KR100413591B1 - 종양 억제 능력을 갖는 화합물의 선별 방법 및 상기화합물을 함유하는 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유 동물에서 종양의 치료 및 예방에 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 화합물의 포스포디에스테라제 억제 활성을 JNK 키나제 활성을 상승시키는 그의 능력과 함께 측정한다. 배양된 종양 세포에 대한 성장 억제 및 세포소멸 유도 효과를 또한 측정한다. 포스포디에스테라제 억제, JNK 키나제 활성을 상승시키는 능력, 성장 억제 및 세포소멸 유도를 나타내는 화합물이 종양의 치료에 바람직하다.

Description

종양 억제 능력을 갖는 화합물의 선별 방법 및 상기 화합물을 함유하는 약학 조성물{A method for screening compounds for their potential to inhibit neoplasia and pharmaceutical compositions containging such compounds}
본 발명은 포유동물의 전암 및 암 병변의 선택적인 치료 및 예방에 잠재적으로 유용한 화합물을 확인하는 방법, 및 이러한 화합물을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
수년간, 연구자들은 정상 세포에 대한 실질적인 성장-억제 부작용없이 종양 세포를 선택적으로 치료하는 화합물들을 찾아왔다. 통상적인 암 화학요법들은, 상기 요법이 목적으로 하는 암의 유형에 관계없이, 한가지 공통적인 특징, 즉 통상적인 조성물(예: 헤르세프틴, 탁솔, 시스플라틴, 타목시펜 등)이 종양 세포에 대해 임의의 상당한 효과를 갖는 정도로, 실제적으로는 항상 정상 조직에도 현저한 부작용을 갖는다는 특징을 공유한다. 이들 부작용들 중 다수는 쇠약화 및 생명-위협적인 것이다. 따라서, 통상적인 화학요법제들을 전형적으로는 상기 약물의 부작용이 상기 화학요법의 비 위험성을 명백히 능가하는 단계까지 종양이 상당히 진행된 경우에만 투여한다.
통상적인 화학요법은 또한 전형적으로 매우 특정한 유형의 종양을 치료하는데 사용된다. 예를 들어, 류프로리드는 진행된 전립선암의 치료에 흔히 처방되지만, 결장암이나 폐암에는 처방되지 않는다. 광범위한 종양에 대해 활성을 갖는 조성물들이 요구된다.
파머큐(Pamukcu) 등의 미국 특허 제 5,401,774 호에는 항-종양 화합물(현재는 엑시슐린드라 알려짐)이 개시되어 있다. 통상적인 화학요법과 대조적으로, 상기 화합물은 정상적인 세포와 상반되게 종양 세포에 대해 매우 선택적이다. 따라서, 상기와 같은 화합물을 통상의 화학요법과 통상적으로 관련된 부작용 없이 장기적으로 투여할 수 있다. 또한, 상기와 같은 화합물의 안전성 프로파일로 인해, 상기 화합물을 질병의 가장 초기 단계에 투여할 수 있다. 따라서, 신규 화합물이 선택적인 세포소멸성 항-종양 약물(“SAAND”)로서 공지된 신규한 부류의 항종양제로서 인정되었다.
SAAND는 또한 통상적인 화학요법제에 대한 현저한 안전성 이점 이외에, 통상적인 화학요법제에 비해 보다 광범위한 치료 용도를 갖는다. 예를 들어, 첫 번째 SAAND인 엑시슐린드는 결장, 유방, 폐, 전립선 및 흑색종 종양에 대해 종양 억제 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 상기는 또한 다른 종양들에 대해서도 효과를 갖는다.
SAAND는 NSAID와 달리 COXI/II 효소를 억제하지 않기 때문에 항-종양 NSAID(예: 슐린닥)보다 더 유리하다. COX I 및/또는 COX II 효소의 억제(예를 들어 인도메타신, 셀레콕시브 및 다른 NSAID에 의해서)는 장기적으로 복용하는 경우 상당한 부작용을 야기한다. 또한, COX 억제는 항-종양 효능에 불필요하다. 다수의 상기와 같은 COX I 및 COX II 억제제들이 또한 현저한 항-종양 활성을 갖지 않는 것으로 나타난 것은 놀라운 일이 아니다. COX I 및 COX II 억제제의 부작용으로는 심각한 궤양을 일으킬 수 있는 위염과 신장 독성이 있다. SAAND 항종양 요법은 만성적이거나 장기적인 투여에 의해 향상되므로, 상기 COX 억제제(임의의 항종양 성질을 나타낼 정도)는 단순히 안전성을 고려하여도 적합하지 않으며, 따라서 사실적으로 COX 억제제를 만성적으로 또는 장기적으로 복용할 수 있는 환자는 거의 없다. 염증에 대해서, COX 억제제는 결과적으로 단지 단기간 또는 급성의 경우에만 흔히 사용된다.
SAAND가 COX 억제제의 부작용 없이(또는 통상적인 화학요법제의 훨씬 더 심각한 부작용) 없이 어떻게 작용할 수 있는가는 최근까지 미스테리로 남아있었다. 미국 특허 제 5,858,694 호에 보고된 바와 같이, SAAND는 부분적으로 PDE5의 억제에 의해 작용하며, 이는 SAAND가 정상 세포에서가 아닌 종양에서 세포소멸(세포 사멸의 한 형태)을 어떻게 유발시키는 가에 대해 필수적인 부분인 것으로 보인다. SAAND는 종양 세포에서 cGMP의 증가 및 cAMP 감소에 의해 작용함이 또한 밝혀졌다(‘694 특허에 또한 보고되어 있음).
그러나, 일부 PDE5 억제제는 세포소멸을 유발시키지 않는 것으로 나중에 밝혀졌다(예를 들어 1998년 10월 15일자로 출원된 미국 특허 출원 제 09/173,375 호를 참조하시오). ‘375 출원에서, 종양 세포에서 신규의 cGMP-특이적인 PDE가 발견되었음이 처음으로 보고되었다. 불활성 PDE5로부터 항-종양성 PDE5 억제제를 분리했다는 보고는 상기 항-종양성 PDE5 억제제가 새로운 cGMP-특이적인 PDE를 억제하는 반면, 불활성 PDE5 억제제(예: 실데나필)는 관련된 효과가 거의 없다는 것이다. 이러한 관찰은 상기 ‘375 출원에 개시된 바와 같이, 활성의 항-종양성 PED5 억제제(즉, 추가의 SAAND)를 확인하기 위한 보다 정확한 약물 발견 선별 방법을 도출해냈다.
그러나, SAAND로서의 유용한 화합물을 평가하고 확인하기 위해서 보다 정확하고 대체적인 방법이 요구된다.
도 1a 내지 c는 슐린닥 설파이드 및 다수의 SAAND에 노출된 SW480 결장암에서의 JNK1 및 카스파제-3의 활성화를 예시한다.
도 1a에서, SW480 세포를 DMSO(-) 또는 지시된 농도(μM)의 슐린닥 설파이드, 엑시슐린드, 화합물 A 또는 화합물 B로 1 시간 동안 처리하였다. 상기 세포들을 용해시키고, JNK1을 항-JNK1 항체로 면역침강시키고, 상기 면역침강물(“IP”)을 기질로서 GST-c-Jun(1-79)을 사용하여 생체외에서 키나제 활성에 대해 분석하였다. 상기 실험을 3 회 반복실시하여 유사한 결과를 얻었다. 인 화상기(Phosphor Imager)를 사용하여 활성화 배수를 측정하였다.
도 1b에서, SW480 세포를 지시된 기간 동안 화합물 A(1 μM)로 처리하고 생체외 JNK 1 키나제 활성을 상기 개시된 바와 같이 측정하였다.
도 1c에서, SW480 세포를 24 시간 동안 슐린닥 설파이드(200 μM), 엑시슐린드(600 μM), 화합물 A(1 μM) 또는 화합물 B(10 μM)로 처리하였다. 상기 세포들을 용해시키고 추출물을 카스파제-3 억제제 Ac-DEVD-CHO의 존재 또는 부재 하에서 기질로서 상기 Ac-DEVD-AFC를 사용하여 카스파제-3 활성에 대해 분석하였다. 상기 Ac-DEVD-CHO 존재 하의 AFC 형광성(여기; 400 ㎚, 방출; 505 ㎚)을 Ac-DEVD-CHO 부재 하의 AFC 형광성으로부터 감하여 카스파제-3-활성을 산출하였다.
도 2a 내지 b는 cGMP 조절제에 의한 JNK1의 활성화 및 PKG의 역할을 예시한다.
도 2a에서, SW480 세포를 DMSO(-) 또는 화합물 A(0.1 μM), dbcGMP(500 μM), YC-1(50 μM), MY-5445(50 μM), 디피리다몰(10 μM) 또는 dbcAMP(500 μM)로 1 시간 동안 처리하였다. 상기 세포들을 용해시키고, JNK1을 면역침강시키고, IP를 도 1a에 개시된 바와 같이 생체외 키나제 활성에 대해 분석하였다.
도 2b에서, SW480 세포를 DMSO, KT5720(2 μM) 또는 Rp-8-pCPT-cGMPS(2 μM)로 2 시간 동안 예비-처리하고 이어서 화합물 B(0, 1 또는 10 μM)로 1 시간 동안 처리하였다. 상기 세포들을 용해시키고 상기 개시된 바와 같이 IP에서의 JNK1 활성화를 분석하였다.
도 3a 내지 b는 SAAND에 의한 MEKK1-SEK1 경로의 활성화를 예시한다.
도 3a에서, SW480 세포를 화합물 A(1 μM)로 처리하고, 지시된 시점에서 수거하고, 세포 용해물을 항-인-SEK1(Thr223) 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 SEK1 활성화에 대해 분석하였다. 인산화의 증가 배수를 농도측정에 의해 측정하였다. 상기 실험을 3 회 반복 실시하여 유사한 결과를 얻었다.
도 3b에서, SW480 세포를 화합물 A(1 μM)로 처리하고 1 또는 2 일 후에 수가하고, 세포 용해물을 항-MEKK1 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 MEKK1 절단에 대해 분석하였다. (-)는 DMSO 처리된 대조군 세포를 가리킨다.
도 4는 Rp-8-pCPT-cGMPS에 의한 화합물 A-유도된 PARP 절단의 억제를 예시한다. SW480 세포를 DMSO(-) 또는 Rp-8-pCPT-cGMPS(2 μM)로 2 시간 동안 예비 처리하고, 이어서 DMSO(-) 또는 화합물 A(1 μM)로 처리하였다. 부유 세포 및 부착된 세포들을 모두 2 일 후에 수거하고, 세포 용해물을 항-PARP 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 PARP 절단에 대해 분석하였다. PARP 절단의 증가 배수를 85 kD 단편의 농도측정에 의해 측정하였다.
도 5는 SAAND에 의해 활성화되는 세포소멸 신호 변환 경로를 예시한다. SAAND는 PDE2/5의 억제를 통해 cGMP의 세포내 수준의 증가를 유도한다. 이는 PKG를 활성화시키고, 이에 의해 MEKK-1/SEK1/JNK1 경로가 활성화된다. 이때 JNK1의 활성화는 추정상 다른 신호들과 함께 카스파제의 활성화, PARP 절단 및 세포소멸을 매개하는 다른 사건들에서 하나의 역할을 수행한다.
도 6은 화합물 I(50 μM)의 처리에 따른 LNCaP 세포 배양액 중의 히스톤-결합된 단편화된 DNA 양의 시간에 따른 증가를 도시한다.
도 7은 환상 뉴클레오티드 동족체 및 선택된 PDE5 억제제에 대한 PDE5의 비-촉매성 cGMP 결합 부위에 대한 특이적인 결합을 예시하는 막대 그래프이다.
도 8a는 첨가된 cGMP의 부재 하에서 약물-처리된 세포 용해물로부터의 SW480 세포 용해물의 SDS(X-선 필름 노출) 단백질 겔 PKG 분석이며, 이때 세포를 배양액 중에서 48 시간 동안 DMSO(0.03%, 1 및 2 번 레인), 엑시슐린드(200, 400 및 600 μM, 3, 4, 5 번 레인) 및 E4021(0.1, 1 및 10 μM, 6, 7, 8 번 레인)로 처리하였다.
도 8b는 첨가된 cGMP의 존재 하에서 약물-처리된 세포 용해물로부터의 SW480 세포 용해물의 SDS(X-선 필름 노출) 단백질 겔 PKG 분석이며, 이때 세포를 배양액 중에서 48 시간 동안 DMSO(0.03%, 1 및 2 번 레인), 엑시슐린드(200, 400 및 600 μM, 3, 4, 5 번 레인) 및 E4021(0.1, 1 및 10 μM, 6, 7, 8 번 레인)로 처리하였다.
도 9는 대조군과 비교한, 종양 세포에서 β-카테닌과 PKG 수준에 대한 엑시슐린드의 효과에 대한 웨스턴 블럿 실험 결과의 막대 그래프이다.
본 발명은 SAAND로서 유용한 화합물을 선별하고 확인하기 위한 신규의 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전암 병변을 포함한 종양을 COX 억제와 관련된 부작용 및 통상적인 화학요법들과 관련된 다른 비-특이적인 상호작용을 최소로 치료 및 예방하기 위해서 사용될 수 있는 화합물의 확인 방법을 제공한다.
일부 PDE5 억제제가 세포소멸을 일으키는 이유를 연구하던 중에, 본 발명자들은 세포소멸을 일으키는 것들이 궁극적으로 JNK1 키나제 활성을 활성화시킴으로써 그렇게 한다는 것을 발견하였다. JNK는 MAP 키나제 연장된 계열의 프롤린-지배 키나제이다. 이러한 효과는 피아자(Piazza) 등의 미국 특허 제 5,858,694 호에 교시된 바와 같이, 전-세포소멸성 PDE5 억제제에 의한 cGMP 및 cAMP의 조절에 의해 상기 JNK 세포소멸 경로의 상부에서 야기되는 것으로 여겨진다. cGMP/cAMP 조절과 JNK1 활성간의 이러한 연관성은 놀라운 것이며, cGMP 억제제가 SAAND인지를 확인하는 유용한 수단을 형성한다. JNK 키나제 활성에 대한 이러한 효과와 대조적으로, 시험된 SAAND는 ERK2 키나제 활성을 단지 약간 활성화시켰으며, 관련은 있지만 별도인 신호 변환 경로가 세포 증식을 자극하는 역할을 하는 것으로 흔히 보고된다.
본 발명은 화합물이 cGMP-의존성 단백질 키나제 G(“PKG”) 활성을 증가시키고 종양 세포에서 JNK1 키나제를 활성화시키는 여부를 평가함을 포함한다. 본 발명자들은 PKG 활성의 상승은 상기 개시된 바와 같이, 적합한 PDE의 SAAND 억제에 의해 야기된 cGMP의 증가에 의해 적어도 부분적으로 정당한 것으로 믿는다.
SAAND의 다른 특징은 (1) 상기 ‘694 특허에 보고된 바와 같은 PDE5의 억제, (2) 신규한 cGMP-특이적인 PDE 일치의 억제, (3) PDE2의 억제, (4) SAAND가 종양 세포에서 세포내 cGMP를 증가시킨다는 점, 및 (5) 이들이 일부 형태의 종양 세포에서 cAMP 수준을 감소시킨다는 점이다.
따라서, 본 발명의 신규한 방법의 하나의 실시태양은 화합물이 JNK를 활성화시키는지, PKG 활성을 종양 세포에서 상승시키는지, 상기 화합물이 PDE5를 억제하는지의 여부를 평가하는 것이다. 본 발명의 신규한 선별 방법의 또 다른 실시태양은 JNK를 활성화시키는지, PKG 활성을 종양 세포에서 상승시키는지, 그리고 상기 화합물이 상기 개시된 신규한 cGMP-특이적인 PDE 및/또는 PDE2를 억제하는지의 여부를 평가하는 것이다. 더욱이 세 번째 실시태양은 화합물이 JNK를 활성화시키는지, PKG 능력을 종양 세포에서 상승시키는지, 그리고 상기 화합물이 종양 세포에서 cGMP를 상승시키고/시키거나 cAMP 수준을 떨어뜨리는지의 여부를 평가하는 것이다. 이러한 방식에서 성공적인 것으로 평가된 화합물들은 SAAND로서의 용도를 갖는다.
본 발명은 다른 것들 중에서, 종양, 특히 전암 병변을 안전하게 치료하고 예방하는 능력에 대해서 화합물들을 선별하기 위한 신규한 생체외 및 생체내 선별 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전암 병변을 포함한 종양을 처리하고 예방하는데 사용될 수 있는 화합물을 선택하는 방법이다. 이렇게 확인된 화합물들은 COX 억제에 기여하는 부작용과 통상적인 화학요법과 관련된 다른 비-특이적인 상호작용을 최소로 가질 수 있다. 종양 세포를 cGMP PDE-억제 화합물에 노출시킴으로써 관심 화합물을 시험할 수 있으며, 상기와 같은 화합물이 상기 세포들에서 JNK를 활성화시키는 경우, 상기 화합물을 다른 항-종양 성질(예를 들어, 생체외 및/또는 생체내에서 세포소멸을 유발시키는 능력)에 대해서 추가로 평가한다.
따라서, 본 발명의 하나의 태양은 화합물의 PDE5 및/또는 PDE2 억제 및 COX 억제를 확인함을 포함하는, 종양 치료에 유용한 화합물을 확인하기 위한 선별/선택 방법을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 선별 및 선택 방법은 상기 화합물이 생체외 또는 생체내에서 종양 세포의 성장을 억제하는지의 여부를 결정함을 추가로 포함한다.
