KR20240001075A

KR20240001075A - 호박손 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20240001075A
Application number: KR1020230082226A
Authority: KR
Inventors: 임태규; 홍수정; 이소정; 임원철
Original assignee: 세종대학교산학협력단
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2023-06-26
Publication date: 2024-01-03

Abstract

본 발명은 가열 추출방법 또는 초음파 추출 방법에 의해 제조된 호박손(호박덩굴손)추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 피부미백 화장료 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 초음파 추출방법에 의해 제조되어, 항산화 및 피부미백 효과가 우수하고 피부에 부작용이 없는 호박손 추출물을 함유하는 항산화 또는 피부미백 화장료 조성물을 제공한다.

Description

호박손 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물{SKIN WHITENING COMPOSITION CONTAINING PUMPKIN'S TENDRIL EXTRACT}

본 발명은 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 호박손 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 부작용이 없으면서도 피부의 멜라닌 색소 생성을 억제하고 색소 침착을 저해함으로써 우수한 미백 효과를 제공한다. 본 발명은 또한 호박손 추출물의 피부 미백 효과를 높이는 제조방법을 제공한다.

현대인들이 건강에 관심이 많아짐에 따라 천연, 친환경적 화장품에 대하여 다양한 연구가 활발하게 이루어져 있다. 기능성 화장품에도 과거 화학성분 기반의 미백, 항산화제, 자외선 차단, 방부, 항균제 등이 들어간 경우보단 천연물 유래 소재를 사용한 화장품에 대한 관심이 높아지고 있다.

여러 천연 소재 중에서 동물유래 소재는 동물복지와 광우병, 돼지콜레라, 조류독감 등으로 동물유래 소재에 대한 소비자의 거부감 증대로 식물성 원료를 이용한 기능성 화장품들의 개발이 활발히 이루어지며 천연물 성분을 사용한 항산화, 미백, 주름개선, 자외선차단 등의 복합 기능성 화장품에 대한 소비자의 수요가 높아지고 있다.

기능성 화장품이란 미백, 주름개선, 자외선 차단과 같이 특정 기능이 첨가된 에센스, 세럼, 크림, 파우더, 베이스 등 다양한 사용단계의 화장품을 말한다. 하나의 제품에 복합기능이 포함된 다기능성화장품도 개발되어 사용의 간편성이 높아지고, 모공케어, 영양공급, 탄력강화, 여드름 치료, 미백과 자외선 차단 등 다양한 목적에 따라 특화된 제품들도 출시되고 있다.

신규 단일물질의 국내유입이 어렵고 거대 화장품 업체가 미백과 자외선 차단의 복합기능성 제품 개발에 집중하고 있어 미백 소재가 급부상하고 있다.

현재까지 피부 미백과 주름개선 효과를 가지는 화장용 소재의 개발 및 사업화가 활발히 진행되었으며 오존층 파괴로 인한 자외선 노출량 증가로 인해 자외선차단제의 수요와 상품화에 대한 수요가 증가하고 있다.

한편, 호박은 산후부종의 치료와 이뇨작용에 효과가 있을 뿐만 아니라 당뇨병, 야맹증, 각막건조 등에도 우수한 효과가 있으며, 배설기능을 향상시켜 변비가 예방되고 기관지 질환인 기침이나 천식에도 탁월한 효과가 있는 것으로 동의보감 등의 옛 문헌에 기록되고 있다.

최근에는 호박 식물의 열매뿐 아니라 줄기 부위에 해당하는 호박손에 대해서도 관심을 갖게 되었는데, 호박손이란 호박덩굴손이라고도 하며, 이는 호박의 줄기로부터 뻣어나와 용수철의 형상과 같이 꼬불꼬불 말려있는 모양의 것으로, 호박줄기 및 열매가 자라면서 자신의 무게를 지탱하고자 주변 식물이나 지지대를 감싸며 무게를 지탱하는 역할을 하는 호박 덩굴의 한 부분을 말한다.

이와 같은 호박손은 임신부들에게 효능이 있는 것으로 알려져 있는데, 임신 초기에 붓기를 빼고, 임신 중 복부 통증 및 출산 전 배 뭉침 현상을 완화시켜주며, 자궁 출혈을 억제해주어 유산을 방지해주는 효과가 있다고 알려져 있으며, 이는 동의보감 등의 옛 문헌을 통해서도 그 효능이 확인되고 있다. 이러한 호박손을 이용하여 피부 미백효과를 도출한 연구결과는 미비한 상태이며, 특히 호박손 추출물의 추출 방법과 관련된 연구는 알려진 바가 없다.

따라서, 본 발명자는 호박손 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물을 제조할 수 있으면, 이를 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있는 화장료 조성물 및 약학 조성물로 응용할 수 있음을 도출하고 본 발명을 완성하였다.

발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 피부 부작용이 적으면서도 멜라닌 생성을 억제함으로써 우수한 피부 미백효과를 갖는 화장료 조성물 및 그 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호박손 추출물을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, "호박손(pumpkin's tendril)"은, 호박의 줄기 부분을 의미하며, 호박덩굴 또는 호박덩굴손이라고도 불리운다.

