TWI239837B

TWI239837B - Methods for identifying compounds for inhibition of neoplastic lesions, and pharmaceutical compositions containing such compounds

Info

Publication number: TWI239837B
Application number: TW088117817A
Authority: TW
Inventors: Lui Li; Zhu Bing; Li Han; Joseph W Thompson; Rifat Pamukcu
Original assignee: Cell Pathways Inc
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2005-09-21
Also published as: EP1161943A3; ES2174573T3; NO994995D0; TR199902578A2; IL132366A0; DE69901082T2; CN100389829C; TR199902578A3; AU5401099A; NO20062682L; JP2000186047A; EP0997145A1; CN1255379A; EP0997145B1; AU770308B2; NO994995L; CA2284853A1; EP1161943A2; DK0997145T3; ATE214920T1

Description

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發明背景本發明關於以一種或多種形式之磷二酯酶型2 ('PDE2”）以及磷二酯酶型5( «pDE5，，）及^或蛋白質激酶G來確定琢等有用於治療及預防哺乳動物中前癌性及癌性病變之化合物之用途，及含有彼等化合物之醫藥組合物，以及用該等化合物處理贅疣之治療法。目前，非-手術性癌症治療涉及，當癌症發展至化學療法/激素療法之治療助益重要性超過其非常嚴重的副作用後，對病患投藥一或多種高毒性化學治療劑或激素療法。此等副作用爲任何癌症學者所熟知，且隨著藥劑之不同而有差異。然而，標準化學療法代表性地僅用於短期治療，往往在治療結束後改換化學療法，以免患者不勝藥劑之副作用。因此，基於危機-助益間之協調，當患者呈現癌症前病徵時，代表性地預先將副作用排除而開始進行化學療法，或於已消除明顯癌症後而欲防止其再發生之慢性基礙上’持績進行化學療法或激素療法。約從十年前開始，於非預期來源出現了一線希望··非類固醇抗炎藥物（“NSAIDs”）。這時癌症及前期癌的研究如雨後春筍般地發表，敘述贅疣組織中過度表現分子之各種的生化途徑’從而導致接踵而至的一組組研究，是否有專一性過度表現分子負責於該疾病，以及是否若該等過度表現遭抑制時’贅疲可否經緩解。例如，於家族性腺瘤息肉病 (“FAP”）中，韋德爾於1983(章德爾，W.R.等人，“用於結 %息肉病之舒林酸”，外科腫瘤學期刊，24:83-87，1983)，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---—--— —訂-------— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 五、發明說明（2 ) A靖先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 假設前列腺素於該息肉中過度表現時，非類固醇抗炎性藥物（“NSAIDs”）應可緩和該等情況，因爲NSAIDs可抑制前列腺素合成酶（PGE2)的活性。因此，章德爾將非類固醇抗炎性藥物（“NSAIDs”），舒林酸（一種PGE^9抑制劑），給予許多FAP患者服用。章德爾發現，在該等治療下息肉消退並且不再復發。PGE2的抑制係源自於環氧化酶（(^幻經 NSAIDs的抑制。章德爾的成功在於舒林酸的使用，以及幾乎可確定PGEVCOX間的關係在於，此二者於致癌作用中其他生化標乾__ p G E 2和C 〇 X —的角色，而此等觀點可經隨後的文獻所強化。給予遭受贅疣患者的一線希望在於確定舒林酸比習用的化學治療或激素產生較小的副作用，並開啓了治療該等疾病初期癌症的可能性，且相較於習用的化學治療時，其可有較長的生命期。然而，該等的希望必須經得起公開的問題：雖然章德爾僅是將舒林酸給予帶有 FAP前期癌狀況之患者，但是可否將一種如舒林酸的化合物用來治療症狀明顯的癌。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製該希望亦須經得起NSAIDs自身的一組副作用。舒林酸和其他的NSAIDS —樣，長期給藥時會加重消化道中pge2 所扮演的保護性角色。此外，長期服用時，彼等會產生副作用’包括腎臟以及干擾正常血液的凝塊。很不幸地，韋德爾經歷到部分服用舒林酸的患者，因爲副作用之故而停止服藥的遭遇（參見韋德爾，W.R·等人，“用於結腸息肉病之舒林酸”’美國外科期刊，157:175-79，1989)，大部分的患者很可能回頭尋求額外的手術介入，以控制息肉的形 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1239837 A7 B7 五、發明說明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 成。因此，就贅疲患者而言，該等藥物不適合實際上的長期治療，如對FAP而言，散發性息肉或前列腺切除後 PSAs(該等人PSAs的升高，顯示疾病復發，但尚未出現症狀明顯、可見的癌症）升高的人。此等副作用並非限定於，將NSAIDs使用在需要長期服藥之其他贅疣適應症上者。最近，一些人建議使用C0X_2專一性NSAIDs如celecoxib。然而，該等藥物對腎和其他的副作用認爲是出在於，以該等化合物用於長期抗贅疲適應症時之劑量及療程。此外，最近發表的數據顯示，需要非常高劑量之藥劑，如 celecoxib，才可對預先明定結腸區域中之結腸息肉達成邊際效應。也許對結腸癌更顯著的治療在於，經報導，特定的結腸贅疣（如HCT-116)並不表現C0X-2，且該等抑制劑並不足以對抗該贅疣（參見，沈等人，“選擇性抑制環氧化酶-2對人類結腸癌細胞生長的抑制，，，臨床研究期刊， 99(9):2254-9 ， 1997) 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製最近之發現已使科學家偏離COX/PGE2標的，因爲該等標的對於在慢性基礎上成功治療贅疣新生患者而言，可能非主要目標（或可能係次要標的）。帕幕古等人（於美國專利案5,401，774中）揭示，業經報導砜基化合物（其實際上缺乏PGE2及COX抑制作用）意外地抑制各種贅疲細胞，包括結腸息肉細胞之生長。此等職基衍生物已於大鼠結腸癌發生模式中證實其功效，且其中一變異體（現稱之爲依席舒林）已於對FAP患者之臨床試驗中證實具有功效，且甚至更顯著地經下文所示之受控臨床研究，顯現其對於症 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1239837 A7 B7 五、發明說明（4 狀明顯癌症：前列腺癌本身之功效。而且，最近之研究以有力地確定，COXI及/或COXII實際上並不表現於所^贊疲中，使得以COXI或COXII特異性抑制劑可廣泛地，於产療上有用地用於贅疣治療上之希望幻滅（參見，林姆= 人，”舒林酸衍生物抑制人類前列腺癌細胞系生長及謗導細胞凋亡”，生化藥理學，卷58,第1〇97_1107頁（1999) 出刊中）。因此，類似其他許多於贅疣中過度表現之蛋白質， PGEs/COX過度表現可能並非某些贅疣之成因，亦非彼等造成之結果。但是此等發現之組合已產生對於，諸如依席舒林等化合物（其具有一定範圍對抗表現C〇x及非表現 COX之贅疣）究竟如何作用的疑問。此類化合物對贅疲細胞之作用爲何？皮亞薩等人（於美國專利申請案〇8/866,〇27及 09/046，739 )發現，化合物（例如依席舒林）抑制環狀· 特異性GMP磷酸二醋酶（例如PDE5 )，及此類化合物可使用该酵素進行篩檢，其可能促使發現仍有其他可經研發，且調製成抗-贅疣醫藥組合物之化合物。此類醫藥組合物可具高度抗-贅疣性，且可尤其不具有與習知化學治療劑相關連之副作用，或甚至不具有對C〇x或pgE2抑制之副作用（若吾人欲避免此類副作用）。此外，抗-贊疣性cGMP-特異性PDE-抑制化合物可於贅疢細胞中，而不會於正常細胞中’謗導細胞凋亡（一種程序性細胞死亡或自殺）。因此，此類新化合物已成爲較佳新一類抗贅疣劑， -7- ^紙張尺度適用中國國家標準(C1S^)A4規格（210 X 297公f ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------1丨tr^·--------線赢經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 ) 其已知稱爲選擇性細胞凋亡性抗-贅疣藥劑（"SAANDs”）。於是，SAANDs已挑戰了數種習知思考方式：（1)抗-贅疣化合物不可能在不亦殺死正常細胞下仍然有效；（2) COXfs 造成贅疣新生；及（3)以NSAIDs防止結腸贅疣新生，係類似地經由抑制一或二類C〇x所介導。然而，以下所呈現之新穎研究已顯示，並非所有展現傳統PDE5抑制作用之化合物，皆會於贅疲細胞中謗導細胞调亡。例如，已熟知之PDE5抑制劑（扎普司特及息丹那非）各別地不會謗發細胞凋亡，或甚至於吾等之實驗中不抑制贅疲細胞生長。然而，因爲前-細胞凋亡性pDE5抑制劑會選擇性（亦即，於贅疣細胞中而不會於正常細胞中）謗導細胞凋亡，且可不在實質上造成C〇x抑制下完成，故可使用PDE5做爲供篩選可希望抗_贅疣化合物之工具並無問題。然而，仍可希望一種用以發現具抗_贅疣、前·細胞凋亡性但爲安全之化合物的PDE5篩選改良方法，以使能調製得用於治療贅疣新生，包括前_癌症與癌症之治療用途的新穎醫藥組合物。於研究爲何某些PDE5抑制劑各別地謗導細胞凋亡，而其餘則否之研究過程中，吾等發現一種環狀QMp_特異性 =酸二酯酶活性形式，其先前未經描述。此種新穎磷酸二酯酶活性先前並未經確定。無欲侷限於特定理論，無等相信此新穎PDE活性可能爲實質上缺乏eAMp_水解活性，亦 -8 _ 本紙張尺度適國國家標準（CNS)A4規格咖X挪公釐）—--—- (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)

1239837 A7 β --—------- 五、發明說明（6 ) 即，其爲cGMP-特異性之PDE2新穎構形。血刑之並非CGMP-特異性（其亦水解cAMP)，於贊疲:胞中亦發現典型之PDE2。此新穎PDE及PDE2可用於篩選具有可希望抗贅疲特性之醫藥用化合物。基本上，於督疾細胞中當PDE5與PDE2活性（以其新穎及習知構形存在時）受抗-贅疣性PDE5-抑制化合物抑制時，結果造成細胞凋亡。當僅有PDE5受抑制（而數種PDE2形式則否）時，細胞凋: 即不會發生。以其最廣義層面，此新穎PDE構形具有以下列爲特徵之活性： (a) cGMP特異性超越CAMP ; (b) 於cGMP受質存在下具有正協同動力學特性； (c) 針對cGMP具有次微莫耳之親和性；及 (d) 對與經純化cGMP-依賴性蛋白質激酶進行之培育不敏感。此新穎PDE之其他特徵包括：其已減低對由扎普司特及 E4021所引起抑制作用之敏感性，其可藉由陰離子_交換層析術而與典型PDE5活性分離，其不受鈣/鈣調蛋白活化，且其對哈利普藍、長春西汀及啕嗓利旦不敏感。本發明之另一具體實施例涉及，評估一化合物是否於贅疣細胞中造成cGMP-依賴性蛋白質激酶g ("PKG”）活性增加，及/或β-連環蛋白減少。已發現，SAANDs之不預期特徵包括，於暴露於SAAND之細胞中PKG活性上升及β-連環蛋白減少。吾等相信該項PKG活性升高，至少有一部份係 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公复） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --^^裝--------11^---------線矣經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) 由於因SAAND對適當PDEs之抑制作用，造成cGMP增加所致（如上所述）。 SAAND之其他特徵爲（1)如<94專利案中所報導之PDE5 抑制作用；（2)對新穎cGMP-特異性PDE構形之抑制作用； (3)對PDE2之抑制作用；（4)彼等於贅疣細胞中增加細胞内 cGMP之事實；及（5)彼等於某些類型贅疣細胞中減低cAMP 之事實。因此，本發明新穎方法之一項具體實施例爲，評估一化合物是否於贅疣細胞中造成PKG活性增高，及該化合物是否抑制PDE5。本發明新穎篩檢方法之另一項具體實施例爲，評估一化合物是否於贅疲細胞中造成PKG活性增高，及該化合物是否抑制如上所述之新穎cGMP-特異性PDE及 /或PDE2。又第三項具體實施例爲，評估一化合物是否於贅疣細胞中造成PKG活性增高，及該化合物是否於贅疣細胞中造成cGMP濃度升高，及/或造成cAMP濃度減低。經此類方式所成功篩選得之化合物具有作爲SAANDs之應用用途。尤其，本發明關於用以對化合物篩檢其用於安全地治療及預防贅疲新生，特別是前-癌症性病害之能力的新穎活 #分及活緵汐方法。特別地，本發明爲供篩選出可用於治療及預防贅疣新生，包括前癌症性病害之化合物的方法。經如此鑑定之化合物可具有最小因COX抑制，及其他與習知化學治療劑相關連之非特異性交互作用所造成的副作用。所興趣之化合物可藉由，將如上所述之新穎PDE暴露 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