이러한 방식으로 화합물들을 선택함으로써, 종양의 치료에 잠재적으로 유리하고 개선된 화합물을 약학 조성물을 개발하고 종양을 치료학적으로 처리하기 위해서 과거에 가능했던 것보다 더 신속하고 정확하게 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 화합물을 함유하는 약학 조성물, 및 이러한 화합물을 포함하는 치료 방법을 포함한다.
I. SAAND의 특징
A. c-Jun 및 JNK에 대한 전반적인 내용
c-Jun은 광범위하게 다양한 세포외 자극들에 의해 활성화되는 전사 인자 AP-1의 성분이다. c-Jun의 조절은 복잡하며 c-Jun 단백질 수준의 증가뿐만 아니라 Jun N-말단 키나제(JNK)에 의한 특정 세린(63 및 73)의 인산화 모두를 포함하는 것으로 여겨진다.
JNK의 활성화는 이전에 세포소멸과 관련지어졌다. 예를 들어, 문헌[Gajate C et al., Mol Pharmacol, 1998년 4월, 53:4, 602-12]에서 인간 종양 세포의 강력한 세포소멸 유도인자인 에테르 포스포리피드 1-O-옥타데실-2 O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린(“ET-18-OCH3”)이 JNK 신호의 활성화와 연관된 방식으로 세포소멸을 유도함을 밝혔다. 구체적으로, 상기 문헌은 독특한 인간 백혈구(HL-60, U937 및 Jurkat)에 ET-18-OCH3를 가하여(상기 백혈구는 ET-18-OCH3로 처리 시 급속한 세포소멸을 겪는다), 활성화제 단백질-1 전사 인자의 활성화와 관련된 c-jun mRNA 수준을 극적이고 지속적으로 증가시킴을 밝혔다. 상기 문헌은 ET-18-OCH3가 세포소멸의 개시 전에 검출된 HL-60 세포에서 JNK의 지속적인 활성화를 유도함을 밝혔으며, 이때 상기 세포소멸은 DNA 단편화 및 혈장 세포막의 외부 조각 상의 포스파티딜세린의 출현에 의해 평가된다. HL-60 단핵세포/대식세포 분화 후의 JNK의 유도 및 ET-18-OCH3-매기된 세포소멸은 각각 상이한 활성화 패턴인 일시적인 것 대 지속적인 것에 의해 구별되었다. 세포소멸을 유도할 수 없는 ET-18-OCH3 동족체들은 JNK를 활성화시키지 못한다. ET-18-OCH3-의존성 JNK 활성화가 K562 세포에서는 탐지되지 않았으며, 상기 세포는 ET-18-OCH3로 처리 시 세포소멸되지 않았다. 포르볼 미리스테이트 아세테이트는 ET-18-OCH3-유도된 세포소멸과 지속적인 JNK 활성화를 모두 억제했으며; 따라서 ET-18-OCH3에 의한 지속적인 JNK활성화는 세포소멸을 유도하는 에테르 포스포리피드의 능력과 관련있다. 더욱또한, 올리고뉴클레오티드 안티센스는 c-jun 차단된 ET-18-OCH3-유도된 세포소멸을 지배하며, 이는 ET-18-OCH3에 대한 세포소멸 응답에서 c-Jun의 역할을 가리킨다.
유사하게, 문헌[Li Y, et al., Mol Cell Biol, 1998년 8월, 18:8, 4719-31]에는 UV-자극된 JNK1 활성화가 UV-유도된 SCLC 세포소멸을 촉진시킴이 보고되어 있다.
상기 보고서들 및 기타의 문헌들은 JNK 활성화 및 c-Jun이 세포소멸을 유도하는 경로를 나타낼 수 있음을 지적한다.
B. JNK 경로에 대한 SAAND의 역할에 대한 확인 실험의 요약
상기 설명한 바와 같이, 비-스테로이드성 소염제인 슐린닥처럼, 엑시슐린드(Aptosyn)와 같은 SAAND는 가족성 선종성 폴립증(FAP)이 있는 환자에서 폴립의 재발을 역행 및 억제시킨다. 엑시슐린드는 또한 설치류에서 발암을 억제하며 다양한 인간 암 세포 주들의 성장을 억제하고 세포소멸을 일으킨다. 그러나, 엑시슐린드는 사이클로옥시게나제 COX-1 또는 2를 억제하지 못한다. 미국 특허 출원 제 09/046,739, 09/173,375 및 09/414,626 호(이들은 모두 본 발명에 참고로 인용되어 있다)에는 엑시슐린드 및 다른 SAAND가 종양 세포에서 cGMP-가수분해성 포스포디에스테라제(PDE2/5)를 억제하여 종양 세포에 단백질 키나제 G(“PKG”)를 증가시킴으로써 작용함이 개시되어 있다.
본 발명에서 밝혀진 종양 세포에서 SAAND에 의해 유도된 cGMP의 증가에 대한 뜻밖의 효과들 중 하나는 JNK 경로에서의 신호 변환에 대한 효과이다. 이러한 관찰에 대한 추가의 확인으로, 슐린닥 설파이드, 엑시슐린드 및 2 개의 다른 SAAND, 즉 화합물 A([(Z)-5-플루오로-2-메틸-(3,4,5-트리메틸-옥시벤질리덴)-3-(N-벤질)-인데닐아세트아미드]) 및 화합물 B((Z)-5-플루오로-2-메틸-(4-피리딜리덴)-3-(N-벤질)인데닐아세트아미드 하이드로클로라이드)가 상기와 같은 약물들에 노출된 SW480 결장암 세포, 및 하기 논의되는 바와 같은 약물에 노출된 다수의 다른 유형의 암 세포들에서 c-Jun 아미노-말단 키나제 1(“JNK1”)의 빠르고 지속적인 활성화를 일으킴을 발견하였다.
SAAND의 이러한 새로운 특징을 입증하기 위해서, 종양 세포에 대한 SAAND의효과들 중 하나가 상기 세포에서의 cGMP 수준의 증가이므로, 본 발명자들은 cGMP의 세포 수준을 증가시키는 것으로 공지된 다른 화합물들도 또한 종양 세포에서 JNK1을 활성화시킴을 발견하였다. 또한, 상기 SAAND 치료 효과들 중 하나가 PKG활성을 증가시키는 것이므로, PKG, Rp-8-pCPT-cGMP의 억제제가 PKG 억제제 및 항-종양성 cGMP-특이적인 PDE 억제제, 예를 들어 슐린닥 설파이드 및 SAAND 모두에 노출된 종양 세포에서 JNK1을 억제함을 발견하였다.
JNK1의 상위인 SEK1 및 MEKK1의 활성화가 또한 종양 세포를 SAAND에 노출시켰을 때 관찰되었다. 상기 PKG 길항물질인 Rp-8-pCPT-cGMPS가 또한 세포소멸의 지표인 슐린닥-유도된 PARP의 절단을 억제하였다. 따라서, 엑시슐린드 및 SAAND에 의해 야기된 cGMP의 상승은 적어도 부분적으로 PKG의 활성화를 통해 세포소멸을 유도하며, 이어서 이는 상기 MEKK1-SEK1-JNK1을 계단식으로 활성화시킨다. 이들 연구는 또한 최초로 JNK 경로에 cGMP의 역할을 포함시켰다.
최근의 연구들은 상기 특허 출원들에 보고된 바와 같이, SAAND가 cGMP-특이적인 포스포디에스테라제 2 및 5(PDE2/5)의 특이적인 억제제임을 지적한다. 이러한 발견들을 근거로, 2 개의 효능있는 SAAND인 화합물 A 및 B가 PDE5/2의 특이적인 억제제인 것으로 밝혀졌다. SAAND에 의한 PDE5/2의 억제는 미국 특허 출원 제 09/046,739 호 및 09/414,626 호에 개시된 바와 같이, cGMP의 세포내 수준의 증가를 유도한다. 이러한 발견은 cGMP의 세포 수준의 상승이 세포소멸을 촉발시키는데 중요한 기작일 수 있으나, 하위의 신호 경로가 모두 확인된 것은 아니다.
본 원에 보고된 실험들에서, 본 발명자들은 SAAND가 JNK1의 빠르고 지속적인 활성화를 일으킴을 발견하였으며, 이는 PKG의 cGMP-자극된 활성화에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. 이들 연구는 또한 최초로 JNK1의 활성화에 PKG의 역할을 포함시켰다.
C. 실험 과정 및 결과-JNK 활성
SW480 인간 결장암 세포를 용매 DMSO 또는 cGMP-특이적인 PDE 억제제(즉, 슐린닥 설파이드, 50 내지 500 μM; 엑시슐린드, 100 내지 600 μM; 화합물 A, 0.1 내지 5 μM; 및 화합물 B, 1 내지 50 μM)로 1 시간 동안 처리하고 JNK1 활성화에 대해 분석하였다. 이들 농도는 상기 농도가 최적의 세포소멸 유도를 제공하기 때문에 선택되었다. 내생적인 JNK1을 항-JNK1 항체로 면역침강시키고 생체외에서 키나제 분석을 기질로서 GST-c-Jun(1-79)를 사용하여 수행하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 슐린닥 설파이드, 엑시슐린드 및 화합물 A 및 B는 JNK1을 활성화시켰다. 유도 배수를 인 화상기 분석에 의해 정량화하고 도 1a에 나타낸다. 매우 낮은 투여량이라 할지라도, 강력한 SAAND인 화합물 A 및 B는 슐린닥 설파이드나 엑시슐린드보다 더 강하게 JNK1을 활성화시켰다. 유사한 효과가 HCT116 및 HT29를 포함한 다른 결장암 세포 주에서 관찰되었다(데이터는 도시 안됨).
시간 경과 연구는 SW480 세포를 화합물 A(1 μM)로 처리했을 때 JNK1의 활성화가 24 시간 이상 지속됨을 나타냈다(도 1b). 이어서 본 발명자들은 SW480 세포를 유사 농도의 슐린닥 설파이드, 엑시슐린드, 화합물 A 또는 화합물 B로 처리한 후에 카스파제-3 활성을 측정함으로써 이들 화합물의 세포소멸 활성을 확인하였다. 이어서 단백질 추출물을 제조하고 기질로서 Ac-DEVD-AFC를 사용하여 카스파제-3 억제제인 Ac-DEVD-CHO의 존재 또는 부재 하에서 카스파제-3 활성을 측정하였다. 도 1c는 SW480 세포의 이들 화합물 모두에 의한 처리로 카스파제-3가 활성화됨을 나타낸다. 유사한 발견이 HCT116 및 HT29 세포에 대해서 얻어졌다(데이터 도시 안됨).
이어서 SW480 세포에서 JNK1 활성에 대한 cGMP 수준의 상승 효과를 시험하였다. cGMP의 세포내 수준을 상기 미국 특허 출원들(8,9)에서 교시한 바와 같이, 구아닐레이트 사이클라제에 의해 양으로 조절하고 포스포디에스테라제 2 및 5(PDE2/5)에 의해 음으로 조절한다. SW480 세포를 1 시간 동안 cGMP 조절제로 처리하고 이어서 JNK1 분석을 위해 단백질 추출물을 수거하였다(도 2a). 세포-투과성 cGMP 동족체인 디부티릴구아노신 3':5'-환상 모노포스페이트(“dbcGMP”; 500 μM)는 SW480 세포에서 JNK1을 활성화시켰으나, 세포 투과성 cAMP 동족체인 디부티릴아데노신 3';5'-환상 모노포스페이트(dbcAMP; 500 μM)는 불활성이었다. YC-1(50 μM), 구아닐레이트 사이클라제 활성화제가 또한 JNK1을 활성화시켰다. MY-5445(50 μM) 및 디피리다몰(10 μM), PDE5-특이적인 억제제는 또한 SW480 세포에서 JNK1을 활성화시켰다. 이들 cGMP 조절제에 의한 JNK1의 유사한 활성화가 HCT116 및 HT29 세포에서 관찰되었다(데이터는 도시 안됨). 이러한 결과는 다양한 수단들에 의한 cGMP 수준의 상승으로 결장암 세포에서 JNK1이 활성화됨을 나타낸다. dbcAMP가 아닌 dbcGMP가 이들 세포에서 JNK1을 활성화시키므로 상기 신호는 cGMP에 대해서는 특이적이나 cAMP에 대해서는 그렇지 않은 것으로 보인다.
PKG는 cGMP의 주요 세포 표적들 중 하나이며, cGMP, 또는 상기 언급된 동족체의 결합은 PKG 활성화를 생체내 및 생체외 모두에서 활성화시킨다. 그러나, 신호 변환 경로에서의 PKG의 정확한 역할은 알려지지 않고 있다. 본 발명을 이끄는 실험의 결과들이 cGMP를 증가시키는 인자들에 의해 JNK1이 활성화됨을 지적하였으므로, PKG-특이적인 억제제인 Rp-8-pCPT-cGMP가 JNK1의 활성화를 유도하는 SAAND의 능력을 억제할 수 있는지에 대한 여부를 시험하였다. 대조군으로서, KT5720을 단백질 키나제 A(“PKA”)-특이적인 억제제로서 사용하였다. SW480 세포를 DMSO, KT5720(2 μM) 또는 Rp-8-pCPT-cGMPS(2 μM)로 2 시간 동안 처리하고, 이어서 DMSO 또는 화합물 B(1 또는 10 μM)로 1 시간 동안 처리하였다. 세포 추출물을 수거하고 JNK1 활성화에 대해 분석하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, Rp-8-pCPT-cGMP는 화합물 B-유도된 JNK1 활성화를 강력하게 억제하는 반면, KT5720은 억제 활성을 갖지 않았다. 이들 결과는 함께 SAAND가 cGMP/PKG 경로를 통해 JNK1을 활성화시킴을 나타낸다.
상기 개시된 JNK1 활성화에 포함된 신호 변환 경로를 추가로 특성화시키기 위해서, JNK1의 바로 상위 단백질 키나제인 SEK1이 또한 SAAND에 의해 활성화되는지의 여부를 시험하였다. SEK1의 활성화는 단백질 키나제 MEKK1에 의해 상기 단백질의 2 개의 잔기, 즉 Ser219 및 Thr223의 인산화를 통해 일어난다. SW480 세포를 화합물 A(1 μM)로 다양한 회수로 6 시간까지 처리하고, 추출물을 인-Thr223-특이적인 SEK1 항체를 사용하여 웨스턴 블럿 분석에 의해 분석하였다. 화합물 A에 의한 처리는 내생적인 SEK1 단백질의 전체 세포 수준을 변화시키지 않으면서 15 내지 30 분 내에 SEK1의 인산화를 증가시켰다(도 3a 참조). 1 시간까지 9 배가 유도되었으며, 이러한 효과는 6 시간 이상 지속되었다(도 3a 참조). 상기 세포를 DMSO 용매로만 처리한 경우 SEK1의 인산화를 일어나지 않았다(데이터 도시 안됨).
이어서 SEK1의 바로 상위의 단백질 키나제인 MEKK1에 대한 SAAND의 효과를 시험하였다. MEKK1에 대한 웨스턴 블럿 분석은 SW480 세포를 화합불 A로 하루 또는 2 일간 처리한 후에 상기 단백질이 절단되었으나, 상기 세포를 DMSO로 처리한 경우에는 절단이 나타나지 않았음을 밝혔다(도 3b). 선행의 연구들은 MEKK1이 카스파제의 활성화 도중 절단됨을 지적하였다(19). 본 발명자들은 또한 MEKK1 자동인산화 및 GST-SEK1의 인산화에 의해 측정된 바와 같이 화합물 A에 의해 MEKK1의 활성이 강력하게 일시적으로 활성화됨을 관찰하였다. 이러한 데이터는 SAAND가 MEKK1-SEK1 경로를 통해 JNK1을 활성화시킴을 시사한다. 그러나, cGMP-활성화된 PKG가 MEKK1을 직접 활성화시키지는지, 혹은 MEKK1의 절단 및 활성화가 세포소멸 과정의 간접적인 효과인지는 분명하지 않다.
최종적으로, pKG 경로의 활성화가 SAAND에 의한 세포소멸의 유도에 필요한지를 조사하였다. SW480 세포를 DMSO 또는 PKG 억제제인 Rp-8-pCPT-cGMPS(2 μM)로 2 시간 동안 처리하고, 이어서 상기 세포를 DMSO 또는 화합물 A(1 μM)로 2 일간 처리하였다. 부유 세포 및 부착된 세포들을 수거하고, 세포 용균물을 항-폴리(ADP-리보오스)폴리머라제(PARP) 항체를 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 상기 PARP에 대해 분석하였다. PARP는 NAD를 니코틴아미드와 단백질-결합된 ADP-리보오스 중합체로 전환시키는 116 kD의 핵성 효소이며, DNA 보수 및 게놈 유지에 중요하다. 세포소멸을 겪은 세포에서, 상기 116 kK PARP 단밸직은 카스파제 3에 의해 85 및 25 kD의 단편들로 절단되어 정상적인 PARP 기능을 상실하게 된다. 이러한 PARP의 불활성화는 NAD 및 ATP(세포소멸의 이후의 사건들에 필요한 것으로 보인다)의 세포 수준의 소모를 명백하게 방지한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 화합물 A는 PARP 절단을 유도하지만, 이 절단은 세포를 PKG 억제제인 Rp-8-pCPT cGMPS와 예비 배양시킴으로써 현저하게 억제된다. 또한, SW480 세포에서 우세한 음성 JNK1 단백질의 발현은 PARP의 화합물 A-유도된 절단을 강력하게 억제함을 관찰하였다. 이러한 데이터는 상기 cGMP/PKG/JNK1 경로가 SW480 세포에서 상기 SAAND에 의해 유도된 세포소멸에 중요한 역할을 하는 증거를 제공한다.
따라서, 이들 실험에서, 본 발명자들은 SAAND 및 다른 cGMP-유도인자가 신호 변환의 JNK1 경로를 활성화시킴을 처음으로 보이며, 상기 경로가 이들 화합물에 의해 유발된 세포소멸에서 중요한 역할을 한다는 증거를 제공한다. 본 발명의 결과들을 기본으로 하는 도식을 도 5에 나타낸다.