본 발명의 호박손 추출물은, 초음파 추출 또는 가열추출된 것일 수 있으며, 가열 추출되는 경우 2시간 내지 3시간 동안 가열된 것, 초음파 추출된 경우 약 30분 내지 1시간 동안 초음파 처리된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 호박손의 초음파 추출 시, 호박손은 초음파를 20kHz 내지 30 kHz의 주파수로 실온 (약 20℃내지 30℃)에서 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 호박손의 추출 시 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, n-부탄올, n-헥산 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매 등이 사용될 수 있나 이에 제한되는 것은 아니다. 호박손의 추출 시 상기 용매로는 60% 내지 70%(바람직하게는 70%)의 에탄올을 용매로하여 추출된 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 스킨류, 로션류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 호박손 추출물을 포함하는, 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서, 상기 과색소성 질환은 기미, 주근깨, 반점, 일광흑자, 약물성 색소침착, 염증성 색소침착, 노인성 색소침착 및 임신성 색소침착을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, (1) 호박손을 준비하는 단계; 및 (2) 상기 호박손을 초음파 추출하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 조성물의 제조방법이 제공된다. 본 발명에서, 상기 단계 (2)의 초음파 추출은, 초음파를 20 kHz의 주파수로 30분 내지 3시간 동안 처리하는 것일 수 있다.

상기와 같이 본 발명은 가열 추출방법 또는 초음파 추출 방법에 의해 제조된 호박손(호박덩굴손)추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 피부미백 화장료 조성물, 약학 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 초음파 추출방법에 의해 제조되어, 항산화 및 피부미백 효과가 우수하고 피부에 부작용이 없는 호박손 추출물을 함유하는 항산화 또는 피부미백 화장료, 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 항산화 활성증진, 티로시나아제 활성 저해, 멜라닌 생성 억제에 유의적인 효과를 갖는 호박손 추출물의 제조방법을 제공하고, 이에 따라 제조된 호박손 추출물은 추출 수율이 우수할 뿐만 아니라 항산화 및 피부미백효과가 우수하여, 화장료 조성물, 약학 조성물 제조에 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 호박손 추출물의 세포독성 실험 결과이다. 도 1을 참조하면, 본원 발명에 따라 제조된 호박손 추출물은 세포독성이 비처리군과 비슷한 결과를 갖는 바, 세포 독성이 미미한 것으로 확인된다.
도 2는 에탄올 추출 방법에 따라 제조된 호박손 추출물의 총 폴리페놀 함량(위) 및 총 플라보노이드 함량(아래)을 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 호박손 가열 추출물의 항산화 효능을 DPPH 분석 결과로 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 호박손 가열 추출물의 티로시나아제 저해능을 분석한 결과이다.
도 5는 가열 추출 방법에 따라 제조된 호박손 추출물의 멜라닌 생성 저해능을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 호박손 초음파 추출물의 멜라닌 저해 활성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 호박손 가열 추출물과 호박손 초음파 추출물의 항산화 효능을 비교한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 머쉬룸 티로시나아제 저해능 실험에 따른 결과로, 상대적인 티로시나아제 활성을 나타낸다. 도 8를 참조하면, 호박손 초음파 추출물(도 8에서 초음파)이 호박손 가열 추출물(도 8에서 가열) 보다 티로시나아제 저해 활성이 크다는 것을 알 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 호박잎 초음파 추출물(도 9에서 호박잎), 호박씨 초음파 추출물(도 9에서 호박씨) 및 호박손 초음파 추출물(도 9에서 호박손)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인한 결과이다. 도 9를 참조하면, 호박손 초음파 추출물에서 가장 활성이 크다는 것을 알 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 호박잎 초음파 추출물(도 10에서 호박잎), 호박씨 초음파 추출물(도 11에서 호박씨) 및 호박손 초음파 추출물(도 10에서 호박손)을 각각 처리한 후 머쉬룸 티로시나아제 저해능을 분석한 결과이다. 도 10을 참조하면, 호박손 초음파 추출물의 경우, 다른 추출부위보다 티로시나아제 활성 억제 정도가 크다는 것을 알 수 있다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 호박잎 초음파 추출물(도 11에서 호박잎), 호박씨 초음파 추출물(도 11에서 호박씨) 및 호박손 초음파 추출물(도 12에서 호박손)을 각각 처리한 후 멜라닌 분비량을 확인한 결과이다. 도 11를 참조하면, 호박잎 또는 호박씨 초음파 추출물과 달리, 호박손 초음파 추출물의 경우 양성대조군보다 더 낮은 정도의 멜라닌 분비량이 나타낸 바, 호박손 초음파 추출물에 유의적인 미백효과가 있다는 것을 알 수 있다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 호박잎 초음파 추출물, 호박씨 초음파 추출물 및 호박손 초음파 추출물을 각각 처리한 후 L-도파(DOPA) 산화물인 Dopaquinone의 생성량을 확인한 결과이다. 도 12을 참조하면, 호박손 초음파 추출물을 처리한 경우 L-DOPA 산화물의 함량이 낮게 나타나 멜라닌 생성 억제에 효과적임을 알 수 있다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 호박손 추출물을 처리한 후 멜라닌 합성에 관여하는 분자적 신호 경로인 TRP-1, TRP-2, MITF, Tyrosinase,p-CREB의 단백질 발현 수준을 확인한 결과이다. 도 13을 참조하면, 호박손 초음파 추출물을 함유한 조성물은 피부에서 멜라닌 생성에 관여하는 효소의 발현을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 호박손 추출물을 처리하여 인체 피부 세포 조직의 어둡기를 현미경으로 확인하고, 조직 내 염색된 멜라닌 수준을 확인한 결과이다. 도 14를 참조하면, 호박손 초음파 추출물을 함유한 조성물은 효소 및 세포 수준에 이어 인체 피부에서도 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 호박손 추출물을 처리하여 제브라피쉬 내 생성된 멜라닌 수준을 확인한 결과이다. 도 15를 참조하면, 호박손 초음파 추출물을 함유한 조성물이 다양한 피부미백 평가모델에서 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자는 호박손을 분석한 결과, 플라보노이드 및 페놀 화합물이 존재하고, 미백, 항산화 활성 등의 기능성 피부미용특성을 갖는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 하여 호박손 추출물을 활용하는 경우 고부가가치의 기능성 피부미용제품을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 호박손 추출물을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 통상의 방법으로 수득될 수 있나, 바람직하게는 호박손을 비 가열 조건에서 출력 750 와트 내지 1000와트(바람직하게는 750와트), 진폭 20 내지 30% (바람직하게는 30%), 펄스는 20초 내지 30초간(바람직하게는 20초) 초음파 진동을 가하고, 다시 20초 내지 30초간 휴지, 주파수 20 kHz 내지 50kHz(바람직하게는 20kHz)를 설정하여 약 30분 내지 3시간(바람직하게는 1시간 내지 2시간 또는 30분 내지 1시간) 동안 추출하여 제조될 수 있다.