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1239837 五、發明說明（8 ) 於琢化合物而進行處理，而若一化合物可抑制此新穎 E則再進一步對该化合物進行評估（例如，活禮#或、&冷動物測4模式或試驗）其抗_贅疲新生性質。口此，本發明之一層面涉及，用以鑀定可有效治療贅疲新生义化合物的篩檢/篩選方法，其包括確定該化合物對此新穎PDE及/或PDE2之抑制作用，及其對c〇x之抑制作用。較佳地，本發明之篩檢及篩選方法進一步包括測定該化合物是否於活鐾分或潑鑀汐抑制腫瘤細胞生長。藉由以此方式篩選化合物，可較過去更快速且更精確地鑑定得用於治療贅疣新生之可能有助益及改善之化合物，以供研發醫藥組合物及於醫療上治療贅疣新生。其他助益將由以下之詳細描述而顯明。本發明亦包括含有此等化合物之醫藥組合物，以及涉及此等化合物之治療方法。圖式之簡要敘述圖1爲得自SW480贅疣細胞之cGMP磷酸二酯酶，以自 DEAE-Trisacryl Μ管柱溶析液進行分析時所呈現之c(JMp 活性圖。圖2爲得自S W480贅疲細胞之重新加樣cgmp磷酸二妒酶，以自DEAE-Trisacryl Μ管柱溶析液進行分析時所呈現之cGMP活性圖。圖3爲本發明新穎PDE之動力學特性圖。圖4説明舒林酸硫化物衍生物或舒林酸職衍生物（例士依席舒林）對經純化環加氧酶活性之影響。 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） C請先間讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 五、發明說明（9 ) 圖5説明化合物B及E對COX抑制作用之影響。圖6説明舒林酸硫化物及依席舒林對自經培養腫瘤細胞所純化得PDE4及PDE5之影響。圖7説明舒林酸硫化物對HT-29細胞中環狀核驻酸濃度之影響。圖8説明化合物B之磷酸二酯酶抑制活性。圖9説明化合物E之磷酸二酯酶抑制活性。圖10説明舒林酸硫化物及依席舒林對HT-29細胞之細胞凋亡及細胞壞死的影響。圖11説明當藉由DN A斷裂進行測定時，舒林酸硫化物及依席舒林對HT·29細胞生長抑制及細胞凋亡謗導之影響。圖12説明化合物E之細胞凋亡-謗導特性。圖13説明化合物B之細胞凋亡-謗導特性。圖14説明舒林酸硫化物及依席舒林對腫瘤細胞生長之影響。圖15説明舒林酸硫化物及對照組（dms〇)之生長抑制及細胞调亡-謗導活性。圖16説明化合物E之生長抑制活性。圖17説明小鼠乳腺器官培養物中前-惡性、贅疲新生性病喜由舒林代謝物所產生之抑制作用。圖1 8A爲得自無添加cGMP下之經藥劑處理細胞胞溶產物之SW480細胞胞溶產物的SDS蛋白質凝膠，立中係將細胞與DMS〇( 〇〇3%，第1與2行）、依席舒林（200、400 與6〇0_，第3、4'5行）及以021(〇卜1與1〇_，第6、 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公f-------- -----------裝--------tr'--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（1Q) 7、8行）培養而加以處理。圖1 8B爲得自於添加cGMP下之經藥劑處理細胞胞溶產物之SW480細胞胞溶產物的SDS ( X*»射線底片曝光）凝膠 PKG分析，其中係將細胞與DMSO( 0.03%，第1與2行）、依席舒林（200、400 與 600μΜ，第 3、4、5行）及E4021( 0.1、 1與1 0μΜ，第6、7、8行）培養而加以處理。圖19爲依席舒林相較於對照組，對贅疣細胞中β-連環蛋白及PKG濃度之影響的西方轉潰實驗結果之柱狀圖。圖20爲得自ΗΤΒ-26贅疣細胞之cGMP磷酸二酯酶，當以得自DEAE-Trisacryl Μ管柱溶析液進行分析時所呈現之 cGMP活性圖。圖21爲得自HTB-26贅疣細胞之cGMP磷酸二酯酶，當以得自DEAE-Trisacryl Μ管柱溶析液，與低及高受質濃度進行分析時所呈現之cGMP活性圖。圖22爲得自LnCAP贅疣細胞之cGMP磷酸二酯酶，當以得自DEAE-Trisacryl Μ管柱溶析液進行分析時所呈現之 cGMP活性圖。圖23爲得自LnCAP贅疣細胞之cGMP磷酸二酯酶，當以得自DEAE-Trisacryl Μ管柱溶析液，與低及高受質濃度進行分析時所呈現之cGMP活性圖。圖24爲説明PDE5之非-催化性cGMP結合位點對於環狀核甞酸類似物及所選PDE5抑制劑之特異性結合的柱狀圖。圖25爲得自S W480贅疣細胞之cGMP磷酸二酯酶，當以 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------tr----------線赢 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（11 知自使用存於緩衝液之乙二醇的DEAE-TrisacrylM管柱溶析液進行分析時所呈現之cGmp活性圖。圖26爲彳于自生長於滾瓶之sw480贅疲細胞的cGMP嶙酸一酉曰酶，當以得自DEAE-Trisacryl Μ管柱溶析液進行分析時所呈現之cGMP活性圖。圖2 7A顯示LNCaP細胞中之組蛋白-相關連斷裂DNA於以50 μΜ化合物I處理後所呈現之時間-依賴型增加。圖27Β顯示PrEC細胞以化合物ΐ( 50μΜ)處理期間，於多達4天之處理並未影響dnA斷裂。丝體實施例丨惫誨沭， L 特異性磷酸二酷n PDE2 A.新穎PDE構形之分離首先自通稱爲SW480，可購自美國組織模式保藏所（於洛克維，馬里蘭，USA )之人類癌細胞系製備得經分離之 cGMP·特異性磷酸二酯酶（其顯示爲pE2之新穎構形）。 SW480爲源自經適度分化之上皮腺癌。如下所論述γ已可自乳瘤形成（亦即HTB-26細胞系）與前列腺瘤形成（亦即LNCAP細胞系）分離得。 y '經分離之、如一般該項技藝所瞭解）意指，不僅係分離自贅疲細胞，亦可藉由重組方法製得（例如，於細菌或其他非-人類宿主載體細胞系中表現得）。然而，'五等目前相信以分離自人類贅疣細胞系爲較佳，因爲五等L产如此分離得之標靶蛋白質具有儘可能較接近（若=全然^ 同）於存在贅疣細胞中之構造（即，構形或拓樸結二了。 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I I — ！ — ·裝·！ — — - ！矿·！ · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239837 A7 B7 五、發明說明（12) 此構形有助於篩選可於活體内抑制標輕酵素之抗-贅疾化合物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製該新穎PDE活性係首先於S W480結腸癌細胞系中發現。爲自SW480中分離出該新穎磷酸二酯酶，遂將四億個 SW480細胞生長至鋪滿，並於以各10毫升冰PBS洗滌兩次後，自150平方公分組織培養盤上脱離，再以離心沈降。將細胞再懸浮於均質化緩衝液（20毫升TMPI-EDTA-Triton pH 7.4，20 mM Tris-HOAc，5 mM MgAc2，〇. 1 mM EDTA， 0.8% Triton-100，ΙΟμΜ苄脒，ΙΟμΜ TLCK，2000 U/毫升抑蛋白酶肽，2 μΜ亮抑蛋白酶肽，2 μΜ胃蛋白酶抑制劑A ) 中，並於冰浴上使用polytron組織均質器（三次，20秒/脈衝）進行均質化。將經均質化物質於1〇5,〇〇〇 g下，於4°C 下於貝克曼L8超高速離心機中離心60分鐘，將上清液以 TMPI_EDTA(60毫升）稀釋，並加樣至經TMPI-EDTA緩衝液之10毫米DEAE-TrisacrylM管柱上。將已加樣之管柱以 60毫升TMPI-EDTA洗滌，並以120毫升存在TMPI-EDTA之 NzOAc線性梯度（0-0.5 M)，於0.95毫升/分鐘，1.4毫升/流份之流速將PDE活性溶析出。收集八十流份並立刻（即於數分中内）分析其cGMP水解作用。圖1列示管柱之溶析分布圖，其顯示兩個cGMP活性起始高峰，即高峰A與B，其分別係以40-50 mM及70-80 mM NaOAc溶析出。如下所説明者，高峰A爲PDE5，而高峰B爲新穎cGMP-特異性磷酸二醋酶活性。使用經修飾湯普森等人（湯普森W.J.等人，進階環狀核 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（13) 甞酸研究10 ; 69-92，1979 )之二步驟放射性同位素方法，測定各流份之環狀核甞酸PDE活性，進一步詳述於下。該反應係於 400微升含有 Tris-HCl (40mM ; pH 8.0)，MgCl2 (5mM)，2_巯基乙醇（4mM)，牛血清白蛋白（30微克）， cGMP(0.25pM-5gM)與恆量含氚受質（200,000 cpm)之反應混合物中進行。將培育時間調整爲可給予少於15 %水解作用。將混合物培育於3(TC下，隨後煮沸45秒以終止反應。然後，將混合物冷卻，將蛇毒蛋白（5〇微克）加入，並將混合物培育於30°C下10分鐘。將MeOH( 1毫升）加入以終止反應’並將混合物轉移至陰離子-交換管柱（杜威克斯1β X8 ’ 0.25毫升樹脂）。將溶析液與第二毫升數之MeOH組合’加樣至樹脂，並於添加6毫升閃爍液後，使用貝克曼 L S 6 5 0 0測量氮活性達一分鐘。爲進一步級分高峰A與B之cGMP水解活性，遂將原先80 之伤15至30重加樣至該DEAE-TrisacrylM管柱上。再次立即分析cGMP水解作用（使用如上所述以〇 2、2、5μΜ 受質進行之程序），其結果以圖呈現於圖2中。一項於圖2 中説明有關高峰Β之觀察爲，增加cGMP受質濃度時活性會明顯地增高，而高峰A則否。此觀察雖與其係ρ〇Ε2相符，但是於圖2中鑑定其爲cGMP-特異性之事實（參見下述），暗示其具有相較於文獻中所報導典型PDE2爲新穎之構形。高峰A活性顯示高親和性催化部位有顯著之受質飽和度。 B.自SW480分離典型pDE2 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼震--------矿---------. 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（14) 經發現兩種可自SW480分離得《高峰B” ，以使該酵素具有典型PDE2活性（亦即非cGMP-特異性，但仍受cGMp 刺激）。第一種方法涉及將SW48〇生長於85〇平方公分康寧滚瓶，而取代培養於150平方公分組織培養燒瓶中。於 0.5 rpm下將SW480生長於滾瓶中，而各瓶含有2〇〇毫升 RPMI 1640，2 mM谷胺酸，及25 mM HEPES。藉由下列程序收取細胞。將PBS培養基加溫至37°C達至少15分鐘。製備200毫升5% FBS/RPMI 1640完全培養基，並將$毫升谷胺酸加入。亦將5毫升抗生素/抗眞菌素加入。將70毫升PBS溶液加入10毫升4X胰酶制劑中。將混合物保持於室溫下。將培養基去除，聲將燒瓶以4亳升pBS洗滌確保燒瓶底部被淹蓋住。將所有溶液以吸管吸除。將4毫升經稀釋之胰酶制劑加至燒瓶中，並涮洗燒瓶以淹蓋其底部。將燒瓶培育於37°C下8-10分鐘。經培育後，將燒瓶立刻於解剖顯微鏡下檢查，以確定所有細胞呈圓球形。將燒瓶小心地於側邊敲打數次，以幫助細胞脱離。將1〇毫升冰凍之完全培養基加入燒瓶中，以終止胰酶制劑之蛋白質分解作用。將溶液迴旋過底部以收集細胞。使用25毫升吸管取出培養基，並將細胞置於5 0毫升離心管中置於冰上。將離心管於1000 rpm下，於4°C下於臨床離心機中離心5分鐘以沈降細胞。將上清液倒除，並將各細胞沈降物於液態氮上冰凍15秒。所收得之細胞可儲存於-70°C冷凍櫃中。使用FPLC程序自所收得之SW480細胞分離出PDEs。使用法馬西亞AKTA FPLC控制於18毫升DEAE-Trisacryl Μ -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝--I-----tr"— —--I I · 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（15) ΐ柱上進行之樣本加樣及溶析〇使用大約6億個SW480細胞於分布分析。待將細胞再懸浮於均質化緩衝液（2〇毫升

TMPI_EDTA-Triton pH 7.4，2G mM Tris-HOAc，5 mM

MgAc2’ 0」mMEDTA’ 0 8%Trit〇n_1〇〇, 1〇μΜ：^腺，ι〇μΜ TLCK ’ 2000 U/毫升抑蛋白酶肽，2 μΜ亮抑蛋白酶肽，2 μΜ

胃蛋白酶抑制劑A )中後，以手動將樣本均質化。fplc緩衝液A爲8 mM TRIS-乙酸鹽，5 mM Mg乙酸鹽，〇」mM EDTA，pH7.5，而缓衝液B爲 8 mM TRIS-乙酸鹽，5 mM Mg 乙酸鹽，0· 1 mM EDTA，1 M Na乙酸鹽，pH7.5。將上清液於每分鐘1毫升下加樣至該管柱上，隨後以6〇毫升緩衝液A於每分鐘1毫升下進行洗滌。以6〇毫升〇_15〇/。緩衝液 B、60亳升15-50%缓衝液B、16亳升50-100%緩衝液b進行梯度溶析。於進行梯度期間收集1 5毫升流份。所知之分布圖（圖26 )類似於上述所得對應新穎pde活性之分布圖（參見’例如圖1 )，惟以此方式所分離得之高峰B顯示於〇·25 μΜ受質下具有cAMP水解活性，而其可於5 μΜ cGMP下被活化2-3倍。

第二種自SW480分離得典型PDE2之方法，係使用如上所述（參見IA節）之FPLCDEAE管柱程序完成，惟修飾點在於該緩衝液含有30%乙二醇，1〇 mM TLCK及3.6 mM β-巯基乙醇。將此等試劑加入緩衝液中會造成溶析分布圖從低至咼乙酸鈉之移位（參見圖2 5 )，而使高峰Α從4 0移至15 0 mM，高峰B從75移至280 mM，而高峰C則從200移至500 mM Na乙鹽（參見圖25)。將圖25中之高岭B以2 μΜ c AMP -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公董） -----------裝--------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（16) 受質進行分析，並顯示由5 μΜ cGMP產生2倍活化作用（參見圖-Y )。選擇性PDE2抑制劑EHNA會抑制此高峰B中之2 μΜ cGMP PDE活性，IC50値爲1.6 μΜ，且抑制高峰B中之2 μΜ cAMP PDE活性，IC5〇値爲3·8 μΜ(而添加10 μΜ咯利普藍則IC5〇値爲2.5 μΜ )。 C. PDE高峰Α與新穎高峰Β活性之cGMP-特異性亦對得自第IA節之DEAE管柱的各流份，分析其有或無 Ca++、Ca+ + _CaM及/或EGTA存在下之cGMP-水解活性 (0·25μΜ cGMP)，及其有或無5μΜ cGMP存在下之cAMP-水解活性（0.25 μΜ c AMP)。PDE高峰A與高峰B二者（流份 5-22 ;參見圖1 )皆不顯著地分解cAMP，確定二者皆不具有PDE典型cAMP-水解家族（亦即PDE1、2、3 )之活性。

Ca++ (有或無鈣調蛋白存在）無法活化高峰A或B之cAMP 或cGMP水解活性，且cGMP無法活化或抑制cAMP水解作用。此等結果確定，高峰A與B構成cGMP_特異性PDE活性，而非典型或先前所知之PDE1、PDE2、PDE3或PDE4活性。關於新穎PDE高峰B (如下所論述），環狀GMP活化該酵素之cGMP水解活性，但是不會活化任何cAMP水解活性 (此與得自上述第IB節之高峰B結果大不相同）。此顯示，新穎PDE高峰B —本發明之新穎磷酸二酯酶一並非受 cGMP-刺激之cAMP水解作用（”cGS”），或不屬於典型或先前所知之PDE2家族活性，因爲已知之PDE2同功型會水解 cGMP及 cAMP二者。 D. 高峰A爲典型PDE5，但新穎高峰B —新的cGMP-特異 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝--------1T---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239837 A7 B7 五、發明說明（17) 性PDE —則否 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲將任一種PDE同功型特徵化，應分析動力學特性及受質優先性。高峰A顯現代表性之"PDE5”特徵。例如，該酵素對cGMP 之Km爲1.07 μΜ，而Vmax爲0.16毫微莫耳/分鐘/毫克。此外，如下所論述，扎普司特（IC50 = 1.37 μΜ)與E4021 (IC50 二3 μΜ)及息丹那非抑制高峰A之活性。而且，扎普司特顯示對高峰A之cGMP水解活性具有抑制作用，與文獻中所報導之結果相符。得自第IA節之高峰B顯示與PDE高峰A相當不同之動力學特性。例如，於圖A之愛迪-赫夫提圖中，環狀GMP水解作用顯示具有隨受質濃度增加而呈負斜率値之單一直線，表示爲米契爾斯-曼頓動力學形式。然而，高峰B對於無cAMP存在下之cGMP水解作用呈現新穎特性，其隨著 cGMP受質增加而具有先減少（顯著Km = 8.4)，然後增加之愛迪-赫夫提斜率（Km< 1)(參見圖3 )。因此，此確定高峰B對cGMP具有次微莫耳親和性（Km< 1)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製與動力學研究（亦即圖3)及有cGMP受質存在下之陽性協同動力學特性一致，於漸增濃度之cGMP受質存在下 cGMP水解活性亦增加。此係經由比較0.25 μΜ、2 μΜ、及 5 μΜ濃度之cGMP，於經第二次DEAE分離後之PDE高峰Β 存在下，排除c AMP水解作用且排除此新穎酵素爲先前所鑑定之PDE5而發現得。cGMP濃度越高引起由PDE高峰B 所造成之cGMP水解作用不成比例地越大，如圖2中所示。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837

五、發明說明（18) 此項觀察暗示，與高峰6酵素結合之咖故之構形改變。此確定使用得自贅細胞之天然酵== 點，但本發明並不限定於該酵素具有上述形式。 1紙足天然 E. PDE高峰B相對於高峰A之扎普司特-及息丹那非- 不敏感性’及其對其他PDE抑制劑之影響使用十二種G.G1至⑽μΜ濃度之藥劑，及受質濃度 0.25/M3H-cGMP，對不同抑制劑進行研究。以可變二率計算ICS0値，使用Prism 2 〇1 (Graphpad)進行”曲線擬合二結果列示於表丨中。雖然化合物以〇21與扎普司特會抑制高峰A，然而（以高親和性）計算得對抗高峰B中新穎 PDE活性之ICw値顯著地減低（>5〇倍）。此確定高峰a 爲PDE5。此等數據進一步説明，本發明之新穎pDE活性爲 (針對所有實際目的而言）扎普司特-不敏感性且爲 E4021-不敏感。表1 PDE抑制劑對抗高峰a及ία節高峰B __(cGMP水解作用）之比較 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 比値（IC50 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PDE家族ic 50 IC 50 化合物抑制劑高峰Α (μΜ) 高峰Β (μΜ) 高峰ΑΛ E4021 5 0.003 8.4 0.0004 扎普司特 5 1.4 >30 < 0.05 化合物E 5及其他 0.38 0.37 1.0 舒林酸硫化物 5及其他 50 50 1.0 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（19 ) 長春西汀 1 EHNA 2.5 峭哚利旦 3 咯利普藍 4 息丹那非 5 反之，舒林酸硫化物與化合物E以相同之程度完全抑制高峰八及6磷酸二酯酶（對PDE高峰八之1(：5〇二〇38μΜ;對 PDE 高峰 Β之 IC50 二 0·3 7μΜ )。由於高峰Β (其任一形式）爲扎普司特_不敏感性，而高峰 Α及Β皆對舒林酸硫化物與化合物Ε敏感之事實，故對於产療贅疲新生及供此類治療之有用化合物的篩選上有顯著性。吾等已測試扎普司特、Ε4〇2丨及息丹那非，以確定彼等是否謗導贅疣細胞之細胞凋亡或抑制其生長，且亦對化合物E進行相同測試。如下所説明者，扎普司特本身即不具有顯著之細胞凋亡-謗導或生長-抑制特性，而息丹那非與化合物E恰好相反。換g之，一化合物抑制高峰a 及B之能力，與其可謗導贅疣細胞中細胞凋亡之能力相關連，而若一化合物（例如扎普司特）僅對PDE高峰A具有特異性，則該化合物單獨並不會謗導細胞洞亡。 F.該新穎PDE高峰B對與cGMP-依賴型蛋白激培育不具敏感性 P D E咼峰A與该新穎南峰B ( IA節）間之其他差異，係於彼等在改變濃度之cGMP-依賴型蛋白激酶〇(其蹲酸化代表性PDE5 )存在下’所各別呈現的CGMP-水解活性中觀察 > 100 > 100 > 100 3. 7 31 > 100 > 100 > 100 • 0003 > 10 <0.3 < 00003 ------------裝--------外--------- C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇χ -22- 1239837 A7 B7 五、發明說明（2(3) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 得。特別地，係將得自IA節之高峰A及高峰B流份與不同濃度之蛋白激酶G於3(TC下進行培育30分鐘。於磷酸化作用後分析該二高峰之環狀GMP水解作用。與先前所發表關於PDE5之資料相符，高峰A顯示與蛋白激酶G培育時cGMP 水解活性增加，表示高峰A被磷酸化。然而，高峰B並無改變（亦即，其並未被磷酸化且對與cGMP-依賴型蛋白激酶G之培育不敏感）。此等數據與爲符合已知PDE5之同功型，而得自IA節之高峰B爲新穎cGMP-特異性PDE活性之描述相符。

