KR102604076B1 - 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 조성물 - Google Patents
수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 수수꽃다리 추출물은 자외선 조사에 의해 증가된 염증성 사이토카인 생성 감소 효과 및 상처가 유도된 피부세포에서의 세포 재생능이 우수하므로, 항염증, 피부 재생용 및 피부 상처 치료용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 조성물에 관한 것이다.
염증 반응은 외부자극에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나로서 여러 가지 질병의 생리 및 병리학적인 과정에 관여하며 외부자극에 의해 손상된 조직을 수복하거나 재생하는 기전이다. 이러한 염증 반응의 특징은 피부 조직 및 관절 조직 등에 이화학적, 화학적, 세균학적 변화를 수반하는 것이다. 염증으로 인하여 생기는 증상으로는 발열, 홍진, 부종 등이 있으며 지속적인 염증 반응으로 인하여 치매, 심혈관질환, 암, 비만, 관절염, 당뇨병 등 다양한 난치병들을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 염증 반응이 일어나면 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증성 사이토카인이 분비되며, 이러한 염증성 사이토카인의 분비는 NF-ĸB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)에 의해 촉진된다. 염증을 치료하는데 주로 사용하는 항염증제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제로 구분되며, 이 중 대부분의 합성 항염증제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 항염증제의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 피부는 인체의 일차 방어막으로서 온도와 습도 변화, 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 체내의 기관들을 보호하며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이러한 피부의 표면에 상처가 생길 경우, 피부는 상처의 회복을 촉진하여 상처를 통한 추가 감염을 방지하며, 피부 표면의 흉터를 줄여주는 역할을 한다. 따라서, 피부 재생 촉진용 물질은 피부 표면의 상처 치료 및 흉터 발생 억제에 큰 도움이 되므로, 피부 재생 효과 기능이 우수하고 인체에 무해하며 제형 안정성이 우수한 피부 재생 촉진용 천연물질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
한편, 수수꽃다리(Syringa oblata)는 물푸레나무과의 낙엽관목으로, 줄기는 높이 2~3 m에 달하며 어린 가지는 털이 없으며 회갈색이다. 황해도, 평안도 등지에서 자라는 특산 식물로, 라일락과 모양이 비슷하며, 꽃이 길고 꿀샘이 깊어서 벌이 수정을 도와줄 수 없어 주로 삽목이나 접목으로 번식한다.
한편, 한국공개특허 제2014-0084907호에는 '수수꽃다리 추출물을 포함하는 당뇨합병증 저해제 및 이를 포함하는 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1915952호에는 '어성초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염증용 및 피부 재생용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 조성물'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 조성물을 제공하고, 본 발명의 유효성분은 세포독성이 없고, 자외선 조사에 의해 증가된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량을 감소시키고, 상처가 유도된 피부세포에서의 세포 재생 효과가 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 상처 치료용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 수수꽃다리 추출물은 자외선 조사에 의해 증가된 염증성 사이토카인의 생성 감소 효과 및 상처가 유도된 피부세포에서의 세포 재생능이 우수하므로, 항염증, 피부 재생용 및 피부 상처 치료용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물의 세포 독성을 인간각질형성세포주 HaCaT 세포에서 확인한 결과이다. C는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군이고, NAC는 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine)이다.
도 2는 자외선(UVB)을 조사한 인간각질형성세포주 HaCaT 세포에서 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물의 TNF-α(A), IL-1β(B) 및 IL-6(C) 생성 억제능을 확인한 결과이다. N은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군이고, C는 자외선 단독 처리군이고, NAC는 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine)이다. ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군(N)에 비해 자외선 단독 처리군(C)의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이고, ###은 자외선 단독 처리군(C)대비 NAC 또는 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 3은 자외선(UVB)을 조사한 인간각질형성세포주 HaCaT 세포에서 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물의 NF-κB 및 IκB 단백질의 발현 조절능을 확인한 결과이다. (N)은 세포 핵내에서의 발현을 의미하고, (C)는 세포질내에서의 발현을 의미하며, NAC는 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine)이다.