본 발명의 초음파 처리시 진폭은 100%(20 ㎛) 기준으로부터 20 내지 30%(4 내지 6㎛)로 설정하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 초음파 처리시 진폭은 6㎛로 설정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 호박손 추출물은 호박손을 물 또는 유기용매를 사용하여 추출한 후 농축 및 건조하여 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 호박손 추출물을 제조하기위한 상기 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, n-부탄올, n-헥산 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매 등이 사용될 수 있나 이에 제한 되는 것은 아니며, 상기 용매로는 물, 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 물 또는 유기용매를 이용하여 추출물을 얻은 이후에는 당업계에서 알려진 통상의 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무건조 또는 동결건조할 수도 있다.

본 발명의 유효성분으로 포함되는 호박손 추출물은 티로시나아제 저해 활성, 항산화 활성 및 멜라닌 합성 저해 활성을 가져 우수한 피부미백, 피부노화 방지 효과를 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, "피부미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "피부노화"는 주름살, 기미, 주근깨, 자외선에 의한 피부 손상, 피부암을 의미한다.

상기와 같은 호박손 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 피부미백 또는 피부노화 방지용 조성물일 수 있다. 상기 호박손 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 1~50중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1~20중량%로 포함되는 것이다. 그 함량이 1중량% 미만일 경우에는 피부미백 또는 피부노화 방지의 효과가 미미할 수 있으며, 50중량%를 초과할 경우에는 사용량 대비 효과가 미미할 수 있다.

상기와 같이 호박손 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 호박손 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제 및 담체가 더 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물에는 글리세린, 부틸렌 글라이콜, 폴리옥 시에칠렌 경화피마자유, 토코페릴 아세테이트, 시트릭산, 판테놀, 스쿠알란, 소듐 시트레이트, 알란토인 등의 보조성분이 추가로 더 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 기본적으로 피부에 도포되는 것이므로, 당업계의 화장료 조성물을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 마스크팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 포함될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등의 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로 용매, 용해화제, 유탁화제 등이 포함될 수 있고, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 등의 액상 희석제; 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 등의 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 호박손 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 피부 노화 개선용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 호박손 추출물을 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 바람직하게는 비경구제제일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 호박손 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 효과를 위한 피부 외용제의 제형으로 제공할 수 있다.