G.前列腺及乳癌細胞系中之新穎高峰B 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製亦自兩種其他贅疣細胞系（乳癌細胞系，HTB-26及前列腺癌細胞系，LnCAP )，藉由與上述用於自SW480分離相同之程序分離得該新穎高峰B。該程序於許多方面加以修飾。爲提供使能比較不同細胞系之較大可重複性，遂使用法馬西亞AKTA FPLC控制於18毫升DEAE-Trisacryl Μ 管柱上進行之樣本加樣及溶析。將SW480藉由此相同程序進行數次，以提供高峰Β之參考値。將200-400億個SW480 細胞用於該分布圖分析。將7千萬個LnCAP細胞用於一項分布圖分析（參見圖22及23 )，而於另一項分別實驗中係將3千2百萬個LnCAP細胞用於一項分布圖分析（參見圖20 及2 1 )。待將細胞再懸浮於均質化缓衝液中後，以手動將樣本均質化。FPLC緩衝液A爲8 mM TRIS·醋酸鹽，5 mM Mg 醋酸鹽，0.1 mM EDTA，pH7.5，而緩衝液B爲 8 mM TRIS-醋酸鹽，5 mM Mg醋酸鹽，0.1 mM EDTA，1 M Na醋酸鹽， -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 A7 B7 21 五、發明說明（ PH7.5。將上清液於母分鐘1毫升下加樣至該管柱上，隨後以60毫升缓衝液Α於每分鐘1毫升下進行洗滌。以6〇毫升〇-15%緩衝液8、60毫升15_50%緩衝液6、16毫升5〇_1〇〇0/〇緩衝液B進行梯度溶析。於進行梯度期間收集丨5毫升流份。於流份65附近溶析出具cgMP PDE活性之高峰，其係於40〇1!^^醋酸鹽下（參見圖20-23 )。此活性係於〇25 μΜ cGMP下測量得（表示對cGMp具有次微莫耳之親和性）。咯利普藍（一種PDE4-特異性藥劑）抑制大部分之 cAMP PDE活性（亦即cAMP活性係由於Pde4)，表示高峰B之cGMP活性係對cGMP具有特異性超越CAMP。所有三種高峰B(得自SW480、HTB_26及LnCAP)並未顯示受鈣/ 舞碉蛋白刺激，且其對100 nM E4021 ( —種類似於扎普司特之特殊PDE5 -特異性抑制劑）具有抗性（參見圖2〇及 22 )。該等高峰B亦顯示當受質自〇 25 μΜ增加至5 cGMP 時，其活性顯著增加（表示具有陽性協同動力學）（參見圖2 1及23 )。又’該三種高峰顯示由依席舒林抑制與化合物I所造成之抑制作用相似（參見下述）。 Π· ·Ιΐ^質激酶G與ϋ環蛋白涉入„一般論述進行一系列實驗以確定抗-贅疣性cGMP-特異性PDE抑制劑例如依席舒林對含有腺瘤結腸性息肉基因（"Apc基因 ”）缺陷’或編碼β-連環蛋白之基因缺陷的贅疣細胞中之 cGMP-依賴型蛋白激_G (”pKG”）具有何種作用。如以下所説明’此抑制劑造成此等贅疣細胞中PKG活性升高。該活性增加不僅係由於含有任一缺陷之細胞中PKG活化作 -24 - 本紙張尺錢财_冢辟（CNS)A4^^_9 ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝--------1T*---------^^^1 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（22) 用增加，而係含有APC缺陷細胞中PKG之表現亦增加。此外，當將得自具有任一缺陷之贅疣細胞的PKG進行免疫沈澱時，其與β-連環蛋白一起被沈澱出。因研究人員已發現β-連環蛋白於具有含APC腫瘤-壓制基因突變之贅疣新生，的患者中濃度高而將其與各種不同癌症產生關聯。於出生時即具有此基因突變之人們，往往於其結腸遒中發育出數千個小腫瘤。當其適當地進行功能時，APC基因編碼據信可結合至並調節β-連環蛋白之正常 APC蛋白質。因此，發現存在含有APC基因缺陷β-連環蛋白缺陷之贅疣細胞中的PKG會與β-連環蛋白結合，確實強烈地推測PKG與一種導致癌症之主要細胞途徑相關聯。此外，因爲以SAANDs治療時產生cGMP-特異性抑制作用與 PKG增高間之關係，遂使cGMP與該等細胞中之PKG/β·連環蛋白/APC缺陷相連結。此項後述之連結經由觀察到，當含有APC基因缺陷β-連環蛋白缺陷之贅疣細胞暴露至SAAND時，β-連環蛋白本身減少而進一步獲得支持。此β-連環蛋白減少係由PKG本身所引發。PKG磷酸化β-連環蛋白一其爲另一項與本發明相關連之新穎觀察。β-連環蛋白之磷酸化作用使β-連環蛋白能夠被遍在蛋白·蛋白酶體系統所分解。此β-連環蛋白被PKG之磷酸化作用於贅疣細胞中爲重要，因其壓制APC及β-連環蛋白突變之影響。經突變之APC 蛋白質影響β-連環蛋白與突變型APC蛋白質之結合，該結合作用之改變迄今已認爲係阻礙β-連環蛋白被GSK-3b激 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .!!1------•裝——-!tj:— 丨——$, 1239837

五、發明說明（23) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製酶磷酸化。於突變型β 亦使突㈣β_連環PKG活性升高隨comp pH 铸酸化。藉由於贅疲細胞中伴 fcCGMP-PDE抑制作用產生之任-型突變之贅€細胞中進行丨二，使-於含有致其降解）。了卜連《㈣酸化作用（導 ^之，此等發現不僅產生用以鏗定其他“AND候選化合物之新穎醫藥篩選方法，亦支持⑷隊特異性酬抑制作用I /口療贅疣新生程序上之功用。此項觀察亦可解釋 saanDs可抑制相當廣泛之贅㈣生，因爲有或無Apc缺陷（贅疣新生皆可以如上所説明者進行治療。 III·兔用PDEs篩檢醫藥組合物 A. —般論述本發明之新穎PDE與PDE2可與或無PDE5用於鑑定可用於治療或預防贅疣新生，且特徵在於無嚴重副作用之化合物0 癌症及前癌症可認爲係，涉及未受調節性細胞生長之疾病。細胞生長涉及許多不同因素。其一因素爲細胞增殖速率如何’而另一因素涉及細胞死亡速率如何。細胞可經由壞死或凋亡而死亡，視所受之環境刺激類型而定。細胞分化爲另一項影響重瘤生長動力學之因素。解析細胞生長係受一化合物之何種層面影響，對於發現醫藥治療之相關標的而言爲重要。基於此技術之篩檢分析，可與其他用以篩選具有生長-抑制，及引發-細胞凋亡活性之化合物的測試結合。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝--------^---------· 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（24 本發明爲數項重要發現之產物。首先，本發明發現可希望之腫瘤細胞生長抑制劑，會藉由細胞凋亡謗導癌細胞之早熟死亡（參見，皮亞薩等人，蓆症砑龙，55: 3 1 10-3116， 1995 )。第二，本發明之數位發明人不預期地發現，選擇性謗導細胞凋亡而實質上不抑制COX但亦抑制PDE5之化合物。尤其，與現今領導之科學研究相反，用於可希望治療贅疣新生病害之化合物會抑制PDE5 (EC 3.1.4.17)。 PD£5爲磷酸二酯酶至少十個基因家族中之一者。pDE5及本發明之新穎PDE爲獨特，因彼等選擇性地降解環狀GMp 而非CAMP，而其他PDE家族則選擇性地降解/awcAMP 而非cGMP，或非選擇性地降解eGMP及cAMP二者。較佳地’可希望用於治療贅疣新生之化合物，實質上不會抑制非選擇性或降解cAMP之磷酸二g旨酶類型。 B· COX篩檢本發明之較佳實施例包含設定所給予化合物之環加氧酶抑制活性，及測定該化合物之特異PDE抑制活性。直接或間接藉由比較彼等與已知可用於治療贅疣新生病害之化合物的活性，而對測試化合物分析其治療贅疣新生病害之能力。已知有效用於治療贅疣新生病害，而不會引起胃部刺激之標準化合物係5-氟·2_甲基(對-甲颯基亞爷基）-3-茚基乙酸（”依席舒林，，）。其他可用於比對目的之化合物包括，該等已知用以抑制C〇X者，例如 < 嗓美心及舒林酸之硫化物代謝物·· 5-氟-2-甲基-1-(對_甲亞砜基亞苄基）-3-茚基乙酸（”舒林酸硫化物，，）。其他可用於比 -----------裝--------tr*--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -27- 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（25 ) 對目的之化合物包括，該等已知用以抑制cGMp_特異性 PDEs者’例如1_(3_氯苯胺基）_4•笨基g太π井（"MY5445”）。用於本文’術語”前癌性病害”包括以異常贅疣新生爲代表之徵候群’其包括發育異常、組織變異。實例包括結腸、乳房、前列腺或肺組織中之異常生長，或諸如異常痣發育症候群、造成皮膚惡性黑素瘤之前身等病況。實例亦包括（除了異常瘛發育症候群之外）息肉發生徵候群、結腸性息肉、宮頸（亦即宮頸發育異常）、食管、肺之前癌性病害、前列腺發育異常、前列腺内贅疣新生、乳房及/ 或皮膚之前癌性病害或相關病況（例如光化性角化病），各病害爲可於臨床上鑑定或不然。用於本文，術語”癌”或《癌症，，意指爲癌性之病害。實例包括惡性黑素瘤、乳癌、前列腺癌及結腸癌。用於本文，術語”贅疣新生，，及《贅疣，，意指癌性及前_癌性之病害。用於本文，縮語PG代表前列腺素；PS代表前列腺素合

成酶，PGEj<表如列腺素I ; PDE代表嶙酸二酯酶；cQX 代表裱加氧酶；環狀核甞酸，RIA代表放射免疫分析。由一化合物所產生之C〇x抑制作用，可藉由兩種方法之其一進行測定。其中一方法涉及測量由完整hl_6〇細胞，於暴露至所欲篩檢化合物後所分泌之PGE2。另一方法涉及測量於該化合物存在下之經純化環加氧酶（coxs)活性。該二万法皆包含先前於文獻中所述之提案，但較佳之提案陳述如下。 ·裝--------tr:---------. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -28- 1239837 A7 B7 五、發明說明（26 可藉由測里PGE2而對化合物進行評估，以測定彼等是否抑制前列腺素E, (，，PGE2”）之製造。使用適於pGE2之酵素免疫分析套組，例如市售可得自艾默遜，亞靈頓海斯，比 U.S.A。適宜 < 細胞包括該等製造豐富pG之細胞例如hL_ 60細胞。HL-60細胞係經DMs〇分化成爲成熟粒細胞之人類早幼粒細胞（參見，柯林斯，s j，盧色迪，F w，加蘭吉，R.E·與盍洛，R.C·， '經培養人類早幼粒細胞性白血症細胞（HL-6〇)受二甲亞職謗導分化後之正常功能特徵” ，J.五xp· Me乂，祖:969-974，1979 )。此等經分化之細胞於以鈣離子載體，A23 187刺激後產生pGE2(參見卡曼，S·，普斯特，P.與伊凡斯，j F.， ”HL_6〇細胞^脂肪氧合酶之轉運”，j. C/zem.，266.:23745-23752， 1991 ) 。HL-60細胞可購自 ATCC (ATCC:CCL240)。彼等可於補充以20%經熱去活化胎牛血清、5〇 u/毫升鏈霉素之 RPMI 164〇培養基中，於含5% C〇2之大氣中於η。。下生長。爲謗導骨體分化作用，遂將細胞暴露至1 3% DMSq 達9天’然後洗務並以3 X 1 〇 6個細胞/毫升之濃度下，再釋浮於杜貝可氏磷酸鹽缓衝食鹽水中。將經分化之HL-60細胞（3 X 106個細胞/毫升）於有所希望濃度之受測試化合物存在下’於37C下培育15分鐘。然後將細胞以A23 187刺激（5 X 10·6Μ)達15分鐘。如上所述測量已分泌至外在培養基中之PGE2。如上所指示，第二種用以評估COX抑制作用之方法，係測量測試化合物存在下之COX活性。業已於文獻中報導兩 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i I! ί tr-··—·——·—- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837

五、發明說明（27 種不同形式用以調節前列腺素合成之環加氧酶（<:0又_1與 C0X-2)。C0X-2代表COX之可謗導形式，而coxy代表組成形式。COX-I活性可使用米契爾等人（《做爲組成即可謗導型環加氧酶之非類固醇消炎藥劑”，Pr〇c &;· f/M，脸:ι 1693-1 1697，1993，併入本文作爲參考文獻）所述之方法測量得，其係使用如布培斯與巴布拉曼尼安’ ”綿羊血小板環加氧酶之純化與鑑定，，（扪/， 211:3 71-3 77 ’ 1988，併入本文作爲參考文獻）所述，自公羊精囊純化得之環加氧酶進行測定。C0X-2活性可使用如米契爾等人（1993,前述）所述，自綿羊胎盤純化得之c〇x-2 測量得。藥劑之環加氧酶抑制活性可藉由該項技藝已知之方法測定得。例如，布培斯與巴布拉曼尼安（1988，前述）曾描述一種程序，其中係將前列腺素Η合成酶1(凱曼化學公司，安亞柏，密西根）與1〇〇 μν[花生四烯酸（西格馬化學公司）、輔因子（例如1·〇 mM谷胱甘肽、1.0 mM氫醌、〇·625 μΜ血紅素與 1·25 mM CaCl2存於 100 mM Tris-HC卜 pH 7.4)及欲受測試藥劑，於37。(：下培育10分鐘。於培育後’可以三氣乙酸終止該反應。待藉由添加硫代巴比土酸及丙二醛停止該反應後，可於5 3 0 nm下以分光光度計測量酵素活性。顯然，相較於其較大PDE5/新穎PDE/PDE2組合抑制活性，而呈現較低COX-I或COX-2抑制活性之化合物，可爲可希望之化合物。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注音？事項再填寫本頁) _裳-------^訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（28) 藉由比對有或無測試化合物存在下之環加氧酶活性，而測定得COX抑制量。於約1 〇〇 μΜ濃度下之殘餘（亦即少於約25% )或無COX抑制活性，表示該化合物應在進一步評估供治療贅疲新生之有用性。 C. 測定磷酸二酯酶抑制活性可使用經如上所述分離得之酵素（重組版本），或使用新穎PDE及/或PDE2與PDE5—起，對化合物篩檢其對本發明新穎磷酸二醋酶活性之抑制功效。另供選擇地，係藉由 RIA測量完整細胞中之環狀核甞酸濃度，並與未經處理及經扎普司特-處理之細胞進行比較。可使用孩項技藝中已知之方法，例如使用具放射活性3η 環狀GMP (cGMP)(環狀3，，5，_鳥苷單磷酸）做爲該pDE酵素受質之方法（湯普森W.j.，塔拉斯基，WL，伊普斯坦， P.M·，史特拉達，S.J·，進階環狀核甞酸研究，^^·，69-92， 1979，併入本文作爲參考文獻），測定磷酸二酯酶活性。簡Τ之，係將已確定受質3H-cGMp比活性之溶澈〇 2 μΜ ; 100,000 cpm ·，含有 40 mM Tris-HCl (pH8.0)，5 mM MgCl2 及1耄克/¾升BSA )，與所欲受測試藥劑混合於總體積爲 400微升。將混合物於3(rc下與本發明之經分離pDE進行培育10分鐘。例如藉由將反應混合物煮沸75秒，而使反應終止。待於冰上冷卻後，將1〇〇微升〇5毫克/毫升蛇毒蛋白 (眼鏡蛇毒蛋白，可購自西格馬公司）加入，並於30°C下培育10分鐘。然後藉由添加醇類，例如1毫升1〇〇%甲醇終止此反應。將存在管柱穿透及洗滌流份中之放射活性量組 -31 - 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1^-- 1239837 A7 五、發明說明（29 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 合’並以閃爍計讀器測量。藉由計算經藥劑-處理反應中之放射活性量，並將其與對照組樣本（缺乏受測試化合物但含有試藥溶劑之反應混合物）進行比較，而測定得磷酸二酯酶之抑制程度。另供選擇地’可希望化合物抑制本發明轉酸二酯酶之能力’係藉由於經暴露至受篩檢化合物之贅疣細胞中cGMp 增加而反應出。可藉由使用放射免疫分析法（RIA)，分析存在受處理細胞之萃取物中的環狀GMP量，而測定得PDE 活性量。於此程序中，係將HT-29或SW_480細胞平佈並生長至鋪滿。如上所指，SW-480含有PDE5及本發明之新穎 PDE，所以當以此方式評估Pde活性時，會同時分析得組合之cGMP水解活性。然後將測試化合物與細胞培養物，於化合物濃度介於約200 μΜ至約200 pM下進行培育。於其後約24至48小時，將培養基自該等細胞除去，並使細胞溶解化。藉由使用〇.2NHCl/50%MeOH將反應終止。取樣以進行蛋白質分析。使用陰離子·交換層析術，例如Do wex 管柱自細胞之酸/醇萃取物純化得環狀GMP。將cGMP乾燥，並根據已公開之程序例如使用乙酸酐於三乙胺中（史坦勒 ’ A.L·’ 派克，C.W·，吉普尼斯，5/〇/· ，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^47 (4χ： 11〇6-13，1971，併入本文作爲參考文獻）進行乙醯基化。將經乙醯基化之cGMP使用放射免疫分析程序（哈柏，J·，布魯克，G.，遠縻環欢孩穿廢砑龙，！0_; 1_33， 1979，併入本文作爲參考文獻）加以定量。將經衍生化環狀GMP之破化配位子（酪胺酸甲酯）與標準物或未知物， -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 A7 五、發明說明（30 ) 於抗血清及適當緩衝液存在下進行培育。抗血清可使用環狀核苷酸-半抗原所指示之技術製得。抗血清係得自注射以琥珀醯基-cGMP-白蛋白共軛物之綿羊，並將其稀釋 1/2 0,000。如先前所述（西柏特，a.F.，湯普森，w j，泰勒，A.，威包恩，W.H·，巴納得，j.，與海尼斯，；， X 却Μρ/ο/.，21:389-395，1992，併入本文作爲參考文獻），自標準曲線進行劑量-内插及誤差分析。此外，可將培養基酸化，冰凍（-7(rc)並亦分析〇〇乂1>與 cAMP 〇除了觀察贅疣細胞中因可希望化合物所造成之cGMp含量增加以外，亦已觀察CAMP含量之減少。已觀察到，特別可希望之化合物（亦即，選擇性地於贅疣細胞中，而實質上不於正常細胞中謗導細胞凋亡者）隨著與cGMp_特異性PDE抑制作用相符之時間過程，而於最初作用導致cGMp 含量於數分鐘内增加。其次，以可希望抗-贅疣化合物處理贅疣細胞，導致cAMP含量於24小時之内減少。藥劑之細胞内標靶正進一步研究當中，但最近之數據支持，起初 cGMP含量增高及隨後cAMP含量降低，引導經暴露至可希望化合物之贅疣細胞中產生細胞凋亡。該二種環狀核嘗酸之比例變化，可爲供評估測試化合物之可希望cGMP-特異性磷酸二酯酶抑制活性的更正確工具，而非僅測量cGMP之絕對値、cGMP-特異性磷酸二酯酶抑制、或僅測量cGMP之水解程度。於未經抗-贅疣新生化合物處理之贅疣細胞中，cGMP含量/ cAMP含量比例係 •33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） (請先閲讀背面之注音？事項再填寫本頁) 一裝 I——-訂——^------%i. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 ----— _B7__ 五、發明說明（31 ) 介於0.03-0.05範圍内（亦即，3〇〇-5〇〇毫微微莫耳/毫克蛋白質cGMP含量對6000-8000亳微微莫耳/毫克蛋白質cAMp (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 含量）。待暴露至可希望抗-贅疣新生化合物後，該比例因爲起初環狀GMP增高且稍後環狀amp減少，而增加數倍 (較佳至少約增加三倍）。尤其，已觀察到特別可希望之化合物，使受處理贅疣細胞中之cGMP含量，於最初cGMp濃度增加至超過約5〇〇毫微微莫耳/耄克蛋白質。此外，特別可希望之化合物於使受處理贅疣細胞中之cAMP含量，於稍後cAMp濃度減少至少於約4000毫微微莫耳/毫克蛋白質。爲測足環狀AMP之含量，遂使用類似於前文關於cGMp 所述之放射免疫分析技術。基本上，係使用陰離子-交換層析術自細胞之酸/醇萃取物純化出環狀核甞酸，乾燥，根據已公開之程序進行乙醯基化，並使用放射免疫分析程序加以定量。將經衍生化環狀AMp及環狀GMp之碘化配位子與標準物或未知物，於抗血清及適當緩衝液存在下進行培育。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製環狀核芬酸含量可藉由測定完整細胞中環狀核苷酸累積量之轉換而獲得證實。爲測量完整細胞cAMp，遂根據已公開程序使用3H-腺苷預_標定（華林，μ·ε.，加瑞特jr.， R.L·，湯晋森W.J·，史特拉達，s j «無細胞大腦環狀核甞酸磷酸二酯酶活性與完整大腦切片中環狀amp衰變之相關性’一激說,感典劈蛋冷f部究，3 1 1-325,1989，併入本文作爲參考文獻）。該程序測量經標定ATp成爲環 -34- 本紙張尺度·巾_家標準（CNS)A4規i：'(210 x 297公愛） 1239837

