KR102298371B1 - 명월초 캘러스 유래 pdrn을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

명월초 캘러스 유래 pdrn을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN(polydeoxyribonucleotide)을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물; 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물; 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터, 피부 염증 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물; 및 상기 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 명월초 캘러스 유래 PDRN은 각질형성세포 증식 유도 효과, 상처 재생 효과, H2O2에 의한 세포 손상 회복 효과, 자외선으로부터의 세포 보호 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 섬유아세포 증식 유도 효과 및 엘라스타아제 활성 억제 효과를 나타내어, 피부 상태 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

명월초 캘러스 유래 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 그 제조방법 {Composition Comprising PDRN from Gynura　Procumbens Callus for Improving Skin Conditions and Preparation Method Thereof}
본 발명은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN(polydeoxyribonucleotide)을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물; 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물; 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터, 피부 염증 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물; 및 상기 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
명월초(Gynura procumbens)는 과꽃과의 일종으로 서식지는 파푸아뉴기니를 포함한 동남아시아 일대이며, 고도 1,000 내지 1,200m에서 잘 자란다. 한국에서 명월초는 추위에 약한 약초로 대한민국 제주도 남쪽인 서귀포에서 자생하는 다년생 약초로 생명력이 강하고 해풍과 많은 햇빛을 필요로 하는 약용식물로 알려져 있다. 진시황의 불로초라 불리는 명월초는 삼붕냐와(Sambung Nyawa)라고도 불리는데, 인도네시아어로 Sambung은 영속성, Nyawa는 생명을 나타내므로, 즉 삼붕냐와는 생명을 이어주는 잎(영어명칭: Life Sustainable Plant)이라는 뜻을 가진 약용식물로서 중국에서는 전통 약초로 사용하고있다. 중국 및 동남아 전통의학에 따르면 명월초는 기침, 기관지염, 폐결핵, 혈액순환, 타박상에 효능이 있다고 알려져 있으며, 동남아시아 및 인도네시아, 태국에서는 민간요법과 식용 및 발진, 신장병, 콜레스테롤, 편두통, 변비, 고혈압, 당뇨병 및 암 예방 및 치료에 이용하고있다. 건강증진을 위한 특정 야채로 간주되어 귀빈 접대용으로 이용되었다. 명월초의 생리활성 및 항염에 대한 연구를 보면 명월초의 물 추출물이 쥐 모델에서 항고혈압 활성과 항염효과가 있다고 보고되었다.
한편, 식물의 줄기세포라고도 불리는 식물 캘러스는 식물의 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리를 의미하는 것으로, 식물이 상처가 있을 때 상처 주변에서 생성되는 분열조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물은 크게 세포 분열을 하는 분열조직과 그렇지 않는 영구 조직으로 구성되어 있으며, 이중 처음 분열 조직의 세포를 영양 배지에 넣고 키우면 캘러스가 형성된다. 이후 부정배가 형성되면서 식물체로 분화된다. 식물줄기세포와 같은 생리적 특성을 갖는 식물 캘러스 세포는 분화가 완료된 식물체와 달리 인체 피부에 유효한 다종의 파이토케미컬들을 함유하고 있어 코스메슈티컬 및 바이오화장품의 핵심소재로 활용되고 있다.
최근 코스메슈티컬 및 바이오화장품의 핵심소재로 사용되는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, 이하 'PDRN'이라 한다.)는 연어 정액으로부터 추출한 DNA로 제조하고 있으며, 50-2000 염기쌍의 데옥시리보뉴클레오티드폴리머를 함유하고 있다. PDRN은 주로 피부이식으로 인한 상처의 치료 및 조직수복에 사용하고 있지만, 마땅한 치료법이 없는 일부 조직재생이나 염증치료에도 의료진 판단에 따라 사용되고 있으며, 당뇨병성 발 궤양, 흉터, 혈관 부전 및 여성 패턴 탈모와 같은 광범위한 장애의 치료에 사용되는 것으로 알려져있다. 또한 피부재생 신호전달체인 A2 수용체를 자극해 각종성장인자 분비촉진, VEGF(혈관내피세포증식인자)에 의한 모세혈관의 생성, 혈액순환 개선, 항 염증 작용 및 모세혈관 누출 방지 기능을 하는 성분으로 알려져 있다.
PDRN은 연어 정액으로부터 추출한 동물성 원료로 그 효과가 입증되어 있지만, 동물성 성분을 포함하지 않은 `비건` 제품과 동물실험을 거치지 않은 `크루얼티프리(Cruelty Free)` 화장품에는 적합하지 않다. 특히, 비건 인증은 동물을 통해 얻을 수 있는 그 어떤 원료도 사용하지 않은 제품에만 부여되기 때문에, 동물 보호뿐 아니라 피부에도 자극이 적다는 장점이 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 식물성 소재를 이용한 피부 상태 개선용 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 명월초에서 유도된 캘러스로부터 PDRN을 제조하고, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 각질형성세포 증식 유도 효과, 상처 재생 효과, H2O2에 의한 세포 손상 회복 효과, 자외선으로부터의 세포 보호 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 섬유아세포 증식 유도 효과 및 엘라스타아제 활성 억제 효과를 나타내어, 피부 상태 개선에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-2047234호 대한민국 등록특허 제10-1940056호
본 발명의 목적은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN(polydeoxyribonucleotide)을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터, 피부 염증 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 명월초 잎으로부터 유도된 명월초 캘러스를 사용하여 명월초 캘러스 유래 PDRN 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN(polydeoxyribonucleotide)을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "명월초(Gynura procumbens)"는 과꽃과의 식물로 동남아시아 아열대 지대에서 주로 서식하며 해발 1000m∼1200m의 고지대에서 잘 자란다. 명월초는 삼붕초 또는 삼붕냐와(Sambung Nyawa)라고도 불린다. 명월초는 항산화 물질과　감로산,　게르마늄 등의　26개의 천연유기질 성분이 풍부해 혈관 건강,　당뇨,　이뇨작용과 위장 건강에 좋은 것으로 알려져 있다.　
