KR20160109764A - 구기자 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구기자 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에서 이용되는 구기자 캘러스 추출물은 콜라겐 합성의 촉진, 섬유아세포 보호 작용, 모낭 진피 유두 세포의 증식효과 등의 분자적 기전을 통한 우수한 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지 효과를 가진다. 아울러, 구기자 캘러스 추출물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 또는 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

구기자 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물{Composition for Improving Skin Conditions Comprising Lycium chinense Mill. callus Extract}

본 발명은 구기자 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지에 효과를 나타내는 구기자 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료, 약제학적 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

피부는 여러 가지 생리 기능을 가진 보호막이면서 동시에 타인으로부터 미용상 호감을 얻는 데 중요한 기관이다. 사람은 외관이 90%라는 말이 있는데, 의식조사에 의하면 나이가 듦에 따라 염려가 되는 것은 남녀 모두에게서, 속이 아닌 외관이라고 한다. 노화된 피부는 외견상 보이는 변화와 함께 여러 가지 피부의 기능적 장애를 동반하므로 이를 지연 또는 예방하기 위하여 화장품 분야에서 활발한 연구가 진행 중이다. 피부 노화는 유전적 인자, 자외선에 노출 정도, 물리 화학적 스트레스에 의한 활성 산소의 생성 등의 여러 요인에 의해 진행 속도 및 정도가 다르게 나타난다. 활성 산소종은 세포 내 단백질, 지질 또는 핵산 등을 공격, 손상을 주게 되며 이러한 손상이 축적되어 노화를 일으키게 된다. 피부노화의 대표적 현상으로 피지 분비량이 감소하여 피부가 건조해지고, 세포 재생이 늦어지고, 노화 각질이 많이 쌓여서 피부가 거칠어지는 특징이 있다. 또한, 표피를 지탱해주는 콜라겐의 합성량이 감소하고 엘라스틴(탄력섬유)이 변성되어 주름이 생긴다. 아울러, 피부색이 얼룩지고 기미, 검버섯 등과 색소 침착 증상이 나타나며, 표피가 얇아져서 피부보호 기능이 약화한다. 그 밖의 현상으로는 피부 두께의 감소와 관련된 피부 장벽작용(barrier effect)의 저하로 인한 피부 트러블의 증가를 들 수 있다. 피부노화와 관련된 연구는 크게 피부노화의 주요 원인이 되는 자외선과 활성산소로부터 피부를 보호하는 소재, 피부 주름 개선 소재, 피부 탄력 증진 소재, 피부 보습력 강화소재, 기미 생성억제에 관련된 소재로 분류할 수 있다.

피부의 노화가 진행되면 특히 진피 위축이 발생하며, 노인의 진피 두께는 약 20% 정도 줄어든다. 이때 진피의 세포 수나 혈관 수도 전반적으로 감소하여 진피의 변화가 나타난다. 진피의 변화는 섬유아세포(fibroblast)의 숫자와 이들의 합성 능력의 감소로 인하여 세포 외 기질 중 큰 분자량을 가진 물질들의 변화로 발생한다. 그 구체적인 변화는 콜라겐 다발의 분리, 점다당질 합성감소, 콜라겐과 탄력섬유(elastin) 수와 직경 감소, 콜라겐과 탄력섬유 분쇄 및 혈관의 팽창 등을 들 수 있다. 일반적으로 피부의 수분 함유량, 콜라겐 함유량 및 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 복합적인 요인 중 주름의 형성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 콜라겐의 생성량과 콜라겐의 함량을 감소시키는 콜라겐 분해 효소인 콜라게나아제(collagenase)의 발현량과 활성이다.

최근에는 내인성 노화뿐만 아니라 환경 파괴 및 오염으로 자외선 노출로 인한 주름 발생, 기미 또는 주근깨, 비만 및 탈모 등과 같은 현상을 효과적으로 해결할 수 있는 물질의 개발이 심도 깊게 연구되고 있다.

식물은 과거 식량 자원의 의미였으나, 현재에는 약제, 향료, 색소, 농약, 염료 등을 포함한 광범위한 화학물질의 공급원으로서 그 의미가 확대되고 있다. 한 예로, 식물 유래 유용물질(예, 카로티노이드, 페놀화합물, 비타민 등)을 이용한 피부 노화, 항산화, 탈모 등의 방지 또는 예방하는 목적으로 화장품 분야에서 식물에 대한 관심이 고조되고 있다.

그러나 식물은 성장속도가 매우 느리고, 식물 내 유용물질은 식물의 특정 기관 내에만 소량 존재하거나 품종에 따라 이차 대사물질들의 종류 및 함량이 달라지며, 같은 종 내에서도 계절, 장소, 지리적 기후, 재배조건, 식물체의 부위 등에 따라 생산성이 달라진다. 또한, 최근 급속한 산업화로 인한 생태계 오염 및 파괴로 인한 식물 자원이 고갈되고 있는 실정이다.