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製狀AMP之通量，且可視特殊提案之不同，而用於估計完敕細胞腺苷酸環化酶或環狀核甞酸磷酸二酯酶活性。環= GMP累積量㉟低以*無法以根據已公開程序之完整: 預-標定進行研究（雷諾德，p E，s L史特拉與w ;湯普森，”藉由完整細胞預-標定測量肺微囊上皮細胞中之二狀GMP累積，，，立命疗學，妞；9〇9_918, Η”，併入二文作爲參考文獻）。亦可自組織樣本測定得化合物之pDE抑制活性功效。自經暴露至測試化合物之個體，收集得自人類的活纽織檢體’或得自經麻醉動物的组織。簡言之，係將組織樣本於 5〇〇微升6%TCA中均質化。取出已知量之均質液進行蛋白質分析。將剩餘之均質液至於冰上20分鐘，以使蛋白質沈澱。接著，將均質液於代’於15,0·下離心30分鐘。將上清液时’絲沈降物时。將上清液以五倍體積之細水飽和二乙鍵洗滌四次。將上乙關於每次洗滌過程中間丟棄。將含水醚萃取物於高速眞空中乾燥。一旦經乾燥後：可將樣本冰凍以供後續使用’或立即使用。將經乾燥之萃取物溶解於500微升分析緩衝液中。藉由使用如前所述之RIA程序分析環狀核苷酸量，而測定出cGMp_特異性抑制作用量。、藉由比較有或典该化合物存在下新穎(或pDE2 )之活〖生’而測疋出抑制作用之量。該新穎活性（或叩叫 ^抑制作用，係指示該化合物可用於治療贅錢生之指 “大於基準（依席舒林）之顯著抑制活性，較佳係於⑺ --------^---------^^wi. (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -35- 1239837 A7 .............. B7 五、發明說明（33 ) μΜ或更低濃度下大於5〇%，爲該化合物應進一步進行抗贅疣特性評估之指標。較佳地，對於欲進一步考量其潛在用途之化合物而言，該新穎pDE抑制作用之値應小於“ μΜ。 D·測定一化合物是否減低腫瘤細胞生長於另一具體實施例中，本發明方法涉及進一步測定該化合物是否會減低腫瘤細胞之生長。視所欲受測試之組織而定，可將於樣本中使用各種細胞系。例如，此等細胞系包括：SW_480 結腸腺癌；Ht_29_結腸腺癌；Α_427 _肺腺癌； MCF-7-乳腺癌；及UACC-375 ·黑素瘤細胞系；與㈣⑷-如歹j腺癌。使用此等細胞系所獲得之細胞毒性數據，爲對贅疲新生病害抑制功效之指標。此等細胞系已經鑑定特徵化，且由美國國家癌症協會用於其篩檢新穎抗_癌藥劑之計劃中。可使用得自ATCC之HT-29人類結腸癌細胞系，測量化合物抑制腫瘤生長之能力。HT-29細胞原先已鑑定爲相關之結腸腫瘤細胞培養模式（佛格，j·與提普，G於：活鑀分之慶痨洳應，J.佛格（編著），普力門出版，紐約，第115_ 159頁，1975 )。將HT-29細胞於37X：下，維持於補充以5〇/〇胎牛血清（吉米尼生物產品股份有限公司，卡斯貝得， CA)，及2 mM谷胺酸與1%抗生素·抗霉素之RpMm養基，於含95%空氣與5% C〇2之大氣中。簡言之，將ht-29細胞以500個細胞/槽之密度平佈於96槽微滴定平盤中，並於37 C下培育24小時’其後將化合物加入。各細胞數之測定包 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------tr-------1—i^^^wi. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 五、發明說明（34) 含六組重複。待培養六天後，將細胞藉由將冰三氣乙酸加至終濃度至爲10%而將細胞固定，並如先前史基漢，p，史托林，R·’史庫迪羅，D·，蒙克斯，A.，麥克曼，J威施提卡，D·，瓦倫，j.t.，布可其，H·，肯尼，s.，及波伊传’ Μ · R · ’ 供師檢抗癌藥劑之新穎比色分析” j. / C⑽cer /似ί. ϋ: 11〇7_1112，1990，併入本文作爲參考文獻，所述使用硫代羅丹明B (SRB)比色蛋白質染色分析測量蛋白質濃度。除了 SRB分析以外，可利用許多其他方法測量生長抑制，且可替代SRB分析。此等方法包括於錐蟲藍染色後計數存活細胞，以BrdU或可經放射標定之胸甞標定能夠進行 D N A合成之細胞’存活細胞之中性紅染色，或存活細胞之 MTT染色。於100 μΜ或更低劑量下達大於約50%之顯著腫瘤細胞生長抑制作用，爲該化合物可用於治療贅疣新生病害之指標。較佳地，係測定得IC5G値並用於比對目的。此値爲藥劑相對於對照組，以抑制腫瘤細胞生長達50%所需之濃度。較佳地，對欲考量其另供治療贅疣新生病害之可能用途而言，1C5〇値應小於100 μΜ。 Ε. 測定化合物是否謗導細胞凋亡於第二項另外具體實施例中，本發明之篩檢方法進一步涉及，測定該化合物是否會腫瘤細胞培養物中謗導細胞凋亡0 細胞死亡之兩種明顯形式，可以形態及生化條件加以描 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁} 訂---------線血經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 五、發明說明（35 ---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製述：壞死與凋亡。壞死係伴隨細胞質膜通透性增加；細胞腫脹及胞質膜於數分鐘内破裂。凋亡之特徵在於胞質膜長水疱、細胞質濃縮及内源性内切酶活化。於正常組織替換期間，及於器官與四肢之胚胎發育期間，自然地發生細胞凋亡。凋亡亦受細胞毒性τ•淋巴細胞與天然殺手細胞、受離子化照射作用及受特定化學治療藥劑所謗導。不適當之細胞凋亡調節作用，被認爲在許多包括癌症、AIDS、或愛耳玆海默氏症等生理病況上扮演重要角色。可使用保持於如上所述條件下之腫瘤細胞培養物，對化合物篩檢歧視否謗導細胞凋亡。以測試化合物處理細胞包含’於各種濃度下處理鋪滿-前或後之培養物達二至七天。於附著及κ漂浮”培養物部分中測量凋亡性細胞。該二部份係藉由將上清液去除、將附著之細胞以胰蛋白酶消化、並於離心洗滌步驟（10分鐘，2000 rpm )後將二製劑組合而收集得。以舒林酸及相關化合物處理腫瘤細胞培養物，以得到顯著量細胞凋亡之提案業經描述於文獻中。（參見，皮亞薩等人，#症碎.意’55:3110-3116, 1995, 併入本文作爲參考文獻）。新穎特點包括收集漂浮與附著細胞，確定供觀察細胞》周亡之取適處理時間與劑量範園，及確定最適細胞培養條件。於以化合物處理後，可於以吖啶燈及溴化乙啶標定後，藉由螢光顯微鏡分析培養物之細胞凋亡及細胞壞死。用於測量凋亡細胞數目之方法先前已由杜克與柯恩所描述， w細胞凋亡之形態及生化分析”克產荸之趨今廣#，柯力 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ►裝---- -丨_------^91. 1239837 A7 五、發明說明（36 ) 根等人編著，3·17·1-3·17.〗6( 1992,併入本文作爲參考文獻）。例如’可藉由以胰蛋白酶消化並於PBS中洗滌三次，而收集得啼浮與附著細胞。可將等分之細胞離心。然後可將沈積物再懸浮於培養基及含有吖啶橙及溴化乙啶，製備於 PBS<染料混合物中，並將其溫和地混合。然後可將混合物置於顯微鏡玻片上，並檢視細胞凋亡之形態特性。細胞凋亡亦可藉由測量，已受測試化合物處理細胞中之 DNA斷裂情形而加以量化。可利用市售供定量之光計量 EIA ’活體外測定細胞質中與組蛋白相結合之〇να片段（單 -與寡核小體）（細胞死亡偵測ELISAQkys，目錄編號 1，774,425 ’百靈佳英袼漢）。該百靈佳英格漢分析法係以夾層-酵素-免疫分析原理爲基礎，使用分別對抗dna與組蛋白之小鼠單株抗體。此使能於細胞胞溶產物之細胞質流份中，特異測定單-與寡核小體。根據廠商，係以下列方法測量細胞凋亡。將樣本（細胞胞溶產物）置於經鏈霉親和素·覆蓋之微滴定平盤（f，MTp”) 中。接著，將含抗-組蛋白-生物素與抗①NA過氧化酶共軛物之混合物加入，並培育達兩小時。於培育期間，抗組蛋白抗體與核小體之組蛋白-組成結合，並同時藉由其生物素醯化作用，將免疫複合物固定至經鏈霉親和素_覆蓋 (MTP上。另外，抗_DNA過氧化酶抗體與核小體之組成反應。待經由洗滌步驟除去未結合之抗體後，以留存在免疫複合物中之過氧化酶定量核小體之量。以abts7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------1T----------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 39- 1239837 A7 __________B7___ 五、發明說明（37 ) (2,2’_疊氮-[3·乙基苯幷噻唑啉-磺酸鹽])做爲受質，經光計量方法測定過氧化酶。例如，將SW-480結腸腺癌細胞以10,〇〇〇個細胞每槽之实度平佈於96-槽MTP中。然後將細胞以測試化合物處理，並令其於37 C下培育48小時。待培育後，將MTp離心，並將上清液去除。然後將各槽中之細胞沈積物再懸浮於溶解緩衝液中30分鐘。然後將胞溶產物離心，並將等分上清液 (亦即，胞質部分）轉移至經鏈霉親和素-覆蓋<Μτρ中。小心切勿搖盪ΜΤΡ中已溶解之沈積物（亦即含有高分子量、斷裂DNA之細胞核）。然後分析樣本。於已知濃度下測定各化合物之倍數刺激作用（FS = 〇Dmax/ODveh) ’其微凋亡性反應之一項指標。亦可藉由評估一系列濃度之測試化合物，而測定得EC5()値。於統計學上顯著增加細胞凋亡（亦即於i 濃度下達大於2倍刺激作用），爲該化合物可用於治療贅疣新生病菩之另一項指標。較佳地，對欲進一步考量其供治療贅疲新生病害之可能用途而言，對應凋亡活性之ec5()値應小於 100 μΜ。ECso在此定義爲，相對於載劑處理組導致5〇%謗導細胞凋亡之濃度。 F ·乳腺器官培養模式試驗可對經上述方法鑑定得之測試化合物，藉由彼等於乳腺器官培養系統中抑制前-贅疣新生病害發生之能力。此小鼠乳腺器官培養技術，已成功地由其他研究者用於研究已知抗贅疣劑例如特定NSAIDs、類視黃酸、他莫昔芬、硒 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1111111 1111111. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（38 與特定天然產物之功效，且可用於確認本發明之篩檢方法0 例如，可每天以含雌二醇與孕酮之組合物處理雌性 BALB/c小鼠，以預備負責於活體外供給激素之腺體。將動物犧牲，並將胸乳腺於無菌下切出，並於補充以騰島素、催乳激素、氫化可的松、及醛错酮之生長培養基中培育十天。將DMBA( 7，12-二甲基苯并蔥）加至培養基中f 以誘導前惡性病害形成。然後將完全發育之腺體除去催乳激素、氫化可的松及醛错酮，導致腺體復原而非造成前惡性病害。 & 將測試化合物溶於DMSO中，並於培養期間持續加入培養物中。於培養終了，將腺體固定於1〇%福馬林中，以; 馨腦脂紅染色，並鑲置於玻片上。形成乳病害之發生，爲該等具有乳病害腺體對無病害腺體之比例。比較受測試化合物處理腺體與未經處理腺體中之乳病害發生。可藉由將腺體影像投射於診斷墊板上，而定量被乳病害占據區域之程度。於該墊板上標示出被腺體覆嘗之面積，並認爲係100%面積。亦於墊板上標示出由各未復原構迕覆蓋之空間，並以電腦量化之。實驗結果將許多化合物於各種實驗方案中進行測試，並篩選立於治療贅疣新生方面之可能用途。此等測試之結果經報告於下。以下以字母碼所指定之化合物相當於下列者· 口 A-外消旋-蘇.⑻ΚΝ,Ν，-二乙胺基乙疏基）小（丁- -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ,!卜------f——-IT-——s. (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（39 1’，4、内酯幷）-[3’54’：1,2]-6-氟-2-甲基-3-(對-甲颯基亞苄基）-茚； (Z)-5-氟-2-甲基-(3,4,5-三甲氧基亞苄基）-3-乙酸； C- (Ζ)-5·氟_2_甲基-]μ(對-氯亞芊基）·3_乙酸，· D·外消旋-0)-1-(丁_1，,4匕内酯幷）-[3，，4’：1，2]-6-氟-2- 甲基-3-(對-甲砜基亞苄基）_1S_氫茚基·Ν-乙醯基半胱胺酸； (Z )-5-氟-2-甲基_ι·(3,4,5-三甲氧基亞爷基）-3-氫印基乙醯胺，N-苄基； F· (Z)-5-氟-2-甲基· (對-甲颯基亞苄基）-3-氫茚基乙醯胺，N，N，-二環己基； G-核-(£)-1-喧味幷-[2，，3’：1，，，3”]-1-(丁-1’，4’-内酯幷）-[3’，4’：1，2]·6·氟-2-甲基(對-甲颯基亞苄基）·茚；及 Η_ 外消旋_$)-1-(丁_1，，4，-内酯并）_[3’，4’：1，2]-6-氟-2· 甲基-3-(對·甲颯基亞苄基）-1S-氳茚基_谷胱甘肽；堂施例卜COX抑制分析根據前述之C0X分析方案，對參考化合物及測試化合物分析其COX抑制活性。圖4列示各種不同濃度舒林酸硫化物或依席舒林對經純化環加氧酶（第1型）活性之影響。環加氧酶活性係使用如前所述（米契爾等人，前述）得自公羊精囊之純化環加氧酶測定得。計算得舒林酸硫化物之 IC5〇値爲大約1·76 μΜ，而依席舒林之IC50値大於10,000 μΜ。此等數據顯示舒林酸硫化物（而非依席舒林）爲一 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1239837 A7 B7 五、發明說明（40 種COX-Ι抑制劑。對於c〇x_2同功酶（湯普森等人癌症協會期刊，87:1259·126(), 1995 )，亦得到類似數據。圖5列示測試化合物Β&Ε對於c〇x抑制作用之影響。如圖4中所示化合物般測定得c〇x活性。數據顯示二二試= 合物B及E顯然皆不抑制cox-ι。表2 一系列化合物之環加氧酶抑制活性參考化合物峭哚美心 MY5445 舒林酸硫化物依席舒林於100 μΜ下之作用 95 94 97 <25 測試化合物於100 μΜΤ之％^|>|作用 A <25 B <25 C 87 D <25 E <25 裝 it!! — 訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製根據前述之實驗方案，評估化合物Α至Ε之〇χ抑制活性’其經報告於上表2中。發現化合物C於100 μΜ劑量下，可抑制COX大於25%，且因此毋需再做進一步篩檢。實施例2- cGMP PDE抑制分析根據前述之分析方案，對參考化合物及測試化合物分析其cGMP PDE抑制活性。圖6列示各種不同濃度之舒林酸硫 43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（41 ) 化物或依席舒林，如前所述（湯普森等人，前述）對自人類結腸HT-29經培養腫瘤細胞所純化得PDE4或cGMP PDE 活性之影響。舒林酸硫化物抑制PDE4之IC5G値爲41 μΜ，而抑制cGMP PDE之IC5〇値爲17 μΜ。依席舒林抑制PDE4 之IC5〇値爲181 μΜ，而抑制cGMP PDE之IC5〇値爲56 μΜ。此等數據顯示舒林酸硫化物及依席舒林皆會抑制磷酸二酯酶活性。該二化合物顯示cGMP PDE同功酶形式對PDE4 同功型之選擇性。圖7列示舒林酸硫化物對cGMP或cAMP產量之影響，其係於HT-29細胞中根據前述之分析測定得。將HT-29細胞以舒林酸硫化物處理30分鐘，並藉由習知放射免疫分析方法測量cGMP或cAMP量。如所示，舒林酸硫化物增加cGMP 之量超過50%，其EC50値爲7·3μΜ(圖7A) acAMP之量並不受處理影響，雖然已知PDE4抑制劑（咯利普藍）會增加cAMP(圖7B)。數據證明抑制cGMPPDE較抑制PDE4 具有藥理學顯著性。圖8列示所指定劑量之測試化合物B對磷酸二酯酶之 cGMP PDE或PDE4同功酶的功效。計算得對cGMP PDE之 IC5〇値爲 18 μΜ，而對 PDE4之 IC5〇値爲 58 μΜ。圖9列示所指定劑量之測試化合物Ε對PDE4或GMP PDE 的功效。計算得對cGMP PDE之IC5〇値爲0.08 μΜ，而對PDE4 之IC5G値爲25 μΜ。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------tr·---------· 1239837 Α7 Β7 五、發明說明（表3 一系列化合物中之cGMP PDEUti活性 <哚美心 ^ MY5445 舒林酸繞化物依席舒林測試化合物

