CN1330772C - 可抑制肿瘤的化合物的筛选方法和含有这些化合物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可治疗预防哺乳动物肿瘤疾病的化合物的鉴定方法，测定化合物的磷酸二酯酶抑制活性，同时测定提高JNK激酶活性的能力。另外还需要测定培养的肿瘤细胞的生长抑制和诱导编程性细胞死亡的作用。显示出磷酸二酯酶抑制活性，有提JNK激酶活性的能力，生长抑制和编程性细胞死亡诱导作用的化合物对于治疗肿瘤而言是理想的。

Description

可抑制肿瘤的化合物的筛选方法和 含有这些化合物的药物组合物
本发明涉及可用作选择性治疗哺乳动物癌前期和癌症病灶的化合物的鉴定方法，以及含有这些化合物的药物组合物。
多年来，人们一直在致力于研究可选择性地治疗肿瘤细胞，而对正常细胞基本上又没有抑制其生长的副作用的化合物。不管需要治疗的癌症是何种类型，通常的化疗方法有一共同特征：常用的组合物(例如herceptin、紫杉醇、顺铂、他莫昔芬等)对肿瘤细胞具有基本的作用-事实上对正常组织常常有很大的副作用。很多副作用使人衰弱不困难危及生命。因此，常用的化疗方法只是在肿瘤病程快速发展至药物的副作用显然大于不进行化疗的危险性的阶段之后才使用。
典型的是，常用的化疗方法也用来治疗某些特定类型的肿瘤。例如亮丙瑞林常常被用来治疗前期的前列腺癌，但是不用于治疗结肠或肺癌。理想的是组合物对肿瘤具有较宽的活性。
Parnukcu等人在U.S.5,401,774中公开了现在已知的抗肿瘤化合物exisulind。与常用的化疗方法不同的是，相对于正常细胞而言，该化合物对肿瘤细胞有很好的选择性。因此，这些化合物可给慢性患者使用，而不会出现常用化疗方法通常所以的副作用。此外，因为它们的安全性，这些化合物也可以对早期的患者进行治疗。另外，还认识到这些新化合物是新一类的，被称为选择性编程性细胞死亡类的抗肿瘤药物(“SAANDs”)。
相对于常用的化疗方法而言，除了显著的安全性能以外，与常用的化疗方法相比SAANDs还有较宽范围的治疗应用。例如，已有报告说第一种SAAND药物可用于治疗结肠、乳腺、肺、前列腺、肾和黑色素瘤的肿瘤，并且对其他肿瘤也有作用。
相对于可肿瘤剂NSAIDS(如舒林酸)而言，SAANDs还具有其他优点，与NSAIDS不同的是SAANDs不能抑制COX I/II酶。在慢性用药时，COX I和/或COX II酶的抑制(例如通过indornethacin，celecoxib和其它的NSAIDs)会导致显著的副作用。此外，对抗肿瘤作用而言不需要COX的抑制作用。并不令人意外的是，许多这类COX I和COX II抑制剂也没有显示出显著的抗肿瘤活性，COX I和COX II抑制剂的副作用包括可能导致严重胃溃疡的胃刺激和肾毒。用SAANDs进行抗肿瘤治疗随慢性或长期用药而增加，相对于所显示出的抗肿瘤性能而言，因为少数患者确实慢性或长期的使用了COX，只是由于安全方面的考虑，COX抑制剂的不适当的。对炎症而言，COX抑制剂通常只是短期或在急性期用药。
知道最近SAANDs为什么可在没有COX抑制剂的副作用(或者甚至是在常用化疗的更严重的副作用)的情况下使用一直是个秘密。如U.S.5,858,694所述，SAANDs的作用部分是通过抑制剂PDE5，由此说明了SAANDs在肿瘤中如何诱导编程性细胞死亡(细胞死亡的形式)，但是在正常细胞中不会发生。在上述694的专利中同时还发现在肿瘤中SAANDs通过提高cGMP和减少cAMP而起作用。
但是，后者发现某些PDE5抑制剂不能诱导编程性细胞死亡(例如参见U.S.申请09/173,375，1998.10.15)。在375的专利申请中，首次公开了在肿瘤细胞中发现的新的cGMP-特异性PDE。观察到的一种结果是，与非活性的PDE5分离的抗肿瘤PDE5抑制剂是能抑制新的cGMP-特异性PDE的抗肿瘤PDE5抑制剂，而非活性的PDE5抑制剂(如sildenafil)只是相对较小的作用。如375申请所公开的结果导致了更准确的药物筛选方法以鉴定抗肿瘤PDE5抑制剂的活性(即另外的SAANDs)。
但是，仍然需要更准确的评价和鉴定化合物用途的其它方法。
发明概述
本发明涉及筛选和鉴定化合物作为SAANDs抑制剂应用的新方法。具体地说，本发明提供了鉴定可用于治疗和预防肿瘤的化合物的方法，所述的肿瘤疾病包括癌前病变、与COX抑制有关极微的副作用和其它与常用的化疗有关的非特异性交互作用。
在研究为什么某些PDE5抑制剂会诱导编程性细胞死亡时，我们发现它们诱导编程性细胞死亡基本上是通过激活JNK激酶活性实现的。JNK是MAP激酶大家族中的脯氨酸定向激酶。如U.S.5,858,694(Piazza等人)的教导，可以确信的是，这种作用是在JNK编程性细胞死亡途径的下游，通过使用编程性细胞死亡前期PDE5抑制剂调节cGMP和cAMP所引起的。cGMP和cAMP调节和JNK1活性之间的联系是奇怪的，并且形成了确定cGMP抑制剂是不是SAANDs的应用途径。与JNK激酶的此作用相反的是，试验用的SAANDs只使ERK2激酶活性略有激活，通常报道的相对，但是分离的信号转导途径具有刺激细胞增殖的作用。
本发明涉及评价化合物是不是能够引起肿瘤细胞中cGMP-依赖蛋白激酶G(“PKG”)活性提高和活化JNK1激酶的方法。如上所述，我们确信PKG活性的提高至少部分是由适当的PDEs的SAANDs抑制作用引起的cGMP的增加。SAANDs的其它特征是(1)如上述694专利中所报道的PDE5的抑制作用；(2)新的cGMP-特异性PDE构形；(3)PDE2的抑制作用；(4)在肿瘤细胞内，SAANDs可提高细胞内cGMP的事实；和(5)在某些种类的肿瘤细胞中，可减少cAMP水平的事实。
因此，本发明新方法的一个实施方案是评价化合物是不是能够激活JNK，引起肿瘤细胞中PKG活性的提高，以及化合物是不是可以抑制PDE5。本发明新的筛选方法的另一实施方案是评价化合物是不是能够激活JNK，引起肿瘤细胞中PKG活性的提高，以及化合物是不是可以抑制如上所述的新的cGMP-特异性PDE和/或PDE5。第三个实施方案是评价化合物是不是能够激活JNK，引起肿瘤细胞中PKG活性的提高，以及化合物是不是可以使肿瘤细胞中的cGMP提高和/或cGMP水平下降。以这种方式可以成功地评价言语SAANDs的化合物。
在这些方面，本发明还涉及新的在体内或体外选择化合物治疗和预防肿瘤的能力的方法，特别是可安全的用于癌前期损伤的方法。具体地说，本发明是选择可治疗和预防肿瘤，包括治疗和预防癌前期损伤的化合物的方法。如此鉴定的化合物对COX抑制作用以及与常规化疗方法有关的其它非特异性交互作用有最小的副作用。可以对感兴趣的化合物进行试验，试验方法是将肿瘤细胞与抑制cGMP PDE的化合物进行接触，如这些化合物能够激活细胞中的JNK，然后再对该化合物进行进一步的评价(例如，动物或人的体内或体外模型或试验)其抗肿瘤的其它性能(例如，在体内或体外诱导编程性细胞死亡的能力)。
所以，本发明的一方面是涉及鉴定化合物是否有效地治疗肿瘤化合物的筛选方法，，这包括确定化合物对PDE5和/或PDE2的抑制作用，以及对COX的抑制作用。优选的，本发明的筛选或选择方法进一步的包括测定化合物是不是能够在体内或体外抑制肿瘤细胞的生长。
通过以此方式选择化合物，很有效地改进了治疗肿瘤的化合物的鉴定工作，与过去研制的药物组合物和治疗向的处理肿瘤的方法相比，使之更加快速，精度更高。更多的好处将在下文详细说明。
本发明还包括含有这些化合物的药物组合物，以及涉及这些化合物的治疗方法。
附图的详细说明
图1A-C说明了JNK1和caspase-3在SW480结肠癌细胞中的活性，该细胞与舒林酸硫化物和几种SAANDs进行接触。
图1A：SW480细胞用DMSO(-)或指定浓度的舒林酸硫化物、exisulind、化合物A或化合物B处理1小时。溶解细胞，用抗JNK1抗体进行JNK1免疫沉淀，用免疫沉淀物(″CF″)进行体外激酶活性试验，以GST-c-Jun(1-79)为基质。该试验以类似的结果重复三次。以磷图象测定活性的倍数。
图1B：SW480细胞用化合物A(1μM)在指定的时间期间内进行体外试验，如上所述测定JNK1激酶急忙活性
图1C：SW480细胞用舒林酸硫化物(200μM)、exisulind(600μM)、化合物A(1μM)或化合物B(10μM)处理24小时。溶解细胞，用提取物进行caspase-3活性，以Ac-DEVD-AFC作为基质，试验在有或没有caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO存在的情况下进行。Caspase-3活性以没有AC-DEVD-CHO存在时的ARC荧光值减去AC-DEVD-CHO存在时的荧光值(激发，400nm，放射，505nm)。
图2A-B说明了由cGMP调节和PKG作用的JNK1活性。
图2A SW480细胞用DMSO(-)或化合物A，0.1μM；dbcGMP，500μM；YC-l，50μM；MY5445，50μM；潘生丁，10μM或dbcAMP，500μM处理1小时。溶解细胞，JNK1免疫沉淀，如图1A所述进行体外激酶活性的IP试验。
图2BSW480细胞用DMSO、KT5720(2μM)或Rp8-pCPT-cGMPS(2μM)预处理2小时，然后用化合物B(0.1或10μM)处理1小时。溶解细胞，如上所述进行JNK1活性的IP试验。
图3A-C说明了SAAND处理的MEKK 1-SEK1途径的活性。
图3A：SW480细胞用化合物A(1μM)处理，在指定的时间收集，溶解进行SEK1试验的细胞，试验用免疫印迹法，以抗-磷酸化-SEK1(Thr223)抗体进行。通过密度测定法测定磷酸化增加的倍数。该试验以类似的结果重复三次。
图3B：SW480细胞用化合物A(1μM)处理，1天或2天后收集细胞，溶解进行MEKK1裂解试验的细胞，试验用免疫印迹法，以MEKK1抗体进行。(-)是指DMSO处理对照组细胞。
图4说明了化合物A-诱导的由Rp-8-pCPT-cGMPS产生的PARP裂解。SW480细胞用DMSO(-)或Rp-8-pCPT-cGMPS(2μM)处理2小时，然后用DMSO(-)或化合物A(1μM)处理。2天后收集漂浮和附着的细胞，溶解进行PARP裂解试验的细胞，试验用免疫印迹法，以抗-PARP抗体进行。PARP裂解倍数的增加以85kD碎片进行密度测定法测定。。
图5说明了被SAANDs激活的编程性细胞死亡信号转导途径。通过抑制PDE2/5，SAANDs诱导了细胞内cGMP水平的提高。因此而激活了PKG，它可以导致MEKK-1/SEK1/JNK1途径的活化。然后，在caspases活化、PARP裂解和其它介导编程性细胞死亡的事件中，JNK1的活化发挥作用，可能会伴随其它信号。
图6指出时间与组蛋白有关的DNA片段数量增加之间的依赖关系，所述的DNA是用50μM化合物I处理后的LNCaP细胞培养物。
图7是说明环核苷酸类似物和选择的PDE5抑制剂中，PDE5的非催化cGMP结合位点的特异性结合的棒状图。
图8A是SW480细胞溶解物的SDS(X-射线膜暴露)蛋白质凝胶PKG试验，该溶解物是在没有cGMP存在的情况下，用药物处理后的细胞溶解物，是把细胞用DMSO(0.03％，1和2道)、exisulind(200，400和600μM；3，4，5道)和E4021(0.1，1和10μM，6，7，8道)培养48小时后得到的。
图8B是SW480细胞溶解物的SDS(X-射线膜暴露)蛋白质凝胶PKG试验，该溶解物是在有cGMP存在的情况下，用药物处理后的细胞溶解物，是把细胞用DMSO(0.03％，1和2道)、exisulind(200，400和600μM；3，4，5道)和E4021(0.1，1和10μM，6，7，8道)培养48小时后得到的。
图9是说明了相对于对照组，exisulind对肿瘤细胞中β-caternin和PKG水平的作用的棒状图。
优选实施方案的详细描述
I.SAANDs的特征
A.一般的c-Jun和JNK
c-Jun是转录因子AP-1的一种组分，它可被很多细胞外的刺激物活化。c-Jun的调节是很复杂的，并且确信其涉及c-Jun蛋白水平的增加和特异性丝氨酸(63和73)被Jun N-端基的激酶(JNK)磷酸化两个方面。
