ES2666864T3

ES2666864T3 - Composiciones para aumentar la actividad telomerasa y tratar infección por VIH

Info

Publication number: ES2666864T3
Application number: ES04777032.6T
Authority: ES
Inventors: Calvin B. Harley; Allison C. Chin; Tsutomu Akama; Nancy Yuk-Yu Ip; Yung-Hou Wong, Phd; David M. Dr. Miller-Martini
Original assignee: Telomerase Activation Sciences Inc
Current assignee: Telomerase Activation Sciences Inc
Priority date: 2003-06-23
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2024-06-23
Also published as: NZ544191A; MXPA05013844A; EA200600076A1; JP2007524627A; JP2014024861A; CY1119951T1; HUE043168T2; US20110071095A1; CA2528483A1; US20080113925A1; WO2005000245A3; BRPI0411856A; US20150093455A1; PT1644009T; JP5841337B2; AP2280A; EA009442B1; CN1809364A; PL1644009T3; EP2548880A2

Abstract

Un compuesto aislado de fórmula I:**Fórmula** donde: X1 es hidroxi o ß-D-xilopiranósido, X2 es hidroxi o ß-D-glucopiranósido, y X3 es hidroxi; OR1 es hidroxi; y R2 forma, junto con el carbono 9, un anillo ciclopropilo fusionado, y representa un enlace sencillo entre los carbonos 9 y 11, en una cantidad eficaz para uso en tratar una infección por VIH.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones para aumentar la actividad telomerasa y tratar infección por VIH Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos que inducen la actividad telomerasa en células para su uso en tratar infección por VIH, y a composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos, como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención y referencias

Telomerasa

La telomerasa es una ribonucleoproteína que cataliza la adición de repeticiones teloméricas a los extremos de los telómeros. Los telómeros son largos tramos de secuencias repetidas que cubren los extremos de los cromosomas y se cree que estabilizan el cromosoma. En seres humanos, los telómeros típicamente tienen de 7-10 kb de longitud y comprenden múltiples repeticiones de la secuencia -TTAGGG-. La telomerasa no se expresa en la mayoría de las células adultas, y la longitud de los telómeros disminuye con sucesivas rondas de replicación. Después de un cierto número de rondas de replicación, el acortamiento progresivo de los telómeros produce que las células entren en una fase de crisis telomérica, que a su vez lleva a senescencia celular. Ciertas enfermedades se asocian con pérdida telomérica rápida, produciendo senescencia celular prematura. Se ha mostrado que la expresión del gen que codifica la proteína telomerasa humana en células humanas confiere un fenotipo inmortal, presumiblemente evitando la ruta de senescencia natural de las células. Además, se ha mostrado que la expresión del gen de la telomerasa en células en envejecimiento con telómeros cortos produce un aumento en la longitud del telómero y restablece un fenotipo típicamente asociado con células más jóvenes.

Las células somáticas, al contrario que las células tumorales y ciertas células madre, tienen poca o ninguna actividad telomerasa y dejan de dividirse cuando los extremos teloméricos de al menos algunos cromosomas se han acortado a una longitud crítica, produciendo senescencia celular programada (muerte celular). Puesto que la pérdida de las repeticiones teloméricas en células somáticas, que produce senescencia, aumenta por baja actividad telomerasa, la inducción de la actividad telomerasa, que tiene el efecto de añadir haces de repeticiones teloméricas a los telómeros, otorga por tanto a células somáticas mortales capacidad replicativa aumentada, y otorga a células senescentes la capacidad para proliferar y salir apropiadamente del ciclo celular tras la reparación del tejido dañado.

Los beneficios terapéuticos potenciales de la actividad telomerasa aumentada en células somáticas incluyen, por ejemplo, tratamiento de SIDA, que se caracteriza por la senescencia temprana de los linfocitos T citotóxicos (células CD8+) que son responsables de destruir células CD4+ infectadas (véase, por ejemplo, Dagarag et al., 2003); neuroprotección en pacientes de Alzheimer (véase, por ejemplo, Mattson, 2000); cicatrización y mantenimiento de células en explantes, tal como células corticosuprarrenales (véase, por ejemplo, Thomas et al., 2000) o células de médula ósea o injerto estromal/mesenquimatoso (véase, por ejemplo, Simonsen et al., 2002). Las citas enteras de estas referencias aparecen a continuación.

Las referencias que discuten estas y otras características de la telomerasa incluyen:

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Se han investigado métodos de aumentar la actividad telomerasa terapéuticamente por, por ejemplo, Bodnar (1997), White (2000), Hannon et al. (1999; 2000), Franzese et al. (2001), y Yudoh et al. (2001), todos citados anteriormente. En estos artículos, la actividad telomerasa se aumenta en general por sobreexpresión de hTRT, el gen que codifica el componente proteico de la telomerasa humana, o por expresión de proteínas que median el ensamblaje de la telomerasa, por ejemplo, proteínas de choque térmico (White). Franzese et al. describen que Saquinavir, un inhibidor de proteasa recetado para el tratamiento de la infección por VIH, aumentó la actividad telomerasa en células mononucleares de sangre periférica; Vasa et al. describieron la activación de la telomerasa, y un retraso resultante en senescencia endotelial, por administración de un precursor del óxido nítrico (NO).

Astragalósidos y ginsenósidos

Se han descrito compuestos de las familias de astragalósido y ginsenósido como que tienen varios efectos biológicos. las referencias que discuten la actividad biológica de los astragalósidos y ginsenósidos incluyen:

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Compendio de la invención

El objeto que no está abarcado por el ámbito de las reivindicaciones no forma parte de la presente invención reivindicada.

La invención descrita en el presente documento en general se refiere a composiciones para uso en métodos de aumentar la actividad telomerasa en células. Tales composiciones se pueden usar en células en cultivo, es decir, in vitro o ex vivo, o in vivo, tal como células en crecimiento en tejidos de un sujeto, incluyendo sujetos humanos y animales no humanos, particularmente mamíferos no humanos.

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En aspectos particulares de la divulgación, las composiciones comprenden un compuesto de fórmula I, II, o III como se describe posteriormente. Aspectos de la divulgación incluyen formulaciones de tales compuestos para uso en aplicaciones cosméticas, nutracéuticas y farmacéuticas, en particular en aplicaciones donde aumentar la actividad telomerasa en células se muestra que es, o espera que sea, beneficioso. También se proporcionan métodos de usar los compuestos y formulaciones de los mismos para tales aplicaciones, incluyendo métodos para aplicar o administrar tales formulaciones después de que se haya determinado la necesidad para, o ventaja de, aumentar la actividad telomerasa en células o tejidos.

La presente divulgación incluye, en un aspecto, un método de aumentar la actividad telomerasa en una célula o tejido. El método comprende poner en contacto la célula o tejido con una formulación de un compuesto aislado de fórmula I, fórmula II, o fórmula III posteriormente. En formas de realización preferidas, el compuesto es de fórmula I o II posteriormente. El método puede comprender además la etapa preliminar de identificar una célula o tejido en el que se desea un aumento en la actividad telomerasa.

Según la divulgación, en compuestos de fórmula I:

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cada uno de X1, X2 y X3 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido;

OR1 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido;

en donde cualquiera de los grupos hidroxilo en dicho glucósido puede estar sustituido con un glucósido adicional, alquilo inferior, o acilo inferior, de modo que el compuesto incluye un máximo de tres glucósidos; y R2 es metilo y — representa un doble enlace entre los carbonos 9 y 11; o, en formas de realización preferidas, R2 forma, junto con el carbono 9, un anillo de ciclopropilo fusionado, y representa un enlace sencillo entre los carbonos 9 y 11.

Preferiblemente, el compuesto incluye cero, uno, o dos, más preferiblemente cero o dos, glucósidos, ninguno de los cuales está sustituido con un glucósido adicional. Preferiblemente, los glucósidos son de la configuración D (natural).

En aspectos seleccionados de la divulgación de fórmula I, cada uno de X1 y X2 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido y X3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido. En formas de realización adicionales, X1 es OH o un glucósido, cada uno de X2 y OR1 es independientemente OH o un glucósido; y X3 es OH o ceto. Los compuestos ejemplares de fórmula I incluyen astragalósido IV, cicloastragenol, astragenol, astragalósido IV 16-ona, cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido y cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido. Los compuestos para uso según la invención se definen en las reivindicaciones.

En formas de realización seleccionadas, el compuesto se selecciona de astragalósido IV, cicloastragenol, astragenol y astragalósido IV 16-ona. En una forma de realización, el compuesto es astragalósido IV.

Según un aspecto de la divulgación, en compuestos de fórmula II:

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cada uno de X4 y X5 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido, y

OR3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido,

en donde cualquiera de los grupos hidroxilo en dicho glucósido puede estar sustituido con un glucósido adicional, alquilo inferior, o acilo inferior, de modo que el compuesto incluye un máximo de tres glucósidos.

Preferiblemente, el compuesto incluye cero, uno, o dos glucósidos, ninguno de los cuales está sustituido con un glucósido adicional. Preferiblemente, los glucósidos son de la configuración D.

En aspectos seleccionados de la fórmula II, cada uno de X4 y OR3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido, y X5 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y ceto (=O). En formas de realización adicionales X4 es OH o un glucósido, y cada uno de X5 y OR3 es OH. En una forma de realización, X4 es OH.

Según un aspecto de la divulgación, en compuestos de fórmula III:

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cada uno de X6, X7 y X8 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido, y

OR4 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido,

En aspectos seleccionados de la fórmula III, cada uno de X6, X7, X8 y OR4 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido, y preferiblemente se selecciona de hidroxi y un glucósido. En formas de realización adicionales, cada uno de X8 y OR4 es OH, y cada uno de X6 y X7 se selecciona independientemente de hidroxilo y un glucósido. En aspectos aun adicionales, cada uno de OR4, X6 y X8 es OH y X7 es un glucósido. Un compuesto ejemplar de fórmula III es ginsenósido RH1.

Un compuesto preferido de fórmula I, II o III anteriormente, cuando se formula en un solvente a una concentración de 1 |jg/ml o menos, es eficaz para producir un nivel de actividad telomerasa en queratinocitos o fibroblastos, medido en un ensayo TRAP, al menos el 50% mayor que el nivel en dichas células tratadas con dicho solvente, medido en un ensayo TRAP como se describe en el presente documento. En formas de realización más preferidas, el compuesto es eficaz para producir un nivel de actividad telomerasa en queratinocitos o fibroblastos, medido en un ensayo TRAP, al menos el 100% mayor que el nivel en dichas células tratadas con dicho solvente, medido en un ensayo TRAP como se describe en el presente documento.

Los compuestos ejemplares de fórmulas I-III incluyen los representados en la figura 1 y designados en el presente documento como 1 (astragalósido IV), 2 (cicloastragenol), 3 (astragenol), 4 (astragalósido IV 16-ona), 5 (20R,24S- epoxi-3p,16p,25-trihidroxi-9p-metiM9-norlanost-1,5-dieno), 6 (cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido), 7 (cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido), y 8 (ginsenósido RH1). Los compuestos 1-4, 6 y 7 son según la invención. En formas de realización seleccionadas, el compuesto se selecciona de los designados en el presente documento como 1 (astragalósido IV), 2 (cicloastragenol), 3 (astragenol), 4 (astragalósido IV 16-ona), 6 (cicloastragenol 6-p-D- glucopiranósido), y 7 (cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido). En formas de realización adicionales, el compuesto se selecciona de los designados en el presente documento como 1, 2, 3, y 4. En una forma de realización, el compuesto es astragalósido IV (1) o cicloastragenol (2).

El método de poner en contacto una formulación de un compuesto aislado de fórmula I, II, o III con una célula o tejido puede comprender, antes de dicho poner en contacto, identificar una célula o tejido en el que se desea un

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aumento en la actividad telomerasa. Los beneficios que se van a producir al aumentar la actividad telomerasa en una célula o tejido incluyen, por ejemplo, aumento de la capacidad replicativa y/o longevidad de dicha célula o células en dicho tejido.