이에 따라 식물에 의존한 다양한 유용물질(예, 이차 대사산물)을 생물 공학적인 방법으로 생산하려는 많은 연구가 시도되었다. 그 중의 가장 효과적인 생산법이 식물세포 배양법이다. 이 방법은 배양배지와 배양환경 및 다양한 유도인자(elicitor) 처리 등을 통해 효과적으로 이차 대사산물을 생산할 수 있다. 또한, 자연환경의 제약(고/맹독성 농약, 중금속 오염, 계절적 지배 등)을 받지 않고도 식물이 생산하는 유용물질을 연속적으로 안정되게 대량생산이 가능하므로 상업적으로 중요하다고 할 수 있다.

한편, 구기자(Lycium chinense Mill.)는 쌍자옆 식물로서 가지과에 속하며, 줄기가 4m에 이르는 낙엽활엽 관목으로서 1925년부터 약용 작물로서 소규모로 재배되어 왔다. 구기자의 약리활성 성분으로 알려진 베타인(betaine)은 (CH)₃NCH₂COOH의 구조를 가지는 아민(amine) 계통의 물질로서 식물체와 미생물 등에서도 약리활성뿐 아니라 각종 항산화, 항노화 또는 항염증 등의 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(한국 공개특허 제2006-0025693호). 민간에서 한약제로 널리 사용되고 있는 열매(구기자)에는 베타인(betaine) 외에 카로틴(carotene), 제아키산틴(zeaxanthine), 니코틴산(nicotinic acid), 비타민(vitamin) 및 피살리엔(physalien) 등이 함유되어 있어서 간장 보호, 피로 및 무력감 치료, 동맥경화 예방, 콜레스테롤의 감소 등과 같은 자양 강장 효과가 있다. 또한, 구기엽에는 각종 성인병 예방에 효과가 있는 루틴(rutin)이 함유되어 있어 결핵, 해소, 토혈 등에 대한 해열 강장 효과가 있다(강경일 외, 2006, 한국식품과학회지, 38(1):99-103.). 그 외에도 항생물질, 플라보노이드(flavonoid), 사포게닌(sapogenin), 트로판 알칼로이드(tropane alkaloid), 디펩타이드(dipeptide)인 리치움아미드(lyciumamide), 수기올(sugiol) 및 (5-α-stigmastane-3,6-dione) 등이 함유되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 구기자 캘러스 추출물의 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 발모 촉진 또는 탈모 방지 효능에 대해서는 전혀 밝혀지지 않았으며, 상기한 효과를 가지는 구기자 유래 캘러스 추출물을 포함하는 조성물을 제조한 예 역시 전무하다.

이에 본 발명자들은 구기자 캘러스 추출물이 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지 효과가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 구기자(Lycium chinense Mill.) 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부상태 개선을 위한 화장료 조성물, 약제학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 설명된다.

하나의 양태로서, 본 발명은 구기자(Lycium chinense Mill.) 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin condition) 개선용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "캘러스"는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포 덩어리로서 대부분 유세포로 되어 있으며, 식물체에서 잘라낸 조직을 다양한 배지, 바람직하게는 옥신(auxin) 또는 사이토키닌(cytokinin)을 함유한 조직배양용 배지에서 배양하거나, 식물체에 상처를 내거나 또는 식물체의 상구를 옥신으로 처리하였을 때 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다.

본 명세서에서, 용어 "피부상태 개선"은 피부상태의 모든 형태의 호전 및 양호화를 의미하며, 바람직하게는 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지를 의미한다.

본 발명에 있어서, "구기자(Lycium chinense Mill.) 캘러스"는 구기자나무의 잎, 줄기, 가지, 열매 및 뿌리로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 바람직하게는 잎, 줄기, 가지 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상, 보다 바람직하게는 잎, 가지 및 열매로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 부위로부터 유도된 캘러스라면 어느 것이나 가능하나, 하나의 구체적 예로, 구기자 캘러스는 구기자나무의 가지를 절취하여 유도시킨 캘러스일 수 있다.

본 발명에 있어서, 캘러스의 유도는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 수행될 수 있다. 보다 구체적으로 캘러스의 유도는 식물체의 조직 또는 이의 절편체를 조직배양용 배지에서 배양하여 이루어진다. 상기 조직배양용 배지로는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지, N6(Chu et al., 1975), B5(Gamborg et al., 1968), NN(Nitsch and Nitsch, 1967) 배지, WHITE 배지 등 다양한 식물의 기본 배지를 사용할 수 있다. 또한, 상기 조직배양용 배지는 식물 생장조절물질이 첨가된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 식물 생장조절물질은 당업계에 공지된 물질을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 2,4,5-T(2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid), Dicamba(2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid), IAA(indole-3-acetic acid), IBA(indole-3-butyric acid), MCPA(2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid), NAA(1-naphthylacetic acid), NOA(2-naphthyloxyacetic acid), Picloram(4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid) 등의 옥신(Auxin)류; BAP(6-benzylaminopurine), 2iP(N6-(2-isopentyl)adenine), Kinetin(6-furfurylaminopurine), Thidiazuron(1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea), Zeatin(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) 등의 사이토키닌(Cytokinin)류 및 이의 유도체를 포함한다. 이외에도 조직배양용 배지에는 세포의 분화 및 증식에 작용하는 알카로이드류, 테르페노이드류, 카로테노이드류, 페놀류 화합물 및 천연 추출물 등을 추가로 첨가할 수 있다.