본 발명의 용어 "캘러스"는 식물의 조직화되지 않은 유세포 덩어리로, 식물체에 상처가 났을 때 생기는 조직이다. 본 발명의 명월초 캘러스는 명월초의 줄기, 뿌리, 잎, 열매, 꽃 또는 이들의 조합으로부터 유도된 캘러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 캘러스를 유도하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 캘러스를 유도하기 위해 기본 MS배지에 피클로람, 또는 피클로람 및 6-벤질아미노퓨린이 포함된 배지를 사용하여 암상태로 유도하는 방법을 사용하였다.
본 발명의 용어 "PDRN"은 폴리디옥시리보뉴클레오티드 (polydeoxyribonucleotide)를 지칭하는 것으로, 짧은 디옥시리보뉴클레오티드 (short deoxyribonucleotide)의 혼합물(mixture)이다. 즉, DNA사슬을 일정 크기로 분획화하여 만든 저분자량 DNA 복합체(Low molecular weight DNA complex)로, 본 발명에서 사용되는 PDRN은 2000bp 이하의 크기를 가지고, 74kDa 이하의 분자량을 가질 수 있다. 용어 "PDRN"은 상기 핵산 단편의 일종일 수 있다. 본 발명의 상기 PDRN을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.
본 발명의 용어 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 용어 "개선"은 본 발명에 따른 명월초 캘러스 유래 PDRN을 사용하여 피부 상태가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지, 피부 탄력 유지, 자외선으로부터의 피부 손상 예방, 자외선으로부터의 피부 보호, 산화 독성으로부터의 피부 세포 보호를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "피부 재생"은 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대해 피부 조직의 회복 과정을 의미한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부적 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "피부 미백"은 피부에 멜라닌 세포가 증가하고 그로 인해 피부에 멜라닌 색소가 과도하게 침착되는 것을 방지하거나, 기존에 침착된 멜라닌 색소를 엷게 하는 기능을 일컫는다. 이에 따라, 과도한 멜라닌 색소의 침착으로 생기는 기미나 주근깨의 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 용어 "주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하므로, 이를 분비하는 엘라스타아제 및/또는 콜라게나아제 활성의 억제 효과를 가지는 경우 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "피부 노화 방지"는 시간이 흐름에 따라 신체의 생리적 변화가 발생하여 나타나는 자연적 노화인 연대학적 노화(내인성 노화)와 햇빛에 노출되는 부위에서 발생하는 광노화(광인성 노화)를 예방 또는 지연시키는 것 모두를 의미한다. 피부 노화를 억제하기 위해서는 피부를 외부의 유해환경으로부터 보호해야 함은 물론 피부세포를 활성화시켜 콜라겐, 엘라스틴 등의 생체 합성 단백질의 합성을 촉진함으로써 주름의 형성을 최대한 억제시켜야 한다. 특히 피부의 구조 중에서 진피층에는 교원섬유인 콜라겐과 탄력섬유인 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨어지면서 엘라스틴이 분해효소인 엘라스타아제(elastase)에 의해 분해되면서 피부가 쳐지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 따라서, 피부노화의 주 원인 중 하나인 엘라스틴의 분해를 억제하여 피부노화를 억제할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 피부 노화는 UV-B 자외선으로부터 야기되는 광노화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 햇빛에 포함된 280nm 내지 40nm 파장의 빛에 의하여 피부 세포의 광노화가 진행될 수 있다. 그 중에서도 특히 280nm 내지 320nm 범위의 파장을 갖는 UV-B와 같은 자외선의 조사에 의하여 피부나 섬유의 손상이 발생할 수 있으며 피부가 까맣게 타는 그을음 현상이 발생할 수 있다. UV-B가 조사되면 피부 세포 내의 활성 산소(예: H2O2) 및 자유 라디칼의 축적이 촉진되며, 라디칼에 의해 세포 내 신호전달 체계를 자극하여 DNA, 단백질, 지질과 같은 생체 분자에 산화적 스트레스를 유발할 수 있고, 이로 인하여 피부 조직의 손상이 발생될 수 있다. 피부 세포의 산화적 스트레스가 증가하면, 표피의 각질세포나 진피의 섬유아세포에 자극이 발생하고 일련의 세포 내 신호 전달 과정을 거쳐 콜라겐 분해효소인 MMP(matrix metalloproteinase)와 같은 유전자의 발현이 증가될 수 있고, 피부의 주요 구성성분으로 진피의 90%를 차지하며 피부에 강도, 장력을 부여해 외부 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 콜라겐(collagen)의 감소가 유발되어, 이에 따라 피부의 노화나 주름이 형성될 수 있다.