El método puede incluir diagnosticar una afección en un sujeto de modo que se desea aumentar la actividad telomerasa en las células o tejido del sujeto, y administrar la formulación al sujeto. El sujeto es preferiblemente un sujeto mamífero, tal como un sujeto o paciente humano. Tales afecciones pueden incluir, por ejemplo, infección por VIH, varias enfermedades degenerativas, tal como enfermedad neurodegenerativa, enfermedad degenerativa de los huesos o articulaciones, degeneración macular, ateroesclerosis, y anemia. Tales afecciones también incluyen heridas y otras afecciones agudas o crónicas de la epidermis, tal como, por ejemplo, una quemadura, una abrasión, una incisión, un sitio de injerto, una lesión causada por un agente infeccioso, una úlcera venosa crónica, una úlcera diabética, una úlcera de compresión, úlceras de decúbito, una úlcera mucosa, y formación de queloide.

Según esto, la divulgación proporciona métodos de tratar una afección en un paciente, tal como las indicadas anteriormente, aumentando la actividad telomerasa en células o tejido del paciente, el método comprende administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento, una formulación de un compuesto aislado de fórmula I, de fórmula II, o de fórmula III, como se ha definido anteriormente. Según la invención, los compuestos reivindicados se usan para tratar una infección por VIH. Las composiciones se pueden administrar por varias rutas, por ejemplo, por vía oral, tópica o parenteral.

La divulgación proporciona además un método de diagnosticar en un sujeto un estado de enfermedad sujeto a tratamiento aumentando la actividad telomerasa en una célula o tejido del sujeto, y administrar un compuesto de fórmula I, II o III como se ha descrito anteriormente, preferiblemente un compuesto de fórmula I o II, en un vehículo farmacéutico, al sujeto en necesidad de tal tratamiento.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de tratar una afección aguda o crónica de la epidermis, que comprende poner en contacto células epidérmicas con una formulación tópica de un compuesto aislado de fórmula I, de fórmula II, o de fórmula III, como se ha definido anteriormente. En aspectos preferidos, el compuesto es de fórmula I o fórmula II. En formas de realización adicionales, el compuesto se selecciona de astragalósido IV, cicloastragenol, astragenol, astragalósido IV 16-ona, cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido, cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido, y 20R,24S-epoxi-3p,16p,25-trihidroxi-9p-metil-l9-norlanost-1,5-dieno (designado en el presente documento como 5).

Las células con las que la formulación se pone en contacto también pueden incluir células en explante que se ponen en contacto ex vivo, por ejemplo, para terapias celulares, u otras células en cultivo. Según esto, la divulgación proporciona un método de aumentar la capacidad replicativa de células in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto dichas células con una cantidad eficaz de una composición que comprende un compuesto de fórmula I, de fórmula II o de fórmula III, como se ha definido anteriormente, incluyendo aspectos seleccionados de los compuestos como se ha definido anteriormente. En aspectos preferidos, el compuesto es de fórmula I o de fórmula II, incluyendo aspectos seleccionados de los compuestos como se ha definido anteriormente. En general, las células son células de mamífero no transformadas; en aspectos seleccionados, las células son células madre, tal como células madre de médula ósea, células estromales de médula ósea, fibroblastos dérmicos jóvenes o de pase temprano, células precursoras de islotes, células de neuroesfera, células corticosuprarrenales, células satélite de músculo, osteoblastos, células epiteliales pigmentadas retinales, y células CD8+ restringidas a VIH.

En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, un compuesto de fórmula I como se ha representado anteriormente donde:

cada uno de X1 y X2 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido;

X3 es ceto;

en donde cualquiera de los grupos hidroxilo en dicho glucósido puede estar sustituido con un glucósido adicional, alquilo inferior, o acilo inferior, de modo que el compuesto incluye un máximo de tres glucósidos; y R2 es metilo y mi representa un doble enlace entre los carbonos 9 y 11; o, en formas de realización preferidas, R2 forma, junto con el carbono 9, un anillo de ciclopropilo fusionado, y mi representa un enlace sencillo entre los carbonos 9 y 11.

Preferiblemente, el compuesto incluye, cero, uno o dos glucósidos, ninguno de los cuales está sustituido con un glucósido adicional, y los glucósidos son de la configuración D.

En aspectos seleccionados de la composición X1 es OH o un glucósido, y cada uno de X2 y OR1 es independientemente OH o un glucósido. Según la invención, la composición farmacéutica es como se define en las reivindicaciones.

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En una forma de realización, el compuesto es astragalósido IV 16-ona (designado en el presente documento como 4).

En un aspecto de la divulgación, la composición comprende, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, un compuesto de fórmula I como se representa anteriormente, donde:

uno de X1 y X2 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y ceto, y el otro es un glucósido; y

cada uno de X3 y OR1 es independientemente hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido;

en donde cualquiera de los grupos hidroxilo en dicho glucósido puede estar sustituido con un glucósido adicional,

alquilo inferior, o acilo inferior, de modo que el compuesto incluye un máximo de tres glucósidos; y

R2 es metilo y representa un doble enlace entre los carbonos 9 y 11; o, en formas de realización preferidas, R2

forma, junto con el carbono 9, un anillo de ciclopropilo fusionado, y representa un enlace sencillo entre los

carbonos 9 y 11.

Preferiblemente, el compuesto incluye un glucósido, que no está sustituido con un glucósido adicional, y que es de la configuración D. En una forma de realización, el compuesto se selecciona de cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido (designado en el presente documento como 6) y cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido (designado en el presente como 7).

En otro aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, un compuesto de fórmula II como se ha definido anteriormente. Aspectos seleccionados del compuesto también son como se ha definido anteriormente. En un aspecto, el compuesto es el designado en el presente documento como 5.

La divulgación también proporciona compuestos de fórmula II como se han definido anteriormente, incluyendo aspectos seleccionados como se han definido anteriormente. En un aspecto, el compuesto es el designado en el presente documento como 5.

En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona una formulación farmacéutica tópica de un compuesto aislado de fórmula I, de fórmula II o de fórmula III, como se han definido anteriormente. Aspectos seleccionados de los compuestos también se definen anteriormente. En aspectos preferidos de la divulgación el compuesto es de fórmula I o fórmula II. Según la invención, en la composición farmacéutica que comprende una formulación tópica, el compuesto aislado se selecciona de cicloastragenol, astragenol, astragalósido IV 16-ona, cicloastragenol 6-p-D- glucopiranósido y cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido.

La formulación tópica típicamente comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en un emulsionante, un espesante, y un emoliente de la piel. Tales composiciones se pueden usar para el tratamiento de heridas u otras afecciones agudas o crónicas de la epidermis.

En otro aspecto relacionado, la divulgación proporciona composiciones nutracéuticas que comprenden una formulación nutracéutica de un compuesto aislado de fórmula I, de fórmula II o de fórmula III, como se ha definido anteriormente. Aspectos seleccionados de los compuestos también se definen anteriormente. En aspectos preferidos el compuesto es de fórmula I o fórmula II, incluyendo formas de realización seleccionadas como se han definido anteriormente. En aspectos adicionales, el compuesto se selecciona de astragalósido IV, cicloastragenol, astragenol, astragalósido IV 16-ona, cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido, cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido, y 20R,24S-epoxi-3p,16p,25-trihidroxi-9p-metil-19-norlanost-1,5-dieno (designado en el presente documento como 5). En aspectos adicionales, la formulación nutracéutica comprende, además del compuesto aislado de fórmula I, II o III, un extracto de hierbas nutracéutico, que puede ser un extracto de Astragalus membranaceous.

Un compuesto aislado de fórmula I, II o III, como se ha definido anteriormente, incluyendo aspectos seleccionados como se han descrito anteriormente, también se puede usar para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad sujeta a tratamiento aumentando la actividad telomerasa en una célula o tejido. Los ejemplos de tales enfermedades se discuten en más detalle posteriormente. De forma similar, un compuesto aislado de fórmula I, II o III, como se ha definido anteriormente, incluyendo aspectos seleccionados como se han descrito anteriormente, también se puede usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección crónica o aguda de la epidermis. En aspectos preferidos de tales usos, el compuesto aislado es de fórmula I o fórmula II, incluyendo aspectos seleccionados de fórmula I o fórmula II como se describe anteriormente.

También se proporciona un método de seleccionar un compuesto eficaz para aumentar la actividad telomerasa en una célula. Según este método, un derivado de un compuesto de fórmula I, fórmula II, fórmula III, como se ha definido anteriormente, se ensaya para su capacidad de aumentar la actividad telomerasa en queratinocitos o fibroblastos, medido por un ensayo TRAP como se describe en el presente documento. El derivado se selecciona si, cuando se formula en un solvente a una concentración de 1 pg/ml o menos, es eficaz para producir un nivel de actividad telomerasa en queratinocitos o fibroblastos, medido en un ensayo TRAP, al menos el 50% mayor, y preferiblemente al menos el 100% mayor, que ese medido en dichas células tratadas con dicho solvente. El derivado se puede formular después con un vehículo tópico, farmacéutico o nutracéutico.

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También se proporciona, en un aspecto relacionado, un método de seleccionar un agente para el tratamiento de afecciones agudas o crónicas de la epidermis. Según este método, un derivado de un compuesto de fórmula I, fórmula II, fórmula III, como se ha definido anteriormente, se ensaya para actividad de cicatrización en queratinocitos o fibroblastos, en un ensayo de arañazo como se describe en el presente documento. El derivado se selecciona si tiene una actividad cicatrizante medida en un ensayo de arañazo, a una concentración de 1 |jg/ml, al menos el 50% mayor que la de un control de solvente, preferiblemente al menos el 100% mayor que la de un control de solvente. El derivado se puede formular después con un vehículo tópico.

Estos y otros objetos y características de la invención serán más completamente aparentes cuando se lea la siguiente descripción detallada junto con los dibujos acompañantes.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-H muestran las estructuras de compuestos ejemplares para uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Los compuestos 1-4, 6 y 7 están dentro del ámbito de las reivindicaciones.

La figura 2 muestra un aumento de la actividad telomerasa en queratinocitos neonatales tratados con 2 (cicloastragenol), medido en un ensayo TRAP.

La figura 3 muestra un aumento de la actividad telomerasa en queratinocitos neonatales por 1 (astragalósido IV), en comparación con EGF (10 nM) y un control de solvente, medido en un ensayo TRAP.

La figura 4 es una serie de imágenes generadas por ordenador que muestran la actividad cicatrizante de 1 (astragalósido IV) en queratinocitos adultos que envejecen, medido en un “ensayo de arañazo”.

La figura 5 es una serie de imágenes generadas por ordenador que muestran la actividad cicatrizante de 1 (astragalósido IV) y 2 (cicloastragenol) en queratinocitos neonatales jóvenes.

La figura 6 es una serie de imágenes generadas por ordenador que muestran la actividad cicatrizante de 1 (astragalósido IV) en queratinocitos que envejecen, solo y en presencia de un oligonucleótido inhibidor de telomerasa (GRN163) o un oligonucleótido control (GRN137227).

La figura 7 es un gráfico que muestra la actividad cicatrizante de 1 (astragalósido IV) en queratinocitos neonatales que envejecen, en presencia y ausencia del inhibidor de telomerasa GRN163, y en comparación con PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) ~2 nM.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Los siguientes términos, como se usan en el presente documento, tienen los significados dados a continuación, a menos que se indique de otra manera:

Se muestra a continuación un esquema general de numeración de átomos de carbono usado para la nomenclatura de los compuestos descritos en el presente documento. (Nótese que los compuestos de estructura II carecen del carbono 19, y los compuestos de estructura III carecen del carbono 18 mostrado en este esquema. Según esto, no se pretende que el esquema de numeración limite las composiciones de la invención).

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“Alquilo” se refiere a un radical monovalente acíclico completamente saturado que contiene carbono e hidrógeno, que puede ser ramificado o lineal. Los ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo, e isopropilo. “Alcoxi” se refiere a un grupo de forma OR, donde R es alquilo como se ha definido anteriormente.

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“Aciloxi” se refiere a un grupo de la forma -OC(=O)R, donde R es alquilo como se ha definido anteriormente. Según esto, “acilo” se refiere al grupo -C(=O)R.

“Alquilo inferior” (o alcoxi inferior, o aciloxi inferior) se refiere a tal grupo que tiene de uno a seis átomos de carbono; en formas de realización seleccionadas, tales grupos incluyen de uno a cuatro átomos de carbono, uno o dos átomos de carbono, o un átomo de carbono (es decir, metilo, metoxi, acetiloxi).

