JP5583882B2 - テロメラーゼ活性を増大させるための組成物および方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、細胞内のテロメラーゼ活性を誘導する方法および組成物に関する。

（発明の背景および参考文献）
（テロメラーゼ）
テロメラーゼは、テロメアの両端へのテロメア反復付加を触媒するリボ核蛋白質である。テロメアは、染色体の両端をキャップする反復配列の長い延伸体であり、染色体を安定化させると考えられている。ヒトにおいて、テロメアは、典型的に７〜１０ｋｂの長さであり、−ＴＴＡＧＧＧ−の複数反復配列から成っている。テロメラーゼは、成人細胞の多くにおいて発現されず、テロメアの長さは、度重なる複製に伴って短くなる。ある一定の複製回数の後に、テロメアの累進的短縮により、細胞はテロメアの危機段階に入り、次いでそれが細胞の老化へと至る。一定の疾患は、早発性細胞老化をもたらす急速なテロメア損失に関連している。ヒト細胞におけるヒトテロメラーゼ蛋白質をコードする遺伝子発現により、恐らく細胞の生来の老化経路を迂回することによる不死表現型が与えられることが示されている。さらに、短いテロメアを有する老化細胞において、テロメラーゼ遺伝子の発現により、テロメアの長さの増加および幼若細胞に典型的に関連した表現型の回復が生じることが示されている。

腫瘍細胞および一定の幹細胞とはコントロール的に、体細胞は、テロメラーゼ活性を僅かしか持たないか、または全く持たず、少なくとも幾つかの染色体のテロメア両端が、危機的な長さまで短縮すると、分裂を停止し、プログラム化された細胞老化（細胞死）へと至る。老化に至りつつある体細胞におけるテロメア反復の損失が、低テロメラーゼ活性により増加するため、テロメア反復の配列をテロメアに付加する作用を有するテロメラーゼ活性の誘導により、死ぬべき運命にある体細胞に複製能力の増強が提供され、老化細胞が、損傷組織の修復時に増殖し、適切に細胞周期から抜け出る能力が与えられる。

体細胞におけるテロメラーゼ活性増大の治療的利益になる可能性のあるものとしては、例えば、感染したＣＤ４^＋細胞を殺す働きを担っている細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋細胞）の早期老化を特徴とするＡＩＤＳの治療（例えば、Ｄａｇａｒａｇら、２００３年を参照）；アルツハイマー病における神経保護（例えば、Ｍａｔｔｓｏｎ、２０００年を参照）；創傷治療および副腎皮質細胞（例えば、Ｔｈｏｍａｓら、２０００年を参照）または骨髄細胞または間質性／間充織移植片細胞（例えば、Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、２００２年を参照）などの外移植片細胞の維持が挙げられる。これらの文献の完全な引用は下記に刊行されている。

テロメラーゼのこれら、ならびに他の特徴を検討している文献としては、以下のものが挙げられる：
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Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｒ．Ｃ．ら、「Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｓｈｏｗ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｏｆ ＨＳＣ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｂｌｏｏｄ（ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）２００３年３月２７日；
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Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．ら、米国特許第６，０９３，８０９号（２０００年７月２５日）；
Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．ら、米国特許第６，１６６，１７８号（２０００年１２月２６日）；
Ｃｅｃｈ，Ｔ．Ｒ．ら、米国特許第６，２６１，８３６号（２００１年７月）；
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Ｆｕｎｋ，Ｗａｌｔｅｒ Ｄ．ら、「Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｅｒｍａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｔｏ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ａｇｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ａ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｓｋｉｎ ｍｏｄｅｌ」、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｃｈ ２５８（２）：ｐ．２７０−２７８（２０００年８月１日）；
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Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．ら、「Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｕｓｉｎｇ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ」、ＰＣＴ国際出願公開第９９／３５２４３（１９９９年７月）；
Ｈａｒｌｅ−Ｂａｃｈｏｒ，Ｃら、「Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｂａｓａｌ ｌａｙｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｉｎｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｉｎ ｉｍｍｏｒｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｋｉｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（１３）：ｐ．６４７６−８１（１９９６年６月２５日）；
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Ｏｈ，Ｈ．およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｄ．、「Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ」、Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ３４（７）：ｐ．７１７−２４（２００２年７月）；
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Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．、Ｙａｎｇ，Ｌ．およびＨｏｒｎｓｂｙ，Ｐ．Ｊ．「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８（１）：ｐ．３９−４２（２０００年１月）；
Ｖａｓａ，Ｍ．ら、「Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｄｅｌａｙｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ」、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７（７）：ｐ．５４０−５４２（２０００）；
Ｖｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，Ｂ．ら、米国特許第５，５８３，０１６号（１９９６年１２月）；
Ｗｅｓｔ，Ｍ．Ｄ．ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ｄｅｒｅｐｒｅｓｓ ｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、米国特許第６．００７，９８９号（１９９９年１２月）；
Ｗｈｉｔｅ，Ｍ．Ａ．「Ａｓｓｅｍｌｙ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ」、ＰＣＴ国際出願公開第２０００／０８１３５号（２０００年２月）；
Ｙａｎｇ，Ｊ．ら、「Ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｉｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国）１９（３）：ｐ．２１９−２４（２００１年３月）；
Ｙａｎｇ，Ｊ．ら、「Ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｆｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３７）：Ｐ．２６１４１−８（１９９９年９月１０日）；
Ｙｕｄｏｈ，Ｋ．ら、「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔｈｅ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｈｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ」、Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．１６（８）：ｐ．１４５３−１４６４（２００１）。

テロメラーゼ活性を治療的に増大させる方法は、例えば、上記に全て引用したＢｏｄｎａｒ（１９９７）、Ｗｈｉｔｅ（２０００）、Ｈａｎｎｏｎら（１９９９；２０００）、Ｆｒａｎｚｅｓｅら（２００１）、およびＹｕｄｏｈら（２００１）によって研究されている。これらの報告において、テロメラーゼ活性は、一般にヒトのテロメラーゼの蛋白質成分をコードする遺伝子、ｈＴＲＴの過剰発現により、またはテロメラーゼの組立てを媒介する蛋白質、例えば、熱ショック蛋白質（Ｗｈｉｔｅ）の発現により増大させられる。Ｆｒａｎｚｅｓｅらは、ＨＩＶ感染の治療に処方されるプロテアーゼ阻害剤であるサキナビルが、末梢血の単核細胞におけるテロメラーゼ活性を増大させると報告しており；Ｖａｓａらは、一酸化窒素（ＮＯ）前駆体の投与により、テロメラーゼの活性化とそれにより生じる内皮老化の遅れを記載している。

（アストラガロシド類およびギンセノシド類）
アストラガロシドファミリーおよびギンセノシドファミリーの化合物は、種々の生物学的作用を有していることが報告されている。アストラガロシド類およびギンセノシド類の生物学的活性を検討している文献としては、以下のものが挙げられる：
Ｂｅｄｉｒ，Ｅ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｙｃｌｏａｒｔａｎｅ−ｔｙｐｅ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ」、Ｂｉｏｌ ＆ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ２３（７）：ｐ．８３４−７（２０００）；
Ｂｉｎｄｅｒ，Ｂ．ら、「Ｕｓｅ ｏｆ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｓａｐｏｎｉｎｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒ１（ＮＲ１） ａｎｄ／ｏｒ ａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅ（ＡＳＩＶ） ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ」、米国特許第５，７７０，５７８号（１９９８年６月）；
Ｃａｌｚａｄａ，Ｌ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｃ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ（ａｒｇｅｎｔａｉｎｓ Ａ，Ｂ ａｎｄ Ｄ）ｏｎ ｔｈｅ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３（１２）：ｐ．８１５−１６（１９９５）；
Ｃｈｅｎ，Ｘ．ら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｇ１ ｏｎ ｄｏｐａｍｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＰＣ１２ ｃｅｌｌｓ」、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎｉｃａ ２２（８）：ｐ．６７３−６７８（２００１）；
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．ら、「Ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ１」、国際公開第２００１９２２８９号（２００１）；欧州特許出願公開第１２９５８９３号（２００３）；
Ｈｏｎｇ，Ｈ．−Ｙ．ら、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ−Ｒｇ_１ ｏｎ ｐ５６^ｌｃｋ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌｓ」、Ｋｏｒｅａｎ Ｊ．Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｓｃｉ．１９（２）：ｐ．１１７−２１（１９９５）；
Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｎｏｎ−ｔｉｍｂｅｒ ｆｏｒｅｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ」、会議標題：Ｆｏｒｅｓｔ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ：Ｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｂｕｓｉｎｅｓｓ， ａｎｄ ｐｏｌｉｃｙ ｔｏｗａｒｄ ａ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｎｏｎ−ｔｉｍｂｅｒ ｆｏｒｅｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｅｃｔｏｒ；カナダ国オンタリオ州ケノラ、１９９９年１０月１〜４日；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ−Ｎｏｒｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＵＳＤＡ Ｆｏｒｅｓｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｎｏ．ＮＣ−２１７）：ｐ．９３−１０１（２０００）；
Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．ら、「Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ａ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｔｈｉｃａｌ ｈｅｒｂａｌ ｄｒｕｇ，Ｈｏｃｈｕ−ｅｋｋｉ−ｔｏ」、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４４（３）：ｐ．２２３−２３１（１９９９）；
Ｋｉｎｊｏ，Ｊ．ら、「Ａｎｔｉ−ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆａｂａｃｅｏｕｓ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２３（７）：ｐ．８８７−９（２０００年７月）；
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（発明の要旨）
本明細書に記載されている本発明は、細胞におけるテロメラーゼ活性を増大させる方法およびこのような方法に用いられる組成物に関する。このような方法および組成物は、細胞培養、すなわちインビトロまたはエキソビボにおける細胞、またはヒト対象および非ヒト動物、特に非ヒト動物などの対象の組織において増殖している細胞などのインビボ細胞に使用できる。

特定の実施例において、該組成物は、下記の式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物を含んでなる。本発明の態様は、化粧品、栄養剤および薬剤の適用、特に細胞内のテロメラーゼ活性増大が有益であることが示されているか、または有益であると考えられている場合の適用における使用のための、このような化合物の処方物を含む。細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させる必要性、またはその利益が判断された後で、このような処方物を適用または投与するための方法を含む、このような適用のための化合物またはそれらの処方物の使用法もまた提供される。

本発明は、一態様において、細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させる方法を含む。該方法は、細胞または組織を、下記の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩの単離化合物の処方物と接触させることを含んでなる。好ましい実施形態において、該化合物は、下記の式Ｉまたは式ＩＩの化合物である。さらに該方法は、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する予備工程を含んでなる。

式Ｉ：

の化合物において、
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケト、およびグリコシドから独立して選択され；
ＯＲ^１は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択され；
前記グリコシド上の任意のヒドロキシル基は、前記化合物が最大３つのグリコシドを含むように、さらにグリコシド、低級アルキル、または低級アシルにより置換され得；
Ｒ^２は、メチルであり、以下：

は、９位の炭素と１１位の炭素との間の二重結合を表すか；または好ましい実施形態において、Ｒ^２は、９位の炭素と一緒になって縮合シクロプロピル環を形成し、以下：

は、９位の炭素と１１位の炭素との間の単結合を表す。

好ましくは、該化合物は、ゼロ、１つまたは２つ、より好ましくはゼロまたは２つのグリコシドを含み、該グリコシドのいずれもさらなるグリコシドで置換されない。グリコシドは、Ｄ（天然の）立体配置のものであることが好ましい。