由前述可知，JNK的活性与编程性细胞死亡有关。例如，Gaiate等人，Mol.Pharmacol.，1998年4月，53：4，602-12中指出醚磷脂化的1-O-十八烷基-2-O-甲基-rac-甘油-3-磷酸胆碱(“ET-18-OCH3”)-是人体肿瘤细胞中编程性细胞死亡的有效诱导物-以与JNK信号活性有关的方式诱导编程性细胞死亡。他们还特别指出，给不同人体的白血病细胞(HL-60，U937，和Jurkat)加入ET-18-OCH3可诱导c-jun mRNA水平发生引人注目的和可以承受的增加，该水平与活化剂蛋白-1转录因子的活性有关，所述的白血病细胞在用ET-18-OCH3治疗的过程中会出现快速的编程性细胞死亡。他们还发现在HL-60细胞中，ET-18-OCH3可诱导JNK(在编程性细胞死亡开始之前可以对其进行测定)的持续活化，后者可由DNA碎片进行评价，也可以用在质膜的外部小叶上出现磷脂酰丝氨酸来评价。在HL-60单核细胞/巨噬细胞分化和ET-18-OCH3调节编程性细胞死亡之后，由于不同的活化方式，分别是短暂与持续的，因此JNK的诱导作用也不同。由于不能活化JNK，ET-18-OCH3的类似物不能诱导编程性细胞死亡。在K-562细胞中测不出ET-18-OCH3和JNK的依赖关系，在用ET-18-OCH3治疗的过程中不会出现编程性细胞死亡。佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯可抑制ET-18-OCH3诱导的编程性细胞死亡和JNK持续不变的活性；因此，ET-18-OCH3诱导的JNK持续活性与醚磷脂诱导编程性细胞死亡的能力有关。再有，反义的低聚核苷酸可直接地使c-Jun不能阻断ET-18-OCH3诱导的编程性细胞死亡，说明了ET-18-OCH3引起的编程性细胞死亡中c-Jun的作用。
类似地，Li Y等人，Mol.Cell Biol.，1998年8月，18：8，4719-31报道了UV刺激的JNK1活性被UV-诱导的SCLC编程性细胞死亡所促进。
这些和其它的一些报道指出JNK活性和c-Jun可以诱导编程性细胞死亡方式存在。
B.关于JNK途径中确认SAANDs的作用实验的概述
如上所述，非甾体抗炎药物舒林酸，SAANDs如exisulind(Aptosyn)可引起退化作用，并抑制患有家族性腺性息肉(FAP)的患者再次出现息肉。Exisulind也可抑制啮齿动物的致癌作用，并和引起生长抑制和在人体各类癌细胞系中的编程性细胞死亡。但是，exisulind不能抑制环氧化酶CQX-1或2。美国专利申请序列号09/046,739，09/173,375和09/414,626(这里引用作为参考)中公开了exisulind和其它的SAANDs在肿瘤细胞中抑制cGMP-水解磷酸二酯酶(PDE2/5)的作用，从而使肿瘤细胞中的蛋白激酶G(“PKG″)增加。
本发明中，我们发现了一种出人意料的作用，这就是在肿瘤细胞中SAANDs诱导的cGMP增加是JNK途径信号转导的作用。为了进一步确认上述结论，我们发现舒林酸硫化物、exisulind和两种另外的SAANDS、化合物A([(Z)-5-氟-2-甲基-(3，4，5-三甲基-氧代亚苄基)-茚基乙酰胺])和化合物B((Z)-5-氟-2-甲基-(4-亚吡啶基)-(3，4，5-三甲基-氧代亚苄基)-茚基乙酰胺盐酸盐)能够导致c-Jun氨基-端基的激酶(“JNK1″)的快速活化，所述激酶是与这些药物接触的SW480结肠癌细胞和与上述药物接触的其它类型的癌细胞。
由于SAANDs对肿瘤细胞的一种作用是提高这些细胞中的cGMP水平，因此为了确认SAANDs的上述新特性，我们还发现其它能提高GMP水平的已知药物也能活化肿瘤细胞中的JNK1。另外，由于SAANDs治疗的一种作用是提高PKG活性，我们发现抑制剂PKG，Rp-8-pCPT-cGMPS可以抑制肿瘤细胞中的JNK1活性，所述的JNK1与PKG抑制剂和抗肿瘤的cGMP特异性PDE抑制剂如舒林酸硫化物和SAANDs接触。
当肿瘤细胞与SAANDs接触时也可以观察到JNK1上游的SEK1和MEKK1被活化。PKG拮抗剂Rp-8-Pcpt-Cgmps也可抑制舒林酸诱导的PARP裂解，它是编程性细胞死亡的标记。因此，由exisulind和SAANDs诱导的编程性细胞死亡可引起cGMP水平提高，至少是部分地提高，通过PKG的活化再形成MEKK1-SEK1-JNK1活化的级串。这些研究还第一次涉及cGMP在JNK途径中的作用.
如在上述专利申请中所报道的，最近的研究指出SAANDs是cGMP-特异性磷酸二酯酶2和5(PDE2/5)的特异性抑制剂.以上述发现为基础，已经发现两种有效的SAANDs，化合物A和B是PDE5/2的特异性抑制剂。如美国专利申请序列号09/046,739和09/414,626中所述，.SAANDs对PDE5/2的抑制作用可诱导细胞内cGMP水平的提高。这些发现说明细胞内cGMP水平的提高可能是触发编程性细胞死亡重要机制，但是没有对所有的下游信号途径做出鉴定。
在本文所报道的实验中，我们发现SAANDs可引起JNK1快速和持续的活化，并确信其可受cGMP刺激的PKG活性介导。这些研究也是第一次涉及PKG对JNK1活性的作用。
C.JNK活性的试验方法和试验结果
将SW480人体结肠癌细胞氧溶剂DMSO或cGMP-特异性PDE抑制剂(即舒林酸硫化物，50-500μM；exisulind，100-600μM；化合物A，0.1-5μM；和化合物B，1-50μM)处理1小时，并对JNK1的活化进行试验。这些浓度可根据对编程性细胞死亡的最佳诱导进行选择。用抗-JNK1的抗体使内源性的JNK1免疫沉淀，以GST-c-Jun(1-79)作为基质进行体外激酶试验。如图1A所示，舒林酸硫化物，exisulind，化合物A和化合物B可活化JNK1。通过磷图象分析对诱导的倍数定量，见图1A。即使在很低的剂量时SAANDs、化合物A和化合物B对JNK1的活化也比舒林酸硫化物和exisulind的作用更强。在其它结肠细胞系，包括HCT 116和HT29中也观察到类似的效果(数据未显示)。
时间进程研究表明当SW480细胞用化合物A(1μM)处理时，JNK1的活性至少可持续24小时(图1 B)。在SW480细胞用类似浓度的舒林酸硫化物，exisulind，化合物A和化合物B处理24小时后，通过测定caspase-3的活性可确认这些化合物引起编程性细胞死亡的活性。然后，制备蛋白质提取物，以Ac-DEVD-APC为基质，在有或没有caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO的存在下，测定caspase-3的活性。图1C指出用所有这些化合物处理SW480细胞可引起caspase-3的活化。用HCT 116和HT29中也可观察到类似的效果(数据未显示)。
本发明还测定了SW480细胞中，cGMP水平的提高对JNK1的影响。如前述美国专利申请8和9所指出的，细胞内的cGMP水平可由鸟苷酸环化酶正向调节，由磷酸二酯酶2和5(PDE2/5)进行反向调节。用各种cGMP调节剂处理SW480细胞1小时，然后收集蛋白质提取物进行JNK1试验(图2A)。二丁酰基鸟苷3′：5′-环状单磷酸酯(″dbcGMP″；500μM)，可细胞渗透的cGMP类似物，可活化SW细胞中的JNK1，但是可细胞渗透的cGMP类似物，二丁酰基腺苷3′：5′-环状单磷酸酯(″dbcAMP″；500μM)是非活性的。YC-l(50μM)，鸟苷酸环化酶活化剂也可以活化JNK1。MY-5445(50μM)和双嘧达莫(10μM)，PDES-特异性抑制剂，也活化SW细胞中的JNK1。由这些cGMP调节剂导致的JNK1的类似活性HCT 116和HT29中也可观察到(数据未显示)。这些结果说明通过各种手段使cGMP水平提高，从而导致了结肠癌细胞中JNK1的活化。该信启、对cGMP是特异性的，对cAMP不是特异性的，因为是dbcGMP，而不是dbcAMP活化细胞中的JNK1。
PKG是cGMP的一种主要细胞靶，可与cGMP或上述类似物结合，可在体内和体外激活PKG活性。但是，在信号转导中PKG的确切作用是未知的。导致本发明的上述试验结果指出cGMP的增加使JNK1活化，我们检测了PKG-特异性抑制剂Rp-8-pCPT-cGMP是否有抑制SAANDs诱导JNK1活性作用的能力。作为对照，将KT5720用作蛋白质激酶A(“PKA”)特异性抑制剂。将SW480细胞用DMSO、KT5720(2μM)或Rp-8-pCPT-cGMPS(2μM)处理2小时，然后用DMSO或化合物B(1或10μM)处理1小时，收集细胞提取物，并测试JNK1活性，KT5720没有抑制活性。综合起来，这些结果表明SAALNDs通过cGMP/PKG途径活化JNK1。
为了将涉及上述JNK1活性的信号转导途径特征化，我们测试了SEK1，JNK1上游最接近的蛋白激酶是否也能够被SAANDs活化。SEK1的活化是通过此类蛋白质的两种残基Ser219和Thr223的由蛋白激酶MEKK1磷酸化实现的。将SW480细胞用化合物A(1μM)多次处理，直到6个小时，提取物用磷酸化的-Thr223-特异性SEK1抗体进行蛋白质印迹分析。在15-30分钟内，用化合物A处理可诱导SEK1磷酸化的增加，但没有改变内源性SEK1蛋白的总细胞水平(见图3A)。1小时可有9倍诱导值，这种作用至少会持续6小时(图3A)。仅用溶剂DMSO处理的细胞不会诱导SEK1的磷酸化(未给出数据)。
然后，我们测试了SAANDs对MEKK1(SEK1上游最接近的蛋白激酶)的作用。对MEKK1蛋白的蛋白质印迹分析说明SW480细胞用化合物A处理1或2天后，此蛋白质发生了裂解，但是，当细胞用DMSO处理时没有出现裂解(图3B)。以前的研究指出当MEKK1被caspases(19)活化时会发生裂解。如对GST-SEK1的MWKK1自动磷酸化和磷酸化作用进行的测定一样，我们也发现化合物A对MEKK1有强和短暂的活化。这些数据说明SAANDs是通过MEKK1-SEK1途径活化JNK1。但是，被PKG活化的cGMP是否能够直接活化MEKK1，或MEKK1的裂解和活化是否直接影响编程性细胞死亡的过程还是不清楚的。
最后，我们研究了SAANDs诱导编程性细胞死亡是否需要PKG的活化的途径。将SW480细胞用DMSO或PKG抑制剂Rp-8-pCPT-cGMPS(2μM)处理2小时，然后，细胞用DMSO和化合物A(1μM)处理2天。收集漂浮和附着的细胞，分析细胞溶解物中的多(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的裂解，用免疫印迹法进行分析，以抗-PARP抗体进行。PARP的116kD的核酶，它使NAD转化为烟酰胺和连接蛋白质ADP-核糖的聚合物，这对DNA修复和基因组的维持是非常重要的。在经历了编程性细胞死亡的细胞中，116kD的PARP蛋白被caspase-3裂解成为85和25kD的碎片，从而丧失了正常的PARP功能。PARP的这种非活性显然可以防止NAD和ATP细胞水平的损失，虽然在编程性细胞死亡中需要后一种作用。如图4所示，化合物A诱导PARP的裂解，但这种裂解不会由于细胞用PKG抑制剂Rp-3-pCPT-cGMPS预孵化而受到显著的抑制。我们还观察到在SW480细胞中，优势的阴性JNK1蛋白的表达强烈地抑制化合物A诱导的PARP裂解。这些数据证明在SW480细胞中cGMP/PKG/JNK1途径对SAAND诱导的编程性细胞死亡起着重要的作用。
因此，在这些试验中，我们首次指出SAANDs和其它cGMP诱导剂可活化信号转导的JNK1途径，并证明此途径对这些化合物诱导的编程性细胞死亡起着重要的作用。上述结果见图5。
