KR20140011583A - 대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 대두 태좌 조직 배양 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하며, 아울러, 항염 효능을 가지고 있다.

Description

대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 {Composition for Skin External Application Comprising Culture Extract of Soy Bean Placenta}

본 발명은 대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 끊임없이 변화를 겪게 되는데, 가장 대표적인 변화가 노화에 의한 피부 기능 저하 및 시각적 아름다움의 감소이다. 피부 노화의 결과 나타나는 최종적인 피부 외관에서의 현상은 주름의 형성, 피부 탄력 저하, 노인성 반점 형성 등이 있으며, 주름의 형성이 가장 대표적인 현상으로 받아들여지고 있다.

최근 피부 주름의 생성 원인에 관한 생리학적인 연구도 많이 이루어지고 있으며, 주름 생성 방지를 위하여 보습제에 의한 각질층의 수분 유지, 자외선 또는 환경으로부터 피부의 보호, 새로운 세포 활성 촉진에 의한 주름 방지 등의 방법이 응용되고 있다.

현재까지 피부 노화 억제를 목적으로 이용되는 물질로는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase), 카탈레이즈(catalase) 등의 효소, α-토코페롤(α-tocopherol, vitamin E), β-카로틴(β-carotene), 아스코르빈산(ascorbic acid, vitamin C) 및 글루타치온(glutathione)과 같은 지용성 및 수용성 항산화제, 그리고 라디칼소거제들이 있다. 이들은 주로 피부 노화에 따른 주름의 형성을 억제하는 예방 효과가 있는 반면, 최근 항노화 물질로 각광받는 비타민 A, 알파 하이드록시산 등은 진피내 콜라겐 합성 증진을 통해 생성된 주름을 완화시키는 치유 효과가 있다. 특히 비타민 A 및 알파 하이드록시산은 주름 완화 효과가 항산화제보다 빠른 시일에 나타나며 피부 세포 재생, 미백 등의 부가적인 효과도 보고되어 있다 (R.Hermitte, C&T, 107, 63, 1992). 그러나, 이들 항산화제 또는 라디칼 소거제, 비타민 A, 알파 하이드록시산 등은 화장료에 배합시 안정성 및 피부 안전성 등이 좋지 못하다는 문제가 있다.

최근 화장품 분야에서는 이러한 문제점을 해소하기 위해 천연물질을 이용한 화장품 제조가 각광받고 있다.

한편, 우리나라의 전통 식품 중 하나인 대두는 일반적으로 양질의 단백질과 지질의 급원으로 사용되기도 하고 된장, 간장 등의 발효식품 및 두부, 콩나물, 콩가루 등의 비발효 식품까지 그 용도가 다양하게 사용되어 온 식품 재료로서 최근에 노화 및 피부미백을 비롯한 성인병을 예방할 수 있는 기능성 식품으로 각광받기 시작하였으며, 기능성 화장품 제조에도 적용되는 사례가 늘고 있다. 대두추출물을 이용한 선행 특허로써, 대두 추출물을 유효성분으로 함유하는 백반증 또는 백모의 개선용 조성물(대한민국공개특허 10-2012-0068152), 대두 추출물 또는 대두발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 비만용 조성물(대한민국공개번호 10-2012-008409) 등이 있다. 이러한 선행 기술들은 대두 추출물에 관한 연구로, 아직까지 일반적인 대두 추출물이 아닌, 식물조직배양법을 이용하여 대두의 태좌 조직을 배양하여 얻은 배양물에 관한 연구는 진행된 바가 없었다.

또한, 이러한 대두에는 이소플라본이 함유되어 있는데, 여러 이소플라본 중 제니스틴(genistein), 다이드제인(daidzein), 글리시틴에 대해서는 많은 연구들이 되어 있다. 글리시틴은 약한 에스트로겐 효과와 항산화 효과가 보고되어 있고, 제니스틴은 피부에서 항산화와 항암 효과를 지니고 있는 것으로 보고된바 있으며, 인체 각질형성세포주인 NCTC 2544에 제니스틴을 처리하였을 때 자외선에 의해 유도되는 activator protein- 1 (AP-1)의 결합을 억제하여 지질과산화를 억제하고 활성산소 생성을 차단하였다. 그러나, 다이드제인의 경우, 연구가 많이 진행되지 아니하였고, 고가이며 물에 잘 녹지 않아 피부 외용제 조성물 제조에 적용하기에 쉽지 않은 단점이 있다.

