JP2000186047A - 腫瘍性疾患を阻害する化合物の同定法及び該化合物を含む組成物 - Google Patents
腫瘍性疾患を阻害する化合物の同定法及び該化合物を含む組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 腫瘍性疾患の治療並びに予防用の薬理組成
物、該組成物において有用な化合物の選別方法を提供す
ることを目的とする。 【解決手段】 腫瘍性疾患を治療するための薬理組成物
であって、製薬上許容される担体と、ある化合物のシク
ロオキシゲナーゼ(COX)阻害活性を測定し、該化合物のP
DE阻害活性を測定し、かつ腫瘍性疾患の治療のために、
該PDE活性よりも低いCOX阻害活性を持つ化合物を選択す
ることによって選別される、該化合物とを含み、該PDE
が、(a) cAMPを越えるcGMP活性、(b) cGMP基質の存在下
での、正の協働的運動学的挙動、(c) cGMPに対するサブ
ミクロモルアフィニティー、および(d) 精製されたcGMP
-依存性プロテインキナーゼとのインキュベーションに
対する不感受性によって、特徴付けられることを特徴と
する。
物、該組成物において有用な化合物の選別方法を提供す
ることを目的とする。 【解決手段】 腫瘍性疾患を治療するための薬理組成物
であって、製薬上許容される担体と、ある化合物のシク
ロオキシゲナーゼ(COX)阻害活性を測定し、該化合物のP
DE阻害活性を測定し、かつ腫瘍性疾患の治療のために、
該PDE活性よりも低いCOX阻害活性を持つ化合物を選択す
ることによって選別される、該化合物とを含み、該PDE
が、(a) cAMPを越えるcGMP活性、(b) cGMP基質の存在下
での、正の協働的運動学的挙動、(c) cGMPに対するサブ
ミクロモルアフィニティー、および(d) 精製されたcGMP
-依存性プロテインキナーゼとのインキュベーションに
対する不感受性によって、特徴付けられることを特徴と
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一種以上の型の、
ホスホジエステラーゼタイプ2(PDE2)およびホスホジエ
ステラーゼタイプ5(PDE5)および/またはプロテインキナ
ーゼGを使用して、哺乳動物における前癌および癌病巣
を治療しかつ予防するのに有用な、化合物の同定および
このような化合物を含む薬理組成物並びにこのような化
合物によって、腫瘍性疾患を処置する治療法に関するも
のである。
ホスホジエステラーゼタイプ2(PDE2)およびホスホジエ
ステラーゼタイプ5(PDE5)および/またはプロテインキナ
ーゼGを使用して、哺乳動物における前癌および癌病巣
を治療しかつ予防するのに有用な、化合物の同定および
このような化合物を含む薬理組成物並びにこのような化
合物によって、腫瘍性疾患を処置する治療法に関するも
のである。
【０００２】
【従来技術】一般的に、非外科的癌治療は、一種以上の
著しく毒性の高い化学療法剤またはホルモン療法剤を、
化学療法/ホルモン療法の治療上の利益が、その重度の
副作用を凌駕する点にまで、患者の癌が進行した後に、
該患者に投与することを含む。このような副作用は、腫
瘍学者には周知であり、薬物ごとに異なっている。しか
し、標準的な化学療法剤は、典型的には短期間に渡って
使用されるに過ぎず、薬物による副作用を示す患者を苦
しめないように、しばしば期間終了(periods off)治療
を伴う化学療法に代えられる。かくして、所定のリスク
−便益の釣り合いのために、副作用は典型的には、患者
が前癌病変を呈した場合に、化学療法を開始し、あるい
は顕症的癌が、その再発を抑える試みにおいて排除され
た後に、長期的に化学療法またはホルモン療法を継続す
ることを妨害する。10年ほど前に、予想外の源、即ち非
−ステロイド系抗−炎症剤(NSAIDs)から、一縷の望みが
見え始めた。
著しく毒性の高い化学療法剤またはホルモン療法剤を、
化学療法/ホルモン療法の治療上の利益が、その重度の
副作用を凌駕する点にまで、患者の癌が進行した後に、
該患者に投与することを含む。このような副作用は、腫
瘍学者には周知であり、薬物ごとに異なっている。しか
し、標準的な化学療法剤は、典型的には短期間に渡って
使用されるに過ぎず、薬物による副作用を示す患者を苦
しめないように、しばしば期間終了(periods off)治療
を伴う化学療法に代えられる。かくして、所定のリスク
−便益の釣り合いのために、副作用は典型的には、患者
が前癌病変を呈した場合に、化学療法を開始し、あるい
は顕症的癌が、その再発を抑える試みにおいて排除され
た後に、長期的に化学療法またはホルモン療法を継続す
ることを妨害する。10年ほど前に、予想外の源、即ち非
−ステロイド系抗−炎症剤(NSAIDs)から、一縷の望みが
見え始めた。
【０００３】癌および前癌の研究は、腫瘍形成細胞内で
過度に発現される、種々の生化学分子を記載する多数の
刊行物で満ちており、これらは順次、特定の過発現分子
が、該疾患の原因となっているか否か、およびこのよう
な過発現が阻害された場合に、腫瘍形成が軽減出来るか
否かに関する研究へと導いた。例えば、家族性腺腫様ポ
リープ症(FAP)では、ワッデル(Waddell) (Waddell, W.