“Células madre” se refiere a células relativamente no diferenciadas de un linaje común que retienen la capacidad de dividirse y ciclar durante toda la vida postnatal, para proporcionar células que se pueden diferenciar más y especializarse (por ejemplo, células madre en las capas basales de la piel o en tejido hematopoyético, tal como células primitivas en la médula ósea de las que derivan todos los diferentes tipos de células sanguíneas).

Mediante “eficaz para aumentar la actividad telomerasa en una célula”, con referencia a un compuesto, se quiere decir que una composición que contiene el compuesto a una concentración de 1 pg/ml o menos es eficaz para producir un nivel de actividad telomerasa en un queratinocito o fibroblasto, medido en un ensayo TRAP como se describe en el presente documento, que es mayor, en un factor de al menos 1,5 (es decir, al menos el 50% mayor) que el nivel producido por una formulación similar que no contiene el compuesto, medido en un ensayo TRAP. En formas de realización preferidas, el compuesto es eficaz, a una concentración de 1 pg/ml o menos, para producir un nivel de actividad telomerasa en tal célula, medido en un ensayo TRAP como se describe en el presente documento, que es mayor en un factor de al menos 2 (es decir, al menos el 100% mayor) que el nivel producido por una formulación similar que no contiene el compuesto.

En referencia a la administración de un compuesto a un paciente, una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa en las células o tejidos del paciente, de modo que se logra un resultado terapéutico deseado. En referencia al tratamiento de células in vitro o ex vivo, una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa en las células, aumentando de esta manera la capacidad replicativa y/o longevidad de las células.

En concentraciones expresadas en el presente documento como % (p/v), el 100% (p/v) corresponde a 1 g de soluto/ml de solvente. Por ejemplo, el 0,1% (p/v) = 1 mg/ml.

Una “formulación de un compuesto aislado” se refiere a una formulación preparada combinando el compuesto aislado con uno o más otros ingredientes (que pueden ser ingredientes activos o inactivos) para producir la formulación. Donde el compuesto se ha purificado directamente de una fuente natural, la frase “compuesto aislado” requiere que el compuesto (antes de la formulación) se haya purificado no menos de 100 veces comparado con la pureza del compuesto en la fuente natural. Donde el compuesto no se purifica directamente de una fuente natural, la frase “compuesto aislado” se refiere a un compuesto que (antes de la formulación) se ha producido por un proceso que implica una o más etapas de síntesis química, produciendo una preparación del compuesto que no tiene menos del 5% (p/p) de pureza.

II. Métodos y composiciones para aumentar la actividad telomerasa

Según la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos para aumentar la actividad telomerasa en una célula. Según la invención, estos compuestos son para uso en tratar infección por VIH. Según el método, una célula o tejido se pone en contacto con una formulación de un compuesto aislado de fórmula I, II o III como se divulga en el presente documento, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa en la célula o tejido, relativa al nivel de actividad telomerasa en la célula o tejido en ausencia del compuesto. El método también puede incluir una etapa preliminar de identificar una célula o tejido en que se desea una actividad telomerasa aumentada.

En un aspecto de la divulgación, el compuesto está representado por la fórmula I:

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En la fórmula I, cada uno de X1, X2 y X3 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido, y el grupo OR1 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido. En aspectos seleccionados, cada uno de X1 y X2 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido.

En aspectos seleccionados de la fórmula I, R2 es metilo y — representa un doble enlace entre los carbonos 9 y 11, como se representa. En otros aspectos, R2 forma, junto con el carbono 9, un anillo de ciclopropilo fusionado, y representa un enlace sencillo entre los carbonos 9 y 11, como se muestra, por ejemplo, en el compuesto 1 (véase, la figura 1).

Mediante un “glucósido”, como se usa en el presente documento en referencia a cualquiera de los compuestos objeto de fórmulas I, II, o III (o derivados de los mismos), se quiere decir uno de los glucósidos conocidos (es decir, ribósido, arabinósido, xilósido, lixósido, altrósido, glucósido, manósido, gulósido, idósido, galactósido, y talósido). El glucósido típicamente está en la forma de anillo de seis miembros (piranósido), por ejemplo, glucopiranósido o manopiranósido. En formas de realización seleccionadas, el glucósido es un D-glucósido, es decir, tiene la configuración encontrada en monosacáridos naturales. Ejemplos específicos incluyen, D-ribopiranósido, D- arabinopiranósido, D-xilopiranósido, D-glucopiranósido, manopiranósido y D-galactopiranósido. Los glucósidos preferidos incluyen D-glucopiranósido y D-xilopiranósido. En aspectos adicionales, la unión es de la configuración p; por ejemplo, p-D-glucopiranósido.

Cualquiera de los grupos hidroxilo libres en un anillo glucósido presente en los compuestos objeto de fórmulas I, II o III (o derivados de los mismos) puede estar sustituido adicionalmente con un glucósido adicional, alquilo inferior, o acilo inferior, por ejemplo, metoxi o acetiloxi. Preferiblemente, como mucho uno de tal grupo hidroxilo está sustituido con un glucósido adicional. Más preferiblemente, ninguno de tal grupo hidroxilo está sustituido con un glucósido adicional, es decir, la sustitución es acilo inferior, tal como acetilo, o alquilo inferior, tal como metilo. En una forma de realización, todos los grupos hidroxilo en el/los glucósido(s) están sin sustituir.

Preferiblemente, un compuesto objeto de fórmula I, II o III (o un derivado de los mismos) incluye un máximo de tres glucósidos, más preferiblemente un máximo de dos glucósidos. En aspectos seleccionados, el compuesto incluye cero, uno o dos glucósidos, ninguno de los cuales está sustituido con un glucósido adicional. En aspectos seleccionados adicionales, particularmente con respecto a la fórmula I, el compuesto incluye cero o dos glucósidos, ninguno de los cuales está sustituido con un glucósido adicional.

En aspectos seleccionados de fórmula I, cada uno de X1 y X2 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, glucopiranósido, y xilopiranósido, y X3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, glucopiranósido, y xilopiranósido, preferiblemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y ceto.

En aspectos adicionales de fórmula I, X1 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior y p-D-xilopiranósido; X2 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior y p-D-glucopiranósido; X3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y ceto (=O); y OR1 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y p-D- glucopiranósido.

En aspectos seleccionados adicionales de fórmula I, X1 es OH o un glucósido, cada uno de X2 y OR1 es independientemente OH o un glucósido, y X3 es OH o ceto. Según la invención, cada uno de X1 y X2 es OH o un glucósido, OR1 es OH, y X3 es OH, en donde si X1 es un glucósido, es beta-D-xilopiranósido, y en donde si X2 es un glucósido, es beta-D-glucopiranósido. En formas de realización adicionales, X1 es B-D-xilopiranósido, X2 es p-D- glucopiranósido, OR1 es oH, y X3 es OH. En otra forma de realización, cada uno de X1, X2, X3 y OR1 es OH.

Para cada una de estas formas de realización descritas, R2 forma, junto con el carbono 9, un anillo de ciclopropilo fusionado.

Los compuestos ejemplares de estructura I según la invención para uso en los métodos de la invención incluyen los mostrados en la figura 1, y designados en el presente documento como 1 (astragalósido IV), 2 (cicloastragenol), 3 (astragenol), 4 (astragalósido IV 16-ona), 6 (cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido), y 7 (cicloastragenol 3-p-D- xilopiranósido).

Otros compuestos que tienen la estructura esqueleto de cicloastragenol (2) sustituido con 3-p-D-glucopiranósido también se consideran para uso en los métodos de la divulgación. Preferiblemente, el compuesto incluye un total de uno o dos glucósidos, unidos a carbonos separados de la estructura esqueleto (es decir, un glucósido no está unido a un glucósido adicional). Los ejemplos incluyen los compuestos naturales astragalósidos A, 1, 2, y 7, así como las astraverrucinas I y II (que se pueden aislar de Astragalus verrucosus).

La divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos de fórmula I, en donde uno de X1 y X2 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y ceto, y el otro es un glucósido. En formas de realización adicionales, los compuestos se seleccionan de los designados 6 y 7. En otras

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formas de realización, la composición farmacéutica incluye un compuesto de fórmula I en el que X3 es ceto; en una forma de realización, el compuesto es el compuesto designado como 4.

En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos representados por la fórmula II.

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En la fórmula II, cada uno de X4 y X5 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido, y OR3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido; donde “glucósido” y sus varios aspectos son como se ha descrito anteriormente. Como se ha indicado anteriormente, el compuesto incluye un máximo de tres glucósidos, más preferiblemente, un máximo de dos glucósidos. En aspectos seleccionados, el compuesto incluye cero, uno o dos glucósidos, ninguno de los cuales está sustituido con un glucósido adicional.

En aspectos seleccionados de la fórmula II, X4 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido. En formas de realización adicionales, cada uno de X4, X5 y OR3 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, glucopiranósido y xilopiranósido.

En aspectos adicionales de fórmula II, cada uno de X4 y OR3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior y un glucósido, preferiblemente, D-xilopiranósido o D-glucopiranósido, y X5 se selecciona hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y ceto (=O). Preferiblemente, en estos aspectos, OR3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, y aciloxi inferior, y es más preferiblemente hidroxi.

En aspectos adicionales de fórmula II, cada uno de X4, X5 y OR3 es independientemente OH o un glucósido, por ejemplo, D-xilopiranósido o D-glucopiranósido. En aspectos aún adicionales, X4 es OH o un glucósido, y cada uno de X5 y OR3 es Oh. En un aspecto, cada uno de X4, X5 y OR3 es OH. Este compuesto (formalmente nombrado 20R,24S-epoxi-3p,16p,25-trihidroxi-9p-metiM9-norlanost-1,5-dieno) se designa en el presente documento como 5.

La divulgación también proporciona compuestos de fórmula II, anteriormente, donde cada uno de X4 y X5 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido, y OR3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido, en donde cualquiera de los grupos hidroxilo en dicho glucósido puede estar sustituido con un glucósido adicional, alquilo inferior o acilo inferior. En aspectos seleccionados, el compuesto incluye cero, uno o dos glucósidos. Preferiblemente cada uno de dicho glucósido, cuando está presente, es de la configuración D. En aspectos adicionales, cada uno de X4 y OR3 se selecciona de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior y un glucósido, y X5 se selecciona hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y ceto (=O). En aspectos aún adicionales, X4 es OH o un glucósido, y cada uno de X5 y OR3 es OH. En un aspecto, cada uno de X4, X5 y OR3 es OH, es decir, el compuesto designado en el presente documento como 5.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de aumentar la telomerasa en una célula o tejido, poniendo en contacto la célula o tejido con una formulación de un compuesto aislado de fórmula III. De nuevo, el método puede incluir la etapa de identificar una célula o tejido en que se desea un aumento en actividad telomerasa.

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En la fórmula III, cada uno de X6, X7, X8 y OR4 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, ceto, y un glucósido, donde “glucósido” y sus varios aspectos son como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, el compuesto incluye un máximo de dos glucósidos, más preferiblemente, un máximo de un glucósido, ninguno de los cuales está sustituido con un glucósido adicional. Los glucósidos preferidos incluyen D- glucopiranósido y D-xilopiranósido.

En aspectos seleccionados de la estructura NI, cada uno de X6, X7, X8 y OR4 se selecciona independientemente de hidroxi, alcoxi inferior, aciloxi inferior, y un glucósido, y preferiblemente se selecciona de hidroxi y un glucósido.

En aspectos adicionales de la estructura III, cada uno de X8 y OR4 es OH, y cada uno de X6 y X7 se selecciona independientemente de hidroxilo y un glucósido, por ejemplo p-D-glucopiranósido. En aspectos adicionales, OR4 es OH. Preferiblemente cada uno de X6 y X8 es también Oh y X7 es un glucósido. Un compuesto ejemplar de estructura III es ginsenósido RH1, designado en el presente documento como 8.

