una atmósfera húmeda con un 10% de
CO_{2}, a 37ºC durante 2-3 horas para permitir la
fijación de las células, se añadió a los pocillos piperina en 500
\mul de medio para obtener las concentraciones finales de 0,1 m5,
10 y 100 \muM. Las células solo con medio con los complementos
mencionados sin endotelina 1 también se establecieron como control
negativo. En cada grupo de tratamiento se usaron seis replicados y
los cultivos se incubaron durante 5 días antes de recoger las
células fijándolas con TCA frío (concentración final 20%) y
procesándolas con ensayo con SRB. La solución con el colorante SRB
solubilizado se transfirió a una placa de 96 pocillos para la
lectura de la densidad óptica.
En el segundo protocolo, se subcultivaron
melanocitos humanos subconfluentes en placas petri de \diameter
de 60 mm (28 cm^{2}, Falcon) con medio básico RPMI 1640
complementado con SBF (10%), bFGF (100 pM), CT (1 nM) y endotelina 1
(1 nM). La densidad inicial de las placas fue de 10.000
células/cm^{2}, con 5 ml de medio por placa. Las células se
incubaron durante 2-3 horas, en atmósfera húmeda con
10% de CO_{2} a, 37ºC, seguido por la adición a las placas de
solución de piperina, obteniendo unas concentraciones finales de 0,
1, 5, 10 y 100 \muM. Asimismo, las células en el medio
complementado sin endotelina 1 se establecieron como control
negativo. Para cada tratamiento se usaron tres placas y el cultivo
se mantuvo durante 5 días, antes de recoger las células, con
adición de tripsina y recuento con una cámara de hemocitómetro.
Para el experimento de producción de melanina, las células se
recogieron y precipitaron. Después de retirar el medio con
precaución, se usó NaOH (1 M) para solubilizar los precipitados
celulares y se leyó la densidad óptica a 475 nm en un
espectrofotómetro UV de Perkin-Elmer (modelo UV/VIS
Lambda 2). Se calculó el contenido de melanina usando una ecuación
de regresión y = 0,005 + 0,005x, correspondiente a la curva de
calibración de la melanina sintética.
La figura 7 delimita los efectos de la piperina
sobre el crecimiento de melanocitos humanos cultivados en una placa
de 24 pocillos. La piperina a las concentraciones de 5 y 10 \muM
estimula de forma marcada el crecimiento de estas células
pigmentadas, con un rendimiento de 36% más células cuando el
cultivo estaba bajo la influencia de piperina 10 \muM durante 5
días. Sin embargo, a 100 \muM, la piperina ejerció un efecto
inhibidor sobre el crecimiento de estas células. Además, en
presencia de endotelina 1 1 nM, el TPA a 20 nM no fue capaz de
estimular el crecimiento celular en nuestro sistema de cultivo, un
resultado que difiere bastante del observado para los melanoblastos
humanos.
La tabla 5 muestra los efectos de la piperina
sobre el crecimiento de melanocitos humanos cultivados en placas
petri. Es un hecho notable que en presencia de ET1 (1 nM), la
piperina a las concentraciones de 5 y 10 \muM estimuló de forma
significativa el crecimiento de melanocitos humanos, con un número
de células de más del doble de las del control ET1 (1 nM), cuando
este celular melanocito se expuso a piperina 5 \muM durante 5
días. Este resultado fue consistente con el obtenido en los
experimentos con placas de 24 pocillos y sirvió para confirmar que
los efectos estimuladores observados mediante ensayo con SRB se
debieron al aumento de número de células en vez de al incremento en
la producción proteica.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (12)
1. Uso en la preparación de un medicamento para
estimular la proliferación de melanocitos de un compuesto de fórmula
(I)
en la
que
(a) n es 0, 1 ó 2, m es 2, los dos R^{1} juntos
representan un grupo
3'-4'-metilendioxi, R^{2} y
R^{3}, junto con los átomos de carbono a los que están unidos,
forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n
es 1 ó 2, R^{4} y R^{5}, junto con los átomos de carbono a los
que están unidos, forman un doble enlace
carbono-carbono y R^{6} es piperidino, o
(b) n es 1 e (i) m es 3, dos R^{1} juntos
representan 3'-4'-metilendioxi y el
otro 6'-metoxi; o (ii) m es 2, siendo los R^{1}
3'-hidroxi-4'-metoxi;
o (iii) m es 1 y el R^{1} es 4'-hidroxi; y
R^{2} a R^{6} son como se ha definido en el caso (a)
anteriormente; o
(c) n es 1, R^{6} es pirrolidino, isobutilamino
o metoxi y los otros símbolos son como se ha definido en el caso
(a) anteriormente, o
(d) n es 1, R^{4} y R^{5} representan átomos
de hidrógeno y o R^{2} y R^{3} también lo son o R^{2} y
R^{3} junto con los átomos de carbono a los que están unidos,
forman un doble enlace carbono-carbono; y m, R^{1}
y R^{6} son como se ha definido en el caso (a) anteriormente;
y en el caso (a), cuando n es 1, la molécula está
en la configuración geométrica E,E, Z,Z, Z,E o E,Z, pero en caso
contrario la molécula está en la configuración geométrica E,E o
todos E.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, de un
compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para
volver a pigmentar la piel despigmentada.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el
que la piel despigmentada es una piel despigmentada tras un
traumatismo.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 de un compuesto de fórmula (I) en la
preparación de un medicamento para el tratamiento del vitíligo.