A B C D E 如前述之分析方案，對表3中上述之化合物評估pDE抑制活性。該等不會抑制COX之化合物中，僅發現化合物£ 於10 μΜ下造成大於50%抑制作用。如圖8中所示，化合物 Β於20 μΜ下展現大於50%抑制作用。因此，視單一劑量試驗中所使用之劑量;辰度而足，可篩檢出某些可能於稍較高劑量下具活性之化合物。所使用爻劍县&& — α „ π此 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------tT*--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 • ▼ ▼门>»主Μ令规日7 ，五1 月匕於某種用以鑑定更具潛力化合物之濃度下發現活性化合物之後將其降低。實施例3 -細胞调亡分析根據前述之分析方案，對參考化合物及測試化合物分析其新穎PDE抑制活性。根據該等實驗方案，圖1 〇列示舒林 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 A7 ___________Β7 ___ 五、發明說明（43 ) 酸硫化物及依席舒林對細胞凋亡及壞死性細胞死亡之影響。將HT-29細胞以所指定劑量之舒林酸硫化物或依席舒林處理六天。事先測定細胞凋亡及壞死性細胞死亡（杜克與柯恩，於免疫學現今實驗方案，3.17.1_3·17.16，紐約，約翰威利父子，1992 )。數據顯示，舒林酸硫化物及依席舒林皆能夠造成細胞凋亡，而不會謗導壞死性細胞死亡。所有數據皆收集自相同之實驗。圖12列示化合物ε之細胞凋亡謗導特性。將ΗΤ-29結腸腺癌細胞以所指定濃度之化合物Ε處理48小時，並藉由 DNA斷裂分析測定其細胞凋亡。所計算得之ec5G値爲0.05 μΜ。圖12列示化合物β之細胞凋亡謗導特性。將ΗΤ-29結腸腺癌細胞以所指定濃度之化合物Β處理48小時，並藉由 DNA斷裂分析測定其細胞凋亡。所計算得之EC5G値爲175 μΜ 〇表4 _二彳化合物中之細胞凋亡·謗導活性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 -------訂--------- 參考化合物經濟部智慧財產局員工消費合作社印製弓1味美心 MY5445 舒林酸硫化物依席舒林 E4021 扎普司特於100 μΜ下之摺疊謗導作用 < 2.0 4.7 7.9 < < < 2.0 2.0 2.0 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 2取公爱） 1239837 A7 B7 五、發明說明（44)

息丹那非 EHNA < 2.0 < 2.0 測試化合物於100上y下之摺疊謗導作用

A B C D E < 2.0 3.4 5.6 <2.0 4.6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製根據前述之摺疊謗導方案，測試化合物A至e之細胞凋 c謗導活性，其經報告於上表4中。化合物B、C及E於100 μΜ劑量下’展現顯著之細胞凋亡謗導活性，即大於2.0倍。此三種化合物中，於此劑量下僅化合物Β與Ε不會抑制 C0X ’但是會抑制cGMP-特異性之PDE。測定一系列磷酸二酯酶抑制劑之細胞凋亡-謗導活性。該等數據列示於下表5中。將HT-29細胞以各種磷酸二酯酶抑制劑處理六天。根據前述之分析方法，測定經吖啶橙及溪化乙淀標定後之細胞凋亡及細胞壞死。數據顯示，該新穎之cGMP-特異性pde可用於篩檢謗導HT-29細胞之細胞调亡的化合物。表5 PDE抑制劑之細胞凋亡-謗導數據 _ 抑制劑_經報導之選擇性％細胞凋亡％細胞壞g 載劑 8 6 8-甲氧基-IBMX PDE1 2 1 -47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239837 A7 B7 五、發明說明（45 抑制劑經報導之選擇性 %細胞凋亡 %細胞壞米力農 PDE3 18 0 RO-20-1724 PDE4 11 2 MY5445 PDE5 80 5 IBMX 無選擇性 4 13 實施例4·生長抑制分析 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 根據前述之分析方案，對參考化合物及測試化合物分析其PDE5抑制活性。圖14列示各種不同濃度之舒林酸硫化物或依席舒林，對ΗΤ·29細胞生長之抑制功效。將ΗΤ-29 細胞以各種所指定劑量之依席舒林（三角形）或舒林酸硫化物（正方形）處理六天。藉由先前所述之硫若丹明分析 (皮亞薩等人，癌症砰究，55: 3110-3116，1995 )測量細胞數量。舒林酸硫化物之IC5G値爲大約45 μΜ，而依席舒林之ICw値大約爲200 μΜ。數據顯示舒林酸硫化物與依席舒林皆能夠抑制腫瘤細胞生長。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖15列示舒林酸硫化物之生長抑制及細胞凋亡-謗導活性。列示一項時間過程實驗，其包含將ΗΤ-29細胞以載劑、〇· 1% DMSO (空心標記）或舒林酸硫化物，120 μΜ (實心標記）處理。藉由於台盼藍染色後計數存活細胞，以測量生長抑制作用（15 Α上部）。如先前所述藉由以經吖啶橙及溴化乙啶染色後之形態學上測定而測量細胞凋亡（杜克與柯恩，於免疫學現今實驗方案，3.17·卜3.17.16,紐约，約翰威利父子，1992 )。數據證明，舒林酸硫化物能夠抑制腫瘤細胞生長，且該功效伴隨細胞凋亡增加。所有數據 -48 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 A7 五、發明說明（46 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製皆收集自相同之實驗。圖16列7F化合物£之細胞凋亡謗導特性。將HT_29結腸腺癌細胞以所指疋濃度之化合物£處理六天，並藉由SRB 分析測定細胞數量。所計算得之IC5。値爲〇.〇4μΜ。表6 —彳化合之生長·抑制法* 參考化合物於1 00 μΜ下之摺疊謗導作用啕哚美心 75 MY5445 88 舒林酸硫化物 88 依席舒林 <50 E4021 <50 息丹那非 <50 扎普司特 <50 測試化合物於100 μΜ下之摺疊謗導作用 A 68 B 77 C 80 D 78 E 62 根據前段所述之篩檢方案，測試化合物Α至Ε之生長抑制活性，其經報告於上表6中 μΜ單一劑量測試之活性。。所有化合物皆展現超過丨〇〇測定一系列磷酸二酯酶抑制劑之生長抑制活性。該等數 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--------- -49 - 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（47) 據列示於下表7中。將HT-29細胞以各種磷酸二酯酶抑制劑處理6天。藉由前述之SRB分析測定細胞數量。下表及前述之數據顯示，新穎PDE抑制劑可有效抑制腫瘤細胞生長。表7 PDE本卩制劑之生長扣卩制數據_ 抑制劑經報導之選擇性生長抑制 (ic50，μΜ) 8-甲氧基·ΙΒΜΧ PDE1 > 200 μΜ 米力農 PDE3 > 200 μΜ RO-20-1724 PDE4 > 200 μΜ ΜΥ5445 PDE5 5 μΜ ΙΒΜΧ 無選擇性 > 100 μΜ 扎普司特 PDE5 > 100 μΜ 息丹那非 PDE5 > 100 μΜ Ε4021 PDE5 > 100 μΜ 爲顯示此篩檢方法於各種形式贅疲新生上之功效，遂將化合物於許多細胞系上進行測試。測定舒林酸硫化物與依席舒林對各種細胞系之作用。數據列示於下表8中。藉由 SRB分析測定IC5G値。數據顯示此等化合物對廣範圍之贅疣新生具有廣泛之功效，且係於可比較之劑量範圍下。因此，經由本發明鑑定及篩選得之化合物，應可用於治療多重形式之贅疣新生。 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝--------訂---------· 1239837 A7 B7 五、發明說明（48) 表8 各種細胞系之峰县抽剎數據細胞類型/ ic5〇 (μΜ) 組織特異性舒林酸硫化物 ^---- 化合物E* HT-29，結腸 60 120 0.10 HCTU6，結腸 45 90 MCF7/S，乳房 30 90 UACC375，黑素瘤 50 100 A_427，肺 90 130 支氣管上皮細胞 30 90 NRK，腎（非經ras-轉化） 50 180 KNRK，腎（經ras·轉化） 60 240 人類前列腺癌PC3 82 0.90 Colo 205 1.62 DU-145 0.10 HCT -15 0.60 MDA-MB-231 0.08 MDA-MB-435 0.04 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 *藉由如許米德等人，於Proc· AACR卷39,第195頁（1998) 所述之天然紅分析測定得。實施例5 -於乳腺器官培養物模式中之活性圖17列示於乳腺器官培養物中由舒林酸代謝物所產生對前惡性病害的抑制作用。乳腺器官培養物實驗係如先前所述完成（梅塔與牧恩，；#症部粟，46:5832-5835，1986 )。 -51 - 本紙適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公f ) " 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（49) 結果證明，舒林酸與依席舒林能夠有效抑制前惡性病害形成，而舒林酸硫化物並不具有活性。該數據支持一項，環加氧酶抑制作用並非所希望化合物之抗-贅疢*新生特性所必需的假説。分析爲篩選用於治療贅疣新生之化合物，本發明提供用以比較得自數種方案之測試化合物實驗數據。於本發明之架構中，可將測試化合物根據彼等可能用於治療人類贅疲新生之用途進行分類。可篩選該等具有所希望功效之化合物進一步測試並後續用於人類。各種測試化合物及數種方案之定量數據，經列示於下表 9中。數據顯示，依席舒林、化合物B及化合物E呈現可通過四項分析篩檢之適當活性：缺乏COX抑制作用，且表現有效之cGMP-特異性PDE抑制作用，生長抑制及細胞凋亡謗導作用。此等化合物於乳腺器官培養物中之活性，認同本發明之功效。篩選方案之定量評估，表示以化合物E最佳，其次爲化合物B然後爲依席舒林。表9 各種化合物之活性概廓_ 化合物 COX PDE 生長乳腺器抑制作用抑制作用抑制作用細胞凋亡官培養物依席舒林 - + + + + + + + + + 舒林酸硫化物+ + + + + + + + + + + + + MY5445 + + + + + + + + + + + + + + -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝--------tT----------*5^^- · 1239837 A7 B7 五、發明說明（5Q) 化合物 COX PDE 生長乳腺器抑制作用抑制作用抑制作用細胞凋亡官培養物 A - - + + + + + + + B - + + + + + + + + + + + D - - + + - - E - + + + + + + + + + + + + + + + + F - - + + + - G 顆 - + + + + + + + + Η 麵 + + 賺 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表9符號：以評估一系列包含供最大活性及功效之試驗的實驗爲主之化合物活性。 •不具活性 +稍具活性 + +具中等量活性 + + +具強活性 + + + +具高度活性亦揭示用於PKG活性之新穎分析法，其係用於篩撿本發明之方法，但是亦具有較普遍用於爲其他目的（例如用於研究PKG於正常細胞功能上之角色）分析PKG活性之有用性。爲解釋之目的，首先有用地在描述PKG活性如何可用於確定一化合物是否可能用於治療贅疲新生，的藥物評估方面之前先描述該項PKG分析。新穎之PKG分析本發明之新穎PKG分析法包含，將多數胺基酸序列（各 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（）至少含有cGMP結合功能域及第5類磷酸二酯酶（"PDE5”) 之磷酸化部位）結合至固相。該序列爲已知’且經描述於下文之文獻中。較佳地’該經結合之PDE5序列並不包括如下所述之PDE5催化性功能域。一種將PDE5序列結合至固相之方法爲，使該等序列表現呈含該PDE5序列與胺基酸結合對中一成員之融合蛋白質’並將胺基酸結合對中另一成員以化學方法鍵聯至固相（例如珠粒）上。其中可被利用之結合對爲谷胱甘肽s-轉移酶（”GST”)及谷胱甘肽 (，，GSH")，該GST經表現呈一種與上述PDE5序列所成之融合蛋白質，且GSH係共價地結合至固相。於此融合作用中，可簡單地藉由將含有該融合蛋白質之溶液通過如下所述之固相，而使該PDE5序列/GST融合蛋白質結合至固相上。使用以自牛PDE5ACDNA序列（力身答等人，J. Biol· Chem· 268，22863-22873，1993 )，所設計得前向與反向引子進行之RT-PCR方法，獲得PDE5之 cGB功能域，並於PDE 1-10家族中進行篩選。與HT-29細胞共同使用用於抽取總體RNA之5，-3’市售套組，並接著以寡聚（dT)管柱純化mRNA。使用前向引子（GAA-TTC-TGT -TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G，203-227)與反向引子（CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTOCTC-TGC-TG， 1664-1686)合成編碼人類PDE5A之磷酸化部位及低與高親和性 cGMP結合部位（103-1686 bp，CGB-PDE5)之 1484 bp 片段。該所合成得之CGB-PDE5核苷酸片段編碼，與牛 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------tr·---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 五、發明說明（52) PDE5A具有97%相似度之494胺基酸。然後將其選殖入具有tac啓動子，及EcoRI與Xhol切割位點之pGEX-5X-3谷胱甘肽S-轉移酶（GST)融合載體（法瑪西雅生物技術公司）中。然後將該融合載體轉感染入大腸桿菌BL21 (DE3)細菌 (因維托金）中。將經轉感染之BL2 1細菌生長至對數期，然後將IPTG加入做爲謗導劑。於20°C下進行謗導作用達24 小時。收集細菌並將其溶解。將可溶性胞溶產物與經GSH 共軛之瓊脂糖4B ( GSH-瓊脂糖4B)進行培育。該GST-CGB-PDE5融合蛋白質可與GSH-瓊脂糖珠粒結合，而其他蛋白質可以過量冰PBS自珠粒洗下。該經表現之GST-CGB-PDE5融合蛋白質於7.5% SDS· PAGE凝膠上呈現爲85 Kd蛋白質。其特徵在於與cGMP結合，以及由蛋白激酶G與A所進行之磷酸化作用。其呈現兩處cGMP結合部位，且Kd爲1.6土0.2 μΜ，其値接近於天然牛PDE5之Kd爲1.3 μΜ。位於經GSH共軛之瓊脂糖珠粒上的GST-CGB-PDE5可於活體外經由cGMP-依賴型蛋白激酶與cAMP-依賴型蛋白激酶A進行磷酸化作用。由PKG所進行GST_cGB-PDE5磷酸化作用之匕^爲2.7 μΜ且Vmax爲 2.8μΜ，而BPDEtide磷酸化作用之Km爲68 μΜ。由PKG所進行之磷酸化作用顯示係將一分子磷酸併入一個GST-CGB-PDE5蛋白質中。使用如上所述經PDE5-結合之固相分析據信含有PKG之液體樣本，係將該樣本及該固相與含有32Ρ-γ-ΑΤΡ之磷酸化作用緩衝液混合。將該溶液於30°C下培育30分鐘，以使 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝--------1T---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 Α7 、發明說明（53 把發生由PKG所進行之PDE5序列磷酸化作用，若有Pkg 存在樣本中。然後將固相自溶液分離出（例如藉由離心或過濾法），並以磷酸-緩衝食鹽水（”PBS，，）洗滌，以除去任何殘餘之溶液，並去除任何尚未經反應之32ρ_Υ_Ατρ。然後將該固相直接進行測試（例如藉由液態閃爍計數器）確定是否併入32P。若確實如此，則表示該樣本含有 pKG，因爲PKG會將PDE5磷酸化。若pDE5係經由融合蛋白質進行結合（如上所述），則含有PI)E5之融合蛋白質 $可以SDS緩衝液自該固相溶析出，並可分析該溶析液分析 p之併入。可將經磷酸化之融合蛋白質以SDS緩衝液自該固相溶析出，並進一步藉由電泳術進行解析。若完成凝膠分離作用，可將蛋白質染色以看出該蛋白質之所在位置，並可藉由對該凝膠曝光之X-射線底片，測出該融合蛋白質 PDE5部分經PKG進行之32P磷酸化作用。若於1射線底片上可見到32P訊號，則表示PKG存在於該含有PKG之原始樣本中’其可將自固相溶析出融合蛋白質之1>£^5部分進行瑪酸化作用。較佳地於該項分析中，吾人應將過量（例如，1〇〇倍）特異且有效地抑制蛋白激酶A ("PKA”），而不會抑制pKG 之蛋白激酶抑制劑加至該分析中。可希望抑制ρκΑ，因爲其可能促使PKG受質（例如PDE5 )之磷酸化作用。藉由添加ΡΚΙ，將可消除任何由ρκΑ造成之磷酸化作用，且所侦測得之任何磷酸化作用可由於僅PKG之作用而較高。可製得供本發明分析使用之套組，該套組含有下列存於 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------tr----------. -56- 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（54) 分開容器中之預先包裝試劑·· 1. 細胞溶解緩衝液：50 mM Tris-Ηα，1%ΝΡ-40，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM Na3V〇4，1 mM NaF， 5 00 μΜ IBMX，蛋白酶抑制劑。 2. 蛋白質激酶G固相受質：重組型GST-CGB-PDE5結合瓊脂糖4B (50%漿液）。 3. 2 X磷酸化緩衝液:32Ρ-γ-ΑΤΡ (3000毫居里/毫莫耳，5-10 爲居里 /分析），10 mM ΚΗ2Ρ〇4, 10 Κ2ΗΡ〇4， 200 μΜ ATP，5 MgCl2。 4. PKA蛋白激酶I抑制劑。該套組中亦可包括其中用以進行上述反應之可棄式容器等類。综上所述，習於分析技藝之人士將容易地想像各種適用於其他形式所述之分析形式。簡言之，使用至少一部分 PDE5(或任何其他可被PKG選擇性磷酸化之蛋白質），可藉由評估可嶙酸化蛋白質之嶙酸化作用（使用經標定之磷酸化試劑），而確定PKG之存在及所含之相對量（相較於對照組）。 SAANDs增加贅疣新生細胞中之PKG活性使用上述之PKG分析完成下述實驗，以確立由於受 SAAND處理之贅疣細胞中的PKG表現增加或CGMP濃度增加，而使得SAANDs增加PKG活性。測試程序對兩不同類型PDE抑制劑評估其對存在贅疣細胞中之 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝--------tT----------^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1239837 _B7_ 五、發明說明（55 ) PKG的作用。評估一種SAAND (依席舒林），因其爲抗-贅疣新生劑。亦評估非-SAAND類PDE5抑制劑（E4021)，以確定PKG升高是否純粹係由於典型PDE5抑制作用，或PKG 升高是否涉及SAANDs對PDE5及揭示於美國專利申請案 09/173,3 75 (劉等人，申請日爲1998年10月15日）中之新穎PDE抑制作用的前·細胞凋亡性作用。爲測試cGMP-特異性PDE抑制作用對含有APC突變之贅疣新生之影響，故使用SW480結腸癌細胞。SW 480已知含有APC突變。將大約5百萬個存在RPMI 5%血清中之SW480 細胞加至各8培養盤中： 2· 10公分培養盤一-3 0微升DMSO載劑對照組（無添加藥劑）， 3-1〇公分培養盤一-2〇〇0]^[、4〇〇0?^、6〇(^]^依席舒林存在DMSO中，及 3-10 公分培養盤一-E4021 ; 0.1 μΜ、1 μΜ、10 μΜ 存在 DMSO中。將各培養盤於37°C下，於5% C02培養箱中培育48小時。將液體培養基自培養盤中吸出（細胞本身附著於培養盤上）。將附著之細胞於各培養盤中以冰PBS洗滌，並將200 微升細胞溶解缓衝液（亦即，50mMTris-HCn，1%ΝΡ-40， 150 mM NaCI，1 mM EDTA，1 mM Na3V04，1 mM NaF， 500 μΜ IBMX，蛋白酶抑制劑）加至各培養盤中。於將細胞溶解緩衝液後立刻將細胞碎片抽出各培養盤，而收集得已溶解之細胞。將得自各培養盤之細胞溶解產物轉移至微 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7