본 발명자들은 피부개선능이 있는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위해 노력하던 중, 대두의 태좌조직을 분리하고, 식물조직배양을 통해 배양하여 대두의 태좌조직 배양물 또는 그 추출물이 피부 세포의 성장 및 증식을 활성화시키고, 항염 및 주름개선효능이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 대두 태좌조직 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 대두의 씨방내의 태좌조직을 분리하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 대두 태좌조직의 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 대두 태좌 조직 배양물 또는 그 추출물 함유 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 피부 콜라겐 합성능이 탁월하며, 아울러, 항염 효능을 가지고 있다.

도 1은 본 발명에 따른 대두 태좌 조직 배양 추출물과 대두 추출물의 추출방법에 따른 다이드제인 함량을 확인한 그래프이다.
도 2는 다이드제인의 화학 구조식과 1H-13C multiple bond correlation (A), 그리고 다이드제인 표준물질의 HPLC 분석 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 3는 본 발명에 따른 대두 태좌 조직 배양 추출물의 세포 성장, 증식 효과를 확인한 그래프이다.
도 4는 대두 태좌 조직 배양추출물의 항염 효과(iNOS 활성저해)를 확인한 그래프이다.

본 발명은 대두(大豆, 학명: Glycine max) 태좌조직 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 대두 태좌조직 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 대두 태좌조직 배양물 또는 그 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.

이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 예컨대, 하기 실시예에서는 0.005 내지 5중량%의 경우를 실험하였으나, 이 이외에 10중량%까지, 또는 그 이상의 20%, 30% 이상 경우도, 우수한 피부개선효과, 항염, 주름개선 기능을 가짐은 당업자에게 자명하다.

본 발명에 있어서, 상기 대두 태좌조직 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 대두 태좌조직 배양 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8 ∼ 48시간동안, 80 ∼100 ℃로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 태좌조직 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, “피부개선용”이란, 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부 외용제 조성물로써 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성 또는 iNOS 억제 활성을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 특히, 프로콜라겐 증가, 콜라겐 생합성 증가능을 가지고 있어, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선/방지용으로 적용될 수 있으며, 이외에도 iNOS 억제 활성을 통한 항염, 피부 염증 예방, 완화, 경감, 치료용으로 적용될 수 있다.

이러한 대두 태좌조직 배양 추출물의 효능은, 실험예 1 및 2에서 구체적으로 제시된 바와 같이, 대두 태좌조직 배양 추출물이 식물 조직 배양을 통하여 대두 추출물과는 다른 여러 성분들이 복합된 추출물로써 구성됨에 기반한 것이며, 특히, 대두 추출물과는 달리 다량의 다이드제인을 함유하고 있음에 기반한 것이다. 대두 추출물의 경우, 열수 추출에서는 다이드제인을 전혀 포함하고 있지 아니하며, 냉수 추출물 또는 50% 에탄올 추출물에서는 미량 포함하고 있다. 특히, 50% 에탄올 추출물의 경우, 대두 추출물에서는 미량의 다이드제인이 포함되어 있음(도 1에서 약 0.05피크)에 비추어, 대두 태좌조직 배양 추출물의 경우 그 보다 8~10배 (도 1에서 약 0.40피크) 많은 다이드제인을 함유하고 있다.

식물조직배양은 살아있는 작은 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식 시키는 기술이다. 식물조직배양에는 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용한다고 볼 수 있다. 식물조직배양 기술은 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 이용하는 것을 기반으로 하는 기술이다. 즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 이들 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 이러한 식물이 분화전능성(totipotency)을 지니는 능력은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존을 하기 위한 전략이다. 따라서 식물은 잃어버린 기관을 다시 재생시키기 위한 능력을 갖게 되었다고 볼 수 있다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

식물의 태좌(胎座, Placenta)는 동물 유래의 태반과 같이, 종자 육성을 주관하는 중요한 부위로, 암술의 씨방(자방, 子房, Ovary)안에서 밑씨가 붙는 부분이다. 보통 씨방을 형성하는 심피(心皮, carpel)의 가장자리에 있는데, 때로는 심피의 중맥에도 있다. 또 씨방의 기저나, 기저로부터 씨방 안에 직립하는 기둥 모양으로 생길 때도 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 대두의 태좌조직을 분리하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 대두 태좌조직 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 대두 태좌조직 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 대두 태좌조직을 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 있어서, (a)단계의 배양을 통해 얻어진 대두 태좌 조직 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 피부 외용제 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 대두 태좌조직 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하거나,

(a)단계에서 얻어진 대두 태좌조직 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물을 열풍 건조후 분말화하여 수분을 증발시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 대두 태좌조직 배양 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 대두 태좌조직 배양 추출물을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 대두 태좌조직 배양 추출물을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 콜라겐 합성 증진능에 따른 피부 노화 방지, iNOS 활성 저해를 통한 염증의 완화/예방 등을 비롯한 면역질환 치료/예방의 기능을 할 수 있는 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 iNOS 활성저해능을 가지고 있어, 면역질환 치료, 예방용 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 대두 태좌조직 배양물 또는 그 추출물 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 이하의 실시예에서는 대두 태좌 조직 배양 추출물에 관한 효능을 확인하였으나, 추출물이 아닌 배양물 자체에 대해서도 이러한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1-1: 본 발명에 따른 대두 태좌 채취