본 발명의 상기 피부 상태 개선은 세포증식 촉진 활성에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로 인간 각질형성세포의 증식 촉진 또는 섬유아세포의 증식 촉진일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 피부 상태 개선은 활성 산소에 의한 세포 손상의 회복에 의한 것일 수 있으며, 구체적으로 활성 산소는 과산화수소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 피부 상태 개선은 UV-B 자외선에 의한 세포 손상의 회복에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 피부 상태 개선은 멜라닌 합성 억제 활성에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 상기 피부 상태 개선은 엘라스틴을 분해하는 엘라스타아제(elastase)의 활성 저해에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선 효과를 가지는 한, 상기 명월초 캘러스 유래 PDRN을 다양한 함량으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 명월초 캘러스 유래 PDRN 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 화장료 조성물에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 실험예에서 명월초 캘러스 유래 PDRN은 각질형성세포 증식을 유도하고(도 1), 상처를 재생시키며(도 2), H2O2에 의한 세포 손상을 회복시키고(도 3), 자외선으로부터 세포를 보호하며(도 4), 섬유아세포 증식을 유도하여(도 7) 피부 재생, 주름 개선 및 피부 노화 방지 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 본 발명의 실험예에서 명월초 캘러스 유래 PDRN은 멜라닌 합성을 억제하여(도 5 및 도 6) 미백효과를 나타냄을 확인하였다. 추가적으로, 본 발명의 실험예에서 명월초 캘러스 유래 PDRN은 엘라스타아제 활성 억제 효과를 나타내어(도 8), 주름 개선 및 피부 노화 방지 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 명월초 캘러스 유래 PDRN은 피부 상태 개선용으로 사용할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품을 제공한다.
상기 "명월초", "캘러스", "PDRN", "유효성분" 및 "개선"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지 또는 피부 탄력 유지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "피부 재생", "피부 미백", "주름 개선" 및 "피부 노화 방지"는 전술한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 피부 노화는 UV-B 자외선으로부터 야기되는 광노화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 광노화는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 대한민국 약사법에 따르면　의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의　의약외품　조성물은 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 필터충진제의 형태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 명월초 캘러스 유래 PDRN을 의약외품　첨가물로 사용할 경우, 상기 명월초 캘러스 유래 PDRN을 그대로 첨가하거나 다른　의약외품　또는　의약외품　성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN을 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터, 피부 염증 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "명월초", "캘러스", "PDRN" 및 "유효성분"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "피부 상처" 및 "피부 흉터"는 피부조직의 콜라겐 총량 증가로 인하여 치료할 수 있는 모든 질환을 의미한다. 상기　피부　상처 및 피부　흉터의 비제한적인 예로 찰과상, 찰과상에 의해 야기되는 흉터 등을 들 수 있다.
본 발명의 용어 "피부 염증"은 면역 자극에 의해 유발되는 모든 질환을 의미한다. 상기　피부　염증 질환의 비제한적인 예로 아토피성　피부염, 습진, 지루성　피부염, 건선, 여드름 등을 들 수 있다.
본 발명의 용어 "피부 색소 침착"은 멜라닌의 생성 증가로 인한　피부　색소 침착으로 유발되는 모든 질환을 의미한다. 상기　피부　색소 침착 질환의 비제한적인 예로 기미, 주근깨, 반점, 일광 색소반, 약물 사용 후의 색소 침착, 염증 후의 색소 침착, 임신성 색소 침착 등을 들 수 있다.
본 발명의 용어 "예방"은 본 발명의 상기 명월초 캘러스 유래 PDRN을 개체에 투여 또는 도포하여 피부 상처, 피부 흉터, 피부 염증 및 피부 색소 침착의 피부 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"는 본 발명의 상기 명월초 캘러스 유래 PDRN을 개체에 투여 또는 도포하여 피부 상처, 피부 흉터, 피부 염증 및 피부 색소 침착의 피부 질환이 호전 또는 완화되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실 리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 피클로람, 또는 피클로람 및 6-벤질아미노퓨린이 함유된 배지에서 명월초 잎을 사용하여 명월초 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 명월초 캘러스를 파쇄한 후, 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (c) 추출된 게놈 DNA를 초음파를 처리하여 PDRN을 수득하는 단계; 및 (d) 수득된 PDRN에 화장료용으로 허용된 담체, 희석제, 보조제 및 부형제 중 하나 이상을 추가하는 단계를 포함하는 상기 피부 상태 개선용 화장료 조성물 제조방법을 제공한다.
상기 "명월초", "캘러스" 및 "PDRN" 은 전술한 바와 같다.