式Ｉの選択された実施形態において、Ｘ^１およびＸ^２の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから独立して選択され、Ｘ^３は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケト、およびグリコシドから選択される。さらなる実施形態において、Ｘ^１は、ＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^２およびＯＲ^１の各々は、独立してＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^３は、ＯＨまたはケトである。式Ｉの例示的化合物としては、アストラガロシドＩＶ、シクロアストラゲノール、アストラゲノール、アストラガロシドＩＶ １６−オン、シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド、およびシクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシドが挙げられる。選択された実施形態において、該化合物は、アストラガロシドＩＶ、シクロアストラゲノール、アストラゲノールおよびアストラガロシドＩＶ １６−オンから選択される。一実施形態において、該化合物は、アストラガロシドＩＶである。

式ＩＩ：

の化合物において、
Ｘ^４およびＸ^５の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケト、およびグリコシドから独立して選択され、
ＯＲ^３は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択され、
前記グリコシド上の任意のヒドロキシル基は、該化合物が最大３つのグリコシドを含むように、さらにグリコシド、低級アルキル、または低級アシルにより置換され得る。

好ましくは、該化合物は、ゼロ、１つ、または２つ、より好ましくはゼロまたは２つのグリコシドを含み、該グリコシドのいずれもさらなるグリコシドで置換されないＤ立体配置のものであることが好ましい。

式ＩＩの選択された実施形態において、Ｘ^４およびＯＲ^３の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択され、Ｘ^５は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびケト（＝Ｏ）から選択される。さらなる実施形態において、Ｘ^４は、ＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々は、ＯＨである。一実施形態においてＸ^４は、ＯＨである。

式ＩＩＩ：

の化合物において、
Ｘ^６、Ｘ^７、およびＸ^８の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケトおよびグリコシドから独立して選択され；
ＯＲ^４は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択され；
前記グリコシド上の任意のヒドロキシル基は、前記化合物が最大３つのグリコシドを含むように、さらにグリコシド、低級アルキル、または低級アシルにより置換され得る。

好ましくは、該化合物は、ゼロ、１つ、または２つのグリコシドを含み、該グリコシドのいずれもさらなるグリコシドで置換されていない、Ｄ立体配置のものであることが好ましい。

式ＩＩＩの選択された実施形態において、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８およびＯＲ^４の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから独立して選択され、ヒドロキシおよびグリコシドから選択されることが好ましい。さらなる実施形態において、Ｘ^８およびＯＲ^４の各々は、ＯＨであり、Ｘ^６およびＸ^７の各々が、ヒドロキシおよびグリコシドから独立して選択される。なお、さらなる実施形態において、ＯＲ^４、Ｘ^６およびＸ^８の各々は、ＯＨであり、Ｘ^７は、グリコシドである。式ＩＩＩの例示的化合物は、ギンセノシドＲＨ１である。

１μｇ／ｍｌの濃度で溶媒中に処方した式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの好ましい化合物は、本明細書に記載されたＴＲＡＰアッセイで測定した時、前記溶媒で処理されたケラチノサイトまたは線維芽細胞中のテロメラーゼ活性レベルをＴＲＡＰアッセイにおいて測定した時よりも、前記細胞における少なくとも５０％超で、テロメラーゼ活性レベルを生じる上で有効である。さらに好ましい実施形態において、該化合物は、本明細書に記載されたＴＲＡＰアッセイで測定した時、前記溶媒で処理されたケラチノサイトまたは線維芽細胞中のテロメラーゼ活性レベルをＴＲＡＰアッセイにおいて測定した時よりも、前記細胞における少なくとも１００％超で、テロメラーゼ活性レベルを生じるのに有効である。

式Ｉ〜ＩＩＩの例示的化合物としては、図１に示されたものが挙げられ、本明細書において、１（アストラガロシドＩＶ）、２（シクロアストラゲノール）、３（アストラゲノール）、４（アストラガロシドＩＶ １６−オン）、５（２ＯＲ，２４Ｓ−エポキシ−３β，１６β，２５−トリヒドロキシ−９β−メチル−１９−ノルラノスタ−１，５−ジエン）、６（シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド）、７（シクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド）、および８（ギンセノシドＲＨ１）と指定される。選択された実施形態において、該化合物は、本明細書において、１（アストラガロシドＩＶ）、２（シクロアストラゲノール）、３（アストラゲノール）、４（アストラガロシドＩＶ １６−オン）、５（２０Ｒ，２４Ｓ−エポキシ−３β，１６β，２５−トリヒドロキシ−９β−メチル−１９−ノルラノスタ−１，５−ジエン）、６（シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド）、および７（シクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド）と指定されるものから選択される。さらなる実施形態において、該化合物は、本明細書において、１、２、３、４および５と指定されるものから選択される。一実施形態において、該化合物は、アストラガロシドＩＶ（１）またはシクロアストラゲノール（２）である
式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物の処方物を、細胞または組織に接触させる方法は、前記接触前に、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定することを含み得る。細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大によって実現すべき利益としては、例えば、前記細胞または前記組織内の細胞の複製能力の増強および／または寿命の延長が挙げられる。

該方法は、対象の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大が望まれるような対象における状態の診断、およびその対象への処方物の投与を含み得る。該対象は、ヒト対象またはヒト患者などの哺乳動物対象であることが好ましい。このような状態としては、例えば、ＨＩＶ感染、神経変性疾患、骨または関節の変性疾患、黄斑変性、アテローム硬化症および貧血などの種々の変性疾患を挙げることができる。このような状態としては、例えば、火傷、擦過傷、切創、移植片部位、感染性因子により生じる病変部、慢性静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍、床擦れ、粘膜潰瘍、およびケロイド形成など、表皮の創傷または他の急性もしくは慢性の状態を挙げることもできる。

したがって、本発明は、上記の患者などの患者の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性を増大させることにより、前記患者における状態を治療する方法を提供し、前記方法は、そのような治療を必要とする患者に、上記に定義した式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩの単離化合物の処方物を投与することを含んでなる。該組成物は、種々の経路、例えば、経口、局所または非経口で投与できる。

本発明は、対象の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性を増大させることにより、対象における治療を必要とする対象に、薬学的ビヒクル中の上記式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物、好ましくは、式ＩまたはＩＩの化合物を投与する方法をさらに提供する。

さらなる態様において、本発明は、表皮細胞を、上記に定義された式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩの単離化合物の局所処方物と接触させることを含んでなる、表皮の急性もしくは慢性状態を治療する方法を提供する。好ましい実施形態において、該化合物は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物である。さらなる実施形態において、該化合物は、アストラガロシドＩＶ、シクロアストラゲノール、アストラゲノール、アストラガロシドＩＶ １６−オン、シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド、シクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド、および２０Ｒ，２４Ｓ−エポキシ−３β，１６β，２５−トリヒドロキシ−９β−メチル−１９−ノルラノスタ−１，５−ジエン（本明細書において、５と指定）から選択される。

該処方物を接触させる細胞としては、また、例えば、細胞ベースの療法のためのエキソビボで接触される外植細胞または培養における他の細胞を挙げることもできる。したがって、本発明は、上記に定義した化合物の選択された実施形態を含む、前記細胞を、上記に定義した式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物を含んでなる組成物の有効量に接触させることを含む、インビトロまたはエキソビボで細胞の複製能力を高める方法を提供する。好ましい実施形態において、該化合物は、上記に定義した化合物の選択された実施形態を含む、式Ｉまたは式ＩＩの化合物である。一般に、該細胞は、非形質転換哺乳動物細胞であり；選択された実施形態において、該細胞は、骨髄幹細胞などの幹細胞、骨髄間質細胞、幼若または初期継代皮膚線維芽細胞、小島前駆体細胞、ニューロスフェア細胞、副腎皮質細胞、筋衛星細胞、骨芽細胞、網膜色素上皮細胞およびＨＩＶ制限ＣＤ８^＋細胞である。

関連した一態様において、本発明は、薬学的に受容可能なビヒクルにおける上記に示された式Ｉの化合物を含んでなる薬学的組成物を提供し、式中：
Ｘ^１およびＸ^２の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケト、およびグリコシドから独立して選択され；
Ｘ_３は、ケトであり；
ＯＲ^１は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択され；
前記グリコシド上の任意のヒドロキシル基は、前記化合物が最大３つのグリコシドを含むように、さらにグリコシド、低級アルキル、または低級アシルにより置換され得；および
Ｒ^２が、メチルであり、以下：

が、９位の炭素と１１位の炭素との間の二重結合を表すか；またはＲ^２が、９位の炭素と一緒になって縮合シクロプロピル環を形成し、以下：

が、９位の炭素と１１位の炭素との間の単結合を表す。

該化合物は、ゼロ、１つまたは２つのグリコシドを含み、該グリコシドのいずれもさらなるグリコシドで置換されないことが好ましく、グリコシドは、Ｄ立体配置のものであることが好ましい。

該組成物の選択された実施形態において、Ｘ^１は、ＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^２およびＯＲ^１の各々は、独立してＯＨまたはグリコシドである。一実施形態において、該化合物は、アストラガロシドＩＶ １６−オン（本明細書において４と指定）である。

あるいは、該組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルにおける上記に示された式Ｉの化合物を含んでなり、式中：
Ｘ^１およびＸ^２のうちの１つは、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびケトから選択され、および他は、グリコシドであり；
Ｘ_３およびＯＲ^１の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから独立して選択され；
前記グリコシド上の任意のヒドロキシル基は、前記化合物が最大３つのグリコシドを含むように、さらにグリコシド、低級アルキル、または低級アシルにより置換され得；および
Ｒ^２が、メチルであり、以下：

が、９位の炭素と１１位の炭素との間の二重結合を表すか；またはＲ^２が、９位の炭素と一緒になって縮合シクロプロピル環を形成し、以下：

が、９位の炭素と１１位の炭素との間の単結合を表す。

該化合物は、１つのグリコシドを含み、該グリコシドがさらなるグリコシドで置換されていないことが好ましく、グリコシドは、Ｄ立体配置のものであることが好ましい。一実施形態において、該化合物は、シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド（本明細書中に６と指定）およびシクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド（本明細書中に７と指定）から選択される。

あるいは、該薬学的組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルにおける上記に定義された式ＩＩの化合物を含んでなる。また、該化合物の選択された実施形態は上記に定義されている。一実施形態において、該化合物は、本明細書において５と指定される化合物である。

また、本発明は、上記に定義され選択された実施形態を含む、上記に定義された式ＩＩの化合物も提供する。一実施形態において、該化合物は、本明細書において５と指定される化合物である。

関連した一態様において、本発明は、上記に定義された式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩの単離化合物の局所用製薬処方物を提供する。また、該化合物の選択された実施形態は上記に定義されている。好ましい実施形態において、該化合物は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物である。さらなる実施形態において、該化合物は、アストラガロシドＩＶ、シクロアストラゲノール、アストラゲノール、アストラガロシドＩＶ １６−オン、シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド、シクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド、および２０Ｒ，２４Ｓ−エポキシ−３β，１６β，２５−トリヒドロキシ−９β−メチル−１９−ノルラノスタ−１，５−ジエン（本明細書において、５と指定）から選択される。局所処方物は、乳化剤、増粘剤および皮膚軟化剤からなる群より選択される１種以上の成分を、典型的に含んでなる。このような組成物は、表皮の創傷または他の急性もしくは慢性状態の治療に使用できる。