美国专利申请序列号09/414,626和09/216,070中指出exisulind(Aptosyn)和其两种有效的衍生物-化合物A和B可抑制SW480细胞和其它引起癌症的细胞系中的cGMP-特异性磷酸二酯酶2和5，因此会导致cGMP细胞水平的提高。如美国专利申请序列号09/414,628所指出的，它可以导致PKG的活化。在30-60分钟内，PKG的活化可以依次导致SEK1的持续磷酸化和活化，然后，会导致JNK1的持续活化，如图5所示。如上文对其它可活化JNK1的非SAANDs编程性细胞死亡试剂所描述的，我们确信JNK1的活化会导致caspases的活化，PARP的裂解和基因的转录，也会造成编程性细胞死亡的程序。有研究者报道JNK1与各种试剂触发的编程性细胞死亡信号途径有关，这些触发途径包括UV和γ-射线、苄基异硫氰酸酯和DNA拓扑异构酶抑制剂β-拉帕醇。报道中没有涉及cGMP或PKG的方法。
JNK1活化AP-I转录因子，因此可诱导某些与t编程性细胞死亡有关的基因，同时使bcl-2磷酸化和使抗编程性细胞死亡的活性失活。好象PKG的活性也影响可造成生长抑制和SAANDs的编程性细胞死亡作用的其它途径。这些研究首次证明了JNK1信号转导途径涉及PKG，因此而扩大了这种酶体系在信号转导和控制基因表达中的作用。
D.进一步确认肿瘤细胞中SAANDs提高PKG活性的作用
应用下述的PKG试验，进行下述试验以确定SAANDs提高PKG活性的作用，在用SAAND处理的肿瘤细胞中该作用或者是因为提高PKG表达，或者提高cGMP水平(或两者)。
对两种不同类型的PDE抑制剂在肿瘤细胞中的作用进行评价。对抗肿瘤剂SAANDs和exisulind进行评价。对非SAANDs类型的PDE5抑制剂E4021也进行评价，以确定PKG水平的提高只是由于典型的PDE5抑制作用，或者PKG水平的提高与PDE5和美国专利申请序列号09/173,375(Liu等人，1998.10.15申请)公开的新的PDE的SAANDs抑制作用的前-编程性细胞死亡作用有关。
为了检测cGMP-特异性PDE对含有APC突变体的肿瘤的抑制作用，使用SW480结肠癌细胞。已知SW480含有APC突变体。在RPMI 5％血清中含有大约5百万SW480细胞，将其加入8个盘中的每个盘：
2-10cm盘---30μL DMSO载体对照(没有药物)，
3-10cm盘---200μM，400μM，600μM exisulind的DMSO溶液，和
3-10cm盘---E4021；0.1μM，1μM和10μM，DMSO溶液。
这些盘在5％CO2的孵化器中于37℃孵化48小时。
液体介质在盘中吸气(细胞本身会附着在盘上)。每个盘上附着的细胞通过将冷的PRS和200μL细胞溶解缓冲液即50mM Tris-HCl，1％NP-40，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF，500μMIBMX与蛋白酶抑制剂)加入各盘中进行洗涤。在细胞缓冲液加入后用刮的方法立刻收集各盘中溶解的细胞。取自各盘的细胞溶解物转移至微型取出管，该管在4℃孵化15分钟，同时缓慢摇动以使细胞完全溶解。完全溶剂外后，将该管全速(14,000 r.p.m.)离心15分钟。将取自各管的上清液转移至新的微型取出管。
然后对各管中的内容物进行蛋白质试验，如果药物抑制细胞的生长，对照组的总蛋白质量大于药物处理后的样品。显然，如果药物不起作用，药物处理样品中的总蛋白质量应该与对照组基本相同。在上述情况下，对照组和E-4021的微型取出管需要进行稀释，以使其与高剂量exisulind处理样品一样标准化(较低剂量exisulind样品也必须与高剂量exisulind处理样品一样标准化)。因此，在蛋白质试验之后，各种样品的蛋白质浓度必须是标准化的(例如通过稀释)。
如下文所述，对各种药物浓度和对照组进行两种PKG试验，一种加入cGMP，另一种不加。需要进行两种不同PKG试验的原因是cGMP可特异性低活化PKG。在用本发明新的PKG试验进行PKG活性试验时，人们不能确定PKG活性的任何提高是不是由于细胞中cGMP的增加(它可能是由于cGMP-特异性PDE抑制剂而引起的)，或者PKG活性水平提高是不是由于提高了PKG蛋白的表达。通过在同一样品中加或者不加cGMP，如果PKG活性有提高上，人们可以确定PKG活性的提高是由于PKG表达的提高。因此，如果相对于对照组，抗肿瘤药物提高了PKG活性，人们就可以确定在下述情况下药物处理组中药物诱导的提高是由于PKG蛋白表达的提高(与活化相反)：(1)与有外加cGMP的对照样品相比，有外加cGMP的药物处理样品显示出较高的PKG活性，和(2)相对于对照样品，没有外加cGMP的药物处理样品显示出较高的PKG活性。
然后，将加或者不加cGMP的平行样品进行比较，把50μL各种细胞溶解物加入上述20μL PDE5/GST固相基质的浆液中。对各个对照或药物细胞溶解液样品进行评价，在各混合物中加入含有10μL Ci32P-ATP溶液的磷酸化缓冲液(200μM  ATP，4.5mM MgCl；5mMKH2PO4；5mM K2HPO4；)使反应开始。得到的混合物在30℃孵化30分钟。然后将混合物离心分离出固相，弃去上清液。每管中的固体相用700μL冷的PBS洗涤。在固相中加入Lammli样品缓冲液(Bio-Rad)(30μL)。使混合物沸腾5分钟，并负载于7.5％SDS-PAGE。该凝胶在150V运行1小时。得到的数条带用commassie蓝染色，如果存在85 Kd GST-PDE5融合蛋白带，染色后可看到85 Kd GST-PDE5融合蛋白带。干燥凝胶，将凝胶放置于X-射线膜上，如果PDF5被磷酸化，则膜会显示出相对发暗的带状。各个带的暗度和磷酸化的程度有关。
如图8A和8B所示，SAAND exisulind引起PKG活性提高以剂量-依赖关系的方式表示，结果是将加或者不加cGMP的两种样品与加或者不加cGMP的对照样品进行比较而完成的。结果由各个药物处理样品中85 Kd的带更暗来证明。此外，试验中，用exisulind处理的，加了cGMP的SW480细胞样品比只用exisulind处理的(即不加cGMP)显示出更高的PKG磷酸化活性。因此，药物处理样品中PKG活性的提高不仅仅是由于PKG被细胞cGMP提高(当SAAND抑制cGMP特异性PDE时)而活化的，在肿瘤中隐藏的APC突变体之中，PKG活性的增加也是由于PKG表达是增加。
相对于对照样品而言，E4021处理的SW480样品没有显示出PKG活性(见图8A和8B)，上述事实说明在含有APC突变体的肿瘤中由SAANDs引起的PKG活性的提高不仅仅是因为典型的PDE5抑制作用。
作为评价PKG活性的分析技术，除了如上所述的X-射线膜暴露方法外，通过由凝胶上把带切割下来，也可以用SDS页的85 Kd带来评价磷酸化的程度，任何结合于移出的带上的32P都可以闪烁(beta)计数器在32P窗口计数。
为了对含有β-链蛋白突变体的肿瘤进行的cGMP-特异性PDE抑制作用进行试验，使用HCT 116结肠癌细胞。已知HCT 116含有β-链蛋白突变体，但不含有APC突变体。
使HCT 116细胞生长时采用与上述SW480相同的方法。在此试验中，只用exisulind和对照。Exisulind处理的细胞产生PKG，它比相应的对照组磷酸化的程度更高，这些说明在药物处理组中出现的PKG活性依赖于APC突变。
因此，为了达到本发明的目的，在权利要求书中我们所用的“减少β-链蛋白”是指野生型蛋白质和/或蛋白质的突变形式。
E.用蛋白质印迹法确认SW480细胞中PKG表达的增加和β-链蛋白的 减少
如上所述，SAANDs引起PKG表达的增加和cGMP水平的提高，两者都回造成SAANDs处理的肿瘤细胞中的PKG活性的提高。PKG蛋白表达的此种提高可由如上所述的蛋白质印迹法定量鉴定。
通过用PBS洗出由微型取出管中收获如上所述用exisulind处理的SW480细胞。该细胞在振动下用改性的RIPA缓冲液溶解15分钟。将细胞溶解物在冷的室内旋转。在旋转后立即把上清液转移至新的微型取出管中。进行BioRad DC蛋白试验(Temecula，CA)，以测定样品中的蛋白质浓度。如上所述对蛋白质浓度进行标准化。
将50μL的各种样品负载于10％SDS凝胶，进行SDS-PAGE。然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，有印迹的硝酸纤维素膜用新制备的，含有5％脱脂干牛奶的TBST阻断，在常规的振动下于室温进行1小时。
将羊的抗-初级抗体以含有5％脱脂干牛奶的TBST稀释至推荐的浓度。把硝酸纤维素膜放在初级抗体溶液中，并在振动下于室温孵化1小时。硝酸纤维素膜各自用TBST洗涤3次。硝酸纤维素膜在含有二级POD结合的兔抗-羊抗体于室温孵化1小时。硝酸纤维素膜各自用TBST洗涤3次，每次10分钟。用Boehringer Maunheim EM蓝POD基质测定。
如图9以图示说明，exisulind引起β-链蛋白滴和贫苦感到提高，这些数据由蛋白印迹法获得。将SW480细胞用exisulind或载体(0.1％DMSO)处理48小时。将50μL每种细胞溶解物负载于10％SDS凝胶，使硝酸纤维素膜产生印迹，将膜用兔子的β-链蛋白和兔子的抗PKG抗体探测。
F.在肿瘤细胞中SAANDs减少β-链蛋白水平
此观察按照下述方法进行：用200，400或600μM exisulind或载体(0.1％DMSO)培养SW480细胞。在处理后48小时收获细胞，并进行免疫印迹法测定。用免疫印迹法测定免疫活性蛋白。免疫印迹法分析说明与对照组相比，用exisutind处理的细胞其β-链蛋白表达减少了50％。这些结果指出β-链蛋白的减少是由于SAANDs处理引起的。将上述结果归纳起来说明这种处理使PKG活性提高，然后造成β-链蛋白被PKG磷酸化，这些结果表明肿瘤细胞中β-链蛋白的减少是由于PKG的活化引起的。因此，用肿瘤细胞中PKG的活性作为抗肿瘤剂化合物的筛选方法是很有用的。
G.β-链蛋白被PKG磷酸化
在体外PKG可使β-链蛋白磷酸化。按照下文所述“β-链蛋白免疫沉淀法”的方法，试验涉及SW480细胞(不用任何药物处理)中含有复合物的β-链蛋白的免疫沉淀。使复合物免疫沉淀，收集固体相(即珠串)，与32P-γ-ATP和纯的PKG(100单位)混合。相应的对照组不加PKG。
通过SDS缓冲液使蛋白质由固体相释放出来，含有蛋白质的混合物在7.5％SDS-page凝胶中反应，混合物在凝胶上的反应由混合物中移出了过量的32P-γ-ATP。因此，在93Kdβ-链蛋白带上测得的32P-γ-ATP都是由于β-链蛋白磷酸化得到的。相对于没有加入过量PKG的对照组，用过量PKG处理的93Kd β-链蛋白带上测得的32P-γ-ATP的任何增加都是由于过量PKG处理使β-链蛋白磷酸化而得到的。
应该注意到，所得到的结果是用PKG处理的带上比对照组磷酸化增加，事实上对照组的磷酸化最小，基本上测不出来。此结果说明β-链蛋白可以被PKG磷酸化。
H.β-链蛋白突变体被PKG磷酶化
用与上一部分所述相同的方法，用HCT116细胞进行试验，其中不含有APC突变体，但是含有β-链蛋白突变体。试验结果也说明突变的β-链蛋白可被PKG磷酸化。
因此，为了实现本发明的目的，在权利要求书所提到的β-链蛋白磷酸化是指野生型蛋白质和/或蛋白质的突变形式。
I.用PKG沉淀β-链蛋白
按与免疫印迹法相同的方法，制备SW480和HCT 116细胞溶解物的上清液。每500μg细胞溶解物中加入150μL蛋白质A琼脂糖珠浆液(50％)以使细胞溶解物预澄清，在管子的震荡器上于4℃孵化10分钟。通过在14,000xg，于4℃离心10分钟除去蛋白质A珠。把上清液转移至新的离心管中，在500μg细胞溶解物中加入10μg兔子的多克隆抗β-链蛋白抗体(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NewYork)。细胞溶解物/抗体混合物于4℃在震荡器上缓慢混合2小时。加入150μL蛋白质A琼脂糖珠浆液(75μl填充的珠)，以及管在震荡器上缓慢摇动，并于4℃过夜。通过离心收集琼脂糖珠(在微型离心器中以14,000rpm离心5秒)。放弃上清液，珠子用800μl冰冷却的PBS缓冲液洗涤3次。将琼脂糖珠悬浮于150μL 2倍样品缓冲液，缓慢混合。使琼脂糖珠沸腾5分钟，以便由琼脂糖珠中分离出免疫复合物。离心收集琼脂糖珠，用上清液进行SDS-PAGE。
