CN100389829C - 用于抑制肿瘤性损伤的化合物的鉴定方法和含所述化合物的药物组合物 - Google Patents

用于抑制肿瘤性损伤的化合物的鉴定方法和含所述化合物的药物组合物 Download PDF

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Abstract

通过鉴定出能抑制cGMP磷酸二酯酶和在肿瘤细胞中增强PKG活性的化合物，可选择出用于治疗肿瘤的药物组合物。

Description

用于抑制肿瘤性损伤的化合物的鉴定方法和含所述化合物的药物组合物
发明背景
本发明涉及使用一种或多种形式的磷酸二酯酶2型(PDE2)和磷酸二酯酶5型(PDE5)和/或蛋白激酶G鉴定用于治疗和预防哺乳动物前癌损伤和癌损伤的用途，并涉及含所述化合物的药物组合物，以及用所述化合物治疗肿瘤的方法。
目前，癌治疗的非手术方法包括在患者的癌症发展到化疗/激素治疗的益处比其副作用更重要的时候，给患者施用一种或多种高毒性的化疗或激素治疗方法。所述副作用是任何癌症学家熟知的，并且因药物的不同而不同。但是，标准化疗方法仅用很短的时间，经常一段时间停止治疗，即交替地进行化疗，以便不会因药物的副作用而使患者难以承受。因此，如果风险-益处做比较，当患者有前癌损伤时，因副作用的存在通常人们不使用化疗，或者在明显的癌已经被消除而需防止其复发时，也不在长期基础上继续进行化疗或激素治疗。
从十年前左右开始，一种意想不到的来源-非甾类抗炎药物(NSAIDs)出现了一线希望。癌症和前癌研究领域充斥了许多文献，所述文献描述了在肿瘤组织中过表达的各种生物化学分子，一组接一组地研究是否是特异性过表达的分子引起了所述疾病，而且，如果抑制所述过表达，是否肿瘤就可消除。例如，在家族性腺瘤息肉病(FAP)中，Waddell在1983年(Waddell，W.R.et al.，“Sulindac for Polyposis of theColon，”Journal of Surgical Oncology，24：83-87，1983)认为由于在所述息肉中前列腺素过表达，所以，非甾类抗炎药物(NSAIDs)应该可以消除所述疾病，因为NSAIDs抑制前列腺素合成酶(PGE2)的活性。因此，可以给数个FAP患者施用非甾类抗炎药物(NSAID)舒林酸(一种PGE2抑制剂)。Waddell发现息肉退化并在所述治疗后，不会复发。PGE2抑制产生于NSAID对环加氧酶(COX)的抑制作用。Waddell利用舒林酸的成功以及PGE2/COX关系似乎可证明其它两种生物化学靶-PGE2和COX在癌形成中的作用，而且随后的文献进一步加强了这些观点。
肿瘤患者的一线希望是舒林酸比常规化疗药物或激素药物有确实小得多的副作用，而且提出了在癌症早期治疗癌症的可能性，并比常规化疗药物有更长的应用时间。但是，所述希望因化合物如舒林酸是否可用于治疗已显癌症问题的提出而不得不有所削弱，因为Waddell仅给患前癌、FAP的患者施用了舒林酸。
由于NSAID具有一系列副作用而使该希望有所破灭。长期施用舒林酸和其它NSAID时，会加重消化泳道的负担，而PGE2在消化泳道中起保护作用。另外，当长期施用时，所述药物对肾有副作用并会干扰正常的血液凝集。正如Waddell所不幸经历过的，他的一些舒林酸患者由于副作用而停止服用所述药物(参见Waddell，W.R.et al.，“Sulindac for Poluposis of the Colon，”The American Journal of Surgery，157：175-79，1989)，大部分需再进行外科手术以控制息肉的形成。因此，对于肿瘤患者来说，所述药物不是一种可行的长期治疗药物，例如对于FAP、发散(sporadic)息肉或男人前列腺切除后产生的PSA(在所述男人中产生PSA表明了疾病的复发，可能还不是明显可见的癌症)。这些副反应也限制了NSAID在任何其它需长期进行药物治疗的肿瘤中的用途。最近，有些人提出可使用COX-2特异性NSAID如celecoxib。但是，认为所述化合物对肾和其它的副作用限制了所述化合物用于长期抗肿瘤指征的剂量和治疗时间的长度。另外，最近公开的数据表明象celecoxib这样的药物需要很高的剂量以便仅在结肠息肉的预定区域对结肠息肉有明显的作用。关于结肠癌症治疗可能更重要的是据报道某些结肠肿瘤(如HCT-116)不表达COX-2，而且所述抑制剂对所述肿瘤是无效的(参见，Sheng，et al.，“Inhibition of Human ColonCancer Cell Growth By Selective Inhibition of Cyclooxygenase-2，”J.Clin.Invest.，99(9)：2254-9，1997)。
最近的发现已使科学家放弃COX/PGE2靶，因为这些靶对于成功地长期治疗肿瘤患者不是主要的(或者可能甚至是二级靶)。Pamukcu等在美国专利5401774中公开了磺酰基化合物可出人意料地抑制多种肿瘤细胞，包括结肠息肉细胞的生长，而据以前报道在实践中磺酰基化合物不引起PGE2和COX抑制作用(因此它不是NSAID或抗炎类化合物)。在结肠癌形成的大鼠模型中，证明这些磺酰基衍生物是有效的，而在对患FAP患者的人临床试验中，已证明一种变体(现称为exisulind)是有效的，而在明显癌症前列腺癌本身中，在下列所列的对照临床研究中效果甚至更显著。此外，最新研究已令人信服地表明在所有肿瘤中基本上都不表达COX I和/或COX II，削弱了将COX I或COX II特异性抑制剂广泛用于肿瘤治疗的希望(参见，Lim et al.，“SulindacDerivatives Inhibit Growth and Induce Apoptosis in Human ProstateCancer Cell Lines，”Biochem.Pharmacology，Vol.58，pp.1097-1107”(1999)，在印刷中)。
因此，象在肿瘤中过表达的许多其他蛋白质一样，PGE2/COX可能不是一些肿瘤形成的原因，而是其结果。但是，将这些发现结合起来，提出了象exisulind(对抑制表达COX和不表达COX的肿瘤有定的活性)这样的化合物如何起作用的问题？所述化合物对肿瘤细胞有什么影响的问题？
Piazza等(在美国专利申请08 866027和09/046,739)发现化合物(如exisulind)抑制特异性环GMP磷酸二酯酶(例如PDE5)，发现其他这类化合物可用所述酶来筛选，这一发现可用于开发其他化合物并将其配制成抗肿瘤药物组合物。所述药物组合物是高度抗肿瘤的，并在实践中可避免与常规化疗药物有关的副作用，或甚至避免COX或PGE2抑制作用的副作用，如果人们想避免所述副作用的话。另外，抗肿瘤形成的cGMP特异性PDE抑制化合物可诱导肿瘤细胞而不是正常细胞中的编程性细胞死亡(程序化细胞死亡或自杀的一种形式)。因此，所述新化合物已成为一类新的抗肿瘤药物，它们是选择性的编程性细胞死亡抗肿瘤药物(SAAND)。因此，SAAND已经向下列常规观点提出挑战：(1)不杀死正常细胞的抗肿瘤化合物不可能是有效的；(2)COX’s引起肿瘤；和(3)NSAID的结肠肿瘤预防作用可能是由对一种或两种COX的抑制作用介导的。
但是，下文所列的新研究已经表明不是所有表现出典型PGE5抑制作用的化合物均可诱导肿瘤细胞中的编程性细胞死亡。例如，熟知的PDE5抑制剂，zaprinast和sildenafil不能单独诱导编程性细胞死亡，或者从我们来看，甚至不能抑制肿瘤细胞生长。但是，由于前编程性细胞死亡PDE5抑制剂选择性地诱导编程性细胞死亡(即，在肿瘤细胞，而不是正常细胞中)，而且这一点可以做到，而基本上没有COX抑制作用，那么PDE5作为筛选理想抗肿瘤化合物的工具是不成问题的。
但是，对发现抗肿瘤、前编程性细胞死亡但安全的化合物的PDE5筛选方法是进行改进是人们所希望的，这样可配制新的药物组合物用于治疗肿瘤包括前癌和癌症。
在研究为什么一些PDE5抑制剂能够单独诱导编程性细胞死亡而其他一些则不能的过程中，我们发现了一种以前未描述过的环GMP特异性磷酸二酯酶活性。以前从未表征过这种新的磷酸二酯酶活性。不受具体理论的限制，我们认为这种新PDE2活性可能是PDE2的一种新构型，它基本上没有cAMP水解活性，即是cGMP特异性的。经典的PDE2不是cGMP特异性(它也水解cAMP)，在肿瘤细胞中也发现了典型的PDE2。这种新PDE和PDE2可用于筛选具有理想抗肿瘤特性的药物化合物。主要而言，在肿瘤细胞中，当抗肿瘤的PDE5抑制性化合物抑制PDE5和PDE2活性(以其新的和常规构型)时，结果就是编程性细胞死亡。当仅有PDE5(但不是PDE2的数种形式)受到抑制时，不会发生编程性细胞死亡。
从最广泛的方面而言，这种新PDE构型有下列活性：
(a)对cGMP的特异性高于对cAMP的；
(b)存在cGMP底物时，表现出积极的动力学行为；
(c)对cGMP有亚微摩尔亲和性；和
(d)对与纯化的cGMP依赖性蛋白激酶一起保温不敏感。
这种新PDE的其他特征包括：对zaprinast和E4021引起的抑制作用的敏感性降低，通过阴离子交换色谱可与典型的PDE5活性分开，不受钙/钙调蛋白的激活，对咯利普兰(rolipram)、长春西汀和引哚利旦(indolidan)不敏感。
本发明的另一实施方案涉及评估一种化合物在肿瘤细胞中是否可提高cGMP依赖性蛋白激酶G(PKG)活性和/或减少β-连环蛋白。已发现SAAND出人意料的特征包括提高与SAAND接触的肿瘤细胞的PKG活性并减少β-连环蛋白。我们认为如上所述，PKG的升高至少部分是由于cGMP增加引起的，而cGMP的增加是由适宜PDE的SAAND抑制作用引起的。SAAND的其他特征是(1)在上述，694专利中报道的PDE5的抑制作用，(2)对新cGMP特异性PDE构型的抑制作用，(3)PDE2的抑制作用；(4)它们增加肿瘤细胞中细胞内cGMP的事实，和(5)它们减少某些肿瘤细胞中的cAMP水平的事实。
因此，本发明新方法的一个实施方案是评估化合物是否会引起肿瘤细胞内PKG活性提高以及所述化合物是否会抑制PDE5。本发明新筛选方法的另一实施方案是评估化合物是否会引起肿瘤细胞中PKG活性的增加以及所述化合物是否抑制上述新cGMP特异性PDE和/或PDE2。第三个实施方案是评估化合物是否会引起肿瘤细胞中PKG活性增加以及所述化合物是否引起肿瘤细胞中cGMP增加和/或引起cAMP水平下降。用所述方式评估的化合物用作SAAND。
其中本发明涉及用于筛选安全地治疗和预防肿瘤，特别是前癌损伤的化合物的能力的新体外和体内方法。具体地讲，本发明是一种筛选化合物的方法，所述化合物用于治疗和预防肿瘤，包括前癌损伤。所鉴定的化合物可能具有最小的副作用，所述副作用为COX抑制作用和与常规化疗药物有关的其他非特异性相互作用。通过将上述新PDE与所述化合物接触，如果一种化合物抑制这种新PDE，则进一步评估(例如体外或体内动物或人检测模型或试验)该化合物的抗肿瘤特性，由此来检测所需的化合物。
因此，本发明的一个方面涉及鉴定可有效治疗肿瘤的化合物的筛选方法，该方法包括确定所述化合物对这种新PDE和/或PDE2的抑制作用和对COX的抑制作用。优选本发明的筛选方法还包括确定所述化合物在体外或体内是否抑制肿瘤细胞的生长。
与过去为开发药物组合物和对肿瘤进行治疗而筛选化合物相比，用这种方式筛选化合物，其好处和可用于治疗肿瘤的更好的化合物可以更快更精确地被识别出来。其它的益处将由以下的详细描述而显而易见。
本发明还包括含所述化合物的药物组合物以及利用所述化合物的治疗方法。
附图描述
图1是从SW480肿瘤细胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用从DEAE-Trisacryl M柱的洗脱液检测的。
图2是从SW480肿瘤细胞得到的在负载有cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用从DEAE-Trisacryl M柱的洗脱液检测的。
图3是本发明新PDE的动力学行为图。
图4说明舒林酸的硫化物衍生物和舒林酸的砜衍生物(a.k.a.exisulind)对纯化的环加氧酶活性的影响。
图5说明待测化合物B和E对COX抑制作用的影响。
图6说明硫化舒林酸和exisulind对从培养的肿瘤细胞中纯化的PDE4和PDE5的抑制作用。
图7说明硫化舒林酸对HT-29细胞中环核苷水平的影响。
图8说明化合物B的磷酸二酯酶抑制活性。
图9说明化合物E的磷酸二酯酶抑制活性。
图10说明硫化舒林酸和exisulind对HT-29细胞的编程性细胞死亡和坏死的影响。
图11说明硫化舒林酸和exisulind对HT-29细胞生长抑制作用和用DNA断裂确定的编程性细胞死亡诱导作用的影响。
图12说明化合物E诱导编程性细胞死亡的特性。
图13说明化合物B诱导编程性细胞死亡的特性。
图14说明硫化舒林酸和exisulind对肿瘤细胞生长的影响。
图15说明硫化舒林酸和对照(DMSO)的生长抑制作用和编程性细胞死亡诱导活性。
图16说明化合物E的生长抑制活性。
图17说明舒林酸代谢产物对小鼠乳腺器官中的前恶性肿瘤损伤的抑制作用。
图18A是不存在加入的cGMP的条件下，来自经药物处理的细胞溶解产物的SW480细胞溶解产物的SDS蛋白质凝胶，其中将细胞在含DMSO(0.03％，泳道1和2)，exisulind(200、400和600μM；泳道3、4、5)和E4021(0.1、1和10μM，泳道6、7、8)的培养基中培养48小时。
图18B是在存在加入的cGMP条件下，来自经药物处理的细胞溶解产物的SW480细胞溶剂产物的SDS(X射线胶片暴露)凝胶PKG检测，其中将细胞在含DMSO(0.03％，泳道1和2)，exisulind(200、400和600μM；泳道3、4、5)和E4021(0.1、1和10μM，泳道6、7、8)的培养基中培养48小时。
图19是相对于对照，exisulind对肿瘤细胞中β-连环蛋白和PKG水平的影响的Western印迹试验柱图。
图20是从HTB-26肿瘤细胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用来自DEAE-Trisacryl M柱的洗脱液检测的。