1239837 五、發明說明（56 ) 量離心管，並將該等微量離心管於代下培育15分鐘，同時溫和地擾動微量離心管以使細胞完全溶解。待溶解作用元成後’將微量離心管以全速（14，_rpm)離心15分鐘。將得自各微量離心管之上清液轉移至乾淨之微量中。 *然後對各微量離心管中之内容物進行蛋白質分析，因爲若該藥劑會抑制細胞生長，則對照組中之總蛋白質量會大於，存在經藥劑-處理樣本中者。顯然，若藥劑確實:有作用，則經藥劑-處理樣本中之總蛋白質量應實際上與對照組相同。於上述情況下，必需將對照組與e_4〇2i微量離心管稀釋，以使其規度化至經高劑量依席舒林_處理樣本 (幸父低劑量依席舒林組必須經規度化至最高劑量依席舒林樣本）。因此，待完成蛋白質分析後，必須將各種樣本之總蛋白質濃度規度化（例如藉由稀釋）。對於各藥劑濃度及對照組，進行兩項PKG分析，其一添加cGMP，而另一項不添加cGMp (詳述如下文）。進行此二種不同項PKG分析之原因在於，cGMP會特異性活化 PKG。當使用本發明之新穎PKG分析來分析pkg活性時，吾人並無法確定PKG活性之增加，是否係由於細胞中 cGMP增加（其可能因cGMP-特異性PDE抑制作用造成）所致，或該PKG活性程度係由於PKG蛋白質之表現增加所致。藉由於有或無添加CGMP下測定相同樣本中之PKG活性，吾人可確定PKG活性之增加（若有）是否係由於pKG 表現增加所致。因此，若抗-贅疲新生藥劑相對於對照組 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 裝tr----------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 -------- -B7 ：-------- 五、發明說明（57 ) 提升PKG活性，則吾人可確立是否該藥劑_所謗導之增加，係由於受藥劑-處理樣本中？&0蛋自質表現增加（而非活化作用）所致，若（1)具有超高cGMp之受藥劑_處理樣本，較超高cGMP之對照組樣本展現較大之pKG活性，以及（2) 無起间cGMP之受藥劑-處理樣本相對於對照組展現較大之PKG活性。於製備It有及操添加cGMP之平行樣本對後，將5〇微升各細胞溶解產物加至20微升上述之PDE5/GST固相受質漿液中。對於所欲進行評估之各對照組或藥劑細胞溶解產物樣本，係藉由添加含有10微居里32Ρ-γ_ΑΤΡ溶液（2〇〇 μΜ ATP，4.5 MgCl2 ; 5 mM ΚΗ2Ρ04，5 Κ2ΗΡ〇4)之磷酸化作用緩衝液加至各反應中而起始該反應。將所成之混合物於 3 0 C下培育3 0分鐘。然後將混合物離心以分離出固相，並將上清液丟棄。將各管中之固相以700微升冰pbs洗滌。將萊姆里樣本緩衝液（Bio_Rad)( 30微升）加入固相中。將混合物煮沸5分鐘，並加樣至7.5% SDS-PAGE上。將凝膠於 15 0 V下進行泳動一小時。將所得之條帶以考馬西藍染色，以顯現出85 Kd GST-PDE5融合蛋白質條帶（若存在）。將該凝膠乾燥，並將凝膠置於X-射線底片上，若PDE5經瑪酸化作用，則該底片將顯現出相對應之暗色條帶。各條帶之暗度相對於磷酸化作用程度。如圖18A與18B中所示，於有添加cGMP及無添加CGMP 之樣本中，相對於有或無超高cGMP之對照組樣本，SAAND 依席舒林使PKG活性以劑量-依賴性方式增加。以係經由 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（58) 於各藥劑-處理樣本出現較暗之85 Kd條帶而獲得證實。此外，經依席舒林處理之SW480樣本顯示，於分析中添加 cGMP時相較於單獨以依席舒林處理（亦即未添加cGMP ) 之樣本，具有較大PKG磷酸化作用活性。因此，經藥劑處理SW480樣本中PKG活性增加，並非僅由於當SAAND抑制 cGMP-特異性PKG時，細胞中之cGMP增加而使PKG活化，而於具有APC突變之贅疣中之PKG活性增加，亦由於PKG 表現增加所致。又，經E4021-處理之SW480樣本相較於對照組並未展現 PKG活化作用（參見圖18A與18B)，顯示含有APC突變之贅由中因SAANDs所造成之PKG活化作用增加，並非僅由於典型PDE5之抑制作用所致。除了如上所述之X-射線底片曝光法以外，可使用供評估 PKG活化作用之分析技術，以評估得自SDS page之85 Kd 條帶的磷酸化作用程度，其係藉由將該條帶自凝膠切下，並可經由設定於32P視窗之閃爍計數器（貝他），計讀所併入該已取出條帶中之32P量。爲測試cGMP-特異性PDE抑制作用對含有β-連環蛋白突變之贅疣之影響，遂使用HCT 116結腸癌細胞。HCT116已知含有β-連環蛋白突變，但已知不含有APC突變。使用與用於SW480中之相同程序生長HCT116細胞。於此實驗中，僅使用依席舒林與對照組。經依席舒林-處理之細胞產生，被磷酸化至較相對應之對照組更大程度的 PKG，表示PKG活化作用可發生於經藥劑-處理細胞中，而 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝--------tr*--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837

五、發明說明（59) 該等細胞與APC突變作用無關。因此，爲達本發明之目的，吾等於申請專利範圍中引述之減低的卜連環蛋白，，，係指該蛋白質之野生型及/或突變形式。丝j西方释所增加之PKG表現及所減低連環蛋白如上所證明’ SAANDs造成PKG表現增加及cGMP濃度增加’其一者皆導致受SAANDs-處理細胞中PKG活性增加。此PKG表現之增加，進一步以相對定量之西方點潰法（如下所述）證實。藉由以冰冷卻之PBS洗滌一次，而自微量離心管中收集如先前所述以依席舒林處理之SW480細胞。將細胞經由已修飾之RIPA緩衝液，伴隨攪動進行溶解達15分鐘。將細胞溶解產物於冷房中離心。將上清液於離心後立刻轉移至乾淨之微量離心管中。進行BioRad DC蛋白質分析（田庫拉， CA)以測定樣本中之蛋白質濃度。將樣本如上所述進行蛋白質濃度之規度化。將50微克各樣本加樣至i〇%SDS凝膠。進行SDS-PAGE，然後將蛋白質轉移至硝基纖維素膜上。將已轉潰之峭基纖維素膜於現配含有5%脱脂奶粉之TBST中，於室溫下伴隨持續攪動進行阻斷達一小時。將山羊-抗-PKG第一級抗體稀釋至所建議之濃度/稀釋於新鮮TBST/5%脱脂牛奶中。將該硝基纖維素膜置於第_ 級抗體溶液中，並於室溫下伴隨攪動進行培育達_小時。 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1239837 Α7 Β7 五、發明說明（60) 將硝基纖維素膜以TBST洗滌三次，每次十分鐘。將該硝基纖維素膜置於含有第二級經P〇I)共軛兔子抗-山羊抗體之溶液中’於室溫下伴隨攪動進行培育達一小時。將硝基纖維素膜以TBST洗滌三次，每次十分鐘。藉由使用百靈佳英格漢BM藍POD受質進行測定。如圖19中之圖示所説明，依席舒林造成卜連環蛋白減少及PKG增加’該等數據係由西方點潰分析獲得。將sw480 細胞以依席舒林或載劑（P/oDMSO)處理銘小時。將50微克各胞溶產物之上清液加樣至10% SDS-凝膠，並轉潰至硝基纖維素膜，然後將該膜以兔子-抗連環蛋白及兔子-抗_ PKG抗體爲探針進行探測。 gAANDs降低贅疣漸生細胞中之連環蛋白濃度此項觀察係藉由將SW480與200、400或600 μΜ依席舒林或載劑（1% DMSO)進行培養而達成。於處理後48小時收集細胞’並加以處理進行免疫轉潰。具免疫反應之蛋白質可以西方轉潰分析測定得。西方轉潰分析證明，β-連環蛋白之表現於經依席舒林處理細胞中，相較於對照組減少了 50%。此等結果表示，β·連環蛋白因SAANDs處理而減低。综合上述確定以此處理會增加PKG活性之結果，以及下述確定β-連環蛋白會受PKG磷酸化之結果，此等結果顯示，贊疲新生細胞中β -連環蛋白減少，係由PKG之活化作用所引發。因此’可使用使用贅疣新生細胞中之PKG活性做爲篩檢探針，以篩選出做爲抗_贅疣劑之化合物。 β-連環蛋白受PKG之磷酸化作用 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注咅？事項再填寫本頁) •裝-----'——τί---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 ____B7_ 五、發明說明（61 ) 於活魅’ PKG將β-連環蛋白磷酸化。確定此事件之實驗涉及將得自SW480細胞（未經任何藥劑處理）含有卜連環蛋白之複合物，以下文” β _連環蛋白免疫沈澱，，所述之方法進行免疫沈澱。將經免疫沈澱（而仍固定於固相（亦即珠粒）上）之複合物與32Ρ-γ-ΑΤΡ及純PKG (1〇〇單位）混合。製備相對應無添加pKG之對照組。藉由SDS緩衝液將蛋白質自固相釋出，並將含有蛋白質之混合物於7.5% SDS-page凝膠上進行電泳。於凝膠上進行之泳動可使過量之32Ρ-γ-ΑΤΡ從該混合物去除。於是，任何於93Kd β·連環蛋白條帶中所偵測得之32P-”atP係由於β_連環蛋白之嶙酸化結果D任何於經超高PKG處理之 93Kd β-連環蛋白條帶中所偵測得，相對於無超高ρκο對照組之32Ρ-γ-ΑΤΡ增加，係由於受處理條帶中β_連環蛋白之磷酸化結果。吾等所得結果爲，經超高PKG處理條帶中之麟酸化作用’相較於對照組（其具有最低、實際上無法偵測到之嶙酸化作用）時顯著增加。此結果表示，β_連環蛋白可被PKG 磷酸化。連環蛋白受PKG磷酸化之作用以HCT116細胞（其不含有APC突變，但是含有卜連環蛋白突變）進行上一節所述之相同程序。該等實驗之結果亦指示，突變型β_連環蛋白受PKG磷酸化。因此，對於本發明之目的，吾等於申請專利範圍所引述之β-連環蛋白磷酸化作用，係指該蛋白質之野生型及/或 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 一__B7_ 五、發明說明（62 ) 突變形式的磷酸化作用。 β-連環蛋白與PKG發生沈澱以前文西方點潰實驗中所述之相同方法，製備得SW480 與HCT 116細胞溶解產物之上清液。預先將細胞溶解產物藉由添加150微升蛋白質Α瓊脂糖珠粒漿液（50%)(每500 微克細胞溶解產物），並於4°C下置於試管搖蕩器上澄清化。藉由於14,000 X g下，於4°C離心10分鐘，而將蛋白質 A珠粒去除。將上清液轉移至乾淨之微量離心管中。以每 500微克細胞溶解產物，加入1〇微克兔子抗連環蛋白多株抗體（歐普史特生物科技，普拉席湖，紐約）。將細胞溶解產物/抗體混合物，溫和地於4°C下置於試管搖蕩器上混合2小時。藉由添加150微升蛋白質A瓊脂糖珠粒漿液；75 微升包裝珠粒），並藉由將混合物溫和地於4°C下置於試管搖蕩器上轉動而固定。藉由脈衝離心（置於微量離心機中於14,000 rpm下離心5秒）收集該等瓊脂糖珠粒。將上清液部分丟棄，並將珠粒以800微升冰-凍PBS緩衝液洗滌。將瓊脂糖珠粒再懸浮於150微升2 X樣本缓衝液中，並加以溫和地混合。將瓊脂糖珠粒煮沸5分鐘，以使免疫複合物與珠粒分離。藉由離心將珠粒收集，並將上清液進行 SDS-PAGE 分析。對上清液進行西方點潰分析，然後將膜以兔子_抗-卜連環蛋白抗體爲探針進行探測。接著將膜以TBST洗滌三次’每次十分鐘，以除去過量之抗-β_連環蛋白抗體。將共軏至山辣根過氧化酶之山羊抗-兔子抗體加入，隨後於 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐) ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------tr----------· 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（63) 室溫下進行培育達—小時。當完成培育後，吾人可以HRP0 受質顯現β-連環蛋白之存在。於此實驗中，吾等可明顯地顯示出β -連環蛋白之存在。爲偵測相同膜上之PKG，首先以含有2% SDS&i〇〇 μΜ 2β-鐃基乙醇之62 mM tris-HCl緩衝液（ρΗ 7 6)，於55。〇水浴中將抗-β-連環蛋白抗體共軛物進行剝除〇 5小時。然後將經清除之膜置於含有5%脱脂奶粉之TBST中，於室溫下伴隨持續授動進行阻斷達一小時。將已經阻斷、清除之膜以兔子抗-PKG多株抗體（卡爾生化公司，拉荷雅，ca ) 爲探針進行探測，將其以共軛至HRP〇之山羊抗-兔子第二級抗體進行偵測。以HRPO受質顯現轉潰膜上PKG之存在。事實上於此實驗中，可顯示出PKG。由於存在膜上之蛋白質僅爲該等可與細胞上清液中之β_連環蛋白進行免疫沈澱者，故此結果明顯地確定，PKG可以物理方式與本有細胞上清液中β-連環蛋白，之蛋白質複合物鍵聯。將該相同膜經清除後，亦以抗-GSO-β抗體爲探針進行探測，以確定其是否亦與β-連環蛋白共沈澱。於該項實驗中，吾等亦偵測到該膜上存在有GSK3-P，表示（^&3_|3會與GSO-β及PKG沈澱，暗示該三種蛋白質可能爲相同複合物之一部分。因爲GSO-β與β-連環蛋白於正常細胞中係形成APC複合物之一部分，表示PKG可能爲相同複合物之一部分，且可能涉及身爲該複合物一部分之β-連環蛋白的磷酸化作用。含有cGMP PDF抑制劑之抗-贅疣新生醫藥組合物 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) -裝--------tr*—-------- -66-