用上清液进行蛋白质印迹测定，以兔子的抗蛋白质印迹作为探针对膜进行探测。然后将膜用TBST洗涤3次，每次10分钟，以除去过量的抗β-链蛋白抗体。加入与辣根过氧化物酶结合的羊，抗兔抗体，接着于室温孵化1小时。之后，可以看见带有HRPO基质的β-链蛋白的存在。在此试验中，可以清楚地看到β-链蛋白的存在。
在同一膜上测定PKG，用含有2％SDS和100mM 2β-巯基乙醇62mM tris-HCl缓冲液(pH7.6)，于55□C，在水浴中进行0.5小时，使β-链蛋白抗体的结合体首先在膜上形成条纹。条纹状的膜在TBST中用5％脱脂干牛奶阻断，反应于室温进行1小时，同时将膜振动。然后，用兔的多克隆抗PKG抗体(Calbiochern，LaJolla，CA)，对阻断的、条纹状的膜进行探测，该体由和URPO结合的羊的抗兔二级抗体检测。有印迹的膜上存在的PKG在HRPO基质中是可见的。在此试验中，事实上PKG是可见的。在膜上仅有的蛋白质是与细胞上清液中的β-链蛋白一起免疫沉淀的，结果清楚地表明PKG与含有细胞上清液中的β-链蛋白的蛋白质复合物以物理形式相连接上是类似的。
在用抗GSK3-β-抗体形成条纹之后，对同一免疫印迹膜进行探测，以确定其是否与β-链蛋白共沉淀。在该试验中，还检测了膜上的GSK3-β-抗体，指出了用GSK3-β和PKG沉淀的GSK3-β，说明三种蛋白质可能都是同一复合物的一部分。因为APC复合物的GSK3-β和β-链蛋白形式部分是正常细胞，因此PKG可能是同一复合物的一部分，并且可能与作为复合物一部分的β-链蛋白的磷酸化有关。
II.利用本发明筛选药用组合物
A.概述
JNK与PGK结合或PDE2s与或不与PDE5结合用来鉴定可用于治疗或预防肿瘤而又没有各种副作用的化合物。
癌或前期癌被认为是涉及不正常细胞生长的疾病。细胞生长涉及各种不同的因素。一个因素是细胞是怎样快速增殖的，另一个因素则涉及细胞是怎样快速死亡的。依环境刺激类型的不同，细胞的死亡可以是通过坏死，也可以是通过编程性细胞死亡。细胞分化也是影响肿瘤增长动力学的另一个因素。弄清由一个化合物所影响的细胞增长的各个方面，对于发现药物治疗的有关目标是重要的。基于这种方法学的筛选试验可与其他试验结合，以便选择具有增长抑制作用或前编程性细胞活性的化合物。
本发明基于以下这样的发现，即对肿瘤细胞增长所希望的抑制剂，通过编程性细胞死亡诱导癌细胞的提前死亡(参阅Piazza，G.A.，etal.，Cancer Research， 55(14)，3110-16，1995)。此外，我们还意外地发现，某些化合物选择性地诱导编程性细胞死亡而无持续的COX抑制作用，它们也抑制PDE5/2。特别是，与引导科学研究相反，治疗肿瘤疾病所希望的化合物抑制PDE5(EC3.1.4.17)。PDE5至少是10个磷酸二酯酶基因谱系中的一个。PDE5和本发明新的PDE在以下方面是独特的，即它们选择性地降解环GMP，而不选择性地降解环cAMP，而PDE的其他谱系选择性地降解或水解环cAMP，而不选择性地降解环cGMP，或不选择性地降解环cGMP和cAMP。
B.JNK筛选
如上说明，利用上面描述的方法能够对化合物活化在肿瘤细胞中JNK的能力进行评价。
C.PKG筛选
有一种新的试验用来评价PGK的活性，它也用于本发明的筛选方法中。为说明其见，在说明PGK活性如何能用于药物评价以确定某化合物是否可潜在地用于肿瘤治疗以前，首先描述PGK试验是有益的。
新的PGK试验涉及结合到固相复合氨基酸序列，每一个这样的序列至今包含有cGMP结合的结构域和磷酸二酯酶型5(PDE5)的磷酸化位点。这个序列是已知的，并在下面的文献中作了描述。如下述，结合的PDE5序列并不包括PDE5的催化结构域。PDE5序列结合到固相的一种方法，是把这些序列表达为PDE5序列的融合蛋白和氨基酸结合对的一肢，氨基酸结合对的另一肢化学键合到固相上(如球)。可以使用的一个结合对是谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)，如上所述，GST与PDE5序列一起被表达融合蛋白，而GST以共价键的形式结合到固相上。如下所述，在这个方法中，PDE5序列/GST融合蛋白可由包含该融合蛋白的溶液在固相上通过的方法结合到固相上。
用RT-PCR方法来获得由牛的PDE5A cDNA序列(McAllister-Lucas L.M.et al，J，Biol.Chem.268，22863-22873，1993)设计的具有正向引物和逆向引物的PDE5的cGB结构域，并在PDE1-10系谱中选择。5’-3’公司的总RNA试剂盒，通过mRNA的微动(dT)柱纯化后同HTt-29细胞一起使用。正向引物(GAA-TTC-TGT-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G，203-227)和逆向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG，1664-1686)被用来合成磷酸化位点的以及人的PDE5A(203-1686bp，cGB-PDE5)低和高亲合力cGMP结合位点的1484bp片断编码。合成的cGB-PDE5核苷肽片断编码成同牛的PDE5A有97％相似性的494氨基酸。而后将其克隆到具有tac启动子的pGEX-5X-3谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合载体(Pharmacia Biotech)上以及EcoRI和XhoI半裂位点上。将这种融合载体转移到E.Coli BL21(DE3)菌(Invitrogen)上。转移的BL21菌生长到对数期，而后将IPDG作为诱导剂加入。使诱导作用在20℃进行24小时。收集该菌并溶解。可溶性的细胞溶胞产物用GSH接合的琼脂糖4B(GSH-琼脂糖4B)孵化。GST-cGB-PDE5融合蛋白可结合到GSH-琼脂糖球上，其他的蛋白用过量的冷PBS从琼脂糖球上洗掉。
表达的GST-cGB-PDE5融合蛋白作为85Kd蛋白显示在7.5％SDS-PAGE凝胶上。它以cGMP结合和由蛋白激酶G和A磷酸化为特征。它有两个cGMP结合点，Kd是1.6±0.2μM，这接近于土著牛PDE5的Kd＝1.3μM。GSH接合的琼脂糖球上的GST-cGB-PDE5可由cGMP依赖蛋白激酶和cAPM依赖蛋白激酶A在体外磷酸化。由PKG对GST-cGB-PDE5磷酸化的Km是2.7μM，Vmax是2.8μM，而BPDE肽磷酸化的Km是68μM。由PKG的磷酸化显示有按1∶1的比率并合到GST-cGB-PDE5蛋白上的分子磷酸盐。
液体样品用上述PDE5结合的固相，确定其含有PKG，为了对此液体样品进行检测，使同一样品和固相与含有32P-γ-ATP的磷酸缓冲液混合。该溶液于30℃孵化30分钟，如果存在PKG，可通过PKG使PDE5序列磷酸化。然后由溶液中分离固相(例如通过离心或过滤)，并用磷酸盐缓冲液盐水(“PBS”)洗涤。以除去任何残留的溶液，以及除去没有反应的32P-γ-ATP。
将固相直接进行试验(例如通过液体闪烁计数器)，以确定32P是否已经结合。如果已经结合，这说明含有PKG的样品中的PKG使PDE5磷酸化。如果如上所述，PDE5通过融合蛋白质结合，含有融合蛋白质的PDE5可由固相中用SDS缓冲液洗出来，然后用洗出液进行32P结合试验。此方法特别的优点是，在可能存在其它蛋白质的情况下，因为可以将洗出液加工(例如凝胶分离)，以便将各种蛋白质相互分离，这样就可以对融合蛋白质部分进行32P结合试验。磷酸化的融合蛋白质可由固相中用SDS缓冲液洗出，并可进一步地用电泳分离。如果进行凝胶分离，可以进行蛋白质的染色以便看到蛋白质的位置，以及融合蛋白的PDE5蛋白被PKG进行的32P磷酸化可以通过X-射线膜与凝胶的结肠检测。如果32P在X-射线膜上是可见的，这说明在含有PKG的原始样品中存在着PKG，它使由固相洗出的融合蛋白中的PDE5部分磷酸化。
在试验中，优选在缓冲液中加入过量(例如100倍)的蛋白酶抑制剂(“RKT”)，它可以特异性的，有效的抑制蛋白激酶A(“PKA”)，而不会抑制PKG。抑制PKA的需要的，因为它可能造成PKG基质(例如PDE5)的磷酸化。通过加入PKI，可以消除PKA的磷酸化，任何可检出的磷酸化与单独存在PKG的情况高度相似。
可以制备成PKG试验用的药盒，该药盒包括预装在各自分开的容器中的下述药剂：
1、细胞溶解缓冲液：50mM Tris-HCl，1％NP-40，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF，500μM IBMX，蛋白酶抑制剂。
2、蛋白激酶C固相基质：重组体GST-cGB-PDE5结合的琼脂糖凝胶4B(50％浆液)。
3、2X磷酸缓冲液：32P-γ-ATP(300 mCi/mmol，5～10μCi/试验)，10mM KH2PO4，10mM K2HPO4，200μM ATP，5mM MgCl2。
4、PKA蛋白激酶抑制剂。
进行上述反应所需要的一次性使用的容器也可以装在药盒中。
分析领域技术人员由上述内容可以很容易地想象出适合于上述试验的各种变化形式。简言之，用标记的磷酸化试剂，至少使用一部分PDE5(或任何其它可被PKG选择地磷酸化的蛋白质)，通过评价可磷酸化的蛋白质的磷酸化可以确定，存在PKG和有相对量(与对照组比较)的PKG。
D.COX筛选
本发明的一种优选的实施方式涉及测定给定化合物对环氧化酶的抑制活性，涉及测定化合物对cGMP PDE的抑制活性。通过把这些化合物与已知的可用于治疗肿瘤组织的化合物比较而评估它们直接或间接地治疗肿瘤组织的能力。已知一种能有效地治疗肿瘤组织而引起胃过敏的标准化合物是5-氟-2-甲基-1-(对甲基磺酰基苯亚甲基)-3-茚基乙酸(“exisulind”)。其它可用于比较目的的化合物包括已知的能抑制COX的化合物，例如吲哚美辛和苏林大的硫化物代谢物：5-氟-2-甲基-1-(对甲基亚磺酰基苯亚甲基)-3-茚基乙酸(“硫化sulindac”)。其它可用于比较目的的化合物包括已知的能抑制cGMP-特异性PDEs的化合物，例如1-(3-氯苯胺基)-4-苯基-2，3-二氮杂萘(“MY5445”)。
这里所用的术语“能发展成肿瘤的组织”包括非正常肿瘤所代表的综合症包括发育不良、组织的变化。例如结肠、乳腺、前列腺或肺组织的恶性生长或者病变例如恶性神经综合症、皮肤恶性黑素瘤前体，除恶性神经综合症之外，这样的例子还包括多孔性综合症、结肠polyps、颈部癌前组织(即颈部恶性肿瘤)、食道癌前组织、肺部癌前组织、前列腺恶性肿瘤、前列腺内新生肿瘤、乳腺和/或皮肤及相关组织病变(例如光化角化病)，不论肿瘤能否在临床上分辨出来。
这里所用的术语“肿瘤”或“癌症”是指肿瘤组织。例子包括恶性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌。这里所用的术语“新生肿瘤”和“新瘤”都是指癌组织和癌前组织。
这里所用的缩写PG代表前列腺素；PS代表前列腺素合成酶；PGE2代表前列腺素E2；PDE代表磷酸二酯酶；COX代表环氧化酶；环状核苷酸，RIA代表放射免疫试验。
由化合物引起的COX抑制可以通过两种方法测定。一种方法涉及暴露于被筛选化合物后测定完整的HL-60细胞的PGE2分泌。另一种方法涉及在化合物存在下测定纯化的环氧化酶(COXs)的活性。两种方法都涉及文献中以前描述的程序，但是下面提出优选的程序。