III. Fuentes y síntesis de compuestos de fórmulas I-III

Los compuestos de fórmulas I, II y III se pueden en general aislar o sintetizar de materiales naturales. Por ejemplo, los astragalósidos I-VII se pueden aislar de raíz de Asatragalus membranaceus, como se describe, por ejemplo, en

A. Kadota et al. JP Kokai No. 62012791 A2 (1987). Como se describe en ella, el tejido de raíz (8 kg), que está comercialmente disponible de varias fuentes de hierbas beneficiosas, se somete a reflujo con MeOH, y el extracto concentrado (200 g) se redisuelve en MeOH y se fracciona por cromatografía en columna en gel de sílice usando mezclas de CHCl3/MeOH/H2O como eluyentes. Cada fracción se procesa por cromatografía inversa en gel de sílice usando mezclas de solventes similares, para dar las siguientes cantidades aproximadas de compuestos aislados: acetilastragalósido I (0,2 g), astragalósido I (3,5 g), isoastragalósido I (0,3 g), astragalósido II (2,3 g), astragalósido III (1,0 g), astragalósido IV (0,8 g), astragalósido V (0,1 g), astragalósido VI (0,3 g), y astragalósido VII (0,1 g). Véase también Kitagawa et al., Chem. Pharm. Bull. 31(2):698-708 (1983b).

Astragalósido IV (designado en el presente documento como 1) también se obtuvo por los presentes autores de Ai Chunmei, Chengdu 610041, P.R. China.

Cicloastragenol (2) se puede preparar por tratamiento de astragalósido IV (1) con HCl metanólico, seguido por neutralización, procesamiento estándar, y purificación por cromatografía, como se describe en la sección experimental posteriormente (ejemplo 1). También se puede obtener cicloastragenol por degradación oxidativa (tratamiento con oxígeno y sodio elemental) de un extracto en butanol de Astragalus membranaceus, como describen P-H Wang et al., J. Chínese Chem. Soc. 49:103-6 (2002). Astragenol (3) y cicloastragenol (2) también se pueden obtener según el procedimiento de Kitagawa et al., Chem. Pharm. Bull. 31(2):689-697 (1983a).

Los compuestos designados en el presente documento como 6 (cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido) y 7 (cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido) se obtuvieron sometiendo a reflujo una solución de astragalósido IV (1) y ácido sulfúrico en metanol seguido por procesamiento estándar y cromatografía en gel de sílice, como se describe en la sección experimental posteriormente (ejemplo 2). También se obtuvieron el producto de reorganización 5 (no reivindicado) y la aglucona, es decir, cicloastragenol (2).

El compuesto 16-ceto 4 se preparó por acetilación de los grupos hidroxilo del glucósido de astragalósido IV, seguido por oxidación con clorocromato de piridinio del 16-hidroxilo y restablecimiento de los hidroxilos del glucósido por tratamiento con borohidruro de sodio (véase, Kitagawa et al., 1983b, citado anteriormente).

La preparación de varios aspectos de las fórmulas I-III, por ejemplo, compuestos que tienen grados variables de alquilación o acilación, o grupos ceto, se puede preparar según métodos conocidos de síntesis orgánica, usando materiales de partida naturales y/o comercialmente disponibles tal como cicloastragenol, astragenol, los astragalósidos o astraverricinas, o panaxatriol, con separación se productos según se necesite. Se dan varios ejemplos en la sección experimental posteriormente. Por ejemplo, los grupos hidroxilo 3, 6 y/o 16 menos estéricamente entorpecidos en general se pueden modificar selectivamente, por ejemplo, por acilación. Si se desea, los grupos hidroxilo sin reaccionar se pueden modificar después por separado, por ejemplo, por alquilación, seguido por eliminación opcional de los grupos acilo. Los compuestos de fórmula I que tienen un anillo ciclopropilo fusionado (por ejemplo, cicloastragenoles) se pueden convertir a los compuestos que tiene un grupo 19-metilo y un doble enlace 9-11 (por ejemplo, astragenoles) por tratamiento con ácido sulfúrico. Esta reacción se puede acompañar de desglucosilación, como se muestra en las reacciones de los ejemplos 9B y 10B, posteriormente.

IV. Determinación de la actividad biológica A. Protocolo del ensayo TRAP

La capacidad de un compuesto para aumentar la actividad telomerasa en una célula se puede determinar usando el ensayo TRAP (Protocolo de Amplificación de Repeticiones Teloméricas), que se conoce en la técnica (por ejemplo,

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Kim et al., Patente en EE UU No. 5.629.154; Harley et al., Patente en EE UU No. 5.891.639). Como se usa en el presente documento, “actividad telomerasa medida en un ensayo TRAP” se refiere a la actividad telomerasa medida en queratinocitos o fibroblastos según el siguiente protocolo. La actividad típicamente se compara con la actividad medida de forma similar en un ensayo control de tales células (por ejemplo, una actividad telomerasa el 50% mayor que la observada en un control de solvente).

Se pueden obtener líneas celulares adecuadas para su uso en el ensayo, preferiblemente fibroblastos humanos normales (NHF) o queratinocitos humanos normales (NHK), de fuentes comerciales, tal como Cascade Biologics, Portland, OR o 4C Biotech, Seneffe, Bélgica, o de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo). Las líneas de fibroblastos humanos normales de la ATCC que se pueden localizar en la página web de la ATCC incluyen, por ejemplo, CCL135, CCL137, y CCL151.

Las células se siembran a aproximadamente 5000 células/pocillo, en medio de cultivo (por ejemplo, medio Epi-Life + suplemento de factor de crecimiento de queratinocitos + CaCl2 60 mM, suministrado por Cascade Biologics, Inc.) durante dos días. Se añaden las composiciones de prueba en un solvente adecuado, tal como etanol al 95% o DMSO, a los pocillos seleccionados en un intervalo de concentraciones y se incuban durante 16-24 horas. Para los datos descritos en el presente documento, el solvente usado fue DMSO.

La solución de lisado de las células se prepara por adición de 3,0 ml de Nonidet® P-40, 1,0 ml de tampón de lisis CHAPS (véase posteriormente), y 1,0 ml de tampón TRAP 10X (véase posteriormente) a 5,0 ml de H2O sin DNasa, ni RNasa (El agua sin DNasa, ni RNasa se puede generar por tratamiento con DEPC (pirocarbonato de dietilo) o comprar de vendedores tal como Sigma).

La morfología de las células tratadas primero se observa en un microscopio, para verificar que no hay signos visuales de crecimiento irregular. El medio se elimina de los pocillos, y las células se enjuagan dos veces en PBS (sin Ca ni Mg). Las placas se enfrían, preferiblemente en hielo, y se añade (aprox. 100 pl por pocillo) tampón de lisis (véase posteriormente) y se trituran pipeteando arriba y abajo varias veces. Las células se incuban en hielo durante 1 hora.

Solución madre Tris-HCl 1 M pH 7,5 MgCl2 1 M EGTA 0,5 M AESBF 100 mM CHAPSa al 10%

BSA

Glicerol al 100%

H2O sin DNasa, ni RNasa

Tampón de lisis CHAPS

Para 1 ml 10 pl

1 pl

2 pl 1 pl 50 pl 1 mg 100 pl

936 pl (hasta 1 ml)

Concentración final

10 mM

1 mM

0,1 mM

0,5%

1 mg/ml 10%

a El detergente CHAPS se añade justo antes del uso del tampón de lisis. Además, se añade AESBF (fluoruro de 4- (2-aminoetil)-bencenosulfonilo HCl) al tampón de lisis justo antes de la etapa de extracción.

Tampón TRAP 10X

Solución madre

Para 5 ml

Concentración final

Tris-HCl 1 M pH 8,3 1 ml 200 mM

MgCl2 1 M 75 pl 15 mM

KCl 1M 3,15 ml 630 mM

Tween 20 (Boehringer Mannheim) 25 pl 0,5%

EGTA 0,1 M 500 pl 10 mM

BSA 20 mg/ml 250 pl 1 mg/ml

Se combinan los siguientes materiales para generar una mezcla maestra de PCR

Solución madre Tampón TRAP 10X dNTPs 2,5 mM Cebador Cy5-TS (0,1 mg/ml) Cebador aCx (0,1 mg/ml) Est. Int. TSU2 (1 pg/ml) Cebador U2 (0,1 mg/ml)

Taq polimerasa (5 U/pl)

H2O sin DNasa, ni RNasa

Por reacción (40 pl)

5.0 pl

1.0 pl 0,2 pl

1.0 pl

1.0 pl 0,4 pl

30,4 pl (hasta 40 pl total)

Concentración final3 1X

50 pM 0,4 ng/ml 2 ng/ml 20 fg/ml 2 ng/ml 2 unidades

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a Basado en el volumen final de 40 |jl de mezcla de PCR más 10 |jl de lisado celular = 50 jl.

La mezcla de PCR incluye los siguientes componentes: el cebador Cy5-TS, un oligonucleótido marcado con Cy5 en 5' que tiene la secuencia 5'-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3' (SEQ ID NO:1), es un sustrato de telomerasa. Dependiendo de la actividad telomerasa del medio, se añadirán repeticiones teloméricas (que tienen la secuencia ..AGGGTT..) al sustrato, para formar productos extendidos de telomerasa, también denominados productos de telomerasa o productos TRAP. El cebador ACX, que tiene la secuencia 5'- GCG CGG CTT ACC CTT ACC CTT ACC CTA ACC-3' (SEQ ID NO: 2), es un cebador inverso anclado que hibrida con los productos extendidos de telomerasa.

El estándar interno TSU2, un oligonucleótido que tiene la secuencia 5'-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AAA AGG CCG AGA AGC GAT-3'; SEQ ID NO:3), una extensión de la secuencia del cebador TS, se añade en una cantidad pequeña controlada para fines de cuantificación. El cebador U2, que tiene la secuencia 5'-ATC GCT TCT CGG CCT TTT (SEQ ID NO:4), es un cebador inverso diseñado para hibridar con la región 3' del estándar interno.

Se añade una muestra del lisado celular (10 jl) a 40 jl de esta mezcla de PCR en un tubo de reacción, y la mezcla se incuba a temperatura ambiente (30°C) durante 30 minutos. La PCR se lleva a cabo incubando la mezcla a las siguientes temperaturas durante los tiempos indicados: 94°C/30 seg, 60°C/30 seg, y 72°C/30 seg; repitiendo este ciclo de tres etapas para realizar 20-30, preferiblemente 31 ciclos.

Se añade colorante de carga que contiene, por ejemplo, azul de bromofenol y xileno cianol, y las muestras se someten a PAGE no desnaturalizante del 10-15% en TBE 0,6x, hasta que el azul de bromofenol se sale del gel. La formación se producto se observa, por ejemplo, usando un fluoroimager para la detección de los productos de telomerasa marcados con CY5 (excitación máxima a 650 nm; emisión máxima a 670 nm).

La cantidad final del estándar interno TSU2 después de la amplificación es en general 5-10 amol por mezcla de reacción de 50 jl. Este control interno da un producto específico de amplificación de PCR 36-mero que aparece como una banda distinta en el gel por debajo del primer producto de adición telomérica (es decir, el producto de una adición telomérica al oligonucleótido TS, seguido por amplificación con el cebador inverso ACX). Esta banda de control interno se puede usar para normalizar las amplificaciones de PCR de diferentes muestras.

El número relativo de moléculas producto de telomerasa (TM) generadas en el ensayo se determina según la fórmula siguiente:

TM = (Tproductos TRAP - TBKD1)/(TEst Int-TeKD2)

donde: Tproductos trap es la intensidad total medida en el gel para todos los productos de telomerasa, Tbkd1 es la intensidad de fondo medida en un carril en blanco para un área equivalente en tamaño a la abarcada por los productos de telomerasa, Test Int es la intensidad para la banda del estándar interno, y Tbkd2 es la intensidad de fondo en un carril en blanco para un área equivalente en tamaño a la abarcada por la banda del estándar interno. El número resultante es el número de moléculas de productos de telomerasa generados para un tiempo de incubación determinado que, para los fines de determinar TM, se designa en el presente documento como 30 minutos.