图21是从HTB-26肿瘤细胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用低和高底物浓度，用来自DEAE-Trisacryl M柱的洗脱液检测的。
图22是从LnCAP肿瘤细胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用来自DEAE-Trisacryl M柱的洗脱液检测的。
图23是从LnCAP肿瘤细胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用低和高底物浓度，用来自DEAE-Trisacryl M柱的洗脱液检测的。
图24是说明环腺苷酸类似物和所选的PDE5抑制剂的PDE5的非催化cGMP结合位点的特异性结合柱图。
图25是从SW480肿瘤细胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用乙二醇缓冲液洗脱DEAE-Trisacryl M柱而得的洗脱液检测的。
图26是从在旋转瓶中生长的SW480肿瘤细胞中得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性图，是用DEAE-Trisacryl M柱的洗脱液检测的。
图27A说明用50μM化合物I处理后，LNCaP细胞培养物中的组蛋白相关的片段化DNA的数量随时间增加。
图27B说明用化合物I(50μM)处理PrEC前列腺细胞的过程，在处理4天内不影响DNA断裂。
优选实施方案的详细描述
I.来自肿瘤细胞的新cGMP特异性磷酸二酯酶和PDE2
A.新PDE构型的分离
首先从得自美国典型培养物保藏中心(位于Rockville，Maryland，U.S.A)的通常称为SW480的人癌细胞系制备分离的cGMP特异性磷酸二酯酶(该酶看来一种新的PDE2构型)。SW480是一种人结肠癌细胞系，来源于中度分化的上皮腺癌。如下文所讨论的，从乳腺(即HTB-26细胞系)和前列腺(即LNCAP细胞系)的肿瘤也可分离出相似的构型。
我们所说的“分离”(正如本领域所理解的)不仅是从肿瘤细胞中分离，还可用重组方法制备(例如在细菌和其它非人宿主载体细胞系中表达)。但是，我们目前认为从人肿瘤细胞系分离是优选的，因为我们认为这样分离出的靶蛋白质的结构，如果与肿瘤细胞中的天然构型之一不完全相同的话，也可能更相近。该构型有助于筛选在体内抑制靶酶的抗肿瘤化合物。
在SW480结肠癌细胞系中首先发现了新的PDE活性。为了从SW480中分离出新的磷酸二酯酶，将大约4亿个SW480细胞在150cm2组织培养皿中生长至汇合，然后用10mL冷PBS洗涤两次后，从培养基皿中刮下，然后离心沉淀。将细胞再悬浮于匀浆缓冲液(20mLTMPI-EDTA-Triton pH 7.4：20mM Tris-HOAc，5mM MgAc2，0.1mMEDTA，0.8％Triton-100，10μM苄脒，10μM TLCK，2000 U/mL抑肽酶、2μM亮肽素、2μM胃酶抑素A)中，并用Polytron tissumizer在冰浴上匀浆(3次，20秒/脉冲)。用Beckman L8超离心器在4℃，将匀浆的物质以105000g离心60分钟，用TMPI-EDTA(60毫升)稀释上清液，然后用于将之加到已用TMPI-EDTA缓冲液预平衡过的10毫升DEAE-Trisacryl M柱。将上述样的柱用60毫升TM-EDTA洗涤，用120毫升线性梯度NaOAC(0-0.5M)的TM-EDTA溶液洗脱PDE活性组分，流速为0.95mL/分钟，1.4mL/馏分。收集8个馏分并立即检测cGMP水解活性(即数分钟内)。图1表示柱的洗脱图谱，揭示了两个开始的cGMP PDE活性峰，峰A和B，它们分别是用40-50mM和70-80mMNaOAC洗脱的。如下文所解释的，峰A是PDE5，而峰B是新的cGMP-特异性磷酸二酯酶活性峰。
用Thompson等(Thompson W.J.等Adv.Cyclic Nucleotide Res.10：69-92，1979)改进的两步放射性同位素法，按下文所述来确定各馏分的环腺苷酸PDE活性。反应在400μl含Tris-HCl(40mM；pH8.0)、MgCl2(5mM)、2-巯基乙醇(4mM)、牛血清白蛋白(30μg)，cGMP(0.25μM-5μM)和恒定氚化底物(200,000cpm)的溶液中进行。调整保温时间以便只有不到15％的水解。将混合物在30℃保温，然后煮沸45秒以停止反应。然后，将混合物冷却，加入蛇毒(50μg)并将混合物在30℃保温10分钟。加入MeOH(1毫升)终止反应，然后将所述混合物转移到阴离子交换柱(Dowex 1-X8，0.25mL树脂)中。将洗脱液与另1毫升MeOH合并，加到树脂上，加入6毫升闪烁液后，用Beckman LS 65000测量1分钟氚活性。
为了进一步分离具cGMP水解活性的峰A和峰B组分，将头80份馏分中的第15至30份再负载到DEAE-Trisaryl M柱上，然后用线性梯度NaOAC(0-0.5M)的TM-EDTA溶液洗脱。再立即检测各馏分的cGMP水解作用(用上述方法，使用0.1，2，5μM底物)，其结果绘于图2中。观察到图2中的峰B的一个结果是，与峰A相比，增加cGMP的底物浓度，其活性显著增加。尽管此观察结果与其作为一种PDE2是一致的，但是，图2中表征的酶是一种cGMP特异性(见下文)的事实说明，与文献中报道的典型PDE2相比，它是一种新构型。峰A活性说明了高亲和性催化位点的表现底物饱和性。
B.从SW480中分离典型PDE2
发现有两种方法可以从SW480中分离“峰B”，以致该酶有典型PDE2活性(即不是cGMP特异性的，但是受cGMP刺激的)。第一种方法包括使SW480在850cm2康宁旋转瓶中而不是150cm2组织培养烧瓶中生长。使SW480在0.5rpm的旋转瓶中生长，各瓶含有200毫升RPMI 1640、2mM谷氨酸和25mM HEPES。按下列方法收集细胞。将PBS加热至37℃至少15分钟。制备200毫升5％FBS/RPMI 1640完全培养基并加入5毫升谷氨酸。再加入5毫升抗生素/抗真菌素。
将70毫升PBS溶液加至10毫升4X Pancreatin中。将该混合物在室温保持。除去培养基，将烧瓶用以确保烧瓶的底部被覆盖的4毫升PBS漂洗。用移液管取出所有溶液。将4毫升稀释的Pancreatin加至烧瓶中，摇动烧瓶以覆盖其底部。将烧瓶在37℃保温8-10分钟。保温后，在反转显微镜下迅速观察烧瓶以确保所有细胞均变圆。在烧瓶边上仔细敲数次以帮助细胞剥离下来。将10毫升冷的完全培养基加至烧瓶中以终止Pancreatin蛋白水解。将溶液在底部涡漩以收集细胞。用25毫升移液管取出培养基，将细胞放在置于冰上的50毫升离心管中。在4℃，用临床离心机将所述离心管以1000rpm离心5分钟以沉淀细胞。倒掉上清液，将各沉淀用液氮冷冻15秒。可将收集的细胞于-70℃冷冻器中冷冻。
用FPLC方法分离来自所收集的SW480细胞的PDEs。用PharmaciaAKTA FPLC控制向18毫升DEAE TrisAcryl M柱的上样和洗脱。用约6亿个SW480细胞作图。将细胞重悬于匀浆缓冲液(20mL TMPI-EDTA-Triton pH 7.4：20mM Tris-HOAc，5mM MgAc2，0.1mMEDTA，0.8％Triton-100，10μM苄脒，10μM TLCK，2000U/mL抑肽酶、2μM亮肽素、2μM胃酶抑素A)后，将样品手工匀浆。FPLC缓冲液A是8mMTRIS-醋酸，5mM醋酸镁，0.1mM EDTA，pH7.5，缓冲液B是8mMTRIS-醋酸，5mM醋酸镁，0.1mM EDTA，1M醋酸钠，pH7.5。将上清液以1mL/分钟的流速上载到柱上，然后用60毫升缓冲液A以1mL/分钟的流速洗涤。梯度是60毫升0-15％缓冲液B，60毫升15-50％缓冲液B，和16毫升50-100％缓冲液B。在所述梯度洗脱期间，收集1.5mL馏分。
所得的图(图26)与上述所得的新PDE活性(参见例如图1)相似，不同的是，用该方法分离的峰B显示出在0.25μM底物浓度时的cAMP水解活性，可以由5μM cGMP激活2-3倍。
从SW480中分离典型PDE2的第二种方法是用上述非FPLCDEAE柱方法(参见IA部分)完成，不同的是所述缓冲液含30％乙二醇、10mM TLCK和3.6mM β-巯基乙醇。将这些试剂加到缓冲液中使从低至高醋酸钠的洗脱图谱(参见图25)有一个位移，使峰A从40mM移至150mM，峰B从75mM移至280mM，峰C从200mM移至500mM醋酸钠(参见图25)。图25中的峰B用2μM cAMP底物检测，表明被5μM cGMP激活2倍(参见图-Y)。选择性PDE2抑制剂EHNA在该B峰中抑制2μM cGMP PDE活性，其IC50为1.6μM；在B峰中也抑制2.0μM cAMP PDE活性，其IC50为3.8μM(加入10μM咯利普兰的IC50为2.5μM)。
C.PDE A峰和新B峰活性的cGMP特异性
在存在或不存在Ca++或Ca++-CaM和/或EGTA的条件下，检测按上文IA部分所述的来自DEAE柱的各馏分的cGMP水解活性，在存在或不存在5μM cGMP的条件下，检测所述馏分的cAMP(0.25μMcAMP)水解活性。PDE A峰和B峰(第5-22馏分，见图1)都明显不水解cAMP，这表明它们都没有PDE的典型cAMP-水解家族(即PDE1、2、3)的活性。
Ca++(在或不存在钙调蛋白的情况下)不能激活A峰或B峰的cAMP或cGMP水解活性，cGMP不能激活或抑制cAMP水解。所述结果表明A和B峰构成了cGMP-特异性PDE活性，但不是典型的或以前已知的PDE1、PDE2、PDE3或PDE4活性。
如上所讨论的，对于新PDE B峰，环GMP激活该酶的cGMP水解活性，但不能激活任何cAMP活性(与上文IB部分的B峰相反)。这表明新PDE B峰--本发明新的磷酸二酯酶--不具有一种受cGMP--刺激的cAMP水解(“cGS”)或典型或以前已知的PDE2家族活性，因为已知的PDE2同种型即水解cGMP也水解cAMP。
D.A峰是一种典型PDE5，但新的B峰--一种新cGMP-特异性PDE-不是典型的PDE5
为了表征任何PDE同种型，应评估其动力学行为和底物偏好。
A峰表现出典型的“PDE5”特征。例如，该酶对cGMP的Km是1.07μM，其Vmax是0.16nM/分钟/mg。另外，如下文所讨论的，zaprinast(IC50＝1.37μM)，E4021(IC50＝3nM)，sildenafil抑制A峰活性。另外，zaprinast抑制A峰的cGMP水解活性，这与文献中报道的结果一致。
来自上文IA部分的PDE B峰与PDE A峰的动力学特性明显不同。例如，在A峰的Eadie-Hofstee图中，随底物浓度的增加，环GMP水解是一条有负斜率的直线，这是Michaelis-Menten动力学行为的标志。但是，在不存在减少的cAMP的条件下，B峰有新的cGMP水解特性(表观Km＝8.4)，随cGMP底物的增加，Eadie-Hofstee图的斜率增加(Km＜1)。
与动力学研究(即图3)和存在cGMP底物的条件下正协同动力学行为一致，随cGMP底物浓度的增加，cGMP水解活性增加。这是在第二次DEAE分离排除cAMP水解并排除该新酶是以前鉴定的PDE5后，在存在PDE B峰的条件下，通过比较0.25μM、2μM和5μM cGMP而发现的。如图2所示，较高浓度的cGMP使PDE B峰引起不成比例的较大程度的cGMP水解。
这些观察结果表明cGMP与B峰酶的结合引起该酶构型的改变。这证明了使用来自肿瘤形成细胞的天然酶的优点，但本发明不限于有上述特征的所述酶的天然形式。
E.相对于A峰，PDE B峰的Zaprinast-和Silednafil-不敏感性，以及其对其它PDE抑制剂的影响
用0.01-100μM的12种浓度的药物和0.25μM 3H-cGMP底物，研究不同PDE抑制剂。用不同斜率、采用Prism 2.01(GraphPad)的乙形曲线吻合法计算IC50值。结果列于表1。尽管化合物E4021和zaprinast抑制A峰，但是，用B峰的新PDE活性(上文IA部分)计算的IC50值(有高亲和性)显著增加(＞50倍)。这表明A峰是PDE5。这些数据进一步说明，对于所有实践目的来说，本发明的新PDE活性均是zaprinast不敏感和E4021不敏感的。
表1
A峰和上文IA部分B峰的PDE抑制剂的比较(cGMP水解)
Figure C9912181800171
相反，硫化舒林酸和化合物E以相同的效力竞争性抑制A峰和B峰(对于PDE A峰，IC50＝0.38μM；对于PDE B峰，IC50＝0.37μM)。
B峰(其任一种形式)是zaprinast-不敏感的，而A和B峰均对硫化舒林酸和化合物E敏感的这一事实，对于治疗肿瘤并选择有用的化合物用于所述治疗是极其重要的。我们已对zaprinast、E4021和sildenafil进行了试验，以确定它们是否可诱导肿瘤细胞的编程性细胞死亡或抑制肿瘤细胞的生长，我们对化合物E进行了相同的试验。如下文所解释的，zaprinast自身没有显著的编程性细胞死亡-诱导或生长-抑制特性，而硫化舒林酸和化合物E正相反。换句话说，一种化合物抑制PDEA峰和B峰的能力与其诱导肿瘤细胞中编程性细胞死亡的能力成正比，而如果一种化合物(如zaprinast)仅对PDE A峰是特异性的，则该化合物本身不能诱导编程性细胞死亡。
F.新的PDE B峰对与cGMP-依赖性蛋白激酶G一起保温不敏感
在存在不同浓度的cGMP-依赖性蛋白激酶G(可使典型的PDE5磷酸化)的条件下，根据其不同的cGMP-水解活性，来观察PDE A峰和新B峰(上文IA部分)之间的其它不同。具体地讲，在30℃，将来自上文IA部分中A峰和B峰馏分与不同浓度的蛋白激酶G一起保温30分钟。在试图磷酸化后，检测两个峰的环GMP水解。与以前公开的有关PDE5的资料一致，随与蛋白激酶G一起保温，A峰的cGMP水解活性增加，这表明A峰被磷酸化了。但是B峰没有变化(即未被磷酸化，并对与cGMP-依赖性蛋白激酶G一起保温不敏感)。这些数据与A峰作为已知PDE5家族的一种同种型相一致，而来自上文IA部分的B峰则具有一种新的cGMP-特异性PDE活性。