본 발명에 사용된 대두는 경남 진주시 사봉면 등건리에서 수확한 것으로, 70% 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30% 락스 +Tween20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하여 염농도를 1/2로 줄인 MS배지 (Murashige and Skoog, 1962)에 agar 8g/L, sucrose 30g/L를 첨가한 배지에 파종하고, 25℃, 습도 70% 의 생장상에서 7일간 암실 배양하며 발아를 유도하였고, 발아된 대두는 기본 MS배지상에서 25℃, 습도 70% 의 생장상에서 명배양하며 계속 키웠다. 두 달 정도 키운 대두의 콩깍지내에서 태좌부위를 채취하였다.

실시예 1-2: 본 발명에 따른 대두 태좌조직 배양 및 대량생산

무균적으로 채취된 대두 태좌조직을 3% Sucrose 및 agar 8g/L가 포함된 MS 기본배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 2~3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였다. 이후, 풍선형 생물반응기를 이용하여 agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 습도 70%, 공기공급량 0.1 vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양 및 증식하여 대량생산하였다.

실시예 1-3: 본 발명에 따른 대두 태좌조직 배양 추출물 및 대두 추출물의 제조

증식된 대두 태좌조직 배양물을 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 대두 태좌조직 배양물 분말 50g을 용기에 담고, 1L의 정제수(냉수 및 열수추출), 50% 에탄올 각각의 용매를 넣어 추출하였다. 구체적으로는, 냉수추출과 50% 에탄올에 용해시킨 시료는 3일간 실온에서 교반시키고, 열수추출은 정제수를 넣은 후 80 ∼100 ℃로 가열하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과하여 나온 대두 태좌조직 배양 추출물을 동결건조하여 정제수에 녹여 본 발명에 사용하였다. 대두 추출물의 경우에도 상기 기술한 바와 같은 방법으로 추출하였다.

실험예 1 : 대두 추출물과 대두 태좌조직배양추출물의 HPLC 에 의한 성분분석

대두 추출물과 대두 태좌조직배양추출물의 HPLC에 의하여 성분분석을 수행하였다. 분석조건은 다음과 같다.

구 분	분 석 조 건
HPLC 기기 종류	Waters 1525μ Binary HPLC Pump
Column 종류	Gemini 5μ C18 110 A (Phenomenex 사)
Column 규격	250 * 4.60 mm, 5 micron
용매 조건	- 용매 A : Water (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유) - 용매 B : Acetonitrile (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유)
파장	234 nm (UV 램프)
유속	1 ml/min

3가지 추출법(냉수 추출, 열수 추출 및 50% 에탄올 추출)에 의한 성분 분석결과, 이소플라본 종류 중 하나로 널리 알려진, 다이드제인(daidzein)의 함량이 50% 에탄올 추출물에서 매우 증가됨을 확인하였다 (도 1).

실험예 2 : 핵자기공명분광법(NMR spectroscopy)을 이용한 대두태좌추출물내 다이드 제인 확인

HPLC분석에 의해 함량 증가 확인된 22분 peak만을 정제하여, 핵자기공명분광법을 이용하여 증가된 물질을 분석하였다. ¹H spectrum을 통해 수소의 종류와 수에 대한 정보 및 수소가 존재하는 주변정보를 탐색하고 ¹³C spectrum을 통해 단일 peak로 나타나는 탄소의 수를 결정할 수 있는데, 대두 태좌조직배양물 50% 에탄올 추출물에서 증가된 물질이 다이드제인(daidzein) 임을 확인할 수 있었다 (도 2).

실험예 3: 본 발명에 따른 대두 태좌조직배양 추출물의 세포 성장 및 증식에 미치는 영향 시험

실시예 1에서 제조한 대두 태좌조직 배양 추출물에 대한 피부 세포의 증식 활성을 알아보기 위하여, 인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast, CCD-986Sk)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다. 각 세포를 1×10⁴cells/ml의 농도로 하여 24 well 배양판에 접종하였다. 배지는 10% FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ~ 30%만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 조성물이 0.5 ~ 5 중량%가 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200 ㎕의 Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕ 씩을 96 well 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 증식 활성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였고, 결과는 도 3에 나타난 바와 같았다.