상기 호박손 추출물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

상기 호박손 추출물이 피부 외용제 제형으로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제와 같은 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 특히 바람직하게 비경구용 제제로 이용될 수 있으며, 예를 들어, 피부외용제는 바세린, 스테아릴알콜 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 기제; 폴리소르베이트, 솔르비탄 세스퀴올레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 계면활성제; 글리세린 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 보습제; 약제학적으로 허용되는 적당한 용제; 및 착향제, 착색제, 안정화제, 점성화제 등을 균질하게 혼합하는 통상의 피부외용제 제조방법에 의해서 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 호박손 추출물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 공지의 피부 미백, 탄력 증진, 주름개선, 및 보습 성분을 포함할 수 있을 것이다. 추가적인 피부 미백, 탄력 증진, 주름개선, 및 보습 성분을 포함하게 되면 본 발명의 조성물의 피부 미백, 탄력 증진, 주름개선, 및 보습 효과는 더욱 증진될 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 상기 조성물은 당업계에 공지된 피부 탄력 또는 주름 개선 성분으로서, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물; 당업계에 공지된 미백 성분으로서, 코즈산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(LAscorbicacid); 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 피부 안전성, 상기 호박손 추출물의 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효량의 상기 호박손 추출물을 포함할 때 바람직한 피부 미백 효과 (이외, 탄력 증진 효과, 주름개선 효과, 및 보습 효과 등)을 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, '유효량'이라 함은 피부 미백 효과를 나타낼 수 있는 호박손 추출물의 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 상기 호박손 추출물의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태, 상기 호박손 추출물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 조성물이 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 상기 호박손 추출물을 포함할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물의 사용량은 연령, 병변의 정도 등의 개인 차이나 제형에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 1일 1회 내지 수회 적당량을 피부에 도포하여 1 주일 내지 수개월 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.

1-1. 호박손 추출물의 제조

호박손 가열 추출물의 제조

본 실험에서 사용한 호박손은 '국내산 건 호박줄기'를 사용했으며, 15.7 g을 증류수 300 mL에 침지시키고 70℃에서 3시간 주정 추출을 진행하였다. 3시간 후 감압여과기를 이용해 20 μm 여과지로 여과하고, 동결건조를 통해 호박손 추출 분말을 확보하였다.

호박손 초음파 추출물의 제조

본 실험에서 사용한 호박손은 '국내산 건 호박줄기'를 사용했으며 15.7 g을 70% 주정 300 mL에 침지시키고 상온에서 초음파 추출을 진행하였다. 구체적인 추출 조건은 비 가열 조건에서 출력 750 와트, 진폭 30%, 주파수 20 kHz로 설정되었으며, 펄스는 20초 초음파 진동을 가하고, 다시 20초 휴지하는 방식으로 총 1시간 초음파 진동시간을 설정하였다. 1시간 후 상기 추출물을 감압여과기를 이용해 20 μm 여과지로 여과하고, 진공 농축을 통해 추출용매를 제거하고 동결건조를 통해 호박손 추출 분말을 확보하였다.

상기 호박손 가열 추출물 및 호박손 초음파 추출물의 제조 공정은 하기 표 1과 같은 차이가 있다. 하기 표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 호박손의 초음파 추출물은 호박손 가열 추출물 보다 짧은 추출시간 동안 낮은 온도(열에너지 불필요)에서 진행됨에도 추출수율이 더 높아, 초음파 추출방법을 이용하였을 때 더 경제적임을 알 수 있다.

추출방법	호박손 가열 추출물	호박손 초음파 추출물
추출온도	70℃	30℃
추출시간	3시간	1시간
추출 수율	26.15%	36.32%

1-2. 호박잎 추출물 및 호박씨 초음파 추출물의 제조

호박잎 초음파 추출물의 제조

본 실험에서는 호박잎 15.7 g을 70% 주정 300 mL에 침지시키고 상온에서 초음파 추출을 진행하였다. 구체적인 추출 조건은 비 가열 조건에서 출력 750 와트, 진폭 30%, 주파수 20 kHz로 설정되었으며, 펄스는 20초 초음파 진동을 가하고, 다시 20초 휴지하는 방식으로 총 1시간 초음파 진동시간을 설정하였다. 1시간 후 상기 추출물을 감압여과기를 이용해 20 μm 여과지로 여과하고, 진공 농축을 통해 추출용매를 제거하고 동결건조를 통해 호박잎 추출 분말을 확보하였다.

호박씨 초음파 추출물의 제조

본 실험에서는 호박씨 15.7 g을 70% 주정 300 mL에 침지시키고 상온에서 초음파 추출을 진행하였다. 구체적인 추출 조건은 비 가열 조건에서 출력 750 와트, 진폭 30%, 주파수 20 kHz로 설정되었으며, 펄스는 20초 초음파 진동을 가하고, 다시 20초 휴지하는 방식으로 총 1시간 초음파 진동시간을 설정하였다. 1시간 후 상기 추출물을 감압여과기를 이용해 20 μm 여과지로 여과하고, 진공 농축을 통해 추출용매를 제거하고 동결건조를 통해 호박씨 추출 분말을 확보하였다.

1-3. 호박손 추출물의 유효성분 분석

<폴리페놀 함량 측정>

96-well plate에 호박손추출물 및 표준적정곡선을 위한 Gallic acid를 농도별로 40 μL씩 분주한 다음, 각 well에 1N 폴린-시오칼토 페놀 시약 20 μL 및 Na₂CO₃60 μL씩 분주한다. 이 후, 호일로 차광하여 shaker에서 30분간 반응 시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하여 표준적정곡선으로부터 구해진 Gallic acid 함량을 기준으로 페놀 함량을 계산하였다.