하나의 구체적 예로, 본 발명의 구기자 캘러스는 구기자나무의 가지를 분리하여 소독한 후 유기성분(예, 탄수화물, 아미노산 등), 무기양분(예, 질소, 인산, 칼륨 등) 및 식물 호르몬(예, 나프탈렌 아세트산, 옥신 등)이 함유된 한천 배지에 5 내지 8주 동안 배양하여 가지의 세포가 분열하여 세포 덩어리인 캘러스가 형성되면 배지로부터 캘러스를 분리하여 신선한 고체 배지 위에 치상한 다음 일정기간 간격으로 캘러스 상태를 관찰하며 계대 배양하여 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 구기자 캘러스 추출물은 구기자 캘러스 자체 또는 구기자 캘러스 분말, 캘러스를 일반적인 소독제(detergent 등)를 이용하여 화학적인 방법 또는 프렌치 프레스(french press) 방법 등의 물리적 방법으로 파쇄하여 얻은 파쇄물, 또는 당업계에 알려진 통상적인 세포배양 방법으로 세포를 배양한 후 초고속 원심분리 등의 물리적 방법을 이용하여 펠렛을 제거한 나머지 배양액을 당업계에 알려진 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 주름 개선, 예방 또는 치료 활성을 갖는 물질을 말한다. 상기 구기자 캘러스 추출물은 통상의 방법에 의하여 추출한 추출액뿐만 아니라 건조분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 말한다.

본 발명의 구기자 캘러스 추출물은 물 또는 유기용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 이때 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

또한, 상기 구기자 캘러스 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 이외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 구기자 캘러스 추출물을 수득할 수 있다.

하나의 구체적 실시양태에 따르면, 본 발명의 구기자 캘러스 추출물은 세포독성 및 부작용이 거의 없으면서 콜라겐 합성 촉진, 콜라게나아제(collagenase) 활성 억제 및 활성산소로 인한 산화적 손상으로부터 섬유아세포를 보호하는 효능이 있음이 확인되었다.

또 다른 하나의 구체적 실시양태에 따르면, 본 발명의 구기자 캘러스 추출물은 모낭 진피 유도 세포의 증식을 증가시키고, 우수한 발모 촉진 또는 탈모 방지 효과를 나타내며, 섬유아세포 내의 이오탁신-1(eotaxin-1)의 생성량을 농도에 의존적으로 감소시키는 효능이 있음이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 구기자 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지를 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "발모 촉진" 또는 "탈모 방지"는 동일한 의미로 사용되며, 이는 당업계에서 이용되는 또 다른 용어 양모 또는 육모 촉진과 동일한 의미를 가진다.

본 발명은 구기자나무 자체가 아니라 구기자 캘러스를 이용함으로써 식물을 훼손하지 않고도 유용물질을 얻을 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 구기자 추출물에 비하여 현저히 우수한 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지 효능을 나타내는 장점을 나타낸다.

본 발명의 조성물은 유효성분인 구기자 캘러스 추출물을 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.00005 내지 15.0 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%로 포함할 수 있다. 상기 구기자 캘러스 추출물의 함량이 0.00005 중량% 미만일 때는 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지 효과가 미약하고, 15 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 용도로서, 본 발명의 조성물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지를 위한 화장료 조성물로서 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서의 구기자 캘러스 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 조성물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지를 위한 약제학적 조성물로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서의 구기자 캘러스 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 이때, 비경구 경로로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 도포에 의한 국부 투여(topical application)가 가장 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중) 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 구체적인 용도로서, 본 발명의 조성물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화 또는 개선, 아토피 피부염의 개선, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지를 위한 식품 조성물로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서의 구기자 캘러스 추출물 이외에 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 다이사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)]를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 상기 구기자 캘러스 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 구기자 캘러스 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화장료, 약제학적 또는 식품 조성물은 개체에 투여하여 개체의 피부상태를 개선할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "개체"는 피부의 불량한 상태, 예를 들어, 주름, 탈모, 자외선 또는 활성산소에 의한 피부 손상, 아토피 피부염을 포함한 염증질환 등을 개선, 예방 또는 치료하고자 하며, 본 발명에 다른 조성물의 투여에 의하여 이들 목적을 달성할 수 있는 인간을 포함한 포유동물, 예를 들어, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 침팬지 등을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "개선" 또는 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제, (b) 질환 또는 질병의 경감, 또는 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 대상, 예를 들어, 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상술한 피부상태는 본 발명의 조성물의 개체 내 투여에 의하여 개선, 호전, 예방 또는 치료 등의 목적을 달성할 수 있음은 상술한 내용 및 하기에 기술된 실시예 등을 통하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해될 것임은 물론이다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 구기자 캘러스 추출물은 콜라겐 합성의 촉진, 섬유아세포 보호 작용 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지 효과를 가진다. 아울러, 구기자 캘러스 추출물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 또는 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