R.等, "結腸のポリープ症に対するスリンダク(Sulindac
for Polyposis of the Colon)", ジャーナルオブサー
ジカルオンコロジー(Journal of Surgical Oncology),
1983, 24:83-87)は、以下のような仮説を立てた。即
ち、プロスタグランジンは、このようなポリープにおい
て過発現されるので、非−ステロイド系抗−炎症剤(NSA
IDs)は、該状態を軽減するはずである。というのは、NS
AIDsが、プロスタグランジンシンセターゼ(PGE2)活性を
阻害するからである。かくして、彼は非−ステロイド系
抗−炎症剤(NSAIDs)スリンダク(PGE2の阻害剤)を、FAP
患者に投与した。ワッデルは、ポリープが退化し、この
ような治療において再発しなかったことを見出した。
過度に発現される、種々の生化学分子を記載する多数の
刊行物で満ちており、これらは順次、特定の過発現分子
が、該疾患の原因となっているか否か、およびこのよう
な過発現が阻害された場合に、腫瘍形成が軽減出来るか
否かに関する研究へと導いた。例えば、家族性腺腫様ポ
リープ症(FAP)では、ワッデル(Waddell) (Waddell, W.
R.等, "結腸のポリープ症に対するスリンダク(Sulindac
for Polyposis of the Colon)", ジャーナルオブサー
ジカルオンコロジー(Journal of Surgical Oncology),
1983, 24:83-87)は、以下のような仮説を立てた。即
ち、プロスタグランジンは、このようなポリープにおい
て過発現されるので、非−ステロイド系抗−炎症剤(NSA
IDs)は、該状態を軽減するはずである。というのは、NS
AIDsが、プロスタグランジンシンセターゼ(PGE2)活性を
阻害するからである。かくして、彼は非−ステロイド系
抗−炎症剤(NSAIDs)スリンダク(PGE2の阻害剤)を、FAP
患者に投与した。ワッデルは、ポリープが退化し、この
ような治療において再発しなかったことを見出した。
【０００４】PGE2阻害は、NSAIDsによるシクロオキシゲ
ナーゼ(COX)の阻害によりもたらされる。スリンダクを
使用したワッデルの成功および該PGE2/COXの関係は、表
面上は他の二つのターゲット、即ちPGE2およびCOXの発
癌における役割を検証しており、また以下の文献はこの
見解を立証した。腫瘍性疾患に罹った患者の一縷の望み
は、スリンダクが従来の化学療法剤またはホルモン剤よ
りも著しく低い副作用を示し、かつ該疾患の初期段階に
おいて、従来の化学療法剤と比較して、より長期間に渡
る、癌治療の可能性を切り開いたことであった。しか
し、このような望みは、スリンダク等の化合物が顕症的
な癌の治療に利用できるか否かに関する未解決の問題に
よって沈静されなければならなかった。というのは、ワ
ッデルは、前癌状態、即ちFAP状態にある患者にスリン
ダクを投与したに過ぎないからである。
ナーゼ(COX)の阻害によりもたらされる。スリンダクを
使用したワッデルの成功および該PGE2/COXの関係は、表
面上は他の二つのターゲット、即ちPGE2およびCOXの発
癌における役割を検証しており、また以下の文献はこの
見解を立証した。腫瘍性疾患に罹った患者の一縷の望み
は、スリンダクが従来の化学療法剤またはホルモン剤よ
りも著しく低い副作用を示し、かつ該疾患の初期段階に
おいて、従来の化学療法剤と比較して、より長期間に渡
る、癌治療の可能性を切り開いたことであった。しか
し、このような望みは、スリンダク等の化合物が顕症的
な癌の治療に利用できるか否かに関する未解決の問題に
よって沈静されなければならなかった。というのは、ワ
ッデルは、前癌状態、即ちFAP状態にある患者にスリン
ダクを投与したに過ぎないからである。
【０００５】この希望は、またNSAIDs自体の一連の副作
用によっても軽減された。定期的に投与した場合、スリ
ンダクおよび他のNSAIDsは、PGE2が保護的な役割を演じ
ている、消化管に炎症を発生する。更に、定期的に投与
した場合、これらは腎臓障害および正常な血液凝固阻害
等を包含する、副作用を示す。不運にもワッデルが経験
したように、そのスリンダク投与患者の幾人かは、副作
用のために薬物投与を停止した(Waddell, W.R.等, "結
腸のポリープ症に対するスリンダク(Sulindac for Poly
posis of the Colon)", ザアメリカンジャーナルオブサ
ージェリー (TheAmerican Journal of Surgery), 1989,
157:175-79)を参照のこと)。恐らく、ポリープ形成の
抑制のために、付随的な外科的切除に戻されるであろ
