MXPA01000444A - Tratamiento de desordenes de la piel - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona piperina y análogos c derivados de esta para la repigmentación de piel despigmentada post-traumatizada y para el tratamiento de condiciones de la piel tales como el vitiligo. La piperina y análogos o derivados de esta también se pueden usar para promover o mejorar de manera cosmética la coloración natural de la piel.

Description

RINA O ANÁLOGOS O DERIVADOS DE LA MISMA PARA EL TRATAMIENTO DE DESORDENES DE LA PIEL Esta invención se relaciona a un tratamiento de desordenes de la piel y más particularmente a aquellos 5 desordenes que requieren estimulación de la proliferación de melanocitos. La invención es de especial aplicación para el tratamiento de vitíligo. El vitíligo es un desorden de pigmentación común caracterizado por el desarrollo de lesiones despigmentadas irregulares. Los 10 tratamientos actuales los cuales incluyen el uso de fotosensibilizadores (por ejemplo psoralens) con radiación UVA (PUVA) , corticosteroides o injerto de piel tiene altos porcentajes de éxito y generalmente están acompañados de efectos colaterales desagradables. El 15 vitíligo tiene un impacto de alto detrimento en el bienestar emocional del perjudicado, estando los efectos de desfiguración de la enfermedad compuestos por la ausencia de un tratamiento adecuado. Aunque no se cree que las manchas de vitíligo contengan melanocitos 20 (células que producen el pigmento) , existe un reservorio en los folículos pilosos en la piel del vitiligoso. De esta manera la activación de los melanocitos foliculares del pelo es un proceso crucial en la repigmentación de piel vitiligosa. 25 Se han empleado ciertos remedios de plantas, usualmente administrados como mezclas o extractos de hierbas, particularmente aquellos utilizados en la medicina REF. NO.126137 ,,«tg>. -_. .S&UtüC ,-- j&wj»<wBti?ut<ffta»». - .-> " - «£ .' <&áítéi¡&?tt?&Sf(í&?s- ¿ásS/r ~^¿t ~?n** »,«...., . -aj&&.fc¿a«?c.jte_a tradicional China y en la medicina Ayurvedica India, para el tratamiento de vitíligo durante un largo tiempo y en muchos casos han dado resultados positivos en estudios de pequeña escala. Son bien conocidas para su uso en esta enfermedad las hierbas tales como Psoralea corylifolia L . y Vernonia anthelmintica Willd. (= entrather um anthelminticum Kuntze) . Psoralens, la cual se emplea en el PUVA moderno y khellin en la terapia KUVA se derivaron originalmente de fuentes herbales ( Psoralea corylifolia L y Ammi visnaga respectivamente) usadas en los remedios tradicionales para el vitíligo. Sin embargo estas terapias dependen del uso de la irradiación UV para su eficacia, la cual se asocia con la etiología de cáncer de la piel.

La fruta de la pimienta negra ( Piper nigrum i.) y pimienta larga son ambas hierbas medicinales importantes en los sistemas de medicina Ayurvedica y Unani (India tradicional), en los cuales los remedios consisten generalmente de mezclas de hierbas. Un amplio rango de los usos medicinales de la pimienta negra han sido documentados por Kirtikar y Basu (Indiam Medicinal Plant, 2a. edición, Vol. 3, (1935) páginas 2128-2135), incluyendo su uso como un posible adjunto para Vernonia anthelmintica en el tratamiento de leucoderma (Indian Medicinal Journal, Vol 1, 3a. edición, (1982) 1267-1270) .

Estas dos hierbas se emplean como un constituyente en varias preparaciones herbales tradicionales para una variedad de usos, que incluyen malestares gastrointestinales y de la piel. Se han usado en el tratamiento de vitíligo las composiciones que comprenden pimienta negra, jengibre e higuera de la India (Ancient Science of Life, Vol. IX. No. 4 (1990 202-206); Sin embargo, no se ha establecido la acción terapéutica específica de la pimienta negra en estas composiciones administradas de manera oral.

Existe, por lo tanto, una necesidad de composiciones y compuestos adicionales, los cuales sean capaces de estimular la proliferación de melanocitos. Preferentemente los compuestos y composiciones de la invención son capaces de estimular la proliferación de melanocitos sin efectos colaterales adversos. La presente invención consigna esa necesidad.

Los presentes inventores han seleccionado 30 extractos de hierbas, los cuales se han usado de manera tradicional en el tratamiento de vitíligo usando un sistema de cultivo de células para evaluar si estos tiene la habilidad para estimular directamente la proliferación de los melanocitos. Se ha encontrado de manera sorprendente que los componentes de la fruta de Piper nigrum L poseen actividad proliferante de melanocitos. En particular, se ha encontrado que el componente piperina es capaz de estimular de manera significativa la producción de melanocitos .

La piperina solamente se ha reportado como presente en otras especies de Piper por ejemplo P. acutisleginum, álbum, argyrophyl u , attenuatum, aurantiacum, betle, callosum, chaba , cubeba , guíñense, hancei , khasiana , longum, macropodum, nepalense, novae hollandiae, peepuloides, retrofractum, sylvaticum. Las composiciones farmacéuticas que contienen piperina se han usado en el tratamiento de tuberculosis y leprosis (EP 0 650 728) . También se ha sugerido que la piperina es capaz de mejorar la biodisponibilidad de los otros constituyentes de una composición farmacéutica (WO 96/25939) .

Un primer aspecto de la invención proporciona el uso de piperina como un análogo activo o derivado de este para la estimulación de la proliferación de melanocitos. La piperina se puede usar en forma aislada, pero se usa de manera más adecuada en combinación con un acarreador o excipiente y de manera opcional uno o más ingredientes activos. También puede ser usada en la forma de un extracto de planta, derivable de Piper nigrum, por ejemplo.