<플라보노이드 함량 측정>

96-well plate에 호박손추출물 및 표준적정곡선을 위한 Quercetin 25 μL씩 넣어주고 그 위에 증류수 125 μL씩 분주한 후, 각 well에 5% NaNO₂ 8 μL씩 분주하고 shaker에 5분간 반응시킨다. 그 다음 각 well에 10% AlCl₃ 15 μL씩 분주하고 shaker에 6분간 반응시킨다. 다시 각 well에 NaOH 50 μL 및 증류수 27 μL씩 분주하여 파이펫으로 잘 섞이게 한 후, 510 nm에서 흡광도를 측정하여 표준적정곡선으로부터 구해진 Quercetin의 함량을 기준으로 플라보노이드의 함량을 계산하였다.

도 2는 가열 추출 방법에 따라 제조된 호박손 추출물의 총 폴리페놀 함량(좌측) 및 총 플라보노이드 함량(우측)을 확인한 그래프이다. 70% 농도의 에탄올로 70

에서 3시간 기존 추출조건을 이용하여 추출한 호박손 추출물에서 총 폴리페놀 함량은 약 200 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량이 약 200 mg QE/g으로 나타난다.

호박손 추출물의 효능 분석

2-1. 호박손 추출물의 항산화 효능 분석

DPPH 라디칼에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해 96-well plate에 호박손 및 양성대조군을 위한 ascorbic acid를 농도별로 80 μL씩 분주한 다음, 0.2 mM DPPH 시약 및 DMSO, MeOH를 80 μL씩 분주한다. 이 후, 호일로 차광하여 shaker에서 30분간 반응 시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성(%) = 1 - {(시료 처리군 및 양성대조군의 흡광도 - 시료 보정군의 흡광도)/(DPPH 흡광도 보정군의 흡광도 - 용매 보정군의 흡광도)}*100

도 3은 가열 추출 방법에 따라 제조된 호박손 추출물의 항산화 효능을 분석한 그래프이다. 도 3를 참조하면, 호박손 가열 추출물은 농도의존적으로 항산화 효능이 나타나는 것을 확인할 수 있다.

2-2. 티로시나아제 저해능 분석

티로시나아제 활성 억제 효능 분석은 튜브에 20 μL의 0.1 potassium phosphate 버퍼를 넣고, 여기에 0.02 mg/mL mushroom tyrosinase를 20 μL 넣고 첨가한 후, 본 발명의 호박손초음파추출물을 농도별로 40 μL 첨가하여 25

에서 10분간 반응 시켰으며, 기질로 1 mM L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)를 40 μL 넣고 25℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 475 nm 파장영역에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 티로시나아제 활성 억제 정도를 분석하였다.

도 4는 가열 추출 방법에 따라 제조된 호박손 추출물의 티로시나아제 저해능을 분석한 결과이다. 본 발명에 따라 제조된 호박손 추출물은 티로시나아제 억제 활성이 있음을 확인할 수 있다.

2-3. 멜라닌 생성 억제 효과 확인

멜라닌 생성 억제 효능 분석은 멜라노마(B16F10 Melanoma) 세포를 6 cm dish에 3Х10⁴ cell/dish로 접종한 후 37℃에서 세포가 30% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 각 농도별로 호박손 추출물을 첨가하고 1시간 배양하였다. 1시간 후 α-MSH (멜라닌 세포 자극 호르몬)을 100 nM과 농도별로 호박손 추출물이 든 배지를 추가하였고 음성대조군에는 배지만 처리하고, 양성대조군에는 멜라닌 세포 자극 호르몬만 든 배지를 처리하여 72시간 동안 추가로 배양하였다. 72시간 후 배지를 수거하여 96-well plate에 배지 100 μL를 분주하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하였다.

도 5는 가열 추출 방법에 따라 제조된 호박손 추출물의 멜라닌 생성 저해능을 분석한 결과이다. 도 5를 참조하면, 호박손 추출물을 처리하였을 때, 양성대조군(PC)보다 멜라닌 생성이 저해되었음을 알 수 있으며, 멜라닌 생성 억제에 있어서 음성대조군(NC)과 유사하거나 이보다 효과가 더 좋음을 알 수 있다.

2-4. 호박손 초음파 추출물의 미백활성 비교

멜라닌 생성 억제 효능 분석은 멜라노마(B16F10 Melanoma) 세포를 6 cm dish에 3Х10⁴ cell/dish로 접종한 후 37℃에서 세포가 30% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 각 농도별로 호박손 추출물을 첨가하고 1시간 배양하였다. 1시간 후 α-MSH (멜라닌 세포 자극 호르몬)을 100 nM과 농도별로 호박손 추출물이 든 배지를 추가하였고 음성대조군에는 배지만 처리하고, 양성대조군에는 멜라닌 세포 자극 호르몬만 든 배지를 처리하여 72시간 동안 추가로 배양하였다. 72시간 후 배지를 수거하여 96-well plate에 100 μL를 분주하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하였다.