G.在前列腺和乳腺癌细胞系中的新B峰
用与上述从SW480中分离新B峰相似的方法，再从其它两种肿瘤细胞系乳腺癌细胞系HTB-26和前列腺癌细胞系LnCAP中分离新B峰。在一些方面对所述方法加以改进。为了提供更高的重复性以比较不同的细胞系，用Pharmacia AKTA FPLC来控制向18毫升DEAETrisAcryl M柱的上样和洗脱。用相同的方法，将SW480处理多次以提供B峰的参照。用200-400百万个SW480细胞作图。用70百万个LnCAP细胞作图(参见图22和23)，在另一试验中，用32百万个HTB-26细胞作图(参见图20和21)。将细胞重悬于匀浆缓冲液后，将样品手工匀浆。FPLC缓冲液A是8mM TRIS-醋酸，5mM醋酸镁，0.1mMEDTA，pH7.5；缓冲液B是8mM TRIS-醋酸，5mM醋酸镁，0.1mMEDTA，1M醋酸钠，pH7.5。将上清液以1mL/分钟的流速上载到柱上，然后用60毫升缓冲液A以1mL/分钟的流速洗涤。进行洗脱采用的梯度是60毫升0-15％缓冲液B，60毫升15-50％缓冲液B，和16毫升50-100％缓冲液B。在所述梯度洗脱期间，收集1.5mL馏分。在位于400mM醋酸钠的第65馏分前后洗脱下cGMP PDE活性峰(见图20-23)。用0.25μM cGMP测量该活性(表明cGMP的亚微摩尔亲和性)。咯利普兰，一种PDE4特异性药物，它抑制大部分cAMP PDE活性(即cAMP活性来自于PDE4)，这表明B峰的cGMP活性对cGMP的特异性超过对cAMP的。所有这三个B峰(来自SW480、HTB-26和LnCAP)都不受钙/钙调蛋白的刺激，对100nM E4021有抗性，E4021与zaprinast一样是一种PDE5-特异性抑制剂(见图20和22)。当底物从0.25μM增加至5μM cGMP时，B峰的活性明显增加(表明积极的合作动力学)(见图21和23)。另外，这三个峰被exisulind和化合物I的抑制也很相似。
II.一般与蛋白激酶G和β-连环蛋白有关
完成一系列试验以确定抗肿瘤的cGMP-特异性PDE抑制剂如exisulind对肿瘤细胞中的cGMP依赖性蛋白激酶G(PKG)有什么影响(如果有的话)，所述肿瘤细胞含有腺瘤息肉coli基因(即APC基因)缺陷或β-连环蛋白编码基因的缺陷。如下文所解释的，所述抑制剂可提高所述肿瘤细胞中的PKG活性。在含上述任一种缺陷的细胞中，所述活性的增加不仅是由于PKG激活作用的增加，而且还归因于含APC缺陷的细胞中PKG表达的增加。另外，当将来自具有任一缺陷的肿瘤细胞的PKG进行免疫沉淀时，它与β-连环蛋白一起沉淀。
β-连环蛋白与各种不同的癌症有关，因为研究人员已经发现在患肿瘤的患者中，其水平很高，所述肿瘤含有在APC肿瘤抑制基因中的突变。出生时，带有该基因缺陷的人常常会在其结肠衬中发展成数千小肿瘤。当其适当发挥功能时，APC基因编码正常APC蛋白，认为该蛋白与β-连环蛋白结合并调节β-连环蛋白。因此，发现含APC基因缺陷或β-连环蛋白缺陷的肿瘤细胞中的PKG与β-连环蛋白结合，这一发现确实有力地说明主要细胞途径之一中的PKG会导致癌症。另外，由于用SAAND治疗后，cGMP-特异性抑制作用与PKG增加之间的关系而将所述细胞中的cGMP与PKG/β-连环蛋白/APC缺陷联系起来。
含APC缺陷或β-连环蛋白缺陷的肿瘤细胞与SAAND接触后，观察到β-连环蛋白本身减少的结果进一步支持了后一种联系。β-连环蛋白的这种减少是由PKG本身引起的。PKG使β-连环蛋白磷酸化--这是与本发明有关的另一新的观察结果。β-连环蛋白的磷酸化可以β-连环蛋白被遍在蛋白-蛋白质体系统降解。
PKG对β-连环蛋白的磷酸化在肿瘤细胞中是很重要的，因为它绕开了APC和β-连环蛋白突变的影响。突变的APC蛋白质影响β-连环蛋白与突变的APC蛋白的结合，迄今为止，认为结合方面的变化抑制了GSK-3b激酶对β-连环蛋白的磷酸化。在突变β-连环蛋白的情况下，PKG活性的增加也可以使突变β-连环蛋白被磷酸化。通过用cGMP-PDE抑制作用来升高肿瘤中的PKG活性，可以使含任一种突变的肿瘤细胞中的β-连环蛋白被磷酸化(导致其降解)。
简而言之，这些发现不仅导致了鉴定其它SAAND候选化合物的新的药物筛选方法，而且还支持了cGMP-特异性PDE抑制作用在肿瘤治疗方法中的作用。如上文所解释的，该观察结果也可解释SAAND可抑制出人意料的宽范围的肿瘤，因为含和不含APC的肿瘤均可被治疗。
III.用PDEs筛选药物组合物
A.综述
本发明的新PDE和PDE2与或不与PDE5一起可用来鉴定用于治疗或预防肿瘤的化合物，所述化合物没有严重的副作用。
癌症和前癌被认为是与细胞生长失调有关的疾病。细胞生长涉及许多不同的因素。一方面是细胞如何快速增殖，另一方面是细胞如何快速死亡。根据环境刺激的类型，细胞可以因坏死或编程性细胞死亡而死亡。细胞分化是影响肿瘤生长动力学的另一因素。确定影响细胞生长的哪一种因素受化合物的影响，对于发现用于药物疗法的相关的治疗靶是非常重要的。以该技术为基础的筛选方法可以与其它检测方法相结合以筛选出有生长抑制和前编程性细胞死亡活性的化合物。
本发明是数个重要发现的产物。首先，本发明人发现理想的抑制肿瘤细胞生长抑制剂可通过编程性细胞死亡来诱导癌细胞的成熟前死亡(见，Piazza，G.A.，et a1.，Cancer Research，55(14)，3110-16，1995)。第二，数位本发明的发明人意外地发现了一些化合物，所述化合物选择性地诱导编程性细胞死亡，而基本上没有COX抑制作用，这些化合物还抑制PDE5。具体地讲，与以前的科学研究相反，治疗肿瘤性损伤的理想化合物可抑制PDE5(EC3.1.4.17)。PDE5是磷酸二酯酶至少10个基因家族中的一个。PDE5和本发明的新PDE是独特的，即它们选择性地降解环GMP，而不降解cAMP，而其它PDE家族选择性地降解/水解cAMP，而不降解cGMP或者非选择性地降解cGMP和cAMP。优选，用于治疗肿瘤的理想化合物基本上不抑制非选择性的或cAMP降解性磷酸二酯酶。
B.COX筛选
本发明优选的实施方案包括测定给定化合物的环加氧酶抑制活性，测定所述化合物的PDE5抑制活性。通过评估试验化合物的活性与特定截断值而直接地或通过将受试化合物的活性与用于治疗肿瘤损伤的已知化合物的活性加以比较而间接地，来评价试验化合物治疗肿瘤损伤的能力。已知可有效治疗肿瘤损伤而不会引起胃刺激的标准化合物是5-氟-2-甲基-1-(对-甲基磺酰基亚苄基)-3-茚基乙酸(exisulind)。其它可用于比较目的的有用的化合物包括已知抑制COX的那些化合物，如消炎痛和舒林酸：5-氟-2-甲基-1-(对-甲基磺酰基亚苄基)-3-茚基乙酸的硫化物代谢物(舒林酸硫化物)。其它用于比较目的的有用化合物包括已知抑制PDE5的那些化合物，如1-(3-氯苯胺基)-4-苯-2，3-二氮杂萘(MY5445)。
文中所用术语“前癌损伤”包括以异常肿瘤形成为代表的综合征，包括异型增生、组织改变。实例包括结肠、乳腺、前列腺或肺组织内的异型增生，或如异型增生痣综合征、皮肤恶性黑素瘤的前体等病症。除异型增生痣综合征外，实例还包括息肉病、结肠息肉、子宫的前癌损伤(即子宫异型增生)、食管、肺、前列腺异型增生、前列腺内肿瘤、乳腺和/或皮肤以及相关疾病(如actinic keraosis)，不论所述损伤在临床上是否是可鉴定的。
文中所用术语“癌”或“癌症”指癌性损伤。实例包括恶性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌。文中所用术语“肿瘤”和“瘤”指癌性的和前癌性损伤。
文中所用缩写PG指前列腺素；PS指前列腺素合成酶；PGE2指前列腺素E2；PDE指磷酸二酯酶；COX指环加氧酶；环核苷酸；RIA指放射性免疫检测。
可用两种方法中的任一种测定COX抑制作用。一种方法包括将完整HL-60细胞与待筛选化合物接触，然后测定HL-60细胞分泌PGE2的量。另一种方法包括在存在所述化合物的条件下，测量纯化的环加氧酶(COX)的活性。这两种方法涉及在以前的文献中描述过的操作方案，但优选的是下列方法。
通过测量PGE2，评估本发明的化合物，以确定其是否可抑制前列腺素E2(PGE2)的生产。通过采用用于PGE2的酶免疫检测(EIA)试剂盒(如从Amersham，Arlington Heights，IL USA购买的)测量细胞分泌的PGE2。适宜的细胞包括产生丰富PG的那些细胞，如HL-60细胞。HL-60细胞是人早幼粒细胞成熟粒细胞中，用DMSO分化。(参见Collins，S.J.Ruscetti，F.W.，Gallagher，R.E.and Gallo，R.C.，“Normal FuctionalCharacteristics of Cultured Human Promyelocytic Leukemia Cells(HL-60)After Induction of Differentiation By Dimethylsulfoxide”，J.Exp.Med.，149：969-974，1979)。在用钙离子载体A23187刺激后这些分化的细胞产生PGE2(参见Kargman，S.，Prasit，P.and Evans，J.F.，“Translocation ofHL-60 Cell 5-Lipoxygenase”，J.Biol.Chem.，266：23745-23752，1991)。HL-60细胞可从美国典型培养物保藏中心得到(ATCC：CCL240)。在37℃，5％CO2下，它们可在补加有20％热灭活胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中生长。为了诱导骨髓分化，将细胞与1.3％DMSO接触9天，然后洗涤并将之以3×106细胞/ml重悬在Dulbecco’s磷酸盐缓冲液中。
在存在所需浓度的受试化合物的条件下，于37℃将分化的HL-60细胞(3×106细胞/ml)保温15分钟。然后用A23187(5×10-6M)对细胞刺激15分钟。按上述测量分泌到外部培养基中的PGE2。
如上所述，评估化合物的COX抑制作用的第二种方法是在存在试验化合物的条件下，检测COX活性。文献已经报道有两种不同形式的环加氧酶(COX-1和COX-2)可调节前列腺素合成。已知COX-2代表COX的可诱导形式，而COX-1代表构成形式。采用按Boopathy &Balasubramanian所述(“Purification And Characterization Of SheepPlatelet Cyclooxygenase”(Biochem.J.，239：371-377，1988，该文献引入本文作为参考))从公羊精囊纯化的COX-1，通过Mitchell等描述的方法(“Selectivity of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs as Inhibitors ofConstitutive and Inducible Cyclooxygenase”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11693-11697，1993，该文献引入本文作为参考)可测量COX-1的活性。按Mitchell等(1993，同上文)所述，用从羊胎盘中纯化的COX-2可测量COX-2的活性。
用本领域已知的方法可测定药物的环加氧酶抑制活性。例如，Boopathy&Balasubramanian(1988，同上文)描述了一种方法，其中在37℃将前列腺素H合酶1(Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan)与100μM花生四烯酸(Sigma Chemical Co.)、辅因子(如1.0mM谷胱甘肽、1.0mM氢醌、0.625μM血红蛋白和1.25mM CaCl2，在100mMTris-HCl中，pH7.4)和待测药物一起保温20分钟。保温后，用三氯乙酸终止反应。通过加入硫代巴比土酸和丙醛终止反应后，可在530nm通过分光光度计测量酶活性。
显然，相对于其较大的PDE5/新PDE/PDE2组合抑制活性而言，表现出最小COX-1或COX-2抑制活性的化合物可能是合乎需要的化合物。
在存在和不存在试验化合物的条件下，通过比较环加氧酶的活性，来确定COX抑制的量。在约100μM有残留(即小于约25％)或没有COX抑制活性表示应进一步评估所述化合物是否可用于治疗肿瘤。
C.确定磷酸二酯酶抑制活性
用按上述分离出的酶、重组酶或者用新PDE和/或PDE2与PDE5一起，就对本发明新磷酸二酯酶的抑制作用来筛选化合物。或者，通过RIA测量全细胞中的环核苷酸水平并与未处理的和经zaprinast处理的细胞进行比较。
用本领域已知的方法，如用放射性3H环GMP(cGMP)(环3′，5′--鸟苷单磷酸)作为PDE酶的底物来测定磷酸二酯酶活性。(Thompson，W.J.Teraski，W.L.，Epstein，P.M.，Strada，S.J.，Advances in CyclicNucleotide Research，10：69-92，1979，该文献引入本文作为参考)。简言之，在共400μl体积中，将确定底物3H-cGMP比活性的溶液(0.2μM；100,000cpm；含40mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2和1mg/mlBSA)与待测药物混合。将混合物与本发明所分离的PDE一起在30℃保温10分钟。例如通过将反应混合物煮沸75秒钟来终止反应。在冰上冷却后，加入100μl 0.5mg/ml蛇毒(可从Sigma得到的O.Hannah蛇毒)，然后在30℃保温10分钟。然后通过加入例如1ml 100％甲醇来终止反应。将检测样品施加到1ml Dowex 1-X8柱上，用1ml 100％甲醇洗涤。然后用闪烁计数器测量背景和柱洗涤物中的放射性量。通过计算药物处理反应中的放射性量，然后与对照样品(不含试验化合物的反应混合物)进行比较来确定磷酸二酯酶抑制的程度。