Los compuestos preferidos de fórmulas I, II o III como se han descrito anteriormente son capaces de producir, a una concentración de 1 jg/ml o menor, un nivel de actividad telomerasa en fibroblastos o queratinocitos al menos el 25% mayor que el nivel de tal actividad visto en un control de solvente. Más preferiblemente, el compuesto es capaz de producir, a una concentración de 1 jg/ml o menor, una actividad telomerasa al menos el 50% mayor que la vista en un control de solvente. Actividades incluso más potentes pueden ser apropiadas para algunas aplicaciones, tal como compuestos que producen actividades telomerasa al menos aproximadamente el 75%, 100% o 500% mayores que el nivel de tal actividad visto en un control de solvente, medido en el ensayo TRAP descrito, a una concentración de 1 jg/ml o menor.

B. Resultados de ensayo TRAP ejemplares

Se evaluó la eficacia en aumentar la actividad telomerasa para compuesto de fórmula I anteriormente en varias concentraciones. Los ensayos se llevaron a cabo en células HEKneoP (queratinocitos neonatales), según el protocolo descrito anteriormente. Las concentraciones variaron desde aprox. 0,03 jM a 10 jM en DMSO.

Como se muestra en la figura 2, para composiciones que contienen el compuesto 1 (astragalósido IV), la actividad telomerasa aumentó al aumentar la concentración, hasta aproximadamente el 306% del control a 1,0 jM, después disminuyó según la concentración aumentó más hasta 10 jM. Como se muestra en la figura 2, para composiciones que contienen 2 (cicloastragenol), la actividad telomerasa aumentó hasta aproximadamente el 300% del control a

1,0 jM (comparada con aproximadamente el 200% en células tratadas con EGF (factor de crecimiento epidérmico) 10 nM), después disminuyó con aumentos adicionales en concentración.

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La tabla 1 da, para composiciones que contienen cada uno de los compuestos mostrados en las figuras 1A-G, la concentración eficaz mínima (CEM) del compuesto que produjo un nivel de actividad telomerasa dos veces la vista en un control de DMSO (es decir, el 100% mayor).

Tabla 1

Designación: Nombre CEM,pM

1: astragalósido IV 0,01

2: cicloastragenol 0,01

3: astragenol 0,03

4: astragalósido IV 16-ona 0,03

5: 20R,24S-epoxi-33,163,25-trihidroxi-9p-metil-19-norlanost-1,5-dieno 0,10

6: cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido 3,2

7: cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido 3,2

8: ginsenósido RH1 10

C. Protocolo de ensayo de cicatrización

Los compuestos de fórmula I-III se pueden usar para fomentar la cicatrización de heridas, quemaduras, abrasiones u otras afecciones agudas o crónicas de la epidermis, como se discute posteriormente. Como se usa en el presente documento, “actividad de cicatrización medida en un ensayo de arañazo” se refiere a la actividad medida en queratinocitos o fibroblastos según el siguiente protocolo, y expresada como el valor de C mostrado en la fórmula posterior.

Las células se siembran en botellas (5 x 105 células por botellas) y se cultivan durante dos días en una cámara humidificada a CO2 al 5%, 37°C. Para crear la “herida”, una pipeta de plástico de 2 ml se arrastra suavemente para “arañar” la superficie celular. La herida ideal tiene aproximadamente 2-3 mm de anchura y 50 mm de longitud (a lo largo del eje largo de la botella de cultivo). Las células se vuelven a tratar con medio que contiene o bien vehículo (DMSO, muestra control) o composiciones de prueba a múltiples concentraciones. Se identifica un área de herida, la botella se marca, y el aspecto de las células se documenta fotográficamente durante 3-4 días de cultivo seguido de las células.

La cantidad de cierre de herida se determina midiendo la anchura de la herida a lo largo del tiempo para muestras tratadas con compuesto relativas a células tratadas con vehículo u otras control. Las medidas se hacen a partir de las fotografías tomadas para cada una de las muestras los días 1 (inmediatamente después de arañar), 2, 3 y 4. El porcentaje de cicatrización (también expresado como “actividad de cicatrización”) se calcula mediante la siguiente fórmula:

C = 100 -[100 x An/Ao]

donde An es la anchura de la herida el día n y A0 es la anchura de la herida el día uno (inmediatamente después de arañar).

Los compuestos preferidos de fórmula I-III como se han descrito anteriormente son capaces de producir, a una concentración de 1 pg/ml o menos, una cantidad de cierre de herida (actividad de cicatrización) en un ensayo de arañazo de queratinocitos o fibroblastos, como se ha descrito anteriormente, que es al menos el 25% mayor que la vista en células sin tratar o control. Actividades incluso más potentes pueden ser apropiadas para algunas aplicaciones, tal como compuestos que producen, a una concentración de 1 pg/ml o menos, una cantidad de cierre de herida en un ensayo de arañazo de queratinocitos o fibroblastos que el al menos aproximadamente el 50% o el 100% mayor que la vista en células sin tratar o control.

D. Resultados ejemplares del ensayo de arañazo

Se evaluó la actividad de cicatrización de los compuestos de la invención 1 (astragalósido IV) y 2 (cicloastragenol) en queratinocitos que envejecen, mediante un ensayo de arañazo como se ha descrito anteriormente. Los resultados de un ensayo típico se muestran en la figura 4, donde la fila superior de imágenes muestra células control (tratadas con solvente, DMSO), y la fila inferior muestra células tratadas con 1 0,1 pg/ml (aproximadamente 0,13 pM) en el mismo solvente. Las células tratadas estaban confluentes el día 4, en contraste con las células control, en las que una “herida” considerable permanecía el día 4. Se vieron resultados similares con esta composición y con 2 (cicloastragenol) 0,01 pM en queratinocitos jóvenes, como se muestra en la figura 5.

La figura 6 muestra la actividad de cicatrización de una composición que contiene 1 (astragalósido IV) en queratinocitos adultos que envejecen, medida en un ensayo similar, en presencia y ausencia de un oligonucleótido inhibidor de telomerasa (GRN163) y un oligonucleótido control (GRN137227). Como se muestra, el oligo inhibidor de telomerasa GRN163 bloquea los efectos de cicatrización de la composición de 1; el efecto del oligo control GRN137227 es mínimo. (GRN163 es un oligonucleótido inhibidor de telomerasa que se dirige a la región molde del

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componente ARN de la telomerasa. Específicamente, GRN163 es un oligonucleótido tiofosforamidato N3'^P5' 13- mero, descrito en detalle en la publicación PCT No. WO 01/18015. GRN137227 es un oligonucleótido control tiofosforamidato N3’^P5’ 13-mero que tiene una secuencia mal emparejada).

La tabla 2 a continuación muestra los valores de C (actividad de cicatrización) para los compuestos 1 y 2 empleados en los ensayos de arañazo mostrados en las figuras 5 y 6, basados en los resultados de esos ensayos, usando la fórmula mostrada anteriormente.

Tabla 2

: Anchura aprox. de la herida (unidades arbitrarias) Ccontrol Cprueba

: Día 1 control Día 4 control Día 1 prueba Día 4 prueba

Fig. 4 (1): 22 10 17 0 54,5 100

Fig. 5 (1): 19 9 18 0 52,6 100

Fig. 5 (2)____: 19 9 21 2 52,6 90,5

La figura 7 ilustra gráficamente el cierre de herida como porcentaje del control para el compuesto de la invención 1 (astragalósido IV) en queratinocitos neonatales que envejecen, en presencia y ausencia de un inhibidor de telomerasa (GRN163), y en comparación con PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) 50 ng/ml (aprox. 2 ml). Como se muestra, la eficacia de 1 era comparable a la de PDGF, y de nuevo se bloqueó por la adición de GRN163.

V. Selección de compuestos adicionales

La divulgación también proporciona métodos de seleccionar compuestos adicionales eficaces para aumentar la actividad telomerasa, por cribado de derivados de compuestos de fórmula I, II, o III en un ensayo TRAP como se describe en el presente documento. En este aspecto, un “derivado” incluye un compuesto producido por modificación de un compuesto de fórmula I, II o III en una o más de las siguientes formas: conversión de un grupo hidroxilo a un grupo carbamato de alquilo inferior, halógeno, tiol, tioéter de alquilo inferior, amino, alquilamino inferior, amida de alquilo inferior, aldehido, o ceto (por ejemplo, alquilación, con formación de un grupo hidroxilo adicional); adición de halógeno, hidroxilo y/o hidrógeno a un doble enlace carbono-carbono; eliminación de un grupo hidroxilo (es decir, conversión a hidrógeno); e inversión de estereoquímica en uno o más centros quirales, preferiblemente un centro quiral que tiene oxígeno. Como se usa en el presente documento, un “derivado” producido por tal(es) modificación(es) excluye los compuestos de fórmulas I, II y III mismos como se han definido anteriormente.

Todas estas modificaciones se pueden lograr usando métodos de síntesis estándar, empleando reacciones sintéticas bien conocidas tal como sustitución nucleófila, que puede incluir la conversión de un grupo hidroxilo a un grupo saliente mejor, tal como tosilato; esterificación; alquilación; oxidación; reducción; halogenación; hidratación; hidrogenación; etc.

Un derivado de un compuesto de fórmula I, II, o III, formulado en un medio solvente adecuado a una o más concentraciones, se criba en un ensayo TRAP de queratinocitos o fibroblastos como se ha descrito anteriormente. Los derivados preferidos para la selección incluyen los que son eficaces, cuando se formulan en un solvente a una concentración de 1 pg/ml o menos, para producir un nivel de actividad telomerasa en queratinocitos o fibroblastos, medido en un ensayo TRAP, al menos el 50% mayor que la medida en dichas células tratadas con dicho solvente.

Alternativamente, o además, un derivado de fórmula I, II, o III, formulado en un medio solvente adecuado a una o más concentraciones, se ensaya para actividad de cicatrización en un ensayo de arañazo como se ha descrito anteriormente. Los derivados preferidos para la selección incluyen los que tienen una actividad de cicatrización, a una concentración de 1 pg/ml o menos, al menos el 25% mayor, y más preferiblemente al menos el 50% mayor, que la de un control de solvente.

VI. Indicaciones terapéuticas y métodos de tratamiento

La presente divulgación proporciona métodos para aumentar la actividad telomerasa en una célula, poniendo en contacto una célula o tejido con una formulación de un compuesto aislado de fórmula I, II o III como se divulgan en la sección II anteriormente, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa en la célula. El método puede incluir la etapa preliminar de identificar una célula o tejido en el que se desea un aumento de la actividad telomerasa. La célula puede estar en cultivo, es decir, in vitro o ex vivo, o dentro de un sujeto o paciente in vivo.

Los beneficios que se van a producir de un aumento en la actividad telomerasa en una célula o tejido incluyen, por ejemplo, aumento de la capacidad replicativa y/o longevidad de las células puestas en contacto. El método puede comprender además diagnosticar una afección en un sujeto o paciente en donde se desea un aumento en la actividad telomerasa en células o tejido del paciente; por ejemplo, diagnosticar una enfermedad sujeta a tratamiento por un aumento en la actividad telomerasa en células o tejido. Según esto, la divulgación proporciona métodos de

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tratar una afección en un paciente, aumentando la actividad telomerasa en células o tejido de dicho paciente, el método comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, II o III como se ha divulgado en la sección II anteriormente. Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa en la células o tejido del paciente, de modo que se alcance un resultado terapéutico.

Tales afecciones pueden incluir, por ejemplo, afecciones asociadas con senescencia celular o con una tasa aumentada de proliferación de una célula en ausencia de telomerasa, lo que produce pérdida de telómeros acelerada. Mediante “tasa de proliferación aumentada” se quiere decir mayor tasa de división celular comparada con células normales de ese tipo celular, o comparada con células normales en otros individuos de ese tipo celular. La senescencia de esos grupos de células a una edad anormalmente temprana puede finalmente producir enfermedad (véase, West et al., patente en EE UU No. 6.007.989).

Existen varios estados de enfermedad en los que un aumento en la actividad telomerasa en ciertos tipos celulares puede ser beneficioso. Según esto, la divulgación proporciona métodos de tratar en un paciente una afección seleccionada de las siguientes, aumentando la actividad telomerasa en las células del paciente, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, II, o III como se ha descrito anteriormente. En algunos casos, la afección también puede estar sometida a tratamiento por terapia celular ex vivo, como se describe posteriormente, empleando los tipos celulares asociados (indicados en paréntesis).