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、發明說明（64 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如上逑所説明，依席舒林爲一種呈現所希望抗-贅疣新 ^特性疋化合物。其做爲抗_贅疣新生劑之功效及用途業、！揭示於，已瞭解該化合物係藉由抑制贅疣新生細胞中之 CGMP•特異性刪活性而進行作用之前。尤其，本發明之篩選方法可用於篩檢供人類治療之化合 2於針對罹患贅疣新生之患者所進行的人類臨床試驗、獲得證明。於知曉依席舒林爲抗_贅疣新生劑（活體外）之ί實後，經由瞭解有許多所希望化合物確實符合本發明 <篩選條件，以該化合物於兩項人類臨床試驗中之成功個案確定亦可篩選出其他符合本發明篩選條件之化合物。如上所指7F，許多贅疣新生具有APC突變作用。尤其，，針對罹患、具有APC突變之贅疣新生患者所進行的二類臨床試驗中，證明本發明之篩選方法。 APC突變作用最先發現於具有遺傳性贅疣新生之患者，夕發性結腸腺癌C’APC”）。APC疾病特徵在於，發生在年齡爲十幾歲者，其結腸中出現數百至數千個息肉，而叙/口療法爲於2 0歲前以手術切除結腸。第一項臨床試驗包含罹患APC之患者。使用依席舒林。於該項研究中，各患者之結腸已被切除，惟保留鄰近直腸之結腸（連接腸之處）以保有直腸功能。然而，此類患者通常在剩餘結腸段中形成息肉，該等息肉必須定期去除（例如藉由電穿刺法）。 ~ 其中進行依席舒林篩選之試驗爲，經設計藉由比較由藥物及安慰劑處理組，歷時十二個月所形成新息肉之累積數 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（謂x 297 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 袭-----— — ·τι^------^ 1239837 五、發明說明（65 ) 量，以評估該藥劑之抗-贅疣新生特性。適任之病来爲咳等，於每年形成9至44個息肉者。於研究之初，二=== 結束後，以及於六個月結束時，將患者進行完全切除手術 (即將所有息肉去除）。該項研究係對三十四位可手術之患者進行。基於歷時一年後於每年病史上形成9至44=息肉之APC患者所形成息肉的評估平均數量，依席舒林在^ 床及統計學上，於減少息肉形成速率方面較安慰劑顯著更佳。基於該研究最初六個月間所產生息肉數量之中間値，以依席舒林處理之患者發展出息肉數，約爲以安慰劑處理 <患者息肉數的三分之一（平均値分別係9息肉/年及26息肉/年；ρ= 0.013 )。基於歷經該研究完整十二個月間所產生息肉數量之中間値，以依席舒林處理之患者生成出息肉數，約爲以士慰劑處理之患者息肉數的一半（平均値分別係18息肉/年及38息肉/年；ρ = 0 〇2〇)。亦對具有前列腺癌而其前列腺已被去除之男性患者，進仃另一項臨床試驗。該項研究係於具有可偵測pSA (前列腺特異性抗原）濃度於放射前列腺切除術後升高，表示前列腺癌再度發生之患者中進行。經濟部智慧財產局員工消費合 η 社印製針對96名患者進行該項前列腺癌評估：一項包含以5〇〇亳克/天量依席舒林投藥予藥劑·接受患者，之雙盲、安慰劑-對照組、多數-中心試驗。如下所述，該數據顯示於經依席舒林-處理組與安慰劑_處理組之間，在pSA濃度上具有統計學上顯著之差異。依席舒林_處理組中之PSA濃度，與安慰劑-處理組之PSA濃度相較時，顯著地被減少。雖然 -68 -:297公釐） 1239837 A7 B7 五、發明說明（66) PSA濃度升高本身並非—種疾錢況，但其在廣泛醫藥丑通性上，係做爲此㈣性前列腺癌再度發生之代表性標^ 指標。丁除了進行以整體依席舒林與安慰劑組間之平均psA濃度差異爲主的評估之外，中期分析亦包括子群分析。將該項研究中之患者，依其發展成轉移性疾病的危險性，區‘ 爲高、中及低度危險群。此分類係使用美國醫學協會 (J趣1999年，五月五日，第1591 97頁）中所建立之方法完成L爲確定何等研究患者符合何種危險群，不知何患者係以藥劑或安慰劑處理之研究員需要提供以醫藥病史二其根據以上所引述之公開方法，將研究患者區分至適當危險群中。統計分析顯示於高級巾度杨群巾，依席舒林與安慰劑處理患者間之平均psA濃度，具有統計學上的顯著差異。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製得自該前列腺研究之數據列示於下·· 表10 依席舒林對具有PSA升高男性中前列腺經前土】腺切除術的平均PSA濃彦乏斟鄕組別安慰劑依席舒林 ” P 總體 4.49 2.85 ---Γ假 0.0004 南度危險 4.98 2.91 0.0002 中度危險 6.24 2.95 0.005.1 A此等依席舒林試驗及數項其他包含依其他指示之藥劑的試驗中，係藉由偵測有害事件（AEs)、臨床實驗室研 -69 - 本紙張巾 _ 緒準(21Q x 297 i¥T-—-- 一裝--------tr---------. 1239837 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（67 究（血液學、血清化學、及尿液分析）、活體象徵（血壓、脈搏速率、呼吸速率、體溫及體重）、身體檢測及上視鏡評估安全性。 n 目前對超過400名患者以依席舒林進行之臨床試驗，證實尚未觀察到顯著之安全性發布。依席舒林並未證實任: 與習知化學療法相關連之血液惡質、劑量限制之二吐壬2 神經學上或腎臟毒性。其於活體象徵上，亦未造成任何= 床上的顯著改變。事實上，APC患者中針對息肉與結腸組織之成對活檢中發現，依席舒林增加息肉之細胞凋亡速率，但是對正常結腸組織則否，暗示其對正常組織具有最小影響。 /、取於上述之劑量下，測得最大耐受劑量（於具有部分結腸切除之患者MTD = 600亳克；於具有部分結腸切除之患者 MTD= 600亳克；於具有完整結腸之患者爲4〇〇毫克；於幼兒患者爲3 5 0耄克），所發現劑量限制之有害事件，僅於處理早期觀察到之肝功能試驗（Lfts)値增高。當實驗進行時，LFT升高可快速逆轉，且當劑量減少後亦不再增高。其他事件（例如，偶發性下腹疼痛）代表性地持續時間短，強度溫和至中度，且不需中斷或減低依席舒林劑量。簡言之’此等試驗證明依席舒林爲一種供臨床調理贅疲新生之有效、耐受性佳的慢性療法。因此，此等結果説明，篩選其他（尤其）抑制cGMP-特異性之PDE活性（以及符合本發明其他篩檢條件）之化合物，可產生於活體内爲治療上有效之藥劑。 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G χ 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 ----訂--------- 1239837 A7 五、發明說明（68 ) 第二種於發現其作用機制涉及cgmp抑制作用之前，且於已知其符合本發明篩檢條件之前，即已被發明之藥劑爲鹽酸（Ζ)·5·氟-2_甲基-(4-亞峨咬基）基）氫莽基乙醯胺（化合物I )。其業已於活體外及活體内評估中證明，可做爲對抗廣範圍贅疣新生活性之抗_贅疣新生劑。其於動物研究及於單一、漸增劑量人類研究中經證實爲安全。習於該項技藝人士應自以下所呈現之數據瞭解，化合物 I可安全地以遠高於習知化療劑或抗·贅疣新生nsaiDs之可耐受（且於許多個案中爲毒性）劑量給予動物。例如，於大鼠進行之確切毒性研究中，係以高於及包括2〇〇〇毫克 /公斤之化合物I單一口服劑量進行投藥，而未造成可觀察到之毒性徵狀。於4000毫克/公斤下，體重稍微減輕。以腹膜内施予1000亳克/公斤劑量造成體重減輕，且將此組動物解剖發現其中有些具有腸系膜沾黏。 —於、犬頒中，以1000晕克/公斤存於膠囊中之化合物I投樂，並未對單一組含有兩雄性及兩雄性狗產生毒性徵狀。由於化合物〖膠囊之特性，此劑量需要對各動物使用至少 13個膠囊’其經校正爲對動物個體未造成迫害之最大數値。因此，依序投藥七次爲1〇〇〇毫克/公斤/天之相同劑量。各施予劑量階段皆未觀察到與藥劑相關之作用徵狀。口此、以單劑量爲基礎，化合物I實際上並不具有毒 =基=此等研％之發現，化合物!之口服叫。被認爲大 ;1〇〇〇毫克/公斤（犬類中）及4〇〇〇亳克/公斤（大鼠中），而腹膜内她藥LD50被認爲大於1000毫克/公斤（大鼠中）。 -71 本紙張尺錢财® x 297公釐） 1239837 A7

五、發明說明（69 ) 於大鼠進行之七天劑量調查研究中，係藉由將化合物j 以〇、50、500或2000毫克/公斤/天之劑量投藥進行評估，其於50毫克/公斤/天下並未觀察到毒性徵狀。於5〇〇亳克/ A斤/天下’與處理相關之影響限定於雌性大鼠中絕對及相對肝重量。於2〇〇〇毫克/公斤/天下，影響包括於雌性大鼠中呼吸沈重與/或呼吸聲異常、體重減輕及攝食減少，而於雄性大鼠則爲肝重量增加。於任一劑量下，皆未觀察到血液學上或血液化學之變化，或任何顯微鏡下病徵。亦於0、50、500或2000毫克/公斤/天之劑量下，於大鼠進行28-天研究。對於CP-461並未觀察到異常之臨床徵狀，且體重變化、檢眼鏡測試、血液學上或血液化學値及尿液分析檢查變化皆不顯著。於解剖後未觀察到據關之組織變化。器官重量數據顯示，於2〇〇〇毫克/公斤/天下，肝重量於統計學上顯著增加，且對於2〇〇〇毫克/公斤/天實驗组’甲狀腺重量於統計學上顯著增加。低劑量下之輕微增加’於統計學上並不顯著。組織之組織病理學評估指示存在濾泡細胞肥大之痕跡，甲狀腺體中有絲分裂數値增加 (表示可能有細胞增殖現象），及肝中輕微的小葉中區肥大。此等變化一般限定於少數接受2000毫克/公斤/天之動物’雖然於500¾克/公斤/天下有一隻雌性氣之甲狀腺體中有絲分裂數値增加。於肝中之發現可爲微小體酵素受非常輕微刺激，而導致甲狀腺激素代謝增加，且後續造成甲狀腺刺激之指標。因此，習於該項技藝人士應瞭解，此等影響若與所預期於相當劑量之習用化療劑或NSAIDs之影響 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

- ---— II β--I I I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（70) 相較時，則顯得非常小。爲進一步確定化合物I之安全性概廓，遂進行研究以評估前列腺癌細胞系疣化合物所謗導之鈿胞凋亡，是否可與其對衍生自正常組織之前列腺上皮細胞造成的影響相比。使雄激素-敏感性前列腺腫瘤細胞系，LNCaP (得自 ATCC (洛克菲勒，MD))於使用含有5〇/〇胎牛血清與2 mM 谷胺醯胺之RPMI 160培養基的標準條件下增殖。將衍生自正常前列腺（得自克隆技術公司（聖地牙哥，CA))之初生前列腺上皮細胞培養物（PrEC)，於與腫瘤細胞系相同之條件下生長，惟其使用適於此類培養物生長所使用之無-血 β培養基（克隆技術公司）。對於該等實驗，係將LNCaP 或PrEC細胞以每槽含10,000個細胞之密度，接種於96槽中。經24小時後，將細胞以載劑DMSO)或50 μΜ溶解於DMSO之化合物ι(自由驗）處理。經各種藥劑處理時間 (4、24、48、72或99小時）後，將細胞溶解，並加以處理以測量與組蛋白相結合之DNA，做爲編程性細胞死亡之指標（參見，皮亞薩等人，癌症砑龙57:2452-2459，1997 )。圖27列示經50 μΜ化合物1(自由鹼）處理後之LNCaP細胞培養物中，與組蛋白相連結DNA片段量隨時間的增加。於處理後24小時偵測成片段DNA之顯著增加，且謗導作用持續至連續處理之4天。相反地，PrEC( ”正常，，前列腺）細胞以化合物I ( 5 〇 μΜ )之處理，對於至多達4天之處理並不影響DNA斷裂。此等結果證明其選擇性謗導贅疣新生細胞之凋亡，而不謗導正常細胞凋亡。此與習知會謗導快 -73' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1239837 A7 五、發明說明（71 ) 速生長正常細胞，及贅疣新生細胞凋亡之化學治療劑相反。最後如對於安全性者，於一項其中藥劑採口服方式之單、漸增劑量人類臨床試驗中，化合物I於任何劑量，包括阿於所預斯產生抗·癌功效所需之濃度的劑量，下皆無產生顯著副作用。如上所指示，化合物1亦呈現有效抗-贅疣新生特性。對於化合物I所得之生長抑制1(：5〇値，於SW-48〇細胞系中爲 0.7 μΜ。此結果已藉由使用異常隱窩病灶（，，AFc，，）做爲致癌作用之指示劑（參見柏得，癌症快報37:147-151，1987 )，於嚆齒動物中評估化合物Ϊ而獲得確定。使用此經確立氧化偶氮甲烷（”A0M，，）-謗導致癌作用之嚆齒動物模式，以分析化合物1(自由鹼與鹽類）對活體内結腸癌發展之影響。 ACF爲結腸性腫瘤之前身，且ACF引發作用爲化學-預防功效之預測指標。、於大鼠進行之此項實驗中，ACF引發作用係藉由兩次連續每週注射該致癌劑而達成。於ACF引發作用前一週投藥化合物I，並持續至實驗全程。於處理5週後評分AFCs。將化合物I混於大鼠飼料中經口服投藥予雄性費雪344大鼠。該研究期間每曰食物消耗量（毫克/公斤體重有所變化，故因此化合物劑量係表示呈每公斤飲食之克數，以做爲各劑量比較之基準。爲決定化合物丨是否對生長及/或銀食習性具有害的影響，遂於實驗全程中測定體重。實驗組體重増加較對照組少，其爲生物可利用性之指標。铁 74 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---- 訂---------鎳經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 1239837 Α7 r__B7 ___ 五、發明說明（72 ) 而，體重差異少於10%，且並不認爲會影響ACF形成。當藉由每結暘之隱窩減少進行測量時，化合物[之自由鹼抑制ACF形成。該等數據综列於表11中δ除了低劑量組 (僅0.5克/公斤飲食、爲例外，於1,0及2,0克/公斤飲食中，處理組與對照組難鉅有實質上、及統計上之顯著差異。表11 由化合物1所產生對異常隱窩病灶之抑制作用 _ 化合物 η 平均ACF/結腸％對照組p(t·試驗）劑量(克/公斤飲食）（+S E) 相對於對照組對照組 10 149士9 - - 0.5 7 149±14 100 0.992 1 10 11 1±9 75 0.008 1.5 10 132土4 89 0.101 2,0 10 107土15 72 0,029 又，化合物I回溯地符合本發明之篩選條件，且其爲用於確立此篩選條件有效性之化合物。例如，使用前述之方案，使用得自HT29細胞萃取物之CGMP-特異性PDE測得，

化合物I具有cGMP_特異性PDE丨(：50値爲〇·68 μΜ 3其COX I 抑制作用（於100 下、小於25%。當其鳥前-細胞凋亡性時，化合物丨之DNA裂解作用ΕΓ5ΰ 锍离15 μΜ =此外《化合拘1於SW-480中之細處凋亡百分比镀、’係依各種藥劑濃恋列示於表！ 2中、、表i2 以形態學測定由化合物ί鮮產生誘等SW480結驕腺癌細 -ί 5» 泰紙m \度遇用甲國國豕標準（CNS)A4規格（23〇 * 2g7公 « — lillllllllv^ «111 . (請先聞讀f面之注意事項再填寫本頁} ϋ n —«1

1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（73) 胞之ΗΤ·29細胞的細胞凋亡處理劑量 %细胞凋亡載劑（0.1% DMSO) - 1 化合物I °·35 μΜ 16 化合物I 0.7 μΜ 27 化合物I 15 μΜ 88 化合物I之活性並不局限於對抗結腸癌細胞系或結腸癌動物模式之活性。其於各種贅疣新生細胞系中，具有廣範圍之抗·贅疲新生功效。將各類型人類癌細胞系，置於含有10%胎牛血清、2 mM L-谷胺醯胺與碳酸氫鈉之RPMI 1640培養基中的滅菌條件下增殖。爲決定化合物[之生長抑制功效，遂將細胞以每槽含1〇〇〇個細胞之密度，接種於 96-槽平盤中。經二十四小時平佈後，將細胞以各種濃度溶解於DMSO之化合物I自由鹼（終濃度爲〇a%)處理。經五天連續處理後，使用中性紅細胞毒性分析測定藥劑對腫瘤細胞生長之影響。中性紅爲由存活細胞，經由ATP-依賴性傳遞機制選擇性吸收入之染劑。如表13中所列，當對抗一組衍生自各種組織來源之經培養人類細胞系進行評估時，化合物I (自由驗）呈現有效的抑制活性。所計算全部細胞系之（^⑼値（藥劑相對於對照組可抑制50%生長之濃度）除下表中之數據外，吾等觀察人類白血病細胞系 (CCRF-CEM、K562、與 Molt-4)、黑素瘤細胞系 (RPMI8226)、胰臟瘤細胞系（PAN-i)、及卵巢瘤細胞系 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（74) (0VCAR-3)對化合物I( HC1鹽類）之可比較敏感性。表13 由化合物I所產生對各種人類腫瘤細胞系之生長抑制作用 __ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} I 裝-----*——TI —-----

細胞系腫瘤起源 GI.o uM GI90 μΜ Colo 205 結腸 1.6 2.4 HCT-15 結腸 1.7 3.0 HT-29 結腸 2.1 8.0 SW-620 結腸 1.7 2.5 DU145 前列腺 1.6 2.8 PC-3 前列腺 1.7 82.5 NCI-H23 肺 1.7 2.5 NCI-H322M 肺 2.1 13.2 NCI-H460 肺 1.9 30.0 NCI-H82 肺 1.7 5.8 MDA-MB-231 乳房 1.8 77.6 MDA-MB-435 乳房 1.6 2.3 UISO-BCA-1 乳房 1.5 4.7 Molt-4* 白血病 1.6 ND CCRF-CEM* 白血病 1.4 ND K-562* 白血病 1.8 ND RPMI8226* 黑素瘤 1.2 ND OVCAR* 卵巢 1.2 ND PANC-1* 胰臟 2.2 ND -77-