도 1은 구기자 캘러스 추출물에 의한 콜라겐 생성 촉진 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 구기자 캘러스 추출물에 의한 콜라겐분해효소(콜라게나아제)의 활성을 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 구기자 캘러스 추출물에 의한 이오탁신-1(eotaxin-1) 활성을 억제하는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 구기자 캘러스 추출물에 의한 산화 스트레스로 유도된 세포노화의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 구기자 캘러스 배양 추출물에 의한 모낭 진피 유두 세포 증식 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 구기자 캘러스 추출물 제조

본 발명의 구기자 캘러스 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다.

구기자나무의 당년생 가지를 70% 에탄올에 30초 동안 침지시킨 후 2% 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite) 용액에 30분 동안 진탕하였다. 그 다음 살균한 구기자나무의 가지를 멸균수로 5회 이상 세척한 후 작은 절편(가로방향으로 0.5~1cm)으로 만들었다. 그 다음 살균된 구기자나무의 가지를 NAA(1-Naphthaleneacetic acid ) 3mg/L의 생장조절물질과 수크로오스(Sucrose) 30g/L, 겔라이트(Gelite) 2.5g/L를 함유한 MS(Murashinge and Skoog, 1962) 기본배지에 접종한 후 25℃의 배양실에서 8주간 배양하여 캘러스(callus)를 유도하였다. 유도된 캘러스는 5주 간격으로 계대 배양하여 증식 및 순화하였다. 상기 유도된 캘러는 공기 부양형 생물반응기내에 접종하여 배양한 후 수확하였다. 이 때, 배양 배지는 기본배지에 겔라이트(Gelite) 2.5g/L를 뺀 동일 배지에 접종한 후 25℃의 배양실에서 6주간 암상태로 현탁 배양하였다. 배양된 캘러스는 6주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다.

그 다음 상기 증식된 캘러스는 수확하여 수분을 제거하고, 55℃의 건조기에서 2일 동안 건조한 후 분쇄하였다. 건조된 구기자 캘러스 분말 100g을 10ℓ의 80% 메탄올에 침지하여 실온에서 2시간 동안 초음파 추출하였다. 그 후 수득한 추출액을 여과지(Advantes, No.2)를 사용하여 여과하고, 감압농축하여 구기자 캘러스 추출물을 제조하였다.

실시예 2 : 구기자 캘러스 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과 측정

콜라겐 생합성능은 사람유래 섬유아세포에 대한 세포실험으로 합성정도를 측정할 수 있다. 콜라겐 생합성능 실험은 인체유래 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 플레이트(24-well plate)에 접종시키고(2 × 10⁵ 세포/well), 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 10 ppm, 50 ppm 및 100 ppm의 구기자 캘러스 추출물을 각각 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen Type I C-peptide EIA kit MK101, 다카라, 일본)를 이용하여 프로콜라겐(procollagen) 타입 I C-펩타이드(Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 자세한 시험방법은 (주)다카라의 키트 설명서에 따라 수행하였다. 대조군(-)으로는 구기자 캘러스 추출물을 처리하지 않은 섬유아세포를 사용하였고, 양성 대조군으로는 구기자 캘러스 추출물은 처리하지 않고, 10 ng/ml TGF-β(형질전환증식인자)만을 처리한 섬유아세포를 사용하였다. 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 10 ppm, 50 ppm 및 100 ppm의 농도의 구기자 캘러스 추출물을 처리한 섬유아세포는 대조군과 비교하여 각각 10%, 20%, 40%씩 콜라겐 생성을 증가시켰다.

실시예 3 : 구기자 캘러스 추출물의 콜라겐 분해효소 활성 억제 효과 측정

콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나아제의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게나아제에 대한 항체를 이용하였다. 콜라게나아제 활성을 유도하는 물질로 알려진 종양괴사인자 알파(Tumor necrosis factor, TNF-alpha, Sigma, USA)를 처리하였다. 구기자 캘러스 추출물의 농도범위는 0ppm, 10 ppm 및 100 ppm으로 결정하였다. 전체적인 시험은 판매회사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 타입 I 콜라게네이즈 어세이 키트(Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기(Bio-Tek ELx808^™ Series Ultra Microplate Reader, 영국)로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균±표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였다. 대조군(-)으로는 종양괴사인자 알파 및 구기자 캘러스 추출물을 처리하지 않은 섬유아세포를 사용하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 구기자 캘러스 추출물은 인체유래 섬유아세포에서 종양괴사인자 알파에 의해서 유도된 콜라겐 분해효소 활성을 농도-의존적으로 억제시켰다.