Se apreciará que la estimulación de la proliferación de melanocitos facilita grandemente la repigmentación de la piel despigmentada. La despigmentación de la piel puede surgir, por ejemplo, de tejido de cicatriz como un resultado de un trauma de la piel tal como quemadura u otras lesiones de la piel o puede ser debido a condiciones de la piel tales como el vitíligo. Las composiciones que comprenden piperina o un análogo o derivado activo de esta pueden por lo tanto ser usadas para repigmentación de piel despigmentada post- traumatizada así como condiciones tales como el vitíligo.

Un segundo aspecto de la invención proporciona el uso de piperina o un análogo o derivado activo de esta en la preparación de un medicamento para la estimulación de melanocitos. El medicamento puede estar en la forma de un polvo sólido; una pasta, pomada o crema; una tableta o una cápsula; o una solución. La piperina o un análogo o derivado activo de esta se puede administrar por las rutas oral, tópica, intravenosa o subcutánea (intramuscular) . Se prefiere que el medicamento se aplique de manera tópica en el área de la piel despigmentada.

En una primera modalidad del segundo aspecto de la invención se proporciona el uso de piperina o un análogo o derivado activo de esta en la preparación de un medicamento para la repigmentación de piel despigmentada post-traumatizada. Por el término "piel despigmentada post-traumatizada" se entiende por referirse a la piel formada durante el proceso de curación que ocurre después de un trauma de la piel tal como una quemadura o una lesión.

En una segunda modalidad preferida del segundo aspecto de la invención se proporciona el uso de piperina o un análogo o derivado activo de esta en la preparación de un medicamento para el tratamiento de vitíligo. Aunque las composiciones se pueden administrar de manera oral, se prefiere la administración tópica.

La invención también proporciona un método para la repigmentación de la piel despigmentada o tratamiento de vitíligo que comprende la administración a un paciente que requiere terapia de una cantidad farmacéuticamente aceptable de piperina o un análogo o derivado activo de esta.

La estimulación de la proliferación de melanocitos puede también ser usada para mejorar o promover la coloración natural de la piel y las composiciones que comprenden piperina o un análogo o derivado activo de esta se pueden usar como agentes de bronceo. El mejoramiento del color natural de la piel se puede usar con fines profilácticos o cosméticos. Una tercera modalidad del segundo aspecto de la invención proporciona el uso de piperina o un análogo o derivado activo de esta en la preparación de una composición para el mejoramiento o promoción del color de la piel .

Además un tercer aspecto de la invención proporciona un método para mejoramiento cosmético o promoción de la coloración de la piel que comprende la administración a una persona que desea un efecto tal de una cantidad cosméticamente efectiva de piperina o un análogo o derivado activo de esta . La administración puede ser por las rutas oral o tópica.

Se apreciará que ciertos análogos o derivados activos de piperina no han sido usados antes de la presente para propósitos terapéuticos y un aspecto adicional de la invención proporciona un análogo o derivado activo de piperina para el uso en la estimulación de la proliferación de melanocitos. La invención también proporciona un análogo o derivado activo de piperina para uso en terapia. Los usos terapéuticos incluyen la repigmentación de la piel despigmentada así como la promoción o mejoramiento de la coloración de la piel.

También se ha encontrado que la piperina inhibe la proliferación de las células de melanoma. La piperina y sus análogos o derivados pueden también utilizarse en el tratamiento de cáncer de la piel. Un cuarto aspecto de la invención proporciona un método de tratamiento o prevención de cáncer de la piel en un paciente humano o no humano que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de piperina o un análogo o derivado activo de esta.

Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de piperina o un análogo o derivado activo de esta en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de la piel.

La piperina o un análogo o derivado activo de esta se puede administrar por las rutas oral o tópica. Las formas de dosificación adecuadas pueden ser cualquiera de aquellas discutidas antes aquí. 10 La estructura de la piperina y derivados y análogos de esta se da a continuación.

Variación en la estereoquímica en los dobles enlaces y en la extensión de la conjugación en la cadena Estructuras para comparación 1 (E,E) -Piperina 10 2 (Z,Z) -Chavicina 3 (Z,E) -Isopiperina 4 (E,Z) -Isochavicina 5 3, 4-dihidropiperina- Piperanina 6 1, 2, 3, 4-tetrahidropiperina 15 Variación en la separación de los anillos (conjugado) Estructuras para comparación (todo E) 7 n = 1 -Ilepcimida 1 n = 2 -Piperina 25 8 n = 3 -Piperetina Alteraciones para los sustituyentes de nitrógeno Estructuras para comparación (todo E,E) R = I piperidinil -Piperina 9 pirrolidinil -Tricostaquina 10 isobutilamino -Piperlonguminina II metoxi -Despiperidilmetoxipiperina Alteraciones para el sustituyente fenilo Estructuras para comparación (todo E,E) R = 1 3' , ' -metilenodioxilfenil -Piperina 12 Como 1 + 6' -metoxi -Wisanina 13 3' -hidroxi, 'metoxifenil -4' -Metoxiisocoumaperina 16 Metil -Hexadienoilpiperidina 14 4'-h?drox?fen?l 15 fenil * '-±.»S^ XX?.^ r?X Los compuestos que ocurren de manera natural (incluyendo la piperina) se pueden extraer de fuentes de plantas adecuadas o sintetizarse usando métodos conocidos para una persona habilitada (ver, por ejemplo, Chapman y may, Combined Chemical Dictionary on CD-Ro , Reléase 1 : 1 (1997) y The Merck Index (1983), décima edición. Publ.

Merck and Co, Rahway, USA. PP. 1077-1078 (excepto los compuestos 2 y 3) ) . Todos los compuestos excepto 6, 11, 13, 15, y 16 ocurren en P. nigrum u otras especies de Piper (10 y 12) .

Los compuestos 2 y 3 se prepararon mediante el aislamiento de P. nigrum usando métodos conocidos para una persona habilitada (ver , por ejemplo, Chelín R de y Verzele M (1975), Constituents of Peppers. Parte VII. Spectroscopy Structure Elucidation of Piperine and its Isomers. Bulletin de la Societe Chimique Belgique, 84, 435-438) .