본 발명의 명월초 캘러스를 유도하는 단계에서 사용되는 피클로람 및 6-벤질아미노퓨린이 함유된 배지에서 피클로람과 6-벤질아미노퓨린의 농도비는 1:1, 10:1, 10:0.5, 10:0.1 또는 10:0일 수 있고, 구체적으로 10:0일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지는 구체적으로 MS 배지, 수크로스, 젤란 검(gellan gum), 피클로람 및/또는 6-벤질아미노퓨린이 함유된 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, MS 배지, 수크로스 및 젤란 검(gellan gum) 의 부피비는 2:15:1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 단계 (a) 후, 유도된 명월초 캘러스를 피클로람이 함유된 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 피클로람이 함유된 배지는 구체적으로 MS 배지 및 피클로람이 2000:1의 부피비로 혼합된 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 배양된 명월초 캘러스는 액체 질소를 사용하여 파쇄될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 5g의 명월초 캘러스를 파쇄하여 사용하였다.
본 발명의 상기 단계 (b)에 따른 게놈 DNA를 추출하는 단계는 파쇄된 명월초 캘러스에 DNA 추출 버퍼(extraction buffer)를 첨가하여 상온에서 반응시키는 단계; 반응물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계; 상기 상등액에 알코올을 첨가하여 상온에서 반응시키는 단계; 및 상기 상등액 및 알코올의 반응물을 원심분리하여 침전된 DNA를 수득하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 상기 알코올은 이소프로판올 또는 75% 에탄올일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 이소프로판올일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 상기 Extraction buffer(EB)는 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 1% SDS 및 10mM b-머캅토에탄올을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 파쇄된 캘러스에 EB 25ml를 첨가한 후, 상온에서 30분간 반응시켰다.
본 발명에서 파쇄된 명월초 캘러스와 EB의 반응물은 9,000 내지 14,000rpm으로 원심분리될 수 있으며, 원심분리 후 상등액을 수득한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상온에서 12,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하였다.
본 발명의 상기 상등액에 알코올을 첨가하여 상온에서 반응시킨다. 본 발명의 일 실시예에서는 상등액과 동일 부피비의 이소프로판올을 첨가하고, 상온에서 10분 동안 반응시켰다.
본 발명의 상기 상등액 및 알코올의 반응물은 9,000 내지 14,000rpm으로 원심분리될 수 있으며, 원심분리 후 침전된 DNA를 수득한다. 본 발명의 일 실시예에서는 4℃에서 12,000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 침전된 DNA를 수득하였다. 수득된 DNA는 70% 에탄올로 두 번 세척 후 건조시킬 수 있으며, elution buffer에 용해시킬 수 있다.
본 발명의 상기 단계 (c)는 20 내지 30% Amp 조건에서 80 내지 120초 동안 게놈 DNA에 초음파를 처리하여 게놈 DNA를 분획화하는 것일 수 있고, 구체적으로 25% Amp 조건에서 100초 동안 초음파를 처리하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 명월초 캘러스 유래 PDRN은 각질형성세포 증식 유도 효과, 상처 재생 효과, H2O2에 의한 세포 손상 회복 효과, 자외선으로부터의 세포 보호 효과, 멜라닌 합성 억제 효과, 섬유아세포 증식 유도 효과 및 엘라스타아제 활성 억제 효과를 나타내어, 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화방지 또는 피부 상태 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리에 따른 인간 각질형성세포의 세포증식률을 나타낸 그래프이다.
도 2는 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리에 따른 인간 각질형성세포주의 상처재생효과를 확인한 현미경 사진이다.
도 3은 명월초 캘러스 유래 PDRN 또는 연어 정액 유래 PDRN 처리에 따른 인간 각질형성세포주의 H2O2에 의한 세포 손상으로부터의 세포회복률을 나타낸 그래프이다.
도 4는 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리에 따른 인간 각질형성세포주의 자외선으로부터의 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리에 따른 멜라닌 생합성 억제효과를 육안으로 확인할 수 있는 사진이다.
도 6은 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리에 따른 멜라닌 합성률을 나타낸 그래프이다.
도 7은 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리에 따른 섬유아세포 증식률을 나타낸 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 명월초 캘러스 유래 PDRN, 연어 정액 유래 PDRN 및 아데노신 처리에 따른 엘라스타아제 활성 억제율을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 명월초 캘러스 유도 및 배양
실시예 1-1: 재료 준비
캘러스 유도를 위한 명월초 식물체는 한국원예종묘에서 구입한 모종을 사용하였다. 명월초를 70% 에탄올(Merck, cat.603-002-00-5) 용액을 이용해 1분동안 살균처리 한 후, 2% 소듐 하이포클로라이드(sodium hypochloride) (Duksan, cat.7681-52-9) 용액에서 10분동안 교반하였다. 이어서, 클린벤치 내에서 멸균된 증류수로 4회 반복 세척한 후, 살균 처리한 잎을 사용하여 아래와 같이 명월초 캘러스를 유도하였다.
실시예 1-2: 명월초 캘러스 유도
명월초 잎을 각각 일정한 크기(10mm×10mm)로 잘라 상처낸 후, 캘러스 유도 배지에 치상하였다. 캘러스 유도를 위하여 기본 MS 배지(Murashige and Skoog, Duchefa Cat. M0222.0050)에 각각 피클로람(Picloram)(Duchefa Cat. P0914.0005) 및/또는 6-벤질아미노퓨린(6-Benzylaminopurine)(BA, Duchefa Cat.B0904.0001)이 포함된 배지를 사용하였으며, 암상태로 유도하였다(표 1).