도 4는 인간각질형성세포주 HaCaT 세포에서 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물의 세포 재생능을 확인한 결과로, A는 스크래치 분석(scratch assay) 결과를 현미경으로 촬영한 세포의 사진이고, B는 A의 결과를 세포 재생율(%)로 나타낸 그래프이다. **, ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군(C)에 비해 10% FBS, 1% FBS, 0.1 또는 10 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 세포 재생율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이고, ###은 1% FBS 처리군에 비해 10% FBS 또는 10 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 세포 재생율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 2는 자외선(UVB)을 조사한 인간각질형성세포주 HaCaT 세포에서 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물의 TNF-α(A), IL-1β(B) 및 IL-6(C) 생성 억제능을 확인한 결과이다. N은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군이고, C는 자외선 단독 처리군이고, NAC는 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine)이다. ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군(N)에 비해 자외선 단독 처리군(C)의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이고, ###은 자외선 단독 처리군(C)대비 NAC 또는 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 3은 자외선(UVB)을 조사한 인간각질형성세포주 HaCaT 세포에서 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물의 NF-κB 및 IκB 단백질의 발현 조절능을 확인한 결과이다. (N)은 세포 핵내에서의 발현을 의미하고, (C)는 세포질내에서의 발현을 의미하며, NAC는 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine)이다.
도 4는 인간각질형성세포주 HaCaT 세포에서 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물의 세포 재생능을 확인한 결과로, A는 스크래치 분석(scratch assay) 결과를 현미경으로 촬영한 세포의 사진이고, B는 A의 결과를 세포 재생율(%)로 나타낸 그래프이다. **, ***은 아무것도 처리하지 않은 대조군(C)에 비해 10% FBS, 1% FBS, 0.1 또는 10 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 세포 재생율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이고, ###은 1% FBS 처리군에 비해 10% FBS 또는 10 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 세포 재생율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 항염증 및 피부 재생용 화장료 조성물에 있어서, 상기 수수꽃다리 추출물은 수수꽃다리 캘러스(callus) 추출물인 것이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 캘러스는 분화되지 않은 부정형의 세포 덩어리로, 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열 조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물의 분열 조직의 세포를 영양 배지에 넣고 배양하면 캘러스가 형성되며 이후 부정배가 형성되고 식물체로 분화된다.
또한, 상기 수수꽃다리 추출물의 추출 용매는 당업계에 공지된 통상적인 추출용매를 사용할 수 있다. 바람직한 추출용매는 DMSO(dimethyl sulfoxide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 수수꽃다리 추출물의 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용하여 추출할 수 있다. 바람직한 추출방법은 초음파 추출이나, 이에 제한되지 않는다. 추출온도는 4~50℃인 것이 바람직하며, 20~30℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 0.5~5시간이 더욱 바람직하고, 1시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 수수꽃다리 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액; 추출액의 희석액 또는 농축액; 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물; 조정제물; 또는 정제물 중 어느 하나를 포함할 수도 있다.
본 발명의 수수꽃다리 추출물은 피부 세포에 독성이 없고, 자외선 조사에 의해 증가한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성 억제능 및 NF-κB 및 IκB단백질의 발현 조절능이 우수하며, 피부 재생 활성을 가지고 있는 것이 특징이다.
본 발명의 항염증 및 피부 재생용 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프락토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 수수꽃다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 상처 치료용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다. 본 발명의 의약외품 조성물은 피부 상처 치료를 목적으로 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 일례로, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여용 제형일 수 있다.
또한, 각 제형에 있어서 의약외품 조성물은 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(억제 또는 완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 수수꽃다리 캘러스 추출물 제조
(1) 수수꽃다리 캘러스 제조방법
수수꽃다리의 기내 배양 체계 확립을 통한 식물세포주를 개발하기 위하여, 국내에서 채집한 수수꽃다리 식물체의 오염 물질을 제거하고 흐르는 물에서 30분~1시간 동안 세척한 후 물기를 제거하고 꽃잎을 잘라 준비하였다. 이후, 유리 배양병에 넣고 70%(v/v) 에탄올 용액에서 1분 동안 흔들어 주면서 소독한 후, 멸균수로 1~2회 세척하고 0.4~0.8%(v/v) 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에 넣고 잘 흔들어 주면서 20분 동안 표면살균을 실시하여 무균 시료를 준비하였다. 살균된 여과지를 이용하여 상기 표면살균이 이루어진 수수꽃다리 시료에 남아 있는 수분을 제거한 다음 무균작업대 내에서 가로 세로 1 cm 내외의 크기로 절단하여 절편으로 제조한 다음, 미리 준비한 배양 배지에 10개씩 3반복으로 치상하여 25℃, 암조건에서 배양하였다. 배양 배지는 사전 실험 결과, 캘러스 유도 효율이 우수한 MS(Murashige and Skoog) 배지에 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨(myo-inositol), 0.4 ㎎/ℓ 티아민(thiamine), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite) 및 1 ㎎/ℓ 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)이 첨가된 배지를 120℃에서 15분간 멸균 후 배양에 사용하였다.