他の関連した一態様において、本発明は、上記に定義された式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩの単離化合物の栄養剤処方物を含んでなる栄養剤組成物を提供する。また、該化合物の選択された実施形態は上記に定義されている。好ましい実施形態において、該化合物は、上記の選択された実施形態を含めて、式Ｉまたは式ＩＩの化合物である。さらなる実施形態において、該化合物は、アストラガロシドＩＶ、シクロアストラゲノール、アストラゲノール、アストラガロシドＩＶ １６−オン、シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド、シクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド、および２０Ｒ，２４Ｓ−エポキシ−３β，１６β，２５−トリヒドロキシ−９β−メチル−１９−ノルラノスト−１，５−ジエン（本明細書において、５と指定）から選択される。さらなる実施形態において、該栄養処方物は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物に加えて、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓの抽出エキスであり得る栄養草本抽出エキスを含んでなる。

上記の選択された実施形態を含めて、上記に定義された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物は、細胞または組織におけるテロメラーゼ活性を増大させることによる治療を必要とする疾病を治療する薬剤の製造にも使用できる。そのような疾病の例は、下記でより詳細に検討されている。同様に、上記の選択された実施形態を含めて、上記に定義された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物はまた、表皮の急性もしくは慢性状態の治療用の薬剤製造に使用できる。そのような使用法の好ましい実施形態において、該単離化合物は、上記式Ｉまたは式ＩＩの選択された実施形態を含めて、式Ｉまたは式ＩＩの単離化合物である。

細胞内のテロメラーゼ活性を増大させるために有効な化合物を選択する方法もまた提供される。本法によれば、上記に定義された式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩの化合物の誘導体が、本明細書に記載されたＴＲＡＰアッセイにより測定された時にケラチノサイトまたは線維芽細胞内のテロメラーゼ活性を増大させるその能力に関して試験される。もし１μｇ／ｍｌ以下の濃度において溶媒中に処方された誘導体が、ＴＲＡＰアッセイで測定された時、前記溶媒で処理したケラチノサイトまたは線維芽細胞内のテロメラーゼ活性の測定されたレベルよりも、前記細胞における少なくとも５０％超、好ましくは少なくとも１００％超のテロメラーゼ活性レベルを生じる上で有効である場合に選択される。次いで、この誘導体を、局所用、処方用または栄養ビヒクルと共に処方できる。

また、関連した一実施形態において、表皮の急性もしくは慢性状態の治療用薬剤を選択する方法も提供される。本法によれば、上記に定義された式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩの化合物の誘導体は、本明細書に記載されたスクラッチアッセイにおいて、ケラチノサイトまたは線維芽細胞内の創傷治癒活性に関して試験される。該誘導体は、スクラッチアッセイにおいて測定した時に、１μｇ／ｍｌの濃度で、溶媒コントロールの創傷治癒活性よりも５０％超、好ましくは溶媒コントロールの創傷治癒活性よりも１００％超で創傷治癒活性を有する場合に選択される。次いでこの誘導体を、局所用ビヒクルと共に処方できる。

本発明のこれらの、および他の目的のならびに特徴は、添付の図面と関連させて、以下の本発明の詳細な説明を読むことにより、さらに十分に明らかとなろう。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ． 定義）
本明細書に用いられる以下の用語は、他に指示されない限り、下記の意味を有する。

本明細書に記載された化合物の命名に用いられた一般的な炭素原子番号付け体系は、下記に示されている（構造ＩＩの化合物は、この体系に示された１９位炭素を欠き、構造ＩＩＩの化合物は、１８位炭素を欠いていることに注意されたい。したがって、この番号付け体系は、本発明の組成物を限定する意図はない）。

「アルキル」は、分枝状または線状であり得る、炭素および水素を含有する完全に飽和した非環式の一価の基を言う。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチルおよびイソプロピルがある。「アルコキシ」は、Ｒが上記に定義したアルキルである式ＯＲの基を言う。「アシルオキシ」は、Ｒが上記に定義したアルキルである式−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒの基を言う。したがって、「アシル」は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ基を言う。

「低級アルキル」（または、低級アルコキシまたは低級アシルオキシ）は、１個から６個の炭素原子を有するような基を言い、選択された実施形態において、このような基は、１個から４個の炭素原子、１個から２個の炭素原子または１個の炭素原子を含む（すなわち、メチル、メトキシ、アセチルオキシ）。

「幹細胞」は、出生後の寿命をとおして分裂し、サイクルする能力を保持する共通系列の比較的未分化の細胞を言い、さらに分化し、特殊化し得る細胞を提供する（例えば、皮膚の基底層における、または種々のあらゆるタイプの血液細胞が由来する骨髄における原始細胞などの造血組織における幹細胞）。

化合物に関して「細胞内テロメラーゼ活性の増大に有効な」とは、１μｇ／ｍｌ以下の濃度で、該化合物を含有する組成物が、本明細書に記載されたＴＲＡＰアッセイで測定された時に、該化合物を含有しない同様の処方物をＴＲＡＰアッセイで測定された時に生じるレベルより、少なくとも１．５の因数でより高い（すなわち、少なくとも５０％超）ケラチノサイトまたは線維芽細胞内のテロメラーゼ活性レベルを生じさせるために有効であることを意味する。好ましい実施形態において、該化合物は、本明細書に記載されたＴＲＡＰアッセイで測定された時に、該化合物を含有しない同様の処方物により生じるレベルよりも少なくとも２の因数でより高く（すなわち、少なくとも１００％超）、このような細胞内のテロメラーゼ活性レベルを生じさせるために１μｇ／ｍｌ以下の濃度で有効である。

患者への化合物の投与に関して、「有効量」とは、所望の治療結果が達成されるような、患者の細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させるための有効な量を言う。インビトロまたはエキソビボでの細胞の治療に関して、「有効量」とは、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させ、それによって細胞の複製能力を増大および／または寿命を延長させるために有効な量を言う。

本明細書において％（ｗ／ｖ）で表される濃度において、１００％（ｗ／ｖ）は、１ｇの溶質／ｍｌ溶媒に相当する。例えば、０．１％（ｗ／ｖ）＝１ｍｇ／ｍｌ。

「単離化合物の処方物」とは、処方物を作製するために、単離化合物を１種以上の他の成分（活性成分であっても、または不活性成分であってもよい）と組合わせることにより調製される処方物を言う。該化合物が天然源から直接精製された場合、「単離化合物」の語句は、該化合物（処方前の）が、天然源における該化合物の純度に比較して、１００倍以上精製されていることを必要とする。該化合物が天然源から直接精製されていない場合、「単離化合物」の語句は、（処方前に）１つ以上の化学合成工程を含む方法によって製造され、該化合物の調製物が、５％（ｗ／ｖ）以上の純度を生じさせる化合物を言う。

（ＩＩ． テロメラーゼ活性を増大させるための方法および組成物）
本発明によれば、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させるために、組成物および方法が提供される。本法によれば、細胞または組織を、該化合物の不在下における細胞または組織内のテロメラーゼ活性レベルに比較して、細胞または組織内のテロメラーゼ活性を増大させるための有効な量において、本明細書に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物の処方物と接触させる。また、該方法は、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する予備工程を含み得る。

一実施形態において、該化合物は、式Ｉ：

により表される。

式Ｉにおいて、Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケト、およびグリコシドから独立して選択され、ＯＲ^１基は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択される。選択された実施形態において、Ｘ^１およびＸ^２の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびグリコシドから独立して選択される。

式Ｉの選択された実施形態において、Ｒ^２は、メチルであり、以下：

は、９位の炭素と１１位の炭素との間の二重結合を表す。他の実施形態において、Ｒ^２は、９位の炭素と一緒になって縮合シクロプロピル環を形成し、以下：

は、例えば、化合物１（図１を参照）に示されるように、９位の炭素と１１位の炭素との間の単結合を表す。

式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの対象化合物（または、それらの誘導体）のいずれに関しても、本明細書で用いられる「グリコシド」は、公知のグリコシド（すなわち、リボシド、アラビノシド、キシロシド、リキソシド、アルトロシド、グルコシド、マンノシド、グロシド、イドシド、ガラクトシドおよびタロシド）の１つを意味する。該グリコシドは、典型的に６員環（ピラノース）形態、例えば、グルコピラノシドまたはマンノピラノシドである。選択された実施形態において、該グリコシドは、Ｄ−グリコシドである。すなわち、それは、天然単糖に見られる立体配置を有する。具体的な例としては、Ｄ−リボピラノシド、Ｄ−アラビノピラノシド、Ｄ−キシロピラノシド、Ｄ−グルコピラノシド、マンノピラノシドおよびＤ−ガラクトピラノシドが挙げられる。好ましいグリコシドとしては、Ｄ−グルコピラノシドおよびＤ−キシロピラノシドが挙げられる。さらなる実施形態において、該結合は、β立体配置の結合、例えば、β−Ｄ−グルコピラノシドである。

式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの対象化合物（または、それらの誘導体）に存在するグリコシド環上のいずれの遊離ヒドロキシル基も、さらなるグリコシド、低級アルキルまたは低級アシル、例えばメトキシまたはアセチルオキシによってさらに置換されてもよい。このようなヒドロキシル基の多くて１つが、さらなるグリコシドによって置換されることが好ましい。このようなヒドロキシル基が、さらなるグリコシドによって置換されない；すなわち、置換基は、アセチルなどの低級アシルまたはメチルなどの低級アルキルであることが、より好ましい。一実施形態において、該グリコシド（１つまたは複数の）上の全てのヒドロキシル基は非置換である。

式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの対象化合物（または、それらの誘導体）は、最大３つのグリコシドを含むことが好ましく、また最大２つのグリコシドを含むことがより好ましい。選択された実施形態において、該化合物は、ゼロ、１つまたは２つのグリコシドを含み、該グリコシドのいずれもさらなるグリコシドによって置換されない。さらなる選択された実施形態において、特に式Ｉに関して、該化合物は、ゼロまたは２つのグリコシドを含み、該グリコシドのいずれもさらなるグリコシドによって置換されない。

式Ｉの選択された実施形態において、Ｘ^１およびＸ^２の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、グルコピラノシドおよびキシログリコシドから独立して選択され、Ｘ^３は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケト、グルコピラノシドおよびキシログリコシドから、好ましくは、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびケトから選択される。

式Ｉのさらなる実施形態において、Ｘ^１は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびβ−Ｄ−キシロピラノシドから選択され；Ｘ^２は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびβ−Ｄ−グルコピラノシドから選択され；Ｘ^３は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびケト（＝Ｏ）から選択され；ＯＲ^１は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびβ−Ｄ−グルコピラノシドから選択される。

式Ｉのさらなる選択された実施形態において、Ｘ^１は、ＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^２およびＯＲ^１の各々は、独立してＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^３は、ＯＨまたはケトである。さらなる実施形態において、Ｘ^１およびＸ^２の各々は、ＯＨまたはグリコシドであり、ＯＲ^１は、ＯＨであり、Ｘ^３は、ＯＨである。なおさらなる実施形態において、Ｘ^１は、β−Ｄ−キシロピラノシドであり、Ｘ^２は、β−Ｄ−グルコピラノシドであり、ＯＲ^１は、ＯＨであり、Ｘ^３は、ＯＨである。他の実施形態において、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３およびＯＲ^１の各々は、ＯＨである。