El compuesto 6 se prepara mediante la hidrogenación de la piperina sobre catalizador de Adams usando métodos conocidos (ver por ejemplo Banerji A, Bandyopadhyay D, Sarkar M et al (1985) .

Los estudios estructural y sintético sobre las retrofractamidas -constituyentes de amida de Piper retrofractum, Phytochemistry, 24, 279-284) .

El compuesto 11 se prepara por metanolisis de la piperina usando metóxido de sodio.

El compuesto 13 y 15 se preparan de 3-hidroxi-4-metoxibenzaldehído y benzaldehído respectivamente como materiales iniciadores usando métodos análogos a aquellos usados para la preparación de piperina.

El compuesto 16 se prepara de la reacción entre piperidina y cloruro de E,E-hexadienoilo.

Los compuestos activos se pueden formular para uso tópico en la forma de cremas, parafinas suaves o lociones. La crema acuosa BP o la Parafina Suave Amarilla BP pueden contener adecuadamente el extracto de planta activo a 0.03-3.0 mg % w/w o una cantidad equivalente. Una loción adecuada se prepara de manera típica de 20% de glicerol y 80% de etanol en agua purificada y contiene 0.03-3.0 mg % w/w del material activo. Estas formulaciones tópicas también pueden contener mejoradores de la penetración tales como ácido oleico, propileno glicol, etanol, urea, dietanolamina o azona laurica, dimetil sulfóxido, decilmetil sulfóxido, o derivados de pirrolidona. También se pueden usar los sistemas de liberación liposomal.

Las composiciones para la formulación oral incluyen tabletas o cápsulas que contienen 1.5-150 mg o una cantidad equivalente de extracto de planta activo.

»«¿A_Sfefc8»_ .-» T- . « .. «<*a _-y .^^^S^c^tfja^-j^ a^a?»jC»fe«¡-» ,. . A. -u. -v- •&3 dwttsfj&¿&*G Figuras y Ejemplos La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplo no limitantes, con referencia a las tablas que los acompañan y dibujos en los cuales: Figura 1: Curvas de crecimiento Melan-a bajo diferentes composiciones de medios. Cada punto representa la media y la desviación estándar de 6 pozos.

Figura 2: Curvas de crecimiento Melan-a de diferentes densidades de placa inicial detectadas con el ensayo SRB. El medio se suplemento con 20 nM de TPA. En el día 4 el medio en las placas que permanecen se reemplazó. Cada punto muestra la media y DS de 6 duplicados.

Figura 3: Efecto del extracto de P. nigrum en el crecimiento de células Melan-a. Los cultivos se mantuvieron durante 8 días. El medio y el extracto se reemplazaron con unos frescos en el día 4. Cada punto designa la media y DS de 6 pozos excepto 12 duplicados para células solamente.

Figura 4: Efectos de extracto de P. nigrum y TPA en la proliferación de la línea celular Melan-a. Cada punto muestra la media y DS de 6 duplicados excepto 12 pozos utilizados para células solamente.

Figura 5: Efectos de la piperina y TPA en el crecimiento de células Melan-a en presencia de RO-31-8220. n = 6 para los pozos tratados con piperina y TPA, aunque n = 12 para RO-31-8228 solo.

Figura 6: Efectos de piperina y TPA en el crecimiento de melanoblastos humanos en la presencia de ET3. *P < 0.05 cuando se comparo con el control vehículo (ANOVA de una vía seguida por la prueba de t de Dunnett) 10 Figura 7: Efectos de piperina en el crecimiento de melanocitos humanos en la presencia de ET1. *P < 0.05 cuando se compara a tratamiento ET1 InM (7ANOVA de una vía seguida por la prueba de t de Dunnett) 15 Las variaciones en estos ejemplos serán evidentes para una persona habilitada en el estado de la técnica.

Ejemplos 20 Muestras de planta y preparación de extractos Se adquirió del Food Centre, 70 Turnpike Lañe, Londres N8, UK la fruta de Piper nigrum L . (pimienta negra, Piperaceae) , originaria de la India. El resto de las 25 hierbas fueron proporcionadas por East-West Herbs, Kingham, Oxon, UK o por Cipla Ltd, Mumbai, India.

Para el programa de investigación inicial, la hierba seca en polvo (10 g) se calentaron hasta hervir en agua destilada (100 ml) y se permitió que hirviera por espacio de 10 minutos, usando una placa caliente como fuente de calor. El material de la planta se filtró bajo condiciones de vacío a través de papel filtro (Whatman) , y el filtrado se secó y congeló.

Experimento de cultivos celulares Ensayo de microplaca de cultivo y sulforhodamina B (SRB) Las células de ratón de la línea celular Melan-a (número de transición 18-24) una primera línea conocida de melanocitos de ratón pigmentados no tumorigénicos se mantuvieron en un frasco (Costar, Cambridge, MA, USA) usando RPMI 1640 (ICN, Costa, Mesa, CA, USA) como un medio básico. Para los ensayos de proliferación en la microplaca, a los cultivos Melan-a subconfluentes se les agregó tripsina (0.25% de tripsina a 37°C durante 5-10 minutos) y se inocularon con una pipeta de repetición (Fin pipette, Labsystems, Finland) dentro de placas de microtitulación de 96 pozos (Costar, Cambridge, MA, USA) .