캘러스 유도 탐색 배지 조성
기본 조건 피클로람 (uM) (옥신) BA (uM) (사이토키닌)
1 MS media
3% sucrose
0.3% gelrite		 10 10
2 10 1
3 10 0.5
4 10 0.1
5 10 0
실시예 1-3: 명월초 캘러스 안정화 및 배양
실시예 1-2의 방법으로 유도된 명월초 캘러스 중 고체상 배지에서 좋은 캘러스 선별 과정을 거친 후, 이를 안정화시켰다. 그 후 캘러스를 성장시키기 위해 기본 MS 배지에 캘러스 성장에 주로 사용되는 피클로람(Duchefa, Cat. P0914.0005) 1 mg/L 함유된 배지를 사용하여 배양하였다.
실시예 2: 명월초 캘러스 유래 PDRN 제조
실시예 2-1: 명월초 캘러스의 게놈 DNA(genomic DNA) 추출
명월초 캘러스 5g을 액체 질소를 이용하여 막자사발로 파쇄하였다. 계속적으로 액체 질소를 추가하여 명월초 캘러스가 완전히 파쇄될때까지 반복하였다. 파쇄된 명월초 캘러스에 50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 1% SDS 및 10mM b-머캅토에탄올이 포함된 extraction buffer(EB) 25ml를 추가한 후, 흔들어 상온에서 30분 동안 반응시켰다.
상온에서 12,000rpm으로 20분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 새로운 튜브로 옮겼다. 상등액과 동일한 부피비로 이소프로판올을 첨가하고, 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 반응물을 4℃에서 12,000rpm으로 20분 동안 원심분리 하였다. 이어서, 70% 에탄올로 2회 세척하고 건조시킨 후, elution buffer 5ml에 용해시켰다.
실시예 2-2: 명월초 캘러스의 게놈 DNA(genomic DNA) 분획화
상기 실시예 2-1에서 수득한 명월초 캘러스 gDNA (genomic DNA)에 초음파를 처리하여 PDRN을 얻었다. 이렇게 수득된 PDRN은 2000bp 이하의 크기와 74kDa 이하의 분자량을 갖는다. DNA 정량을 통해 농도를 확인하였고, DNA 전기영동을 통해 분해된 것을 확인하였다. 실험을 위해 200ug/ml로 stock을 만들어 최종농도 20ug/ml, 10ug/ml, 5ug/ml, 2.5ug/ml 및 1.25ug/ml 등으로 사용하였다.
실험예 1: 명월초 캘러스 유래 PDRN의 각질형성세포 증식 유도 활성 확인
실험예 1-1: 인간 각질형성세포 배양
세포의 배양에는 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum) (FBS, GIBCO, Cat.No.26140-079, USA), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat.No.11995-065, USA)을 사용하였다. 계대배양을 위하여 75 T-플라스크(NUNC, Cat. No. 156499, Danmark)를 사용하였으며, 세포 독성 시험을 위해서는 96 well plate (NUNC, Cat.No.142475, Danmark)를 사용하였다.
인간 피부구성세포인 각질형성세포(keratinocyte) 세포주 HaCaT를 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신 처리로 세포를 탈착시키고, 계수 후 5 X 103 cells/cm2으로 계대배양하였다.
실험예 1-2: 인간 각질형성세포 증식 시험
명월초 캘러스 유래 PDRN이 장기간 사용에도 자극없이 피부 상태 개선 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 인간 각질형성세포에대한 세포 증식 효과를 관찰하였다.
상기 실험예 1-1에서 배양된 인간 각질형성세포를 hemacytometer를 사용하여 96 well plate에 5 X 103 cells/well씩 동일하게 계수한 후 분주하였다. 인간 각질형성세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 내지 30%만큼 배양되면, 명월초 캘러스 유래 PDRN(20ug/ml, 10ug/ml, 5ug/ml 및 1.25ug/ml)이 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/ml)을 20 ul 첨가하고, 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ul의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200ul씩 처리하여 교반하였다. 각 well에서 100 ul씩 취하여 540 nm에서 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)를 실시하여 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 하기 수학식 1로 계산하였고, 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
[수학식 1]
세포증식률(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100
그 결과, 도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN을 처리한 경우, 최대 117.54%의 세포증식률을 나타내었고, 무처리군에 비해 각질형성세포의 세포증식률이 증가함을 확인하였다.
명월초 캘러스 유래 PDRN (ug/ml) 0 1.25 5 10 20
세포증식률 (%) 100 105.06 108.71 107.89 117.54
이러한 결과로부터 명월초 캘러스 유래 PDRN은 인간 각질형성세포의 증식을 유도하고, 장기간 사용에도 세포독성에 의한 피부자극을 유발하지 않음을 확인하였다.
실험예 2: 명월초 캘러스 유래 PDRN의 상처 재생 효과 확인
인간 각질형성세포주를 사용하여 명월초 캘러스 유래 PDRN의 상처 재생 효과를 조사하였다.
