KR102406981B1 - 항산화 및 항염 활성을 가지는 개구리발톱 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 조성물 - Google Patents
항산화 및 항염 활성을 가지는 개구리발톱 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 및 항염 활성을 가지는 개구리발톱 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 개구리발톱 추출물은 항산화 및 항염 활성이 있으며 콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해 활성이 우수하므로, 피부주름 개선용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 항산화 및 항염 활성을 가지는 개구리발톱 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부의 노화는 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 일컫는 것으로, 연령이 증가함에 따라 자연적으로 유발되는 내인성 생리적 노화와 장기간 자외선 노출에 의해 진행되는 외인성 광노화(photoaging)로 구분할 수 있다. 내인성 피부 노화의 임상적 특징은 피부가 얇아지고 탄력성이 감소하는 것이며, 조직학적 소견으로는 표피 및 진피의 두께가 얇아지고 혈관이 감소하며 진피 내의 섬유아세포의 수가 감소하는 것이다. 또한, 외인성 피부 노화인 광노화의 임상적 특징은 피부가 거칠어지고 탄력성이 없어지며, 불규칙한 색소 침착이 발생하고 깊은 주름살이 증가하는 것이다.
주름의 생성 원인으로는 여러 가지가 보고되고 있는데, 우선 피부가 과다한 자외선에 노출되면 피부의 구성성분인 콜라겐(collagen) 분해가 촉진되어 피부가 탄력을 잃고 주름이 생성될 수 있다. 또한, 피부가 과도한 온도 변화, 습도 저하 또는 바람 등에 의해 지나치게 건조해지면 외부에 대한 방어벽으로서의 피부 기능이 저하되어 주름이 생기기도 한다. 그리고 피부가 활성 산소종이나 자유 라디칼에 노출되면 산화 작용에 의해 과산화 지질이 생성되고 그로 인해 콜라겐 등의 피부 구성 단백질이 변형되어 주름이 생길 수 있다. 이러한 외부적 요인과 내부적 요인에 의한 주름 발생을 억제하고자 다양한 화장품 조성물에 대한 연구가 이루어지고 있다. 하지만 화학 성분이 함유된 기능성 화장품의 경우, 피부 자극을 유발하여 민감성 피부에 적합하지 않은 문제점이 있는 바, 피부에 자극이 적고 친환경적인 천연 식물 유래의 기능성 화장품에 대한 관심이 집중되고 있다.
개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides)은 미나리아재비과에 속하는 식물로, 개구리망 또는 천규자라고도 한다. 주로 산기슭에서 자라며 높이는 20∼30 cm이고, 긴 잎자루가 있고 3장의 작은 잎이 나오는데 작은 잎의 잎자루가 짧고 3갈래로 깊게 갈라진 모양이 개구리의 물갈퀴와 닮아 개구리발톱이라고 불린다. 한방에서는 소변불리, 요로결석, 림프선염, 치질, 자궁염, 임질, 경기, 간질 등에 처방한다. 민간요법으로는 뱀이나 벌레 등에 물렸을 때 찧어서 상처에 붙인다고 알려져 있으며, 주로 한국, 일본 및 중국 등지에 분포한다.
한편, 한국등록특허 제1544176호에는 '제주 황칠나무 추출물의 피부 미백, 주름개선, 항염 및 항산화활성 안정화방법 및 안정화된 제주 황칠나무 추출물을 함유하는 화장료 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2144677호에는 '그린볼 사과 껍질추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용, 항염증용, 또는 주름개선용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '항산화 및 항염 활성을 가지는 개구리발톱 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 조성물'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 개구리발톱 부정근 추출물의 항산화 및 항염 효과를 확인하였고, 콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해 활성 분석을 통한 우수한 피부주름 개선 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 피부 외용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 개구리발톱 부정근 추출물은 항산화 및 항염 활성을 가지며, 콜라게나아제 및 엘라스타아제 저해 활성이 우수하므로, 피부주름 개선을 위한 화장료, 약학 또는 건강기능식품 조성물의 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 개구리발톱 부정근 추출물의 RAW 264.7 세포에서의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 2는 개구리발톱 부정근 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 확인한 결과이다.
도 3은 개구리발톱 부정근 추출물의 활성 산소(과산화물, superoxide) 소거능을 확인한 결과이다.
도 4는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 개구리발톱 부정근 추출물의 NO 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 5는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 개구리발톱 부정근 추출물의 염증성 사이토카인 생성 억제능을 확인한 결과로, A는 TNF-α의 생성량이고, B는 IL-1β의 생성량이며, C는 IL-6의 생성량이다.