Las placas se incubaron a 37 °C en un 10% de C02, 90% de atmósfera de aire humedecido durante el tiempo establecido. Al final de la incubación, se realizó un ensayo de SRB, Brevemente, las células unidas al fondo de la placa se fijaron mediante la adición de ácido tricloracético frío (TCA, 4°C, Aldrish, Dorset, UK) en la parte más alta del medio del crecimiento (TCA final 20% w/v) . La placa se colocó a 4°C durante una hora antes de ser delicadamente lavada cinco veces con agua de la llave. Se le permitió secarse al aire, o auxiliada con un 5 secador de aire para acelerar el proceso de secado, después se adicionó a cada pozo durante 30 minutos 50 µl de SRB al 4% w/v disuelto en 1% de ácido acético en agua. Al final del período de teñido, el SRB no ligado se removió por medio de lavado cuatro veces con ácido acético al 1%. La placa se seco nuevamente con aire, y se adicionaron dentro de cada pozo 150 µl de diez mM de Tris base acuosa (Sigma-Aldrich Co. Ltd, Irvine, UK) para solubilizar la tintura unida a la célula. La placa fue agitada durante 15 minutos en un agitador giratorio seguido por la lectura de la densidad óptica (OD) a 550 nm en un espectrofotómetro de microplaca (Anthos Labtec HT3, versión 1.06) Ejemplo 1 20 Optimización de las condiciones de incubación- concentración de FBS y densidad de las células de siembra Previo a la prueba de los extractos herbales, se establecieron las condiciones ópticas de cultivo. Los 25 factores variables con respecto a las condiciones de incubación incluyen la concentración de suero fetal bovino (FBS), la densidad inicial de las células de siembra y el período de incubación. Para determinar la concentración óptima de FBS, se usaron para cultivar la línea celular melan-a 1, 2, y 5% de FBS, el modelo de crecimiento con cada concentración de FBS fue monitoreado mediante el ensayo SRB. Para la determinación de la densidad óptima de las células de siembra, se colocaron en placas de 96 pozos una serie inicial de células de siembra de 0.15 a 1.2 X 104 por pozo de células melan-a con 5% de FBS y 20 nM de medio de crecimiento suplementado con tetradecanoil phorbol acetato (TPA) . El modelo de crecimiento se monitoreo con el ensayo SRB a intervalos diarios. El cultivo se extendió durante 8 días; en el día 4 se remplazó el medio en las placas restantes.

Resultados El efecto de las concentraciones de FBS en el crecimiento de melan-a La condición óptima para el control experimental negativo, es que las células ni crezcan demasiado rápido ni declinen de manera dramática. El rápido crecimiento podría enmascarar cualquier efecto estimulante sutil originado por los extractos herbales, aunque una declinación dramática en el número de las células indica condiciones de cultivo poco favorables para la supervivencia de las células, lo cual podría llevar a daño celular. La Figura 1 muestra las curvas de crecimiento de la línea celular melan-a a tres diferentes concentraciones de FBS. Ni el medio suplementado con FBS al 1% ni el de 2% fueron capaces de mantener a las células vivas; el número de células declinó de manera significativa en 4 días de cultivo. Sin embargo, 5% de FBS fue capaz de mantener viva a la línea celular melan-a con solamente un ligero incremento en el número de células observados a los 4 días. El TPA (20 nM) fue capaz de causar proliferación adicional en la presencia de 5% de FBS indicando que las células fueron capaces de responder al estímulo mitogénico a 5% de FBS. Las observaciones morfológicas en un microscopio revelaron que con medio suplementado con 1% y 2% de FBS, los cuerpos celulares fueron redondos, ligeramente pigmentados con algunos procesos dendríticos y el cultivo desplegado en un modelo de crecimiento en envejecimiento. Sin embargo en 5% de FBS, las células tuvieron más melanosomas y algunas dendritas cortas sin una apariencia de envejecimiento. Por lo tanto se uso 5% de FBS en cada parte en los experimentos de investigación herbal.

Curvas de crecimiento de la línea celular melan-a con varia densidades de siembra.

En la Figura 2, se delinearon las curvas de crecimiento a los 8 días con diferente número inicial de células para elucidar el modelo de crecimiento de la línea celular melan-a en placas de 96 pozos en la presencia de 5% de FBS y 20 nM de TPA. Se determinó la densidad de laminado -?aux?^^? ?^ Si'f-^Piíi^-^?fs íi?í^.^á?Íkí^ .-?«fc«.«~»^_pJ__Íl inicial óptima junto con el propio tiempo de cosecha. Todo del número de laminado inicial de las células mostraron una red de crecimiento en la presencia de TPA y medio suplementado con 5% de FBS, a pesar de que la más 5 alta densidad de laminado de 1.2 X 104 células/pozo agotó el medio de crecimiento en el día 3 de cultivo y las células cesaron de crecer hasta que el medio fue reemplazado. Con las densidades de laminado bajas (2-4 X 103 células/pozo) el ensayo SRB leyó OD que permanecieron relativamente bajas después de 8 días de cultivo. La densidad de laminado inicial de 6 X 103 células/pozo exhibió crecimiento exponencial, y después de 4 días de cultivo, leyó OD incrementado a un valor de alrededor de 0.4. Puesto que los valores más altos de OD se asociaron con la mayor precisión y exactitud, se determinó que la inoculación inicial de 6 X 103 células/pozo era la densidad óptima para el experimento de prueba herbal. Para la simplicidad del experimento, el tiempo de cosecha fue de 4 días puesto que las células en esta etapa no se3 confluyeron y después de 4 días, el medio de crecimiento tendía a ser agotado y era necesario el reemplazo para crecimiento adicional.

Ejemplo 2 25 Experimentos de investigación herbal preliminar.

Las células melan-a fueron sembradas a una densidad de 6 X 103/100 µl/pozo en medio de cultivo estándar suplementado con 0 nM de TPA y 5% de FBS. Después de 4 horas de incubación, los extractos herbales de diferentes concentraciones, los cuales fueron reconstituidos en el medio de crecimiento y esterilizados por filtración (tamaño del poro 0.2 µm) , se adicionaron dentro de cada pozo. Las concentraciones finales de los extractos de plantas fueron 0 (control negativo) 10, 100 y 1000 µg de extracto seco por ml. Se usaron 6 pozos de copia para cada concentración probada, el control negativo (12 pozos) el control positivo (6 pozos, 20 nM TPA), y los pozos de prueba se encontraban todos en la misma placa. El cultivo se terminó después de 4 días y se realizó el ensayo SRB de conformidad con los métodos dados antes.