(a) enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, e ictus (células del sistema nervioso central, incluyendo neuronas, células de glía, por ejemplo, astrocitos, células endoteliales, fibroblastos),

(b) enfermedades seniles de la piel, tal como atrofia y adelgazamiento dérmico, elastolisis y arrugas en la piel, hiperplasia o hipoplasia de glándulas sebáceas, lentigo senil, y otras anomalías de pigmentación, encanecimiento del pelo y pérdida o adelgazamiento del pelo, o úlceras crónicas de la piel (fibroblastos, células de glándulas sebáceas, melanocitos, queratinocitos, células de Langerhans, células endoteliales microvasculares, células del folículo piloso),

(c) enfermedad degenerativa de las articulaciones (células del cartílago articular, tal como condrocitos y fibroblastos lacunares y sinoviales),

(d) osteoporosis y otras afecciones degenerativas del sistema esquelético (células del sistema esquelético, tal como osteoblastos, células estromales o mesenquimatosas de la médula ósea, células osteoprogenitoras),

(e) enfermedades seniles y de estrés del sistema vascular incluyendo ateroesclerosis, calcificación, trombosis y aneurismas (células del corazón y sistema vascular, incluyendo células endoteliales, células de músculo liso, y fibroblastos adventicios),

(f) degeneración macular senil (células del ojo, tal como células de epitelio pigmentadas y endoteliales vasculares),

(g) SIDA (células CD8+ restringidas a VIH), y

(h) alteración del sistema inmunitario senil y por estrés, incluyendo alteración de la renovación de tejido, que se produce con envejecimiento natural, cáncer, terapia de cáncer, infecciones agudas o crónicas, o con trastornos genéticos que producen recambio celular acelerado, y anemias relacionadas y otras afecciones degenerativas (otras células del sistema inmunitario, incluyendo células en los linajes linfoide, mieloide y eritroide, tal como linfocitos B y T, monocitos, macrófagos circulantes y especializados en tejido, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, células NK, y sus respectivos progenitores).

Además de los tipos celulares indicados anteriormente, tipos celulares adicionales en los que un aumento en la actividad telomerasa puede ser terapéuticamente beneficioso incluyen, pero no están limitados a, células del hígado, glándulas endocrinas y exocrinas, musculatura lisa, o musculatura esquelética.

Según la invención, los compuestos son para uso en tratar infección por VIH. En el caso de individuos infectados por VIH, el recambio de células CD8+ aumenta ya que estas células intentan controlar el nivel de células cD4+ infectadas por VIH. En SIDA (punto (g) anteriormente), se cree que la enfermedad está causada por la senescencia temprana de células CD8+ restringidas a VIH. El envejecimiento de tales células se atribuye no solamente a la cantidad anómala de pérdida de secuencias de telómeros por duplicación celular, sino, además, a la tasa replicativa aumentada de las células, de modo que el desgaste de los telómeros es mayor de lo normal para ese grupo de células. La invención, por tanto, proporciona compuestos para uso en métodos de tratar un sujeto infectado por VIH, y más particularmente de reducir la senescencia temprana de células CD8+ restringidas a VIH en un sujeto infectado por VIH, administrando a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto como se especifica en las reivindicaciones.

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Un aumento en la actividad telomerasa puede beneficiar a células que no se dividen, así como a células en proliferación, por ejemplo, en afecciones asociadas con susceptibilidad aumentada a muerte celular debido a estrés, tal como isquemia en insuficiencia cardiaca o en ictus (véase, por ejemplo, Oh y Schneider, J Mol Cell Cardiol 34(7):717-24; Mattson, Exp Gerontol. 35(4):489-502). La divulgación, por tanto, proporciona métodos de reducir la muerte celular inducida por estrés o daño al ADN en un sujeto, tal como un sujeto que experimenta afecciones isquémicas en tejido debido a insuficiencia cardiaca o ictus, aumentando la actividad telomerasa en las células del sujeto, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, II o III como se divulga en la sección II anteriormente. Como se ha indicado anteriormente, el método puede incluir la etapa preliminar de diagnosticar en el sujeto la afección indicada.

En otro aspecto, la composición se puede usar para el tratamiento de individuos en los que uno o más tipos celulares son limitantes en ese paciente, y cuya vida se puede extender extendiendo la capacidad de esas células de seguir la replicación o resistir la muerte celular inducida por estrés. Un ejemplo de tal grupo de células es linfocitos presentes en pacientes de síndrome de Down. La divulgación, por tanto, proporciona un método de aumentar la capacidad replicativa y/o longevidad de linfocitos presentes en un paciente con síndrome de Down, aumentando la actividad telomerasa en dichas células del paciente, que comprende administrar a tal paciente una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, II o III como se divulgan en la sección II anteriormente. Las composiciones también se pueden usar para mejorar la resistencia a muerte celular inducida por estrés que se produce durante el envejecimiento normal.

En un aspecto adicional de la divulgación, aumentar la actividad telomerasa es eficaz para fomentar la cicatrización de heridas, quemaduras, abrasiones u otras afecciones agudas o crónicas de la epidermis. La divulgación, por tanto, proporciona un método de tratar una afección aguda o crónica de la epidermis, administrando a un paciente en necesidad de tal tratamiento, preferiblemente por vía tópica al área afectada, una cantidad eficaz de una formulación de un compuesto aislado de fórmula I, II o III como se divulga en la sección II anteriormente.

Como se usa en el presente documento, una “afección aguda o crónica de la epidermis” incluye afecciones agudas tal como lesiones padecidas en traumatismo, quemaduras, abrasiones, incisiones quirúrgicas, sitios de injertos donantes, y lesiones causadas por agentes infecciosos, y afecciones crónicas tal como úlcera venosa crónica, úlcera diabética, úlcera de compresión, úlceras de decúbito, y úlceras o llagas de la superficie mucosa. También se incluyen lesiones de la piel o superficie epitelial causadas por una afección o infección inflamatoria persistente, o por un defecto genético (tal como formación de queloide y anomalías de coagulación). Véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 02/91999.

Los efectos deseables de un aumento en la actividad telomerasa en tal tratamiento incluyen proliferación o migración celular en el sitio de tratamiento, epitelización de la superficie, cierre de una herida si está presente, o restablecimiento de función fisiológica normal. Mediante “epitelización” o “reepitelización” de un sitio de tratamiento se quiere decir un aumento en la densidad de células epiteliales en el sitio como resultado de la terapia aplicada.

El método también se puede usar para aumentar el crecimiento de células injertadas. Los efectos deseables de un aumento en la actividad telomerasa en tal tratamiento incluyen cobertura del sitio de tratamiento, supervivencia de las células injertadas, falta de rechazo inmunitario, cierre de una herida si está presente, o restablecimiento de la función fisiológica normal. Las células injertadas pueden participar en el cierre de una herida ya sea participando directamente en el proceso de cicatrización (por ejemplo, convirtiéndose en parte del tejido cicatrizado), o cubriendo la herida y proporcionando de esta manera un medio que fomenta la cicatrización por células huéspedes.

La divulgación también contempla la manipulación de la piel y la reparación de cualquier defecto percibido en la superficie de la piel para otros fines, tal como mejora estética.

En un aspecto adicional, los métodos y composiciones de la divulgación se pueden usar para aumentar la capacidad replicativa y/o extender la longevidad de células en cultivo, por ejemplo, en terapia celular ex vivo o en la producción de anticuerpos monoclonales, aumentando la actividad telomerasa en las células. Aumentar la actividad telomerasa aumenta la capacidad replicativa de tales células ralentizando la pérdida de repeticiones de los telómeros y/o mejorando la resistencia a muerte celular inducida por estrés durante la proliferación celular.

En el caso de aplicaciones ex vivo, una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I, II o III como se han descrito anteriormente, se añade a células en explantes obtenidas de un sujeto. Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa en las células, aumentando de esta manera la capacidad replicativa y/o la longividad de las células.

Las células en explantes pueden incluir, por ejemplo, células madre, tal como células madre de médula ósea (patente en EE UU No. 6.007.989), células estromales de médula ósea (Simonsen et al., Nat Biotechnol 20(6):592-6, 2002), o células corticosuprarrenales (Thomas et al, Nat Biotechnol 18(1):39-42, 2000). Los estados de enfermedad tal como los indicados en los puntos (a)-(g) anteriormente también se pueden someter a terapia celular ex vivo. Los ejemplos incluyen el uso de células satélite de músculo para el tratamiento de distrofia muscular, osteoblastos para

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tratar osteoporosis, células epiteliales pigmentadas retínales para degeneración macular senil, condrocitos para artrosis, y así sucesivamente.

Por ejemplo, el reconocimiento de que células CD8+ funcionales son limitantes en pacientes de SIDA para controlar la expansión de células CD4+ infectadas permite que se conciba un protocolo terapéutico en el que células CD8+ restringidas a VIH se retiran de un individuo infectado por VIH en una fase temprana, cuando se detecta el SIDA, se almacenen en un banco, y después se vuelvan a introducir en el individuo en una fase posterior, cuando ese individuo ya no tiene las células CD8+ requeridas disponibles. Por tanto, la vida de un individuo se puede extender mediante un protocolo que implica la administración continuada de las células limitantes de ese individuo en puntos de tiempo apropiados. Estos puntos de tiempo apropiados se pueden determinar siguiendo la senescencia de células CD8+, o determinando la longitud de los telómeros en tales células CD8+, como una indicación de cuando esas células se volverán senescentes. Según la divulgación, las células almacenadas se pueden expandir en número en presencia de un agente que ralentiza la pérdida de repeticiones de telómeros, es decir, un compuesto de fórmula I, II o III como se divulga en la sección II anteriormente.

Según esto, la divulgación proporciona métodos de terapia celular ex vivo, que incluyen obtener una población celular de un sujeto, y expandir la población celular ex vivo, en donde la población celular se trata con un compuesto de fórmula I, II o III como se divulga en la sección II anteriormente, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa y aumentar mediante ello la capacidad replicativa y/o la longevidad de la población celular. El método generalmente incluye diagnosticar en un sujeto una afección objeto de tratamiento por terapia celular ex vivo, tales como las indicadas anteriormente.

En una forma de realización adicional, la divulgación proporciona un método de proliferación de células madre, en donde una población de células madre se trata con un compuesto de fórmula I, II o III como se divulga en la sección II anteriormente, en una cantidad eficaz para aumentar la actividad telomerasa y aumentar mediante ello la capacidad replicativa y/o la longevidad de la población celular.

VI. Formulaciones y métodos de administración

La divulgación abarca métodos de preparar composiciones farmacéuticas útiles para aumentar la actividad telomerasa en una célula y/o fomentar la cicatrización. Según esto, un compuesto aislado de fórmula I, II o III como se describe en la sección II se combina con un excipiente farmacéutico, y opcionalmente con otros agentes medicinales, adyuvantes, y similares, que pueden incluir ingredientes activos e inactivos. Las composiciones pueden tomar la forma de formas farmacéuticas sólidas, semisólidas, polvo liofilizado o líquidas, tal como, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, cremas, pomadas, lociones, aerosoles, o similares. Las formulaciones se pueden proporcionar en formas farmacéuticas unitarias adecuadas para la administración sencilla de dosis precisas.

Un compuesto aislado de fórmula I, II o III también se puede formular como un suplemento nutricional o nutracéutico, para la administración oral. Para una formulación nutracéutica, o una formulación farmacéutica oral, los excipientes adecuados incluyen calidades farmacéuticas de soportes tal como manitol, lactosa, glucosa, sacarosa, almidón, celulosa, gelatina, estearato de magnesio, sacarina sódica, y/o carbonato de magnesio. Para uso en formulaciones líquidas orales, la composición se puede preparar como una solución, suspensión, emulsión, o jarabe, suministrándose o bien en forma sólida o líquida adecuada para hidratación en un soporte acuoso tal como, por ejemplo, solución salina acuosa, dextrosa acuosa, glicerol, o etanol, preferiblemente agua o solución salina normal. Si se desea, la composición también puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas tal como agentes humectantes, agentes emulsionantes, o tampones. Un compuesto aislado de fórmula I, II o III también se puede incorporar a formulaciones nutracéuticas existentes, tal como están convencionalmente disponibles, que también pueden incluir un extracto de hierbas, tal como un extracto de Astragalus membrananaceus.