5. Uso en la preparación de un medicamento para
el tratamiento del cáncer de piel de un compuesto de fórmula (I)
como se ha definido en la reivindicación 1.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto de fórmula (I) está
en forma de un extracto vegetal.
7. Un compuesto de fórmula (Ia)
en la
que
(a) n es 0 ó 2, m es 2, los dos R^{1} juntos
representan un grupo
3'-4'-metilendioxi, R^{2} y
R^{3}, junto con los átomos de carbono a los que están unidos,
forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n
es 1 ó 2, R^{4} y R^{5}, junto con los átomos de carbono a los
que están unidos, forman un doble enlace
carbono-carbono y R^{6} es piperidino, o
\newpage
(b) n es 1 y (i) m es 3, dos R^{1} juntos
representan 3'-4'-metilendioxi y el
otro 6'-metoxi o (ii) m es 2, siendo los R^{1}
3'-hidroxi-4'-metoxi;
o (iii) m es 1 y el R^{1} es 4'-hidroxi; y
R^{2} a R^{6} son como se ha definido en el caso (a)
anteriormente; o
(c) n es 1, R^{6} es pirrolidino, isobutilamino
o metoxi y todos los otros símbolos son como se ha definido en el
caso (a) anteriormente, o
(d) n es 1, R^{4}y R^{5} representan átomos
de hidrógeno y o R^{2} y R^{3} también lo son o R^{2} y
R^{3} junto con los átomos de carbono a los que están unidos,
forman un doble enlace carbono-carbono; y m,
R^{1} y R^{6} son como se ha definido en el caso (a)
anteriormente;
y la molécula está en la configuración geométrica
E,E o todos E, para su uso en tratamientos.
8. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la
reivindicación 7 para volver a pigmentar la piel despigmentada.
9. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la piel despigmentada es piel
despigmentada tras un traumatismo.
10. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con
las reivindicaciones 7 u 8 para el tratamiento del vitíligo.
11. Una composición farmacéutica que comprenda un
vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad
farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (Ia)
en la
que
(a) n es 0 ó 2, m es 2, los dos R^{1} juntos
representan un grupo
3'-4'-metilendioxi, R^{2} y
R^{3}, junto con los átomos de carbono a los que están unidos,
forman un doble enlace carbono-carbono y, cuando n
es 1 ó 2, R^{4} y R^{5}, junto con los átomos de carbono a los
que están unidos, forman un doble enlace
carbono-carbono y R^{6} es piperidino, o
(b) n es 1 y (i) m es 3, dos R^{1} juntos
representan 3'-4'-metilendioxi y el
otro 6'-metoxi; o (ii) m es 2, siendo los R^{1}
3'-hidroxi-4'-metoxi;
o m es 1 y el R^{1} es 4'-hidroxi; y R^{2} a
R^{6} son como se ha definido en el caso (a) anteriormente; o
(c) n es 1, R^{6} es pirrolidino, isobutilamino
o metoxi y todos los otros símbolos son como se ha definido en el
caso (a) anteriormente, o
(d) n es 1, R^{4} y R^{5} representan átomos
de hidrógeno y o R^{2} y R^{3} también lo son o R^{2} y
R^{3} junto con los átomos de carbono a los que están unidos,
forman un doble enlace carbono-carbono; y m, R^{1}
y R^{6} son como se ha definido en el caso (a) anteriormente;
y la molécula está en la configuración geométrica
E,E o todos E.
12. Un procedimiento de potenciar estéticamente
el color de la piel, que comprende la administración a un receptor
que desea potenciar el color de la piel de una cantidad
estéticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) como se define
en la reivindicación 1.
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