미국 특허 출원 제 09/414,626 호 및 09/216,070 호에는 엑시슐린드(Aptosyn), 및 2 개의 효능있는 유도체인 화합물 A 및 B가 SW480 세포 및 다른 암-유발된 세포 주에서 cGMP-특이적인 포스포디에스테라제 2 및 5를 억제하여, cGMP의 세포 수준을 증가시킴이 개시되어 있다. 이에 의해 미국 특허 출원 제 09/414,628 호에 교시된 바와 같이 PKG가 활성화된다. PKG의 활성화는 30 내지 60 분 내에 SEK1의 지속적인 인산화와 활성화를 일으키며, 이는 차례로 도 5에 도시된 바와 같이 JNK1의 빠르고 지속적인 활성화를 일으킨다. 이어서 JNK1의 활성화는 카스파제, PARP의 절단, 및 JNK1을 활성화시키는 다른 비-SAAND 세포소멸제에 대해 이미 개시한 바와 같이, 세포소멸 프로그램에 또한 기여하는 유전자의 전사를 전사시킨다. 다수의 연구자들이 JNK1이 UV 및 γ-조사, 벤질 이소티오시아네이트, 및 DNA 토포아이소머라제 억제제인 β-라파콘을 포함한 다양한 약제들에 의해 촉발되는 세포소멸 신호 경로에 관여함을 보고하였다. 그러나, 이들 방법 중 어느 것도 cGMP 또는 PKG를 포함시키지 않는다.
JNK1은 AP-1 전사 인자를 활성화시키며, 이에 의해 세포소멸에 관련되는 다수의 유전자를 유도한다. 상기는 또한 bcl-2를 인산화시키며 따라서 그의 항-세포소멸 활성을 불활성화시킨다. 이는 PKG의 활성화가 또한 SAAND의 성장 억제 및 세포소멸 효과에 기여할 수 있는 다른 경로들에 영향을 미치는 것처럼 보인다. 이러한 연구들은 PKG를 신호 변환을 위한 JNK1 경로에 관련시키며, 따라서 신호 변환 및 유전자 발현 조절에서의 상기 효소 시스템의 역할을 확장시키는 첫 번째 증거를 제공한다.
D. 종양 세포에서 SAAND가 PKG 활성을 증가시키는 것에 대한 추가적인 확인
하기 개시된 PKG 분석을 사용하여, SAAND가 상기로 처리된 종양 세포에서 PKG 발현의 증가 또는 cGMP 수준의 증가(또는 이들 모두)에 기인하여 PKG 활성을 증가시키는 것을 확립시키기 위해서 하기의 실험을 수행하였다.
2 개의 상이한 유형의 PDE 억제제를 종양 세포에서 PKG에 대한 이들의 효과에 대해서 평가하였다. SAAND인 엑시슐린드를 상기가 항-종양성이므로 평가하였다. 또한, 비-SAAND인 전통적인 PDE5 억제제 E4021을 PKG 상승이 단순히 전통적인 PDE5 억제에 기인하는지, 혹은 PKG 상승이 PDE5 및 1998년 10월 15일자로 출원된 리우(Liu) 등의 미국 특허 출원 제 09/173,375 호에 개시된 바와 같은 신규 PDE의 SAAND 억제에 대한 전-세포소멸 효과에 관련된 것인지를 확인하기 위해서 평가하였다.
APC 돌연변이를 함유하는 종양에 대한 cGMP-특이적인 PDE 억제의 효과를 시험하기 위해서, SW480 결장암 세포를 사용하였다. SW480은 APC 돌연변이를 함유하는 것으로 공지되어 있다. RPMI 5% 혈청 중의 약 5 백만개의 SW480 세포를 각각 8 개의 접시에 가하였다:
2개의 10 ㎝ 접시---30 μM DMSO 비히클 대조군(약물 없음),
3개의 10 ㎝ 접시---DMSO 중의 200 μM, 400 μM, 600 μM의 엑시슐린드, 및
3 개의 10 ㎝ 접시---E4021; DMSO 중의 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM.
상기 접시들을 5% CO2배양기에서 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다.
액체 배지를 상기 접시들로부터 흡기시킨다(세포 자체가 상기 접시들에 부착될 것이다). 부착된 세포들을 각각의 접시에서 냉 PBS로 세척하고, 200 μM의 세포 용해 완충액(즉, 50 mM 트리스-HCl, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 500 μM IBMX와 프로테이나제 억제제)을 각각의 접시에 가한다. 세포 용균 완충액을 가한 직후에, 용균된 세포들을 각 접시에서부터 세포들을 긁어내어 수거한다. 각 접시로부터의 세포 용균물을 마이크로퓨즈 튜브로 옮기고, 상기 마이크로퓨즈 튜브를 서서히 교반시키면서 4 ℃에서 15 분간 배양시켜 세포들을 완전히 용해시켰다. 용해를 완료시킨 후에, 상기 마이크로퓨즈 튜브를 충분한 속도(14,000 rpm)로 15 분간 원심분리시켰다. 상기 튜브로부터의 상등액을 새로운 마이크로퓨즈 튜브로 옮겼다.
이어서 상기 약물이 세포 성장을 억제한다면 전체 단백질의 양이 상기 약물-처리된 샘플에서보다 대조군에서 더 많을 것이므로 각 마이크로튜브의 함량에 대해 단백질 분석을 수행한다. 명백하게, 상기 약물이 작용한다면, 상기 약물-처리된 샘플 중의 전체 단백질은 실제로 대조군과 동일해야 한다. 상기의 상황 하에서, 대조군 및 E-4021 마이크로퓨즈 튜브를 고-용량 엑시슐린드-처리된 샘플(보다 낮은 용량의 엑시슐린드 그룹들에 대해서는 최고 용량의 엑시슐린드 샘플로 표준화시켜야 한다)로 표준화시키기 위해서 희석이 필요하다. 따라서, 단백질 분석을 수행한 후에, 다양한 샘플들의 전체 단백질 농도를 표준화해야 한다(예를 들어, 희석에 의해).
각 약물의 농도 및 대조군에 대해서, 2 개의 PKG 분석을 수행하며, 이때 하기에 상세히 개시된 바와 같이 하나에는 cGMP를 가하고, 다른 하나에는 cGMP를 가하지 않는다. 이들 2 개의 상이한 PKG 분석을 수행하는 이유는 cGMP가 PKG를 특이적으로 활성화시키기 때문이다. PKG 활성화를 본 발명의 신규한 PKG 분석을 사용하여 분석하는 경우, PKG 활성의 임의의 증가가 세포 중의 cGMP의 증가(cGMP-특이적인 PDE 억제에 의해 야기될 수도 있다)에 의한 것인지, 혹은 PKG 활성 수준이 PKG 단백질의 증가된 발현에 의한 것인지를 확인할 수 없다. 동일한 샘플에서 cGMP를 가한 것과 가하지 않은 것 모두에 대해 PKG 활성을 측정함으로써 PKG 활성의 증가(존재하는 경우)가 증가된 PKG 발현에 기인한 것인지를 확인할 수 있다. 따라서, 항-종양성 약물이 PKG 활성을 대조군에 비해 상승시키는 경우, 상기 약물-유도된 증가가 (1) 여분의 cGMP를 갖는 약물-처리된 샘플이 여분의 cGMP를 갖는 대조군 샘플에 비해 보다 큰 PKG 활성을 나타내고, (2) 여분의 cGMP가 없는 약물-처리된 샘플이 대조군에 비해 보다 큰 PKG 활성을 나타내는 경우, 상기 약물-처리된 샘플에서의 증가된 PKG 단백질 발현(활성화와 상반됨)에 기인한다는 것을 확립시킬 수 있다.
그 후에, cGMP가 첨가된 것과 첨가되지 않은 유사 샘플을 제조하고, 각각의 세포 용해물 50 ㎕를 상기 개시된 PDE5/GST 고체 상 기질 슬러리 20 μM에 가한다. 각 대조군 또는 약물 세포 용해물 샘플을 평가하기 위해서, 각 혼합물에 10 μCi32P-γ-ATP 용액(200 μM ATP, 4.5 mM MgCl2; 5 mM KH2PO4; 5 mM K2HPO4)을 함유하는 인산화 완충액을 가하여 반응을 개시시킨다. 생성된 혼합물을 30 ℃에서 30 분간 배양한다. 이어서 상기 혼합물을 원심분리시켜 상기 고체상을 분리시키고, 상등액은 버린다. 각 튜브 중의 고체 상을 700 ㎕의 냉 PBS로 세척한다. 상기 고체 상에 라엠리(Laemmli) 샘플 완충액(Bio-Rad)(30 ㎕)을 가한다. 상기 혼합물을 5 분간 비등시키고, 7.5% SDS-PAGE에 건다. 상기 겔을 150 V에서 1 시간 동안 실행시킨다. 수득된 밴드를 쿠마씨 블루로 염색하여 85 kD GST-PDE5 융합 단백질 밴드(존재하는 경우)를 가시화한다. 상기 겔을 건조시켜 x-선 필름 상에 놓고, PDE5가 인산화된 경우, 상기 필름은 상응하는 짙은색 밴드를 나타낼 것이다. 각 밴드의 진한 부분은 인산화의 정도와 관련된다.
도 8a 및 8b에 도시된 바와 같이, SAAND 엑시슐린드는 여분의 cGMP가 있고없는 대조군 샘플에 비해 cGMP가 있고 없는 샘플 모두에서 투여량-의존 방식으로 PKG 활성을 증가시킨다. 이는 각각의 약물-처리된 샘플에서 85 Kd 밴드의 보다 진한 외관에 의해 입증된다. 또한, 엑시슐린드로 처리된 SW480 샘플은 분석 시 엑시슐린드만(즉 cGMP가 첨가되지 않음)으로 처리된 샘플에 비해 cGMP 첨가 시 보다 큰 PKG 인산화 활성을 나타낸다. 따라서, 약물-처리된 샘플에서 PKG 활성의 증가는 SAAND가 cGMP-특이적인 PDE를 억제하는 경우 세포성 cGMP의 증가에 의한 PKG의 활성화에만 기인하는 것이 아니며, APC 돌연변이를 갖는 종양에서 PKG 활성의 증가는 또한 증가된 PKG 발현에도 기인한다.
E4021-처리된 SW480 샘플이 대조군에 비해 PKG 활성화를 나타내지 않는다는 사실(도 8a 및 8b 참조)은 또한 APC 돌연변이를 함유하는 종양에서 SAAND에 의해 야기된 PKG 활성의 증가가 단순히 전통적인 PDE5의 억제 기인하는 것은 아님을 보여준다.
PKG 활성화를 평가하기 위한 분석 기법으로서, 상기 개시된 x-선 필름 노출 대신에, SDS-PAGE로부터 85 Kd 밴드를 절단시킴으로써 상기 밴드를 인산화의 정도에 대해서 평가할 수 있으며, 제거된 밴드에 결합된32P를32P 창에서 섬광(베타) 계수기에 의해 카운트할 수 있다.
β-카테닌 돌연변이를 함유하는 종양에 대한 cGMP-특이적인 PDE 억제의 효과를 시험하기 위해서, HCT116 결장암 세포를 사용하였다. HCT116은 β-카테닌 돌연변이를 함유하지만 APC 돌연변이는 함유하지 않는 것으로 공지되어 있다.
상기 개시된 SW480 공정에 사용된 바와 동일한 공정을 사용하여 HCT116 세포를 생육시킨다. 본 실험에서, 오직 엑시슐린드와 대조군만을 사용하였다. 엑시슐린드-처리된 세포는 상응하는 대조군보다 큰 정도로 인산화된 PKG를 생성시켰으며, 이는 PKG 활성화가 APC 돌연변이와 무관한 약물-처리된 세포에서 발생함을 가리킨다.
따라서, 본 발명의 목적을 위해서, 청구의 범위에서 “환원 β-카테닌”이란 상기 단백질의 야생형 및/또는 돌연변이형을 지칭한다.
E. 웨스턴 블럿에 의한 W480 에서의 증가된 PKG 발현과 감소된 β-카테닌의 확인
상기 입증된 바와 같이, SAAND는 PKG의 발현을 증가시키고 cGMP 수준을 증가시키며, 이들은 모두 SAAND-처리된 종양 세포에서 PKG 활성을 증가시킨다. 이러한 PKG 단백질 발현의 증가는 하기 개시되는 바와 같이 상대적으로 정량적인 웨스턴 블럿에 의해 추가로 입증된다.
앞서 개시된 바와 같이 엑시슐린드로 처리된 SW480 세포를 빙-냉 PBS로 1 회 세정함으로써 마이크로퓨즈 튜브로부터 수확한다. 상기 세포를 변형된 RIPA 완충액에 의해 15 분간 교반하면서 용해시킨다. 상기 세포 용해물을 저온실에서 회전시킨다. 상등액을 회전 직후에 새로운 마이크로퓨즈 튜브로 옮긴다. BioRad DC 단백질 분석(Temecula, CA)을 수행하여 샘플 중의 단백질 농도를 측정한다. 상기 샘플들을 상기 개시한 바와 같이 단백질 농도에 대해 표준화한다.
각 샘플 50 ㎍을 10% SDS 겔에 건다. SDS-PAGE를 수행하고, 이어서 단백질을 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮긴다. 블럿팅된 니트로셀룰로즈 멤브레인을 5% 비 지방 분유를 함유하는 새로 제조된 TBST에서 실온에서 1 시간 동안 일정하게 교반하면서 차단시킨다.
염소-항-PKG 1 차 항체를 새로운 TBST/5% 비 지방 분유에서 권장 농도/희석비로 희석한다. 상기 니트로셀룰로즈 멤브레인을 상기 1 차 항체 용액에 넣고 실온에서 교반하면서 1 시간 동안 배양시킨다. 상기 니트로셀룰로즈 멤브레인을 10 분간 매번 TBST로 3 회 세척한다. 상기 니트로셀룰로즈 멤브레인을 2 차 POD 결합된 토끼 항-염소 항체를 함유하는 용액 중에서 1 시간 동안 실온에서 교반하면서 배양한다. 상기 니트로셀룰로즈 멤브레인을 10 분간 매번 TBST로 3 회 세척한다. 베링거 만하임(Boehringer Mannheim) BM 블루 POD 기질을 사용하여 검출을 수행한다.
도 9에 그래프로 나타낸 바와 같이, 엑시슐린드는 β-카테닌을 강하시키고 PKG를 증가시키며, 이때 상기 데이터는 웨스턴 블럿에 의해 수득된 것이다. SW480 세포를 엑시슐린드 또는 비히클(0.1% DMSO)로 48 시간 동안 처리하였다. 각 세포 용해물의 상등액 50 ㎍을 10% SDS-겔에 걸고 니트로셀룰로즈 멤브레인에 블럿팅하고, 상기 멤브레인을 토끼-항-β-카테닌과 토끼 항-PKG 항체로 탐침 검사하였다.
F. 종양 세포에서 SAAND에 의한 β-카테닌 수준의 감소
본 관찰은 SW480 세포를 200, 400 또는 600 μM의 엑시슐린드 또는 비히클(0.1% DMSO)과 함께 배양함으로써 수행하였다. 상기 세포를 처리 후 48 시간 째에 수확하고 면역블럿팅을 수행하였다. 면역-반응성 단백질을 웨스턴 블럿에 의해 검출할 수 있다. 웨스턴 블럿 분석은 β-카테닌의 발현이 대조군에 비해 엑시슐린드-처리된 세포에서 50%까지 감소되었음을 입증하였다. 이러한 결과는 β-카테닌이 SAAND 처리에 의해 감소됨을 가리킨다. PKG 활성이 상기와 같은 처리에 의해 증가함을 확립시킨 상기 결과, 및 β-카테닌이 PKG에 의해 인산화됨을 확립시킨 하기의 결과는 함께 종양 세포에서 β-카테닌의 감소는 PKG의 활성화에 의해 개시됨을 가리킨다. 따라서, 항-종양성 화합물을 선택하는 선별 도구로서 종양에서의 PKG 활성을 사용하는 것이 유용하다.
G. PKG에 의한 β-카테닌의 인산화
생체외에서 PKG는 β-카테닌을 인산화한다. 이를 확립시킨 실험은 β-카테닌 함유 착체를 하기 “β-카테닌 면역침강법”에 개시된 방식으로 SW480 세포(어떠한 약물로도 처리되지 않음)로부터 면역침강시킴을 포함한다. 상기 면역침강된 착체를 여전히 고체 상(즉, 비이드)에 포집되어 있는 동안32P-γ-ATP 및 순수한 PKG(100 단위)와 혼합한다. PKG가 첨가되지 않은 상응하는 대조군을 제조한다.
단백질을 SDS 완충액에 의해 고체 상으로부터 분리시키고, 단백질-함유 혼합물을 7.5% DSD-PAGE 겔에 건다. 상기 겔에 상기 혼합물을 거는 것은 상기 혼합물로부터 과잉의32P-γ-ATP를 제거한다. 따라서 93Kd β-카테닌 밴드에서 검출된 임의의32P-γ-ATP는 β-카테닌의 인산화에 기인한다. 여분의 PKG를 갖지 않는 대조군에 비해 여분의 PKG로 처리된 상기 93 Kd β-카테닌 밴드에서 검출된32P-γ-ATP의 임의의 증가는 상기 여분의 PKG에 의해 처리된 밴드에서 β-카테닌의 인산화에 기인한다.
실제적으로 검출할 수 정도의 최소의 인산화를 나타내는 대조군에 비해 PKG로 처리된 밴드에서 인산화가 주목할만하게 증가하였다는 결과를 얻었다. 상기 결과는 β-카테닌을 PKG에 의해 인산화할 수 있음을 가리킨다.
