KR102448072B1 - 항산화 활성을 가지는 병꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 조성물 - Google Patents
항산화 활성을 가지는 병꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 활성을 가지는 병꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 병꽃나무 추출물은 항산화 활성이 있으며 염증이 유도된 세포에서의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과 및 여드름 원인균이 처리된 세포에서의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과와 여드름 원인균에 대한 항균 활성이 우수하므로, 아토피 피부염 또는 여드름 개선용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 항산화 활성을 가지는 병꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 유전적, 환경적, 면역학적 원인에 의해 발생하고, 피부 가장 바깥에서 보호벽 역할을 하는 각질층에 이상이 생긴 것으로 건조한 기후에서 더욱 심해지는 알레르기 질환이다. 이러한 아토피 피부염의 원인은 주로 유전적인 요소가 많고 면역 반응과 관련되어 있는 것으로 밝혀져 있으며, 그 외에 건조한 피부, 정상인에 비해 쉽게 피부 가려움증을 느끼는 특성, 세균, 바이러스 및 곰팡이 등에 의한 감염, 정서적 요인 및 환경적 요인 등이 서로 복합적으로 작용하여 일어나는 것으로 알려졌다. 아토피 피부염에 동반되는 염증은 과도한 면역세포의 작용으로 인해 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α)와 인터루킨-1(interleukin-l, IL-1) 등의 염증성 사이토카인과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 대량생산하기 때문에 주변 조직의 손상을 야기한다. 아토피성 피부염에 대한 처방은 주로 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 등과 같은 약물요법이다. 스테로이드제(부신피질호르몬제)는 효과가 우수하지만 장기간 바르면 피부약화, 전신 호르몬증상, 중독성 등의 부작용이 나타날 수 있다. 따라서 아토피성 피부염에 효과가 있으면서도 부작용이 없는 천연물을 이용한 새로운 아토피성 피부염 치료를 위한 조성물 개발이 요구되고 있다.
여드름은 모낭 피지선의 염증성 질환으로, 개방성 면포, 구진, 낭종, 결절 등 다양한 피부 병변을 나타낸다. 여드름은 주로 안드로겐 호르몬의 이상 작용에 의해 과도하게 분비된 오일이 모낭에 정체되어 모낭의 입구를 막아 공기의 순환을 차단함으로써 모낭 내부에 상주하는 혐기성 세균이 과도하게 증식하여 발생한다. 특히, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)는 모낭 내부의 오일 성분들을 탐식하고, 그로 인해 자유지방산을 생산하여 모공을 자극하고 염증을 유발시킨다고 알려져있다. 세균에 의한 여드름 피부염의 치료에 있어서, 에리스로마이신(erythromycin), 테트라사이틀린(tetracycline), 신다마이신(cindamycine)과 같은 항균 물질들이 주로 사용되어 왔으나, 이러한 항균 물질은 장기간 사용시 여드름 원인균의 내성, 광과민 작용과 같은 부작용을 야기한다. 이에 대해, 최근에는 식물을 비롯한 천연자원으로부터 인체에 무해하고 부작용이 없으며 강력한 항여드름균 효과를 갖는 유효성분들을 탐색하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.
병꽃나무(Weigela subsessilis)는 인동과의 낙엽관목으로, 주로 산지의 숲속에서 서식한다. 추위와 대기오염 환경에 강하며 꽃이 화려하여 관상용으로 흔하게 재배되며 여러 품종이 개발되어 있다. 병꽃나무의 잎은 소화불량, 이뇨작용, 황달, 간의 염증, 저혈압에, 꽃은 산후통, 타박상, 피부 가려움증, 두드러기, 골절 등에 효과가 있다고 알려져있다.