Para uso en cicatrización o tratamiento de otras afecciones agudas o crónicas de la epidermis, un compuesto de fórmula I, II o III se formula para administración tópica. El vehículo para la aplicación tópica puede estar en una de varias formas, por ejemplo, una loción, crema, gel, pomada, barra, espray, o pasta. Estas formas de producto se pueden formular según métodos bien conocidos. Pueden comprender varios tipos de soportes, incluyendo, pero limitados a, soluciones, aerosoles, emulsiones, geles y liposomas. El soporte se puede formular, por ejemplo, como una emulsión que tiene una base de aceite en agua o agua en aceite. Los componentes hidrofóbicos (oleaginosos) adecuados empleados en emulsiones incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, grasas y aceites animales, hidrocarburos sintéticos, y ésteres y alcoholes de los mismos, incluyendo poliésteres, así como aceites de organopolisiloxanos. Tales emulsiones también incluyen un emulsionante y/o tensioactivo, por ejemplo, un tensioactivo no iónico, tal como se conocen bien en la técnica, para dispersar y suspender la fase discontinua en la fase continua.

La formulación tópica típicamente contiene uno o más componentes seleccionados de un agente estructurante, un espesante o agente de gelificación, y un emoliente o lubricante. Los agentes estructurante empleados con frecuencia incluyen alcoholes de cadena larga, tal como alcohol estearílico, y éteres o ésteres de glicerilo y éteres o ésteres de oligo(óxido de etileno) de los mismos. Los espesantes y agentes gelificantes incluyen, por ejemplo,

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polímeros de ácido acrílico o metacrílico y ésteres de los mismos, poliacrilamidas, y espesantes naturales tal como agar, carragenano, gelatina y goma guar. Los ejemplos de emolientes incluyen ésteres triglicéridos, ésteres de ácidos grasos y amidas, ceras, tal como cera de abeja, espermaceti o cera carnauba, fosfolípidos tal como lecitina, y esteroles y ésteres de ácidos grasos de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir además otros componentes como se conocen en la técnica, por ejemplo, astringentes, fragancias, pigmentos, agentes potenciadores de penetración de la piel, protectores solares, etc.

Las composiciones farmacéuticas también se pueden formular para la administración por vía parenteral, transdérmica, o por inhalación. Una composición inyectable para administración parenteral típicamente contiene el compuesto activo en una solución IV adecuada, tal como solución salina fisiológica estéril. La composición también se puede formular como una suspensión en un lípido o fosfolípido, en una suspensión liposómica, o en una emulsión acuosa.

Para la administración por inhalación, el compuesto activo se formula como partículas de aerosol sólidas o líquidas. La formulación también incluye un propelente y/o un dispersante, tal como lactosa, para facilitar la formación de aerosol. Para la administración transdérmica, el compuesto activo preferiblemente se incluye en un parche transdérmico, que permite una administración lenta del compuesto a una región de la piel seleccionada, y que también puede incluir sustancias potenciadoras de penetración, tal como alcoholes alifáticos o glicerol.

Los métodos para preparar tales formulaciones son conocidos o serán aparentes para los expertos en la materia; por ejemplo, véase, Remington's Pharmaceutical Sciences (19a Ed., Williams & Wilkins, 1995). La composición que se va a administrar contendrá una cantidad del compuesto seleccionado en una cantidad farmacéuticamente segura y eficaz para aumentar la actividad telomerasa en las células o tejido diana.

Preferiblemente, la composición farmacéutica o nutracéutica contiene al menos el 0,1% (p/v) de un compuesto de fórmula I, II o III como se ha descrito anteriormente, preferiblemente mayor del 0,1%, hasta aproximadamente el 10%, preferiblemente hasta aproximadamente el 5%, y más preferiblemente hasta aproximadamente el 1% (p/v). La elección de una concentración adecuada depende de factores tales como la dosis deseada, frecuencia y método de administración del agente activo.

Para el tratamiento de un sujeto o paciente, tal como un mamífero o un paciente humano, las dosis se determinan basadas en factores tales como el peso y salud global del sujeto, la afección tratada, gravedad de los síntomas, etc. Se determinan dosis y concentraciones para producir el beneficio deseado al tiempo que se evita cualquier efecto secundario indeseado. Las dosis típicas de los compuestos objeto están en el intervalo desde aproximadamente 0,5 a 500 mg/día para un paciente humano, preferiblemente aproximadamente 1-100 mg/día. Por ejemplo, pautas de dosis mayores incluyen, por ejemplo, 50-100, 75-100, o 50-75 mg/día, y pautas de dosis menores incluyen, por ejemplo, 1-50, 25-50 o 1-25 mg/día. En formas de realización específicas, por ejemplo, el compuesto designado en el presente documento como 2 (cicloastragenol) se administra a un nivel de al menos 1 mg/día, preferiblemente al menos 5 mg/día; o el compuesto designado en el presente documento como 1 (astragalósido IV) se administra a un nivel de al menos 50 mg/día, preferiblemente al menos 100 mg/día.

Estudios en apoyo de la invención indican que los compuestos de fórmula I-III tienen excelente biodisponibilidad y baja toxicidad. Por ejemplo, un compuesto representativo, cicloastragenol (2), fue negativo para potencial mutación bacteriana inversa en la prueba de Ames, empleando cepas controladoras de Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 y cepa controladora de E. coli WP2 uvrA, a niveles de hasta 5000 pg/placa. Se toleró bien sistémicamente en ratas Sprague-Dawley, después de inyecciones intravenosas únicas de hasta 10 mg/kg. No se observaron cambios dependientes de dosis significativos para machos o hembras en comportamiento (comer, beber), peso bruto, pesos de órganos (corazón, pulmón, hígado, riñones, glándulas suprarrenales y bazo), hematología o bioquímica clínica.

Ejemplos

(Los compuestos 1-4, 6 y 7 son según la invención)

Ejemplo 1. Conversión de astragalósido IV (1) a cicloastragenol (2)

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Se añadió a astragalósido IV (1) (5,00 g, mmol) “HCl-MeOH 10” (TCI America) (500 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. La mezcla de reacción se concentró a aproximadamente la mitad del volumen a presión reducida a 20°C (sin calentar). La mezcla se repartió en bicarbonato de sodio acuoso y acetato de etilo. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo otra vez. Las fases orgánicas se combinaron, lavaron con cloruro de sodio saturado, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (cloroformo/metanol 20:1 ~ 14:1). Para sustituir el solvente residual con etanol, el material purificado se disolvió en etanol y el solvente se eliminó a presión reducida para dar 2 (2,1 g, 64%).

1H RMN (CDCla) 8 (ppm) 0,34 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,48 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,92 (s, 3H), 0,93 (s, 3H), 1,0-1,8 (m, 13H), 1,11 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,22 (s, 6H), 1,27 (s, 3H), 1,9-2,0 (m, 4H), 2,30 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 2,54 (q, J= 11,8 Hz, 1H), 3,27 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,72 (t, J= 7,4 Hz, 1H), 4,65 (q, J= 7,4 Hz, 1H). ESI-MS m/z Positivo 491 (M+H)+, Negativo 549 (M+AcO)-, TLC (Merck, Kieselgel 60) Rf = 0,33 (cloroformo/metanol 6:1)

Ejemplo 2. Preparación de los compuestos 5, 6 y 7 a partir de astragalósido IV (1): Eliminación de glucósidos de astragalósido IV (1), con y sin reorganización concomitante

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A una solución de astragalósido IV (1, 1,00 g, 1,28 mmol) en metanol (80 ml) se añadió ácido sulfúrico (0,4 ml), y la mezcla se sometió a reflujo durante 1,5 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se echó en acetato de etilo y agua. La fase orgánica se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo/metanol 20:1 ~ 10:1 ~ 7:1) para dar el producto reorganizado 5 (24 mg, 4,0%), monoglucósidos 6 (172 mg, 21%) y 7 (29 mg, 3,6%) y la aglucona, cicloastragenol (2) (326 mg, 52%).

GRN140724: ESI-MS m/z 623 (M+H)+ C35H58O9 = 622 GRN140725: ESI-MS m/z 653 (M+H)+ C36H60O10 = 652 GRN140726: ESI-MS m/z 473 (M+H)+ C30H48O4 = 472.

1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 0,72, 0,85, 0,95, 1,05, 1,11, 1,17, 1,18, y 1,25 (s, 3H cada uno), 0,9-2,1 (m, 13H), 2,20 (d, J= 7,4 Hz, 1H), 2,4-2,6 (m, 2H), 3,42 (m, 1H), 3,70 (dd, J= 7,8, 5,9 Hz, 1H), 4,63 (q, J= 7,4 Hz, 1H), 5,45 (br s, 1H), 5,57 (br s, 1H).

Ejemplo 3. Acetilación de 1; formación de 16-cetona 10:

Los compuestos 9 y 10, a continuación, se obtuvieron según el método de Kitagawa 1983b, citado anteriormente. Brevemente, la acetilación de astragalósido IV (1) proporcionó 9, junto con una cantidad menor del equivalente 16- acetato. La oxidación con clorocromato de piridinio de 9 dio 10.

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Ejemplo 4. Preparación de 4 (véase la figura 1) por desacilación de 10

5 A una solución de 10, anteriormente (10 mg, 0,0093 mmol) en metanol se añadió brorohidruro de sodio (10 mg, 0,26 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se diluyó con cloroformo (3 ml) y se sometió directamente a cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo/metanol 3:1) para dar 4 (8,0 mg, cuant.). ESI-MS m/z 783 (M+H)+ C41H66O14 = 782.

10 Ejemplo 5. Formación de triona 11 de cicloastragenol 2

El derivado 3,6,16-triona 11 de cicloastragenol se obtuvo por oxidación con CrO3 de 2, según el método de Kitagawa et al., Chem. Pharm. Bull. 31(2):689-697 (1983a).

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Ejemplo 6. Acilación del grupo hidroxilo 3 o 6 de cicloastragenol (2)

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A una solución de cicloastragenol (2) (50 mg, 0,10 mmol) en diclorometano (5 ml) se añadieron trietilamina (0,030 ml, 0,22 mmol) y cloruro de pivaloilo (0,014 ml, 0,12 mmol) y la mezcla se agitó a 0°C durante la noche. La mezcla se sometió directamente a cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo 1:1 ~ 1:2) para dar 12 (17 mg, 30%) y 13 (3,3 mg, 2,9%).

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12: ESI-MS m/z 575 (M+H)+ C35H5aO6= 574. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 8 (ppm) 0,32 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,49 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,92 (s, 3H), 0,95 (s, 3H), 1,07 (s, 3H), 1,1-2,0 (m, 17H), 1,15 (s, 9H), 1,18 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 1,34 (s, 6H), 2,19 (dd, J = 13,7, 9,8 Hz, 1H), 2,36 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 3,27 (m, 1H), 3,51 (td, J= 9,4, 3,5 Hz, 1H), 3,71 (t, J= 7,4 Hz, 1H), 5,32 (td, J= 7,8, 4,7 Hz, 1H).

30 13: ESI-MS m/z 575 (M+H)+ C35H5aO6= 574. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 8 (ppm) 0,35 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,51 (d, J=

4,3 Hz, 1H), 0,92 (s, 3H), 1,0-2,0 (m, 17H), 1,03 (s, 3H), 1,09 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 1,17 (s, 9H), 1,21 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 2,29 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 2,53 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,73 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 4,50 (dd, J= 10,9, 4,3 Hz, 1H), 4,65 (m, 1H).

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Ejemplo 7A. Acetilación de los hidroxilos secundarios de cicloastragenol (2)

Esta reacción se llevó a cabo según el método de Kitagawa 1983a, citado anteriormente. Brevemente, la acetilación con anhídrido acético/piridina dio una mezcla de 14 (producto principal) y 15 (producto minoritario).

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Ejemplo 7B. Metilación de 3.6-diacetil cicloastragenol (14), con retención de grupos acetilo

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A una solución de 14 (30 mg. 0.052 mmol) en dimetilformamida (3 ml) se añadieron yodometano (0.75 ml. 12 mmol) e hidruro de sodio (dispersión en aceite al 60%. 40 mg. 1.0 mmol) a 0°C en nitrógeno. y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió agua. y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo 4:1) para dar el compuesto 16 (29 mg. 92%).