H. PKG에 의한 돌연변이 β-카테닌의 인산화
바로 앞에서 개시한 바와 동일한 공정을 HCT116 세포(APC 돌연변이를 함유하지 않고 β-카테닌 돌연변이를 함유한다)에 대해 수행하였다. 이들 실험의 결과는 또한 돌연변이 β-카테닌이 PKG에 의해 인산화됨을 지적한다.
따라서, 본 발명의 목적을 위해서, 특허청구범위에서 β-카테닌의 인산화는 상기 단백질의 야생형 및/또는 돌연변이형의 인산화를 지칭하는 것이다.
I. PKG에 의한 β-카테닌의 침강
SW480 및 HCT116 세포 용해물 모두의 상등액을 상기 웨스턴 블럿 실험에서 개시한 바와 동일한 방식으로 제조한다. 상기 세포 용해물을 세포 용해물 500 ㎍ 당 단백질 A 세파로스 비이드 슬러리(50%) 150 ㎕를 가하고 튜브 진탕기에서 10 분간 4 ℃에서 배양시킴으로써 미리 등명화시킨다. 단백질 A 비이드를 4 ℃에서 14,000 x g에서 원심분리에 의해 제거한다. 상기 상등액을 새로운 원심분리 튜브로 옮긴다. 토끼의 타클론성 항-β-카테닌 항체(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) 10 ㎍을 세포 용해물 500 ㎍에 가한다. 상기 세포 용해물/항체 혼합물을 튜브 진탕기에서 4 ℃에서 2 시간 동안 서서히 혼합한다. 상기 면역착체를 150 ㎕의 단백질 A 세파로스 비이드 슬러리(75 ㎕의 충전된 비이드)를 가하고 상기 혼합물을 4 ℃에서 밤새 튜브 진탕기 상에서 서서히 흔들어 포착하였다.상기 세파로스 비이드를 펄스 원심분리(14,000 rpm에서 미세원심분리로 5 초간)에 의해 수거한다. 상등액 부분을 버리고, 비이드는 800 ㎕의 빙냉 PBS 완충액으로 3 회 세척한다. 상기 세파로스 비이드를 150 ㎕ x 2의 샘플 완충액에 재현탁시키고 서서히 교반한다. 상기 세파로스 비이드를 5 분간 비등시켜 상기 비이드로부터 면역착체를 분리시켰다. 상기 비이드를 원심분리에 의해 수거하고, SDS-PAGE를 상등액에 대해 수행한다.
웨스턴 블럿을 상기 상등액에서 실시하고, 이어서 멤브레인을 토끼 항 β-카테닌 항체로 탐침 조사한다. 이어서 상기 멤브레인을 10 분간 매번 TBST로 3 회 세척하여 과잉의 항 β-카테닌 항체를 제거한다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 염소 항-토끼 항체를 가한 다음 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 이를 수행하면, HRPO 기질을 사용하여 β-카테닌의 존재를 가시화할 수 있다. 이 실험에서, β-카테닌의 존재를 확실히 가시화할 수 있다.
동일한 멤브레인 상의 PKG를 검출하기 위해서, 항-β-카테닌 항체 결합물을 먼저 55 ℃ 수욕에서 0.5 시간 동안 2% SDS 및 100 μM의 2β-머캅토에탄올을 갖는 62 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.6)으로 상기 멤브레인으로부터 스트립핑시킨다. 이어서 상기 스트립핑된 멤브레인을 교반하면서 실온에서 1 시간 동안 5% 비-지방 분유를 갖는 TBST에서 차단시킨다. 이어서 상기 차단된, 스트립핑된 멤브레인을 토끼의 다클론성 항-PKG 항체(Calbiochem, LaJolla, CA)로 탐침조사하며, 상기 항체는 HRPO에 결합된 염소 항-토끼 2 차 항체로 검출된다. 상기 블럿 멤브레인 상의 PKG의 존재를 HRPO 기질로 가시화한다. 이 실험에서, 실제로 PKG는 가시화되었다. 상기 멤브레인 상의 유일한 단백질이 세포 상등액 중에서 β-카테닌으로 면역침강된 것인 경우, 이러한 결과는 PKG가 세포 상등액에서 β-카테인을 함유하는 단백질 착체에 물리적으로 결합되었음을 분명히 확립시킨다.
동일한 웨스턴 블럿 멤브레인을 또한 상기가 β-카테닌으로 공-침강되는지의 여부를 확인하기 위해서 항-GSK3-β 항체로 스트립핑시킨 후에 탐침조사하였다. 이 실험에서, 본 발명자들은 상기 멤브레인 상에서 GSK3-β를 검출하였으며, 이는 상기 3 개의 단백질이 동일한 착체의 부분일 수 있음을 시사한다. GSK3-β 및 β-카테닌이 정상 세포에서 APC 착체의 일부를 형성하므로, PKG는 동일한 착체의 부분일 수 있으며 상기 착체의 β-카테닌의 인산화에 포함될 수 있다.
II. 본 발명을 사용한 약학 조성물의 선별
A. 전반적인 내용
종양을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있고, 심각한 부작용을 특징으로 하지 않는 화합물을 확인하기 위해서 JNK를 PKG 또는 PDE2(PDE5의 존재 여부에 관계없이)와 함께 사용한다.
암 및 전암을 조절되지 않는 세포 성장을 수반하는 질병으로서 고려할 수 있다. 세포 성장은 다수의 상이한 인자들을 수반한다. 하나의 인자는 어떻게 세포가 급속히 증식하는가이고, 또 다른 하나는 어떻게 세포가 급속히 죽는가이다. 세포는 환경적인 자극의 유형에 따라 세포괴사 또는 세포소멸에 의해 죽을 수 있다. 세포 분화가 또한 종양 성장 역학에 영향을 미치는 또 다른 인자이다. 세포 성장의 다수의 태양이 화합물에 의해 영향을 받는 것을 해결하는 것이 약학요법에 관련된 표적의 발견에 중요하다. 이러한 기술을 근거로 하는 선별 분석을 성장 억제 및 전-세포소멸 활성을 갖는 화합물을 선택하기 위한 다른 시험들과 결합시킬 수 있다.
본 발명은 종양 세포 성장의 바람직한 억제제가 세포소멸에 의한 암 세포의 조기 사망을 유도한다는 발견으로부터 전개되었다(Piazza, G.A., et al., Cancer Research, 55(14), 3110-16, 1995). 또한, 뜻밖에도 상당한 COX 억제없이 세포소멸을 선택적으로 유도하고 또한 PDE5/2를 억제하는 화합물을 발견하였다. 특히, 선두의 과학적 연구들과 대조적으로, 종양 병변의 치료에 바람직한 화합물은 PDE5(EC3.1.4.17)를 억제한다. PDE5는 포스포디에스테라제의 10 개 이상의 유전자 군들 중 하나이다. PDE5 및 본 발명의 신규한 PDE는 cAMP가 아닌 환상 GMP를 선택적으로 분해함에 있어서 독특한 반면, 다른 PDE 군들은 cGMP가 아닌 cAMP를 선택적으로 분해/가수분해하거나 cGMP 및 cAMP를 모두 비-선택적으로 분해한다.
B. JNK 선별
상기 설명한 바와 같이, 화합물들을 상기 개시된 방법을 사용하여 종양 세포에서 JNK를 활성화시키는 능력에 대해 평가할 수 있다.
C. PKG 선별
PKG 활성을 분석하는데 신규의 분석을 사용하며, 이를 본 발명의 선별 방법에 사용한다. 설명을 위해서, 화합물이 종양의 치료에 잠재적으로 유용한지를 확인하기 위해서 PKG 활성이 약물 평가에 어떻게 유용할 수 있는가를 개시하기 전에, 먼저 상기 PKG 분석을 개시하는 것이 유용하다.
상기 신규한 PKG 분석은 고체 상의 복수의 아미노산 서열들에의 결합을 포함하며, 상기 서열들은 각각 적어도 cGMP 결합 영역과 포스포디에스테라제 유형 5(“PDE5”)의 인산화 부위를 함유한다. 상기 서열은 공지된 것이며 하기 문헌에 개시되어 있다. 바람직하게는, 결합된 PDE5 서열은 하기 개시하는 바와 같이 PDE5의 촉매 영역을 포함하지 않는다. 고체 상에 PDE5 서열이 결합하는 한 가지 방법은 상기 서열을 PDE5 서열의 융합 단백질 및 아미노산 결합 쌍의 일원으로서 발현시키고 상기 아미노산 결합 쌍의 다른 일원을 고체 상(예: 비이드)에 화학적으로 결합시키는 것이다. 사용할 수 있는 한가지 결합 쌍은 글루타치온 S-트랜스퍼라제(“GST”) 및 글루타치온(“GSH”)이며, 이때 GST는 상기 개시된 PDE5 서열과의 융합 단백질로서 발현되고, GSH는 고체 상에 공유 결합된다. 이러한 방식으로, 상기 PDE5 서열/GST 융합 단백질을 하기 개시되는 바와 같이, 단순히 고체 상 위에 상기 융합 단백질을 함유하느 용액을 통과시킴으로써 상기 고체 상에 결합시킬 수 있다.
RT-PCR 방법을 사용하여 소 PDE5A cDNA 서열(McAllister-Lucas L. M. et al., J. Biol. Chem. 268, 22863-22873, 1993)로부터 디자인되고 PDE1-10 계열 중에서 선택된 전방 및 역 프라이머를 갖는 PDE5의 cGB 영역을 수득한다. 전체 RNA에 대한 5'-3' 결합된 키트에 이어서 mRNA의 올리고(dT) 컬럼 정제를 HT-29 세포에 사용한다. 전방 프라이머(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G, 203-227) 및 역 프라이머(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 1664-1686)를 인산화 부위, 및 인간 PDE5A의 저 및 고 친화성 cGMP 결합 부위(203-1686 pb, cGB-PDE5)를 암호화하는 1484 bp 단편을 합성하는데 사용한다. 상기 합성된 cGB-PDE5 뉴클레오티드 단편은 소 PDE5A와 97% 유사한 494 개 아미노산을 암호화한다. 이어서 상기를 tac 프로모터, 및 EcoRI 및 XhoI 절단 부위로 pGEX-5X-3 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 벡터(Pharmacia Biotech)내로 클로닝시킨다. 이어서 상기 융합 벡터를 이 콜라이 BL21(DE3) 세균(Invitrogen)에 형질감염시킨다. 상기 형질감염된 BL21 세균을 대수기까지 증식시키고, 이어서 IPTG를 유도인자로서 가한다. 상기 유도를 20 ℃에서 24 시간 동안 수행한다. 상기 세균을 수확하고 용해시킨다. 가용성 세포 용해물을 GSH 결합된 세파로스 4B(GSH-세파로스 4B)와 함께 배양한다. 상기 GST-cGB-PDE5 융합 단백질은 GSH-세파로스 비이드에 결합될 수 있으며 다른 단백질은 과잉의 냉 PBS에 의해 비이드로부터 씻겨진다.
발현된 GST-cGB-PDE5 융합 단백질은 7.5% SDS-PAGE 겔 상에 85Kd 단백질로서 나타난다. 이는 그의 cGMP 결합 및 단백질 키나제 G 및 A에 의한 인산화를 특징으로 한다. 상기는 2 개의 cGMP 결합 부위를 나타내며, Kd는 1.6 ± 0.2 μM이고, 이는 고유 소 PDE5의 Kd=1.3 μM에 가깝다. GSH 결합된 세파로스 비이드 상의 GST-cGB-PDE5를 cGMP-의존성 단백질 키나제 및 cAMP-의존성 단백질 키나제 A에 의해 생체외에서 인산화시킬 수 있다. PKG에 의한 GST-cGB-PDE5 인산화의 Km는 2.7 μM이고 Vmax는 2.8 μM인 반면, BPDEtide 인산화의 Km는 68 μM이다. PKG에 의한 인산화는 하나의 분자 포스페이트가 하나의 GST-cGB-PDE5 단백질 비로 결합됨을 나타낸다.
상기 개시된 PDE5-결합된 고체 상을 사용하여 PKG를 함유하는 것으로 여겨지는 액체 샘플을 분석하기 위해서, 상기 샘플 및 고체 상을32P-γ-ATP 함유 인산화 완충액과 혼합한다. 상기 용액을 30 ℃에서 30 분간 배양시켜 PKG(존재하는 경우)에 의한 PDE5 서열의 인산화를 허용한다. 이어서 상기 고체 상을 용액으로부터 분리시키고(예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해) 포스페이트-완충 염수(“PBS”)로 세척하여 임의의 잔류 용액을 제거하고 임의의 비반응된32P-γ-ATP를 제거한다.
이어서 상기 고체 상을32P가 결합되는지를 확인하기 위해서 직접(예를 들어 액체 섬광 계수기에 의해) 시험할 수 있다. 이를 수행하는 경우, 상기는 PKG가 PDE5를 인산화시키므로 상기 샘플이 PKG를 함유함을 가리킨다. PDE5가 융합 단백질을 통해 결합되는 경우, 상기 개시된 바와 같이, 상기 PDE5 함유 융합 단백질을 SDS 완충액으로 상기 고체 상으로부터 융출시킬 수 있으며, 상기 용출물을 P 결합에 대해 분석할 수 있다. 이는 다른 단백질들이 존재할 가능성이 있는 경우 특히 유리한데, 그 이유는 상기 용출물을 처리하여(예를 들어 겔 분리에 의해) 융합 단백질 부분을32P 결합에 대해 분석할 수 있도록 다양한 단백질들을 서로 분리시킬 수 있기 때문이다. 상기 인산화된 융합 단백질을 SDS 완충액으로 고체 상으로부터 용출시킬 수 있으며 전기영동에 의해 추가로 분리시킬 수 있다. 겔 분리를 수행하는 경우, 단백질을 염색하여 상기 단백질의 위치(들)를 알 수 있으며, PKG에 의한 상기 융합 단백질의 PDE5 부분의32P 인산화를 X-선 필름을 상기 겔에 노출시킴으로써 측정할 수 있다.32P를 X-선 필름 상에서 볼 수 있도록 만든 경우, 이는 PKG가, 상기 고체 상으로부터 용출된 융합 단백질의 PDE5 부분을 인산화시킨 PKG가 함유된 원래의 샘플에 존재함을 가리킨다.
바람직하게는 상기 분석에서, 분석 완충액에 PKG을 억제하지 않으면서 단백질 키나제 A(“PKA”)를 특이적이고 강력하게 억제하는 과잉량(예: 100 배)의 단백질 키나제 억제제(“PKI”)를 가해야 한다. PKA의 억제가 바람직한데, 그 이유는 상기가 PKG 기질(예: PDE5)의 인산화에 기여할 수 있기 때문이다. PKI를 가함으로써, PKA에 의한 인산화에 대한 임의의 기여가 제거될 것이며, 탐지된 임의의 인산화는 PKG에만 기인한다고 거의 볼 수 있다.
PKG 분석용 키트를 제조할 수 있으며, 상기 키트는 별도의 용기에 미리 패키징된 하기의 시약들을 함유한다:
1. 세포 용해 완충액: 50 mM 트리스-HCl, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 500 μM IBMX, 프로테이나제 억제제.
2. 단백질 키나제 G 고체 상 기질: 세파로스 4B에 결합된 재조합체 GST-cGB-PDE5(50% 슬러리).
3. 2배 인산화 완충액:32P-γ-ATP(3000 mCi/mmol, 5∼10 μCi/분석), 10 mM KH2PO4, 10 mM K2HPO4, 200 μM ATP, 5 mM MgCl2.
4. PKA 단백질 키나제 I 억제제.
상기 반응들을 수행하기 위한 일회용 용기 등을 또한 상기 키트에 제공할 수 있다.
상기로부터, 분석 분야의 숙련가들은 더욱 다른 포맷에 대해 개시된 분석 포맷에 적합한 다양한 방식을 쉽게 기획할 것이다. 간단히, 적어도 일부의 PDE5(또는 PKG에 의해 선택적으로 인산화될 수 있는 임의의 다른 단백질)를 사용하여, 표지된 인산화제로 인산화 단백질의 인산화를 평가함으로써 PKG의 존재 및 상대적인 양(대조군에 대한)을 확인할 수 있다.
D. COX 선별
본 발명의 바람직한 실시태양은 주어진 화합물의 사이클로옥시게나제 억제 활성을 측정하고, 상기 화합물의 cGMP PDE 억제 활성을 측정함을 포함한다. 시험 화합물들을 이들의 활성을 종양 병변 치료에 유용한 공지 화합물과 비교함으로써 직접 또는 간접적으로 상기 종양 병변을 치료하는 능력에 대해 평가한다. 위염을 일으키지 않으면서 종양 병변의 치료에 유효한 것으로 공지된 표준 화합물은 5-플루오로-2-메틸-1-(p-메틸설포닐벤질리덴)-3-인데닐아세트산(“엑시슐린드”)이다. 비교를 위한 다른 유용한 화합물로는 COX를 억제하는 것으로 공지된 화합물, 예를 들어 인도메타신 및 슐린닥의 설파이드 대사산물: 5-플루오로-2-메틸-1-(p-메틸설피닐벤질리덴)-3-인데닐아세트산(“슐린닥 설파이드”)이 있다. 비교를 위한 다른 유용한 화합물로는 cGMP-특이적인 PDE를 억제하는 것으로 공지된 화합물, 예를 들어 1-(3-클로로아닐리노)-4-페닐프탈라진(“MY5445”)이 있다.