실시예 4 : 구기자 캘러스 추출물을 포함하는 화장료의 피부탄력 증진 효과 측정

4-1. 구기자 캘러스 추출물을 포함하는 영양크림의 제조

구기자 캘러스 추출물을 포함하는 영양크림의 조성은 하기 표 1과 같다.

먼저, 수상인 정제수, 트리에탄올 아민 및 프로필렌글리콜을 70℃로 가열하고 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 0.01%, 0.05% 또는 1.00% 구기자 캘러스 추출물 및 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각하였다.

성분	함량 (중량%)
	대조군	시험군 1	시험군 2	시험군 3
구기자 캘러스 추출물	-	0.01	0.05	1.00
호호바 오일	5.0	5.0	5.0	5.0
유동 파라핀	7.0	7.0	7.0	7.0
세틸아릴 알코올	2.0	2.0	2.0	2.0
폴리글리세릴-3 메칠 글루코스 디스테아레이	2.0	2.0	2.0	2.0
글리세릴 스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0
프로필렌글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0
트리에탄올 아민	0.3	0.3	0.3	0.3
카르복시 비닐폴리머	0.3	0.3	0.3	0.3
토코페릴 아세테이트	0.2	0.2	0.2	0.2
방부제, 향	미량	미량	미량	미량
정제수	70.7	70.69	70.65	69.7
합계	100	100	100	100

4-2. 구기자 캘러스 추출물을 포함하는 화장료의 피부탄력 증진 효과 측정

상기 실시예 4-1의 방법으로 제조한 영양크림을 건강한 여성 30명을 대상으로 피부탄력 변화의 측정을 통해 주름개선 효과를 평가하였다.

구체적으로, 온도 25℃, 습도 40%로 일정하게 유지되는 조건에서 건강한 여성 30명(25∼35세)을 대상으로 제조예 1 크림의 3종류와 비교 제조예의 영양크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일 2회씩 3개월 동안 사용하게 한 후, Cutometer SEM 474(Courage + Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 피부탄력도를 측정하였으며, 판정기준은 피부탄력이 없는 경우를 0, 많은 경우를 5로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시험항목 (구기자 캘러스 추출물)	시험군 1 (0.01% )	시험군 2 (0.05%)	시험군 3 (1%)	대조군 (0%)
피부탄력도	2.57	2.77	2.84	2.53

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 시험군 1, 시험군 2 및 시험군 3이 대조군에 비해 피부탄력도가 향상됨을 확인하였다. 이를 통해 구기자 캘러스 추출물의 피부탄력 증진 효과를 확인하였으며, 또한 구기자 캘러스 추출물의 함유 농도가 증가함에 따라 피부탄력도는 농도-의존적으로 향상됨을 확인하였다.

실시예 5 : 경구투여에 의한 항노화 효과

노화는 모든 생물체에서 나타나는 현상으로 전체 조직 및 기관에 나타난다. 피부는 동물의 경우 개체의 최외곽을 구성하는 가장 면적이 넓은 기관으로 피부에 나타나는 주름은 노화 정도를 가장 쉽게 판별할 수 있는 지표이다. 특히 자외선을 조사할 경우 인위적으로 노화과정을 촉진할 수 있기 때문에 동물시험에서 자외선을 쬔 후 시험물질을 경구나 경피로 투여하여 그 효과를 측정함으로써 그 물질이 실제 항노화 효과가 있는지를 확인할 수 있다.

본 발명의 조성물이 광노화 증상에 미치는 영향을 조사하고자 무모생쥐(hairless mouse)를 동물모델로 선정하여 실험하였다. 6∼7 주령의 암컷 무모생쥐(hairless mouse-Skh: HR-1)를 그룹 당 8 마리씩 정상군, UV 대조군, UV/구기자 캘러스 추출물 투여군으로 나누어 실험기간 동안 사육하였다. 정상군과 UV 대조군은 0.5 ㎖의 생리식염수를 경구투여하였고, UV/구기자 캘러스 추출물 투여군은 고형분 기준으로 체중 Kg당 100 ㎎의 구기자 캘러스 추출물을 0.5 ㎖ 식염수에 섞어 액체 투여용 주사기를 이용하여 경구 투여하였다.