通过测定PGE2可以评价化合物能否抑制前列腺素E2(“PGE2”)。使用PGE2酶免疫试验(EIA)试剂盒例如从Amersham，ArlingtonHeights，IL USA购买。合适的细胞包括能制造大量PG的细胞，例如HL-60细胞。HL-60细胞是人类前髓细胞，用DMSO可把它分化成成熟的粒细胞(参见Collins，S.J.，Ruscetti，F.W.，Gallagher，R.E.andGallo，R.C.，“Normal Functional Characteristics of Cultured HumanPromyelocytic Leukemia Cells(HL-60)After Induction of differentiationBy Dimethylsulfoxide”，J.Exp.Med.， 149：969-974，1979)。在用钙离子团A23187激发后，这些分化的细胞能生产PGE2(参见Kargman，S.，Prasit，P.and Evans，J.F.，“Translocation of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase”，J.Biol.Chem.， 266：23745-23752，1991)。HL-60可从ATCC(ATCC：CCL240得到)。它们可以在添加有20％热去活的小牛血清、50U/mL的青霉素和50μg/ml的链霉素的RPMI 1640培养基中在含5％CO2的大气中在37℃生长。为了诱导骨髓细胞分化，让细胞接触DMSO 9天，然后洗涤，悬浮于浓度为3×106细胞/ml的Dulbecco磷酸缓冲的盐水中。
在37℃下在所要浓度的试验化合物存在下，培养分化的HL-60细胞(3×106)15分钟。然后用A23187(5×10-6M)激发细胞15分钟。按照下述方法测定分泌到外部培养基中的PGE2。
如上所述，评估化合物抑制COX的第二种方法就是要在试验化合物的存在下测定COX的活性。文献中已经报道了用于调节前列腺素合成的两种不同形式的环氧化酶(COX-1和COX-2)。COX-2代表COX的可诱导形式而COX-1代表COX的结构形式。使用从Boopathy&Balasubramanian在“Purification And Characterization Of SheepPlatelet Cyclooxygenase”(Biochem.J.， 239：371-377，1988，在此通过参考文献引入)中描述的随机半载体纯化得到的COX-1，按照Mitchell等人描述的方法可以测定COX-1的活性(“Selectivity of NonsteroidalAntiinflammatory Drugs as Inhibitors of Constitutive and InducibleCyclooxygenase，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.， 90：11693-11697，1993，在此通过参考文献引入)。COX-2的活性可以使用从绵羊胎盘纯化得到的COX-2按照Mitchell等人于1993在上述期刊中描述的方法测定。
药物对环氧化酶的抑制活性可以按照本领域已知的方法测定，例如Boopathy&Balasubramanian于1988在上述期刊中描述了已知方法，其中在37℃把前列腺素H合成酶1(Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan)与100μM花生四烯酸(Sigma Chemical Co.)、辅因子(例如1.0mM谷胱甘肽、1.0mM氢醌、0.625μM血红蛋白和1.25mM CaCl2的100mM Tris-HCl，pH7.4溶液)和试验药物一起培养20分钟。培养后，用三氯乙酸终止反应。在通过加入硫代巴比妥酸和丙二醛停止反应后，在530nm处通过测定光度来测定酶活性。
显然，相对于那些具有更大的综合PDE5/新的PDE/PDE2抑制活性的化合物，具有更低COX-1或COX-2抑制活性得到化合物或许是所要的化合物。
通过比较在有或没有试验化合物存在下环氧化酶的活性，可以确定COX的抑制量。在大约100μM浓度下残留的活性(即少于大约25％)或没有COX抑制活性表明，应当进一步评价化合物治疗肿瘤的用途。
E.确定磷酸二酯酶的抑制活性
使用按照上述方法分离的重组酶或者使用新的PDE和/或PDE2和PDE5，可以筛选化合物对本发明的新的磷酸二酯酶活性的抑制作用。另外，通过RIA并且与未经处理的和用zaprinast处理的细胞比较，测定了完整细胞中环状核苷酸的水平。
可以使用本领域已知的方法测定磷酸二酯酶的活性，例如使用放射活性的3H环状GMP(cGMP)(环3’，5’-鸟苷单磷酸酯)作为PDE酶的底物的一种方法(Thompson，W.J.，Teraski，W.L.，Epstein，P.M.，Strada，S.J.，Advances in Cyclic Nucleotide Research， 10：69-92，1979，在此通过参考文献引入)。简单地说，把具有确定的底物3H-cGMP特异性活性的溶液(0.2μM，100,000cpm，含有40mM Tris-HCl(pH8.0)，5mMMgCl2和1mg/mL BSA)与试验药物按照400μl的总体积混合。在30℃把混合物与本发明分离出的PDE一起温育10分钟。终止反应，例如通过煮沸反应混合物75秒来终止反应。在冰上冷却后，加入100μl0.5mg/ml蛇毒(O.Hannah蛇毒从Sigma得到)，在30℃温育10分钟。然后通过加入醇例如1ml 100％的甲醇来终止该反应。把试验样品放在1mL的Dowex 1-X8柱上纯化，用1mL 100％甲醇洗涤。合并柱子馏出液和洗涤液，用闪烁计数器测定放射活性的数量。通过计算经过药物处理的反应液中放射活性的数量并且与对照样品(不含有试验化合物但含有药物溶剂的反应混合物)比较，确定磷酸二酯酶的抑制度。
另外，所要化合物抑制本发明磷酸二酯酶的能力反映在暴露于所筛选化合物的肿瘤细胞中cGMP的增加上。PDE的活化度可以通过测定用放射免疫试验(RIA)处理的细胞萃取液中环GMP的数量而确定。在该方法中，把HT-29或SW-480细胞置于培养板中并生长到融合。如上所述，SW-480同时含有PDE5和PDE2s，因此，当以这种方式评价PDE活性时，也就同时分析了总的cGMP的水解活性。然后把试验化合物与细胞培养基一起在大约200μM-200pM的化合物浓度下培养。大约24-48小时以后，从细胞中除去培养基，并且把细胞溶解。用0.2N HCl/50％MeOH停止反应。取出样品进行蛋白质分析。使用阴离子交换色谱例如Dowex柱从细胞的酸/醇萃取液中纯化环GMP。干燥环cGMP，按照公开的方法，例如使用乙酸酐的三乙胺溶液进行乙酰化(Steiner，A.L.，Parker，C.W.，kipnis，D.M.，J.Biol.Chem.，247(4)：1106-13，1971，在此通过参考文献引入)。使用放射免疫分析方法(Harper，J.，Brooker，G.，Advances in Nucleotide Research， 10：1-33，1979，在此通过参考文献引入)定量测定乙酰化的cGMP。把从环GMP衍生得到的碘代配体(酪氨酸甲基酯)与标准或未知化合物在抗血清和适当的缓冲液存在下一起培养。抗血清可以使用环状核苷酸-半抗原定向技术来生产。抗血清从注射了丁二酰基-cGMP-白蛋白结合物的绵羊得到，并且稀释到1/20,000。按照前人描述的方法(Seibert，A.F.，Thompson，W.J.，Taylor，A.，Wilbourn，W.H.，Barnard，J.and Haynes，J.，J.Applied Physiol.， 72：389-395，1992，在此通过参考文献引入)，从标准曲线进行剂量内推和误差分析。
另外，可以把培养基酸化、冷冻(-70℃)，也可以进行cGMP和cAMP分析。
除了观察由所要化合物引起的肿瘤细胞中cGMP含量的增加外，还观察了cAMP含量的减少。发现，具体的所要化合物(即能选择性地引起肿瘤细胞编程性细胞死亡但是基本上不会引起正常细胞编程性细胞死亡)遵守与cGMP-特异性PDE抑制一致的时间进度，如同在几分钟内引起cGMP含量增加的初始作用一样。其次，用所要的抗肿瘤化合物治疗肿瘤细胞导致24小时内cAMP含量的减少。进一步研究了药物作用的胞内目标，但是现有的数据支持这样的概念：cGMP含量的初始增加和后来cAMP含量的降低导致了暴露于所要化合物的肿瘤细胞的编程性细胞死亡。
与仅仅测定cGMP的绝对值、仅仅测定cGMP-特异性磷酸二酯酶的抑制活性或者仅仅测定cGMP的水解的水平相比，测定两种环核苷酸比例的变化或许是一个评价所要的试验化合物对cGMP-特异性磷酸二酯酶的抑制活性的一个更为准确的工具。在没有用抗肿瘤化合物处理的肿瘤细胞中，cGMP含量/cAMP含量的比率在0.03-0.05的范围内(即300-500fmol/mg蛋白质的cGMP含量对6000-8000fmol/mg蛋白质的cAMP含量)。暴露于所要的抗肿瘤化合物后，由于cGMP含量的初始增加和后来cAMP含量的降低，该比率增大了好几倍(优选至少增大3倍)。
特别地，已经观察到：具体的所要化合物引起了接受处理的肿瘤细胞中cGMP含量的初始增加，使得cGMP的水平高于大约500fmol/mg蛋白质。另外，具体的所要化合物引起了接受处理的肿瘤细胞中cAMP含量的降低到低于大约4000fmol/mg蛋白质。
为了测定环AMP的含量，使用了与上述测定cGMP水平相似的放射免疫技术。基本上按照文献方法，使用阴离子交换色谱从细胞的酸/醇萃取液把环核苷酸纯化，干燥，乙酰化，并且使用放射免疫分析方法定量测定。把从环AMP和环GMP衍生得到的碘代配体与标准或未知化合物一起在特异性抗血清和适当的缓冲液存在下培养。
通过测定完整的细胞中环核苷酸的转变或积累，可以核实环核苷酸的含量。为了测定完整细胞的cAMP，按照文献的方法(Whalin，M.E.，Garrett Jr.，R.L.，Thompson，W.J.，and Strada，S.J.“Correlationof cell-free brain cyclic nucleotide phosphodiesterase activities to cyclicAMP decay in intact brain slices”，Sec.Mess.and Phos.ProteinResearch， 12：311-325，1989，在此通过参考文献引入)预先进行3H-腺嘌呤标记。该方法测定标记的ATP转变为环AMP，根据特定的程序，可用于估测完整细胞的腺苷酸环化酶或环核苷酸磷酸二酯酶的活性。环GMP积累太低，不能按照文献方法通过对完整细胞进行预先标记来进行研究(Reynolds，P.E.，S.J.Strada and W.J.Thompson，“CyclicGMP Accumulation In Pulmonary Microvascular Endothelial CellsMeasured By Intact Cell Prelabeling，”Life Sci.， 60：909-918，1997，在此通过参考文献引入)。
也可以从组织样品测定化合物对PDE活性的抑制作用。从暴露于试验化合物的主体采集人的组织活切片或者麻醉动物的组织。简要地说，在500μl 6％的TCA中均化组织样品。取出已知量的匀浆进行蛋白质分析。把剩余的匀浆坐在冰上20分钟，使蛋白质沉淀。其次，在15,000g和4℃下离心匀浆30分钟。回收上清液，回收小丸。用5倍体积的饱含水的乙醚洗涤上面的乙醚层4次。在每次洗涤中，扔弃上面的乙醚层。快速真空干燥含水的乙醚萃取液，干燥后，可以把样品冷冻以备将来使用或立刻使用。把干燥的萃取液溶于500μl分析缓冲液中。通过使用上述的RIA方法分析环核苷酸的数量来测定cGMP-特异性抑制的数量。
通过比较在有或没有化合物存在的情况下PDE的活性来确定抑制的数量。对上述cGMP PDEs的抑制表明，本发明的化合物可用于治疗肿瘤。与benchmark、exisulid相比，本发明的化合物具有显著的更大的抑制活性，尤其是在10μM或更低的浓度下，具有大于50％的抑制活性，这表明，应当进一步评价化合物的抗肿瘤性能。优选地，对于进一步考虑可能使用的化合物来说，针对新的PDE抑制的IC50值应当低于50μM。
F.测定化合物是否减少了肿瘤细胞的生长
在另一种实施方式，本发明的方法还涉及测定化合物是否减少了肿瘤细胞的生长。根据试验组织的不同，可以在样品中使用各种细胞系。例如，这些细胞系包括：SW-480-结肠腺癌、HT-29-结肠腺癌、A-27-肺腺癌、MCF-27乳腺癌、UACC-375黑素瘤和DU145-前列腺癌。使用这些细胞系得到的细胞毒性数据表明，对肿瘤组织具有抑制作用。这些细胞系已经被很好地表征，并且被美国国家癌症研究所在他们的筛选项目中用作新的抗癌药物。