한편, 한국등록특허 제1516866호에는 '떡쑥 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 치료 및 예방용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2096600호에는 '자가포식 활성 유도 화합물을 포함하는 여드름 피부의 염증 개선 화장료 및 치료용 약학 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '항산화 활성을 가지는 병꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 조성물'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 병꽃나무 캘러스 추출물의 항산화 효과를 확인하였고, 우수한 아토피 피부염 또는 여드름 개선 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 병꽃나무(Weigela subsessilis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 병꽃나무(Weigela subsessilis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 병꽃나무(Weigela subsessilis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 병꽃나무 추출물은 항산화 활성을 가지며, 염증이 유도된 세포에서의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과 및 여드름 원인균이 처리된 세포에서의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과가 우수하므로, 아토피 피부염 또는 여드름 개선용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 병꽃나무 캘러스 추출물의 RAW 264.7 세포(A) 및 HaCaT 세포(B)에서의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2는 병꽃나무 캘러스 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 확인한 결과이다.
도 3은 병꽃나무 캘러스 추출물의 활성 산소 소거능을 확인한 결과이다.
도 4는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 NO 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 5는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 염증성 사이토카인 생성 억제능을 확인한 결과로, A는 TNF-α의 생성량이고, B는 IL-1β의 생성량이며, C는 IL-6의 생성량이다.
도 6은 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 PGE2 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 7은 병꽃나무 캘러스 추출물의 아토피 피부염 개선 효과를 확인한 결과로, TNF-α및 IFN-γ로 염증이 유도된 HaCaT 세포에서의 IL-6 생성량(A) 및 IL-8 생성량(B)을 나타낸 것이다.
도 8은 병꽃나무 캘러스 추출물의 여드름 피부염 개선 효과를 확인한 결과로, 여드름 원인균을 처리한 HaCaT 세포에서의 IL-6 생성량(A) 및 IL-8 생성량(B)을 나타낸 것이다.
도 9는 여드름 원인균(Propionibacterium acnes)에 대한 병꽃나무 캘러스 추출물의 항균 활성을 확인한 결과이다. A는 DMSO를 점적한 디스크이고, B는 병꽃나무 캘러스 추출물 1 ㎎을 점적한 디스크이고, C는 병꽃나무 캘러스 추출물 2 ㎎을 점적한 디스크이며, D는 병꽃나무 캘러스 추출물 3 ㎎을 점적한 디스크이다.
도 2는 병꽃나무 캘러스 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 확인한 결과이다.
도 3은 병꽃나무 캘러스 추출물의 활성 산소 소거능을 확인한 결과이다.
도 4는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 NO 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 5는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 염증성 사이토카인 생성 억제능을 확인한 결과로, A는 TNF-α의 생성량이고, B는 IL-1β의 생성량이며, C는 IL-6의 생성량이다.
도 6은 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 PGE2 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 7은 병꽃나무 캘러스 추출물의 아토피 피부염 개선 효과를 확인한 결과로, TNF-α및 IFN-γ로 염증이 유도된 HaCaT 세포에서의 IL-6 생성량(A) 및 IL-8 생성량(B)을 나타낸 것이다.
도 8은 병꽃나무 캘러스 추출물의 여드름 피부염 개선 효과를 확인한 결과로, 여드름 원인균을 처리한 HaCaT 세포에서의 IL-6 생성량(A) 및 IL-8 생성량(B)을 나타낸 것이다.
도 9는 여드름 원인균(Propionibacterium acnes)에 대한 병꽃나무 캘러스 추출물의 항균 활성을 확인한 결과이다. A는 DMSO를 점적한 디스크이고, B는 병꽃나무 캘러스 추출물 1 ㎎을 점적한 디스크이고, C는 병꽃나무 캘러스 추출물 2 ㎎을 점적한 디스크이며, D는 병꽃나무 캘러스 추출물 3 ㎎을 점적한 디스크이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병꽃나무(Weigela subsessilis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부염은 아토피 피부염, 여드름, 알레르기 또는 습진 등일 수 있고, 바람직하게는 아토피 피부염 또는 여드름일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 피부염 개선용 화장료 조성물에서, 상기 병꽃나무 추출물은 병꽃나무 캘러스(callus) 추출물인 것을 특징으로 하지만 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 캘러스는 분화되지 않은 부정형의 세포 덩어리로, 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열 조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물의 분열 조직의 세포를 영양 배지에 넣고 배양하면 캘러스가 형성되며 이후 부정배가 형성되고 식물체로 분화된다.