これらの記載された実施形態の各々に関して、さらなる実施形態は、Ｒ^２が、メチルであり、以下：

が、二重結合を表す化合物を含み、一般に好ましい他の実施形態は、Ｒ^２が、９位の炭素と一緒になって縮合シクロプロピル環を形成する化合物を含む。

本発明の方法に用いられる構造Ｉの例示的化合物としては、図１に示され、本明細書において、１（アストラガロシドＩＶ）、２（シクロアストラゲノール）、３（アストラゲノール）、４（アストラガロシドＩＶ １６−オン）、６（シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド）、および７（シクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド）と指定されるものが挙げられる。

３−β−Ｄ−グリコピラノシドによって置換されたシクロアストラゲノール（２）の骨格構造を有する他の化合物もまた、本発明の方法における使用が考慮されている。該化合物は、骨格構造の別個の炭素に結合した合計１つまたは２つのグリコシドを含むことが好ましい（すなわち、１つのグリコシドは、さらなるグリコシドと結合していない）。例としては、天然化合物のアストラガロシドＡ、１、２および７ならびにアストラベルシン（ａｓｔｒａｖｅｒｒｕｃｉｎ）ＩおよびＩＩ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｓから単離できる）が挙げられる。

本発明はまた、Ｘ^１およびＸ^２の１つは、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびケトから選択され、他は、グリコシドである式Ｉの１つ以上の化合物を含んでなる薬学的組成物を提供する。さらなる実施形態において、該化合物は、６および７と指定されるものから選択される。他の実施形態において、該薬学的組成物は、Ｘ_３がケトである式Ｉの化合物を含み；一実施形態において、該化合物は、４と指定される化合物である。

他の態様において、本発明は、式ＩＩ

によって表される化合物を含んでなる薬学的組成物を提供する。

式ＩＩにおいて、Ｘ^４およびＸ^５の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびケト、ならびにグリコシドから独立して選択され、ＯＲ^３は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択され；「グリコシド」およびその種々の実施形態は、上記のとおりである。上記のとおり、該化合物は、最大３つのグリコシドを含み、より好ましくは、最大２つのグリコシドを含む。選択された実施形態において、該化合物は、ゼロ、１つまたは２つのグリコシドを含み、該グリコシドのいずれもさらなるグリコシドによって置換されない。

式ＩＩの選択された実施形態において、Ｘ^４は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択される。さらなる実施形態において、Ｘ^４、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、グルコピラノシドおよびキシロピラノシドから独立して選択される。

式ＩＩのさらなる実施形態において、Ｘ^４およびＯＲ^３の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびグリコシド、好ましくは、Ｄ−キシロピラノシドまたはＤ−グルコピラノシドから選択され、Ｘ^５は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびケト（＝Ｏ）から選択される。これらの実施形態において、ＯＲ^３は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシから選択されることが好ましく、ヒドロキシであることがより好ましい。

式ＩＩのさらなる実施形態において、Ｘ^４、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々は、独立してＯＨまたはグリコシド、例えば、Ｄ−キシロピラノシドまたはＤ−グルコピラノシドである。なおさらなる実施形態において、Ｘ^４は、ＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々は、ＯＨである。一実施形態において、Ｘ^４、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々は、ＯＨである。この化合物（正式の名称は、２０Ｒ，２４Ｓ−エポキシ−３β，１６β，２５−トリヒドロキシ−９β−メチル−１９−ノルラノスタ−１，５−ジエン）は、本明細書において、５と指定される。

本発明はまた、Ｘ^４およびＸ^５の各々が、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケトおよびグリコシドから独立して選択され、ＯＲ^３が、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから選択され、前記グリコシド上のいずれかのヒドロキシル基が、さらなるグリコシド、低級アルキルまたは低級アシルによって置換されてもよい、上記式ＩＩの化合物を提供する。選択された実施形態において、該化合物はゼロ、１つまたは２つのグリコシドを含む。前記各グリコシドが存在する場合、Ｄ立体配置であることが好ましい。さらなる実施形態において、Ｘ^４およびＯＲ^３の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびグリコシドから選択され、Ｘ^５は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシおよびケト（＝Ｏ）から選択される。なおさらなる実施形態において、Ｘ^４は、ＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々は、ＯＨである。一実施形態において、Ｘ^４、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々は、ＯＨ；すなわち本明細書で５と指定される化合物である。

さらなる一態様において、本発明は、細胞または組織を、式ＩＩＩの単離化合物の処方物と接触させることにより、細胞または組織内のテロメラーゼを増加させる方法を提供する。該方法はやはり、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する工程を含み得る。

。

式ＩＩＩにおいて、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８およびＯＲ^４の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、ケトおよびグリコシドから独立して選択され、「グリコシド」およびその実施形態は、上記に定義されたとおりである。該化合物は、いずれもさらなるグリコシドによって置換されていない、好ましくは、最大２つのグリコシド、より好ましくは、最大１つのグリコシドを含む。好ましいグリコシドとしては、Ｄ−グルコピラノシドおよびＤ−キシロピラノシドが挙げられる。

構造ＩＩＩの選択された実施形態において、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８およびＯＲ^４の各々は、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルオキシ、およびグリコシドから独立して選択され、好ましくは、ヒドロキシおよびグリコシドから選択される。

構造ＩＩＩのさらなる実施形態において、Ｘ^８およびＯＲ^４の各々は、ＯＨであり、Ｘ^６およびＸ^７の各々は、ヒドロキシおよびグリコシド、例えば、β−Ｄ−グルコピラノシドから独立して選択される。さらなる実施形態において、
ＯＲ^４は、ＯＨである。好ましくは、Ｘ^６およびＸ^８の各々も、ＯＨであり、Ｘ^７は、グリコシドである。構造ＩＩＩの例示的化合物の１つは、本明細書において８と指定されるギンセノシドＲＨ１である。

（ＩＩＩ． 式Ｉ〜ＩＩＩの化合物の出所および合成）
式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物は、一般に天然物から単離または合成できる。例えば、アストラガロシドＩ〜ＶＩＩは、例えば、Ａ．Ｋａｄｏｔａら、特開昭６２−０１２７９１号（１９８７）に記載されているとおり、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓの根から単離できる。そこで報告されているとおり、有益な薬草の種々の出所から商品として入手できる根組織（８ｋｇ）を、ＭｅＯＨと共に還流し、その濃縮抽出エキス（２００ｇ）をＭｅＯＨに再溶解して、溶出液としてＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏの混液を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィにより分画する。同様の溶媒混合物を用いて、逆相クロマトグラフィにより、各画分を後処理して、凡そ以下の量の単離化合物を得る：アセチルアストラガロシドＩ（０．２ｇ）、アストラガロシドＩ（３．５ｇ）、イソアストラガロシドＩ（０．３ｇ）、アストラガロシドＩＩ（２．３ｇ）、アストラガロシドＩＩＩ（１．０ｇ）、アストラガロシドＩＶ（０．８ｇ）、アストラガロシドＶ（０．１ｇ）、アストラガロシドＶＩ（０．３ｇ）およびアストラガロシドＶＩＩ（０．１ｇ）。また、Ｋｉｔａｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３１（２）：ｐ．６９８−７０８（１９８３ｂ）も参照されたい。

アストラガロシドＩＶ（本明細書において１と指定）はまた、Ａｉ Ｃｈｕｎｍｅｉ、Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１、Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａの本著者によっても得られた。

シクロアストラゲノール（２）は、下記の実験の節（実施例１）に記載されるとおり、アストラガロシドＩＶ（１）をメタノール性ＨＣｌで処理した後、中和し、標準的な後処理をし、クロマトグラフィにより精製することにより調製できる。また、シクロアストラゲノールは、Ｐ−Ｈ Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４９：ｐ．１０３−６（２００２）により記載されたように、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓのブタノール抽出物を酸化的分解（酸素およびナトリウム元素による処理）することによっても得ることができる。また、アストラゲノール（３）およびシクロアストラゲノール（２）は、Ｋｉｔａｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３１（２）：ｐ．６８９−６９７（１９８３ａ）の方法によっても得ることができる。

本明細書において６と指定される化合物（シクロアストラゲノール６−β−Ｄ−グルコピラノシド）および７と指定される化合物（シクロアストラゲノール３−β−Ｄ−キシロピラノシド）は、下記の実験の節（実施例２）に記載されるとおり、メタノール中、アストラガロシドＩＶおよび硫酸溶液を還流後、標準的な後処理およびシリカゲルクロマトグラフィにより得られた。また、転移生成物５およびアグリコン、すなわちシクロアストラゲノール（２）も得られた。

１６−ケト化合物４は、アストラガロシドＩＶのグリコシドヒドロキシル基のアセチル化後、１６−ヒドロキシルのピリジニウムクロロクロメート酸化および水素化ホウ素ナトリウムを用いた処理によるグリコシドヒドロキシルの回復により調製された（上記引用のＫｉｔａｇａｗａら、１９８３ｂを参照）。

式Ｉ〜ＩＩＩの種々の実施形態、例えば、様々な程度にアルキル化またはアシル化した、またはケト基を有する化合物は、シクロアストラゲノール、アストラゲノール、アストラガロシド類またはアストラベルシン類またはパナキサトリオールなどの天然の、および／または商品として入手できる出発物質を用い、必要ならば生成物を分離して、有機合成の公知の方法によって調製することができる。下記の実験の節に幾つかの例が提供されている。例えば、立体障害の少ない３−、６−および／または１６−ヒドロキシル基を、一般に例えば、アシル化によって選択的に修飾できる。所望の場合、次いで未反応のヒドロキシル基を、例えば、アルキル化後、任意にアシル基を除去することにより、別々に修飾することができる。融合シクロプロピル環を有する式Ｉの化合物（例えば、シクロアストラゲノール類）は、硫酸処理によって、１９−メチル基および９−１１二重結合を有する化合物（例えば、アストラゲノール類）へと変換できる。この反応は、下記の実施例９Ｂおよび１０Ｂの反応に示される脱グリコシル化によって達成できる。

（ＩＶ． 生物学的活性の決定）
（Ａ． ＴＲＡＰアッセイプロトコル）
細胞内のテロメラーゼ活性を増大させる化合物の能力は、当業界に公知のＴＲＡＰ（テロメア反復増幅プロトコル）アッセイを用いて決定することができる（例えば、Ｋｉｍら、米国特許第５，６２９，１５４号；Ｈａｒｌｅｙら、米国特許第５，８９１，６３９号）。本明細書に用いられる「ＴＲＡＰアッセイで測定されたテロメラーゼ活性」とは、以下のプロトコルに従って、ケラチノサイトまたは線維芽細胞において測定されたテロメラーゼ活性を言う。該活性は、典型的にこのような細胞のコントロールアッセイにおいて、同様に測定された活性と比較される（例えば、溶媒コントロールにおいて見られたものより５０％超のテロメラーゼ活性）。

該アッセイにおける使用に好適な細胞系、好ましくは、正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）または正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）は、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、オレゴン州ポートランド所在または４Ｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ベルギー国Ｓｅｎｅｆｆｅ所在、などの商業的供給源、またはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得ることができる。ＡＴＣＣウェブサイトで探索できるＡＴＣＣ正常ヒト線維芽細胞系としては、例えば、ＣＣＬ１３５、ＣＣＬ１３７およびＣＣＬ１５１が挙げられる。

細胞は、増殖培地（例えば、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社により供給されるＥｐｉ−Ｌｉｆｅ培地＋ケラチノサイト増殖因子補足物＋６０ｍＭ ＣａＣｌ_２）中、２日間、凡そ５０００細胞／ウェルで平板培養される。９５％エタノールまたはＤＭＳＯなどの好適な溶媒中、試験組成物を、ある範囲の濃度で選択されたウェルに加え、１６〜２４時間温置する。本明細書に報告されたデータに関して、使用された溶媒はＤＭＳＯであった。