도 6은 본 발명에 따라 제조된 호박손 초음파 추출물의 멜라닌 저해 활성을 확인한 결과이다. 도 6을 참조하면, 호박손 초음파 추출물을 처리하였을 때, 양성대조군(PC)보다 멜라닌 생성이 저해되었음을 알 수 있으며, 멜라닌 생성 억제에 있어서 음성대조군(NC)과 유사하거나 이보다 효과가 더 좋음을 알 수 있다. 특히, 도 5와 비교하였을 때, 호박손 가열 추출물의 경우 약 30% 내지 35% (약 33%) 수준의 멜라닌 분비 감소 효능을 나타냈으나, 호박손 초음파 추출물의 경우 약 40% 내지 60% (약 50%) 수준의 멜라닌 분비 감소 효능을 나타나, 초음파 추출물의 경우 멜라닌 생성 억제 효과가 유의적임을 알 수 있다.

2-5. 호박손 초음파 추출물의 항산화 효능 비교

도 7은 본 발명에 따라 제조된 호박손 가열 추출물과 호박손 초음파 추출물의 항산화 효능을 비교한 결과이다. 도 7을 참조하면, 초음파 추출물의 경우 동일 시간동안 추출하였을 때, 가열추출물보다 더 높은 수준의 항산화 효능이 나타남을 알 수 있다.

호박손 초음파 추출물의 효과 비교

3-1. 호박손 초음파 추출물 및 열수 추출물의 티로시나아제 저해능 비교

실시예 1-1에 따라 제조된 호박손 초음파 추출물과 가열 추출물에 멜라닌 생성 과정의 주요 효소인 티로시네이스(Tyrosinase)에 대한 억제 활성이 있는지 확인하기 위해, mushroom 티로시네이스(Tyrosinase) 활성 억제 실험을 수행하였다.

티로시나아제 활성 억제 효능 분석은 튜브에 20 μL의 0.1 potassium phosphate 버퍼를 넣고, 여기에 0.02 μg/mL mushroom tyrosinase를 20 μL 넣고 첨가한 후, 본 발명의 호박손 초음파추출물을 농도별로 40 μL 첨가하여 25℃에서 10분간 반응 시켰으며, 기질로 1 mM L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)를 40 μL 넣고 25℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 475 nm 파장영역에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 티로시나아제 활성 억제 정도를 분석하였다.

도 8은 본 발명에 따라 제조된 호박손 가열 추출물과 호박손 초음파 추출물의 티로시나아제 저해 활성을 비교한 결과이다. 도 8에서 '가열추출'은 본 발명에 따른 호박손 증류수 가열 추출물의 티로시나아제 저해능 분석 결과이고, '초음파 추출'은 본 발명에 따른 호박손 에탄올 초음파 추출물의 티로시나아제 저해능 분석 결과이다. 도 8를 참조하면, 호박손 초음파 추출물은 더 적은 시간에 걸쳐 제조되는 경우에도, 더 오랜 시간 가열 추출한 호박손 가열 추출물보다 높은 수준의 티로시나아제 저해 활성 효과를 갖는다. 즉, 본 발명의 초음파 추출물은 더 적은 시간 추출하여도 충분한 미백효과를 도출할 수 있음을 알 수 있다.

3-2. 호박잎, 호박씨 및 호박손 초음파 추출물의 항산화 활성 확인

본 실시예에서는 실시예 1-1에 따라 제조된 호박손 초음파 추출물과 실시예 1-2에 따라 제조된 호박잎, 호박씨 초음파 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인하였다.

도 9를 참조하면, 800 μg/mL의 각 추출물을 처리하였을 때, 호박씨 추출물에서는 소거 활성이 나타나지 않았으며, 호박잎, 호박씨 추출물 보다 호박손 추출물에서 DPPH라디칼 소거 활성이 더 크다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 호박손 추출물에서 항산화 효과가 가장 크고, 유의적임을 알 수 있다.

3-3. 호박잎, 호박씨 및 호박손 초음파 추출물의 티로시나아제 억제 활성 확인

본 실시예에서는 실시예 1-1에 따라 제조된 호박손 초음파 추출물과 실시예 1-2에 따라 제조된 호박잎, 호박씨 초음파 추출물의 티로시나아제 저해능 효과를 확인하였다.

티로시나아제 활성 억제 효능 분석은 튜브에 20 μL의 0.1 potassium phosphate 버퍼를 넣고, 여기에 0.02 μg/mL mushroom tyrosinase를 20 μL 넣고 첨가한 후, 본 발명의 호박손초음파추출물을 농도별로 40 μL 첨가하여 25

에서 10분간 반응 시켰으며, 기질로 1 mM L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)를 40 μL 넣고 25

에서 30분간 반응시켰다. 이후 475 nm 파장영역에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 티로시나아제 활성 억제 정도를 분석하였다.