본 원에 사용된 “전암성 병변”이라는 용어는 복부 종양, 예를 들어 조직의 변화인 이형성으로 나타나는 징후를 포함한다. 예로서, 병변들이 임상적으로 확인할 수 있든 없든간에, 결장, 유방, 전립선 또는 폐 조직의 이형성 성장, 또는 증상, 예를 들어 이형성 반점 징후, 피부의 악성 흑색종에 대한 전구체가 있다. 예로서 또한 임상적으로 확인할 수 있든 없든간에, 이형성 반점 징후 이외에, 폴립증, 결장 폴립, 경부의 전암성 병변(즉, 경부 이형성), 식도, 폐, 전립선 이형성, 전립선내 종양, 유방 및/또는 피부 및 관련 증상(예: 화학선 각화증)이 있다.
본 원에 사용된 “암종” 또는 “암”이란 용어는 암에 걸린 병변을 지칭한다. 예로서 악성 흑색종, 유방암, 전립선암 및 결장암이 있다. 본 원에 사용된 “종양” 및 “신생물”이란 용어는 암에 걸린 및 전암성 병변 모두를 지칭한다.
본 원에 사용된 PG란 약어는 프로스타글린딘을; PS는 프로스타글란딘 합성효소; PGE2는 프로스타글란딘 E2를; PDE는 포스포디에스테라제를; COX는 환상 뉴클레오티드인 사이클로옥시게나제를; RIA는 방사면역분석을 나타낸다.
화합물에 의한 COX 억제를 2 가지 방법들 중 하나로 측정할 수 있다. 한가지 방법은 완전한 HL-60 세포에 의해 PGE2분비를 측정한 다음 선별할 화합물에 노출시킴을 포함한다. 다른 방법은 정제된 사이클로옥시게나제(COX)의 능력을 상기 화합물의 존재 하에서 측정함을 포함한다. 상기 두 방법은 모두 문헌에서 이미 개시한 프로토콜을 포함하지만, 바람직한 프로토콜은 하기에 나타낸다.
PGE의 측정에 의해 프로스타글란딘 E2(“PGE2”)의 생산을 억제하는지의 여부를 측정하기 위해서 화합물들을 평가할 수 있다. PGE에 대한 효소 면역분석(EIA), 예를 들어 에머샴(Amersham, Arlington Heights, IL U.S.A.)으로부터 상업적으로 입수할 수 있는 것을 사용한다. 적합한 세포에는 다량의 PG를 제조할 수 있는 것, 예를 들어 HL-60 세포가 있다. HL-60 세포는 DMSO에 의해 성숙된 과립화구로 분화되는 인간 전골수세포이다(문헌[Collins, S.J., Ruscetti, F.W., Gallagher, R.F. and Gallo, R.C., “디메틸설폭사이드에 의한 차별화의 유도 후에 배양된 인간 전골수세포성 백혈구(HL-60)의 정상적인 기능 특징”, J. Exp. Med., 149:969-974, 1979]을 참조하시오). 이들 분화된 세포는 칼슘 이온 투과 담체 A23187로 자극된 후에 PGE2를 생산한다(문헌[Kargman, S., Prasit, P. and Evans, J.F., “HL-60 세포 5-리폭시게나제의 전좌”, J. Biol. Chem., 266:23745-23752, 1991]을 참조하시오). HL-60을 ATCC(ATCC:CCL240)로부터 입수할 수 있다. 이를 37 ℃에서 5% CO2의 분위기 하에 20% 열-불활성화된 소 태아 혈청, 50 U/㎖의 페니실린 및 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 생육시킬 수 있다. 골수세포 분화를 유도하기 위해서, 세포를 9 일간 1.3% DMSO에 노출시키고, 이어서 세척하고 둘베코의 포스페이트-완충 염수에 3 x 106세포/㎖의 농도로 재현탁시킨다.
분화된 HL-60 세포(3 x 106세포/㎖)를 목적하는 농도에서 시험된 화합물의 존재 하에 37 ℃에서 15 분간 배양한다. 이어서 세포를 A23187(5 x 10-6M)에 의해 15 분간 자극한다. 외부 배지 내로 분비된 PGE2를 상기 개시한 바와 같이 측정한다.
상기 지적된 바와 같이, 화합물의 COX 억제를 평가하는 두 번째 방법은 시험 화합물의 존재 하에서 COX 활성을 측정하는 것이다. 2 가지 상이한 형태의 사이클로옥시게나제(COX-I 및 COX-2)가 프로스타글란딘 합성을 조절하는 것으로 문헌에 보고되었다. COX-2는 COX의 유도성 형태를 나타내는 반면, COX-1은 구성 형태를 나타낸다. COX-1 활성을 문헌[Mitchell et al., “구성 및 유도성 사이클로옥사게나제의 억제제로서 비스테로이드성 소염제의 선택성”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90:11693-11697, 1993](본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 개시된 방법을 사용하여 측정하며, COX-I는 문헌[Boopathy Balasubramanian, “양의 혈소판 사이클로옥시게나제의 정제 및 특성화”, Biochem., J., 239:371-377, 1988](본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 개시된 바와 같이 양의 정낭으로부터 정제하였다. COX-2 활성을 상기 문헌[Mitchell, et al.,]에 개시된 바와 같이 양의 태반으로부터 정제한 COX-2를 사용하여 측정할 수 있다.
약물의 사이클로옥시게나제 억제 활성을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어 상기 문헌[Boopathy Balasubramanian, 1988]에 프로스타글란딘 신타제 I(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)을 37 ℃에서 20 분간 100 μM 아라키돈산(Sigma Chemical Co.), 보조인자(예를 들어, 100 mM 트리스-HCl( pH 7.4) 중의 1.0 mM 글루타치온, 1.0 mM 하이드로퀴논, 0.625 μM 헤모글로빈 및 1.25 mM CaCl2) 및 시험할 약물과 함께 배양하는 과정이 개시되어 있다. 배양에 이어서, 트리클로로아세트산을 사용하여 반응을 종료시킬 수 있다. 티오바르비투르산 및 말론알데히드를 가하여 반응을 정지시킨 후에, 효소 활성을 530 ㎚에서 분광광도측정에 의해 측정할 수 있다.
명백하게, 보다 크게 결합된 PDE5/신규한 PDE/PDE2 억제 활성에 관하여 보다작은 COX-I 또는 COX-2 억제 활성을 나타내는 화합물이 바람직한 화합물일 수 있다.
COX 억제량을 시험 화합물의 존재 및 부재 하에서 사이클로옥시게나제의 활성을 비교함으로서 측정한다. 약 100 μM의 농도에서 잔류(즉, 약 25% 미만) 또는 COX 억제 활성이 없음은 상기 화합물을 종양 치료의 유용성에 대해 추가로 평가해야 함을 가리킨다.
E. 포스포디에스테라제 억제 활성의 측정
본 발명의 신규한 포스포디에스테라제의 활성에 대한 억제 효과에 대해서 상기 개시된 바와 같이 단리된 재조합체 변형 효소, 또는 신규한 PDE 및/또는 PDE2를 PDE5와 함께 사용하여 화합물을 선별할 수 있다. 한편으로, 전 세포에서 환상 뉴클레오티드 수준을 RIA에 의해 측정하며 비처리된 세포 및 자프리나스트-처리된 세포와 비교한다.
포스포디에스테라제 활성을 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 PDE 효소에 대한 기질로서 방사성3H 환상 GMP(cGMP)(환상 3',5'-구아노신 모노포스페이트)를 사용하는 방법(Thompson, W.J., Teraski, W.L., Epstein, P.M., Strada, S.J., Advances in Cyclic Nucleotide Research, 10:69-92, 1979, 본 발명에 참고로 인용되어 있다)을 사용하여 측정할 수 있다. 간단하게, 규정된 기질3H-cGMP 특이적인 활성을 갖는 용액(0.2 μM; 100,000 cpm; 40 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 5 mM MgCl2및 1 ㎎/㎖의 BSA 함유)을 시험 약물과 400 ㎕의 총 부피로 혼합한다. 상기 혼합물을 30 ℃에서 10 분간 본 발명의 단리된 PDE와 함께 배양한다. 반응을 예를 들어 반응 혼합물을 75 초간 비등시켜 종료시킨다. 빙 상에서 냉각시킨 후에, 0.5 ㎎/㎖의 뱀독(Sigma로부터 입수할 수 있는O. Hannah독) 100 ㎕를 가하고 30 ℃에서 10 분간 배양한다. 이어서 상기 반응을 알콜, 예를 들어 100% 메탄올 1 ㎖을 가하여 종료시킨다. 분석 샘플을 1 ㎖의 Dowex 1-X8 컬럼에 걸고; 100% 메탄올 1 ㎖로 세척한다. 상기 컬럼의 통과물 및 세척물 중의 방사능의 양을 합하여 섬광 계수기로 측정한다. 포스포디에스테라제 억제의 정도를 상기 약물-처리된 방사능의 양을 계산하고 대조군 샘플(시험 용매는 있으나 시험 화합물이 결여된 반응 혼합물)과 비교하여 측정한다.
한편으로, 본 발명의 포스포디에스테라제를 억제하는 바람직한 화합물의 능력은 선별되는 화합물에 노출된 종양 세포 중의 cGMP의 증가에 의해 반영된다. PDE 활성의 양을 방사면역분석(RIA)을 사용하여 처리된 세포 추출물 중의 환상 GMT의 양을 분석함으로써 측정할 수 있다. 이 과정에서, HT-29 또는 SW-480 세포를 도말하고 융합될 때까지 생육시킨다. 상기 지적된 바와 같이, SW-480은 PDE5와 PDE2를 모두 함유하며, 따라서 PDE 활성을 이러한 방식으로 평가하는 경우 결합된 cGMP 가수분해 활성이 동시에 분석된다. 이어서 시험 화합물을 약 200 μM 내지 약 200 pM의 화합물 농도에서 세포 배양액과 함께 배양한다. 약 24 내지 48 시간 후에, 배양 배지를 상기 세포로부터 제거하고, 세포들을 용해시킨다. 반응을 0.2 N HCl/50% MeOH를 사용하여 정지시킨다. 샘플을 단백질 분석을 위해 회수한다. 환상 GMP를 음이온-교환 크로마토그래피, 예를 들어 Dowex 컬럼을 사용하여 세포의 산/알콜 추출물로부터 정제시킨다. 상기 cGMP를 건조시키고,공개된 절차에 따라, 예를 들어 트리에틸아민 중의 아세트산 무수물을 사용하여(Steiner, A.L., Parker, C.W., Kipnis, D.M., J. Biol. Chem., 247(4):1106-13, 1971, 본 발명에 참고로 인용되어 있다) 아세틸화시킨다. 상기 아세틸화된 cGMP를 방사면역분석 절차(Harper, J., Brooker, G., Advances in Nucleotide Research, 10:1-33, 1979, 본 발명에 참고로 인용되어 있다)를 사용하여 정량분석한다. 유도체화된 환상 GMP의 요오드화된 리간드(티로신 메틸 에스테르)를 항혈청 및 적합한 완충액의 존재 하에서 표준물 또는 알려지지 않은 물질과 함께 배양한다. 항혈청은 환상 뉴클레오티드-헵텐 유도된 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 항혈청은 숙시닐-cGMP-알부민 결합물이 주입된 양으로부터의 것이며 1/20,000으로 희석된 것이다. 표준 곡선으로부터의 용량-보간법과 오차 분석을 앞서 개시된 바와 같이 적용한다(Seibert, A.F., Thompson, W.J., Taylor, A., Wilbourn, W.H., Barnard, J. and Haynes, J., J. Applied Physiol., 72:389-395, 1992, 본 발명에 참고로 인용되어 있다).
또한, 배양 배지를 산성화시키고, 냉동(-70 ℃)시키고, 또한 cGMP 및 cAMP에 대해서 분석할 수 있다.
바람직한 화합물에 의해 야기된 종양 세포 중의 cGMP 함량의 증가를 관찰하는 것 이외에, cAMP 함량의 감소도 또한 관찰하였다. 특히 바람직한 화합물(즉 종양 세포에서 세포소멸을 선택적으로 유도하나, 정상 세포는 실질적으로 유도하지 않는 것)은 수분 내에 증가된 cGMP 함량을 생성시키는 초기의 작용으로서 cGMP-특이적인 PDE와 일치하는 과정을 따른다는 것을 관찰하였다. 부수적으로, 종양세포를 바람직한 항-종양 화합물로 처리하면 24 시간 내에 cAMP 함량이 감소된다. 약물 작용의 세포내 표적은 추가로 연구 중이나, 현재의 데이터는 cGMP 함량의 초기 상승 및 후속적인 cAMP 함량의 감소가 바람직한 화합물에 노출된 종양 세포에서의 세포소멸에 우선한다는 개념을 지지한다.
2 개의 환상 뉴클레오티드 비율의 변화가 단지 cGMP의 절대 값, 단지 cGMP-특이적인 포스포디에스테라제 억제, 또는 단지 cGMP 가수분해 수준을 측정하는 것 보다, 시험 화합물의 바람직한 cGMP-특이적인 포스포디에스테라제 억제 활성을 평가하는데 더 정확한 도구일 수 있다. 항-종양 화합물로 처리되지 않은 종양 세포에서, cGMP 함량/cAMP 함량의 비는 0.03 내지 0.05 범위(즉 6000 내지 8000 fmol/단백질 ㎎의 cAMP 함량에 대한 300 내지 500 fmol/단백질 ㎎의 cGMP 함량)이다. 바람직한 항-종양 화합물에 노출된 후에, 상기 비율은 환상 GMP의 초기 증가 및 환상 AMP의 후속적인 감소의 결과로서 수배(바람직하게는 약 3 배 이상) 증가한다.
구체적으로, 특히 바람직한 화합물은 처리된 종양 세포 중의 cGMP 함량을 약 500 fmom/단백질 ㎎ 이상의 cGMP 수준까지 초기에 증가시킴이 관찰되었다. 또한, 특히 바람직한 화합물은 처리된 종양 세포 중의 cAMP 함량을 약 4000 fmom/단백질 ㎎ 미만의 cAMP 수준까지 후속적으로 감소시킨다.
환상 AMP의 함량을 측정하기 위해서, 상기 cGMP에 대해 개시된 것과 유사한 방사면역분석 기법을 사용한다. 기본적으로, 환상 뉴클레오티드를 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 세포의 산/알콜 추출물로부터 정제하고, 건조시키고,공개된 절차에 따라 아세틸화시키고, 방사면역분석 절차를 사용하여 정량분석한다. 유도체화된 환상 AMP 및 환상 GMP의 요오드화된 리간드를 특정한 항혈청 및 적합한 완충액의 존재 하에서 표준물 또는 알려지지 않은 물질과 함께 배양한다.
환상 뉴클레오티드 함량의 확인은 완전한 세포 중의 환상 뉴클레오티드의 턴오버 또는 축적을 측정함으로써 수행할 수 있다. 완전한 세포 cAMP를 측정하기 위해서, 공개된 절차(Whalin, M.E., Garrett Jr., R.L., Thompson, W.J., and Strada, S.J., “완전한 뇌 조각에서 환상 AMP 붕괴에 대한 세포 비함유 뇌 환상 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 활성의 보정”, Sec. Mess. and Phos. Protein Research, 12:311-325, 1989, 본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 따라3H-아데닌 예비-표지를 사용한다. 상기 절차는 환상 AMP에 대한 표지된 ATP의 플럭스를 측정하며 특정한 프로토콜에 따라 완전한 세포 아데닐레이트 사이클라제 또는 환상 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 활성을 추정하는데 사용될 수 있다. 환상 GMP의 축적은 공개된 절차(Reynold, P,E., S.J. Strada and W.J. Thompson, “완전한 세포 예비표지에 의해 측정된 폐 미세혈관 내피 세포 중의 환상 GMP 축적”, Life Sci., 60:909-918, 1997, 이는 본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 따른 완전한 세포 예비표지로 연구하기에는 너무 적다.
화합물의 PDE 억제 활성 효과를 또한 조직 샘플로부터 측정할 수 있다. 인간의 조직 생검 또는 마취된 동물의 조직을 시험 화합물에 노출된 대상자로부터 수거한다. 간단하게, 조직 샘플을 6% TCA 500 ㎕에 균질화시킨다. 기지량의 균질물을 단백질 분석을 위해 회수한다. 나머지 균질물은 얼음 상에서 20분간 정치시켜 단백질을 침전시킨다. 이어서, 상기 균질물을 15,000 g에서 4 ℃에서 30 분간 원심분리시킨다. 상등액을 회수하고, 펠렛을 회수한다. 상기 상등액을 5 배 분량의 수 포화된 디에틸 에테르로 4 회 세척한다. 상부의 에테르 층은 매 세척 중간에 버린다. 수성 에테르 추출물을 가속 진공 하에서 건조시킨다. 일단 건조되면, 샘플을 나중의 사용을 위해 냉동시키거나 즉시 사용한다. 건조된 추출물을 분석 완충액 500 ㎕에 용해시킨다. cGMP-특이적인 억제량을 상기 개시된 바와 같이 RIA 절차를 사용하여 환상 뉴클레오티드의 양을 분석함으로써 측정한다.
상기 억제량을 화합물의 존재 및 부재 하에서의 PDE 활성을 비교함으로써 측정한다. 상기 개시된 cGMP PDE의 억제는 화합물이 종양 치료에 유용하다는 것을 가리킨다. 기준인 엑시슐린드의 활성보다 현저하게 큰, 바람직하게는 10 μM 이하의 농도에서 50% 이상 큰 억제 활성은 화합물을 항종양 성질에 대해 추가로 평가해야 함을 가리킨다. 바람직하게는, 신규한 PDE 억제에 대한 IC50값은 잠재적인 사용을 위해 추가로 고려되는 화합물에 대해 50 μM 미만이어야 한다.