細胞溶解溶液は、５．０ｍＬのＤＮアーゼ、ＲＮアーゼの無いＨ_２Ｏ（ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼの無いＨ_２Ｏは、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理により作製できるか、またはＳｉｇｍａなどの販売会社から購入できる）に、３．０ｍＬのＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０、１．０ｍＬのＣＨＡＰＳ溶解緩衝液（下記参照）および１．０ｍＬの１０Ｘ ＴＲＡＰ緩衝液（下記参照）を加えることによって調製される。

処理された細胞の形態を先ず、顕微鏡下で観察し、異常な増殖の目視できる兆候がないことを確認する。培地をウェルから取り出し、細胞をＰＢＳ（ＣａおよびＭｇのない）にて２回濯ぐ。ディッシュを、好ましくは氷上で冷却し、細胞溶解緩衝液（下記参照）を加え（１ウェル当たり凡そ１００μＬ）、ピペットを用いて数回上下して砕く。該細胞を、氷上で１時間培養する。

^ａＣＨＡＰＳ界面活性剤を、該溶解緩衝液の使用直前に加える。さらに、ＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリドＨＣｌ）を、抽出工程の直前に、該溶解緩衝液に加える。

以下の材料を合わせて、基本ＰＣＲ混合物を作製する。

^ａ４０μｌのＰＣＲ混合物プラス１０μｌの細胞溶解液＝５０μｌの最終容量に基づく。

ＰＣＲ混合物は、以下の成分を含む：Ｃｙ５−ＴＳプライマー、配列５’−ＡＡＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ−３’（配列番号：１）を有する５’−Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドは、テロメラーゼの基質である。培地のテロメラーゼ活性に依存して、テロメラーゼ反復（配列．．ＡＧＧＧＴＴ．．を有する）が基質に付加され、テロメラーゼ産物またはＴＲＡＰ産物とも称されるテロメラーゼ延長産物を形成する。配列５’−ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＴ ＡＣＣ ＣＴＴ ＡＣＣ ＣＴＴ ＡＣＣ ＣＴＡ ＡＣＣ−３’（配列番号：２）を有するＡＣＸプライマーは、テロメラーゼ延長産物とハイブリダイズする固定復帰プライマーである。

定量目的で、少量の制限量のＴＳＵ２内部基準、配列５’−ＡＡＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＣＧ ＡＧＡ ＡＧＣ ＧＡＴ−３’；配列番号：３）を有するオリゴヌクレオチド、ＴＳプライマー配列の延長が加えられる。配列５’−ＡＴＣ ＧＣＴ ＴＣＴ ＣＧＧ ＣＣＴ ＴＴＴ（配列番号：４）を有するＵ２プライマーは、内部標準の３’領域にハイブリダイズするようにデザインされた復帰プライマーである。

反応管中、このＰＣＲ混合物４０μＬに、細胞溶解液サンプル（１０μＬ）を加え、この混合物を室温（３０℃）で３０分間温置する。以下に示された温度と時間、該混合物を温置することによりＰＣＲを実施する：９４℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒；この３工程サイクルを２０〜３０サイクル、好ましくは３１サイクル繰り返す。

例えば、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールを含有する添加染料を添加し、ブロモフェノールブルーがゲルから消えるまで、該サンプルを０．６ｘ ＴＢＥ中、１０〜１５％非変性ＰＡＧＥに供する。ＣＹ５−標識テロメラーゼ産物の検出（６５０ｎｍで最大励起；６７０ｎｍで最大発光）のため、例えば、蛍光画像を用いて産物形成を観察する。

増幅後のＴＳＵ２内部標準の最終量は、一般に５０μＬの反応混合物当たり５〜１０アモルである。この内部コントロールは、第１のテロメア付加産物の下に、ゲル上の明瞭な１本のバンドとして現れる特定の３６量体ＰＣＲ増幅産物（すなわち、ＴＳオリゴヌクレオチドへの１つのテロメア付加後、ＡＣＸ復帰プライマーによる増幅産物）を提供する。この内部コントロールバンドは、種々のサンプルのＰＣＲ増幅を正規化するために用いることができる。

該アッセイで生成したテロメラーゼ産物分子（ＴＭ）の相対数は、下式：
ＴＭ＝（Ｔ_{ＴＲＡＰ産物}−Ｔ_ＢＫＤ１）／（Ｔ_内部標準−Ｔ_ＢＫＤ２）
によって決定され、
式中：Ｔ_{ＴＲＡＰ産物}は、全てのテロメラーゼ産物に関してゲル上に測定された合計強度であり、Ｔ_ＢＫＤ１は、テロメラーゼ産物によって囲まれた面積と等しい大きさの面積に関して空白レーンにおいて測定された背景強度であり、Ｔ_内部標準は、内部標準に関する強度であり、Ｔ_ＢＫＤ２は、内部標準バンドよって囲まれた面積と等しい大きさの面積に関して空白レーンにおいて測定された背景強度である。結果として得られた数は、本明細書において、ＴＭを決定する目的で３０分と指定される所与の温置時間に生成したテロメラーゼ産物の分子数である。

上記式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの好ましい化合物は、１μｇ／ｍｌ以下の濃度で線維芽細胞またはケラチノサイトにおいて、溶媒コントロールにおいて見られるテロメラーゼ活性レベルより、少なくとも２５％超のテロメラーゼ活性を生じさせることができる。より好ましくは、該化合物は、１μｇ／ｍｌ以下の濃度で溶媒コントロールにおいて見られるよりも、少なくとも５０％超のテロメラーゼ活性を生じさせることができる。１μｇ／ｍｌ以下の濃度で、記載されたＴＲＡＰアッセイで測定した時、溶媒コントロールにおいて見られるテロメラーゼ活性レベルより、少なくとも約７５％、１００％または５００％超のテロメラーゼ活性を生じさせる化合物など、さらに強力な活性が、幾つかの適用に関しては適切であり得る。

（ Ｂ．ＴＲＡＰアッセイ結果の例）
上記式Ｉの化合物に関して、種々の濃度においてテロメラーゼ活性増大における有効性を評価した。アッセイは、上記のプロトコルに従い、ＨＥＫｎｅｏＰ細胞（新生児ケラチノサイト）において実施された。濃度は、ＤＭＳＯ中凡そ０．０３μＭから１０μＭの範囲であった。

図２に示されているように、化合物１（アストラガロシドＩＶ）を含有する組成物に関して、テロメラーゼ活性は、１．０μＭにおいて、コントロールの約３６０％まで、濃度の増加につれて増加し、その後、濃度をさらに１０μＭへ増加させるにつれて低下した。図２に示されているように、２（シクロアストラゲノール）を含有する組成物に関して、テロメラーゼ活性は、０．１μＭにおいて、コントロールの約３００％まで増加し（１０ｎＭのＥＧＦ（上皮成長因子）によって処理された細胞における約２００％に比較して）、その後、濃度をさらに増加させるにつれて低下した。

表１は、図１Ａ〜Ｇに示された各化合物を含有する組成物に関して、ＤＭＳＯコントロールにおいて見られるテロメラーゼ活性レベルの２倍（すなわち、１００％超）のテロメラーゼ活性レベルを生じさせる化合物の最低有効濃度（ＭＥＣ）を提供している。

（Ｃ． 創傷治癒アッセイプロトコル）
式Ｉ〜ＩＩＩの化合物は、下記でさらに検討されるように、創傷、火傷、擦過傷または表皮の他の急性もしくは慢性状態の治癒を促進するために使用できる。本明細書で用いられる「スクラッチアッセイで測定された創傷治癒活性」は、以下のプロトコルに従って、ケラチノサイトまたは線維芽細胞において測定され、下式で示されたＷＨの数値で表される活性を言う。

細胞をフラスコに塗布し（１つのフラスコ当たり５×１０^５細胞）、５％ＣＯ_２、３７℃の加湿チャンバ内で２日間培養する。「創傷」を作出するために、２ｍｌのプラスチックピペットを静かに引き動かして細胞表面を「スクラッチ」する。理想的な創傷は、幅が約２〜３ｍｍ、長さが５０ｍｍ（組織培養フラスコの長軸に沿って）である。ビヒクル（ＤＭＳＯ；コントロールサンプル）または複数濃度の試験組成物のいずれかを含有する培地によって、該細胞を再処理する。細胞培養の連続３〜４日間に亘って、創傷範囲を確認し、フラスコに印を付け、細胞の外観を写真により記録する。

ビヒクル処理細胞または他のコントロール細胞に対する化合物処理サンプルの創傷の幅を、経時的に測定することにより創傷閉包の量が決定される。測定は、１日目（スクラッチング直後）、２日目、３日目、および４日目に各サンプルに関して、撮られた写真から行われる。創傷治癒のパーセンテージ（「創傷治癒活性」としても表される）を、下式：
ＷＨ＝１００−［１００×Ｗ_ｎ／Ｗ_ｏ］
から算出し、
式中、Ｗ_ｎは、ｎ日目の創傷の幅であり、Ｗ_ｏは、１ｎ日目の創傷の幅である。

上記の式Ｉ〜ＩＩＩの好ましい化合物は、１μｇ／ｍｌ以下の濃度で、上記のケラチノサイトまたは線維芽細胞のスクラッチアッセイにおいて未処理細胞またはコントロール細胞に見られる創傷閉包量（創傷治癒活性）の少なくとも２５％大きな創傷閉包量を生じさせることができる。１μｇ／ｍｌ以下の濃度で、ケラチノサイトまたは線維芽細胞のスクラッチアッセイにおいて未処理細胞またはコントロール細胞に見られる創傷閉包量の少なくとも約５０％または１００％大きな創傷閉包量を生じさせる化合物など、さらに強力な活性が、幾つかの適用に関しては適切であり得る。

（Ｄ． スクラッチアッセイ結果の例）
本発明の化合物１（アストラガロシドＩＶ）および２（シクロアストラゲノール）の創傷治癒活性を、上記のスクラッチアッセイにより、老化ケラチノサイトにおいて評価した。典型的なアッセイ結果が図４に示されており、ここで、上段の画像は、コントロール細胞（溶媒、ＤＭＳＯにより処理）を示し、下段は、同じ溶媒中、０．１μｇ／ｍｌ（約０．１３μＭ）の１で処理した細胞を示している。大きさの見分けられる「創傷」が、４日目に残っていたコントロール細胞とはコントロール的に処理細胞は、４日目で集密的であった。図５に示されるように、幼若ケラチノサイトにおいて、この組成物および０．０１μＭ２（シクロアストラゲノール）により、同様の結果が見られた。

図６は、テロメラーゼ阻害オリゴヌクレオチド（ＧＲＮ１６３）およびコントロールオリゴヌクレオチド（ＧＲＮ１３７２２７）の存在下および不在下において、同様のアッセイで測定した。老齢の成人ケラチノサイトにおける１（アストラガロシドＩＶ）を含有する組成物の創傷治癒活性を示している。示されているように、テロメラーゼ阻害オリゴＧＲＮ１６３は、１の組成物の創傷治癒作用を妨げるが；コントロールオリゴＧＲＮ１３７２２６の効果は、ごく小さい（ＧＲＮ１６３は、テロメラーゼＲＮＡ成分のテンプレート領域を標的にするテロメラーゼ阻害オリゴヌクレオチドである。すなわち、ＧＲＮ１６３は、ＰＣＴ国際公開第０１／１８０１５号に詳述されている１３単量体単位のＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドである。ＧＲＮ１３７２２７は、ミスマッチ配列を有する１３単量体単位のＮ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデートコントロールオリゴヌクレオチドである）。

下記の表２は、図５および図６に示されたスクラッチアッセイの結果に基づき、上記に示された式を用いて、それらのアッセイに用いられた化合物１および化合物２に関するＷＨ値（創傷治癒活性）を示している。

図７は、テロメラーゼ阻害剤（ＧＲＮ１６３）の存在下および不在下において、また５０ｍｇ／ｍＬ（約２ｍＬ）のＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）と比較した、老化新生児ケラチノサイトにおける、本発明の化合物１（アストラガロシドＩＶ）に関する、コントロールのパーセントとしての創傷閉包をグラフで示している。示されているように、１の効果は、ＰＤＧＦの効果に匹敵し、やはりＧＲＮ１６３の添加によって妨害された。

また、本発明は、本明細書に記載されたＴＲＡＰアッセイにおいて、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物の誘導体をスクリーニングすることによりテロメラーゼ活性を増大させる上で効果的な追加化合物を選択する方法を提供する。この態様において、「誘導体」は、以下の方法の１つ以上において、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物の修飾により作製される化合物を含む：低級アルキルカルバメート基、ハロゲン基、チオール基、低級アルキルチオエーテル基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、低級アルキルアミド基、アルデヒド基、またはヒドロキシル基のケト基への変換；そのようなアルデヒド基もしくはケト基への、または既存のケト基への低級アルキル基の付加（例えば、さらなるヒドロキシル基を形成するアルキル化）；炭素−炭素二重結合への、ハロゲン、ヒドロキシル、および／または水素の付加；ヒドロキシル基の除去（すなわち、水素への転換）；１つ以上のキラル中心、好ましくは、酸素担持キラル中心における立体化学の反転。本明細書中で用いられる場合、そのような修飾により作製される「誘導体」は、上記の式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物自体を除外する。

これらの修飾は全て、求核置換など、周知の合成反応を用いて、標準的な合成法を用いて達成することができるが、これらには、トシレートなどのより良好な脱離基へのヒドロキシル基の変換；エステル化；アルキル化；酸化；還元；ハロゲン化；水和；水素化などが挙げられる。

１つ以上の濃度において好適な溶媒ビヒクル中、処方された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の誘導体は、上記のケラチノサイトまたは線維芽細胞のＴＲＡＰアッセイにおいてスクリーニングされる。選択される好ましい誘導体としては、１μｇ／ｍｌ以下の濃度で、溶媒中に処方された際に、ＴＲＡＰアッセイで測定した時、前記溶媒で処理したケラチノサイトまたは線維芽細胞において測定されたテロメラーゼ活性レベルより少なくとも５０％超、前記細胞におけるテロメラーゼ活性レベルを生じさせる上で有効な誘導体が挙げられる。

あるいは、またはそれに加えて、１つ以上の濃度において好適な溶媒ビヒクル中、処方された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの誘導体は、上記のスクラッチアッセイにおける創傷治癒活性に関してアッセイされる。選択される好ましい誘導体としては、１μｇ／ｍｌ以下の濃度で、溶媒コントロールの創傷治癒活性より、少なくとも２５％超、より好ましくは、少なくとも５０％超の創傷治癒活性を有する誘導体が挙げられる。

（ＶＩ． 治療上の効能および治療法）
本発明は、細胞または組織を細胞内のテロメラーゼ活性を増大させる上で有効な量の上記ＩＩ節で開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物の処方物に接触されることにより、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させる方法を提供する。該方法は、テロメラーゼ活性の増大が望まれる細胞または組織を同定する予備工程を含み得る。該細胞は、培養されているもの、すなわち、インビトロもしくはエキソビボでもよいし、またはインビボで対象または患者内にあってもよい。

細胞または組織内のテロメラーゼ活性の増大によって実現すべき利益としては、例えば、接触させた細胞の複製能力の増強および／または寿命の延長が挙げられる。該方法は、患者の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大が望まれる対象または患者における状態の診断、例えば、細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大による治療を必要とする疾病の診断をさらに含み得る。したがって、本発明は、患者の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性の増大により、前記患者における状態を治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする対象に、上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の有効量を投与することを含んでなる。「有効量」とは、治療成果が得られるように、患者の細胞または組織におけるテロメラーゼ活性を増大させるための有効な量を言う。

このような状態には、例えば、細胞の老化に関連するか、またはテロメア反復の損失促進を導く、テロメラーゼ不在下における細胞増殖速度の増加に関連する状態が含まれる。「増殖速度の増加」とは、その細胞タイプの正常な細胞と比較して、またはその細胞タイプの他の個体内の正常な細胞と比較して、より高い細胞分裂速度を意味する。異常に早い年齢におけるそれらの細胞群の老化は、結局は疾病に至り得る（Ｗｅｓｔら、米国特許第６，００７，９８９号を参照）。

ある一定の細胞タイプにおけるテロメラーゼ活性の増大が、有益であり得る種々の疾病状態が存在する。したがって、本発明は、患者の細胞内のテロメラーゼ活性を増大させることによる治療を必要とする対象に、上記の式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の有効量を投与することを含んでなり、患者の細胞内のテロメラーゼ活性を増大させることにより、以下から選択される状態を患者において治療する方法を提供する。幾つかの場合、状態は、関連した細胞タイプ（括弧内に示されている）を用いて下記でさらに記載されているエキソビボ細胞療法による治療に供することもできる。

（ａ）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および脳卒中（ニューロン、グリア細胞、例えば、星状細胞、内皮細胞、線維芽細胞）、
（ｂ）皮膚の萎縮および非薄化、もしくは弾性衰弱および皮膚のしわ皮脂腺の過形成または形成不全、老年性ほくろおよび他の色素沈着異常、白髪化および抜毛または非薄化、もしくは慢性皮膚潰瘍などの皮膚の加齢関連疾患（線維芽細胞、皮脂腺細胞、メラニン形成細胞、ケラチノサイト、ランゲルハンス細胞、微小血管内皮細胞、毛嚢細胞）、
（ｃ）変性関節疾患（軟骨細胞および軟骨小腔ならびに滑膜細胞などの関節軟骨の細胞）、
（ｄ）骨粗鬆症および骨格系の他の変性状態（骨芽細胞、骨髄間質細胞または間充織細胞、骨芽前駆細胞などの骨格系の細胞）、
（ｅ）アテローム硬化症、カルシウム沈着、血栓形成および動脈瘤などの血管系の加齢関連およびストレス関連疾患（内皮細胞、平滑筋細胞および外膜線維芽細胞などの心血管系細胞）、
（ｆ）加齢関連黄斑変性（色素沈着上皮細胞および血管内皮細胞などの眼細胞）
（ｇ）ＡＩＤＳ（ＨＩＶ制限ＣＤ８^＋細胞）；および
（ｈ）自然的加齢、癌、癌療法、急性および慢性感染に伴って生じ、または細胞ターンオーバーの加速を生じる遺伝子障害に伴って生じる組織ターンオーバーの障害ならびに関連貧血および他の変性状態などの加齢関連およびストレス関連免疫系障害（Ｂリンパ球ならびにＴリンパ球、単球、循環性および特殊化組織マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞およびそれらの各々の前駆体など、リンパ系、骨髄系および赤血球系の細胞を含む免疫系の他の細胞）
上記の細胞タイプに加えて、テロメラーゼ活性の増大が治療的に有益であるさらなる細胞タイプとしては、限定はしないが。肝臓、内分泌腺、平滑筋系または骨格筋系の細胞が挙げられる。

一例として、ＨＩＶ感染個体の場合、ＣＤ８^＋細胞は、ＨＩＶ感染ＣＤ４^＋細胞濃度の制御を図る際に、ＣＤ８^＋細胞のターンオーバーを増大させる。ＡＩＤＳ（上記（ｇ）の項）において、ＨＩＶ制限ＣＤ８^＋細胞の早期老化により、疾患が生じると考えられる。このような細胞の老化は、単に１回の細胞倍加当たりのテロメラーゼ配列損失の異常量によるだけでなく、それに加えて、複製速度が増大する結果、テロメラーの損耗が、その細胞群の通常のテロメラーゼ損耗より増大することによる。したがって、本発明は、ＨＩＶ感染の治療を必要とする対象に、上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の有効量を投与することにより、ＨＩＶ感染対象を治療する、より具体的には、ＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶ制限ＣＤ８^＋細胞の早期老化を低下させる方法を提供する。

テロメラーゼ活性の増大は、例えば、心不全または脳卒中における虚血など、ストレスによる細胞死に対する脆弱性増大に関連した状態において、増殖細胞と同様、非分裂細胞を益することができる（例えば、ＯｈおよびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ３４（７）：ｐ．７１７−２４；Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３５（４）：ｐ．４８９−５０２を参照）。したがって、本発明は、ストレスまたはＤＮＡ損傷に誘導された細胞死を減少させる治療を必要とする対象に、上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の有効量を投与することを含んでなり、対象の細胞内テロメラーゼ活性の増大により、心不全または脳卒中による組織におけるストレスまたはＤＮＡ損傷に誘導された細胞死を減少させる方法を提供する。上記のとおり、該方法は、対象における指示された状態を診断する予備的工程を含み得る。

他の態様において、患者における１つ以上の細胞タイプが限界を与えており、それらの細胞が複製を続ける能力またはストレス誘導細胞死に抵抗する能力を拡大することにより、患者の生命を延長することのできる個体の治療に該組成物が使用できる。このような細胞群の一例は、ダウン症候群の患者に存在するリンパ球である。したがって、本発明は、ダウン症候群の患者に上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の有効量を投与することを含んでなり、前記患者のリンパ球におけるテロメラーゼ活性の増大により、前記患者に存在するリンパ球の複製能を高める、および／または寿命を延長する方法を提供する。また、該組成物は、通常の老化時に生じるストレス誘導細胞死に対する抵抗性を改善するためにも使用できる。

本発明のさらなる態様において、テロメラーゼ活性の増大は、創傷、火傷、擦過傷または表皮の他の急性もしくは慢性状態の治癒を促進するために有効である。したがって、本発明は、表皮の急性もしくは慢性状態の治療を必要とする患者、好ましくは、その幹部に局所的に、上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物の処方物の有効量を投与することにより、表皮の急性もしくは慢性状態を治療する方法を提供する。

本明細書に用いられる「表皮の急性もしくは慢性状態」としては、創傷、火傷、擦過傷、手術切開部、ドナー移植部位における患部および感染性因子により生じた病変部ならびに、慢性静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、圧迫潰瘍、褥瘡、および粘膜潰瘍または糜爛などの慢性状態が挙げられる。また、永続的な炎症性状態または感染により、または遺伝子欠陥により生じた皮膚または表皮表面の病変（ケロイド形成および凝固異常など）も挙げられる。例えば、ＰＣＴ国際公開第０２／９１９９９号を参照されたい。

このような治療におけるテロメラーゼ活性増大の望ましい効果としては、治療部位における細胞増殖または細胞移動、表面の上皮形成、存在する場合は創傷の閉包、または正常な生理学的機能の回復が挙げられる。治療部位の「上皮形成」または「再上皮形成」とは、適用された療法の結果としての該部位における上皮細胞の密度増加を意味する。