투여기간은 총 5주로 주 5일 동일한 시간에 투여하였다. 경구투여 후 2주부터 5주까지 UV 대조군, UV/구기자 캘러스 추출물 투여군에 주 3회 태양광과 유사하게 UV를 조사하였다. 실험기간 중 총 UV 조사량은 600 mJ/㎝²이 되도록 하였다. 항노화 효과의 주요 현상으로 주름개선 효과의 객관적 판정을 위하여 부검 전 무모생쥐(hairless mouse)의 등쪽에서 실리콘 폴리머를 이용하여 피부주형(replica)을 채취하였고 마찬가지로 5주 후에 각 샘플 처리군으로 부터 피부주형을 채취하여 항노화 효과 즉 주름개선 효과를 비교하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

R-파라미터	UV/대조군	UV/구기자 캘러스 추출물
R1 값	0.67±0.010	0.52±0.003
R2 값	0.59±0.011	0.45±0.008
R3 값	0.31±0.007	0.20±0.005
R4 값	0.22±0.004	0.13±0.013
R5 값	0.41±0.009	0.36±0.009

R1 값: 피부의 주름도(Skin roughness), R2 값: 피부의 깊은 주름도(Maximum roughness), R3 값: 피부의 평균주름도(Average roughness), R4 값: 주름 평균깊이(Smoothness depth), R5 값: 피부의 평균 거칠기(Arithmetic average roughness)(International Journal of Cosmetic Science, 27(3):155-60(2005)).

상기 표 3에서 보여지는 바와 같이, 주름개선정도를 나타내는 R1, R2, R3, R4, R5 모두, 구기자 캘러스 추출물을 투여한 무모생쥐(hairless mouse)에서 투여하지 않은 UV/대조군에 비해 크게 감소한 것을 관찰하였다. 이 결과를 통해 본 발명의 조성물이 피부주름을 개선하는 효과를 가짐을 알 수 있었다. 즉, 경구투여시, 구기자 캘러스 추출물의 주름개선 효과가 나타나 항노화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6 : 구기자 캘러스 추출물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

6-1. 구기자 캘러스 추출물을 포함하는 피부 외용제의 제조

구기자 캘러스 추출물이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 하기 표 4의 성분 및 함량으로 구기자 캘러스 추출물을 함유한 피부 외용제를 제조한 다음 피부누적자극시험을 통해 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 먼저, 스쿠알렌을 베이스로 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하여 약 70℃의 온도에서 용해한 다음(수상파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 약 70℃의 온도에서 용해하였다(유상파트). 그 후, 상기 유상파트를 수상파트에 첨가시켜 호모믹서(Tokushu Kika사, 일본)로 교반하여 1차 유화한 다음, 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다.

성분	함량 (%)
	대조군	시험군 1	시험군 2	시험군 3
정제수	72	71.9	71.5	71
글리세린	8.0	8.0	8.0	8.0
부틸렌글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0
구기자 캘러스 추출물	0	0.1	0.5	1.0
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드	8.0	8.0	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0
세테아릴 글루쿠사이드	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4	0.4	0.4
세테아릴 알코올	1.0	1.0	1.0	1.0
트리메탄올아민	0.1	0.1	0.1	0.1
총중량	100	100	100	100

6-2. 피부누적 자극 실험

상기 실시예 6-1에서 제조한 피부 외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포를 시행하여 구기자 캘러스 추출물이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 첩포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 1을 이용하여 점수화하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

[수학식 1]

평균반응도 = [[{(반응지수× 반응도)/(총 피검자수 × 최고점수(4점))}] × 100] ÷ 검사회수(9회)

반응도에서 ±는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.

시험물질	반응이 나타난 피검자 수																											평균 반응도
	1주									2주									3주
	1차			2차			3차			4차			5차			6차			7차			8차			9차
	±	+	++	±	+	++	±	+	++	±	+	++	±	+	++	±	+	++	±	+	++	±	+	++	±	+	++
대조군 (스쿠알렌)	0	-	-	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.00
구기자 캘러스추출물(0.1%) [시험군 1]	0	-	-	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.00
구기자 캘러스 추출물 (0.5%) [시험군 2]	0	-	-	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.00
구기자 캘러스 추출물(1%) [시험군 3]	0	-	-	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.00

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 시험군 1, 2 및 3 모두 ±, + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명 및 0명이고, 평균 반응도는 각각 0.00, 0.00, 0.00이었다. 평균반응도가 3 이하의 반응도를 나타내므로, 구기자 캘러스 추출물은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않는 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.