F. 화합물에 의한 종양 세포 성장 억제 여부의 측정
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 화합물이 종양 세포의 성장을 감소시키는지의 여부를 추가로 측정함을 포함한다. 다양한 세포 주들을 시험 조직에 따라 샘플로 사용할 수 있다. 예를 들어 이들 세포주에는 SW-4800-결장 선암; HT-29-결장 선암; A-427-폐 선암종; MCF-7-유방 선암; 및 UACC-375-흑색종 주; 및 DU145-전립선 암종이 포함된다. 이들 세포 주를 사용하여 수득한 세포독성 데이터는 종양 병변에 대한 억제 효과를 가리킨다. 이들 세포주는 잘 특성화된 것이며, 미국 국립 암 연구소에 의해 신규한 항암 약물의 선별 프로그램에 사용된다.
종양 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 ATCC로부터 수득한 HT-29 인간 결장암 세포 주를 사용하여 측정할 수 있다. HT-29 세포는 이미 절절한 결장 종양 세포 배양 모델로서 특성화되었다(Fogh, J., and Trempe, G. In: Human Tumor Cells in Vitro, J. Fogh(eds.), Plenum Press, NY, pp. 115-159, 1975). HT-29 세포를 37 ℃에서 95% 공기 및 5% CO2의 가습 분위기 하에서 5% 송아지 태아 혈청(Gemini Bioproducts, Inc., Carlsbad, CA) 및 2 mM 글루타민, 및 1% 항생-항진균제가 보충된 RPMI 배지에서 유지시킨다. 간단하게, HT-29 세포를 96 웰 미세적정 플레이트에서 500 세포/웰의 밀도로 도말하고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 후에 화합물을 첨가한다. 세포 수의 각 측정은 6 회 반복한다. 배양액 중에서 6 일 후에, 세포를 냉 트리클로로아세트산을 10% 최종 농도로 가하여 고정시키고, 단백질 수준을 문헌[Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesch, H., Kenney, S., and Boyd, M.R., “항암 약물 선별을 위한 새로운 비색측정 분석법”, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112, 1990](본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 이미 개시된 바와 같이 설포르호다민 B(SRB) 비색측정 단백질 염색 분석을 사용하여 측정한다.
상기 SRB 분석 이외에, 다수의 다른 방법들을 성장 억제의 측정에 이용할 수 있으며 상기 SRB 분석을 대체할 수 있다. 이러한 방법으로는 트리판 블루 염색에 따라 가시화할 수 있는 세포 수의 측정, BrdU 또는 방사능표지된 티미딘에 의한 DNA 합성 가능한 세포의 표지화, 가시화가능한 세포의 바랜 적색 염색, 또는 가시화가능한 세포의 MTT 염색이 있다.
100 μM 이하의 용량에서 약 50% 이상의 현저한 종양 세포 성장 억제는 화합물이 종양 병변의 치료에 유용함을 가리킨다. 바람직하게는 IC50값을 측정하고 비교를 위해 사용한다. 상기 값은 종양 세포 성장을 대조군에 비해 50% 까지 억제하는데 필요한 약물의 농도이다. 바람직하게는, IC50값은 추가로 종양 병변의 치료에 잠재적으로 사용하기 위해 고려되는 화합물에 대해 100 μM 미만이어야 한다.
G. 화합물에 의한 세포소멸 유도 여부의 측정
두 번째의 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 선별 방법은 화합물이 종양 세포의 배양액에서 세포소멸을 유도하는지를 측정함을 추가로 포함한다.
2 개의 독특한 형태의 세포 사멸을 형태학적 및 생화학적 기준인 괴사와 세포소멸에 의해 기술할 수 있다. 괴사는 혈장 멤브레인의 증가된 투과성을 수반하며; 세포가 수분내에 팽윤되고 혈장 멤브레인이 파괴된다. 세포소멸은 세포막의 수포화, 세포질의 응축 및 내생적인 엔도뉴클레아제의 활성화를 특징으로 한다.
세포소멸은 정상 조직의 턴오버, 및 기관과 사지의 미 발달 도중 자연적으로 발생한다. 세포소멸은 또한 세포독성 T-림프구 및 천연 킬러 세포에 의해, 이온화 조사 및 특정한 화학요법 약물에 의해 유도된다. 세포소멸의 부적합한 조절이 암, AIDS 또는 알쯔하이머 병 등을 비롯한 많은 병적인 증상에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 상기 개시된 조건 하에서 유지된 종양 세포의 배양액을 사용하여 화합물들을 세포소멸의 유도에 대해서 선별할 수 있다. 세포를 시험 화합물로 처리하는 것은 전-융합성 또는 후-융합성 배양액과 다양한 농도에서 2 내지 7 일간의 처리를 포함한다. 세포소멸성 세포를 상기 배양액의 부착된 구획 및 “부유” 구획 모두에서 측정한다. 상기 두 구획들을 상등액을 제거하고, 부착된 세포를 트립신처리하고, 상기 두 제조물을 원심분리 세척 단계(10 분, 2000 rpm)에 따라 합하여 수거한다. 종양 세포 배양액을 상당한 정도의 세포독성을 얻기 위해서 슐린닥 및 관련 화합물로 처리하는 프로토콜이 문헌[Piazza, G.A., et al., Cancer Research, 55:3110-16, 1995](본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 개시되어 있다. 새로운 특징은 상기 두 부유 세포 및 부착된 세포를 모두 수거하고, 세포독성을 관찰하기 위해서 최적의 처리 시간 및 용량 범위를 확인하고 최적의 세포 배양 조건을 확인함을 포함한다.
화합물에 의한 처리에 이어서, 배양액을 아크리딘 오렌지 및 에티디움 브로마이드로 표지한 후에 형광 현미경 분석법에 의해 세포소멸과 괴사에 대해서 분석할 수 있다. 세포소멸성 세포 수의 측정 방법은 문헌[Duke Cohen, “세포소멸의 형태학적 및 생화학적 분석”, Current Protocols In Immunology, Coligan et al., eds., 3.17.1-3.17.16(1992)](본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 이미 개시되어 있다.
예를 들어, 부유 세포 및 부착된 세포를 트립신처리에 의해 수거하고 PBS에서 3 회 세척할 수 있다. 세포 분액들을 원심분리시킬 수 있다. 이어서 펠렛을 배지에 재현탁시키고 아크리딘 오렌지 및 에티디움 브로마이드를 함유하는 염료 혼합물을 PBS 중에서 제조하고 서서히 혼합할 수 있다. 이어서 상기 혼합물을 현미경 슬라이드 상에 놓고 세포소멸의 형태학적 특징에 대해서 검사할 수 있다.
세포소멸을 또한 시험 화합물로 처리한 세포 중의 DNA 단편의 증가를 측정함으로써 정량분석할 수 있다. 세포질 히스톤-결합된-DNA-단편(모노- 및 올리고뉴클레오소머)의 정량적인 생체외 측정을 위해서 상업적인 광도측정 EIA를 이용할 수 있다(Cell Death Detection ELISAokys, 카탈로그 번호 1,774,425 번, 베링거 만하임). 상기 베링거 만하임 분석은 각각 DNA 및 히스톤에 대한 마우스 단클론 항체를 사용하는 샌드위치-효소-면역분석 원리를 기본으로 한다. 이에 의해 세포 용해물의 세포질 부분에서 모노- 및 올리고뉴클레오솜을 특정하게 측정한다.
상기 분석에 따라, 세포소멸을 하기의 방식으로 측정한다. 샘플(세포-용해물)을 스트렙트아비딘-피복된 미세적정 플레이트(“MTP”)에 넣는다. 후속적으로, 항-히스톤-비오틴 및 항-DNA 퍼옥시다제 결합물의 혼합물을 가하고 2 시간 동안 배양한다. 배양 기간 동안, 상기 항-히스톤 항체는 뉴클레오솜의 히스톤-성분에 결합하고 동시에 상기 면역착체를 그의 비오틴화를 통해 스트렙트아비딘-피복된 MTP에 고정시킨다. 추가로, 상기 항-DNA 퍼옥시다제 항체는 상기 뉴클레오솜의 DNA 성분과 반응한다. 세척 단계에 의해 결합되지 않은 항체를 제거한 후에, 뉴클레오솜의 양을 상기 면역착체 중에 남아있는 퍼옥시다제에 의해 정량분석한다. 퍼옥시다제를 기질로서 ABTS7(2,2'-아지도-[3-에틸벤즈티아졸린-설포네이트])를 사용하여 광도 측정법에 의해 측정한다.
예를 들어 SW-480 결장 선암 세포를 웰 당 10,000 개 세포의 밀도에서 96-웰 MTP에 도말한다. 이어서 세포를 시험 화합물로 처리하고, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다. 배양 후에, MTP를 원심분리시키고, 상등액을 제거한다. 이이서 각 웰 중의 세포 펠렛을 용해 완충액에 30 분간 재현탁시킨다. 이어서 용해물을 원심분리시키고 상등액의 분액들(즉 세포질 부분)을 스트렙트아비딘-피복된 MTP로 옮긴다. MTP에 용해된 펠렛(즉 고 분자량의 단편화되지 않은 DNA를 함유하는 세포 핵들)을 조심스럽게 진탕시킨다. 이어서 샘플을 분석한다.
세포소멸 반응의 지표인 자극 배수(FS=ODmax/ODveh)를 주어진 농도에서 시험된 각각의 화합물에 대해 측정한다. EC50값을 또한 일련의 농도의 시험 화합물들을 평가함으로써 측정할 수 있다.
세포소멸의 통계학적으로 의미있는 증가(즉 100 μM의 농도에서 2 이상의 자극 배수)는 화합물이 종양 병변의 치료에 유용함을 추가로 가리킨다. 바람직하게는, 세포소멸 활성에 대한 EC50값은 종양 병변의 치료에 잠재적으로 사용하기 위해 추가로 고려되는 화합물에 대해서 100 μM 미만이어야 한다. 본 발명에서 EC50은 비히클 처리에 비해 세포소멸을 50% 유발시키는 농도로서 정의된다.
H. 유선 기관 배양액 모델 시험
상기 방법에 의해 확인된 시험 화합물을 유선 기관 배양 시스템에서 전-종양병변의 발생을 억제하는 능력에 의해 항종양 활성에 대해서 시험할 수 있다. 상기 마우스 유선 기관 배양 기법은 몇몇 NSAID, 레티노이드, 타목시펜, 셀레늄 및 몇몇 천연 생성물과 같은 공지된 항종양제의 효과를 연구하기 위해서 다른 연구자들에 의해 성공적으로 사용되었으며, 본 발명의 선별 방법의 확인에도 유용하다.
예를 들어, 암컷 BALB/c 마우스를 상기 선에 생체외에서 호르몬에 반응성이되도록 에스트라디올과 프로제스테론의 배합물로 매일 처리할 수 있다. 상기 동물들을 죽이고, 가슴의 유선을 무균적으로 절제하고 10 일간 인슐린, 프로락틴, 하이드로코르티손 및 알도스테론이 보충된 성장 배지에서 배양한다. DMBA(7,12-디메틸벤즈(a)안트라센)를 상기 배지에 가하여 전암 상태의 병변을 형성시킨다. 이어서 완전히 발병된 선에서 프로락틴, 하이드로코르티손 및 알도스테론을 끊어, 상기 선을 복귀시켰으나, 상기 전암성 병변은 복귀되지 않았다.
시험 화합물을 DMSO에 용해시키고 배양 지속기간 동안 배양 배지에 가한다. 상기 배양 기간의 끝에서, 상기 선을 10% 포르말린에 고정시키고, 알룸 카민으로 염색하고 유리 슬라이드 상에 놓는다. 유방 병변의 형성은 유방 병변이 없는 선에 대한 상기 병변을 갖는 선의 비이다. 시험 화합물 처리된 선에서의 유방 병변의 발생을 비처리된 선과 비교한다.
유방 병변이 차지하는 정도를 상기 선의 상을 진단 패드 상에 투영시킴으로써 정량분석할 수 있다. 상기 선으로 덮인 영역이 상기 패드 상에 자취를 남기며 상기 영역의 100%로 간주된다. 상기 회복되지 않은 각각의 조직으로 덮인 공간을 또한 디지털 패드 상에 개략적으로 나타내고 컴퓨터에 의해 정량화한다.
III. cGMP PDE 억제제/JNK1 활성화제 화합물을 함유하는 항-종양성 약학 조성물
상기 설명한 바와 같이, 엑시슐린드는 바람직한 항 종양 성질을 나타내는 하나의 화합물이다. 그의 효능 및 항 종양제로서의 용도가 발견된 후에 상기 화합물이 종양 세포에서 cGMP-특이적인 PDE 활성을 억제하고 JNK1을 활성화시킴으로써 작용함이 이해되었다.
다른 것들 중에서도, 인간의 치료를 위한 화합물을 선택하기 위해서 본 발명의 선택 방법을 사용할 수 있다는 것이 종양이 있는 환자에서 임상적인 시도로 입증되었다. 엑시슐린드가 본 발명의 선택 기준을 만족시키는 바람직한 화합물의 프로파일을 갖는 항 종양성(생체외에서)이라는 사실을 이해함으로써, 상기 2 개의 인간 임상 시도에서의 상기 화합물의 성공은 다른 화합물들이 본 발명의 선택 기준을 만족시키는 것으로 선택될 수 있음을 확립시킨다.
상기 나타낸 바와 같이, 다수의 종양들은 APC 돌연변이를 갖는다. 다른 것들 중에서, 본 발명의 선택 방법의 확인은 APC 돌연변이를 갖는 종양이 잇는 환자의 인간 임상 시험에서 이루어졌다.
상기 APC 돌연변이는 유전성 종양인 선암성 결장 폴립증(“APC”)이 있는 환자에서 처음 발견되었다. 상기 APC 질병은 10 대에 수백 내지 수천 개의 폴립이 결장에서 나타남을 특징으로 하며, 통상적인 치료는 20 세 전에 상기 결장을 외과적으로 제거하는 것이다.
처음의 임상적 시도는 엑시슐린드를 사용하여 APC를 갖는 환자를 치료하는 것을 포함하였다. 상기 연구에서, 각각의 환자는 직장의 기능을 보존하기 위해서 직장에 인접한 결장의 작은 부분(소장이 연결되어 있다)을 제외하고, 이미 결장이 제거된 상태였다. 그러나, 이러한 환자는 흔히 나머지 작은 결장 부분에도 폴립이 형성되어 있으며, 이들 폴립을 주기적으로 제거(예를 들어, 전기소작에 의해)할 것이 요구된다.
엑시슐린드를 선택한 상기 시도는 상기 약물과 위약 그룹에 의해 12 개월 간 형성된 새로운 폴립의 축적 수를 비교함으로써 상기 약물의 항 종양 특성을 평가하도록 디자인된 예방적인 시도였다. 적합한 환자는 1 년에 9 내지 44 개의 폴립이 형성되는 환자였다. 연구의 출발 시, 6 개월의 끝 및 12 개월의 끝에서 환자들로부터 완전히 제거되었다(모든 폴립이 제거되었다). 상기 연구는 34 명의 적합한 환자들을 등록시켰다. 역사적으로 1 년에 9 내지 44 개의 폴립이 형성되었던 APC 환자들에서 1 년에 걸친 폴립의 추정 평균 수를 근거로, 엑시슐린드가 폴립 형성 비율의 감소에 있어서 위약 보다 임상적으로 및 통계적으로 현저하게 양호하였다. 상기 연구의 처음 6 개월 동안 생성된 폴립의 중간 수를 근거로, 엑시슐린드로 처리된 환자들에서 위약으로 처리된 환자의 폴립 수의 대략 1/3이 발생하였다(중간 값이 각각 18 폴립/년 및 38 폴립/년이다; p=0.013). 상기 연구의 전체 12개월에 걸쳐 생성된 폴립의 중간 수를 근거로, 엑시슐린드로 처리된 환자들에서 위약으로 처리된 환자의 폴립 수의 대략 1/2이 발생하였다(중간 값이 각각 18 폴립/년 및 38 폴립/년이다; p=0.020).
별도의 임상 시험을 또한 전립선 암을 갖는 남성 환자에서 수행하였으며; 그 결과 전립선을 제거하였다. 상기 연구는 라디칼 전립선 절제술에 이어서 상승하는(전립선 암의 재발을 가리킨다) 검출가능한 PSA(전립선 특이적인 항원)를 갖는 환자에서 수행하였다.
96 명의 환자를 전립선암의 평가에 등록시켰다: 이중 맹검법의 위약 대조된다 중심 시도는 500 ㎎/일의 약물 복용 환자에게 엑시슐린드를 투여함을 포함한다. 하기 제공되는 바와 같이, 데이터는 엑시슐린드-처리된 그룹과 위약-처리된 그룹 간에 PSA 수준에 있어서 통계학적으로 의미있는 차이를 나타낸다. 엑시슐린드-처리된 그룹에서 PSA 수준은 위약-처리된 그룹의 PSA 수준과 비교 시 현저하게 감소되었다. PSA의 상승 수준 자체가 질병 상태인 것은 아니지만, 이는 의료 사회에서 상기와 같은 남자들에서 전립선암의 재발을 나타내는 대용 표지로서 광범위하게 간주되고 있다.
전체로서 엑시슐린드와 위약 그룹 간의 평균 PSA 수준의 차이를 근거로 하는 평가를 수행하는 것 이외에, 가 분석은 소그룹 분석을 포함한다. 상기 연구에서는 환자들을 전이성 질병이 발병할 위험성과 관련하여 상기 위험성이 높은 그룹, 중간 그룹 및 낮은 그룹으로 분류하였다. 이러한 분류는 문헌[Journal of the American Medical Association(JAMA 1999년 5월, pp. 1591-97]에 공개된 방법론을 사용하여 수행하였다. 위험 그룹으로 분류된 연구 환자들을 확인하기 위해서, 상기 환자들이 약물 그룹인지 위약 그룹인지를 모르는 연구자들에게 병력을 제공하였고; 상기 연구자들은 연구 환자들을 상기 참고로 공개된 방법론에 따라 적합한 위험 그룹들로 할당하였다. 통계학적 분석은 고 위험군과 중간 위험군 모두에서 엑시슐린드와 위약 환자 간의 평균 PSA 수준의 통계학적으로 현저한 차이를 밝혔다.