化合物抑制肿瘤细胞生长的能力可以用从ATCC得到的HT-29人结肠癌细胞系测定。前人已经把HT-29细胞表征为相关的结肠肿瘤细胞培养基模型(Fogh，J.，and Trempe，G.，Human Tumor Cells inVitro，J.Fogh(eds.)，Plenum Press，New York，pp.115-159，1975)。把HT-29细胞放在添加有5％小牛血清(Gemini Bioproducts，Inc.，Carlsbad，CA)和2mm谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌素的培养基中，在37℃下在含有95％空气和5％CO2的潮湿的大气中培养。简单地说，以500个细胞/孔的密度把HT-29细胞放在96孔微量滴定板中，并且在37℃培养24小时，然后加入化合物。每次测定细胞数目都重复6次。细胞在培养基中放置6天后，通过加入冷的三氯乙酸到最终浓度为10％而固定细胞，按照前人Skehan，P.，Storeng，R.，Scudiero，D.，Monks，A.，McMahon，J.，Vistica，D.，Warren，J.T.，Bokesch，H.Kenney，S.，和Boyd，M.R.，在“New Colorimetric Assay For Anticancer-DrugScreening，”J.Natl.Cancer Inst. 82：1107-1112，1990中描述的方法(在此通过参考文献引入)，使用磺基罗丹明B(SRB)进行蛋白质种比色分析。
除了SRB分析法之外，可以使用许多其它方法来测定生长抑制，并且可以替代SRB分析法。这些方法包括在用锥虫兰染色后计数活的细胞，用BrdU或放射性标记的胸苷标记能进行DNA合成的细胞，用中性红给活细胞染色，或者用MTT给活细胞染色。
100μM或以下剂量的化合物能显著地抑制大约50％以上的肿瘤细胞的生长，这进一步表明这些化合物可用于治疗肿瘤。优选地，确定IC50值，该值可用于比较。这个值是：与对照相比，抑制50％的肿瘤细胞生长所需要的药物浓度。优选地，对于考虑进一步可能用于治疗肿瘤的化合物，其IC50值应当小于100μM。
G.确定化合物是否引起编程性细胞死亡
在另外一种实施方式中，本发明的筛选方法还涉及确定化合物是否引起了培养基中肿瘤细胞的编程性细胞死亡。
可以用形态和生化标准来描述两种不同形式的细胞死亡：坏死和编程性细胞死亡。坏死伴随着原生质膜渗透性的增大、细胞膨胀和原生质膜在几分钟之内破裂。编程性细胞死亡的特征在于膜起疱、细胞质浓缩和内源性核酸内切酶的活化。
自然编程性细胞死亡发生在正常组织更新和器官及肢体的胚胎发育期间。编程性细胞死亡还由对细胞有毒的T-淋巴细胞和天然的细胞杀手、电离辐射和某些化疗药物引起。对编程性细胞死亡的不当调控被认为在包括癌症、艾滋病或早老性痴呆症等在内的多种病理中起着重要作用。使用上述条件下培养肿瘤细胞的培养基可以筛选出用于诱导编程性细胞死亡的化合物。用试验化合物处理细胞涉及融合前或融合后的培养以及在各种浓度下处理2-7天。在培养基的黏附的和“飘浮”的隔室中测定编程性细胞死亡的细胞。通过除去上清液、用胰蛋白酶作用于黏附的细胞，并且在离心洗涤步骤(10分钟，2000rpm)之后合并两种制备液。文献中已经描述了用sulindac和相关化合物处理肿瘤细胞培养液的方法(参见Piazza，G.A.，等人，Cancer Research，55：3110-16，1995，在此通过参考文献引入)。新的特征包括收集飘浮的和黏附的细胞，鉴定出观察编程性细胞死亡的最佳处理次数和剂量范围，并且鉴定出最佳的细胞培养条件。
在用化合物处理之后，可以在用吖啶橙和溴锭标记后通过荧光显微分析培养物的编程性细胞死亡。测定编程性细胞死亡的细胞数目的方法已经被前人Duke&Cohen在“Morphological And BiochemicalAssays Of Apoptosis，”Current Protocols In Immunology，Coligan etal.，eds.，3.17.1-3.17.16，1992中描述过，在此通过参考文献引入。
例如，漂浮和附着细胞可通过胰蛋白酶消化和在PBS中洗涤三次来收集。对细胞的等分试样进行离心。而后将沉淀重新悬浮在介质中，包含有吖啶橙和溴化乙锭的染料混合物在PBS制备并慢慢混合。将该混合物放置在显微镜的载玻片上，考察编程性细胞死亡的形态特征。
编程性细胞死亡还可通过测定用实验化合物已经处理过的细胞中DNA断裂的增加来定量化。市场上用于定量的光度EIA，在体外测定胞质组蛋白联结的DNA片断(单和寡核粒)是可能的(Cell DeathDetection  ELISAOKYS，Cat.No.1,774,425，Boehringer Mannheim)。Boehringer Mannheim试验是基于多层酶的免疫测定原则，分别利用抗DNA和组蛋白的小鼠单克隆抗体。这就能具体测定细胞溶胞产物的胞质部分中的单和寡核粒。
按照卖主的指示，由下面的方法测定编程性细胞死亡。样品(细胞的溶胞产物)被放置在链霉抗生物素涂抹的微量滴定板(MTP)上。接着加入抗组蛋白生物素和抗DNA过氧化酶偶联物的混合物，并孵化两小时。在孵化期间，抗组蛋白的抗体结合到该核粒的组蛋白组分上，同时通过生物素化，免疫复合物固定在链霉抗生物素涂抹的微量滴定板(MTP)上。另外，抗DNA过氧化酶抗体同核粒的DNA组分反应。通过洗涤除去未结合的抗体后，核粒的量由在免疫复合物中阻留的过氧化酶来定量化。过氧化酶用ABTS7(2，2’-叠氮基-[3-乙基苯基噻唑啉磺酸酯])作为培养基进行光度法测定。
例如，将SW-480结肠腺癌细胞，以每孔10,000细胞的密度放置在96孔MTP上。而后用试验化合物处理这些细胞，并使其在37℃孵化48小时。在孵化后，离心MTP，排除上清液。将每个孔中的细胞沉淀转移到溶胞缓冲液中30分钟。离心溶胞产物，将上清液的等分试样(胞质部分)转移到链霉抗生物素涂抹的MTP。注意不要振动在MTP上溶解的沉淀(即包含高分子量的细胞核，未断裂的DNA)。而后对样品进行分析。
折叠刺激(FS＝ODmax/ODveh)，一种编程性细胞响应的指标，在一定的浓度对每个试验化合物都进行测定。EC50值也可通过评价一系列试验化合物的浓度来测定。
编程性细胞死亡在统计上显著增加(即在100μM浓度大于2折叠刺激)是该化合物可用来治疗瘤形成病灶的进一步指示。编程性细胞活性的EC50值，对进一步考虑作为潜在用于治疗瘤形成病灶的化合物，应低于100μM。EC50在这里被定义为相对于赋形剂处理引起50％编程性细胞死亡诱导的浓度。
H.乳腺器官培养模型试验
由上面的方法鉴定的试验化合物，可由它们抑制在乳腺器官培养系统中预肿瘤病灶发病率的能力用来试验抗肿瘤活性。这种小鼠乳腺器官培养技术已由其他研究者，为研究已有抗癌剂，如某些NSAIDs、视黄酸、三苯氧胺、硒和某些天然产品的影响而成功使用，它可用来证实本发明所筛选的方法。
例如，雌性BALB/c小鼠可每天用雌二醇和孕酮结合处理，以便在体外使乳腺对激素产生响应。把这些动物杀死，无菌切开胸乳腺，在补充有胰岛素、催乳激素、氢化可的松和醛甾酮的增长介质中孵化10天。将DMBA(7，12-二甲基苯并蒽)加入到介质中，以诱导癌前期病灶的形成。最后使增大的乳腺脱离催乳激素、氢化可的松和醛甾酮，导致乳腺的退化，但并无癌前期病灶。
将试验化合物溶解在DMSO中，并在全程培养期加入到培养介质中。在培养期终了，将乳腺放在10％的富马啉中，用明矾洋红染色，放置在玻片上。形成乳腺病灶的发生率是具有乳腺病灶的腺体同无病灶腺体的比率。试验化合物处理的腺体乳腺病灶的发生率与未处理的腺体病灶的发生率是可相比较的。
乳腺病灶所占据的区域范围可通过把腺体象投影在指状突垫上来定量化。由腺体覆盖的区域被扫描在垫上，看作是区域的100％。由每个非退化的结构覆盖的区域也描绘在指状突垫上，由计算机进行定量分析。
III.包含cGMP PED抑制剂/JNK1活化剂化合物的抗肿瘤药用组合物
如上所述，exisulind是一种具有所希望的抗肿瘤性能的化合物。在人们认识到该化合物通过抑制cGMP特异性PED活性和活化肿瘤细胞中的JNKI而起作用的以前，就发现了它可用作抗肿瘤剂及其效能。
其中，本发明选用的方法在患者的人体肿瘤疾病的临床试验中，可用于选择治疗人体疾病的化合物的鉴定。可以理解的是，就exisulind可作为抗肿瘤剂(体外)而言，能够满足本发明选择标准理想化合物的方法，所述化合物在两种人体临床试验中是成功的，由此确定它也可以用来选择能够满足本发明选择标准的其他化合物。
如上文所指出的，一些肿瘤形成中存在APC突变。其中，通过在患者中进行的的人体肿瘤疾病的临床试验，可以在肿瘤中存在APC突变确定本发明的选用方法。
在有遗传性肿瘤的患者中首次发现了腺瘤结肠息肉病APC[adenomatous polyposis coli(“APC”)]突变。APC疾病是以在十年里在结肠中出现成百至成千的息肉为特征，通常的治疗方法是在20岁之前手术切除结肠。
第一种临床试验包括给患有APC疾病的患者施用exisulind。在此研究中每个患者(他/她)已经切除了结肠，只是保留了与直肠相邻的一小部分结肠(与小肠连接的部分)，以维持直肠的功能。但是，这些患者通常回在保留的一小部分结肠中形成息肉，这些息肉需要定期切除(例如，通过electrocautery)。
在该试验中，选择exisulind进行预防试验以评价药物的抗肿瘤特性，评价是将药物组和安慰剂组在十二个月内形成新的息肉的累计数目进行比较而进行的。合适的患者是每年形成9-44个息肉的患者。在可是试验前，在6个月结束时和在12个月结束时，需要将患者进行完全清除(将所有的息肉除去)。该项研究征用了四分之三的患者。以APC患者在一年中形成的息肉的平均数为基础，这些患者有每年产生9-44个息肉的病史，将exisulind用于临床，在息肉形成速率减少方面其统计学意义显然高于安慰剂组。以研究的前6个月产生的息肉的中值为基础，用exisulind治疗的患者所产生的息肉数目是安慰剂组的三分之一左右(其着值分别是9个息肉/年，和26个息肉/年，p＝0.013)。以整个研究的12个月产生的息肉的中值为基础，用exisulind治疗的患者所产生的息肉数目是安慰剂组的一半左右(其着值分别是18个息肉/年，和38个息肉/年，p＝0.020)。
对前列腺癌男性患者还进行了独立的临床试验，其结果他们的前列腺被切除了。还对前列腺完全切除后可检测的PSA(前列腺特有抗原)水平上升的患者进行了这种研究，表明前列腺癌复发了。
96位患者被登记进行前列腺癌评价：双盲、安慰剂对照、多中心试验涉及把exisulind以500mg/天给予受药患者。如下所述，试验数据表明，exisulind处理组与安慰剂处理组之间的PSA水平在统计上有明显的差异。exisulind处理组的PSA水平与安慰剂处理组的PSA水平相比明显下降。虽然PSA水平上升本身并不是疾病状态，但在医学界被广泛认为是这些病人的前列腺癌存在复发的替代性指标。
除了在总体上根据exisulind组和安慰剂组男性PSA水平的差异进行评价外，还进行了阶段分析，包括亚组分析。将研究的患者依照其产生癌转移的危险性分成高、中、低危险组。这种分类是利用Journalof American Medical Association(JAMA May 5，1999，pp.1591-97)中发表的方法进行的。为确定那些受试患者分在那个危险组，将病史提供给研究人员，而他并不知道哪些病人是用药的，哪些病人是用安慰剂的；他按照上述可参考的公开的方法，将受试患者标记为适当的危险组。统计分析表明，在高和中危险组中，exisulind组和安慰剂组患者的平均PSA水平，在统计上有明显的差异。
由前列腺研究的数据如下：
                        表1
              前列腺切除后PSA升高的男性中
              exisulind对平均PSA水平的影响