另外，通过与待筛选化合物接触的肿瘤细胞中cGMP的增加，来反映本发明理想化合物抑制本发明磷酸二酯酶的能力。通过用放射性免疫检测法(RIA)来检测经处理的细胞提取物中环GMP的量可确定PDE活性的量。在该方法中，将HT-29或SW-480细胞铺开并使之生长至汇合。如上所述，SW480含有PDE5和本发明的新PDE，这样当用这种方式评估PDE活性时，同时可测量组合的cGMP水解活性。然后，将试验化合物以约200μM至约200pM的浓度，与细胞培养物一起保温。约24至48小时后，将细胞与培养基分开，然后溶解细胞。用0.2N HCl/50％MeOH终止反应。取样进行蛋白质检测。用阴离子交换色谱如Dowex柱，从细胞的酸/醇提取物中纯化环GMP。将cGMP干燥，按照公开的方法如用醋酸酐三乙胺溶液(Steiner，A.L.，ParkerC.W.，Kipnis，D.M.，J.Biol.Chem.，247(4)：1106-13，1971，该文献引入本文作为参考)进行乙酰化。用放射性免疫检测法(Harper，J.，Brooker，G.，Advances in Nucleotide Research，10：1-33，1979，该文献引入本文作为参考)定量分析经乙酰化的cGMP。在存在抗血清和适宜缓冲液的条件下，将衍生的环GMP的碘化配体(酪氨酸甲酯)与标准物或未知物一起保温。用环核苷酸半抗原介导的技术可生产抗血清。所述抗血清来自用琥珀酰-cGMP-白蛋白结合物注射的羊并以1/20,000进行了稀释。按以前所述(Seibert，A.F.，Thompson，W.J.，Taylor，A.，Wilbourn，W.H.，Barnard，J.and Haynes，J.，J.Applied Physiol.72：389-395，1992，该文献引入本文作为参考)使用标准曲线进行剂量插入和误差分析。
另外，将培养基酸化、冷却(-70℃)并进行cGMP和cAMP分析。
除观察到由所述理想化合物在肿瘤细胞中引起cGMP含量的增加外，还观察到cAMP含量的减少。已观察到特别理想的化合物(即选择性诱导肿瘤细胞的编程性细胞死亡，而基本上不诱导正常细胞的编程性细胞死亡的化合物)具有与cGMP特异性PDE抑制相一致的时间过程，这是一种在数分钟内导致cGMP含量增加的起始作用。第二，用理想的抗肿瘤化合物处理肿瘤细胞导致cAMP在24小时内减少。药物作用的细胞内靶还需进一步研究，但目前的数据表明开始时的cGMP含量增加和随后cAMP含量的减少都是在与理想化合物接触的肿瘤细胞中的编程性细胞死亡以前。
两种环核苷酸比例的变化是一种更精确地评估试验化合物的cGMP-特异性磷酸二酯酶抑制作用的工具，而不是仅仅测量cGMP的绝对值、cGMP-特异性磷酸二酯酶抑制作用，或者仅仅测量cGMP水解的水平。在未用抗肿瘤化合物处理的肿瘤细胞中，cGMP含量/cAMP含量的比例为0.03-0.05(即300-500fmol/mg蛋白质的cGMP含量比6000-8000fmol/mg蛋白质的cAMP含量)。与理想的抗肿瘤化合物接触后，由于开始的环GMP增加和随后环AMP的减少，该比例增加数倍(优选至少增加3倍)。
具体地讲，已观察到特别理想的化合物可以使处理过的肿瘤细胞中在起始时cGMP含量增加达到大于约500fmol/mg蛋白质的cGMP水平。另外，特别优选的化合物使处理过的肿瘤细胞中随后cAMP含量的减少达到小于约4000fmol/mg蛋白质的cAMP水平。
为了确定环AMP的含量，使用与上述用于cGMP的相似的放射性免疫检测技术。简而言之，用阴离子交换色谱从细胞的酸/醇提取物中纯化环核苷酸，干燥，按照公开的方法进行乙酰化并用放射性免疫检测法定量分析经乙酰化的cGMP。在存在抗血清和适宜缓冲液的条件下，将衍生的环AMP和环GMP的碘化配体与标准物或未知物一起保温。
通过确定完整细胞中环状核苷酸的转化或累积，可以验证环状核苷酸的含量。为测定完整细胞的cAMP，按照已经公开的方法，采用3H-腺嘌呤预标记(Whalin，M.E.，Garrett Jr.，R.L.，Thompson，W.J.，和Strada，S.J.“无细胞脑组织环核苷酸磷酸二酯酶活性与未处理的脑组织切片中环AMP衰减的相互关系”，Sec.Mess.and Phos.ProteinResearch，12：311-325，1989，作为参考引入本文)。该方法测定标记ATP到环AMP的转化量，它可以按照个别方案评价完整细胞腺苷酸环化酶或环状核苷酸磷酸二酯酶的活性。环GMP累积量太低而不能按照公开的方法用完整细胞预标记研究(Reynolds，P.E.，S.J.Strada和W.J.Thompson，“通过完整细胞标记测量肺微血管内皮细胞中环GMP的累积”《生命科学》60：909-918，1997，作为参考引入本文)。
化合物的PDE抑制活性作用也可以从组织样品中测定出来。从与试验化合物接触的受试体中采集人活组织切片或麻醉动物组织。简单地说，组织样品在500μl 6％的TCA中匀化。取出一定量的组织匀浆用于蛋白质分析。其余的匀浆放置于冰面上20分钟，以使蛋白沉淀。接着，匀浆在15,000g、4℃条件下离心30分钟。取出上清液，收集沉淀。上清液用5倍体积的水饱和乙醚洗四次。每次清洗时弃去上层醚层。水醚提取物在快速真空下干燥。干燥后，样品可以冷冻保存留作将来使用，或者立即使用。干燥提取物溶于500μl分析缓冲液。如上所述利用RIA法通过分析环核苷酸的量确定cGMP的特异性抑制量。
通过比较存在和缺乏化合物情况下新PDE的活性，确定抑制量。新PDE(或PDE2)活性的抑制表明化合物在治疗肿瘤中是有用的。当浓度为10μM或更低时，化合物的抑制活性明显高于基准物——exisulind，优选高出50％，表明应该进一步评价化合物的抗肿瘤性质。当进一步考虑化合物的应用潜力时，新PDE抑制的IC50值最好应当低于50μM。
D.测定A化合物是否降低了肿瘤细胞的生长
在一个替换实施例中，本发明的方法涉及进一步测定化合物是否降低了肿瘤细胞的生长。在依赖受测组织的样品中可以使用各种细胞系。例如，上述细胞系包括：SW-480-结肠腺癌；HT-29-结肠腺癌；A-427-肺腺癌；MCF-7-乳腺癌；和UACC-375-黑素瘤系；以及DU145-衰竭性癌。通过这些细胞系获得的细胞毒性数据显示出对肿瘤损伤的抑制作用。这些细胞系的特征已有详细描述，并且美国国家癌症研究所在他们筛选抗癌药物的程序中用到这些细胞系。
可以利用从ATCC得到的HT-29人结肠癌细胞系测定化合物抑制肿瘤细胞生长的能力。HT-29细胞以前曾作为相关结肠癌细胞培养模型描述(Fogh，J.，和Trempe，G.离体人肿瘤细胞，J.Fogh(编)，Plenum Press，New York，115-159页，1975)。HT-29细胞在添加5％胎牛血清(Gemini生物制品有限公司，Carlsbad，CA)、2mm谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌剂的RPMI培养基中，在95％空气、5％二氧化碳的潮湿大气下，于37℃维持培养。简要地说，HT-29细胞在96孔的微量滴定平板上铺板，密度为500个细胞/孔，在添加化合物之前，先于37℃培养24小时。每次测定细胞数目重复六遍。培养六天后，加入冷三氯乙酸至终浓度为10％，固定细胞，利用Skehan，P.，Storeng，R.，Scudiero，D.，Monks，A.，McMahon，J.，Vistica，D.，Warren，J.T.，Bokesch，H.，Kenney，S.，和Boyd，M.R.，(“用于抗癌药物筛选的新的比色分析法”天然癌症研究杂志，82：1107-1112，1990，作为参考引入本文)描述的硫氰酸胺B(SRB)蛋白染色比色分析法测定蛋白浓度。
除了SRB分析法，很多其他方法也可以用来测定生长抑制，并且可以代替SRB分析法。这些方法包括锥虫蓝染色后统计活细胞数、用BrdU或放射性标记的胸苷标记能够进行DNA合成的细胞、活细胞的中性红染色、或者活细胞的MTT染色。
当剂量为100μM或更低时，高出约50％的显著的肿瘤细胞生长抑制进一步显示，化合物在治疗瘤变中是有用的。最好，测定IC50值，其目的是用于比较。该值是化合物相对于对照抑制肿瘤细胞生长达50％时需要的药物的浓度。当考虑化合物进一步用于治疗瘤变的应用潜力时，IC50值优选应当低于100μM。
E.测定化合物A是否诱导编程性细胞死亡
在第二个替换实施例中，本发明的筛选方法进一步包括测定化合物是否诱导肿瘤细胞培养物的编程性细胞死亡。
可以通过形态学和生化标准描述细胞死亡的两种不同形式：坏死和编程性细胞死亡。坏死伴随着原生质膜的渗透性增加；细胞涨大，随后原生质膜在几分钟内破裂。编程性细胞死亡的特征在于气泡状膜、细胞质浓缩和内源性核酸内切酶激活。
在正常组织更新过程中和胚胎的器官和四肢形成过程中发生自然编程性细胞死亡。细胞毒性T-淋巴细胞和自然杀伤细胞、电离辐射和某些化疗药物也可以诱导编程性细胞死亡。然而非适宜性的编程性细胞死亡调节在一些包括癌症、AIDS、或Alzheimer′s病等的病理状态下发挥重要作用。可以利用在上述条件下维持生长的肿瘤细胞培养物筛选诱导编程性细胞死亡的化合物。用试验化合物处理细胞包括前期加入培养物或者后期加入培养物，以各种浓度处理2-7天。分别测定培养物的附着单元和“漂浮”单元中的编程性细胞死亡细胞。通过除去上清液收集这两个单元，用胰蛋白酶处理附着细胞，混合这两种配制品，随后是离心冲洗步骤(10分钟，2000rpm)。为获得明显的细胞编程性细胞死亡量，已有文献描述用舒林酸和相关化合物处理肿瘤细胞培养物(参见，Piazza，G.A.等，癌症研究，55：3110-16，1995，作为参考引入本文)。新的特征包括收集漂浮细胞和附着细胞，确定可观察到编程性细胞死亡的最优处理时间和剂量范围，确定优化细胞培养条件。
用化合物处理之后，可以用丫啶橙和溴乙啶标记，然后通过荧光显微镜分析培养物的编程性细胞死亡和坏死。测定编程性细胞死亡细胞数的方法以前已经由Duke和Cohen描述过，参见“细胞编程性细胞死亡的形态学和生化分析方法”《免疫学当代方法》Coligan等编，3.17.1-3.17.16(1992，通过参考引入本文)。
例如，可以通过胰蛋白酶处理收集漂浮细胞和附着细胞，然后在PBS中冲洗三次。可以离心分离出细胞部分。然后沉淀重悬浮于培养基和PBS中配制的含丫啶橙和溴乙啶的染料混合物中，然后轻轻混匀。然后混合物放置于显微镜载玻片上，检查细胞编程性细胞死亡的形态学特征。
也可以通过测定试验化合物处理过的细胞中的DNA片段的增加，来定量编程性细胞死亡。用于定量测定离体细胞质组蛋白相关-DNA-片段(单和寡核小体)的商业光度测定EIA已有提供(细胞死亡检测ELISAokys，Cat.No.1,774,425，Boehringer Mannheim)。BoehringerMannheim分析法基于间接酶免疫分析原理，分别使用定向抗DNA和组蛋白的鼠单克隆抗体。它可以专属性测定细胞溶解产物的细胞质碎片中的单和寡核小体。
按照厂家介绍的方法，以下列模式测定编程性细胞死亡。样品(溶胞液)置于链霉抗生素蛋白涂层的微滴定平板(“MTP”)中。随后，加入配对的抗组蛋白生物素和抗DNA过氧化酶混合物，保温2小时。保温期间，抗组蛋白抗体结合到核小体的组蛋白成分上，同时免疫复合物通过生物素标记固定到链霉抗生素蛋白涂层的MTP中。另外，抗DNA过氧化酶抗体与核小体的DNA成分反应。通过冲洗步骤除去未结合的抗体后，通过保留在免疫复合物中的过氧化酶测定核小体的量。用ABTS7(2，2′-叠氮基-[3-乙基苯噻唑啉-磺酸盐])作为底物光比色测定过氧化酶。
例如，SW-480结肠腺癌细胞以每孔10000个细胞的密度在96孔MTP中铺板。然后用试验化合物处理细胞，并在37℃培养48小时。培养后，MTP离心，除去上清液。然后各孔中的细胞沉淀重悬浮于溶胞缓冲液30分钟。然后离心溶胞液，上清液部分(即，细胞质碎片)转移到链霉抗生素蛋白涂层的MTP中。需要注意不能震摇起MTP中的溶胞沉淀(即，含高分子量未成片段的DNA的细胞核)。然后分析样品。
测定以给定浓度试验的每个化合物的刺激倍增化(foldstimulation)(FS＝ODmax/ODveh)，它是编程性细胞死亡反应的指标。也可以通过评价试验化合物的一系列浓度确定EC50值。
统计学上编程性细胞死亡效果显著增加(即，浓度为100μM时刺激倍增比大于2)，进一步表明化合物在治疗肿瘤损伤时有用。当进一步考虑化合物治疗肿瘤损伤的应用潜力时，其表示编程性细胞死亡活性的EC50值最好应当低于100μM。此处，EC50值定义为：相对于溶媒处理，诱导50％编程性细胞死亡的化合物浓度。
F.乳腺器官培养模型试验
通过上述方法鉴定的试验化合物，可以通过它们抑制乳腺器官培养系统中早期肿瘤损伤的发生率，来检测其抗肿瘤活性。这种鼠乳腺器官培养技术已经由其他研究者成功地用于研究抑制抗肿瘤试剂例如某些NSAID、类维生素A、他莫昔芬、硒、和某些天然产物的效果，该技术有效地保证了本发明的筛选方法。
例如，用雌二醇和黄体酮的混合物每日处理雌性BALB/c鼠，以便使与体外激素反应的腺体饱满。处死动物，无菌条件下切下胸部乳腺，在添加胰岛素、催乳素、氢化可的松、和醛甾酮的生长培养基上培养10天。培养基中加入DMBA(7，12-二甲基苯并蒽)，以诱发癌症前期损伤的形成。然后将完全成熟腺体脱离催乳素、氢化可的松、和醛甾酮的支持，导致腺体的衰退，而不是癌症前期损伤。
试验化合物溶解于DMSO，加入培养过程中的培养基。培养末期，腺体用10％福尔马林固定，用明矾卡红染色，在玻璃片上制作标本。形成乳腺损伤的发生率为乳腺损伤腺体和无损伤腺体的比值。比较由试验化合物处理腺体的乳腺损伤发生率和未处理腺体的乳腺损伤发生率。
乳腺损伤占据的面积范围可以通过将腺体图像投射到数字比衬垫上定量。腺体覆盖的面积描记在衬垫上，计作100％的面积。每个由无衰退结构覆盖的空间也描记到数字比衬垫上，然后通过计算机定量。
试验结果
在各种试验方案中检测了一系列化合物，并筛选其中具有治疗肿瘤应用潜力的化合物。这些试验的结果记录如下。此后试验化合物以字母代码指示下列相应化合物。
A-外消旋-苏-(E)-1-(N，N’-二乙基氨基乙硫基)-1-(丁-1’，4’-交酯基(olido))-[3’，4’：1，2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-2，3-二氢化茚；