도 6은 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 개구리발톱 부정근 추출물의 PGE2 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 7은 개구리발톱 부정근 추출물의 피부주름 개선 효과를 확인한 결과로, A는 콜라게나아제 저해 활성을 나타낸 것이고, B는 엘라스타아제 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 개구리발톱 부정근 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 확인한 결과이다.
도 3은 개구리발톱 부정근 추출물의 활성 산소(과산화물, superoxide) 소거능을 확인한 결과이다.
도 4는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 개구리발톱 부정근 추출물의 NO 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 5는 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 개구리발톱 부정근 추출물의 염증성 사이토카인 생성 억제능을 확인한 결과로, A는 TNF-α의 생성량이고, B는 IL-1β의 생성량이며, C는 IL-6의 생성량이다.
도 6은 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 개구리발톱 부정근 추출물의 PGE2 생성 억제능을 확인한 결과이다.
도 7은 개구리발톱 부정근 추출물의 피부주름 개선 효과를 확인한 결과로, A는 콜라게나아제 저해 활성을 나타낸 것이고, B는 엘라스타아제 저해 활성을 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 피부주름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 개구리발톱 추출물은 개구리발톱 부정근 추출물인 것을 특징으로 하지만 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 부정근(adventitious root)은 개구리발톱의 조직 일부를 떼어내어 무균상태로 기내도입하여 식물의 전형성능(totipotency)에 의해 형성되는 부정근을 말하며, 개구리발톱 부정근은 일정기간 동안 사전배양(seed culture)한 후, 생물반응기에서 본 배양함으로써 대량생산이 가능하며, 상기와 같은 기내배양 방법에 의해 생산된 개구리발톱 부정근은 잔류농약이나 중금속 등의 유해성분이 근본적으로 배제되어, 자연상태의 생육과정에서 발생 가능한 병충해 및 바이러스의 감염으로부터 안전한 장점이 있다.
또한, 상기 개구리발톱 추출물의 추출 용매는 당업계에 공지된 통상적인 추출용매를 사용할 수 있다. 바람직한 추출용매로는 DMSO(dimethyl sulfoxide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 개구리발톱 추출물의 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용하여 추출할 수 있다. 바람직한 추출방법은 초음파 추출이나, 이에 제한되지 않는다. 추출온도는 4~50℃인 것이 바람직하며, 20~30℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 0.5~5시간이 더욱 바람직하고, 1시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 개구리발톱 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액; 추출액의 희석액 또는 농축액; 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물; 조정제물; 또는 정제물 중 어느 하나를 포함할 수도 있다.
본 발명에 있어서, '주름개선'이라 함은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 발명의 개구리발톱 추출물은 자유라디칼 또는 활성산소종의 소거능이 우수하고, 다양한 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있으며 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 활성을 저해하는 활성이 우수한 것이 특징이다.
본 발명의 조성물은 항염 및 항산화 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 피부주름 개선용 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 피부 외용제를 제공한다.
본 발명의 용어 "피부 외용제"는 일반적으로 피부 외용에 사용하는 물질 전반을 포함하는 포괄하는 개념으로, 피부 외용제 제형의 비제한적인 예로는 경고제(PLASTERS), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질, 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 또는 서방화제제가 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제는 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 제제화된 비경구 투여제일 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 외용제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
각 제형에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.
또한, 본 발명은 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 개구리발톱 부정근 추출물 제조
(1) 개구리발톱 부정근 제조방법
기내 배양을 위한 무균 시료를 확보하기 위해 국내에서 채집한 개구리발톱 식물체를 준비하여, 오염 물질을 제거하고 흐르는 물에서 30분~1시간 동안 세척한 후 물기를 제거하였다. 이후, 잎자루(petiole)를 잘라 유리 배양병에 넣고 70%(v/v) 에탄올 용액에서 1분 동안 흔들어 주면서 소독한 후, 멸균수로 1~2회 세척하고 상업용 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 0.4~0.8%(v/v)로 희석한 용액에 넣고 잘 흔들어 주면서 20분 동안 표면살균을 실시하여 무균 시료를 준비하였다. 표면살균이 이루어진 개구리발톱 시료는 살균된 여과지로 남아 있는 수분을 제거한 다음 무균작업대 내에서 가로 세로 1 cm 내외의 적절한 크기로 절취하여 절편들을 준비한 다음 미리 준비한 배양 배지에 10개 씩 3반복으로 치상하여 25℃, 암조건에서 배양하였다. 배양 배지는 MS 배지(Murashige and Skoog, 1962)에 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite), 0.4 ㎎/ℓ 티아민(thiamine), 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 0.1 ㎎/ℓ NAA(α-naphthaleneacetic acid)가 첨가된 배지를 120℃에서 15분간 멸균 후 사용하였다.