    分组     安慰剂    exisulind     “p”值
    总计     4.49    2.85     0.0004
    高危险组     4.98    2.91     0.0002
    中危险组     6.24    2.95     0.0053
在这些exisulind试验和涉及该药其它指标的某些另外的试验中，通过监测副作用(AEs)、临床实验室实验(血浆学、血清化学、尿分析)、生命信号(血压、脉率、呼吸率、体温和体重)、体力考察和上内窥镜对安全进行了评价。
到目前对超过400个患者用exisulind进行的临床试验中，已证明没有明显的安全问题。exisulind并不显示任何血液性的体液不调、剂量限制性呕吐或与常规化学治疗相关的神经毒性或肾毒性。它也并不引起任何生命信号的临床重要变化。事实上，在APC病人的息肉和正常结肠组织的成对活性组织检查中，已经发现，exisulind增加息肉的编程性细胞死亡速率，而在正常结肠组织中并不增加，这说明对正常组织的影响小。
在最大允许剂量(MDT＝600mg，亚整体结肠切除的病人；400mg，具有完整结肠的病人；350mg，儿科病人)以上的剂量下，所发现的唯一的剂量限制副作用是治疗初期看到的肝功(LFTs)上升。实验时LFT升高迅速逆转，剂量降下时也不再重复。其它副作用(如偶尔的腹痛)一般持续的时间很短，也相当温和，因而没有必要终止给药或降低剂量。
简言之，这些试验表明，exisulind是一种对瘤形成临床控制有效的、耐性好的慢性治疗方法。这些结果说明，选择特别抑制cGMP特异性PDE活性(以及满足本发明的其它选择标准)的另外化合物可产生体内治疗的有效药。在其作用机理被发现涉及cGMP抑制和知道它满足本发明的选择标准以前发明的第二个药是化合物B。体外和体内的实验已证明它可作为具有抗广泛肿瘤形成活性的抗肿瘤剂。在对动物的研究中和对人的单一逐步上升的剂量研究中，它也是安全的。
作为本领域内的一位专业技术人员将从下面提供的数据认识到，化合物B可在大大高出常规化学治疗中或抗肿瘤剂NSAIDs的允许(在许多情况下是有毒的)剂量安全地给予动物。例如，在大鼠的急性毒性研究中，化合物B的单一口服剂量(在0.5％的羧基甲基纤维素赋形剂中)可高达2000mg/kg，不会导致明显的毒性信号。在4000mg/kg，体重略有下降。单一剂量1000mg/kg经腹膜内注射给药，导致体重减轻，这一组的某些动物经尸体剖检发现肠糸膜粘连。
对狗，化合物B以胶囊的形式给药，剂量为1000mg/kg，对两个雄性狗和两个雌性狗的单一组没有导致毒性信号。由于化合物B胶囊的性质，这个剂量对每个动物至少需13个胶囊，这是对动物不致于造成威胁的最大数，因而，这些狗被接着连续7次给药，剂量为1000mg/kg/天。在这两种剂量形式下没有发现与药物相关的任何明显信号。
这样，根据单一剂量，化合物B不是急性毒性的。根据这些研究的发现，化合物B口服的LD50，对狗被认为高于1000mg/kg，对大鼠被认为高于4000mg/kg，对大鼠腹膜内注射的LD50被认为高于1000mg/kg。
大鼠的7天剂量发现研究中，对化合物B的评价是通过在0，50，500或2000mg/kg/天的剂量给药而进行的，在50mg/kg/天的剂量没有明显的毒性信号。在500mg/kg/天，与治疗相关的影响仅限于雌性大鼠绝对和相对肝重的增加。在2000mg/kg/天的剂量，其影响包括雄性大鼠的用力呼吸和/或不正常的呼吸声、体重和进食减少和雌性大鼠的肝重增加。在任一剂量水平均未看到血液学或血压化学的变化。
对大鼠也在0，50，500，和2000mg/kg/天剂量进行了28天的研究。没有起因于化合物B的不正常临床观察，体重变化、眼底镜检查、血液学和血压化学值以及尿分析检查均不明显。剖尸检查未发现显微组织变化。器官重量数据显示在2000mg/kg/天剂量肝重在统计上显著增加，在2000mg/kg/天组甲状腺重统计上显著增加。在低剂量的稍微增加没有统计上的产意义。组织病理学评价表明，在甲状腺中存在有滤泡细胞过度增长的痕迹，增加了有丝分裂象数(说明可能有细胞感染)，在肝中有温和的过度增长。这些变化一般被限制在2000mg/kg/天剂量下的少数动物，虽然有一个雌性的在500mg/kg/天剂量下增加了甲状腺的丝分裂象数。肝脏中的发现或许是非常温和刺激微体粒酶类的指示，并导致增加甲状腺激素的新陈代谢，继而导致对甲状腺的刺激。本领域的专业科技人员将认识到，这些影响与相同剂量的常规化学治疗法或NSAIDs的预期影响相比，是非常小的。
为进一步确定化合物B的安全范围，进行了评价化合物B诱导的前列腺瘤细胞系的编程性细胞死亡是否同来自正常组织的它对前列腺上皮细胞的影响是可相比的研究。雄激素灵敏的前列腺瘤细胞系LNCaP(来自ATCC(Rockville，MD))在标准条件下莉包含5％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 160介质繁殖。来自正常前列腺(来自Clonetics Inc，(SanDiego，CA))的初步的前列腺上皮细胞培养物(PrEC)在与瘤细胞系相同的条件下生长，不同的是使用无血清的介质(CloneticsInc)以便这些培养物生长的最好。对于这个实验，是把LNCaP或PrEC以每孔10000细胞的密度放置在96孔板上。24小时后，这些细胞用赋形剂(0.1％DSMO)或在DSMO中溶解的50μM化合物B中处理。在不同的药物处理时间(4，24，48，72或99小时)后，将这些细胞溶解加工，测定作为编程性细胞死亡指示的组蛋白联结的DNA。(参阅Piazza etal.，Cancer Rsearch 57：2452-2459，1997)
图6表明在LNCaP培养物中组蛋白联结的断裂的DNA量在用50μM化合物B处理后的时间依赖性增加。在处理24小时后，检测到断裂的DNA显著增加，诱导作用持续到连续处理的4天。相反，用化合物B(50μM)处理PrEC(“正常”前列腺)，在处理的4天时间内，并未影响DNA的断裂。这些结果表明，在瘤形成细胞中选择性诱导了编程性细胞死亡。这是同常规化学治疗法明显的不同，后者使快速增长的正常细胞或瘤形成细胞编程性细胞死亡或坏死。
最后就安全而言，在单一的逐步升高剂量的人的临床试验中，在病人、人的安全研究中药采用口服，化合物B在任何剂量都不产生副作用，包括高于产生抗癌作用所需的预知水平。
如上面指出的那样，化合物B还表现有潜在的抗肿瘤形成性能。在SW-480细胞系中，由化合物B得到的增长抑制IC50值是0.7μM。这些结果已经在啮齿类动物中利用异常隐窝病灶(ACF)作为致癌作用的指示通过评价化合物B得到证实(参阅Bird，Cancer Lett.37：147-151，1987)。这样所建立的氧化偶氮甲烷(AOM)诱导致癌作用的啮齿类动物模型可用来在实验室评价化合物B(游离碱和盐)对结肠癌产生的影响。ACF是结肠癌的前体，ACF抑制作用化学保护效能的指出。
在大鼠的这个实验中，ACF引发作用是通过连续两周注射抗癌剂来实现的。在ACF引发作用前一周服用化合物B，在处理5周后记录ACFs。将化合物B口服给雄性的Fisher344大鼠，在整个实验过程中每天食物的消耗(mg/公斤体重)是变化的，化合物B剂量表示为克/公斤食品，以提供不同剂量间可相比较的基础。为确定化合物B是否对生长和/或饲养行为有不利影响，在实验的整个过程中都测定体重。实验组获得了比对照组较低的体重，这是生物利用率的指示。但是，体重差小于10％，不认为影响ACF的形成。
化合物B抑制了ACF的形成，这由每个结肠的隐窝减少来测定。这些数据归纳于表2。除低剂量组(仅0.5g/kg食品)外，处理组与对照组之间的差异是明显的，在1.0和2.0g/kg食品的情况下，统计上有明显差异。
                        表2
            化合物B对异常隐窝病灶的抑制作用
  化合物剂量g/kg食品对照     n10     平均ACF/结肠与对照(+SE)149±9     ％对照-     p(t-实验)-
  0.5     7     149±14     100     0.992
  1     10     111±9     75     0.008
  1.5     10     132±4     89     0.101
  2.0     10     107±15     72     0.029
还有，化合物B满足本发明的选择标准，是用来确定这个选择标准正确性的化合物之一。例如，利用前面描述的协议，利用来自HT29细胞提取物的cGMP特异性PDE，化合物B具有cGMP特异性PDE IC50值0.68μM。它的COX I抑制作用(在100μM)小于25％。
至于原编程性死亡细胞，化合物B的DNA断裂EC50是15μM。此外，在SW-480中对于化合物B来说在各种药量浓度下编程性细胞死亡的百分数列于表3。
                        表3
        由形态学测定的化合物B对SW-480结肠腺癌细胞的
            HT-29细胞的编程性细胞死亡诱导作用
处理     剂量     ％编程性细胞死亡
赋形剂(0.1％DSMO)     -     1
化合物B     0.35μM     16
化合物B     0.7μM     27
化合物B     1.5μM     88
化合物B的活性不限于抗结肠癌细胞系的活性或结肠癌的动物模型。在各种瘤形成细胞系中，它具有广泛的抗瘤形成作用。各种类型的人癌细胞系在无菌条件下，在含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和碳酸氢纳的RPMI 1640介质中增长。为测定化合物B的增长抑制作用这些细胞以每孔1000个细胞的密度放置在96孔板中。在平板接种后24小时，用溶解在DMSO中的各种浓度的化合物B游离碱(最后浓度为0.1％)调剂细胞。该药对肿瘤细胞增长的影响，在连续处理5天后，利用中性红细胞毒性试验测定。中性红是一种染料，通过ATP依赖传输机理由活细胞选择性地吸收。
如表4所归纳的那样，当对一系列来自不同组织的培养人细胞系进行评价时，化合物B(游离碱)显示了有效的增长抑制活性。化合物B显示了可相比较的增长抑制作用，不管细胞系来自瘤的组织发生是怎样的。对所有细胞系计算的GI50值(相对于赋形剂对照，抑制50％增长的药浓度)是1-2μM。
除下表中的数据外，我们还观察到了人的白血病细胞系(CCRF-CEM，K562和Molt-4)、骨髓瘤细胞系(RPMI8226)、胰腺瘤细胞系(PAN-1)和卵巢瘤细胞系(OVCAR-3)同化合物B(盐酸盐)可相比较的灵敏性。
                           表4
            化合物B对各种人瘤细胞系的增长抑制作用
    细胞系     肿瘤起源     GI50μM     GI90μM
    Colo205     结肠     1.6     2.4
    HCT-15     结肠     1.7     3.0
    HT-29     结肠     2.1     8.0
    SW-620     结肠     1.7     2.5
    DU145     前列腺     1.6     2.8
    PC-3     前列腺     1.7     82.5
    NCI-H23     肺     1.7     2.5
    NCI-H322M     肺     2.1     13.2
    NCI-H460     肺     1.9     30.0
    NCI-H82     肺     1.7     5.8
    MDA-MB-231     乳腺     1.8     77.6
    MDA-MB-435     乳腺     1.6     2.3
    UISO-BCA-1     乳腺     1.5     4.7
    Molt-4*     白血病     1.6     ND
    CCRF-CEM*     白血病     1.4     ND