수수꽃다리 식물체 절편 시료들은 배양개시 2주 후부터 조직 절단면에서 팽창이 이루어지면서 백색의 캘러스가 형성되기 시작하였다. 배양개시 4주 후, 백색 캘러스의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 크기가 약 1mm 정도에 이르렀고 배양개시 6주 후에는 캘러스의 증식이 더욱 활발해지는 것을 관찰하였다. 상기 캘러스는 동일 조성의 새로운 배지에 4주 주기로 계대배양하여 수수꽃다리 꽃잎 유래 식물세포주(BP1347304, 이하, 수수꽃다리 캘러스라 칭함)를 확보하였다(KCTC No. PC4392).
(2) 수수꽃다리 캘러스 추출물 제조방법
상기 방법으로 제조된 수수꽃다리 캘러스를 건조한 후 분말화한 다음, 수수꽃다리 캘러스 건조분말 100 ㎎에 DMSO(dimethyl sulfoxide) 1 ㎖을 첨가한 후 실온(20±5℃)에서 1시간 동안 초음파 처리하여 추출하였다. 이후, 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 취해 실험에 사용하였다.
실시예 1. 수수꽃다리 캘러스 추출물의 세포독성 분석
인간각질형성세포주(human keratinocyte cell line) HaCaT 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구매하여 사용하였으며, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에 1% 페니실린을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
HaCaT 세포를 1×104 cells/㎖로 96웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 1, 10, 50, 100, 150, 200 및 500 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물을 각 웰에 넣고 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 5 mg/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 각 웰에 넣고 4시간 동안 배양한 후, 상등액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100 ㎕씩 분주하여 각 웰에 생성된 결정체를 모두 용해시키고, 마이크로플레이트 리더기(Multiskan Go, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 계산식을 통해 세포생존율을 분석하였다. 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine, NAC)을 1 mM의 농도로 처리하여 비교군으로 이용하였다.
세포생존율(%)=[시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도]×100
그 결과, 1, 10, 50, 100, 150, 200 및 500 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물은 HaCaT 세포에서 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 수수꽃다리 캘러스 추출물의 항염 활성 분석
인간각질형성세포주(human keratinocyte cell line) HaCaT 세포는 피부 장벽을 형성하는 대표적인 표피세포로, 스트레스 환경에서 염증 반응 및 면역 반응에 관여한다.
(1) 염증성 사이토카인 생성 억제능 측정
수수꽃다리 캘러스 추출물의 자외선 조사에 의해 증가하는 염증성 사이토카인 생성 억제 효능을 측정하였다. HaCaT 세포를 1×106 cells/㎖로 100 mm 디쉬에 분주하여 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 500 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물을 전처리하고 16시간 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 PBS를 넣은 상태에서 자외선 조사기(UV crosslinker, Analytik Jena AG, Germany)를 이용하여 UVB를 80 mJ/㎠로 조사하고, 500 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물을 재처리하였다. 6시간 배양한 후, 세포배양 상등액을 회수하여 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1β(Interleukin-1β) 및 IL-6(Interleukin-6)의 생성량을 ELISA 키트(Abcam, R&D systems)를 사용하여 측정하였다. 양성 대조군으로는 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(NAC)을 1 mM의 농도로 처리하였으며, 대조군은 자외선 조사 없이 동일한 조건으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군 대비 자외선 단독 처리군의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성량은 현저하게 증가하였고, 자외선 단독 처리군 대비 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성량은 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 2).