ESI-MS m/z 603 (M+H)+ C36H5sO7= 602. 1H RMN (400 MHz. CDCla) 8 (ppm) 0.33 (d. J= 4.7 Hz. 1H). 0.56 (d. J= 4.7 Hz. 1H). 0.82 (s. 3H). 0.89 (s. 3H). 0.96 (s. 3H). 1.06 (s. 3H). 1.1-1.9 (m. 17H). 1.13 (s. 3H). 1.19 (s. 3H). 1.23 (s. 3H). 1.97 (s. 3H). 2.02 (s. 3H). 2.3-2.4 (m. 2H). 3.05 (s. 3H). 3.23 (s. 3H). 3.81 (dd. J= 9.0. 6.6 Hz. 1H). 3.95 (td. J= 7.8.

5.1 Hz. 1H). 4.54 (dd. J= 10.9. 4.7 Hz. 1H). 4.70 (td. J= 9.4. 4.3 Hz. 1H).

Ejemplo 7C. Preparación de 16.25-dimetoxi cicloastragenol. 17: eliminación de grupos acetilo de 16

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Una mezcla de 16 (28 mg. 0.046 mmol) y metóxido de sodio (0.5 mol/l en metanol. 6 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. Se añadió agua. y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con

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agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo 2:3) para dar el compuesto dimetoxi diol 17 (23 mg, 96%)

ESI-MS m/z 519 (M+H)+ C32H54O5 = 518. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 0,32 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,47 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,90 (s, 3H), 0,93 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 1,11,9 (m, 17H), 1,13 (s, 3H), 1,20 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 2,3-2,4 (m, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,23 (s, 3H), 3,27 (m, 1H), 3,51 (td, J= 9,4, 3,5 Hz, 1H), 3,81 (dd, J= 9,4, 6,6 Hz, 1H), 3,96 (td, J= 7,8, 5,5 Hz, 1H).

Ejemplo 7D. Alquilación de 3,6-diacetil cicloastragenol (14), con retención de grupos acetilo

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A una solución de 14 (109 mg, 0,109 mmol) en diclorometano (10 ml) se añadieron diisopropiletilamina (1,0 ml) y clorometil metil éter (0,5 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo 3:1) para dar el compuesto 18 (114 mg, 90%).

1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 0,31 (d, J= 5,1 Hz, 1H), 0,56 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,80 (s, 3H), 0,88 (s, 3H), 0,96 (s, 3H), 1,1-2,0 (m, 18H), 1,15 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 1,34 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,28 (d, J=

8,2 Hz, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,33 (s, 3H), 3,81 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 4,17 (m, 1H), 4,5-4,6 (m, 3H), 4,7-4,8 (m, 3H).

Ejemplo 7E. Eliminación de los grupos acetilo de 18

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Una mezcla de 18, anterior (derivado 3,6-diacetil-16,25-di(metoximetil)éter de cicloastragenol) (102 mg, 0,150 mmol) y metóxido de sodio (0,5 mol/l en metanol, 10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas. Se añadió agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo 1:1) para dar el compuesto di(metoximetil)éter 19 (80 mg, 92%).

ESI-MS m/z 579 (M+H)+ C34H58O7 = 578. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 0,32 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,48 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,89 (s, 3H), 0,93 (s, 3H), 1,1-2,0 (m, 18H), 1,15 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,29 (s, 3H), 1,34 (s, 3H), 2,29 (d, J= 8,6 Hz, 1H), 3,28 (m, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,33 (s, 3H), 3,53 (m, 1H), 3,81 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 4,18 (td, J= 7,8, 5,5 Hz, 1H), 4,50 (d, J= 6,6 Hz, 1H), 4,54 (d, J= 6,2 Hz, 1H), 4,71 (d, J= 7,0 Hz, 1H), 4,76 (d, J= 7,4 Hz, 1H).

Ejemplo 8. Alquilación de triacetil cicloastragenol 15, seguido por eliminación de grupos acetilo

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A una solución de 15 (30 mg, 0,049 mmol) en dimetilformamida (3 ml) se añadieron yodometano (0,75 ml, 12 mmol) e hidruro de sodio (dispersión en aceite al 60%, 40 mg, 1,0 mmol) a 0°C en nitrógeno, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida.

Al residuo se añadió metóxido de sodio en metanol (0,5 mol/l, 6 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió ácido clorhídrico al 10%, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo 1:2) para dar 20 (23 mg, 93%).

ESI-MS m/z 505 (M+H)+ C31H52O5 = 504. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 0,33 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,48 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,8-2,1 (m, 17H), 0,91 (s, 3H), 0,93 (s, 3H), 1,04 (s, 3H), 1,14 (s, 3H), 1,20 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 2,28 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 2,60 (q, J= 10,9 Hz, 1H), 3,17 (s, 3H), 3,27 (m, 1H), 3,51 (td, J= 9,8, 3,5 Hz, 1H), 3,72 (dd, J= 9,0, 5,5 Hz, 1H), 4,62 (m, 1H).

Ejemplo 9A. Alquilación de los hidroxilos libres de cicloastragenol monoglucósido 6

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A una solución de 6 (50 mg, 0,077 mmol) en dimetilformamida (4 ml) se añadieron yodometano (1,0 ml, 16 mmol) e hidruro de sodio (dispersión en aceite al 60%, 60 mg, 1,5 mmol) a 0°C en nitrógeno, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo 3:1) para dar el compuesto permetoxi 2l (33 mg, 57%).

ESI-MS m/z 751 (M+H)+ C43H74O10 = 750. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 0,21 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,47 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,8-2,0 (m, 17H), 0,87 (s, 3H), 0,89 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 2,3-2,4 (m, 2H), 2,67 (dd, J= 11,0, 4,1 Hz, 1H), 2,92 (t, J= 8,2 Hz, 1H), 3,06 (s, 3H), 3,1-3,6 (m, 6H), 3,22 (s, 3H), 3,32 (s, 3H), 3,35 (s, 3H), 3,48 (s, 3H), 3,49 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 3,80 (dd, J= 9,0, 6,6 Hz, 1H), 3,94 (m, 1H), 4,24 (d, J= 7,4 Hz, 1H).

Ejemplo 9B. Preparación de 3,16,25-trimetoxi astragenol, 22: eliminación del glucósido del compuesto permetoxi 21, con reorganización concomitante

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A una solución de 21 (30 mg, 0,040 mg) en metanol (10 ml) se añadió ácido sulfúrico (0,2 ml) y la mezcla se sometió a reflujo durante 10 horas. Se añadió agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo 4:1) para dar 22 (3,6 mg, 17%).

ESI-MS m/z 533 (M+H)+ C3aH56O5= 532. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 0,73 (s, 3H), 0,8-2,0 (m, 18H), 0,85 (s, 3H), 1,00 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 1,14 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), 2,3-2,4 (m, 2H), 2,58 (dd, J= 10,9, 3,9 Hz, 1H), 3,09 (s, 3H), 3,24 (s, 3H), 3,34 (s, 3H), 3,80 (dd, J= 9,4, 6,6 Hz, 1H), 3,98 (m, 1H), 5,25 (br d, = 5,5 Hz, 1H).

Ejemplo 10A. Alquilación de los hidroxilos libres de cicloastagenol monoglucósido 7

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El compuesto 23 (18 mg, 53%) se obtuvo a partir de 7 (30 mg) según el procedimiento usado para la preparación del compuesto 21, anteriormente.

ESI-MS m/z 707 (M+H)+ C41H70O9 = 706. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 0,20 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,44 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,8-1,9 (m, 17H), 0,90 (s, 3H), 0,93 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,11 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,18 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 2,3-2,4 (m, 2H), 2,9-3,6 (m, 6H), 3,09 (s, 3H), 3,20 (s, 3H), 3,22 (s, 3H), 3,42 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 3,80 (dd, J= 9,0, 6,6 Hz, 1H), 3,9-4,0 (m, 2H), 4,21 (d, J= 7,4 Hz, 1H).

Ejemplo 10B. Preparación de 6,16,25-trimetoxi astragenol, 24: eliminación del glucósido del compuesto permetoxi 23, con reorganización concomitante

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El compuesto 24 (7,1 mg, 56%) se obtuvo a partir de 23 (17 mg) según el procedimiento usado para la preparación del compuesto 22, anteriormente.

ESI-MS m/z 533 (M+H)+ C33H56O5 = 532. 1H RMN (400 MHz, CDCla) 8 (ppm) 0,74 (s, 3H), 0,8-2,4 (m, 18H), 0,85 (s, 3H), 0,92 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 1,14 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 3,10 (s, 3H), 3,18 (m, 1H), 3,23 (s, 3H), 3,34 (s, 3H), 3,53 (m, 1H), 3,80 (dd, J= 9,4, 6,6 Hz, 1H), 3,97 (m, 1H), 5,24 (d, J= 5,5 Hz, 1H).

Ejemplo 11. Preparación de 3,6-dimetoxi cicloastragenol, 25: metilación del compuesto 16,25-d¡(metoximet¡l)éter 19, con eliminación de los grupos di(metoximet¡l)éter

imagen23

A una solución de 19 (30 mg, 0,052 mmol) en dimetilformamida (3 ml) se añadieron yodometano (0,75 ml, 12 mmol) e hidruro de sodio (dispersión en aceite al 60%, 40 mg, 1,0 mmol) a 0°C en nitrógeno, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida.

A este residuo se añadieron tetrahidrofurano (5 ml) y ácido clorhídrico al 10% (1 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche, después se sometió a reflujo durante 1 hora. Se añadió agua, y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó a presión reducida, y el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo 3:1 ~ 1:1) para dar 25 (13 mg, 48%) y una cantidad menor (7,4 mg, 25%) del compuesto 3,6-dimetoxi-16-(metoximetil)éter 26.

25: ESI-MS m/z 563 (M+H)+ C34H58O6 = 562. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 0,19 (d, J= 4,7 Hz, 1H), 0,45 (J= 4,3 Hz, 1H), 0,8-2,3 (m, 18H), 0,86 (s, 3H), 0,92 (s, 3H), 1,05 (s, 3H), 1,07 (s, 3H), 1,20 (s, 3H), 1,24 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 2,41 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 2,70 (dd, J= 11,1, 4,5 Hz, 1H), 2,90 (m, 1H), 3,19 (s, 3H), 3,326 (s, 3H), 3,330 (s, 3H), 3,71 (t, J= 7,4 Hz, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,53 (d, J= 6,2 Hz, 1H), 4,59 (d, J = 6,2 Hz, 1H).

26: ESI-MS m/z 519 (M+H)+ C32H54O5 = 518. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm) 0,21 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 0,45 (d, J=

4,3 Hz, 1H), 0,8-2,0 (m, 17H), 0,86 (s, 3H), 0,93 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 1,20 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 2,30 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 2,54 (q, J= 10,2 Hz, 1H), 2,69 (dd, J= 11,3, 4,3 Hz, 1H), 2,89 (td, J= 8,2, 4,3 Hz, 1H), 3,19 (s, 3H), 3,32 (s, 3H), 3,72 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 4,66 (m, 1H).

Claims

REIVINDICACIONES

1.

5

Un compuesto aislado de fórmula I:

imagen1

donde:

X1 es hidroxi o p-D-xilopiranósido,

10 X2 es hidroxi o p-D-glucopiranósido, y

X3 es hidroxi;

OR1 es hidroxi;

y

R2 forma, junto con el carbono 9, un anillo ciclopropilo fusionado, y representa un enlace sencillo entre 15 los carbonos 9 y 11,

en una cantidad eficaz para uso en tratar una infección por VIH.
2. Astragalósido IV 16-ona en una cantidad eficaz para uso en tratar una infección por VIH.

20 3. Una composición farmacéutica que comprende, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, un compuesto

seleccionado de astragalósido IV 16-ona, cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido y cicloastragenol 3-p-D- xilopiranósido.
4.

25

Una composición farmacéutica que comprende una formulación tópica de un compuesto aislado seleccionado del cicloastragenol, astragenol, astragalósido IV 16-ona, cicloastragenol 6-p-D-glucopiranósido y cicloastragenol 3-p-D-xilopiranósido.
5.

30

La composición de la reivindicación 4, en donde dicho compuesto está presente en dicha formulación a una concentración de al menos el 0,1% (p/v).