Resultados El efecto de 30 extractos herbales en la proliferación de la línea celular melan-a La Tabla 1 muestra el resultado de la investigación preliminar de 30 extractos acuosos de hierbas en la proliferación de la línea celular melan-a. Se observaron para estimular la proliferación de melanocitos los extractos crudos de Astragal us membranaceous (Fisch.) Bunge, Ci trus reticulata inmaduro Blanco, Dictamnus dasycarpus Turcz., Ophiopogon japonicus (Thunb.) Kergawe, Piper nigrum L., Poria cocos (Schw.) Wolf y Tribul us terestris L., algunas veces incluso en un nivel de dosificación más bajo de 10 µg/ml. Otros extractos no .„jaSS¿B8S»». tuvieron efecto significativo o fueron citotóxicos. Entre estas respuestas positivas, aquella del extracto de Piper nigrum L. a 0.01 y 0.1 mg/ml fue más pronunciada. El extracto de Piper nigrum a estas dos concentraciones no solamente mejora el crecimiento celular de manera impresionante, sino que este extracto también alteró la morfología celular. En la presencia del extracto de Piper nigrum, los cuerpos celulares fueron más pequeños, con más y más grandes procesos bipolares o polidendríticos, un efecto similar al observado con TPA.

Ejemplo 3 Repeticiones de las pruebas de extracto de Piper nigrum en las células melan-a.

Un extracto de fruta de Piper nigrum preparado nuevamente se probó en un nuevo lote de la línea celular melan-a con el cultivo en microplacas entendido a lo largo de 8 días. El efecto del extracto de Piper nigrum en el crecimiento de la línea celular melan-a se evaluó mediante el ensayo SRB.

Resultados Repeticiones de las pruebas de extracto de Piper nigrum en las células melan-a.

A la luz de los resultados positivos del experimento preliminar, se llevaron a cabo investigaciones adicionales en el extracto de Piper nigrum. La Figura 3 muestra que los resultados del efecto de proliferación significativa alcanzados por el extractro de Piper nigrum fue incluso más marcado en la extensión del periodo de 5 incubación a 8 días de cultivo, el crecimiento fue 272% del control (células solamente) . Microscópicamente, la morfología de las células se alteró de la manera observada en los experimentos preliminares.

Ejemplo 4 Confirmación del efecto de proliferación de Piper nigrum por conteo en hemocitómetro.

Las células melan-a fueron colocadas en cajas de petri (0 15 35 mm, Nuclon, Dinamarca) con una densidad de laminado de 2 X l?Vm.1 y el extracto de Piper nigrum a concentraciones de 0.01 y 0.1 mg/ml. También se dispusieron un control negativo (células en medio solamente) y positivo TPA (20 nM) . Después de 4 días las 20 células en cada caja se cosecharon y contaron con el hemocitómetro.

Resultados Confirmación del efecto de proliferación de Piper nigrum 25 por conteo en hemocitómetro.

El ensayo SRB estima de manera indirecta el número de células a través de la proteína teñida y medidas de a»«_i&&' .J**¡_ w».*»». .- ****** «-»»- . -was- . > An^_. , x> ¡ü B Ítß&*»?> «7> fa& "&- JíSt¡ J " _.» j?^&é i^^^^ espectrofotometría. Para confirmar si el extracto de Piper nigrum estimula la proliferación de las células melan-a, se empleó un método de conteo directo de células con hemocitómetro. La Tabla 2 muestra el número de células en la presencia de extracto de Piper nigrum y 20 nM de TPA. El número de células bajo la influencia del extracto de Piper nigrum a 0.01 y 0.1 mg/ml se incrementó de manera significativa comparada con el control, pero menos que aquella con 20 nM de TPA. Este resultado es consistente con el hallazgo en la microplaca de 96 pozos del ensayo SRB.

Ejemplo 5 Efecto de la piperina en la proliferación de la linea celular melan-a Se disolvió la piperina (sigma-Aldrich Co. Ltd, Irvine UK) en MeOH, se esterilizó por filtración a través de una membrana (tamaño de poro de 0.2 µm) y se diluyó con medio de crecimiento estándar. Las concentraciones finales en el tejido fueron 0.1 y 1 µM. Un experimento separado (datos no mostrados) exhibieron que la concentración de MeOH presente en estos experimentos no fue tóxico o proliferante para las células.

Resultados El efecto de la piperina en la proliferación de la línea celular melan-a El efecto de este compuesto en la línea celular melan-a se muestra en la figura 4. La piperina en las dos concentraciones probadas estimuló de manera significativa la proliferación de melan-a. Este compuesto estimuló cambios morfológicos en las células melan-a, con cuerpos celulares mas pequeños mas y mas grandes dendritas celulares, emulando aquellas alteraciones inducidas por el extracto de Piper nigrum y TPA. Esto indica que la piperina es el principio activo responsable para el efecto de proliferación observada de Piper nigrum .

Ejemplo 6 Prueba de piperina en diferentes tipos celulares para determinar su especificidad A fin de determinar la especificidad de la piperina se emplearon unos panel de diferentes tipos celulares para facilitar esta investigación. Esta se incluyen líneas celulares melan-a, melan-c, SVK14, CSM, XB2, CSl, B16F10, iM9, CAC02, Swiss 3T3 y linfocitos humanos normales. El TPA (20 nm) se probó también en estas células. La Tabla 3 muestra el origen biológico de de las células y el resumen de los protocolos de cultivos celulares . -*¿&JÁMm&á e¡£ ,r . + +« -t-* J *^^i . ^^^ ^^^^^ ^^^^^^^^ás^^ Resultados Los efectos de la piperina y TPA en el crecimiento de un panel de tipos celulares.