실시예 7: 항염증효능 평가

항염증 효과가 있는지 살펴보기 위하여 NIH/3T3 세포(섬유아세포)를 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였고, 12 well plate에 1 × 10⁵개/웰씩 분주한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 FBS가 포함되지 않은 새로운 DMEM로 바꾸어주고, 100% DMSO에 녹인 구기자 캘러스 추출물 10ppm 또는 100 ppm을 전처리하여 1시간 동안 전배양시켰다. 전배양 후 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)를 50 ng/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양 후 배양상등액을 회수하여 효소면역 측정법(Enzyme-linked innumosorbent assay, ELISA)를 수행하여 이오탁신-1(eotaxin-1)의 분비 정도를 비교 측정하였다. 대조군(-)으로는 IL-4와 구기자 캘러스 추출물을 처리하지 않은 NIH/3T3 세포(섬유아세포)를 사용하였고, 양성 대조군으로는 IL-4는 처리하였으나 구기자 캘러스 추출물은 처리하지 않은 NIH/3T3 세포(섬유아세포)를 사용하였다. 그 결과를 도 3 및 표 6에 나타내었다.

시료	Eotaxin-1 활성(%)
양성 대조군[IL-4(50 ng/㎖)]	100
IL-4(50 ng/㎖)+ 구기자 캘러스 추출물(10 ppm)	91.5
IL-4(50 ng/㎖)+ 구기자 캘러스 추출물(100 ppm)	77

도 3 및 표 6에서 보는 바와 같이, 10 ppm 및 100 ppm의 농도의 구기자 캘러스 추출물을 처리한 섬유아세포는 양성 대조군과 비교하여 각각 8.5%, 23%의 이오탁신-1(eotaxin-1)의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인했으며, 이를 통해 구기자 캘러스 추출물이 아토피 피부염을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 효능을 갖고 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 활성산소로부터 섬유아세포 보호효과 및 항노화 효과

사람의 정상 섬유아세포(Human normal fibroblast, 아주대 피부과)를 DMEM 배지가 들어 있는 24-웰 플레이트(24-well plate)에 접종시키고(2 × 10⁵ 세포/well), 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 무혈청 DMEM배지로 교환하고 구기자 캘러스 추출물은 농도별(0, 10 및 100 ppm)로 처리한 다음, 미토콘드리아 활성산소를 유도하는 것으로 알려진 로테논을 1 μM 함께 처리하였다. 로테논과 실험물질 3일 처리군은 세포생존력을 측정하였고, 6일 처리군은 세포노화 측정 지표인 SA-beta-Gal염색실험을 실시하였다. 각각의 현미경 사진 이미지를 Image J 프로그램으로 분석하여 염색정도를 측정하였다. 대조군(-)으로는 로테논 및 구기자 캘러스 추출물을 처리하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 것과 같이 로테논에 의해 증가된 SA-beta-Gal 염색 강도가 구기자 캘러스 추출물이 처리된 군에서 감소되는 결과가 관찰되었다.

실험물질 처리 3일 후 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 방법을 이용하여 세포생존력을 관찰하였다. MTT는 담황색의 기질로서 생세포의 미토콘드리아 내의 호흡쇄 효소에 의해 개열(開裂)하고 암청색의 포르마잔을 생성하였다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이러한 포르마잔의 생성량은 생세포수 측정에 이용된다. 측정 결과는 표 7에 나타내었다. 세포재생율은 하기 수학식 2를 사용하였으며, 수학식 2는 다음과 같다.

[수학식 2]

세포재생율 측정 = {(시료처리군 - 로테논 처리군)/로테논 처리군} × 100

시험항목	구기자 캘러스 추출물 (100 ppm)	구기자 캘러스 추출물 (500 ppm)
세포재생율(%)	15	37

상기 표 7에서 확인할 수 있듯이, 구기자 캘러스 추출물은 로테논에 의해 유도된 섬유아세포 독성 효과를 완화시켰다. 이는 구기자 캘러스 추출물이 미토콘드리아가 활성산소에 의해 손상되는 것을 방어하는 기전을 통해 섬유아세포를 보호하는 것임을 보여준다.

실시예 9: 모낭 진피 유두 세포(Hair follicle dermal papillar cells) 증식 효과

본 발명에 따른 구기자 캘러스 추출물의 탈모방지와 육모 효과를 생체외(in vitro) 실험조건에서 알아보기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다

모낭 진피 유두 세포를 구기자 캘러스 추출물이 함유된 무혈청 배지에 배양하여 구기자 캘러스 추출물이 세포생존능에 미치는 효과를 관찰하였다. 모낭 진피 유두 세포는 Cell Application사로부터 구입하였고 모낭 진피 유두 세포 성장용 배지(Hair Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium, Cell Apllications, Inc. USA) 배지를 이용하여 배양하였다.

구체적으로, 모낭 진피 유두 세포 성장용 배지(Hair Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium)를 이용해 배양한 모낭 진피 유두 세포 3 × 10⁵을 6-웰 플레이트(6-well plate)에 접종하여, 다음 날 무혈청 배지로 1회 세척 후, 1, 10 또는 50 μg/mL 농도의 구기자 캘러스 추출물이 함유된 무혈청 배지에 72시간 배양하였다. 배양 후 무혈청 배지로 1회 세척 후, 10% MTT를 처리하여 세포와 3시간 동안 반응시킨 뒤 O·D 값을 측정하여 값을 백분율로 환산하였다. 대조군으로는 구기자 캘러스 추출물을 처리한 모낭 진피 유두 세포를 사용하였고, 양성 대조군으로는 구기자 캘러스 추출물 대신 섬유아세포 성장인자인 FGF2와 FBS를 10% 포함한 완전배지(C,M: complete medium)을 처리한 모낭 진피 유두 세포를 사용하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 구기자 캘러스 추출물을 처리한 모낭 진피 유두 세포는 농도-의존적으로 세포 성장이 증가하였다.