B-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3，4，5-三甲氧基亚苄基)-3-乙酸；
C-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(对氯亚苄基)-3-乙酸；
D-外消旋-(E)-1-(丁-1’，4’-交酯基)-[3’，4’：1，2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-1S-2，3-二氢化茚基-N-乙酰半胱氨酸；
E-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3，4，5-三甲氧基亚苄基)-3-茚基-N-苄基乙酰胺；
F- Z)-5-氟-2-甲基-1-(对甲基磺酰基亚苄基)-3-茚基-N，N’-二环己基乙酰胺；
G-ribo-(E)-1-三唑并-[2’，3’：1″，3″]-1-(丁-1’，4’-交酯基)-[3’，4’：1，2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-2，3-二氢化茚；和
H-外消旋-(E)-1-(丁-1’，4’-交酯基)-[3’，4’：1，2]-6-氟-2-甲基-3-(对甲基磺酰基亚苄基)-1S-2，3-二氢化茚基-谷胱甘肽。
实施例1-COX抑制分析法
按照COX分析法(同上)的方案分析参比化合物和试验化合物的COX抑制活性。图4显示各种浓度的硫化舒林酸和exisulind对纯化环氧化酶(1型)活性的影响。如同以前的描述(Mitchell等，同上)，采用来源于公羊精囊中的纯化环氧化酶测定环氧化酶的活性。计算出硫化舒林酸的IC50值为1.76μM，而exisulind的IC50值为10000μM。这组数据表明硫化舒林酸是COX-I抑制剂，而exisulind不是。COX-2同功酶得到类似的数据(Thompson，等，国家癌症研究所杂志，87：1259-1260，1995)。
图5显示试验化合物B和E对COX的抑制作用。测定了图4显示的化合物的COX活性。数据显示试验化合物B和E都不能显著地抑制COX-I。
表2一系列化合物的环氧化酶抑制活性
Figure C9912181800331
按照上述方案，化合物A到E的COX抑制活性的评价如上表2所示。发现化合物C在剂量为100μM时，COX抑制率高于25％，因此，它不能用于进一步筛选。
实施例2-cGMP PDE抑制分析法
按照上述分析方法的方案，分析参比化合物和试验化合物的cGMPPDE抑制活性。图6显示各种浓度的硫化舒林酸和exisulind对从人结肠HT-29肿瘤细胞培养物中纯化出来的PDE4和cGMP PDE活性的影响，PDE4和cGMP PDE的纯化方法同以前的描述(W.J.Thompson等，同上)。硫化舒林酸抑制PDE4的IC50值为41μM，抑制cGMP PDE的IC50值为17μM。exisulind抑制PDE4的IC50值为181μM，抑制cGMPPDE的IC50值为56μM。这组数据表明硫化舒林酸和exisulind都抑制磷酸二酯酶活性。这两种化合物都表现出对cGMP PDE同功酶的选择性高于PDE4同种型。
图7显示硫化舒林酸对cGMP或cAMP产生的影响作用，cGMP或cAMP按照上述分析方法在培养的HT-29细胞中测定。HT-29细胞用硫化舒林酸处理30分钟，用常规放射免疫分析法测定cGMP或cAMP。结果表明，硫化舒林酸使cGMP水平增加超过50％，EC50值为7.3μM(图7A)。cAMP的水平不受化合物处理影响，然而一种公知PDE4抑制剂——咯利普兰，增加了cAMP水平(图7B)。数据论证了相对于PDE4，抑制cGMP PDE具有更重要的药理学意义。
图8显示标示量的试验化合物B对cGMP PDE和PDE4磷酸二酯酶同功酶的影响。计算出cGMP PDE的IC50值为18μM，PDE4的IC50值为58μM。
图9显示标示量的试验化合物E对PDE4和cGMP PDE的影响。计算出cGMP PDE的IC50值为0.08μM，比PDE4的IC50值高25μM。
表3  一系列化合物的cGMP PDE抑制活性
如上面方案中的描述，评价表3中化合物的PDE抑制活性。不能够抑制COX的化合物中，仅发现化合物E在10μM时产生超过50％的抑制率。从图8中注意到，化合物B在剂量为20μM时显示超过50％的抑制率。因此，根据单剂量试验使用的剂量水平，可以筛选出在略微较高剂量时可能具有活性的某些化合物。使用的剂量是主观的，当在某一剂量水平发现活性化合物后，可以降低使用剂量，以便筛选出甚至更强效的化合物。
实施例3-编程性细胞死亡分析
按照上面的分析方案，分析参比化合物和试验化合物的新PDE抑制活性。按照这些方案，图10显示硫化舒林酸和exisulind对编程性细胞死亡性和坏死性细胞死亡的影响。用标示量的硫化舒林酸和exisulind处理HT-29细胞6天。如同以前的描述测定编程性细胞死亡性和坏死性细胞死亡(Duke和Cohen，当代免疫学试验方法，3.17.1-3.17.16，New York，John Wiley和Sons，1992)。数据表明硫化舒林酸和exisulind都能够促使编程性细胞死亡性细胞死亡，而不诱导细胞坏死。所有的数据从相同试验中得到。
图11显示硫化舒林酸和exisulind对通过DNA断裂测定的肿瘤生长的抑制作用和编程性细胞死亡的诱导作用。上图(11A)：exisulind的生长抑制(空心符号，左轴)和DNA断裂(实心符号，右轴)。下图(11B)：硫化舒林酸的生长抑制(空心符号，左轴)和DNA断裂(实心符号，右轴)。用SRB分析法测定处理6天后的生长抑制。处理8天后测定DNA断裂。所有数据从相同试验中得到。
图12显示化合物E诱导编程性细胞死亡的特性。HT-29结肠腺癌细胞用标示浓度的化合物E处理48小时，用DNA断裂分析法测定编程性细胞死亡。计算出EC50值为0.05μM。
图13显示化合物B诱导编程性细胞死亡的特性。HT-29结肠腺癌细胞用标示浓度的化合物B处理48小时，用DNA断裂分析法测定编程性细胞死亡。计算出EC50值约为175μM。
表4  一系列化合物的编程性细胞死亡诱导活性
Figure C9912181800361
按照上述倍数诱导方案，试验了化合物A到E的诱导编程性细胞死亡活性，结果如上表4所示。当剂量为100μM时，化合物B、C和E表现出显著的编程性细胞死亡诱导活性，超过2.0倍。当然这三个化合物在此剂量下，仅化合物B和F不抑制COX但是抑制cGMP-特异性PDE。
测定了一系列磷酸二酯酶抑制剂的诱导编程性细胞死亡活性。数据在下表5中列出。HT-29细胞用各种磷酸二酯酶抑制剂处理6天。按照上述试验方法用丫啶橙和溴乙啶标记后，从形态学上确定编程性细胞死亡和坏死。数据表明新cGMP-特异性PDE对于筛选诱导HT-29细胞编程性细胞死亡的化合物有利。
表5  PDE抑制剂的编程性细胞死亡诱导数据
Figure C9912181800371
实施例4-生长抑制分析法
按照上面的分析方案，分析参比化合物和试验化合物的PDE5抑制活性。图14显示各种浓度的硫化舒林酸和exisulind对HT-29细胞生长都有抑制作用。如指示用各种剂量exisulind(三角形)或硫化舒林酸(方块形)处理HT-29细胞6天。如以前的描述，利用硫氰酸胺分析法测定细胞数目(Piazza等，癌症研究，55：3110-3116，1995)。硫化舒林酸的IC50值约为45μM，exisulind约为200μM。数据表明硫化舒林酸和exisulind都能够抑制肿瘤细胞生长。
图15显示硫化舒林酸的生长抑制活性和诱导编程性细胞死亡活性。记载的时间曲线试验包括用溶媒——0.1％的DMSO(空心符号)或硫化舒林酸120μM(实心符号)分别处理HT-29细胞。通过锥虫蓝染色后记活细胞数确定生长抑制状况(15A，上图)。如以前的描述(Duke和Cohen，当代免疫学试验方法，3.17.1-3.17.16，New York，John Wiley和Sons，1992)，通过丫啶橙和溴乙啶染色后进行形态学鉴定，测定编程性细胞死亡(15B，下图)。数据表明硫化舒林酸能够抑制肿瘤细胞生长，同时该作用伴随着编程性细胞死亡的增加。所有的数据从相同试验中得到。
图16显示试验化合物E的生长抑制活性。用标示浓度的化合物E处理HT-29结肠腺癌细胞6天，用SRB法测定细胞数目。计算出IC50值为0.04μM。
表6  一系列化合物的生长抑制活性
Figure C9912181800381
按照前面的筛选方案，检测化合物A到E的生长抑制活性，结果如上表6所示。所有试验化合物均显示活性超过100μM单剂量试验。
测定了一系列磷酸二酯酶抑制剂的生长抑制活性。数据如下表7所示。用各种磷酸二酯酶抑制剂处理HT-29细胞6天。用上述SRB法测定细胞生长。上面试验得到的数据表明新PDE的抑制剂对于抑制肿瘤细胞生长有效。
表7  PDE抑制剂的生长抑制数据
Figure C9912181800391
为了表明这种筛选方法对各种形式的肿瘤都有效，对大量细胞系进行化合物试验。测定了硫化舒林酸和exisulind对各种细胞系的影响作用。数据如表8所示。用SRB法测定IC50值。数据表明这些化合物对很宽范围的肿瘤表现出广泛有效性，有效性在可比较的剂量范围内。因此，通过本发明验证和选择的化合物对于治疗多种形式的肿瘤应该是有用的。
表8  多种细胞系的生长抑制数据
Figure C9912181800401
*利用Schmid等描述的中性红法测定(AACR汇编，39卷，第195页，1998)。
实施例5-乳腺器官培养模型中的活性
图17显示舒林酸代谢物抑制乳腺器官培养物中的癌症前期损伤。乳腺器官培养试验按照以前的描述进行操作(Mehta和Moon，《癌症研究》，46：5832-5835，1986)。结果证明舒林酸和exisulind有效地抑制癌症前期损伤的形成，而硫化舒林酸无效。这组数据支持这样一个假设：环氧化酶抑制作用对于所需药物的抗肿瘤性质不是必须的。
分析
为了筛选治疗肿瘤的化合物，本发明提供了一种对从若干试验方案中得出的试验化合物的试验数据进行比较的基本原理。本发明的构思中，试验化合物可以根据它们治疗人类肿瘤的应用潜力分级。具有理想效果的化合物可以筛选出来进行进一步试验，随后应用于人类。
各种试验化合物和这几种试验方案的定量数据显示于下表9中。数据显示exisulind、化合物B和化合物E表现出合适的活性，通过四次分析的筛选：无COX抑制作用、具有有效的cGMP-特异性PDE抑制作用、生长抑制和诱导编程性细胞死亡。这些化合物在乳腺器官培养物中的活性证实本发明的有效性。筛选方案的定量评价确定化合物E最佳、其次是化合物B，然后是exisulind。
表9  各种化合物的活性谱
Figure C9912181800411
表9的代码：化合物活性的评价基于一系列包括测试最大活性和效力的试验。
-无活性
+微弱活性
++中度活性
+++较高活性
++++高度活性
同时还公开了一种新的PKG活性分析法，该方法用在本发明的筛选方法中，并且它在分析其他目的的PKG活性中具有较高的通用性(例如，研究PKG在正常细胞功能中的作用)。作为解释的目的，当描述PKG活性在确定一种化合物是否具有治疗肿瘤的应用潜力的药物评价中如何有用之前，首先描述PKG分析方法是有用的。新的PKG分析法
本发明的新的PKG分析法涉及将多个氨基酸序列结合到一个固相上，每个氨基酸序列都至少含有cGMP结合区和5型磷酸二酯酶(“PDE5”)磷酸化位点。这些序列是已知的，在下面描述。结合的PDE5序列优选不包括下述PDE5的催化片段。将PDE5序列结合到固相上的一种方法是作为PDE5序列和一种氨基酸结合对之一的融合蛋白表达这些序列，然后将这种氨基酸结合对的另一个成分化学连接到固相(例如，小珠)上。可以使用的一种结合对是谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)和谷胱甘肽(“GSH”)，GST作为与上述PDE5序列的融合蛋白表达，GSH公价结合到固相上。在这种模式中，可以如下述通过将包含融合蛋白的溶液浸过固相，即可使PDE5序列/GST融合蛋白简单地结合到固相上。
RT-PCR法用于获得PDE5的cGB区，其中使用根据牛PDE5AcDNA序列设计出来的正向和反向引物(McAllister-Lucas L.M.等，生物化学杂志，268：22863-22873，1993)并在PDE1-10组中进行选择。总RNA的5′-3′，Inc.试剂盒以及其后mRNA的寡(dT)柱纯化用HT-29细胞进行。使用正向引物(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G，203-227)和反向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG，1664-1686)合成1484bp的片段，该片段编码磷酸化位点以及人PDE5A的低亲合和高亲合cGMP结合位点(203-1686bp，cGB-PDE5)。合成的cGB-PDE5核苷酸片段编码494个氨基酸，它与牛PDE5有97％的相似性。然后用tac启动子以及EcoRI和XhoI切割位点，将它克隆到pGEX-5X-3谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合载体(Pharmacia Biotech)上。然后将融合载体转染到E.Coli BL21(DE3)细菌中(Invitrogen)。转染的BL21细菌生长到对数生长期时，加入IPTG作为诱导子。诱导在20℃进行24小时。收获细菌并溶解细菌。细胞溶解产物的溶液部分加入GSH结合的Sepharose 4B(GSH-Sepharose 4B)保温。GST-cGB-PDE5融合蛋白可以结合到GSH-Sepharose小珠上，其他蛋白用大量冷PBS从小珠上洗脱。