A partir de la tabla 4, se puede apreciar que la piperina tiene un efecto altamente selectivo en el crecimiento de un panel de tipos celulares, puesto que ésta solamente estimula los melanocitos de ratón (melan-a, melan-c) , los melanoblastos humanos (FM21E) , los melanocitos humanos (EM21E) , y las líneas celulares de fibroblastos de ratón SCI en la concentración probada. La línea de célula SCI puede tener una sensibilidad particular al TPA debido a la manera en la cual ésta se ha derivado, es decir, ésta se ha cultivado en la presencia de TPA. No obstante, la piperina no tiene efecto o tiene un efecto citotóxico en otras células. Este resultado implica que la piperina puede tener el índice de especificidad deseable para la proliferación de melanocitos en cultivo, y no es un mitógeno general. En nuestro sistema experimental, el TPA, un activador PKC bien conocido y un agente promotor de tumor, tienen efectos similares a la piperina en los tipos de célula probados, salvo porque el TPA estimula sorprendentemente el linfocito humano y la proliferación del fibroblasto 3T3, en tanto que la piperina obviamente careció de tal -actividad. Al parecer la piperina es un estimulante menos potente que el TPA.

Ejemplo 7 Modo de acción: efecto de RO-31-8220 en el crecimiento de las células melan-a con'piperina y TPA La línea celular melan-a cultivada con un ,µM de piperina y 20 nM de TPA de manera separada se colocan en una placa de 96 pozos, se introdujo 1 µl de RO-31-8220 (Calbiochem-Novabiochem) a diferentes concentraciones en DMSO con una micro-siringe dentro de los pozos para alcanzar las concentraciones del RO-31-8220 final de 0 (control), 0.1, 1, 5, 10, 100 nM, con concentraciones finales de DMSO menores a 0.01% v/v, a las cuales en DMSO no mostró efecto tóxico ni proliferante para las células en un experimento separado ( datos no mostrados) . Se usaron 6 pozos copia para cada concentración. El cultivo se incubó durante 4 días antes de que ser terminado y procesado con el ensayo SRB para evaluar el crecimiento de las células melan-a .

Resultados Modo de acción: efecto de RO-31-8220 en el crecimiento de las células melan-a con piperina y TPA La figura 5 muestra el efecto de RO-31-8220 en la supervivencia y crecimiento de la línea celular melan-a en la presencia o ausencia de piperina y TPA. El RO-31-8220 solo no tuvo efectos citotóxico significativo para las células en las concentraciones superiores a 100 nM. - ?^^& ^á ^^^¡^^ ^_yjB.W8B.-M» - , *» a- «r **•*&&& *i& .

Sin embargo, los efectos proliferantes de piperina, y TPA (como se indicó mediante los valores del eje de la Y) en las células melan-a se inhibieron de manera efectiva debido a la presencia de RO-31-8220 en las concentraciones de 0.1 - 100 nM. De esta manera se aparenta que la piperina y el TPA ejercen sus efectos proliferantes a través de la activación de la vía de señalización celular PKC.

También se ha aprobado la selectividad de la piperina en el crecimiento de un panel de tipos celulares. Se encontró que la piperina posee una claramente alta especificidad y selectividad hacia los melanocitos, puesto que esta estimula de manera significativa el crecimiento en cultivo melan-a, melan-c y melanoblastos FM21E y melanocitos FM21E, aunque esta no estimuló a todas las otras células alejadas de una línea celular de fibroblastos sensibles a TPA. Se observo que la piperina tiene efectos inhibitorios en la línea celular del melanoma del ratón B16 la cual es singeneica con las células melan-a. De esta manera la piperina puede ser un estimulante especifico para la proliferación de melanocitos en piel vitiligosa sin el riesgo de estimulación de células de melanoma.

Ejemplo 9 Experimentos en melanoblastos humanos en cultivo Los melanoblastos humanos en cultivo en este experimento se establecieron de suero fetal bovino. Se subcultivaron e inocularon en microplacas de 96 pozos con 6 X 10 células/100 µl/pozo, los melanoblastos subconfluentes mantenidos en el medio MCDB 153 suplementado con 10 % de FBS, 10 ng/ml del factor de célula madre (SCF) y un nM de endotelina 3. Después de la incubación en la atmósfera humidificada, 10% de C02, a 37a C durante 3-4 horas para permitir la ligadura de las células en la placa, la piperina disuelta en MeOH y agua se adicionó en los pozos. Las concentraciones finales de piperina fueron 1, 5, 10, 100 µM, con TPA (20 nM) como control positivo. Se usaron seis copias en cada grupo de tratamiento, con 12 pozos usados para el control del vehículo. La incubación se condujo durante 5 días antes de que las células se cosecharan mediante la mezcla con ácido tricloroacético frío (TSA, a 4a , concentración final de 20% v/v ) , y evaluado el número celular usando un ensayo SRB. Se empleó ANOVA de una vía y la prueba de t de Dunnett para probar la significancia de algunas diferencias entre los grupos de tratamiento y el control del vehículo. Se expresó el crecimiento en la presencia de piperina y TPA como % de incubaciones control que no contienen piperina o TPA. Los experimentos se repitieron usando melanoblastos de 3 donadores diferentes.

Resultados La Fig. 6 muestra el efecto de la piperina en el crecimiento in vi tro de los melanoblastos humanos. Se 5 encontró que la piperina a concentraciones de 1, 10, 100 µM causa estimulación significativa para los melanoblastos humanos en una manera de respuesta a la dosis, con 34 % mas producción celular comparada al control del vehículo cuando el cultivo se expuso a 100 µM de piperina en cultivo durante 5 días. El TPA, un agente estimulante del crecimiento melanocítico bien conocido, también fue capaz de causar crecimiento celular significativo en las concentraciones probadas, con arriba del 50% de producción celular observada cuando el cultivo se expuso a 20 nM durante 5 días. En los otros experimentos respectivos la piperina se observó consistentemente que la piperina induce de manera significativa el crecimiento celular en las concentraciones que van de 5-100 µM; estos efectos estimulatorios fueron de manera general menores que aquel de TPA. Morfológicamente, en la presencia de piperina los melanoblastos aparentaron ser más dendríticos y los cuerpos celulares fueron más aplanados y más pequeños.