또한, 상기 병꽃나무 추출물의 추출 용매는 당업계에 공지된 통상적인 추출용매를 사용할 수 있다. 바람직한 추출용매로는 DMSO(dimethyl sulfoxide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 병꽃나무 추출물의 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용하여 추출할 수 있다. 바람직한 추출방법은 초음파 추출이나, 이에 제한되지 않는다. 추출온도는 4~50℃인 것이 바람직하며, 20~30℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 0.5~5시간이 더욱 바람직하고, 1시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 병꽃나무 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액; 추출액의 희석액 또는 농축액; 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물; 조정제물; 또는 정제물 중 어느 하나를 포함할 수도 있다.
본 발명의 병꽃나무 추출물은 피부 세포의 성장을 촉진할 수 있고, 항산화 및 항염 활성이 우수하며, 염증 유발원에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제할 수 있고, 여드름 유발균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지고 있으므로 피부염을 효과적으로 개선시킬 수 있다.
본 발명의 피부염 개선용 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선절될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 병꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 피부염은 전술한 것과 같다.
본 발명의 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 피부염의 예방 또는 치료용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학조성물을 제공한다. 병꽃나무 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명의 병꽃나무 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 병꽃나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 피부염은 전술한 것과 같다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 병꽃나무 캘러스 추출물 제조
(1) 병꽃나무 캘러스 제조방법
기내 배양을 위한 무균 시료를 확보하기 위해 국내에서 채집한 병꽃나무 식물체를 준비하여, 오염 물질을 제거하고 흐르는 물에서 30분~1시간 동안 세척한 후 물기를 제거하였다. 이후, 줄기를 잘라 유리 배양병에 넣고, 70%(v/v) 에탄올 용액에서 1분 동안 흔들어 주면서 소독한 후, 멸균수로 1~2회 세척하고 상업용 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 0.4~0.8%(v/v)로 희석한 용액에 넣고 잘 흔들어 주면서 20분 동안 표면살균을 실시하여 무균 시료를 준비하였다. 표면살균이 이루어진 병꽃나무 시료는 살균된 여과지로 남아 있는 수분을 제거한 다음 무균작업대 내에서 가로 세로 1 cm 내외의 적절한 크기로 절취하여 절편들을 준비한 다음 미리 준비한 배양 배지에 10개 씩 3반복으로 치상하여 25℃, 암조건에서 배양하였다. 배양 배지는 1/2 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite), 0.4 ㎎/ℓ 티아민(thiamine), 0.6% 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 1 ㎎/ℓ의 BA(6-benzyladenine)와 0.3㎎/ℓ 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)가 첨가된 배지를 120℃에서 15분간 멸균 후 사용하였다.
병꽃나무 식물체 절편 시료들은 배양개시 2주 후부터 조직 절단면에서 팽창이 이루어지면서 연황색의 캘러스가 형성되기 시작하였다. 4주 배양 후에는 연황색 캘러스의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 크기가 약 1~2 mm 정도에 이르렀다. 6주 후에는 형성된 다수의 캘러스들이 더욱 증식이 활발해지는 것을 관찰하였다. 상기 캘러스는 동일 조성의 새로운 배지에 4주 주기로 계대배양하여 병꽃나무 줄기 유래 식물세포주를 확보하였다(KCTC PC4388).
(2) 병꽃나무 캘러스 추출물 제조방법
상기 방법으로 제조된 병꽃나무 캘러스 건조분말 100 ㎎에 DMSO(dimethyl sulfoxide) 1 ㎖을 첨가한 후 실온(25±5℃)에서 1시간 동안 초음파 처리하여 얻은 추출물을 1,2000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 취해 실험에 사용하였다.