개구리발톱 식물체 절편 시료들은 배양개시 2주 후부터 조직 절단면에서 팽창이 이루어지면서 연황색의 부정형의 뿌리들이 형성되기 시작하였다. 4주 배양 후에는 부정근의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 크기가 약 5 mm 정도에 이르렀다. 6주 후에는 형성된 다수의 부정근들이 더욱 증식이 활발해지는 것을 관찰하였다. 상기 부정근은 동일 조성의 새로운 배지에 4주 주기로 계대배양하여 개구리발톱 잎자루 유래 식물세포주를 확보하였다(KCTC PC2040).
(2) 개구리발톱 부정근 추출물 제조방법
상기 방법으로 제조된 개구리발톱 부정근의 건조분말 100 ㎎에 DMSO(dimethyl sulfoxide) 1 ㎖을 첨가한 후 실온(25±5℃)에서 1시간 동안 초음파 처리하여 얻은 추출물을 1,2000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 취해 실험에 사용하였다.
실시예 1. 개구리발톱 부정근 추출물의 세포독성 분석
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB, No. 40071)에서 분양받아 사용하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum, GE Healthcare Life Sciences, USA)가 함유된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Welgene, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였고, 3일에 한 번씩 계대배양을 수행하였다. RAW 264.7 세포를 5×103 cells/웰로 96 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 5 mg/㎖의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 각 웰에 넣고 4시간 동안 배양한 후, 상등액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 100 ㎕씩 분주하여 각 웰에 생성된 결정체를 모두 용해시키고, 마이크로플레이트 리더기(Multiskan Go, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 계산식을 통해 세포생존율을 분석하였다.
세포생존율(%)=[시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도]X100
그 결과, 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물은 RAW 264.7 세포에서 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 개구리발톱 부정근 추출물의 항산화 활성 분석
(1) 자유 라디칼 소거능 측정
개구리발톱 부정근 추출물의 자유 라디칼(free radical) 소거능은 DPPH를 이용하여 분석하였다. 먼저 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 에탄올에 용해하여 0.1 mM DPPH 용액을 준비하고, 에탄올로 희석한 10, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 준비하였다. 각 농도의 개구리발톱 부정근 추출물과 0.1 mM DPPH 용액을 1:1로 섞어 96 웰 플레이트에 처리하고 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음, 517 nm에서 흡광도를 측정하고 하기 계산식을 통해 자유 라디칼 소거능을 산출하였다.
DPPH 자유 라디칼 소거능(%) =｛1-(A-B/C)}X100
A : 시료와 DPPH를 반응시킨 후의 흡광도
B : 시료와 에탄올을 반응시킨 후의 흡광도
C : 에탄올과 DPPH를 반응시킨 후의 흡광도(blank)
그 결과, 개구리발톱 부정근 추출물에 의한 자유 라디칼 소거능이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2).
(2) 활성산소 소거능 측정
개구리발톱 부정근 추출물의 활성산소 소거능은 SOD(Superoxide dismutase) 측정 키트를 이용하여 분석하였다. 10, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 준비한 다음, 키트 내의 반응액에 섞어 96 웰 플레이트에 넣고 37℃에서 20분간 반응시켰다. 이후, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하고, 하기 계산식을 통해 활성산소 소거능을 산출하였다.
활성산소 소거능(%) = {[(C-D)-A-B)]/(C-D)}x100
A : 시료와 반응액을 반응시킨 후의 흡광도
B : 시료와 WST Working Solution을 반응시킨 후의 흡광도
C : 반응액의 흡광도
D : WST Working Solution의 흡광도
그 결과, 개구리발톱 부정근 추출물에 의한 활성산소 소거능이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3).
상기 결과를 통해 개구리발톱 부정근 추출물이 우수한 항산화 활성이 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 개구리발톱 부정근 추출물의 항염 활성 분석
LPS(lipopolysaccharide)로 염증이 유도된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서의 개구리발톱 부정근 추출물의 항염 활성을 분석하였다.