상기 전립선 연구로부터의 데이터는 하기와 같다:
이들 엑시슐린드 시험 및 다른 적응증에서 상기 약물을 포함하는 다수의 다른 시험들에서, 안전성을 역효과(AE), 임상적인 실험실용 시험(혈액학, 혈청 화학 및 소변 검사), 생명 징후(혈압, 맥박, 호흡율, 체온 및 체중), 물리적인 검사 및 상부 내시경검사에 의해 평가하였다.
지금까지 400 명 이상의 환자에서 엑시슐린드를 사용하여 수행된 임상 시험에서 두드러진 안전성의 문제가 나타나지 않았다. 엑시슐린드는 어떠한 혈액 질환, 투여량-제한 구토, 또는 통상적인 화학요법들과 관련된 신경 또는 신 독성을 나타내지 않았다. 상기는 또한 어떠한 임상적으로 중대한 생명 징후의 변화도 일으키지 않았다. 실제로, APC 환자에서 폴립과 정상적인 결장 조직의 짝을 이룬 생검법에서, 엑시슐린드가 폴립의 세포소멸 속도는 증가시켰으나, 정상적인 결장 조직에 대해서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌으며, 이는 정상 조직에 대한 최소의 영향을 시사한다.
최대 허용량(MTD=결장 절제한 환자에서 600 ㎎; 완전한 결장을 갖는 환자에서 400 ㎎; 소아 환자에서 350 ㎎) 이상의 투여량에서 발견된 유일한 용량-제한 역효과는 초기의 처리 기간 중에 나타난 간 기능 시험(LFT)에서의 상승이었다. 경험 상, LFT의 상승은 신속하게 역전되었으며, 투여량을 낮췄을 때 다시 일어나지 않았다.
다른 사건들(예를 들어 빈번한 복부 통증)은 전형적으로는 짧게 지속되며 보통의 강도로 온화하고, 상기 엑시슐린드 투여의 중단 또는 투여량의 강하가 필요하지 않았다.
간단히, 이들 시험은 엑시슐린드가 종양의 임상적인 관리를 위한 효과적이고 잘-허용되는 장기적인 치료법임을 입증하였다. 따라서, 이러한 결과는 특히 cGMP-특이적인 PDE 활성을 억제하는(뿐만 아니라 본 발명의 다른 선택 기준을 만족시키는) 추가의 화합물을 선택하여 생체내에서 치료학적으로 유효한 약물을 생성시킬 수 있음을 예시한다.
작용 기전이 cGMP 억제를 수반하는 것으로 밝혀지고 본 발명의 선택 기준을 만족시키는 것으로 공지되기 전에 또한 발견된 제 2의 약물이 화합물 B이다. 상기는 생체외 및 생체내 평가에서 광범위한 종양에 대해 활성을 갖는 항-종양제로서 입증되었다. 상기는 또한 동물 연구에서 안전하며, 단번에 인간 투여량 연구를 단계적으로 확대시킨다.
당해 분야의 숙련가들이 하기 제공된 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 화합물 B는 통상적인 화학요법제 또는 항-종양 NSAID의 허용되는( 및 다수의 경우에 독성인) 투여량보다 훨씬 더 많은 투여량으로 동물에게 안전하게 제공될 수 있다. 예를 들어, 래트의 급성 독성 연구에서, 2000 ㎎/㎏ 이하의 투여량으로 1 회 경구 투여된 화합물 B(0.5% 카복시-메틸셀룰로즈 비히클 중의)에서 독성 징후가 관찰되지 않았다. 4000 ㎎/㎏에서, 체중 증가가 약간 감소되었다. 1000 ㎎/㎏을 1 회 투여량으로 복강내 투여한 결과 체중 증가가 감소되었으며, 상기 그룹의 부검 시 일부 동물에서는 장간막 협착이 나타났다.
개에서, 화합물 B를 캡슐로 1000 ㎎/㎏ 투여한 결과 단일 그룹의 2 마리의 수컷 및 2 마리의 암컷 동물에서 독성 징후가 나타나지 않았다. 화합물 B 캡슐의 성질로 인해, 상기 투여량은 각각의 동물에게 13 개 이상의 캡슐을 사용할 것이 필요했으며, 이는 상기 동물들에게 스트레스를 주지 않는 최대 개수로 판단되었다. 따라서, 상기 개들에게 후속적으로 1000 ㎎/㎏/일의 7 회 연속 투여량을 투여하였다. 어느 투여 단계에서도 약물-관련된 효과의 어떠한 징후도 관찰되지 않았다.
따라서, 1 회 투여량을 기준으로, 화합물 B는 심한 독성이 없다. 이러한 연구의 발견을 근거로, 화합물 B의 경구 LD50은 개에서 1000 ㎎/㎏ 이상이고 래트에서는 4000 ㎎/㎏ 이상이었으며, 복강내 LD50은 래트에서 1000 ㎎/㎏ 이상인 것으로 간주되었다.
래트의 7 일 투여량 범위 발견 연구에서, 화합물 B를 0, 50, 500 또는 2000 ㎎/㎏/일의 투여량으로 투여하여 50 ㎎/㎏/일에서 독성 징후가 관찰되지 않은 것으로 평가하였다. 500 ㎎/㎏/일에서, 치료-관련된 효과는 암컷 래트에서 절대 및 상대적인 간 중량의 증가로 제한되었다. 2000 ㎎/㎏/일의 투여량에서는 수컷래트에서 괴로운 숨쉬기 및/또는 비정상적인 호흡기 울림, 감소된 체중 증가 및 음식물 소비, 및 암컷 래트에서 증가된 간 중량 효과들이 포함된다. 어떠한 혈액학적 또는 혈액 화학적 변화, 혹은 임의의 미시적인 병적인 변화도 임의의 투여량 수준에서 나타나지 않았다.
래트에서 28-일 연구를 0, 50, 500 및 2000 ㎎/㎏/일에서 또한 수행하였다. 화합물 B에 기인한 비정상적인 임상적 관찰은 없었으며, 체중 변화, 육안 검사, 혈액학 및 혈액 화학 수치, 및 소변 검사도 눈에 띄는 것은 없었다. 부검 시 거시적인 변화도 보이지 않았다. 기관 중량 데이터는 2000 ㎎/㎏/일에서 간 중량의 통계학적으로 현저한 증가, 및 2000 ㎎/㎏/일 그룹에 대한 갑상선 중량의 통계학적으로 현저한 증가를 나타내었다. 보다 낮은 투여량에서의 약간의 증가는 통계학적으로 의미가 없었다. 조직의 병력학적 평가는 소낭 세포 비대의 흔적, 갑상선에서의 증가된 수의 유사분열 형태(가능한 세포 증식을 시사함), 및 간에서의 온화한 중심소엽 비대를 지적하였다. 한 마리의 암컷이 500 ㎎/㎏/일에서 증가된 갑상선 유사분열 형태를 가졌지만, 이러한 변화는 일반적으로는 2000 ㎎/㎏/일의 투여량에서 소수의 동물들에게 제한된다. 간에서의 발견은 마이크로솜 효소의 매우 온화한 자극에 의해 갑상선 호르몬의 대사가 증가하여 갑상선을 자극함을 지시하는 것일 수 있다. 따라서, 당해 분야의 숙련가는 이러한 효과가 유사한 투여량의 통상적인 화학요법제 또는 NSAID에서 예상되는 것에 비해 대단히 최소임을 인식할 것이다.
화합물 B의 안전성 프로파일을 추가로 확립하기 위해서, 전립선 종양 세포주의 화합물 B-유도된 세포소멸이 정상 세포로부터 유래된 전립선 내피 세포에 대한 효과에 필적할만한 것인지를 평가하기 위해서 연구를 수행하였다. 안드로겐-감수성 전립선 종양 세포주 LNCaP(ATCC(Rockville, MD)로부터)를 표준 조건 하에서 5% 송아지 태아 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 160 배지를 사용하여 증식시켰다. 정상적인 전립선으로부터 유래된 초기 전립선 내피 세포 배양액(PrEC)(Clonetics Inc.(San Diego, CA)로부터)을 상기와 같은 배양액의 성장에 최적화시킨 혈청 비 함유 배지(Clonetics Inc.)를 사용함을 제외하고 상기 종양 세포 주와 동일한 조건 하에서 증식시켰다. 상기 실험을 위해서, LNCaP 또는 PrEC 세포를 웰 당 10,000 세포의 밀도로 96 웰 플레이트에 시이딩시켰다. 24 시간 후에, 상기 세포들을 비히클(0.1% DMSO) 또는 DMSO에 용해시킨 50 μM의 화합물 B(유리 염기)로 처리하였다. 다양한 약물 처리 시간(4, 24, 48, 72 또는 99 시간) 후에, 세포들을 용해시키고 세포소멸성 세포 치사의 지표로서 히스톤-결합된 DNA의 측정을 위해 처리하였다(Piazza et al., Cancer Research 57:2452-2459, 1997).
도 6은 50 μM의 화합물 B(유리 염기)로 처리한 후의 LNCaP 세포 배양액 중의 히스톤-결합된 단편화된 DNA의 양의 시간에 따른 증가를 나타낸다. 단편화된 DNA의 현저한 증가가 24 시간 처리 후에 탐지되었으며, 상기 유도는 4 일까지의 연속 처리 기간동안 지속되었다. 대조적으로, PrEC(“정상” 전립선) 세포를 화합물 B(50 μM)로 처리하는 것은 4 일 까지의 처리 기간 동안 DNA의 단편화에 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 종양 세포에서 세포소멸의 선택적인 유도가 정상 세포에 대한 것과 상반됨을 입증한다. 이는 급속히 성장하는 정상 및 종양 세포와 마찬가지로 세포소멸 또는 괴사를 유도하는 통상적인 화학요법과 현저하게 대조적인 것이다.
최종적으로 안전성에 대해서, 약물을 경구 복용시킨 인간 투여량 임상 시험, 환자, 인간 안전성 연구를 한번에 단계적으로 확대시킨 것은 화합물 B가 항암 효과를 생성시키는데 필요한 것으로 예견되는 수준 이상의 투여량을 포함한 임의의 투여량에서 현저한 부작용을 생성시키지 않는다는 것이다.
상기 지적된 바와 같이, 화합물 B는 또한 강력한 항 종양 성질을 나타낸다. 화합물 B에 대해 수득된 성장 억제 IC50은 SW-480 세포 주에서 0.7 μM이었다. 이러한 결과는 화합물 B를 발암의 지표로서 비정상적인 장샘 병소(“ACF”)를 사용하여 설치류에서 평가함으로써 입증되었다(Bird, Cancer Lett. 37:147-151, 1987). 아족시메탄(“AOM”)-유발된 발암에 대해 확립된 이러한 설치류 모델을 생체내에서 결장암 발병에 대한 화합물 B(유리 염기 및 염)의 효과를 평가하는데 사용하였다. ACF는 결장 종양의 전구체이며, ACF 억제는 화학-예방적 효능의 전조가 된다.
상기 실험의 래트에서, ACF 억제를 발암성 물질을 2 주 연속해서 주입하여 달성하였다. 화합물 B를 ACF 개시 전 1 주일째에 상기 실험의 지속기간 동안 투여하였다. ACF를 처리 5 주 후에 평가하였다. 화합물 B를 래트의 사료에 수컷 피셔(Fisher) 344 래트에게 경구 투여하였다. 1 일 음식물 소비(㎎/체중 ㎏)를 상기 연구의 과정에 걸쳐 변화시켰으며, 따라서 화합물 B의 투여량을 투여량들 간의 비교 기준을 제공하기 위해서 음식물 ㎏ 당 g으로서 나타내었다. 화합물 B가 성장 및/또는 식사 행동에 대해 역효과를 나타내는지를 측정하기 위해서, 상기 실험 전 과정에 걸쳐 체중을 측정하였다. 실험 그룹들은 대조군보다 중량 증가가 적었으며, 이는 생체이용효능을 나타내는 것이었다. 그러나, 중량 변화는 10% 미만이었으며 ACF 형성에 영향을 미치는 것으로 간주되지는 않았다.
화합물 B의 유리 염기는 결장 당 장샘의 감소에 의해 측정시 ACF 형성을 억제하였다. 이 데이터를 표 2에 요약한다. 낮은 투여량 그룹(단지 0.5 g/먹이 ㎏)을 제외하고, 처리 및 대조군 그룹들 간의 차이는 상당하였으며, 1.0 및 2.0 g/먹이 ㎏ 그룹의 경우에는 통계학적으로 현저하였다.
또한, 화합물 B는 본 발명의 선택 기준을 소급적으로 만족시켰으며, 상기 선택 기준의 타당성을 확립하는데 사용되는 화합물들 중 하나였다. 예를 들어, 앞서 개시된 프로토콜을 사용하여, 화합물 B는 HT29 세포 추출물로부터의 cGMP-특이적인 PDE를 사용하여 0.68 μM의 cGMP-특이적인 PDE IC50값을 가졌다. 그의 COX I 억제(100 μM에서)는 25% 미만이었다.
전-세포소멸인 것에 대해서, 화합물 B의 DNA 단편화 EC50은 15 μM이었다. 또한, SW-480에서 화합물 B에 대한 세포소멸%를 다양한 약물 농도에서 하기 표 3에 나타낸다.
화합물 B의 활성은 결장암 세포 주 또는 결장암의 동물 모델에 대한 활성으로 국한되지 않는다. 상기는 다양한 종양 세포 주에서 광범위한 항 종양 효과를 갖는다. 다양한 유형의 인간 암 세포주들을 멸균 조건 하에서 10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 중탄산 나트륨이 보충된 RPMI 1640 배지에서 증식시켰다. 화합물 B의 증식 억제 효과를 측정하기 위해서, 세포들을 웰 당 1000 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시이딩시켰다. 도말 후 24 시간 째에, 세포들에게DMSO에 용해된 다양한 농도의 화합물 B의 유리 염기(최종 농도 0.1%)를 투여하였다. 종양 세포 성장에 대한 상기 약물의 효과를 5 일의 연속 치료 후에 뉴트랄 레드 세포독성 분석을 사용하여 측정하였다. 뉴트랄 레드는 ATP-의존성 운반 기작에 의해 생존가능한 세포를 선택적으로 집어내는 염료이다.
표 4에 요약된 바와 같이, 화합물 B(유리 염기)는 다양한 기원의 조직들로부터 유래된 배양된 인간 세포 주의 패널에 대해 평가 시 강력한 성장 억제 활성을 나타내었다. 화합물 B는 상기 세포주가 유래된 종양의 초기 조직과 무관하게 필적할만한 성장 억제 효과를 나타내었다. 모든 세포 주들에 대해 산출된 GI50값(비히클 대조군에 비해 성장을 50%까지 억제시키는 약물의 농도)은 1 내지 2 μM이었다.
하기 표의 데이터 이외에, 본 발명자들은 화합물 B(HCl 염)에 대한 인간 백혈구 세포주(CCRF-CEM, K562 및 Molt-4), 골수종 세포 주(RPMI8226), 췌장 종양 세포주(PAN-1) 및 난소 종양 세포주(OVCAR-3)의 필적할만한 감수성을 관찰하였다.
주어진 동물 및 인간 안전성 특징, 및 화합물 B의 동물 및 매우 광범위한 세포 배양액 효능에 대해서, 본 발명의 선택 기준을 만족시키는 화합물(cGMP-특이적인 PDE 억제 포함)이 유용한 항 종양 치료제일 수 있음은 분명하다.
항 종양제로서 치료학적으로 유효할 수 있는 구조상 추가의 cGMP-특이적인 PDE 억제 화합물을 확인함에 관해서, 당해 분야의 숙련가는 동일한 형태를 갖지만 화학적으로는 상이한 추가의 화합물들의 컴퓨터 모델링을 위한 토대로서 사용될 수 있는 본 원에 개시된 다수의 유용한 모델 화합물들(뿐만 아니라 참고로 인용된 이들의 동족체들)을 알고 있다. 예를 들어, 몰레큘라 시뮬레이션즈 인코포레이티드(Molecular Simulations Inc.)에서 WebLab(등록상표) ViewerProTM으로 시판하는 것과 같은 소프트웨어는 분자 가시화 및 화학적 교신 능력을 포함한다. 이러한 소프트웨어는 묘사되거나 내포된 화학 구조를 정확하게 확인하기 위해서 공지된 활성 화합물의 3D 가시화를 포함한 기능들을 포함한다. 또한, 상기 소프트웨어는 구조들을 사용자-정의된 특징 기준에 포개질 수 있게 하며, 상기 사용자는 거리, 각도 또는 2면각을 측정할 수 있다.
이러한 상황 하에서, 다른 활성 화합물들의 구조가 상기에 개시되었으므로, 본 발명의 선택 기준에 따라 선별 및 선택될 수 있는 잠재적인 신규의 추가 화합물들을 확인하기 위해서 상기와 같은 소프트웨어를 갖는 2D 및 3D 유사성 연구 기법과 집단 분석을 적용할 수 있다. 이러한 소프트웨어 방법들은 유사하게 보이거나 유사한 성질을 갖는 화합물들이 보다 유사한 활성(본 발명의 선택 기준을 사용하여 확인할 수 있다)을 가질 것 같다는 원리에 따른다.