該方法は、移植された細胞の成長を高めるためにも使用できる。このような治療におけるテロメラーゼ活性増大の望ましい効果としては、治療部位の被覆、移植細胞の存続、免疫拒絶が無いこと、存在する場合は創傷の閉包、または正常な生理学的機能の回復が挙げられる。移植細胞は、治癒過程に直接寄与する（例えば、治癒組織の一部となる）ことによるか、または創傷を被覆し、それによって、宿主細胞による治癒を促進する環境を提供することによって、創傷閉包に寄与できる。

本発明はまた、化粧上の向上など、他の目的のための皮膚の処置および皮膚表面における何らかの認められる欠陥の治癒を考慮している。

さらなる一態様において、本発明の方法および組成物は、例えば、エキソビボ細胞療法において、またはモクローナル抗体産生において、培養中の細胞におけるテロメラーゼ活性を増大させることにより、前記細胞の複製能力を高め、および／または前記細胞の寿命を延長させるために使用できる。テロメラーゼ活性の増大は、細胞増殖時のテロメラーゼ反復の損失を緩速化し、および／またはストレス誘導細胞死に対する抵抗性を改善することにより、このような細胞の複製能力を増大させる。

エキソビボ適用の場合、上記の式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の有効量が、対象から得られた外植細胞に加えられる。「有効量」とは、該細胞内のテロメラーゼ活性を増大させ、それによって、該細胞の複製能力を増大させ、および／または該細胞の寿命を延長させるための有効な量を言う。

外植細胞としては、例えば、骨髄幹細胞（米国特許第６，００７，９８９号）、骨髄間質細胞（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０（６）：ｐ．５９２−６、２００２年）、または副腎皮質細胞（Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８（１）：ｐ．３９−４２、２０００年）などの幹細胞を挙げることができる。上記（ａ）〜（ｇ）項に記載されたものなどの状態もまた、エキソビボ細胞ベース療法の対象となり得る。例としては、筋ジストロフィ治療のための筋衛星細胞、骨粗鬆症治療のための骨芽細胞、加齢関連黄斑変性に対する網膜色素沈着上皮細胞、骨関節炎に対する軟骨細胞の使用が挙げられる。

例えば、ＡＩＤＳ患者においては、感染したＣＤ４＋細胞の増大を制御する機能的ＣＤ８^＋細胞が限界を与えているという認識によって、ＡＩＤＳが、最初に検出された時の早い段階で、ＨＩＶ感染個体からＨＩＶ制限ＣＤ８^＋細胞を取り出し、バンクに依存し、その後、その個体に必要な利用できるＣＤ８^＋細胞が、もはや無くなった時の後の段階で、その個体に再導入するという治療プロトコルを考案することができる。したがって、適切な時点で、個体の限界を与えている細胞の継続的投与を含むプロトコルによって、その個体の寿命を延長することができる。これらの適切な時点は、その後のＣＤ８^＋細胞の老化により、または、それらの細胞が老化する時の１つの兆候として、このようなＣＤ８^＋細胞内のテロメアの長さを測定することにより決定することができる。本発明により、テロメア反復の損失を緩速化する薬剤、すなわち、上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の存在下で保存細胞の数を増加させることができる。

したがって、本発明は、対象から細胞集団を得て、前記細胞集団をエキソビボで増加させることを含み、前記細胞集団のテロメラーゼ活性を増大させ、それによって、該細胞集団の複製能力を増大させ、および／または該細胞集団の寿命を延長させるための有効な量の上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物によって前記細胞集団が処理される、エキソビボ細胞ベース療法の方法を提供する。該方法は、対象において、エキソビボ細胞ベース療法による治療の対象となる上記の状態などの状態を診断することを一般に含む。

さらなる一実施形態において、本発明は、前記幹細胞集団のテロメラーゼ活性を増大させ、それによって、該幹細胞集団の複製能力を増大させ、および／または該幹細胞集団の寿命を延長させるための有効な量の上記ＩＩ節に開示された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物によって前記幹細胞集団が処理される幹細胞増殖の方法を提供する。

（ＶＩＩ． 投与剤形および投与方法）
本発明は、細胞内のテロメラーゼ活性を増大させ、および／または創傷治癒を促進するために有用な薬学的組成物を調製する方法を包含する。したがって、上記ＩＩ節に記載された式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物は、製薬用賦形剤および任意に活性成分および非活性成分であり得る他の薬剤、アジュバントなどと組合わされる。該組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、徐放処方物、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルなどの固体、半固体、凍結乾燥粉末または液体剤形の形態をとることができる。該処方物は、正確な用量の簡単な投与に好適な単位剤形において提供できる。

また、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物は、経口投与用の食物サプリメントまたは栄養剤として処方することもできる。栄養処方物または経口薬処方物に関して、好適な賦形剤としては、マンニトール、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、澱粉、セルロース、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、および／またはカルボン酸マグネシウムなどの医薬品用担体が挙げられる。経口液体処方物における使用に関して、該組成物は、例えば、生理食塩水、デキストロース水、グリセロールまたはエタノールなどの水性担体、好ましくは、水または通常の生理食塩水における水和に好適な固体または液体形態のいずれかで供給される液剤、懸濁剤、乳剤またはシロップ剤として調製できる。所望の場合、該組成物はまた、湿潤剤、乳化剤または緩衝液などの微量の非毒性補助物質を含有してもよい。式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの単離化合物はまた、Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓの抽出エキスなどの植物抽出エキスも含み得る従来の入手できるような、既存の栄養処方物に組み込んでもよい。

創傷治癒または表皮の他の急性もしくは慢性状態の治療における使用のために、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物は、局所投与用に処方される。局所適用のためのビヒクルは、種々の形態のうちの１つ、例えば、ローション、クリーム、ゲル、軟膏、スティック、スプレーまたはパスタであり得る。これらの製品形態は、周知の方法に従って処方できる。それらは、限定はしないが、溶液、エアロゾル、乳液、ゲルおよびリポソームなどの種々のタイプの担体を含み得る。該担体は、例えば、水中油基剤または油中水基剤を有する乳剤として処方できる。乳剤中に用いられる好適な疎水性（油性）成分としては、例えば、植物油、動物油脂、合成炭化水素およびそれらのポリエステルなどのエステル類およびアルコール類ならびに有機ポリシロキサン油が挙げられる。このような乳剤はまた、連続相内の不連続相を分散および懸濁させるために、乳化剤および／または界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤を含んでもよい。

局所処方物は、典型的に構造化剤、増粘剤またはゲル化剤および皮膚軟化剤または潤滑剤から選択される１種以上の成分を含有する。多用される構造化剤としては、ステアリルアルコールなどの長鎖アルコール類およびグリセリルエーテル類またはそれらのエステル類ならびにオリゴ（エチレンオキシド）エーテル類またはそれらのエステル類が挙げられる。増粘剤およびゲル化剤としては、例えば、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー類およびそれらのエステル類、ポリアクリルアミド類ならびに寒天、カラゲナン、ゼラチンおよびガーゴムなどの天然増粘剤が挙げられる。皮膚軟化剤の例として、トリグリセリドエステル類、脂肪酸エステル類およびアミド類、蜜蝋、鯨蝋、カルナウバ蝋などの蝋、レシチンなどのリン脂質、ならびにステロール類およびそれらの脂肪酸エステル類が挙げられる。該局所処方物は、当業界で公知の他の成分、例えば、収斂剤、芳香剤、色素、皮膚浸透増強剤、日焼け止めなどをさらに含んでもよい。

該薬学的組成物は、非経口、経皮または吸入による投与用に処方することもできる。非経口投与のための注射用組成物は、典型的に滅菌生理食塩水などの好適なＩＶ溶液中に活性化合物を含有する。該組成物はまた、脂質またはリン脂質中、リポソーム懸濁液中、または水性乳液中の懸濁剤として処方できる。

吸入による投与のために、該活性化合物は、固体または液体のエアロゾル粒子として処方される。該処方物はまた、噴射剤および／またはエアロゾル形成を容易にするために乳糖などの分散剤を含んでもよい。経皮投与のために、選択された皮膚領域への化合物の緩徐な送達を考慮し、また脂肪族アルコール類またはグリセロールなどの浸透増強物質も含み得る経皮パッチに、該活性化合物が含まれることが好ましい。

このような処方物を調製する方法は、当業者に公知であるか、または明らかになろう；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５年）を参照されたい。投与される該組成物は、標的細胞または標的組織におけるテロメラーゼ活性増大のために、薬学的に安全かつ有効な量において選択された化合物量を含有する。

該薬学的組成物または栄養剤組成物は、好ましくは、少なくとも０．１％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）超で約１０％（ｗ／ｖ）まで、好ましくは、約５％（ｗ／ｖ）まで、より好ましくは、約１％（ｗ／ｖ）までの上記式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物を含有する。好適な濃度の選択は、該活性剤の所望の用量、送達の頻度および方法などの因子に依存する。

哺乳動物またはヒト患者などの対象または患者の治療に関して、用量は、対象の体重および全身の健康状態、治療を受ける状態、症状の重症度などの因子に基づいて決定される。用量および濃度は、所望の利益を生み出すと同時に、望ましくない副作用を避けるように決定される。対象化合物に典型的な用量は、ヒト患者に対して、約０．５ｍｇ／日から、５００ｍｇ／日の範囲、好ましくは、約１ｍｇ／日から１００ｍｇ／日の範囲である。例えば、高用量療法としては、例えば、５０〜１００ｍｇ／日、７５〜１００ｍｇ／日または５０〜７５ｍｇ／日が挙げられ、低用量療法としては、例えば、１〜５０ｍｇ／日、２５〜５０ｍｇ／日または１〜２５ｍｇ／日が挙げられる。特定の実施形態において、例えば、本明細書において２と指定される化合物（シクロアストラゲノール）が、少なくとも１ｍｇ／日、好ましくは少なくとも５ｍｇ／日のレベルで投与されるか、または本明細書において１と指定される化合物（アストラガシドＩＶ）が、少なくとも５０ｍｇ／日、好ましくは、少なくとも１００ｍｇ／日のレベルで投与される。

本発明を支持する試験により、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物は、優れた生物学的利用能を有し、かつ低毒性であることが示されている。例えば。代表的な化合物、シクロアストラゲノール（２）は、ネズミチフス菌テスト株ＴＡ９８、ＴＡ１００，ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７および大腸菌テスト株ＷＰ２ ｕｖｒＡを用いたエイムズ試験において、５０００μｇ／プレートのレベルまで、細菌の復帰突然変異可能性に関して陰性であった。それは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、１０ｍｇ／ｋｇまでの単回静脈注射後、全身的に、十分に耐容された。挙動（飲食）、全体重、臓器重量（心臓、肺臓、肝臓、腎臓、副腎および脾臓）、血液学、臨床化学において、オスまたはメスに関して、有意な用量依存的変化は認められなかった。

（実施例１．アストラガロシドＩＶ（１）のシクロアストラゲノール（２）への変換）

アストラガロシドＩＶ（１）（５．００ｇ、ｍｍｏｌ）に、「ＨＣｌ−ＭｅＯＨ１０」（ＴＣＩアメリカ）（５００ｍＬ）を加え、この混合物を、室温で７日間攪拌した。反応混合物は、２０℃（加熱せず）で減圧下、約半分の容量に濃縮した。この混合物を、重炭酸ナトリウム水および酢酸エチルに分配した。水層を、再度酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（２０：１〜１４：１クロロホルム／メタノール）により精製した。残渣の溶媒をエタノールに置き換えるために、精製物質をエタノールに溶解し、この溶媒を減圧留去して２（２．１ｇ、６４％）を得た。