Ejemplo 10 Experimentos en melanocitos humanos en cultivo Los melanocitos humanos usados en este experimento se derivaron de la diferenciación inducida de melanoblastos fetales humanos. La clave distintiva de los melanocitos humanos que los hace diferentes de sus melanoblastos precursores consiste en su habilidad para sintetizar melanina. La melanina es un marcador válido para los melanocitos. El concentrado celular de melanocitos humanos exhibe un color característico de café a negro, a pesar de que los melanoblastos humanos no puede producir melanina estando por esto desprovistos de color café o negro en el concentrado celular.

Se emplearon dos protocolos para los experimentos en los melanocitos humanos en cultivo. El primero empleado y evaluado el número celular con el ensayo SRB fueron placas de 24 pozos. El segundo empleado fueron cajas de petri y el número celular se contó con una cámara de hemocitómetro .

Para el primer protocolo, se subcultivaron melanocitos humanos subconfluentes mantenidos en una caja de petri de 0100 mm en dos placas de 24 pozos (Falco) utilizando medio de cultivo básico de RPMI 1640 suplementado con FBS (10%), bFGF (lOOpM), CT (1 nM) y endotelina 1 (1 nM). La densidad de laminado inicial fue de 20,000 células/cm2 (38,200 células/pozo) conteniendo cada pozo 1000 µl del medio. Después de la incubación en una atmósfera húmeda, 10% de C02, a 37°C durante 2 - 3 horas ara permitir la unión de las células, se agregó dentro de los pozos la piperina en 500 µl de medio para alcanzar las concentraciones finales de 0, 1, 5, 10 y 100 µM. También se dispusieron como control negativo las células solas en el medio que carece del suplemento mencionado antes de endotelina 1. Se utilizaron seis copias encada grupo de tratamiento, y el cultivo se incubó durante 5 días antes de que las células se cosecharan mediante la mezcla con TCA frío (concentración final de 20%) y se procesaran con el ensayo SRB. La solución teñida de SRB solubilizada se trasfirió a una placa de 96 pozos para lectura de densidad óptica.

Para el segundo protocolo, se subcultivaron melanocitos humanos subconfluentes en una caja de petri de 060 mm (28 cm2, Falcon) con medio básico RPMI 1640 suplementado con FBS (10%), CT (1 nM) , bFGF (100 pM) y endotelina 1 (1 nM) . La densidad de laminado inicial fue de 10,000 células/cm2, con 5 ml de medio por caja. Las células se incubaron durante 2 - 3 horas en una atmósfera húmeda, 10% de C02, a 37°C, seguido por la adición de piperina en solución a las cajas, alcanzando las concentraciones finales de 0, 1, 5, 10 y 100 µM. se dispusieron como un control negativo las células en el medio suplementado anterior que carece de endotelina 1. Se utilizaron tres cajas para cada tratamiento y el cultivo se mantuvo durante 5 días antes de que las células se cosecharon mediante adición de tripsina y se contaran con una cámara de hemocitómetro. Para el experimento de producción de melanina, las células cosechadas fueron centrifugadas y concentradas. Después de la remoción cuidadosa del medio, se utilizó NaOH (1 M) para solubilizar los concentrados 5 celulares y leer la densidad óptica a 475 nm en un espectrofotómetro UV Perkin-Elmer (modelo UV/VIS Lambda 2) . El contenido de melanina se calculó por medio del uso de una ecuación de regresión y = 0.005 + 0.005x que corresponde a la curva de calibración para la melanina 0 sintética.

Resultados La Figura 7 delinea los efectos de la piperina en el 5 crecimiento de los melanocitos humanos cultivados en placa de 24 pozos. La pipepna en las concentraciones de y 10 µM estimula de manera marcada el crecimiento de estas células pigmentadas, con 36% más células producidas cuando el cultivo se encuentra bajo la influencia de 10 0 µM de piperma por espacio de 5 días. Sin embargo, a 100 µM, la piperma ejerce efecto inhibitorio en el crecimiento de estas células. Además, en la presencia de 1 nM de endotelma 1, el TPA a 20 nM no fue capaz de estimular el crecimiento celular en un sistema de 5 cultivo, un resultado que es de gran diferencia con aquel observado en los melanoblastos humanos.

La Tabla 5 muestra los efectos de la piperina en el crecimiento de los melanocitos humanos cultivados en cajas de petri. Es sobresaliente que en la presencia de ET 1 (1 nM) , la piperina a las concentraciones de 5 y 10 µM estimulan de manera significativa el crecimiento de los melanocitos humanos, con el número celular por arriba tanto como dos veces más que aquel del control de ET1 (1 nM) cuando este tipo de célula melanocítica se expuso a 5 µM de piperina durante 5 días. Este resultado fue congruente con aquel obtenido de los experimentos de placas de 24 pozos, y sirvió para confirmar que los efectos estimulatorios observados mediante el ensayo de SRB se listaron debido al número celular incrementado en vez de al aumento de la producción de proteína sola.

TABLAS Tabla 1. Investigación preliminar de 30 extractos herbales acuosos en la proliferación de la línea celular melan-a detectada mediante el ensayo SRB después de 4 días de cultivo.

O *P < 0.01 comparado con el tratamiento vehículo (ANOVA de una vía seguida por la prueba de t de Dunnett) .

Tabla 2. Efectos del extracto de Piper nigrum en la proliferación de las células melan-a contadas con hemocitómetro.