    K-562*     白血病     1.8     ND
    RPMI-8226*     骨髓瘤     1.2     ND
    OVCAR*     胰腺瘤     1.2     ND
    PANC-1*     卵巢瘤     2.2     ND
*未特别标记的实验是用该化合物的游离碱进行的，用*标记的实验是用盐酸盐进行的。
在给出了化合物B的动物和人的安全特性以及动物和非常宽的细胞培养效率之后，就可明白，满足本发明选择标准(包括cGMP-特异性PDE抑制作用)的化合物可用作抗肿瘤形成治疗剂。
至于从结构上鉴定另外的作为抗肿瘤剂在治疗上有效的cGMP-特异性PDE抑制化合物，本领域内的专业技术人员有许多本发明公开的有用的模型化合物(以及收编在这里供参考的它们的同类物)，可用作计算机模拟具有相同构象但不同化学性能的另外化合物的基础。例如，由Molecular Simulation Inc.发行WebLabViewerProTM而出售的软件包括分子显示和化学通讯能力。这样的软件包括官能度，包括已知化合物的3D显示，以证实草拟的或示意的化学结构的准确性。此外，根据使用者定义的细节，这个软件还可使结构叠加，使用者可测定距离、夹角或二面角。
在这种情况下，因为其他活性化合物的结构上面已公开，所以人们就可由这样的软件利用聚类分析以及2D和3D相似的研究技术，去鉴定按照本发明的选择标准可筛选和选择潜在的新的另外的化合物。这些软件法依据的原则是，化合物好象有或具有相似的性能，很有可能是具有相似的活性，利用本发明的选择标准可证实这些化合物。
另外，这些另外的化合物被计算机模拟时，许多这样的化合物及其变种可利用已知的药学工业中普通的专业技术人员共同使用的合成化学技术来合成。某些雇用合成化学服务业务的例子包括由NewChemical Entities，Inc，of Bothell Washington，Protogene，Laboratories，Inc.，of Palo Alto，California，Axys，Inc，of South SanFrancisco，California，Nanosyn，Inc.of Tucson Arizoza，Trega，Inc，of SanDiego，California，RBI，Inc，of Natick，Mass.提供的服务。还有一些其他的雇用公司。如果不是特别超群的话，许多大的医药公司自身的能力相同。简言之，本领域内的专业技术人员可容易地制备许多化合物，供从中筛选以选择具有本发明公开化合物作用的用于治疗肿瘤有前途的化合物。
为进一步支持鉴定利用本发明的标准可进行筛选和选择的化合物，了解所选择的抗肿瘤化合物结合到PDE5蛋白上是有意义的。按照下面讨论的方法，可以发现，满足本发明标准的优选的有希望的化合物结合到PDE5的cGMP催化区域。
为了确定这一点，使用不包括催化结构域的PDE5序列。产生这种序列的一个方法是把这个序列表达为融合蛋白，优选用谷胱甘肽S-转移酶，其理由明显的。
用RT-PCR方法来获得由牛的PDE5A cDNA序列(McAllister-Lucas L.M.et al，J，Biol.Chem.268，22863-22873，1993)设计的具有正向引物和逆向引物的PDE5的cGB结构域，并在PDE1-10系谱中选择。5’-3’公司的总RNA试剂盒，通过mRNA的微动(dT)柱纯化后同HT-29细胞一起使用。正向引物(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G，203-227)和逆向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG，1664-1686)被用来合成磷酸化位点的以及人的PDE5A(203-1686bp，cGB-PDE5)低和高亲合力cGMP结合位点的1484bp片断编码。合成的cGB-PDE5核苷肽片断编码成同牛的PDE5A有97％相似性的494氨基酸。而后将其克隆到具有tac启动子的pGEX-5X-3谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合载体(Pharmacia Biotech)上以及EcoRI和XhoI半裂位点上。将这种融合载体转移到E.ColiBL21(DE3)菌(Invitrogen)上。转移的BL21菌生长到对数期，而后将IPTG作为诱导剂加入。使诱导作用在20℃进行24小时。收集该菌并溶解。可溶性的细胞溶胞产物用GSH接合的琼脂糖4B(GSH-琼脂糖4B)孵化。GST-cGB-PDE5融合蛋白可结合到GSH-琼脂糖球上，其他的蛋白用过量的冷PBS从琼脂糖球上洗掉。
表达的GST-cGB-PDE5融合蛋白  作为85Kd蛋白显示在7.5％SDS-PAGE凝胶上。它以cGMP结合和由蛋白激酶G和A磷酸化为特征。它有两个cGMP结合点，Kd是1.6±0.2μM，这接近于土著牛PDE5的Kd＝1.3μM。GSH接合的琼脂糖球上的GST-cGB-PDE5可由cGMP依赖蛋白激酶和cAPM依赖蛋白激酶A在体外磷酸化。由PKG对GST-cGB-PDE5磷酸化的Km是2.7μM，Vmax是2.8μM，而BPDE肽磷酸化的Km是68μM。由PKG的磷酸化显示有按1∶1的比率并合到GST-cGB-PDE5蛋白上的分子磷酸盐。
对有兴趣的(Francis S，H，et al，J.Biol.Chem.255，620-626，1980)化合物在总体和为100μL，包含有5mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.8)、1mM的EDTA、0.25mg/mL的BSA、H3-cGMP(2μM，NEN)和GST-cGB-PDE5融合蛋白(30μg/试验)的介质中进行。被实验的舀一个化合物都在同时作为H3-cGMP培养基加入，该混合物在22℃孵化1小时。而后将该混合物用GF/B作为过滤器膜转移到BrandelMB-24细胞收集器中，接着用10mL冷5mM钾缓冲液(pH＝6.8)洗涤两次。而后把膜切碎并转入到闪烁小瓶中，接着向每个小瓶加入1mL水和6mL Ready SafeTM液体闪烁混合物。小瓶在Beckman LS6500闪烁计数器上计数。
为了计算，通过沸腾结合的蛋白5分钟来制备对照样品，与未沸腾的蛋白比较时结合计数小于1％。由过滤器膜淬火或对其他残渣也进行校淮。
PDE5抑制剂、亚硫酸盐、exisulind、化合物B、化合物A、E4021和zaprinast、和环核苷肽同系物、cAMP、环IMP、8-溴cGMP、环UMP、环CMP、8-溴cAMP、2’-O-丁基-cGMP和2’-O-丁基-cAMP被选定来试验它们是否能相竞争地结合到GST-cGB-PDE5蛋白的cGMP结合点上。结果示于图7。cGMP特别地结合GST-cGB-PDE5蛋白。环AMP、cUMP、cCMP、8-溴cAMP、2’-O-丁基-cGMP和2’-O-丁基-cAMP在结合中不与cGMP竞争。环IMP和8-溴cGMP在高浓度(100μM)与cGMP(2μM)结合有部分竞争。无PDE5抑制剂在GST-cGB-PDE5结合中同cGMP显示任何的竞争。因而，它们不结合到PDE5的cGMP结合点。
但是，化合物A(同cGMP)竞争地结合到PDE5上(即峰A)(化合物A也(同cGMP)竞争地结合到PDE上，峰B)。知道了化合物A并不结合到PDE5的cGMP结合点上之后，化合物A和cGMP之间完全竞争的事实，就表示所希望的化合物如化合物A，结合到PDE5的cGMP催化点上，本领域内的专业技术人员易于得到的信息(用常规的竞争结合实验)并不支持他们比较容易地模拟其他化合物。这样，用本发明提出的希望化合物的化学结构和cGMP结合点信息，本领域内的专业技术人员可模拟、鉴定和选择(利用本发明的选择标准)用作治疗剂的其他化合物。
按照本发明的方法选定的化合物可配制成药用组合物，这从“药用组合物”术语的含义是容易理解的，也就是说，为把化合物(如上面描述的固体)和药用载体输送给病人，可以固体或液体形式由口服给药，以液体形式由药，以形式由局部给药，或以栓剂形式由直肠或局部给药。口服给药的载体是最被选的。
如本领域内所公认的那样，口服给药的药用组合物中的药用载体包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂、锭剂和粒剂。在这些固体剂量形式中，载体可至少含有一种惰性稀释剂，如蔗糖、乳糖或淀粉。这些固体还可包含稀释剂以外的其他物质，正常操作也这样，如硬脂酸镁这样的润滑剂。在胶囊、片剂、丸剂、锭剂情况下，载体可包含有缓冲剂。像片剂、丸剂、粒剂这样的载体，可在片剂、丸剂、粒剂的表面用肠道式涂抹的方法制备。另外，肠道式涂抹的化合物可压制成片剂、丸剂、粒剂，使这样的片剂、丸剂、粒剂给病人服用。优选的肠道涂抹物包括在结肠的pH下能溶解或分解的涂抹物，如紫胶或Eudraget S。
药用组合物中的药用可接受的载体包括口服给药的液体剂量形式，如药用可接受的乳化液、溶液、悬浮液、糖浆和包含本领域内通用的惰性稀释剂的酏剂。除这些惰性稀释剂，组合物还可包含佐剂，如增湿剂、乳化剂和悬浮剂、溶胀剂、增香剂和加香剂。
IV或IP给药的药用组合物中药用可接受的载体包括普通的药用生理盐水溶液。
局部给药的药用组合物中药用可接受的载体包括DSMO、乙醇和丙二醇等，它们可同档布或其他液体阻留材料一起使用，以便把药保持在皮肤的某个地方，这样药就不会干掉。
直肠给药的药用组合物中药用可接受的载体优选栓剂，除了本发明的化合物外，它还可包含赋形剂，如可可奶油或栓剂蜡或凝胶。
药用可接受的载体和本发明的化合物被配制成单一剂量形式的药用组合物供病人服用。在单位剂量中有效组分(即依据本发明选乏的化合物)的剂量水平是可以变化的，以便按照所希望的服用方法(如口服或直肠服用)得到为消除瘤形成活性有效的活性组分量。因而所确定的剂量水平取决于所服用的活性化合物的性质(如它的IC50，很容易确定)、服用方式、所希望的治疗时间和其他因素。一个单位剂量可以是每天对活性化合物需要量，或将其分成几份剂量服用，如每天2-4次。对IV服用法，服用的起始剂量可根据在平均成年男性的血浆含量中(即大约4升)达到IC50的剂量来确定。按照本发明选定的活性化合物的最后剂量可在0.5-600mg范围内变化。
本发明的药用组合物优选包装在附有指标、使用说明等印刷材料(如包装衬)的容器中(如盒或瓶或筒)。
很显然，借助于上面的介绍，本发明的许多改进和变化都是可能的。因而应当认为在本发明权利要求范围内，用这里具体说明以外的方法也可实施本发明。

Claims (7)

1.选择用于治疗要被治疗肿瘤的化合物的方法，该方法包括：
(a)评价该化合物对要治疗肿瘤的抗肿瘤活性；
(b)评价该化合物是否在要治疗的肿瘤中增加蛋白激酶G活性；
(c)评价该化合物是否在要治疗的肿瘤中活化jun N-端激酶活性；
(d)选择对要治疗的肿瘤具有抗肿瘤活性、增加蛋白激酶G活性和活化jun N-端激酶活性的化合物。
2.权利要求1的方法，进一步包括评价该化合物是否抑制磷酸二酯酶5，并选择抑制磷酸二酯酶5的化合物。
3.权利要求1的方法，进一步包括评价该化合物是否在要治疗的肿瘤中减少β-链蛋白，并选择减少β-链蛋白的化合物。
4.权利要求1的方法，进一步包括评价该化合物是否抑制cGMP特异性磷酸二酯酶，并选择抑制所说的磷酸二酯酶的化合物。
5.权利要求1的方法，进一步包括评价该化合物是否增加蛋白激酶G表达，并选择增加蛋白激酶G表达的化合物。
6.权利要求1的方法，进一步包括评价该化合物是否增加蛋白激酶G活性，并选择增加蛋白激酶G活性的化合物。
7.鉴定能有效治疗肿瘤的化合物的方法，该方法包括：
选择能提高蛋白激酶G活性和活化肿瘤中的jun N-端激酶的化合物；
评价化合物对肿瘤生长的抑制活性，以及确定能提高蛋白激酶G活性，活化肿瘤中的jun N-端激酶，具有肿瘤生长抑制活性，能够有效抑制肿瘤，但不抑制正常细胞的生长的化合物。
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