表达出来的GST-cGB-PDE5融合蛋白在7.5％的SDS-PAGE凝胶上显示为85Kd的蛋白。它表现出其cGMP结合特性和能够被蛋白激酶G和A磷酸化的特性。它显示具有两个cGMP结合位点，Kd为1.6±0.2μM，该值接近其来源牛的PDE5，Kd＝1.3μM。在结合GSH的Sepharose小珠上的GST-cGB-PDE5可以用cGMP-依赖蛋白激酶和cAMP-依赖蛋白激酶A在体外磷酸化。用PKD进行的GST-cGB-PDE5磷酸化中，Km为2.7μM，Vmax为2.8μM，而BPDEtide磷酸化的Km为68μM。PKG的磷酸化显示一分子磷酸插入一分子GST-cGB-PDE5蛋白的比例。
为了用上述PDE5-结合固相分析可能含有PKG的液体样品，将样品和固相与含有32P-γ-ATP的磷酸化缓冲液混合。溶液在30℃保温30分钟，那么如果存在PKD，通过PKG进行的PDE5序列的磷酸化将得以发生。然后从溶液中分离固相(例如，通过离心或过滤)，用磷酸盐缓冲液(“PBS”)冲洗除去所有残留溶剂同时除去所有未反应的32P-γ-ATP。
然后可以直接检测固相(例如，液体闪烁计数器)，以验证是否插入32P。如果插入了，表明样品含有PKG，因为PKG已将PDE5磷酸化。如果PDE5通过上述融合蛋白结合，含PDE5的融合蛋白可以用SDS缓冲液从固相上洗脱下来，然后洗脱液可以用于分析是否插入32P。如果具有存在其它蛋白的可能性，该方法显得尤其有利，因为可以处理洗脱液(例如，通过凝胶分离)以分开各种蛋白，从而可以分析融合蛋白组分的32P插入状况。磷酸化的融合蛋白可以用SDS缓冲液从固相洗脱下来，随后进一步通过电泳分辨。如果进行凝胶分离，可以对蛋白染色以便看到蛋白的位置，融合蛋白PDE5部分通过PKG的32P磷酸化可以通过与凝胶接触的X线胶片曝光测定。如果X线胶片上可以观察到32P，表明含有PKG的原始样品中存在PKG，其将从固相上洗脱下来的融合蛋白的PDE5部分磷酸化。
在该分析方法中，最好应当在分析缓冲液中加入过量(例如，100倍)蛋白激酶抑制剂(“PKI”)，它可以特异地和强烈地抑制蛋白激酶A(“PKA”)而不抑制PKG。对PKA的抑制是需要的，因为PKA也可能对PKG底物(例如，PDE5)进行磷酸化。通过加入PKI，将完全取消PKA磷酸化的作用，检测到的全部磷酸化将十分接近PKG自身的磷酸化。
可以制作用于本发明分析方法的试剂盒，该试剂盒含有下列预先包装好的置于单独容器中的试剂：
1.溶胞缓冲液：50mM Tris-HCl，1％NP-40，150mM NaCl，1mMEDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF，500μM IBMX，蛋白酶抑制剂。
2.蛋白激酶G固相基质：重组GST-cGB-PDE5结合的Sepharose4B(50％悬液)。
3.2×磷酸化缓冲液：32P-γ-ATP(3000 mCi/mmol，5-10μCi/次分析)，10mM KH2PO4，10mM K2HPO4，200μM ATP，5mM MgCl2。
4.PKA蛋白激酶I抑制剂。
试剂盒中还可以包括进行上述反应的一次性容器等。
根据上面的描述，分析领域的技术人员很容易想出多种将所述分析步骤调整为其他步骤的方法。简短地说，利用至少一部分PDE5(或者任何可以由PKG选择性磷酸化的其它蛋白)，即可以用经标记的磷酸化试剂，通过评价可磷酸化蛋白的磷酸化作用确定PKG的存在和相对含量(与对照相比)。
SAAND促进肿瘤细胞中PKG活性增加
利用上述PKG分析法，进行下面的试验，以证实SAAND通过增加经SAAND处理的肿瘤细胞中PKG的表达或者增加cGMP水平(或者使二者都增加)，从而促进PKG活性的增加。
试验步骤
评价了两种不同类型的PDE抑制剂对肿瘤细胞中PKG的影响。对于SAAND，选择评价exisulind，因为它具有抗肿瘤作用。对于非-SAAND型的典型PDE5抑制剂，选择评价E4021，以确定PKG的增高是否仅由于典型的PDE5抑制作用，或者PKG的增高是否涉及SAAND抑制PDE5和一种新的PDE的前编程性细胞死亡作用，上述新的PDE在Liu等人于1998年10月15日申请的美国专利申请No.09/173375中公开。
为了检测cGMP-特异性PDE抑制作用对含APC突变的肿瘤的影响，使用SW480结肠癌细胞。已知SW480含有APC突变。将约5百万个SW480细胞分散于含5％血清的RPMI中，并将之分置于8个培养皿中：
2个10cm培养皿——30μL DMSO溶媒对照(没有药物)，
3个10cm培养皿——溶于DMSO中的200μM、400μM、600μM exisulind
3个10cm培养皿——E4021；溶于DMSO中的0.1μM、1μM、10μM。
平皿在37℃，5％CO2的恒温箱中保温48小时。
将液体培养基从平皿中吸出(细胞将自动附着到平皿上)。每个平皿中的附着细胞用冷PBS冲洗，各皿均加入200μL溶胞缓冲液(即，50mM Tris-HCl，1％NP-40，150 mM NaCl，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF，含有蛋白酶抑制剂的500μM IBMX)。加入溶胞缓冲液后，立即从每个平皿上刮下细胞以收集溶解的细胞。将各皿中的细胞溶解产物分别转移到微量离心管中，将微量离心管在4℃保温15分钟，同时轻轻震摇微量离心管，以使细胞溶解完全。完全溶解后，全速离心(14000r.m.p.)微量离心管15分钟。将各微量离心管的上清液转移到一个新的微量离心管中。
然后对每个微量离心管中的内容物进行蛋白质分析，因为如果药物抑制细胞生长，对照中的总蛋白量将高于经药物处理的样品中的总蛋白量。显然，如果药物不起作用，经药物处理的样品中的总蛋白量应该基本上与对照相同。在上述情况下，对照和E-4021微量离心管需要稀释，以使它们符合经高剂量exisulind处理的样品的标准(exisulind的较低剂量组应该达到最高剂量exisulind样品的标准)。因此，进行蛋白分析之后，各种样品的总蛋白浓度应当标准化(例如，通过稀释)。
对每个浓度的药物和对照，分别进行两次PKG分析，一次加cGMP，一次不加cGMP，详细描述该分析如下。进行这两次不同PKG分析的原因在于cGMP特异地激活PKG。当通过本发明的新PKG法分析PKG活性时，研究者不能确定是否所有PKG活性的增加都是由于细胞中cGMP的增加引起(可能通过cGMP-特异性PDE抑制作用实现)，或者PKG活性水平的升高是否是由于PKG蛋白的表达量增加引起的。通过测定同一样品在加和不加cGMP时其PKG的活性，研究者可以确定PKG活性是否增加，如果增加了，该增加是否是由于PKG的表达量增加引起的。因此，如果一种抗肿瘤药物相对于对照促使PKG活性增高，研究者可以基于以下两点确定经药物处理的样品中，药物诱导的PKG活性的增加是否是由于PKG蛋白的表达量增加所致(而不是活化作用)，如果(1)加入额外cGMP的经药物处理的样品与加入额外cGMP的对照样品相比，表现较高的PKG活性，并且(2)没有加cGMP的经药物处理的样品相对于对照也表现较高的PKG活性。
之后，制备加和不加cGMP的平行样品，将各50μL的细胞溶解产物分别加入20μL上述的PDE5/GST固相底物悬液中。对于进行评价的各对照或药物细胞溶解产物样品，分别向各混合物中加入含10μCi32P-γ-ATP的磷酸化缓冲液(200μM ATP，4.5mM MgCl2，5mMKH2PO4，5mM K2HPO4)，以此开始反应。将所得到的混合物在30℃保温30分钟。然后离心混合物以分离出固相，弃去上清液。各管中的固相用700μL冷PBS冲洗。将Laemmli样品缓冲液(BIO-Rad)(30μL)加入固相。将混合物煮沸5分钟，装载到7.5％SDS-PAGE上。将凝胶在150V电泳1小时。所获得的谱带用考马斯亮蓝染色，如果存在的话，即可以看到85Kd的GST-PDE5融合蛋白色带。将凝胶干燥，然后将凝胶置于X线胶片上，如果PDE5已经磷酸化，那么胶片将显示相应的黑色条带。各带的暗度与磷酸化程度相关。
如图18A和18B所示，SAAND exisulind以剂量依赖性模式使加和不加cGMP的样品的PKG活性相对于加和不加cGMP的对照样品均增高。这通过经各药物处理的样品中出现较黑85 Kb带的现象得以证实。另外，分析中加入cGMP的经exisulind处理的SW480样品相对于用exisulind单独处理样品(即不加cGMP)，表现出较高的PKG磷酸化活性。因此，当SAAND抑制cGMP-特异性PDE时，经药物处理的样品中PKG活性的增加就不仅仅是因为胞内cGMP增加导致的PKG激活，在含APC突变的肿瘤形成中，PKG活性的增加还源于PKG表达量增加。
经E4021处理的SW480样品相对于对照也不表现PKG激活作用(见图18A和18B)的事实表明，在含APC突变的肿瘤中，SAAND引起的PKG活性增加不仅仅是由于典型PDE5的抑制。
在评价PKG活性的分析技术中，可以不必如上述与X-射线胶片接触来评价SDS胶上的85Kd蛋白的磷酸化程度，而可以通过从凝胶上切下该色带，在32P视窗中用闪烁(β)记数仪记录所切下的色带中掺入的所有32P的量。
为了检测cGMP特异性PDE抑制作用对含β-连环蛋白突变的肿瘤的影响，使用HCT116结肠癌细胞。已知HCT116结肠癌细胞含有β-连环蛋白突变，而不含APC突变。
使用如上述关于SW480所用的方法同样的程序培养HCT116细胞。该实验中，仅使用exisulind和对照。经exisulind处理的细胞相对于对照产生较大程度磷酸化的PKG，表明在经药物处理的细胞中出现的PKG活化作用与APC突变无关。
因此，为本发明目的，我们在权利要求中指出的“减少的β-连环蛋白”指该蛋白质的野生型和/或突变型。
通过Western印迹确定SW 480中PKG表达的增加和β-连环蛋白的降低
如上面所论述的，SAAND促使PKG表达量增加以及cGMP水平增加，这两方面都能够促使经SAAND处理的肿瘤细胞中PKG活性增加。PKG蛋白表达的增加由下述相对定量性的western印迹进一步证实。
如前所述，将经exisulind处理的SW 480细胞用冰冷的PBS清洗一次，从微量离心管中收获。细胞用改良RIPA缓冲液溶解15分钟，同时震摇。将细胞溶解产物在低温室中离心沉降。离心后，立即将上清液转移到新的微量离心管中。进行BioRad DC蛋白质分析(Temecula，CA)，确定样品中的蛋白浓度。将样品如上述标准化以测定蛋白浓度。
将每个样品各50μL装载到10％的SDS凝胶上，进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白质转移到硝化纤维素薄膜上。将含有印迹的硝化纤维素薄膜浸没在新鲜配制的含5％脱脂奶粉的TBST中，室温下保持1小时，同时不断震摇。
将山羊-抗-PKG一级抗体用含5％脱脂奶粉的新鲜TBST稀释至推荐的浓度/稀释度。硝化纤维素薄膜置于所述一级抗体溶液中，并在室温下保温1小时，同时震摇。硝化纤维素薄膜用TBST漂洗三次，每次10分钟。硝化纤维素薄膜在含POD结合的次级兔抗-山羊抗体的溶液中于室温下保温1小时，同时震摇。硝化纤维素薄膜用TBST再漂洗三次，每次10分钟。用Boehringer Mannheim BM兰色POD底物进行检测。
如图19的照片所示，exisulind使β-连环蛋白降低，使PKG增加，这些数据是通过Western印迹获得的。SW480细胞用exisulind或溶媒(0.1％DMSO)处理48小时。将各细胞溶解产物的50μg上清液装载到10％的SDS-凝胶上，并印迹到硝化纤维素薄膜上，用兔抗-β-连环蛋白和兔抗-PKG抗体作为探针检测薄膜。
SAAND降低肿瘤细胞中β-连环蛋白的水平
通过分别用200、400、和600μM exisulind或溶媒(0.1％DMSO)培养SW480细胞，进行这一步的观察。细胞在处理后48小时收获，进行免疫印迹处理。可以用Western印迹检测免疫反应蛋白质。Western印迹分析证明经exisulind处理的细胞与对照相比，β-连环蛋白的表达降低了50％。该结果表明由于SAAND的处理，β-连环蛋白水平降低。将上面已经确立的因exisulind处理使PKG活性增加，以及下面所确立的PKG使β-连环蛋白磷酸化的结果综合起来，这些结果表明在肿瘤细胞中由于PKG的活化引起β-连环蛋白降低。因此，利用肿瘤中PKG活性作为选择抗肿瘤化合物的筛选工具是有用的。PKG使β-连环蛋白磷酸化
在体外，PKG使β-连环蛋白磷酸化。确立该结果的试验涉及使来源于SW480细胞(没有用任何药物处理)的含β-连环蛋白的复合物按照下文“β-连环蛋白免疫沉淀”描述的方式进行免疫沉淀。将免疫沉淀的复合物(仍然被捕获在固相(即小珠)上)与32P-γ-ATP和纯品PKG(100单位)混合。制备不加PKG的相应对照样品。
用SDS缓冲液使蛋白质从固相上释放下来，将含蛋白质的混合物在7.5％SDS-凝胶上跑胶。混合物在凝胶上电泳跑胶可以除去混合物中过量的32P-γ-ATP。因此，在93Kd 3-连环蛋白带中检测出的任何32P-γ-ATP均是β-连环蛋白磷酸化的结果。相对于不加额外PKG处理的对照组，在用额外PKG处理的93Kd β-连环蛋白带中检测的32p-γ-ATP的任何增加均是由于用额外PKG处理的带中的β-连环蛋白的磷酸化。
我们获得的结果是与显示最少、基本上不能检测到磷酸化的对照组相比，用PKG处理的带中的磷酸化显著增加。该结果表明β-连环蛋白可被PKG磷酸化。
PKG对突变β-连环蛋白的磷酸化
用HCT116细胞进行在紧接的上一部分中描述的相同的过程，其中HCT116细胞不包含APC突变，但包含β-连环蛋白突变。那些实验的结果还表明突变的β-连环蛋白也被PKG磷酸化。
因此，为了本发明的目的，我们将权利要求中所述的β-连环蛋白的磷酸化认为是该蛋白的野生型和/或突变型的磷酸化。
使用PKG沉淀β-连环蛋白