마찬가지로, 상기와 같은 추가의 화합물들을 컴퓨터 모델링하는 경우, 다수의 상기 화합물들 및 그의 변형물들을 약학 산업의 통상적인 숙련가들에 의해 흔하게 사용되는 공지된 조합적인 화학 기법들을 사용하여 합성할 수 있다. 몇 가지 이용할 수 있는 조합적인 화학 서비스의 예로 뉴 케미칼 엔터티스 인코포레이티드(New Chemical Entities, Inc., of Bothell Washington), 프로토젠 레보라토리즈 인코포레이티드(Protogene Laboratories, Inc., of Palo Alto, CA), 액시스 인코포레이티드(Axys, Inc., of South San Francisco, CA), 나노신 인코포레이티드(Nanosyn, Inc., of Tucson, Arizona), 트레가 인코포레이티드(Trega, Inc., of San Diego, CA) 및 RBI 인코포레이티드(Natick, Mass.)에 의해 제공된 것들이 있다. 다수의 다른 이용가능한 회사들이 있다. 다수의 큰 제약사들은, 보다 우수하지 않다면, 비슷한 사내 능력을 갖는다. 간단히, 당해 분야의 숙련가는 본 원에 개시된 화합물의 특성들을 갖는 종양 치료에 유망한 화합물들을 선별하기 위해서 다수의 화합물들을 쉽게 제조할 수 있다.
본 발명의 기준을 사용하여 선별 및 이어서 선택할 수 있는 화합물들의 확인을 보다 지원하기 위해서, PDE5 단백질에 대한 선택된 항-종양 화합물의 결합을 아는 것이 중요하다. 하기 논의되는 절차에 의해, 본 발명의 선택 기준을 만족시키는 바람직한 화합물들은 PDE5의 cGMP 촉매 영역에 결합함을 발견하였다.
이를 확립시키기 위해서, 상기 촉매 영역을 포함하지 않는 PDE5 서열들을 사용하였다. 이러한 서열을 제조하는 한가지 방식은 융합 단백질로서, 바람직하게는 명백해질 것이라는 이유로 글루타치온 S-트랜스퍼라제(“GST”)를 갖는 서열을 발현시키는 것이다.
RT-PCR 방법을 사용하여 소 PDE5A cDNA 서열(McAllister-Lucas L. M. et al., J. Biol. Chem. 268, 22863-22873, 1993)로부터 디자인되고 PDE1-10 계열 중에서 선택된 전방 및 역 프라이머를 갖는 PDE5의 cGB 영역을 수득한다. 전체 RNA에 대한 5'-3' 결합된 키트에 이어서 mRNA의 올리고(dT) 컬럼 정제를 HT-29 세포에 사용한다. 전방 프라이머(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G, 203-227) 및 역 프라이머(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG, 1664-1686)를 인산화 부위, 및 인간 PDE5A의 저 및 고 친화성 cGMP 결합 부위(203-1686 pb, cGB-PDE5)를 암호화하는 1484 bp 단편을 합성하는데 사용한다. 상기 합성된 cGB-PDE5 뉴클레오티드 단편은 소 PDE5A와 97% 유사한 494 개 아미노산을 암호화한다. 이어서 상기를 tac 프로모터, 및 EcoRI 및 XhoI 절단 부위로 pGEX-5X-3 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 벡터(Pharmacia Biotech)내로 클로닝시킨다. 이어서 상기 융합 벡터를 이 콜라이 BL21(DE3) 세균(Invitrogen)에 형질감염시킨다. 상기 형질감염된 BL21 세균을 대수기까지 증식시키고, 이어서 IPTG를 유도인자로서 가한다. 상기 유도를 20 ℃에서 24 시간 동안 수행한다. 상기 세균을 수확하고 용해시킨다. 가용성 세포 용해물을 GSH 결합된 세파로스 4B(GSH-세파로스 4B)와 함께 배양한다. 상기 GST-cGB-PDE5 융합 단백질은 GSH-세파로스 비이드에 결합될 수 있으며 다른 단백질은 과잉의 냉 PBS에 의해 비이드로부터 씻겨진다.
발현된 GST-cGB-PDE5 융합 단백질은 7.5% SDS-PAGE 겔 상에 85Kd 단백질로서 나타난다. 이는 그의 cGMP 결합 및 단백질 키나제 G 및 A에 의한 인산화를 특징으로 한다. 상기는 2 개의 cGMP 결합 부위를 나타내며, Kd는 1.6 ± 0.2 μM이고, 이는 고유 소 PDE5의 Kd=1.3 μM에 가깝다. GSH 결합된 세파로스 비이드 상의 GST-cGB-PDE5를 cGMP-의존성 단백질 키나제 및 cAMP-의존성 단백질 키나제 A에 의해 생체외에서 인산화시킬 수 있다. PKG에 의한 GST-cGB-PDE5 인산화의 Km은 2.7 μM이고 Vmax는 2.8 μM인 반면, BPDEtide 인산화의 Km은 68 μM이다. PKG에 의한 인산화는 GST-cGB-PDE5 단백질에 1 대 1의 비로 결합된 분자 포스페이트를 나타낸다.
관심 화합물에 대한 cGMP 결합 분석(Francis S.H. et al., J. Biol. Chem. 255, 620-626, 1980)을 5 mM 인산 나트륨 완충액(pH=6.8), 1 mM EDTA, 0.25 ㎎/㎖의 BSA,3H-cGMP(2 μM, NEN) 및 GST-cGB-PDE5 융합 단백질(30 ㎍/분석)을 함유하는 총 부피 100 ㎕로 수행한다. 각각의 시험 화합물을3H-cGMP 기질과 동시에 가하고, 상기 혼합물을 22 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이어서, 상기 혼합물을 필터 멤브레인으로서 GF/B를 사용하여 브란델(Brandel) MB-24 세포 수확기로 옮긴 다음 냉 5 mM 칼륨 완충액(pH 6.8) 10 ㎖로 2 회 세척한다. 이어서 상기 멤브레인을 절단하고 섬광 바이알로 옮긴 다음 각각의 바이알에 H2O 1 ㎖ 및 레디 세이프(Ready Safe)TM액체 섬광 칵테일 6 ㎖을 가한다. 상기 바이알들을 벡크만 LS 6500 섬광 계수기 상에서 카운트한다.
계산을 위해서, 결합 단백질을 5 분간 비등시킴으로써 블랭크 샘플을 제조하며, 상기 결합 수는 비등시키지 않은 단백질과 비교할때 <1%이다. 필터 멤브레인 또는 다른 세포 부스러기에 의한 급냉을 또한 눈금화한다.
PDE5 억제제, 설파이드, 엑시슐린드, 화합물 B, 화합물 A, E4021 및 자프리나스트, 및 환상 뉴클레오티드 동족체 cAMP, 환상 IMP, 8-브로모-cGMP, 환상 UMP,환상 CMP, 8-브로모-cAMP, 2'-O-부틸-cGMP 및 2'-O-부틸-cAMP이 GST-cGB-PDE5 단백질의 cGMP 결합 부위와 경쟁적으로 결합할 수 있는지를 시험하기 위해서 상기 화합물들을 선택한다. 결과를 도 7에 나타내었다. cGMP는 GST-cGB-PDE5 단백질과 특이적으로 결합한다. 환상 AMP, cUMP, cCMP, 8-브로모-cAMP, 2'-O-부틸-cAMP 및 2'-O-부틸-cGMP는 cGMP와 결합에 대해 경쟁하지 않았다. 환상 IMP 및 8-브로모-cGMP는 고 농도(100 μM)에서 cGMP(2 μM)와 부분적으로 경쟁할 수 있다. PDE5 억제제들 중 어느 것도 GST-cGB-PDE5의 결합에서 cGMP와 어떠한 경쟁도 나타내지 않았다. 따라서, 이들은 PDE5의 cGMP 결합 부위에 결합하지 않았다.
그러나, 화합물 A는 PDE5(즉, 피이크 A)에 경쟁적으로(cGMP와) 결합한다(화합물 A는 또한 PDE 피이크 B에 경쟁적으로(cGMP와) 결합한다). 화합물 A가 PDE5의 cGMP-결합 부위에 결합하지 않고 화합물 A와 cGMP 간에 경쟁적인 결합이 존재한다는 사실은 화합물 A와 같은 바람직한 화합물이 PDE5에 대해 cGMP 촉매 부위에 결합함을 의미하며, 이는 당해 분야의 숙련가에 의해(통상적인 경쟁 결합 실험에 의해) 쉽게 입수될 수 있으나, 다른 화합물들을 모델링하기 위해서 당해 분야의 숙련가를 보다 쉽게 지원할 수 있는 정보이다. 따라서, 본 발명에 제공된 바람직한 화합물의 화학적 구조 및 cGMP 결합 부위 정보를 사용하여, 당해분야의 숙련가는 다른 화학적 화합물들을 치료제로서 사용하기 위해서 모델링하고, 확인하고 선택(본 발명의 선택 기준을 사용하여)할 수 있다.
본 발명의 방법론에 따라 선택된 화합물을 용어 “약학 조성물”, 즉 화합물(예를 들어 상기 개시된 고체와 같은) 및 고체 또는 액체 형태로 경구 투여에 의해, 액체 형태로 IV 또는 IP 투여에 의해, 연고 형태로 국소 투여에 의해, 또는 좌제 제형으로 직장 또는 국소 투여에 의해 환자에게 전달하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체의 통상적인 의미로부터 잘 이해되는 바와 같이 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 담체가 가장 바람직하다.
당해 분야에 잘 공지된 바와 같이, 경구 투여를 위한 약학 조성물 중의 약학적으로 허용가능한 담체에는 캡슐, 정제, 환제, 분말, 트로키제 및 과립이 있다. 이러한 고체 투여형에서, 상기 담체는 하나 이상의 불활성 희석제, 예를 들어 슈크로즈, 락토오즈 또는 전분을 포함할 수 있다. 이러한 담체는 또한 통상적인 실시에서와 같이, 희석제 이외의 추가의 물질들, 예를 들어 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제, 트로키제 및 환자의 경우에, 상기 담체는 또한 완충제를 포함할 수도 있다. 정제, 환제 및 과립과 같은 담체는 상기 정제, 환자 또는 과립의 표면 상에 장용 코팅하여 제조할 수 있다. 한편으로, 장용-코팅된 화합물을 정제, 환제 또는 과립으로 압착시킬 수 있으며, 상기 정제, 환제 또는 과립은 환자에게 투여하기 위한 것이다. 바람직한 장용 코팅에는 결장 pH에서 용해되거나 붕해되는 것들, 예를 들어 쉘락 또는 유드라젯(Eudraget) S가 있다.
약학 조성물에서 약학적으로 허용가능한 담체에는 경구 투여용 액체 투여형, 예를 들어 당해 분야에서 흔히 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물을 함유하는 약학적으로 허용가능한 유화액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서가 포함된다. 상기와 같은 불활성 희석제 이외에, 상기 조성물은 또한 습윤제, 유화 및 현탁제, 및감미제, 풍미제 및 방향제와 같은 보조약을 포함할 수 있다.
IV 또는 IP 투여용 약학 조성물에 약학적으로 허용가능한 담체는 통상적인 약학적 염수 용액을 포함한다.
국소 투여용 약학 조성물에 약학적으로 허용가능한 담체는 약체를 건조되지 않게 피부에 적소에 유지시키기 위해서 패치 또는 다른 액체 보유 물질과 함께 사용될 수 있는 DMSO, 알콜 또는 프로필렌 글리콜 등을 포함한다.
직장 투여용 약학 조성물에 약학적으로 허용가능한 담체는 바람직하게는, 본 발명의 화합물 이외에 코코아 버터 또는 좌약 왁스 또는 겔과 같은 부형제을 함유하는 좌제이다.
본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체 및 화합물을 환자에게 투여하기 위해서 단위 투여형의 약학 조성물로 제형화한다. 단위 투여형에서 유효 성분(즉, 본 발명에 따라 선택된 화합물)의 투여량 수준을 목적하는 투여 방법(즉, 경구 또는 직장)에 따라서 종양 제거 활성을 성취하는데 유효한 양의 유효 성분을 얻도록 변화시킬 수도 있다. 따라서 상기 선택된 투여량 수준은 투여되는 화합물의 성질(즉 그의 IC50, 이는 쉽게 확인될 수 있다), 투여 경로, 목적하는 치료 지속기간 및 다른 인자들에 따라 변한다. 경우에 따라, 단위 투여형은 유효 화합물의 1 일 요구량을 1 회 용량으로, 또는 다수의 투여 용량으로 분할해서, 예를 들어 하루에 2 내지 4 회 분할 용량이 되도록 하는 것일 수 있다. IV 투여를 위해서, 초기 투여량을 평균 성인 남자의 혈장 함량(즉 약 4 ℓ)에서 IC50을 성취하는 투여량을 기준으로 확인할 수 있다. 본 발명에 따라 선택된 활성 화합물의 초기 투여량은 0.5 내지 600 ㎎ 범위일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 바람직하게는 적응증, 사용 설명서 등을 함유하는 적합하게 인쇄된 물질(예: 패키지 삽입물)과 함께 용기(예: 상자 또는 병, 또는 이들 모두)로 패키징한다.
명백하게, 본 발명의 다수의 변경 및 변화들이 상기 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 첨부된 특허청구범위의 범위 내에서 본 발명을 본 원에 구체적으로 개시된 것과 다르게 수행할 수도 있음은 물론이다.
본 발명에 따라 SAAND로서 유용한 화합물을 평가하고 확인하여 보다 정확하고 대체적인 방법을 발견하였다.

Claims (23)

  1. (a) 인간의 신체에서 분리되어진 치료하려는 종양에 대한 화합물의 항 종양 활성을 평가하고;
    (b) 상기 화합물이 상기 치료하려는 종양에서 PKG(단백질 키나제 G) 활성을 증가시키는 지의 여부를 평가하고;
    (c) 상기 화합물이 상기 치료하려는 종양에서 JNK(Jun N-말단 키나제) 활성을 활성화시키는 지의 여부를 평가하고;
    (d) 상기 치료하려는 종양에서 항 종양 활성을 나타내고, PKG 활성을 증가시키며, JNK를 활성화시키는 화합물을 선택함을 포함하는
    치료하려는 종양의 치료를 위해 화합물을 선택하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 화합물이 PDE5를 억제하는 지의 여부를 평가하고, PDE5를 억제하는 화합물을 선택함을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 화합물이 치료하려는 종양에서 β-카테닌을 감소시키는 지의 여부를 평가하고, β-카테닌을 그렇게 감소시키는 화합물을 선택함을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 화합물이 cGMP-특이적인 포스포디에스테라제(“PDE”)를 억제하는 지의 여부를 평가하고 상기 PDE를 억제하는 화합물을 선택함을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 화합물이 PKG 발현을 증가시키는 지의 여부를 평가하고, 상기 화합물이 PKG 발현을 증가시키는 경우 상기 화합물을 선택함을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 화합물이 PKG 활성화를 증가시키는 지의 여부를 평가하고, 상기 화합물이 PKG 활성화를 증가시키는 경우 상기 화합물을 선택함을 추가로 포함하는 방법.
  7. (a) 화합물이, 인간의 신체에서 분리되어진 치료하고자 하는 종양에서 PKG 활성을 증가시키는 지의 여부를 평가하고;
    (b) 상기 화합물이 상기 종양 세포에서 β-카테닌을 감소시키는 지의 여부를 평가하고;
    (c) 상기 화합물이 상기 치료하려는 종양에서 JNK 활성을 활성화시키는 지의 여부를 평가하고;
    (d) 상기 치료하려는 종양에서 PKG 활성을 증가시키고, β-카테닌을 감소시키고, JNK1을 활성화시키는 화합물을 선택함을 포함하는 치료하려는 종양의 치료를 위해 화합물을 선택하는 방법.
  8. 인간의 신체에서 분리되어진 종양에서 PKG 활성을 증가시키고 JNK를 활성화시키는 화합물을 선택하고; PKG 활성을 증가시키고 JNK를 활성화시키며 종양 성장 억제 활성을 갖는 화합물이 정상 세포의 성장을 실질적으로 억제하지 않으면서 종양을 억제하는 능력을 갖는다는 점에서, 상기 화합물의 종양 성장 억제 활성을 평가함을 포함하는 종양 치료 능력을 갖는 화합물을 확인하는 방법.
  9. 화합물의 사이클로옥시게나제(COX) 억제 활성을 측정하고; 낮은 COX 억제 활성 및 JNK의 활성화가 화합물의 종양 치료 능력의 표시라는 점에서, 상기 화합물이 인간의 신체에서 분리되어진 종양 세포에서 JNK를 활성화시키는 지의 여부를 측정함을 포함하는 종양 치료 능력을 갖는 화합물을 확인하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 종양 세포 성장의 억제가 화합물이 종양의 치료에 유용하다는 추가의 표시라는 점에서, 상기 화합물이 샘플에서 종양 세포 성장을 억제하는 지의 여부를 측정함을 추가로 포함하는 방법.
  11. 인간의 신체에서 분리되어진 종양 세포에 대하여 화합물의 종양 세포성장 억제 활성을 측정하고; 상기 화합물이 상기 종양 세포에서 PKG 활성을 증가시키고 JNK를 활성화시키는 지의 여부를 측정하고; 상기 종양 세포에서 종양 세포 성장 억제 활성을 나타내고, PKG 활성을 증가시키며, JNK를 활성화시키는 화합물을 선택함을 포함하는 종양 치료 화합물을 선택하는 방법.
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  23. (a) 화합물이 인간의 신체에서 분리되어진 종양에서 PKG 활성을 증가시키는 지의 여부를 평가하고;
    (b) 상기 화합물이 상기 종양 세포에서 β-카테닌을 감소시키는 지의 여부를 평가하고;
    (c) 상기 화합물이 상기 종양에서 JNK를 활성화시키는 지의 여부를 평가하고;
    (d) 상기 종양에서 PKG 활성을 증가시키고, JNK를 활성화시키고, β-카테닌을 감소시키는 화합물을 선택함을 포함하는 종양 치료 화합물의 선택 방법.
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