(2) NF-κB 생성 억제능 측정
NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)는 염증 반응과 면역 체계를 조절하는 신호전달인자로, NF-κB 억제 단백질인 IκB(inhibitory κB)와 결합하여 세포질 내에서 비활성화 상태로 존재한다. 외부 염증 유발인자에 의해 NF-κB가 활성화되면 IκB와 세포질에서 분리되어 핵 내로 이동하여 유전자 전사인자를 활성화시켜 2차 염증 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.
수수꽃다리 캘러스 추출물의 자외선 조사에 의해 증가하는 NF-κB의 생성 억제 효능을 측정하였다. HaCaT 세포를 1×106 cells/㎖로 100 mm 디쉬에 분주하여 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하여 안정화 한 후, 500 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물을 전처리하고 16시간 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 PBS를 넣은 상태에서 자외선 조사기(UV crosslinker, Analytik Jena AG, Germany)를 이용하여 UVB를 80 mJ/㎠로 조사하고, 500 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물을 재처리하였다. 6시간 배양한 후, 세포질(C) 및 핵(N)내 단백질을 각각 추출하여 NF-κB 및 IκB에 대한 웨스턴 블랏을 수행하여 발현양을 분석하였다. 양성 대조군으로는 염증 치료제로 알려진 N-아세틸-L-시스테인(NAC)을 1 mM의 농도로 처리하였으며, 대조군은 자외선 조사 없이 동일한 조건으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 핵 내 NF-κB 단백질은 자외선 조사에 의해 발현이 증가하였고, 수수꽃다리 캘러스 추출물에 의해 감소하는 것을 확인하였다. 세포질 내 IκB 단백질은 자외선 조사에 의해 발현이 감소하였고, 수수꽃다리 캘러스 추출물에 의해 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 NF-κB 관련 단백질의 발현 조절 활성은 양성 대조군인 NAC보다 효과적인 것을 확인하였다(도 3).
이상의 결과를 통해 본 발명의 수수꽃다리 캘러스 추출물은 우수한 항염 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 수수꽃다리 캘러스 추출물의 피부 재생 효과 분석
수수꽃다리 캘러스 추출물의 피부 재생 효능을 측정하기 위해서 스크래치 분석(scratch assay)을 수행하였다. HaCaT 세포를 2.5×105 cells/㎖로 6웰 플레이트에 분주하여 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 200 ㎕ 팁(tip)을 이용하여 각 웰의 중앙을 균일하게 긁은 후, 배지를 모두 제거하고 PBS로 세척하였다. 이후, 1% FBS가 포함된 0.1 및 10 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물을 각각 1 ㎖씩 처리하고 24시간 배양한 후, 현미경을 이용하여 세포가 재생된 정도를 관찰하였다. 10% FBS 및 1% FBS 처리군을 비교군으로 이용하였다.
그 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군 대비 0.1 및 10 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군의 세포 재생율이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 10 ㎍/㎖의 수수꽃다리 캘러스 추출물 처리군은 10% FBS 처리군과 유사한 수준의 세포 재생율을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).
Claims (6)
- 수수꽃다리 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 수수꽃다리 캘러스 추출물은 자외선에 의해 생성된 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β) 및 IL-6(interleukin-6)의 발현을 억제시키고, 상처가 유도된 피부 세포의 재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는 항염증 및 피부 재생용 화장료 조성물.
- 수수꽃다리 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 재생용 건강기능식품 조성물.
- 수수꽃다리 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 상처 치료용 약학 조성물.
- 수수꽃다리 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 피부 상처 치료용 의약외품 조성물.
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| KR100955388B1 (ko) | 2009-05-25 | 2010-04-29 | (주)바이오에프디엔씨 | 염증 및 피부노화 방지용 화장료 조성물 및 그 제조방법 |
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2021
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| KR100955388B1 (ko) | 2009-05-25 | 2010-04-29 | (주)바이오에프디엔씨 | 염증 및 피부노화 방지용 화장료 조성물 및 그 제조방법 |
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| Title |
|---|
| CELL JOURNAL (Yakhteh). Vol.16. No.1. pp.25-30 |
| Cellular and Molecular Biology. Vol.53. No.6. pp.84-91 |
| Journal of the Science of Food and Agriculture. Vol.87. No.1. pp.160-166 |
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