*P < 0.01 comparado con el tratamiento vehículo (ANOVA de una vía seguida por la prueba de t de Dunnett) . J Tabla 3. Origen biológico y las condiciones de cultivo de un panel de diferentes tipos celulares usadas en el experimento selectivo. OJ 00 O V Tabla 4. Efectos de la piperina y TPA en el crecimiento de un panel de tipos celulares (ver Tabla 3 para detalles acerca de las células) -fc *P < 0.05 comparado al tratamiento con el vehículo solo (ANOVA de una vía seguida por la prueba de t de Dunnett) ; ND = no realizado. Se usaron las desviaciones estándar relativas de todos los valores menores a 10% de la media Tabla 5. Efectos de la piperina en la proliferación y producción de melanina de melanocitos humanos cultivados en cajas de petri. 4-.

*, ' P < 0.05 cuando se comparó con el control (InM) de ETI (ANOVA de una vía seguida por la prueba de t de Dunnett) ; Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: -xi ^JÍi -s^^^ -_feS

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. El uso en la preparación de un medicamento para la estimulación de la proliferación de melanocitos de un compuesto de fórmula (I) en el cual (a) n es 0, 1, o 2, m es 2, los dos R1 juntos representan un grupo 3' , 4' -metilenodioxi, R2 y R3, junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono y, cuando n es 1 o 2, R4 y R5, junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono y R6 es piperidino, o (b)n es 1 y (i) m es 3, dos R1s juntos que representan 3' , 4' -metilenodioxi y el otro 6' -metoxi; o (ii) m es 2, los R1s siendo 3' -hidroxi-4' -metoxi; o (iii) m es 1 y el R1 es 4' -hidroxi; y R2 a R6 se definen como en el caso (a) anterior, o (c) n es 1, R6 es piperidino, isobutilamino o metoxi y todos los demás símbolos se definen como en el caso (a) arriba, o (d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y tanto R2 como R3 también los representan o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono; y m, R1 y R6 se encuentran definidos como en el caso (a) anterior : y en la totalidad de cuyos casos (a) a (d) la molécula se encuentra en la configuración geométrica E,E o todo E o en el caso (a) cuando n es 1 puede estar de manera opcional en la configuración geométrica Z,Z, Z,E o E,Z.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1 de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para la repigmentación de la piel despigmentada.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en la cual la piel despigmentada es piel post-traumatizada despigmentada .

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de un compuesto de fórmula (I) en la preparación de un medicamento para el tratamiento de vitíligo .

5. El uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de la piel de un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1.

6. El uso de conformidad a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en los cuales el compuesto de fórmula (I) se encuentra en la forma de un extracto de planta.

7. Un compuesto de fórmula (I! en el cual (a) n es 0, 1, o 2, m es 2, los dos Rxs juntos representan un grupo 3' , 4' -metilenodioxi, R2 y R3, junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono y, cuando n es 1 o 2, R4 y R5, junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono y R6 es piperidino, o (b)n es 1 y (i) m es 3, dos R1s juntos que representan 3' , 4' -metilenodioxi y el otro 6'-metox? o (ii) m es 2, los R1s siendo 3' -hidroxi-4' -metoxi; o (iii) m es 1 y el R1 es 4' -hidroxi; y R2 a Rd se definen como en el caso (a) anterior, o 5Sfe«Ja». «- ia»,/^W?A¿>>. ~<afo£jafc_.. . * * .¿88988». ÜBtüSCtlMlfláa (c) n es 1, R6 es piperidino, isobutilamino o metoxi y todos los demás símbolos se definen como en el caso (a) arriba, o (d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y tanto R2 como R3 también los representan o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono; y m, R1 y R6 se encuentran definidos como en el caso (a) anterior: y en la totalidad de cuyos casos (a) a (d) la molécula se encuentra en la configuración geométrica E,E o todo E o en el caso (a) cuando n es 1 la molécula se encuentra necesariamente en la configuración geométrica Z,Z, Z,E o E,Z para uso en terapia.

8. Un compuesto de fórmula (I) de conformidad a la reivindicación 7 para la repigmentación de piel despigmentada .

9. Un compuesto de fórmula (I) de conformidad a la reivindicación 8 caracterizado porque la piel despigmentada es piel post-traumatizada despigmentada.

10. Un compuesto de fórmula (I) de conformidad a las reivindicaciones 7 u 8 para el tratamiento de vitíligo.

11. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un acarreador farmacéuticamente aceptable y una &_ n¿®c --& .je ? ..' Ma¿«&*&. cantidad farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (I) en el cual (a) n es 0, 1, o 2, m es 2, los dos R1s juntos representan un grupo 3' , 4' -metilenodioxi, R2 y RJ, junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono y, cuando n es 1 o 2, R4 y R5, junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono y R6 es piperidino, o (b) n es 1 y (i) m es 3, dos R1s juntos que representan 3' , 4' -metilenodioxi y el otro 6' -metoxi; o (ii) m es 2, los R1s siendo 3' -h?drox?-4' -metoxi; o (iii) m es 1 y el R1 es 4'-h?drox?; y R2 a R6 se definen como en el caso (a) anterior, o (c) n es 1, R6 es piperidmo, isobutilamino o metoxi y todos los demás símbolos se definen como en el caso (a) arriba, o (d) n es 1, R4 y R5 representan átomos de hidrógeno y tanto R2 como R3 también los representan o R2 y R3 junto con los átomos de carbono a los cuales estos se encuentran unidos forman un doble enlace de carbono; y m, r &»iaf L4 «H¿¡é$¡fr R1 y R6 se encuentran definidos como en el caso (a) anterior : y en la totalidad de cuyos casos (a) a (d) la molécula se encuentra en la configuración geométrica E,E o todo E o 5 en el caso (a) cuando n es 1 la molécula puede estar de manera opcional en la configuración geométrica Z,Z, Z,E o E,Z.

12. Un método de mejoramiento cosmético del color de la 10 piel caracterizado porque comprende la administración a un paciente que desea mejorar su color de piel de una cantidad efectiva cosméticamente de un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1. 15 20 25