실시예 1. 병꽃나무 캘러스 추출물의 세포독성 분석
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB, No. 40071)에서 분양받아 사용하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum, GE Healthcare Life Sciences, USA)가 함유된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였고, 3일에 한 번씩 계대배양을 수행하였다. RAW 264.7 세포를 5×103 cells/웰로 96 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 병꽃나무 캘러스 추출물을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 5 mg/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 각 웰에 넣고 4시간 동안 배양한 후, 상등액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100 ㎕씩 분주하여 각 웰에 생성된 결정체를 모두 용해시키고, 마이크로플레이트 리더기(Multiskan Go, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 계산식을 통해 세포생존율을 분석하였다.
세포생존율(%)=[시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도]X100
인간각질형성세포주 HaCaT 세포는 CLS에서 분양받아 사용하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum, GE Healthcare Life Sciences, USA)가 함유된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였고, 3일에 한 번씩 계대배양을 수행하였다. HaCaT 세포를 5×103 cells/웰로 96 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지에 병꽃나무 캘러스 추출물을 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 농도별로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 MTS(4,5-dimethylthiazol-2-yl-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 20 ㎕를 각 웰에 넣고 잘 섞어 준 후 4시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 리더기(Multiskan Go, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 계산식을 통해 세포생존율을 분석하였다.
세포생존율(%)=[시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도]X100
그 결과, 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖ 농도의 병꽃나무 추출물은 RAW 264.7 세포 및 HaCaT 세포에서 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 병꽃나무 캘러스 추출물의 항산화 활성 분석
(1) 자유 라디칼 소거능 측정
병꽃나무 캘러스 추출물의 자유 라디칼(free radical) 소거능은 DPPH를 이용하여 분석하였다. 먼저 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 에탄올에 용해하여 0.1 mM DPPH 용액을 준비하고, 병꽃나무 캘러스 추출물을 각각 10, 100, 250 및 500 ㎍/㎖ 농도가 되게 에탄올에 희석하였다. 각 농도의 병꽃나무 캘러스 추출물과 0.1 mM DPPH 용액을 1:1로 섞어 96 웰 플레이트에 처리하고 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음, 517 nm에서 흡광도를 측정하고 하기 계산식을 통해 자유 라디칼 소거능을 산출하였다.
DPPH 자유 라디칼 소거능(%) ={1-(A-B/C)X100
A : 시료와 DPPH를 반응시킨 후의 흡광도
B : 시료와 에탄올을 반응시킨 후의 흡광도
C : 에탄올과 DPPH를 반응시킨 후의 흡광도(blank)
그 결과, 병꽃나무 캘러스 추출물에 의한 자유 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인하였다(도 2).
(2) 활성산소 소거능 측정
병꽃나무 캘러스 추출물의 활성산소 소거능은 SOD(Superoxide dismutase) 측정 키트를 이용하여 분석하였다. 병꽃나무 캘러스 추출물의 최종농도가 10, 100, 250 및 500 ㎍/㎖가 되게 희석한 다음, 키트 내의 반응액에 섞어 96 웰 플레이트에 넣고 37℃에서 20분간 반응시켰다. 이후, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하고, 하기 계산식을 통해 활성산소 소거능을 산출하였다.
활성산소 소거능(%) = {[(C-D)-A-B)]/(C-D)}x100
A : 시료와 반응액을 반응시킨 후의 흡광도
B : 시료와 WST Working Solution을 반응시킨 후의 흡광도
C : 반응액의 흡광도
D : WST Working Solution의 흡광도
그 결과, 병꽃나무 캘러스 추출물에 의한 활성산소 소거능이 증가하는 것을 확인하였다(도 3).
상기 결과를 통해 병꽃나무 캘러스 추출물이 우수한 항산화 활성이 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 병꽃나무 캘러스 추출물의 항염 활성 분석
LPS(lipopolysaccharide)로 염증이 유도된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 항염 활성을 분석하였다.