실시예 10: 탈모방지 및 육모효과

본 발명에 따른 구기자 캘러스 추출물의 탈모방지와 육모 효과에 대하여 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

10-1. 발모제 조성물의 제조

구기자 캘러스 추출물을 함유한 발모제 조성물은 하기 표 8의 성분 함량으로 하여 하이드로겔 베이스를 제조하였다. 시험군 1 및 시험군 2는 각각 구기자 캘러스 추출물을 포함하는 발모제 조성물이다.

성분	함량(%)
	시험군 1	시험군 2
구기자 캘러스 추출물	0.1	1.0
방부제(그람벤)	0.8	0.1
점증제(Xanthan-Gum)	0.3	0.1
총 중량	100	100

10-2. 탈모 방지 및 육모 효과 측정

40대에서 60대 후반의 모낭이 위축되어 두피가 매끈매끈한 민 대머리성 탈모증 환자, 전형적인 남성탈모증 환자 및 급성 원형탈모증 환자 등 40명을 4개 군으로 나누고, 1군당 10명씩 할당하였다. 상기 실시예 10-1에서 제조한 발모제를 탈모증 환자의 탈모부위에 1일 2회 각각 3㏄씩 6개월간 적용하였다. 1개월 단위로 탈모 및 육모 상태를 관찰하였다. 비교군으로는 시판중인 목시딜(한미약품)을 사용하였으며, 대조군으로는 50% 에탄올만을 적용하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.

판정기준은 다음과 같다:

4: 높은 효과 있음 = 신생모가 보임

3: 중간 정도의 효과 있음 = 신생모가 보임(솜털)

2: 약간 효과 있음 = 탈모의 수가 감소함

1: 효과 없음 = 전혀 변화가 보이지 않음

-	대조군	비교군	시험군 1	시험군 2
효능/효과	2.2	3.5	2.7	3.0

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 구기자 캘러스 추출물을 포함하는 발모제를 사용한 탈모증 환자에게서 처치 1개월 또는 2개월째부터 솜털을 비롯한 강모의 신생모가 나타나기 시작하였고, 처치 6개월째에는 80% 이상의 환자에게서 발모 효과가 나타났다. 또한, 신생모가 지속적으로 자라났으며 탈모 현상이 발견되지 않음을 관찰하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 화장료 제제

1-1. 유연화장수

성분	중량%
구기자 캘러스 추출물	0.01
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
카복시비닐폴리머	0.1
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	82.79
총계	100.0

1-2. 영양화장수

성분	중량%
구기자 캘러스 추출물	0.01
밀납	4.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	5.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
카복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	69.69
총계	100.0

1-3. 영양크림

성분	중량%
구기자 캘러스 추출물	0.01
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	56.79
총계	100.0

1-4. 마사지 크림

성분	중량%
구기자 캘러스 추출물	0.01
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	27.49
총계	100.0

1-5. 팩

성분	중량%
구기자 캘러스 추출물	0.01
폴리비닐알콜	13.0
소듐카복시메틸셀룰로스	0.2
알란토인	0.1
에탄올	5.0
노닐페닐에테르	0.3
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수	81.39
총계	100.0

제제예 2 : 약학적 제제

2-1. 산제의 제조

성분	g
구기자 캘러스 추출물	2
유당	1

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2-2. 정제의 제조

성분	㎎
구기자 캘러스 추출물	100
옥수수전분	100
유당	100
스테아린산 마그네슘	2

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

2-3. 캡슐제의 제조

성분	㎎
구기자 캘러스 추출물	100
옥수수전분	100
유당	100
스테아린산 마그네슘	2

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 구기자(Lycium chinense Mill.) 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물로서, 상기 피부상태 개선은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지인 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
   
2. 구기자(Lycium chinense Mill.) 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 약제학적 조성물로서, 상기 피부상태 개선은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지인 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 약제학적 조성물.
   
3. 구기자(Lycium chinense Mill.) 캘러스 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 식품 조성물로서, 상기 피부상태 개선은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손상의 완화 또는 개선, 아토피 피부염의 개선, 및 발모 촉진 또는 탈모 방지인 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 식품 조성물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구기자 캘러스는 구기자나무의 잎, 줄기, 가지, 열매 및 뿌리로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 부위로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구기자 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.00005 내지 15.0 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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