[수학식 1]

세포증식효과(%) = [(실험군 흡광도 - 대조군 흡광도)/대조군의 흡광도] ×100

	처리 농도 (mg/ml)	세포독성효과(%)
	대조군	100
대두 추출물	0.005	103.53
	0.05	90.83
	0.5	89.93
	5	78.32
대두 태좌조직 배양 추출물	0.005	101.2
	0.05	95.3
	0.5	87.1
	5	79

상기 인간각질형성 세포(keratinocyte)를 이용한 Cytotoxicity(세포독성)에 미치는 영향시험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 0.005 ~ 5 mg/ml의 대두 추출물 및 대두태좌조직배양추출물 처리에 의해서 세포독성을 보이지 않았다.

실험예 4: iNOS 활성 저해 시험

생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 이용하여 인위적으로 유발시킨 염증의 억제 효과를 알아보기 위하여, iNOS가 들어있지 않은 10% FBS-DMEM(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청, Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO사) 배지에 1×10⁵세포를 현탁시켜 24 well plate에 접종하여 부착시켰다.

하루 후 실시예 1에서 제조한 대두 태좌조직 배양 추출물을 아래 표 3에 제시된 다양한 농도별로 처리하여 18시간 배양한 후 1 ㎍/ml의 Lipopolysaccharide (Sigma사)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상층액을 회수하여 96 well plate에 100 ㎕씩 넣고 Griess reagent (Sigma사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 가볍게 흔들어 주어 570 nm에서 흡광도를 측정했다. Sodium Nitrite를 표준품으로 하여 검량선을 작성하고 각 시료를 배양액 중의 Nitric Oxide의 생성량을 구하였다. Lipopolysaccharide를 처리한 군의 Nitric Oxide의 생성량을 100%로 하여 각 시료의 % 수득율을 구하였다.

LPS 처리유무		처리 농도 (mg/ml)	Cell Viability (%)	NO Production (M)
-		대조군	100	1.3
+		대조군	61.5	3.3
	대두 추출물	0.01	90.1	3.25
		0.05	89.0	3.2
		0.1	92.7	3.1
		0.5	95.1	2.8
	대두태좌 추출물	0.01	64	3.1
		0.05	69.2	3
		0.1	83.2	2.6
		0.5	91.2	1.5
		Indomethacin (100M)	95.8	3.1

상기 표 3에서와 같이, iNOS의 활성은 0.5 mg/ml 농도의 대두 태좌조직배양추출물이 처리에 의하여 대조군과 비교하여 NO 생산을 저해하며 염증효과를 보였으며, 이는 대두 추출물에서는 볼 수 없는 매우 우수한 효과이다 (도 4).

실험예 5: Procollagen 합성 증진 시험

인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1×10⁵개/ml로 24 well plate에 500㎕ 씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 대조군(DMEM 배지)과 0.1 ~ 10 중량%의 다양한 농도의 실시예 1에서 얻은 대두 태좌조직 배양추출물을 함유한 배지를 넣고 48시간동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 48시간 후, 배지의 상층액을 각각 20㎕ 을 취해 Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit(PICP, Takara, Cat No. MK101)를 이용하여 측정함으로써 새로 합성된 콜라겐 양을 측정하였다. PICP양은 ng/1×10⁵세포로 환산하였으며, 하기 수학식에 따라 계산하여 그 결과는 표 4에 나타나 있다.

[수학식 2]

	시료 농도 (mg/ml)	콜라겐 생합성 증가율(%)
	대조군	100
대두 추출물	0.005	98
	0.05	102
	0.5	110
	5	120
대두 태좌조직배양 추출물	0.005	107
	0.05	115
	0.5	135
	5	148

상기 표 4에서 볼 수 있듯이, 실시예1의 대두 태좌조직배양추출 처리 농도가 증가함에 따라 Procollagen 생합성량이 증가함을 알 수 있고, 대두추출물과는 비교할 수 없을만큼 탁월한 콜라겐 합성 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.

화장료 조성물의 제조

본 발명의 대두 태좌조직 배양 추출물를 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 2-1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
대두 태좌 조직 배양 추출물	2.0
정제수	to 100

제조예 2-2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
대두 태좌 조직 배양 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
대두 태좌 조직 추출물	5.0
정제수	to 100

제조예 2-4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
대두 태좌 조직 추출물	7.0
정제수	to 100

제조예 2-5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
대두 태좌 조직 추출물	1.0
정제수	to 100

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 대두 태좌조직의 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 대두 태좌조직의 배양물의 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화 방지용인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항염 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
5. 다음의 단계를 포함하는 대두 태좌조직의 배양물 또는 그 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법:
   (a) 대두의 씨방내의 태좌조직을 분리하여 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 조성물을 제조하는 단계.
6. 제5항에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 대두 태좌조직 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 (b)단계는, (a)단계에서 얻어진 대두 태좌조직 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   

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