ＥＳＩ−ＭＳ 正のｍ／ｚ ４９１（Ｍ＋Ｈ）^＋、負のｍ／ｚ ５４９（Ｍ＋ＡｃＯ）⁻。ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０）Ｒｆ＝０．３３（６：１クロロホルム／メタノール）。

（実施例２．アストラガロシドＩＶ（１）から化合物５、６および７の調製：同時転移の有り無しのアストラガロシドＩＶ（１）からグリコシドの除去）

アストラガロシドＩＶ（１、１．００ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）のメタノール（８０ｍＬ）溶液に、硫酸（０．４ｍＬ）を加え、この混合物を１．５時間還流した。室温に冷却後、この混合物を酢酸エチルおよび水に注いだ。有機層を、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（２０：１〜１０：１〜７：１クロロホルム／メタノール）により精製して、転移生成物５（２４ｍｇ、４．０％）、モノグリコシド６（１７２ｍｇ、２１％）および７（２９ｍｇ、３．６％）ならびにアグリコン、シクロアストラゲノール（２）（３２６ｍｇ、５２％）を得た。
ＧＲＮ１４０７２４：ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ６２３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３５Ｈ_５８Ｏ_９＝６２２
ＧＲＮ１４０７２５：ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ６５３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３６Ｈ_６０Ｏ_１０＝６５２
ＧＲＮ１４０７２６：ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４７３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３０Ｈ_４８Ｏ_４＝４７２

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（実施例３．１のアセチル化；１６−ケトン１０の形成）
下記の化合物９および１０は、上記に引用された１９８３ｂのＫｉｔａｇａｗａの方法に従って得られた。簡潔に述べると、アストラガロシドＩＶ（１）のアセチル化により、少量の１６−アセテート対応物と共に９を得た。９のピリジニウムクロロクロメート酸化により１０を得た。

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（実施例４：１０の脱アセチル化による４の調製（図１を参照））
上記の１０（１０ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を、室温で一晩攪拌した。混合物をクロロホルム（３ｍＬ）で希釈し、直接シリカゲルカラムクロマトグラフィ（３：１クロロホルム／メタノール）に供し、４（８．０ｍｇ、定量的）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ７８３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_４１Ｈ_６６Ｏ_１４＝７８２。

（実施例５：シクロアストラゲノール２のトリオン１１の形成）
シクロアストラゲノールの３，６，１６−トリオン誘導体１１は、Ｋｉｔａｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３１（２）：ｐ．６８９−６９７（１９８３ａ）の方法により、２のＣｒＯ_３酸化により得られた。

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（実施例６．シクロアストラゲノール（２）の３−または６−ヒドロキシル基のアシル化）

シクロアストラゲノール（２）（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（０．０３０ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）および塩化ピバロイル（０．０１４ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を０℃で一晩攪拌した。この混合物を、直接シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１：１〜１：２ヘキサン／酢酸エチル）に供し、１２（１７ｍｇ、３０％）および１３（３．３ｍｇ、２．９％）を得た。
１２：ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５７５（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３５Ｈ_５８Ｏ_６＝５７４。

１３：ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５７５（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３５Ｈ_５８Ｏ_６＝５７４。

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（実施例７Ａ．シクロアストラゲノール（２）の第二級ヒドロキシルのアセチル化）
本反応は、上記に引用されたＫｉｔａｇａｗａ １９８３ａの方法に従って実施された。簡潔に述べると、無水酢酸／ピリジンによるアセチル化により、１４（主生成物）および１５（副生成物）の混合物を得た。

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（実施例７Ｂ．アセチル基を保持したまま３，６−ジアセチルシクロアストラゲノール（１４）のメチル化）

１４（３０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３ｍＬ）溶液に、窒素下、ヨードメタン（０．７５ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）および水素化ナトリウム（６０％油分散、４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、この混合物を室温で一晩攪拌した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：１ヘキサン／酢酸エチル）により精製し、化合物１６（２９ｍｇ、９２％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ６０３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３６Ｈ_５８Ｏ_７＝６０２。

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（実施例７Ｃ．１６，２５−ジメトキシシクロアストラゲノール、１７の調製：１６からアセチル基の除去）

１６（２８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）およびナトリウムメトキシド（メタノール中０．５ｍｏｌ／Ｌ、６ｍＬ）の混合物を、室温で４８時間攪拌した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（２：３ヘキサン／酢酸エチル）により精製し、ジメトキシジオール化合物１７（２３ｍｇ、９６％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５１９（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３２Ｈ_５４Ｏ_５＝５１８。

（実施例７Ｄ．アセチル基を保持したまま３，６−ジアセチルシクロアストラゲノール（１４）のアルキル化）

１４（１０９ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ）およびクロロメチルメチルエーテル（０．５ｍＬ）を加え、この混合物を室温で２４時間攪拌した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（３：１ヘキサン／酢酸エチル）により精製し、化合物１８（１１４ｍｇ、９０％）を得た。

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（実施例７Ｅ．１８からアセチル基の除去）

上記（シクロアストラゲノールの３，６−ジアセチル−１６，２５−ジ（メトキシメチル）エーテル誘導体）１８（１０２ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）およびナトリウムメトキシド（メタノール中０．５ｍｏｌ／Ｌ、１０ｍＬ）を、室温で４８時間攪拌した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１：１ヘキサン／酢酸エチル）により精製し、ジ（メトキシメチル）エーテル化合物１９（８０ｍｇ、９２％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５７９（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３４Ｈ_５８Ｏ_７＝５７８。

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（実施例８．トリアセチルシクロアストラゲノール１５のアルキル化に次いでアセチル基の除去）

１５（３０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３ｍＬ）溶液に、窒素下、ヨードメタン（０．７５ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）および水素化ナトリウム（６０％油分散、４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、この混合物を室温で一晩攪拌した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した。

この残渣に、メタノール中ナトリウムメトキシド（０．５ｍｏｌ／Ｌ、６ｍＬ）を加え、この混合物を室温で一晩攪拌した。１０％塩酸を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（１：２ヘキサン／酢酸エチル）により精製し、２０（２３ｍｇ、９３％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５０５（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３１Ｈ_５２Ｏ_５＝５０４。

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（実施例９Ａ．シクロアストラゲノールモノグリコシド６の遊離ヒドロキシルのアルキル化）

６（５０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｍＬ）溶液に、窒素下、ヨードメタン（１．０ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）および水素化ナトリウム（６０％油分散、６０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を０℃で加え、この混合物を室温で一晩攪拌した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（３：１ヘキサン／酢酸エチル）により精製してペルメトキシ化合物２１（３３ｍｇ、５７％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ７５１（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_４３Ｈ_７４Ｏ_１０＝７５０。

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（実施例９Ｂ．３，１６，２５−トリメトキシアストラゲノール、２２の調製：同時転移を伴うペルメトキシ化合物２１からグリコシドの除去）

２１（３０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液に、硫酸（０．２ｍＬ）を加え、この混合物を１０時間還流した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：１ヘキサン／酢酸エチル）により精製して２２（３．６ｍｇ、１７％）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５３３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３３Ｈ_５６Ｏ_５＝５３２。

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（実施例１０Ａ．シクロアストラゲノールモノグリコシド７の遊離ヒドロキシルのアルキル化）

化合物２３（１８ｍｇ、５３％）を、上記化合物２１の調製のために用いられた手法に従って７（３０ｍｇ）から得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ７０７（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_４１Ｈ_７０Ｏ_９＝７０６。

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（実施例１０Ｂ．６，１６，２５−トリメトキシアストラゲノール、２４の調製：同時転移を伴うペルメトキシ化合物２３からグリコシドの除去）

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化合物２４（７．１ｍｇ、５６％）を、上記化合物２２の調製のために用いられた手法に従って２３（１７ｍｇ）から得た。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５３３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３３Ｈ_５６Ｏ_５＝５３２。

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（実施例１１．３，６−ジメトキシシクロアストラゲノール２５の調製：ジ（メトキシメチル）エーテル基の除去を伴う１６，２５−ジ（メトキシメチル）エーテル化合物１９のメチル化）

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１９（３０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３ｍＬ）溶液に、窒素下、ヨードメタン（０．７５ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）および水素化ナトリウム（６０％油分散、４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、この混合物を室温で一晩攪拌した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した。

この残渣に、テトラヒドロフラン（５ｍＬ）および１０％塩酸（１ｍＬ）を加え、この混合物を室温で一晩攪拌してから１時間還流した。水を加え、混合物を、酢酸エチルで抽出した。有機層を、水とブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（３：１〜１：１ヘキサン／酢酸エチル）により精製し、２５（１３ｍｇ、４８％）および少量（７．４ｍｇ、２５％）の３，６−ジメトキシ−１６−（メトキシメチル）エーテル化合物２６を得た。
２５：ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５６３（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３４Ｈ_５８Ｏ_６＝５６２。

２６：ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ５１９（Ｍ＋Ｈ）^＋ Ｃ_３２Ｈ_５４Ｏ_５＝５１８。

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図１Ａ〜Ｈは、本明細書に記載された方法および組成物に使用するための例示的化合物の構造を示している。 図１Ａ〜Ｈは、本明細書に記載された方法および組成物に使用するための例示的化合物の構造を示している。 図２は、ＴＲＡＰアッセイで測定した時の、２（シクロアストラゲノール）で処理した新生児ケラチノサイトにおけるテロメラーゼ活性の増大を示している。 図３は、ＴＲＡＰアッセイで測定した時の、ＥＧＦ（１０ｎＭ）および溶媒コントロールと比較した、１（アストラガロシドＩＶ）による新生児ケラチノサイトにおけるテロメラーゼ活性の増大を示している。 図４は、「スクラッチアッセイ」で測定した時の老齢の成人ケラチノサイトにおける１（アストラガロシドＩＶ）による創傷治癒活性を示す一連のコンピュータ作成画像である。 図５は、幼若新生児ケラチノサイトにおける、１（アストラガロシドＩＶ）および２（シクロアストラゲノール）の創傷治癒活性を示す一連のコンピュータ作成画像である。 図６は、老化ケラチノサイト単独およびテロメラーゼ阻害オリゴヌクレオチド（ＧＲＮ１６３）またはコントロールオリゴヌクレオチド（ＧＲＮ１３７２２７）の存在下での老化ケラチノサイトにおける１（アストラガロシドＩＶ）の創傷治癒活性を示す一連のコンピュータ作成画像である。 図７は、テロメラーゼ阻害剤ＧＲＮ１６３の存在下および不在下における、また約２ｎＭ ＰＤＧＦ（血小板由来因子）と比較した、老化新生児ケラチノサイトにおける１（アストラガロシドＩＶ）の創傷治癒活性を示すグラフである。

Claims (4)

1. 式ＩＩ：
   の化合物であって、
   式中、
   Ｘ^４およびＸ^５の各々が、ヒドロキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アシルオキシ、ケト、およびグリコシドから独立して選択され、
   ＯＲ^３が、ヒドロキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アシルオキシ、およびグリコシドから選択され、
   前記グリコシド上の任意のヒドロキシル基が、さらにグリコシド、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、またはＣ_１〜Ｃ_６アシルにより置換され得る、化合物。
2. Ｘ^４およびＯＲ^３の各々が、ヒドロキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アシルオキシ、およびグリコシドから選択され、Ｘ^５が、ヒドロキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アシルオキシ、およびケト（＝Ｏ）から選択される、請求項１に記載の化合物。
3. Ｘ^４が、ＯＨまたはグリコシドであり、Ｘ^５およびＯＲ^３の各々が、ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
4. Ｘ^４が、ＯＨである、請求項３に記載の化合物。