도 10을 참조하면, 각 추출물을 400 μg/mL씩 처리하였을 때, 호박잎 추출물 또는 호박씨 추출물은 양성대조군보다 티로시나아제 활성이 커, 미백효과가 미미함을 알 수 있다. 반면, 본원 발명에 따른 호박손 초음파 추출물은 양성대조군 보다 티로시나아제 활성이 낮아, 처리에 따른 티로시나아제 저해능이 크다는 것을 확인할 수 있다. 본 결과에 따르면, 호박손 추출물은 호박의 다른 부위 대비 예기치 못한 미백효과가 발생한다는 것을 알 수 있다.

3-4. 호박잎, 호박씨 및 호박손 초음파 추출물 처리에 따른 멜라닌 분비량 측정

본 실시예에서는 실시예 1-1에 따라 제조된 호박손 초음파 추출물과 실시예 1-2에 따라 제조된 호박잎, 호박씨 초음파 추출물의 멜라닌 분비 억제 효과를 확인하였다.

멜라닌 생성 억제 효능 분석은 멜라노마(B16F10 Melanoma) 세포를 6 cm dish에 3Х10⁴ cell/dish로 접종한 후 37℃에서 세포가 30% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 각 농도별로 호박잎, 호박씨 또는 호박손을 각각 첨가하고 1시간 배양하였다. 1시간 후 α-MSH 멜라닌 세포 자극 호르몬을 100 nM과 농도별로 부위별 호박 추출물이 든 배지를 추가하였고 음성대조군에는 배지만 처리하고, 양성대조군에는 멜라닌 세포 자극 호르몬만 든 배지를 처리하여 72시간 동안 추가로 배양하였다. 72시간 후 배지를 수거하여 96-well plate에 100 μL를 분주하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 상기 과정을 총 3회 반복하였고 평균값을 측정하여 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하였다.

도 11의 A 및 B를 참조하면, 각 추출물을 100 μg/mL씩 처리하였을 때, 호박잎 추출물과 호박씨 추출물의 경우, 멜라닌 분비량이 양성대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 반면, 호박손 추출물의 경우, 양성대조군, 호박잎 추출물 및 호박씨 추출물 보다 유의적으로 낮은 멜라닌 분비량을 나타냈다. 본 실시예에 따르면, 호박손 추출물에는 호박의 다른 부위에서 도출할 수 없는 유의한 미백효과가 존재함을 알 수 있고, 특히, 호박의 특정 부위를 분리하여 초음파 추출했을 때 미백효과가 반드시 나타나는 것은 아님을 알 수 있다.

3-5. 호박잎, 호박씨 및 호박손 초음파 추출물의 미백 활성 확인

본 실시예에서는 실시예 1-1에 따라 제조된 호박손 초음파 추출물과 실시예 1-2에 따라 제조된 호박잎, 호박씨 초음파 추출물을 농도별로 처리하여, 도파(DOPA)의 산화활성을 저해하는지 여부를 확인하였다.

멜라닌 생성 억제 효능 분석은 멜라노마(B16F10 Melanoma) 세포를 6 cm dish에 3Х10⁴ cell/dish로 접종한 후 37℃에서 세포가 30% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 각 농도별로 호박손, 호박잎, 호박씨를 첨가하고 1시간 배양하였다. 1시간 후 α-MSH 멜라닌 세포 자극 호르몬을 100 nM과 농도별로 호박손, 호박잎, 호박씨가 든 배지를 추가하였고 음성대조군에는 배지만 처리하고, 양성대조군에는 멜라닌 세포 자극 호르몬만 든 배지를 처리하여 72시간 동안 추가로 배양하였다. 72시간 후 멜라노마(B16F10 Melanoma) 세포를 lysis buffer로 용해하고 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화 하였다. 동량의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 겔을 사용하여 분리하였다. 50 kDa 이하의 부분의 겔을 잘라 coomassie brilliant blue 용액에 담가 반응시켰다. 50~75 kDa 부분은 0.1 M sodium phosphate monobasic buffer에 두 번 세척하였다. 0.1 M sodium phosphate monobasic buffer를 이용하여 10 mM L-DOPA 용액을 제조하였다. 제조된 용액에 겔을 넣어 37℃로 준비된 shaking water bath에서 3시간 반응시켰다.

도 12를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 호박손 추출물의 경우, 호박잎 추출물 또는 호박씨 추출물을 처리하였을 때 보다, L-DOPA 산화물의 함량이 낮게 나타나, L-DOPA 산화 활성 저해율(항산화능)이 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 호박손 초음파 추출물을 함유한 조성물은 피부에서 도파(DOPA)의 산화 활성을 저해함으로써 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

3-6. 호박손 초음파 추출물의 멜라닌 합성 억제 기전 확인

멜라닌 합성 억제 기전 분석은 멜라노마(B16F10 Melanoma) 세포를 6 cm dish에 3Х10⁴ cell/dish로 접종한 후 37℃에서 세포가 30% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 각 농도별로 호박손 추출물을 첨가하고 1시간 배양하였다. 1시간 후 α-MSH 멜라닌 세포 자극 호르몬을 100 nM과 농도별로 호박손 추출물이 든 배지를 추가하였고 음성대조군에는 배지만 처리하고, 양성대조군에는 멜라닌 세포 자극 호르몬만 든 배지를 처리하여 확인하고자 하는 단백질의 발현 양상에 따라 MITF 단백질은 6시간, p-CREB 단백질은 3시간, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase 단백질들은 각각 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 세포를 lysis buffer로 용해하고 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화 하였다. 동량의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 겔을 사용하여 분리하고 25 V 15분 동안 polyvinylidene difluoride membrane으로 옮겼다. Membrane을 실온에서 1시간동안 3% 소 혈청 알부민용액으로 반응시키고 특정 1차 항체와 함께 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 이 후, tris-HCl buffer로 10분동안 3회 세척하고 Horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체와 함께 40분동안 반응시켰다. Membrane을 세척한 후 chemiluminescence reader 를 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.