인간 각질형성세포주를 6 well plate에 2 X 105 cells/well 씩 동일하게 hemocytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 90 내지 100%만큼 배양되면, 각 세포에 날카로운 도구를 활용하여 십자형의 상처를 냈다. 그 후, FBS-free DMEM에 20ug/ml, 10ug/ml, 5ug/ml 및 1.25ug/ml의 명월초 캘러스유래 PDRN이 함유된 배양배지로 교체하여 24시간 동안 배양하고, 현미경을 통하여 상처 재생 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN을 처리한 실험군 모두에서 상처 재생능이 대조군(무처리군)에 비해 현저하게 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로부터, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 피부 재생 및 피부 상태를 개선할 수 있는 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 3: 명월초 캘러스 유래 PDRN의 H 2 O 2 에 의한 세포 손상 회복 효과 확인
대표적인 활성산소인 H2O2가 유발하는 산화적 스트레스에 의한 세포 손상으로부터 명월초 캘러스 유래 PDRN의 세포 회복 효과를 확인하기 위하여, 인간 각질형성세포 세포주 HaCaT를 사용하여 실험을 실시하였다.
인간 각질형성세포주를 24 well plate에 3 X 104 cells/well씩 동일하게 hemacytometer를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 80 내지 90%만큼 배양되면, 20ug/ml, 10ug/ml, 5ug/ml 및 2.5ug/ml의 명월초 캘러스 유래 PDRN이 함유된 배양배지와 1.5mM H2O2를 처리한 후 12시간 동안 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/mL)을 20 μL 첨가하고 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 500 μL 의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well에 처리하여 교반한 후, 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포회복률은 하기 수학식 2를 사용하여, 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
[수학식 2]
세포회복률(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100
그 결과, 도 3 및 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이, H2O2만을 처리하였을 때는 세포회복률이 40% 미만이였으나, 명월초 캘러스 유래 PDRN을 처리한 모든 군에서는 세포회복률이 100%를 초과함을 확인하였다. 즉, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 산화 독성으로부터 세포를 보호할 뿐만 아니라, H2O2에 의한 세포 손상으로부터 세포 회복을 극대화 시킴을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 비교군으로 사용한 연어 정액 유래 PDRN을 처리한 인간각질 세포주에서는 H2O2가 유발하는 산화적 스트레스가 극대화 됨을 확인하였다. 즉, 명월초 캘러스 유래 PDRN은 시판되는 연어 정액 유래 PDRN보다 H2O2 세포독성에 의한 세포 손상 후 세포 회복효과 및 H2O2에 의한 세포 손상 억제 효과가 현저하게 뛰어남을 확인하였다.
명월초 캘러스 유래 PDRN (ug/ml) 0 0 2.5 5 10 20
H2O2 처리 - + + + + +
세포회복률 (%) 100 33.06 100.68 125.87 155.26 166.55
연어 정액 유래 PDRN (ug/ml) 0 0 2.5 5 10 20
H2O2 처리 - + + + + +
세포회복률 (%) 100 45.03 37.35 23.11 17.44 11.55
이러한 결과로부터, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 산화 독성 또는 산화적 스트레스로 유발되는 세포 손상을 억제 및 회복시키고, 피부 상태를 개선할 수 있는 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 4: 명월초 캘러스 유래 PDRN의 자외선으로부터의 세포 보호 효과 확인
자외선에 의한 피부 손상으로부터 명월초 캘러스 유래 PDRN의 세포 보호 효과를 확인하기 위하여, 인간 각질형성세포 세포주 HaCaT를 사용하여 실험을 실시하였다.
인간 각질형성세포주를 6 well plate에 2 X 105cells/well씩 동일하게 hemacytometer를 이용하여 계수한 후 분주해 배양하였다. 인간 각질형성세포주를 10ug/ml, 5ug/ml 및 2.5ug/ml의 명월초 캘러스 유래 PDRN이 함유된 10% FBS DMEM에서 48시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 80 내지 90%만큼 배양되면, 20mJ UV-B를 처리하고 12시간을 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/mL)을 50 μL 첨가하고 3시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 1 mL 의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well에 처리하여 교반한 후 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 수학식 3을 사용하여, 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
[수학식 3]
세포생존율(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100
그 결과, 도 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN을 처리한 군은 UV-B만을 처리한 군에 비하여 현저희 뛰어난 세포생존율을 나타내었다.
명월초 캘러스 유래 PDRN (ug/ml) 0 2.5 5 10
세포생존율 (%) 0 22.27 20.47 19.57
이러한 결과로부터, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 자외선에 의한 피부 손상 억제, 피부 보호 및 손상으로부터의 회복 효과를 갖는 피부 상태 개선용 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 5: 명월초 캘러스 유래 PDRN의 피부 미백 효과 확인
명월초 캘러스 유래 PDRN의 피부 미백 효과를 확인하기 위하여, 멜라닌 합성에 관한 실험을 실시하였다.
실험예 5-1: B16 멜라노마 세포 배양
명월초 캘러스 유래 PDRN의 미백활성을 확인하기 위하여, 멜라닌을 형성하는 피부구성세포인 B16F10 세포주를 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신 처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 X 103 cells/cm2으로 계대배양하였다. 세포 배양에는 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO, Cat. No.,26140-079, USA), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No.11995-065, USA)을 사용하였다. 계대배양을 위하여 75 T-플라스크(NUNC, Cat. No.156499, Danmark)가 사용되었으며, 미백효능 관련 실험을 위해 6 well plate(NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)가 사용되었다.