(1) NO 생성 억제능 측정
NO(nitric oxide)는 면역계에서 방어분자로서 중요한 역할을 하지만, 과도하게 증가하면 NO를 생성하는 세포자신과 주위의 세포와 조직, 기관에 손상을 초래하여 면역질환을 포함한 관절염, 기관지염, 다발성 경화증과 같은 병적반응을 일으킨다. 따라서, 병꽃나무 캘러스 추출물의 항염 활성을 분석하기 위하여 NO 생성 억제능을 측정하였다. RAW 264.7 세포를 5×104 cells/웰로 24 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지에 병꽃나무 캘러스 추출물을 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 농도별로 희석하여 전처리하고 2시간 후, LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리스 시약(Griess Reagent System, Promega, USA)을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 50 ㎕에 그리스 시약 100 ㎕를 처리하고 30분 내에 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군의 NO 생성량은 대조군 대비 현저하게 증가하였고, 병꽃나무 추출물 처리군의 NO 생성량은 감소하였으며 특히, 500 ㎍/㎖의 병꽃나무 캘러스 추출물 처리군은 LPS 단독 처리군 대비 약 80.96% 가량의 NO 생성 억제능을 보이는 것을 확인하였다(도 4).
(2) 염증성 사이토카인의 생성 억제능 측정
RAW 264.7 세포를 5×104 cells/웰로 24 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM에 병꽃나무 캘러스 추출물을 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 농도별로 희석하여 전처리 후, 2시간 후에 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 배양하였다. 24시간 후 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액으로 염증성 사이토카인 TNF-α(tumor necrosis factor alpha), IL-1β(Interleukin 1 beta) 및 IL-6(Interleukin 6)의 생성량을 측정하였다. 각 사이토카인은 ELISA 키트(R&D systems Inc., USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선 R2 값이 0.9 이상이었다.
그 결과, LPS 단독 처리군은 대조군 대비 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성량이 현저하게 증가하였고, 병꽃나무 캘러스 추출물 처리군의 염증성 사이토카인 생성량은 감소하는 것을 확인하였다(도 5).
(3) PGE2 생성 억제능 측정
RAW 264.7 세포를 5×104 cells/웰로 24 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM에 병꽃나무 캘러스 추출물을 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 농도별로 희석하여 전처리 후, 2시간 후에 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 배양하였다. 24시간 후 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액으로 Prostaglandin E2(PGE2)의 생성량을 측정하였다. ELISA 키트(R&D systems Inc., USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선 R2 값이 0.9 이상이었다.
그 결과, LPS 단독 처리군은 대조군 대비 PGE2 생성량이 현저하게 증가하였고, 병꽃나무 캘러스 추출물 처리군의 PGE2의 생성량은 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
이상의 결과를 통해 본 발명의 병꽃나무 캘러스 추출물이 우수한 항염 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 병꽃나무 캘러스 추출물의 아토피 피부염 개선 효과 분석
피부 손상으로 인해 만성적으로 사이토카인이 생성되면 피부 건조를 유발시켜 아토피 피부염과 같은 피부질환을 일으키게 된다. 이에 TNF-α및 IFN-γ로 염증이 유도된 인간각질형성세포주인 HaCaT 세포에서의 병꽃나무 캘러스 추출물의 아토피 피부염 개선 효과를 확인하였다. HaCaT 세포를 1×105 cells/웰 농도로 24 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지에 병꽃나무 캘러스 추출물을 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 농도별로 희석하여 전처리 후, 4시간 후에 TNF-α(10 ng/㎖) 와 IFN-γ(10 ng/㎖)를 동시에 처리하여 배양하였다. 18시간 후 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액으로 염증성 사이토카인 IL-6 및 IL-8의 생성량을 측정하였다. 염증성 사이토카인은 ELISA 키트(BD Pharmingen, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선 R2 값이 0.9 이상이었다.