도 13을 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 호박손 추출물의 처리에 따라 멜라닌 합성에 관여하는 분자적 신호 경로인 TRP-1, TRP-2, MITF, Tyrosinase, p-CEEB의 단백질 발현 수준을 농도의존적으로 억제함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 호박손 초음파 추출물을 함유한 조성물은 피부에서 멜라닌 생성에 관여하는 효소의 발현을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

3-7. 재구성된 인간 피부 세포 조직에서의 호박손 초음파 추출물의 미백 활성 확인

재구성된 인간 피부 세포 조직에서의 미백 활성 분석은 피부조직의 한천을 제거하고 12-well plate로 옮긴 후 각 농도별로 호박손 추출물과 양성대조군인 알부틴을 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 7일 동안 유지하였다. 인간 피부 세포 조직에서의 멜라닌 생성 억제를 확인하기 위해 7일째 현미경 분석을 실시하고 image J software로 피부색을 측정하여 비교하였다. 피부 조직의 조직학적 염색을 위해 폰타나-마손 염색 분석은 60℃ 인 ammoniacal silver solution에서 피부 조직이 갈색이 될 때까지 반응시켰다. 그 후, 0.2% gold chloride solution for 30초, 5% sodium thiosulfate solution에서 1분동안 순차적으로 반응시켰다. 피부 조직의 핵 염색을 하기 위해 nuclear fast red solution에서 5분동안 반응시킨 후, absolute alcohol을 사용하여 탈수 시켰다. 이후, 현미경을 사용하여 멜라닌이 염색된 부분을 확인하였다.

도 14를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 호박손 추출물의 처리에 따라 인체 피부 세포 조직의 어둡기와 조직 내 염색된 멜라닌 수준이 감소됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 호박손 초음파 추출물을 함유한 조성물은 효소 및 세포 수준에 이어 인체 피부에서도 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

3-8. 제브라피쉬에서의 호박손 초음파 추출물의 미백 활성 확인

제브라피쉬에서의 미백 활성 분석은 채집된 배아가 8시간 발달 후, 호박손 추출물을 각 농도별로 처리하고 72시간 후 멜라닌 침착을 현미경으로 관찰하였다. 체내 침착 된 멜라닌 함량을 측정하기 위해 제브라피쉬를 1Х 트립신으로 처리하고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이 후, 1N NaOH로 80℃에서 1시간 동안 멜라닌 색소를 용해시켰다. 96-well plate에 분주하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율과 부화율은 3일 동안 매일 살아남아 부화한 제브라피쉬 수를 세어 측정하였고, 형태학적 기형은 EVOS XL Core Imaging System을 이용하여 대조군과 비교하여 측정하였다.

도 15를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 호박손 추출물의 처리에 따라 제브라피쉬 내 생성된 멜라닌 수준이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 이는 본 발명의 호박손 초음파 추출물을 함유한 조성물이 다양한 피부미백 평가모델에서 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

호박손 추출물을 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 호박손 추출물은 초음파 추출된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 호박손 추출물은 호박손을 20kHz 내지 50 kHz의 주파수에서, 750 내지 1000 와트로 20초 내지 30초간 초음파를 가한 후, 20초 내지 30초간 휴지하는 과정을 30분 내지 3시간 동안 반복처리하여 추출된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 호박손 추출물은 에탄올을 용매로하여 추출된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
제4 항에 있어서,
상기 호박손 추출물은 70% 농도의 에탄올로 추출된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 스킨류, 로션류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인, 피부 미백용 화장료 조성물.
호박손 추출물을 포함하는, 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7 항에 있어서,
상기 과색소성 질환은 기미, 주근깨, 반점, 일광흑자, 약물성 색소침착, 염증성 색소침착, 노인성 색소침착 및 임신성 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 과색소성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
(1) 호박손을 준비하는 단계; 및
(2) 상기 호박손을 초음파 추출하는 단계를 포함하는, 피부 미백용 조성물의 제조방법.
제9 항에 있어서,
상기 단계 (2)의 초음파 추출은, 호박손을 20kHz 내지 50 kHz의 주파수에서, 750 내지 1000 와트로 20초 내지 30초간 초음파를 가한 후, 20초 내지 30초간 휴지하는 과정을 30분 내지 3시간 동안 반복처리하는 것인, 피부 미백용 조성물의 제조방법.