(1) NO 생성 억제능 측정
NO(nitric oxide)는 면역계에서 방어분자로서 중요한 역할을 하지만, 과도하게 증가하면 NO를 생성하는 세포자신과 주위의 세포와 조직, 기관에 손상을 초래하여 면역질환을 포함한 관절염, 기관지염, 다발성 경화증과 같은 병적반응을 일으킨다. 따라서, 개구리발톱 부정근 추출물의 항염 활성을 분석하기 위하여 NO 생성 억제능을 측정하였다. RAW 264.7 세포를 5×104 cells/웰로 24 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 2시간 동안 전처리한 다음 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리스 시약(Griess Reagent System, Promega, USA)을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 50 ㎕에 그리스 시약 100 ㎕를 처리하고 30분 내에 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군의 NO 생성량은 대조군 대비 현저하게 증가하였고, 개구리발톱 부정근 추출물 처리군의 NO 생성량은 감소하였으며 특히, 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물 처리군은 LPS 단독 처리군 대비 약 43% 가량의 NO 생성 억제능을 보이는 것을 확인하였다(도 4).
(2) 염증성 사이토카인의 생성 억제능 측정
RAW 264.7 세포를 5×104 cells/웰로 24 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 2시간 동안 전처리한 다음 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액으로 염증성 사이토카인 TNF-α(tumor necrosis factor alpha), IL-1β(Interleukin 1 beta) 및 IL-6(Interleukin 6)의 생성량을 측정하였다. 각 사이토카인은 ELISA 키트(R&D systems Inc., USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선 R2 값이 0.9 이상이었다.
그 결과, LPS 단독 처리군은 대조군 대비 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성량이 현저하게 증가하였고, 개구리발톱 부정근 추출물 처리군의 염증성 사이토카인 생성량은 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5).
(3) PGE2 생성 억제능 측정
RAW 264.7 세포를 5×104 cells/웰로 24 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 희석한 50, 100, 250 및 500 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 2시간 동안 전처리한 다음 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 12,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻어진 상층액으로 염증 지표인 Prostaglandin E2(PGE2)의 생성량을 측정하였다. ELISA 키트(R&D systems Inc., USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선 R2 값이 0.9 이상이었다.
그 결과, LPS 단독 처리군은 대조군 대비 PGE2 생성량이 현저하게 증가하였고, 개구리발톱 부정근 추출물 처리군의 PGE2의 생성량은 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
이상의 결과를 통해 본 발명의 개구리발톱 부정근 추출물이 우수한 항염 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 개구리발톱 부정근 추출물의 주름개선 효과 분석
(1) 콜라게나아제의 저해 활성 측정
콜라게나아제(collagenase) 저해 활성은 EnzChek® 젤라티나아제/콜라게나아제 어세이 키트(ThermoFisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 100, 500 및 1,000 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 준비한 다음, 키트 내 기질과 콜라게나아제 효소를 96 웰 플레이트에 넣고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 형광 플레이트 분석기를 이용하여 흡수 파장은 495 nm이고, 발광 파장은 515 nm로 하는 조건으로 형광강도를 측정하였고, 콜라게나아제 저해 활성은 하기 계산식을 통해 산출하였다.
콜라게나아제 저해 활성(%) = {1-(S-B)/C}×100
(S: 시료의 흡광도, B: blank의 흡광도, C: control의 흡광도)
그 결과, 개구리발톱 부정근 추출물에 의해 콜라게나아제 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 7A).
(2) 엘라스타아제의 저해 활성 측정
엘라스타아제(elastase) 저해 활성은 EnzChek® 엘라스타아제 어세이 키트(ThermoFisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 100, 500 및 1000 ㎍/㎖의 개구리발톱 부정근 추출물을 준비한 다음, 키트 내 기질과 엘라스타아제 효소를 96 웰 플레이트에 넣고 25℃에서 50분간 반응시켰다. 형광 플레이트 분석기를 이용하여 흡수 파장은 505 nm이고, 발광 파장은 515 nm로 하는 조건으로 형광강도를 측정하였고, 엘라스타제 저해 활성은 하기 계산식을 통해 산출하였다.
엘라스타아제 저해 활성(%) = {1-(S-B)/C}×100
(S: 시료의 흡광도, B: blank의 흡광도, C: control의 흡광도)
그 결과, 개구리발톱 부정근 추출물에 의해 엘라스타아제 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 7B).
상기의 결과를 통해 본 발명에 따른 개구리발톱 부정근 추출물이 피부주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.
Claims (6)
- 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 부정근 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항염 및 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
- 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 부정근 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 피부 외용제.
- 개구리발톱(Semiaquilegia adoxoides) 부정근 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 건강기능식품 조성물.
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| KR100789634B1 (ko) * | 2001-07-05 | 2007-12-27 | 주식회사 엘지생활건강 | 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 식물 추출물을 함유하는피부미백용 화장료 |
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