用上面在蛋白质印迹实验中描述的相同方法制备SW480和HCT116细胞溶解产物的上清液。通过向每500ug细胞溶解产物中加入150ul蛋白A Sepharose珠匀浆(50％)将细胞溶解产物预澄清，并在4℃下在管式摇床中保温10分钟。4℃下，通过以14,000×g离心10分钟除去蛋白A珠。将上清液转移至新的离心管中。将10ug多克隆兔抗β-连环蛋白抗体(Upstate Biotechnology，Lake Placid，纽约)加入到500ug细胞溶解产物中。4℃下在管式摇床中将细胞溶解产物/抗体混合物轻轻混合2小时。通过加入150ul蛋白A Sepharose珠匀浆(75ul填充珠)并通过4℃下在管式摇床中将混合物轻轻震摇过夜，来捕获免疫复合物。通过脉冲离心(在微离心机中以14,000rpm离心5秒)收集Sepharose珠。弃去上清液部分，并将珠用800ul冰冷的PBS缓冲液洗涤3次。将Sepharose珠重新悬浮在150ul 2×样品缓冲液中，并轻轻混合。将Sepharose珠煮沸5分钟以从珠中解离出免疫复合物。离心收集珠并对上清液进行SDS-PAGE分析。
对上清液进行蛋白质印迹，用兔抗β-连环蛋白抗体探测膜。用TBST将膜洗涤3次，每次10分钟，以除去过量的抗β-连环蛋白抗体。加入与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体，接着在室温下保温1小时。当完成后，可使用HRPO底物观察到β-连环蛋白的存在。在该实验中，我们可清楚地观察到β-连环蛋白的存在。
为了在相同的膜中检测PKG，通过在55℃水浴中保温0.5小时，用62mM tris-HCl缓冲液(pH7.6)、2％SDS和100μM 2β-巯基乙醇首先将抗β-连环蛋白抗体结合物从膜上剥离下来。接着在室温下，在搅动膜的同时，将剥离下抗β-连环蛋白抗体结合物的膜在含5％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。接着用与HRPO结合的山羊抗兔次级抗体检测的兔多克隆抗PKG抗体(Calbiochem，LaJolla，CA)探测该被封闭的膜。用HRPO底物检测印迹膜中的PKG的存在。在该实验中，实际上观察到了PKG。假定膜上的蛋白仅为那些在细胞上清液中被β-连环蛋白免疫沉淀下来的那些蛋白，该结果清楚地证实PKG与细胞上清液中包含β-连环蛋白的蛋白复合物物理性地相连。
在剥离下抗体结合物后，还用抗GSK3-β抗体探测相同的蛋白质印迹膜以证实它还是否与β-连环蛋白一起沉淀。在该实验中，我们还在膜中检测到GSK3-β，表明GSK3-β与β-连环蛋白和PKG一起沉淀，因此表明这三种蛋白可能为相同复合物的一部分。由于在正常细胞中GSK3-β与β-连环蛋白形成APC复合物的一部分，因此，PKG可能为相同复合物的一部分，并可能参与作为该复合物一部分的β-连环蛋白的磷酸化。
包含cGMP PDE抑制剂的抗肿瘤药物组合物
如上所述，exisulind为一种显示所希望的抗肿瘤特性的化合物。在认识到该化合物通过抑制肿瘤中的cGMP特异性PDE活性而起作用之前已发现了其作为抗肿瘤剂的功效和用途。
其中，在患有肿瘤的病人中的人体临床实验中获得本发明的选择方法可被用来选择用于人体治疗的化合物的证据。根据exisulind为抗肿瘤剂(体外)的事实，认识到其具有满足本发明的选择标准的所希望的化合物的图谱，该化合物在两个人体临床实验中的成功，表明也可选择出满足本发明选择标准的其它化合物。
如上所述，许多肿瘤带有APC突变。其中在患有带有APC突变的肿瘤的病人的人体临床试验中确立了本发明选择方法的证据。
在具有遗传性瘤，即腺瘤息肉coli(“APC”)的病人中首先发现APC突变。APC疾病的特征在于在青少年时期在结肠中出现成百上千的息肉，常规治疗是在20岁以前手术切除结肠。
第一例临床试验涉及具有APC的病人。
使用exisulind。在该研究中，各病人已切去结肠，但保留邻近直肠的小部分结肠(其中与小肠相连)以保持直肠的功能。然而，该病人经常在小部分余下的结肠部分形成息肉，这些息肉需要周期性地切除(例如，通过电烙)。
选择exisulind的试验是被设计用来通过比较药物和安慰剂组在12个月中所形成的新的息肉的累积数量来评价药物抗肿瘤特征的预防性试验。适宜的病人为每年形成9至44个息肉的病人。在研究开始、6个月末和12个月末时，病人的息肉被完全切除(切除所有息肉)。试验包括34位适宜的病人。根据在每年周期性形成9至44个息肉的APC病人在一年中形成的息肉的估测平均数目，exisulind组在降低息肉形成速率方面从临床和统计上显著优于安慰剂组。根据研究开始6个月中产生的息肉的平均数目，用exisulind治疗的病人形成的息肉数量大约是用安慰剂治疗的病人的息肉的数量的三分之一(分别为中间值9个息肉/年和26个息肉/年；p＝0.013)。根据在研究整个12个月中产生的息肉的平均数目，用exisulind治疗的病人形成的息肉数量大约是用安慰剂治疗的病人的息肉的数量的一半(分别为中间值18个息肉/年和38个息肉/年；p＝0.020)。
还在患有前列腺癌并因此而切除了他们的前列腺的男性病人中进行了独立的临床试验。在进行完全前列腺切除后其可检测水平PSA(前列腺特异性抗原)上升的病人中进行该研究，PSA水平的上升表明重新出现了前列腺癌。
将96位病人编入前列腺癌的评价中：双盲，安慰剂对照，包括以500mg/天对受药病人给药exisulind的多中心试验。如下所示，数据表明在exisulind治疗组和安慰剂组之间的PSA水平在统计学上差异显著。与安慰剂治疗组的PSA水平相比，exisulind治疗组中的PSA水平显著降低。虽然PSA水平的增加本身不是疾病状态，但在医学界它被广泛认为是在这些男性中出现前列腺癌复发的替代性标记指示。
除了进行基于exisulind和安慰剂组之间平均PSA水平差异的评价外，中间分析包括亚组分析。根据他们发展成转移性疾病的危险，研究中的病人被分成高、中和低危组。使用在美国医学协会杂志(JAMM，1999年5月5日，pp1591-97)中的方法进行该分类。为了确定哪些研究病人落入何种危险组，给不知病人是否使用药物或安慰剂的研究者提供病史；他根据上面提及的公开的方法确定把病人分配到适宜的危险组。统计分析表明在高和中危组中exisulind和安慰剂病人之间的平均PSA水平具有统计学上的显著性差异。
来自前列腺研究的数据如下：
表10
exisulind对在前列腺切除后具有增加的PSA的男性的平均PSA水平的影响
组          安慰剂      exisulind    “p”值
全部        4.49        2.85          0.0004
高危        4.98        2.91          0.0002
中等危险    6.24        2.95          0.0053
在这些exisulind试验以及一些其它包括其它适应症的药物的试验中，通过监测副作用(AEs)，临床实验室实验(血液学，血清化学和尿分析)，活体信号(血压、脉搏速率、呼吸速率、体温和体重)，物理测定和上内窥镜学来评价安全性。
目前在四百多位病人中使用exisulind进行的临床试验证实了没有明显的安全性问题。exisulind不显示任何与传统化疗相关的血质不调，剂量限制性呕吐或神经或肾毒性。其也没有造成活体信号的任何临床显著性变化。事实上，在APC病人的息肉和正常结肠组织的成对活体组织检查中，发现exisulind增加息肉，而非正常结肠组织中的编程性细胞死亡速率，这表明exisulind对正常组织的影响极小。
在高于最大耐受剂量(在进行了亚整体结肠切除术的病人中MTD＝600mg；在具有完整结肠的病人中为400mg；在儿童病人中为350mg)的剂量下，发现的唯一的剂量限制性副作用为在治疗早期见到的肝功能试验(LETs)的升高。在试验时，LET的升高可迅速地逆转，当降低剂量时不复发。其它作用(例如偶然的腹痛)通常持续短时间和弱至中等强度，并不必需中断或降低exisulind剂量。
简单地说，这些试验证实exisulind为一种有效的、耐受性好的可用于对肿瘤进行长期临床处治的治疗法。因此，这些结果表明选择尤其是在体内抑制cGMP特异性PDE活性(以及满足本发明其它选择标准)的另一种化合物可产生有疗效的药物。
在发现其作用机理涉及cGMP抑制和获知其满足本发明选择标准之前发明的第二种药物为(Z)-5-氟-2-甲基-(4-吡啶亚基)-3-(N-苄基)茚基乙酰胺盐酸盐(化合物I)。在体外和体内评价中它被证实是一种具有抗多种肿瘤活性的抗肿瘤剂。在动物研究和单独的升高剂量的人体研究中它也是安全的。
如本领域技术人员从下面提供的数据认识到的，化合物I可被安全地以远远超过可耐受剂量的常规化疗剂或抗肿瘤剂NSAIDs(和在许多情况下有毒性)的剂量对动物给药。例如，在大鼠的急性毒性研究中，以高达和包含2000mg/kg的剂量给药的化合物I的单口服剂量(在0.5％羧甲基纤维素赋形剂中)未产生可观察的毒性迹象。在4000mg/mg时，体重的增加稍有降低。以腹膜内给药的1000mg/mg单剂导致体重增加减缓，在尸体解剖时在来自该组的一些动物中见到肠系膜的粘附。
在狗中，以1000mg/kg以胶囊剂形式给药化合物I，对于为两只雄性和两只雌性狗的一组未产生毒性迹象。由于化合物I胶囊的特性，对于每只动物该剂量必需使用至少13颗胶囊，其被判断为在不使动物产生紧张时的最大数目。因此，这些狗随后被给药1000mg/kg/天的连续七次的剂量。在每次给药期间均未观察到任何明显的药物相关性作用的迹象。
因此，在单剂基础上，化合物I不是急性毒性的。根据这些研究的发现，化合物I的口服LD50被认为比狗中的1000mg/mg和大鼠中的4000mg/kg大，腹膜内LD50被认为比大鼠中的1000mg/kg大。
在大鼠的有关剂量范围的七天研究实验中，其中通过以0，50，500或2000mg/kg/天给药来评价化合物I，在为50mg/kg/天时未产生可观察的毒性迹象。在雌性大鼠中，在为500mg/kg/天时，治疗相关的作用仅为肝脏重量的绝对和相对增加。在2000mg/kg/天时，在雄性大鼠中，作用包括加重的呼吸和/或异常呼吸声音，体重增加减缓和食物消耗减少，在雌性大鼠中为肝脏重量增加。在任何剂量水平，未观察到血液学或血液化学变化和任何显微病理学变化。
还以0，50，500和2000mg/kg/天用大鼠进行28天研究。未观察到由CP-461引起的异常临床迹象，体重的变化、眼底镜检查、血液学和血液化学值和尿分析实验值不显著。在尸体解剖中未见到肉眼可见的组织变化。器官重量的数据表明在2000mg/kg/天时肝脏重量在统计学意义上显著增加，和对于2000mg/kg/天组的甲状腺重量在统计学意义上显著增加。在低剂量时的轻微增加不具有统计学显著性。对组织的组织病理学评价表明在甲状腺中存在滤泡细胞肥大的痕迹，有丝分裂相的数目增加(表明可能的细胞增殖)和肝脏中存在中度的中心小叶肥大。在2000mg/kg/天剂量时，这些变化通常局限于少量动物，虽然在500g/kg/天时一只雌性大鼠在甲状腺中具有增加的有丝分裂相。在肝脏中的这些发现可能是导致甲状腺激素的代谢增加的微粒体酶受到非常适宜的刺激的指征，它反过来导致甲状腺的刺激。因此，本领域技术普通人员认识到与在类似剂量的常规化疗剂或NSAIDs时所达到的效果相比较，这些作用极小。
为了进一步建立化合物I的安全性范围，进行研究以评价由化合物I诱导的前列腺肿瘤细胞系的编程性细胞死亡是否可与其对来自正常组织的前列腺上皮细胞的作用相比。在标准条件下，使用包含5％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 160培养基使对雄激素敏感的前列腺肿瘤细胞系，LNCaP(来自ATCC(Rockville，MD))增殖。将来自正常前列腺的原前列腺上皮细胞培养物(PrEC)培养在与肿瘤细胞系相同的条件下，不同的是使用优化用于这些培养物生长的无血清培养基(Clonetics公司)。为了实验，将LNCaP或PrEC细胞以10,000细胞/孔的密度接种在96孔培养板中。24小时后，将细胞用赋形剂(0.1％DMSO)或溶解在DMSO中的50μM化合物I(游离碱)处理。经过不同的药物处理时间后(4，24，48，72或99小时)，将细胞溶解并进行测定作为编程性细胞死亡的指标的与组蛋白相关的DNA(参见Piazza等，癌症研究57：2452-2459，1997)。
图27表明在用50μM化合物I(游离碱)处理后，在LNCaP细胞培养物中的与组蛋白相关的断裂DNA的量随时间增加。24小时处理后，检测出断裂DNA有显著增加，将该诱导保持长达4天的连续处理。相反，在长达4天的处理中，用化合物I(50μM)对PrEC(“正常”前列腺)细胞进行的处理不影响DNA的断裂。这些结果证实与正常细胞相反，在肿瘤细胞中的对编程性细胞死亡具有选择性诱导。这与在迅速生长的正常和肿瘤细胞等中诱导编程性细胞死亡或坏死的常规化疗剂明显相反。
最后，对于安全性，采用单独的提高剂量的人临床试验，其中在对口服药物的病人的安全性研究中，在任何剂量下，化合物1没有产生显著的副作用，包括在被预测对于产生抗癌作用为必需的用量之上的剂量。
如上所述，化合物I还显示可能的抗肿瘤特性。在SW-480细胞系中，对于化合物I所获得的生长抑制IC50值为0.7μM。该结果通过使用异常小囊转化灶(“ACF”)作为致癌作用的指示物在啮齿类动物中评价化合物I而得以证实(参见Bird，癌症通讯37：147-151，1987)。这种由氧化偶氮甲烷(“AOM”)诱导的癌症发生的啮齿类动物模型被用来评价化合物I(游离碱和盐)在体内对结肠癌发生的影响。ACF为结肠癌的前体，ACF的抑制是化疗预防有效的表示。
在该试验的大鼠中，通过连续两周注射致癌物来完成ACF的启动。在启动ACF之前一周和在试验中给药化合物I。治疗5周后，计数ACF。对雄性Fisher 344大鼠口服给药化合物I。在试验过程中改变每天的食物消耗(mg/kg体重)，因此，化合物I的剂量以g/kg食物表示以提供剂量之间比较的基础。为了确定化合物I是否对生长和/或饲养行为具有副作用，在整个实验过程中测定体重。实验组比对照组获得较少的增重，增重是生物利用率的表现。然而，体重的差异小于10％，并不被认为影响ACF的形成。
如通过每根结肠的小囊数减少所测定的，化合物I的游离碱抑制ACF的形成。数据总结在表11中。除了低剂量组(仅0.5g/kg饮食)外，治疗和对照组之间的差异是明显的，在1.0和2.0g/kg饮食组的情况下其差异为统计学上的显著性。
表11
化合物I对异常小囊转移灶的抑制
Figure C9912181800581