1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（75) *除非另行以星號指定（其係以HC1鹽類進行）者，其餘測試系以該化合物之自由鹼完成。根據化合物I之動物與人類安全性特徵，以及其動物與非常廣泛細胞培養物功效，明顯地符合本發明筛選條件 (包括cGMP-特異性PDE )之化合物，可爲有用之抗_贊# 新生治療劑。若欲鑑定於治療上可有效做爲抗-贅疣新生治療劑之結構上額外的抑制cGMP-特異性PDE之化合物，習於該項技藝人士具有許多本文所揭示之有用模式化合物（以及彼等併入本文做爲參考之類似物），其可用做爲供電腦模擬具有相同構型但化學性質相異之額外化合物的參考基準。例如，分子模擬有限公司所販售之軟體，名稱WebLab(g) ViewerProTM，包括分子顯形及化學聯繫能力。此軟體包括函數性（包括已知活性化合物之3D顯影），以確認所描繪或併入化學結構之正確性。此外，該軟體可基於使用者所足義之特性，而將結構添加上去，且使用者可測量出距離、角度或上反角。於此情況下，因爲其他活性化合物之結構經揭示於上，吾等應用群體分析及2D與3]〇相似性研究技術，以此軟體鑑定得可根據本發明篩選條件篩檢及篩選得之，可能的新穎額外化合物。此等軟體方法係基於，外觀結構類似或具有相似特性之化合物，似乎較具有相似活性之原理，其可使用本發明之篩選條件加以確定。同樣地，©此等額外化合物經電腦定型後，可使用一般 ___ -78- 本紙張尺度細> 關家----- ------------裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239837

五、發明說明（76) 習於製藥化學技藝人士所通用之已知組合化學技術，合成許多此類化合物及其變異體。一些雇用組合化學服務之實例包括該等由波提爾華盛頓之新化學實體股份有限公司、帕洛雅圖，加州之普洛金實驗室股份有限公司、舊金山，加州之艾席斯股份有限公司'土克森，亞力桑納州之奈洛新股份有限公司、聖地牙哥，加州之特瑞加股份有限公司、及納提克，麻州之RBI股份有限公司。亦有許多其他雇用公司。許多大型製藥公司具有類似（若非較優越）之内部組織能力。簡言之，習於該項技藝人士可容易地製造出許多供篩選之化合物，從其篩檢得具有本文所揭示化合物特質，而可用於治療贅疣新生之化合物。爲進一步繁助鎩定可經檢查出，然後使用本發明條件篩檢得之化合物’其已知所興趣者在於，所選之贅疲新生化合物與PDE5 蛋白質之結合。藉由以下所論述之程序，經發現符合本發明篩檢條件之較佳、所希望化合物，可與PDE5之cGMP催化區域結合。舄確立此點’遂使用佈包括該催化性功能域之PDE5序列。一種製造此類序列之方法爲，將該序列表現呈融合蛋白質（較佳係與谷胱甘肽S-轉移酶（"GST”）者），其原因在於變得更加明顯。 RT-PCR方法係用於以自牛PDE5A cDNA序列（# 力身塔-魯卡斯LM·等 k，J. Biol, Chem. 268，22863-22873， 7 993)設計之前向及反向引子，獲得PDE5之cGB功能域，並於PDE 1-10家族中進行篩檢。與HT-29細胞共同使用用 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝--------II*---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（77 ) 於抽取總體RNA之5’-3’市售套組，並接著以寡聚（dT)管柱純化mRNA。使用前 AGC-CAOCAG-AGA-AAT-G，203-227)與反向引子（CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG，1664-1686) 合成編碼人類PDE5A之磷酸化部位及低與高親和性cGMP 結合部位（103-1686 bp，CGB-PDE5)之 1484 bp片段。該所合成得之CGB-PDE5核替酸片段編碼，與牛PDE5 A具有97% 相似度之494胺基酸。然後將其選殖入具有tac啓動子，及 EcoRI與Xhol切割位點之pGEX-5X-3谷胱甘肽S-轉移酶 (GST)融合載體（法瑪西雅生物技術公司）中。然後將該融合載體轉感染入大腸桿菌BL21(DE3)細菌（因維托金）中。將經轉感染之BL21細菌生長至對數期，然後將IPTG 加入做爲謗導劑。於20°C下進行謗導作用達24小時。收集細菌並將其溶解。將可溶性胞溶產物與經GSH共軛之瓊脂糖4B ( GSH-瓊脂糖4B)進行培育。該GST-CGB-PDE5融合蛋白質可與GSH-瓊脂糖珠粒結合，而其他蛋白質可以過量冰PBS自珠粒洗下。該經表現之GST-CGB-PDE5融合蛋白質於7.5% SDS-PAGE凝膠上呈現爲85 Kd蛋白質。其特徵在於與cGMP結合，以及由蛋白激酶G與A所進行之磷酸化作用。其呈現兩處cGMP結合部位，且Kd爲1.6±0.2 μΜ，其値接近於天然牛PDE5之Kd爲1·3 μΜ。位於經GSH共軛之瓊脂糖珠粒上的GST-CGB-PDE5可於活體外經由CGMP-依賴型蛋白激酶與cAMP-依賴型蛋白激酶A進行磷酸化作用。由PKG所 -80- Θ氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝--------矿--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 B7 五、發明說明（78) 進行GST-cGB_PDE5磷酸化作用之&111爲2.7 μΜ且Vmax爲 2.8μΜ，而BPDEtide磷酸化作用之1^爲68 μΜ。由PKG所進行之磷酸化作用顯示，係將磷酸分子以一對一之比例，併入GST-CGB-PDE5蛋白質中。對於所興趣化合物之cGMP結合分析，係於總體積100 微升含有5 mM磷酸納緩衝液（pH二6.8)、1 mM EDTA、0.25 毫克 /亳升 BSA、3H-cGMP (2μΜ，NEN)及 GST-CGB-PDE5 融合蛋白質（30微克/分析）之溶液中完成。於同一時間將欲受測試之各化合物加入做爲3H-cGMP受質，並將混合物於 22°C下培育1小時。然後，將混合物轉移至以GF/B爲濾膜之布蘭得Μ B - 2 4細胞收集器中’隨後以1 〇毫升冰5 m Μ抑緩衝液（pH 6· 8)沖洗2次。然後將膜切出，並轉移至閃爍計數小瓶中，隨後將1亳升H20及6毫升Ready 體閃爍計數混合液加至各小瓶中。將小瓶於貝克曼LS 6500閃爍計數器中計讀。爲進行計算，遂藉由將蛋白質煮沸5分鐘製備得空白樣本，且當與未經煮沸之蛋白質比較時，其結合計量< 1〇/〇。亦校正經由濾膜或其他碎片猝滅。選擇PDE5抑制劑（硫化物、依席舒林、化合物b、化合物E、E402 1與扎普司特）、及環狀核甞酸類似物（cAMP、環狀IMP、8-溴-cGMP、環狀UMP、環狀 CMP、8-溴-cAMP、 2，-〇· 丁基-cGMP與2’_0_ 丁基-cAMP)，測試彼等是否能競爭性地結合至GST-CGB-PDE5蛋白質之cGMP結合位置上。結果列示於圖24中。cGMP特異地與GST_cGB-PDE5 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝--------tr:--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1239837 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（79) 蛋白質結合。環狀cAMP、cUMP、cCMP、8-溴-cAMP、2’-0-丁基-cGMP與2’-0· 丁基-cAMP不與cGMP競爭結合。環狀 IMP與8_溴-cGMP於高濃度（ΙΟΟμΜ)下，可部分地與cGMP (2 μΜ)競爭結合。無任何PDE5抑制劑顯示會與cGMP競爭 GST-CGB-PDE5之結合。因此，彼等不結合至PDE5之cGMP 結合位置上。然而，化合物E的確競爭性（與cGMP )地結合至PDE5 (亦即，高峰A)。（化合物E亦競爭性（與cGMP)地結合至PDE高峰B)。由於化合物E不結合至PDE5之cGMP結合位置上，而基於化合物E與cGMP間具有競爭性結合作用之事實，故表示所希望化合物，如化合物E係與PDE5上之 cGMP催化位置結合，此容易地由習於該項技藝人士（以習知競爭性結合實驗）獲知，而其可協助習於該項技藝人士容易地模擬定型出其他化合物。因此，以本文所示可希望化合物之化學結構，及cGMP結合位置資料，習於該項技藝人士（使用本發明之篩選條件）模擬定型、鑑定及篩檢出其他供用於做爲治療劑之化學化合物。根據本發明方法所篩檢得之化合物，可經調製呈如一般所瞭解術語”醫藥組合物”之定義的醫藥組合物，亦即包含化合物（例如，上述之固體）及醫藥上可接受之載體，以供經由呈固體或液體形式之口服投藥、經由呈液體形式之IV或IP投藥、或軟膏形式之局部投藥、或呈栓劑形式之直腸或局部投藥遞送至病患。以供口服投藥之載體爲最 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 ----^---------_ 1239837

五、發明說明（80 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製該項技藝已熟知用於供口服投藥之醫藥組合物的醫藥上可接受載體包括膠囊、片齊i、丸劑、粉末、錠劑、及顆粒。於此類固體劑型中，該載體可包含至少一種惰性稀釋劑，例如蔗糖、乳糖或澱粉。此類載體亦可包含（如正常之實施）除稀釋劑以外之其他物質，例如潤滑劑如硬脂酸鎂。於膠囊、片劑、錠劑及丸劑之個案中，該等載體亦可包含緩衝劑。諸如片劑、丸劑及顆粒，可於片劑、丸劑或顆粒之表面上塗覆腸衣塗層而製備得。另供選擇地，可將經腸衣-塗覆之化合物壓製成片劑、丸劑或顆粒，以及供投藥予患者之片劑、丸劑或顆粒。較佳之腸衣塗層包括該等於結腸pH値下溶解或崩解者，例如蟲膠或丙晞酸乳膠 Eudraget S 〇用於醫藥組合物之醫藥上可接受載體，包括供口服投藥的液體劑量形式，例如含有一般用於該項技藝中之惰性稀釋劑（例如水）的醫藥上可接受乳液、溶液、懸浮液、糖漿及触劑。除此等惰性稀釋劑之外，組合物亦可包括佐如澄腐劑、乳化劑與懸浮劑、及甜味劑、香料與芳香劑用於供IV或IP投藥之醫藥組合物的醫藥上可接受載包括一般通用之醫藥食鹽水溶液。用於供局部投藥之醫藥组合物的醫藥上可接受載體括DMSO、醇類或丙二醇等類，其可與貼布或其他用以藥劑保留於皮膚上，以免藥劑被擦去之液體-保留物質用0 用於供直腸投藥之醫藥組合物的醫藥上可接受載體劑體包使共 -83 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1239837 A7 _ B7 五、發明說明（81 ) 佳地除本發明化合物外，可含有諸如可可脂或检劑蠟質、或凝膠之賦形劑的栓劑。舲醫藥上可接爻《載體及本發明化合物調製成，呈供投藥予患者之單位劑㈣式的醫藥組合物。單位劑量形式中活性成分（亦即，根據本發明所篩選得之化合物）之劑量濃度’可加以變化而獲得—根據所希望投藥（#即，口服或直腸投藥）线，達到贅㈣除之有效量。因此所選擇之劑量視所投藥之活性化合物本性（例如％。，其可容易地確定得）、所希望之治療時間、及其他因素而定。若希望，單位劑量可爲該活性化合物以—次劑量所需之每日劑量，或分成供每日例如二至四次投藥之多數劑量。對於 IV投藥，可藉由將其以於平均成年雄性血漿内容物（亦即、々4升）中達到IC5〇之劑量爲基準確定得起始劑量。根據本發明户斤篩選得化合物之起始劑量範園介於〇5_6〇〇毫克。本發明之醫藥組合物較佳係包裝於容器（例如，盒子或瓶子，或二者）中，其中附上含有指示（使用指示等）之適宜印刷文件（例如包裝内頁）。明顯地，由上述敎示可能進行本發明之許多修飾及變異。因此，應瞭解於所附之申請專利範圍内，除經本文所特別描述者外皆可實施本發明。 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） ·裝--------tT----------· (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

Claims

A8 B8t C8: D8〜 123獨7_號專利_ 中文申凊專利範圍替換本(94年7月）六、申請專利範圍 1 ·種旆選用於治療贅疣新生之化合物的方法，其包含測疋该化合物之環加氧酶（COX)抑制活性；測疋該化合物之PDE2抑制活性；及選出具有cox抑制活性低於該PDE活性以供治療贅疣新生之化合物。、 2·:艮據申凊專利範圍第i項之方法，纟中該化合物係藉由測疋該化合物是否於贅疣細胞培養物中減低腫瘤細胞生長而進一步進行篩檢；並篩檢出抑制贅疣細胞以治療贅疣新生之化合物。 3·，據中請專利範圍第2項之方法，纟中生長抑制作用係精由評估該化合物是否誘導細胞凋亡而確定。 4·厂種篩選用於治療贅疣新生之化合物的方法，其包含： 4定邊化合物之贅疣細胞生長抑制活性；測疋孩化合物之PDE2抑制活性；及師選出呈現贅疲細胞生長及該PDE抑制活性之化合物。 5·根據中請專利範圍第4項之方法，其進—步包含測定該、口物疋否會於贅疣細胞中謗導細胞凋亡；並篩檢出誘導細胞凋亡之化合物。 6· _中料利範圍第5項之线，其進—步包含：測定邊化合物是否具有C0X抑制活性；並筛檢出該化合物相對於對抗該PDE之抑制活性，具有較低c〇x抑制活性之化合物。 7‘-種篩選用於治療贅貌新生之化合物的方法，其包含 60830-940708.DOC

1239837 、申請專利範圍 ::該化合物之PDE2抑制活性，及筛選出具有制〉舌性之化合物。 9. η申清專利範圍第7項之方法，其中該化合物係藉由乎疋邊化合物是否於贅虎細胞中誘導細胞洞亡而進一二進仃篩檢，並篩檢出具有凋亡“秀導活性之化合物。 =鐘定用於治療贅疲新生之化合物的方法，其包含 7疋孩化合物之環加氧酶（cox)抑制活性；合物之咖抑制活性，其中該削之特徵為：]^化 (a) cGJVTP特異性超越camp ; (b) 於cGMP受質存在下具有正協同動力學特性； (c) 針對cGMP具有次微莫耳之親和性；及 (幻對與經純化cGMP-依賴性蛋白質激酶進行之培育不敏感；且篩選出具有C〇X抑制活性低於該PDE活性之化合物。 10.根=申請專利範圍第9項之方法，其進一步包/測定該化合物是否於贅疣細胞培養物中抑制腫瘤細胞生長；並篩檢出抑制腫瘤細胞生長之化合物。 11 ·根據申請專利範圍第9項之方法.，其進一步包含·· 及 (a) 測足該化合物是否會謗導腫瘤細胞之細胞凋亡，含 (b) 篩檢出謗導細胞凋亡以供治療贅疣新生之化合物 1 2. —種篩選用於治療贅疣新生之化合物的方法，其包/ 測足该化合物之生長抑制活性；測定該化合物之PDE 抑制活性，其中該PDE之特徵為： (a) cGMP特異性超越CAMP ; -2- 60830-940708.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1239837

A cGMP受質存在下具有正協同動力. c針對cGMP具有次微莫耳之親和性；2性’ (d)對與經純化cGMp_依賴性敏感；且員/數酶進行之培育師選出呈現生長抑制活性及該p 13·-種筛檢具有供治療贊虎新生潛力其包含測定該化合物之PDE抑制活性，=物的方法徵為·· 其中該PDE之= U)cGMP特異性超越cAMP ; ㈨於cGMP受質存在下具有正協同動 (c)針對cGMP具有次微莫耳之親和性；及， ⑷對與經純化cGMIM衣賴性蛋白質激酶敏感；且心仃义乓月篩選出具有此類抑制活性之化合物。 14.根據中請專利範圍㈣項之方法，其進—步包含測定孩化合物是否於細胞中誘導細胞凋亡，並進一步出具有凋亡謗導活性之化合物。、 15·根據巾請專利範圍第13項之方法，其進_步包含測定孩所選之化合物是否抑制前列腺素合成，並進一步篩選出具有實質上前列腺素抑制活性之化合物。 16·根據申請專利範圍第13項之方法，其中該pDE活性係藉由自含有PDE5與該新穎pj)E之贅疣細胞系分離得 cGMP-特異性PDE活性，藉由將該組合得之PDE分離物暴露至其濃度不抑制該新穎PDE之PDE5抑制劑而抑制 60830-940708.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公嫠)

裝- 玎.

A BCD 1239837 六、申請專利範圍 PDE5活性，及確定該測試化合物對乘|J餘cGMP之抑制活性而確定，藉此可測定得該測試化合物對該新穎PDE 之抑制活性。 1 7. —種篩選用於處理欲受治療之贅疣之化合物的方法，其包含： (a) 評估該化合物是否於欲受治療贅疣之完整贅疣細胞中增加PKG活性； (b) 評估該化合物是否於贅疣細胞中減少β-連環蛋白；及 (c) 篩選出於完整贅疣細胞造成PKG活性增加且於欲受治療贅疲中減少β _連環蛋白之化合物。 1 8. —種供鑑定具有供治療贅疣新生潛力之化合物的方法，其包含：篩選出於贅疣中增加PKG活性；及評估該化合物之贅疲生長抑制活性，其中增加PKG活性且具有贅虎生長抑制活性之化合物具有用以抑制贅虎而實質上不抑制正常細胞生長之潛力。 1 9. 一種鑑定具有供治療贅虎新生潛力之化合物的方法，其包含：測定該化合物之環加氧酶（COX)抑制活性；與測定該化合物是否於贅疣細胞中增加PKG活性；其中低COX抑制活性及PKG活性增加為該化合物具有治療贅疣新生潛力之指標。 2 0. —種篩選用於治療贅疣新生之化合物的方法，其包含： 60830-940708.DOC -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

8 8 8 8 A BCD 1239837 六、申請專利範圍測定該化合物之贅虎生長抑制活性；測定該化合物是否於贅疣細胞中增加PKG活性；及選出呈現贅疣生長抑制活性且於贅疣細胞中增加PKG 活性之化合物。 2 1 . —種篩選用於處理欲受治療之贅虎之化合物的方法，其包含評估於經該化合物處理之贅疣中PKG是否促使 β -連環蛋白被磷酸化，及篩選出當以該化合物處理欲受治療之贅疣時會促使PKG磷酸化β-連環蛋白之化合物。 60830-940708.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)