실험예 5-2: B16 멜라노마 세포에서의 멜라닌 합성 억제 시험
명월초 캘러스 유래 PDRN을 B16F10 세포주에 처리하고, 세포 배양 중 생성되는 멜라닌의 생합성 양을 측정하였다.
6 well plate에 10% FBS 및 20ug/ml, 10ug/ml, 5ug/ml 또는 2.5ug/ml의 명월초 캘러스 유래 PDRN을 함유하는 DMEM 을 처리하였다. B16F10 세포주를 1 X 105 cells/well씩 동일하게 hemocytometer를 이용하여 계수한 후 위의 배지에 분주하였다. 멜라닌 생합성의 저해를 유도하기 위하여, 10 uM α-MSH(α-melanocyte-stimulating hormone)로 자극하고 72시간 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, 트립신 처리로 세포를 탈착시켜 e-tube에 옮겨 세포를 원심분리하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 10% DMSO가 함유된 1N NaOH를 500ul씩 처리하여 50℃에서 녹인 후, 150 ul씩 96 well로 취하여 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수학식 4를 사용하여 멜라닌 합성률을 백분율로 나타내어 미백 활성을 평가하였다.
[수학식 4]
멜라닌 합성률 (%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN을 고농도로 처리하였을 때 반응물의 색깔이 가장 밝은색을 띄는바, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 멜라닌의 생합성을 현저히 억제하였음을 육안으로도 확인할 수 있었다.
또한, 도 6및 표 6에 나타낸 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN 20 ug/ml 처리군은 α-MSH를 처리하지 않은 대조군과 유사한 멜라닌 합성률인 113.06%를 나타냈고, α-MSH를 처리한 대조군 대비 약 35% 정도 억제된 멜라닌 생합성을 나타내었다.
명월초 캘러스 유래 PDRN (ug/ml) 0 0 2.5 5 10 20
α-MSH 처리 - + + + + +
멜라닌 합성률 (%) 100 325.45 326.96 310.61 212.73 113.06
이러한 결과로부터, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 α-MSH에 의한 세포내 멜라닌 생합성을 현저하게 억제하는 것을 확인한바, 피부 미백 활성을 갖는 피부 상태 개선용 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 6: 명월초 캘러스 유래 PDRN의 섬유아세포 증식능 확인
명월초 캘러스 유래 PDRN의 섬유아세포 증식능을 확인하기 위하여, 섬유아세포주를 이용한 MTT 시험을 실시하였다.
실험예 6-1: 섬유아세포 세포 배양
섬유아세포 CCD986SK 세포주를 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 용기의 85 내지 90%의 면적만큼의 배양도를 보이면, 트립신 처리로 세포를 탈착시켜 계수 후, 5 X 103 cells/cm2으로 계대배양하였다. 세포 배양에는 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO, Cat. No., 26140-079, USA), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 Delbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, Cat. No. 11995-065, USA)을 사용하였다. 계대배양을 위하여 75 T-플라스크(NUNC, Cat. No. 156499, Danmark)를 사용하였으며, 섬유아세포 증식능 관련 실험을 위해서는 96 well plate (NUNC, Cat. No., 142475, Danmark)를 사용하였다.
실험예 6-2: 섬유아세포 증식능 시험
명월초 캘러스 유래 PDRN이 장기간 사용 시에도 자극 없이 피부 개선 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 섬유아세포에 대한 세포 증식효과를 조사하였다.
실험예 6-1에서 배양된 CCD986SK 세포를 96 well plate에 5 X 103 cells/well씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 24시간 동안 배양하여 배양용기 표면적의 25 내지 30%만큼 배양되면, 20ug/ml, 10ug/ml, 5ug/ml 또는 2.5ug/ml의 명월초 캘러스유래 PDRN이 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/ml)을 20 ul 첨가하고 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ul의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200ul 처리하여 교반한 후, 100 ul씩 96 well로 취하여 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포증식률은 수학식 1을 사용하여 계산하였고, 세포 독성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.
[수학식 1]
세포증식률(%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100
그 결과, 도 7 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리군은 대조군(무처리군)에 비하여 우수한 세포증식률을 나타내었다.
명월초 캘러스 유래 PDRN (ug/ml) 0 1.25 2.5 5 10 20
세포증식률 (%) 100 108.95 131.93 122.5 135.77 128.10
이러한 결과로부터, 명월초 캘러스 유래 PDRN은 섬유아세포 증식을 촉진하는 효과를 확인한바, 피부 상태 개선용 기능성 소재로 활용될 수 있음을 확인하였다.
실험예 7: 명월초 캘러스 유래 PDRN의 피부 탄력 유지 및 주름 개선 활성 확인
명월초 캘러스 유래 PDRN의 피부 탄력 유지 및 주름 개선 효과를 확인하기 위하여, 엘라스타아제(elastase) 저해능 확인 실험을 실시하였다.