而且，化合物I可追溯性地满足本发明的选择标准，并为一种被用来确立该选择标准的可行性的化合物。例如使用前面描述的方法，使用来自HT29细胞提取物的cGMP特异性PDE，化合物I具有0.68μM的cGMP特异性PDE IC50值。其COX I的抑制(为100μM)小于25％。
如对于前编程性细胞死亡，化合物I的DNA断裂EC50为15μM。此外，在各种药物浓度下化合物I在SW-480中的编程性细胞死亡的百分数示于表12中。
表12
按形态学所确定的化合物I对SW-480结肠腺瘤细胞的HT-29细胞的编程性细胞死亡的诱导
化合物I的活性不局限于抗结肠癌细胞系活性或结肠癌的动物模型。它在各种肿瘤细胞系中具有广范围的抗肿瘤作用。在无菌条件下，在含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI 1640培养基中让各种类型的人癌症细胞系增殖。为了确定化合物I的生长抑制作用，以1000细胞/孔将细胞接种在96孔板中。接种后经过24小时，用各种浓度的溶解在DMSO中的化合物I的游离碱对细胞进行给药(最终浓度为0.1％)。在五天的连续处理后，使用中性红细胞毒性分析法确定药物对肿瘤细胞生长的作用。中性红为一种通过ATP依赖性转运机理被活细胞选择性摄取的染料。
如表13所总结的，当对一组来自各种组织器官的培养的人细胞系进行评价时，化合物I(游离碱)显示有效的生长抑制活性。不管作为细胞系来源的肿瘤的组织发生如何，化合物I显示可比较的生长抑制作用。对于所有细胞系计算的GI50值(相对于对照组生长抑制50％时的药物浓度)为1-2μM。
除了下表中的数据以外，我们观察到人白血病细胞系(CCRF-CEM，K562和Molt-4)、骨髓瘤细胞系(RPMI8226)、胰腺肿瘤(PAN-1)和卵巢癌细胞系(OVCAR-3)对化合物I(盐酸盐)具有可比较的敏感性。
表13
化合物I对各种人肿瘤细胞系生长的抑制
Figure C9912181800601
*用化合物I的游离碱进行试验，除非用星号另有说明(其中试验使用盐酸盐来进行)。
在已知化合物I的动物和人安全性特征以及化合物I对动物和很多种细胞培养物功效的条件下，很明显，满足本发明的选择标准的化合物(包括cGMP特异性PDE抑制)可用于抗肿瘤治疗。
为了鉴定可治疗有效性地作为抗肿瘤剂的并具有cGMP特异性PDE抑制活性的化合物，本领域普通技术人员具有许多公开的有用的模型化合物(以及其它的类似物，在此引入参考)，它们可被用作具有相同构象、但不同化学性质的其它化合物的计算机模拟的基础。例如，如由Molecular Simulations公司出售的软件，
Figure C9912181800611
ViewerProTM版本包括分子目测法和化学交换能力。该软件包括官能度，包括已知化合物的3D目测以证实所勾勒出或输入的化学结构的精确度。此外，该软件允许根据用户规定的特性添加结构，并且用户可测定距离、角度或双面。
在这种情况下，由于上面公开了其它活性化合物的结构，可应用簇分析和该软件的2D和3D类似性检索技术来鉴定可能的新的其它化合物，对鉴定出的化合物可根据本发明的选择标准接着进行筛选和选择。这些软件方法依赖于这一原理，即类似或具有类似特性的化合物最有可能具有类似的活性，其中这些化合物可使用本发明的选择标准而得以证实。
同样，当这些其它的化合物被计算机模拟时，可使用药物工业领域普通技术人员通常使用的已知的结合化学方法来合成许多这些化合物和其变异体。一些可用的结合化学方法的实例包括由位于BothellWashington的New Chemical Entities公司，位于Palo Alto，California的Protogene Laboratories公司，位于South San Francisco，California的Axys公司，位于Tucson，Arizona的Nanosyn公司，位于San Diego，California的Trega公司和位于Natick，Mass的RBI公司提供的那些方法。有许多其它雇用公司。许多大的药物公司具有虽然不是极好，却也类似的实验室能力。简单地说，本领域普通技术人员可容易地制备许多用于从中选择有效的化合物而用于治疗肿瘤的具有本文公开的化合物特性的化合物。为了进一步有助于鉴定可使用本发明标准筛选和接着选择的化合物，判断所选择的抗肿瘤化合物与PDE5蛋白的结合特性是有价值的。通过下面讨论的方法，发现满足本发明选择标准的理想化合物可与PDE5的cGMP催化区结合。
为了确定它，使用不包括催化区的PDE5序列。制备该序列的一种方式是将优选与谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)形成的融合蛋白的序列表达，其原因是显而易见的。
使用按牛PDE5A cDNA序列设计的正向和反向引物和在PDE 1-10家族中的选择，用RT-PCR法来获得PDE5的cGB区(McAllister-Lucas L.M.等，生物化学杂志268，22863-22873，1993)。用于总RNA的5′-3′-公司试剂盒，接着用寡(dT)柱纯化mRNA，与HT-29细胞一起使用。正向引物(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G，203-227)和反向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG，1664-1686)被用来合成编码磷酸化位点和人PDE5A的低和高亲和性cGMP结合位点的1484bp片段(203-1 686bp，cGB-PDE5)。所合成的cGB-PDE5核苷酸片段编码与牛PDE5A具有97％相似性的494个氨基酸。接着将它克隆至具有tac启动子和EcoRI和XhoI切割位点的pGEX-5X-3谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合载体中(Pharmacia Biotech)。然后将融合载体转染至大肠杆菌BL21(DE3)细菌中(Invitrogen)。将转染的BL21细菌培养至对数期，接着加入作为诱导剂的IPTG。20℃下，将诱导进行24小时。收集细菌并裂解。将可溶性细胞溶解产物与GHS结合的Sepharose 4B(GSH-Sepharose 4B)一起保温。GST-cGB-PDE5融合蛋白可与GSH-Sepharose珠结合，并用过量的冷PBS将其它蛋白从珠中洗脱下来。
所表达的GST-cGB-PDE5融合蛋白在7.5％SDS-PAGE凝胶中以85Kd蛋白显示。其特征在于其与cGMP结合和可被蛋白激酶G和A磷酸化。它显示两个cGMP结合位点，Kd为1.6±0.2μM，它接近于天然牛PDE5的Kd＝1.3μM。GSH结合的Sepharose珠上的GST-cGB-PDE5可在体外通过cGMP依赖性蛋白激酶和cAMP依赖性蛋白激酶A磷酸化。通过PKG磷酸化的GST-cGB-PDE5的Km为2.7μM，Vmax为2.8μM，而BPDEtide磷酸化的Km为68μM。由PKG的磷酸化表明磷酸分子以1∶1的比例掺入至GST-cGB-PDE5蛋白中。
在包含5mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.8)，1mM EDTA，0.25mg/mlBSA，H3-cGMP(2μM，NEN)和GST-cGB-PDE5融合蛋白(30μg/分析)的100μl总体积中进行对感兴趣化合物的cGMP结合分析(Francis S.H.等，生物化学杂志255，620-626，1980)。同时加入作为H3-cGMP底物的待测各种化合物，22℃下，将混合物保温1小时。接着将混合物转移至使用GF/B作为滤膜的Brandel MB-24细胞收集器中，接着用10ml冷的5mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)洗涤2次。切下膜另转移至闪烁瓶中，接着将1ml H2O和6ml Ready SafeTM闪烁液体混合物加入至各瓶中。在Beckman LS 6500闪烁仪中进行计数。
为了计算，通过将结合蛋白煮沸5分钟来制备空白样品，当与未煮沸的蛋白比较时，结合读数小于1％。还校正了滤膜或其它残渣的猝灭。选用PDE5抑制剂、硫化物、exisulind、化合物B、化合物E、E4021和zaprinast和环核苷酸类似物、cAMP、环IMP、8-溴-cGMP、环UMP、环CMP、8-溴-cAMP、2′-O-丁基-cGMP和2′-O-丁基-cAMP，检测它们是否竞争性地与GST-cGB-PDE5蛋白的cGMP结合位点结合。结果示于图24中。cGMP特异性地与GST-cGB-PDE5蛋白结合。环AMP、cUMP、cCMP、8-溴-cAMP、2′-O-丁基-cAMP和2′-O-丁基-cGMP在结合中不与cGMP竞争。高浓度(100μM)的环IMP和8-溴-cGMP可部分地与cGMP(2μM)结合竞争。没有任何一种PDE5抑制剂显示出在与GST-cGB-PDE5的结合中与cGMP的竞争。因此，它们不与PDE5的cGMP结合位点结合。
然而，化合物E确实竞争性地(与cGMP)和PDE5结合(即峰A)。(化合物E还竞争性地(与cGMP)和PDE峰B结合)。在化合物E不与PDE5的cGMP结合位点结合的条件下，在化合物E与cGMP之间存在竞争性结合的事实完全意味着理想化合物，如化合物E与PDE5中的cGMP催化位点结合，这一信息可容易被本领域技术人员获得(使用常规竞争性结合实验)并有助于本领域技术人员更容易地模拟其它化合物。因此，借助于本文提供的理想化合物的化学结构和cGMP结合位点的信息，本领域技术人员可模拟、确定和选择(使用本发明的选择标准)其它可用作治疗剂的其它化合物。
从术语“药物组合物”即化合物(如上述的固体)和可药用载体的一般含义可以熟知，根据本发明方法选择的化合物可被配制成药物组合物，可以通过固体或液体形式口服给药，通过液体形式以IV或IP给药，通过软膏形式局部给药，或通过栓剂形式直肠或局部给药。口服给药的载体是最优选的。
如本领域所熟知的，在药物组合物中用于口服给药的可药用的载体包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂、锭剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，载体可包含至少一种惰性稀释剂，如蔗糖、乳糖或淀粉。如在常规实践中，这些载体还可包含除稀释剂外的其它物质，例如润滑剂，如硬脂酸镁。在胶囊剂、片剂、锭剂和丸剂的情况下，载体还可包含缓冲剂。可制备在片、丸或颗粒的表面有肠衣的载体，如片、丸和颗粒。另外，可将肠衣包覆的化合物压成片、丸或颗粒中，片剂、丸剂或颗粒剂用于对病人给药。优选的肠衣包括在结肠pH值下溶解或分解的那些，如紫胶或Eudraget S。
药物组合物中的可药用的载体包括用于口服给药的液体剂型，例如包含本领域常用的惰性稀释剂，如水的可药用的乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆和驰剂。除这些惰性稀释剂外，组合物还包含佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂，增甜剂、增香剂和芳香剂。
用于IV或IP给药的药物组合物中的可药用载体包括常用的药物盐溶液。
用于局部给药的药物组合物中的可药用载体包括DMSO、醇或丙二醇等可与膜片和其它保持液体的物质引起使用，以将药物适当地保留在皮肤上以使药物不蒸发掉。
用于直肠给药的药物组合物中的可药用载体优选为除本发明化合物外，可包含赋形剂，如可可油或栓剂蜡或凝胶的栓剂。
可药用载体和本发明化合物被配制成单剂形式的用于对病人给药的药物组合物。单剂中的活性成分(即根据本发明选择的化合物)的剂量可以变化，以在根据所需给药方法中(即口服或经直肠)获得消除致瘤作用活性的有效量的活性成分。因此，选择的剂量取决于给药的活性化合物的特性(例如其IC50，它可容易地确定)、给药途径、所需的治疗期和其它因素。如果需要，单剂可为对活性化合物的每日需要量在一个剂量中，或分散在多个给药剂量中，例如每天2至4次。对于IV给药，可通过在平均成年男性的血浆内含物(即约4升)中获得IC50的剂量来确定用于给药的起始剂量。根据本发明选择的活性化合物的起始剂量的范围可为0.5-600mg。
本发明的药物组合物优选被包装在具有包括适应症、使用说明等的适宜印刷物(例如包装插页)容器中(例如药盒或药瓶或两者)。
显然，根据上面的说明，本发明许多的修改和改变均是可能。因此，应理解在所附权利要求书的范围内，本发明可以不如本文具体描述的其它方式来进行。

Claims (8)

1.用于治疗肿瘤的化合物的选择方法，包括：
确定化合物的环加氧酶(COX)抑制活性；
确定化合物的PDE2抑制活性；和
选择具有比所述PDE2活性低的COX抑制活性的化合物。
2.权利要求1的方法，其中所述化合物是通过如下步骤进一步选择的：确定化合物在肿瘤细胞培养物中是否抑制肿瘤细胞的生长；和选择显示抑制肿瘤细胞生长的化合物。
3.权利要求2的方法，其中对生长的抑制通过确定化合物是否诱导编程性细胞死亡来确定。
4.用于治疗肿瘤的化合物的筛选方法，包括：
确定化合物的肿瘤细胞生长抑制活性；
确定化合物的PDE2抑制活性；和
选择显示出肿瘤细胞生长抑制活性和所述PDE2抑制活性的化合物。
5.权利要求4的方法，包括进一步确定化合物是否在肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡；和选择出能诱导编程性细胞死亡的化合物。
6.权利要求5的方法，进一步包括：
确定化合物是否具有COX抑制活性；和选择出其COX抑制活性比对所述PDE2的抑制活性低的化合物。
7.用于治疗肿瘤的化合物的选择方法，包括确定化合物的PDE2抑制活性并选择具有该抑制活性的化合物。
8.权利要求7的方法，其中化合物通过如下步骤进一步选择：确定化合物是否在肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡，并选择具有编程性细胞死亡诱导活性的化合物。
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