그 결과, 병꽃나무 캘러스 추출물에 의해 IL-6 및 IL-8의 생성량이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 7).
이상의 결과를 통해, 본 발명의 병꽃나무 캘러스 추출물이 사이토카인의 만성적 생성에 의한 아토피 피부염을 개선할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 병꽃나무 캘러스 추출물의 여드름 피부염 개선 효과 분석
프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, KCTC 6919)는 여드름 피부염을 유발하는 주요한 균으로, 피부에서 과잉 생산된 피지에 의해 막힌 모낭 내에서 증식하며, 피부 내의 단핵구를 활성화시키고 염증성 사이토카인의 분비를 촉진한다. P. acnes를 BHI(brain heart infusion) 배지에 접종하여, 혐기 조건으로 37℃에서 600nm에서의 흡광도가 1.0가 될 때까지 액체배지에서 배양한 후 상등액을 회수하여 5,000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리 후 다시 멸균된 PBS로 2회 세척하였다. P. acnes를 80℃ 에서 30분간 처리하여 사멸시킨 후 실험에 사용하였다.
(1) 염증성 사이토카인 생성 억제 억제능 측정
HaCaT 세포를 1×105 cells/웰 농도로 24 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지에 병꽃나무 캘러스 추출물을 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 전처리 후, 4시간 후에 P. acnes를 처리하여 배양하였다. 18시간 후 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액으로 염증성 사이토카인 IL-6 및 IL-8의 생성량을 측정하였다. 염증성 사이토카인은 ELISA 키트(BD Pharmingen, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선 R2 값이 0.9 이상이었다.
그 결과, P. acnes 단독 처리군은 대조군 대비 IL-6 및 IL-8의 생성량이 현저하게 증가하였고, 병꽃나무 캘러스 추출물 처리군의 염증성 사이토카인 생성량은 감소하는 것을 확인하였다(도 8).
(2) 항균 활성 측정
평판배지에 배양된 P. acnes 균주를 백금이로 취하여 BHI 액체배지 5 ㎖에 현탁한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이를 다시 평판배지에 100 ㎕ 분주하여 스프레더(spreader)로 균일하게 도말하였다. 페이퍼 디스크(paper disc, 8 mm. ADVANTEC, Japan)에 병꽃나무 캘러스 추출물을 1 ㎎/디스크, 2 ㎎/디스크 및 3 ㎎/디스크로 점적하여 P. acnes 균주가 도말된 상기 평판배지 위에 올려놓고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 생육 저지환(clear zone)의 직경을 측정하여 항균 활성을 확인하였다.
그 결과, 병꽃나무 캘러스 추출물은 1 ㎎/디스크에서는 직경 12mm, 2 ㎎/디스크에서는 직경 15mm, 3 ㎎/디스크에서는 직경 20mm의 생육 저지환을 확인함으로써 병꽃나무 캘러스 추출물은 P. acnes에 대한 항균 효과가 있음을 알 수 있었다(표 1, 도 9).
시료 | 생육 저지환의 직경(mm) | |
A | DMSO(Dimethyl sulfoxide) | 0 |
B | 병꽃나무 캘러스 추출물 1 ㎎/디스크 | 12 |
C | 병꽃나무 캘러스 추출물 2 ㎎/디스크 | 15 |
D | 병꽃나무 캘러스 추출물 3 ㎎/디스크 | 20 |
이상의 결과를 통해, 본 발명의 병꽃나무 캘러스 추출물이 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes)에 의한 여드름 피부염을 개선할 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (6)
- 병꽃나무(Weigela subsessilis) 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 의한 여드름 개선용 화장료 조성물.
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- 병꽃나무(Weigela subsessilis) 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 의한 여드름의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 병꽃나무(Weigela subsessilis) 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 의한 여드름 개선용 건강기능식품 조성물.
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Y. C. Yoo et al., Journal of Life Science 2016, 26(3), 338-345.* |
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