먼저, 200mM Tris-HCL 완충용액을(pH 8.0)을 제조하였다. 완충용액에 엘라스타아제 기질 Suc-AlaAlaAla-p-nitroanilide(Sigma)이 0.5mM이 되도록 혼합하였다. 다음으로, 완충용액을 사용하여 효소인 엘라스타아제(Porcine Pancreatic Elastase, sigma, Cat No. E7885)를 0.25U/100ul의 농도로 제조하였다. 이렇게 준비된 기질 용액과 명월초 캘러스 유래 PDRN 시료(20, 5, 1.25, 0.625, 0.3125 ug/ml)를 섞은 후, 효소 용액을 첨가하여 25℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후, 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교군으로 명월초 캘러스 유래 PDRN 대신 연어 정액 유래 PDRN 또는 아데노신을 사용하여 실험을 반복하였다. 엘라스타아제 활성 억제율은 수학식 5를 사용하여 계산하였다.
[수학식 5]
엘라스타아제 활성 억제율(%)＝(1 - 시료처리군의 흡광도/ 대조군의 흡광도)×100
그 결과, 도 8a 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN의 엘라스타아제 활성 억제율은 상기 PDRN의 농도가 높을수록 증가하는 추세로 나타났다. 또한, 도 8b 및 표 10에 나타낸 바와 같이, 주름개선 기능성 원료로 사용되고 있는 아데노신 1.5 mM(400ug/ml, 0.04%) 처리군의 억제율은 18.67%로, 명월초 캘러스 유래 PDRN 20ug/ml 처리군도 이와 유사한 17.26%의 억제율을 나타냈다. 아울러, 도 8a 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 명월초 캘러스 유래 PDRN 처리군에서는 연어 정액 유래 PDRN 처리군 보다 엘라스타아제 활성 억제율이 높게 나타났다.
명월초 캘러스 유래 PDRN (ug/ml) 0 0.313 0.625 1.25 5 20
엘라스타아제 활성 억제율 (%) 0 6.99 6.06 11.51 14.15 17.26
연어 정액 유래 PDRN (ug/ml) 0 0.313 0.625 1.25 5 20
엘라스타아제 활성 억제율 (%) -1.24 4.35 5.75 7.62 12.91 16.02
아데노신 (mM) 0 0.047 0.188 0.375 0.75 1.5
엘라스타아제 활성 억제율 (%) 2.04 6.46 6.55 9.47 15.49 18.68
이러한 결과로부터, 명월초 캘러스 유래 PDRN은 엘라스틴 분해효소인 엘라스타아제 활성을 억제하여 피부 탄력 유지 및 주름 개선 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 명월초 캘러스 유래 PDRN은 아데노신보다 훨씬 적은 농도로 유사한 엘라스타아제 억제 효과를 나타낸바, 명월초 캘러스 유래 PDRN이 아데노신보다 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (17)

  1. 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN(polydeoxyribonucleotide)을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지 또는 피부 탄력 유지인, 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 피부 노화는 UV-B 자외선으로부터 야기되는 광노화인 것인, 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 명월초 캘러스는 명월초의 줄기, 뿌리, 잎, 열매, 꽃 또는 이들의 조합으로부터 유도된 캘러스인, 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 세포증식 촉진 활성에 의한 것인, 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 활성 산소에 의한 세포 손상 억제에 의한 것인, 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 UV-B 자외선에 의한 세포 손상 억제에 의한 것인, 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 멜라닌 합성 억제에 의한 것인, 화장료 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 엘라스타아제(elastase)의 활성 저해에 의한 것인, 화장료 조성물.
  10. 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN(polydeoxyribonucleotide)을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 피부 재생, 피부 미백, 주름 개선, 피부 노화 방지 또는 피부 탄력 유지인, 의약외품 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 피부 노화는 UV-B 자외선으로부터 야기되는 광노화인 것인, 의약외품 조성물.
  13. 명월초 캘러스에서 유래된 PDRN(polydeoxyribonucleotide)을 유효성분으로 포함하는 피부 상처, 피부 흉터, 피부 염증 및 피부 색소 침착으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
  14. (a) 피클로람, 또는 피클로람 및 6-벤질아미노퓨린이 함유된 배지에서 명월초 잎을 사용하여 명월초 캘러스를 유도하는 단계;
    (b) 상기 명월초 캘러스를 파쇄한 후, 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (c) 추출된 게놈 DNA를 초음파를 처리하여 PDRN을 수득하는 단계; 및
    (d) 수득된 PDRN에 화장료용으로 허용된 담체, 희석제, 보조제 및 부형제 중 하나 이상을 추가하는 단계
    를 포함하는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 화장료 조성물 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 단계 (a) 후, 유도된 명월초 캘러스를 피클로람이 함유된 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 화장료 조성물 제조방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 단계 (b)에 따른 게놈 DNA를 추출하는 단계는
    파쇄된 명월초 캘러스에 DNA 추출 버퍼(extraction buffer)를 첨가하여 상온에서 반응시키는 단계;
    반응물을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
    상기 상등액에 알코올을 첨가하여 상온에서 반응시키는 단계; 및
    상기 상등액 및 알코올의 반응물을 원심분리하여 침전된 DNA를 수득하는 단계
    를 포함하는, 화장료 조성물 제조방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 20 내지 30% Amp 조건에서 80초 내지 120초 동안 게놈 DNA에 초음파를 처리하여 게놈 DNA를 분획화 하는 것인, 화장료 조성물 제조방법.
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