う。かくして、腫瘍性病変患者にとって、このような薬
物の投与は、例えばFAP、散発性ポリープまたはPSAsの
上昇を示す、前立腺摘出後の男性(このような男性にお
けるPSAsの上昇は、顕症的可視的な癌は未だ存在しない
可能性があるが、疾患の再発を意味する)に対する、実
用的な長期的治療ではない。
用によっても軽減された。定期的に投与した場合、スリ
ンダクおよび他のNSAIDsは、PGE2が保護的な役割を演じ
ている、消化管に炎症を発生する。更に、定期的に投与
した場合、これらは腎臓障害および正常な血液凝固阻害
等を包含する、副作用を示す。不運にもワッデルが経験
したように、そのスリンダク投与患者の幾人かは、副作
用のために薬物投与を停止した(Waddell, W.R.等, "結
腸のポリープ症に対するスリンダク(Sulindac for Poly
posis of the Colon)", ザアメリカンジャーナルオブサ
ージェリー (TheAmerican Journal of Surgery), 1989,
157:175-79)を参照のこと)。恐らく、ポリープ形成の
抑制のために、付随的な外科的切除に戻されるであろ
う。かくして、腫瘍性病変患者にとって、このような薬
物の投与は、例えばFAP、散発性ポリープまたはPSAsの
上昇を示す、前立腺摘出後の男性(このような男性にお
けるPSAsの上昇は、顕症的可視的な癌は未だ存在しない
可能性があるが、疾患の再発を意味する)に対する、実
用的な長期的治療ではない。
【０００６】これら副作用は、また長期にわたる薬物投
与を必要とする、任意の他の腫瘍形成の適応症に対し
て、NSAIDsの使用を制限する。ごく最近、幾人かの研究
者は、COX-2特異的NSAIDs、例えばセレコキシブ(celeco
xib)が使用できることを示唆している。しかし、このよ
うな化合物の腎臓に対するおよびその他の副作用が、そ
の服用量および長期に及ぶ腫瘍形成の適応症に対する、
かかる化合物による治療期間の長さを制限するものと考
えられている。また、最近報告されたデータは、結腸直
腸の予め決められた領域のみにおける結腸ポリープに限
界的な作用を及ぼすためには、セレコキシブ等の薬物
の、極めて高い服用量が必要であることを示している。
恐らく、結腸癌治療にとってより重要なことは、幾つか
の結腸腫瘍形成(例えば、HCT-116)が、COX-2を発現せ
ず、またこのような阻害剤が、この種の腫瘍形成に対し
て無効であることが報告されていることである(シェン
(Sheng)等, 「シクロオキシゲナーゼ-2の選択的阻害によ
るヒト結腸癌細胞成長の阻害(Inhibition of Human Col
on Cancer Cell Growth By Selective Inhibition of C
yclooxygenase-2)」, J. Clin. Invest., 1997, 99(9):
2254-9を参照のこと」。
与を必要とする、任意の他の腫瘍形成の適応症に対し
て、NSAIDsの使用を制限する。ごく最近、幾人かの研究
者は、COX-2特異的NSAIDs、例えばセレコキシブ(celeco
xib)が使用できることを示唆している。しかし、このよ
うな化合物の腎臓に対するおよびその他の副作用が、そ
の服用量および長期に及ぶ腫瘍形成の適応症に対する、
かかる化合物による治療期間の長さを制限するものと考
えられている。また、最近報告されたデータは、結腸直
腸の予め決められた領域のみにおける結腸ポリープに限
界的な作用を及ぼすためには、セレコキシブ等の薬物
の、極めて高い服用量が必要であることを示している。
恐らく、結腸癌治療にとってより重要なことは、幾つか
の結腸腫瘍形成(例えば、HCT-116)が、COX-2を発現せ
ず、またこのような阻害剤が、この種の腫瘍形成に対し
て無効であることが報告されていることである(シェン
(Sheng)等, 「シクロオキシゲナーゼ-2の選択的阻害によ
るヒト結腸癌細胞成長の阻害(Inhibition of Human Col
on Cancer Cell Growth By Selective Inhibition of C
yclooxygenase-2)」, J. Clin. Invest., 1997, 99(9):
2254-9を参照のこと」。
【０００７】最近の発見は、研究者の該COX/PGE2ターゲ
ットからの撤退に導いた。というのは、これらターゲッ
トは、長期的な観点から、首尾良く腫瘍疾患患者の治療
にとって、根本的なものではない(恐らく、二義的なも
のでもない)からである。パムク(Pamukcu)等は、米国特
許第5,401,774号において、実際にはPGE2およびCOX阻害
性に欠けるもの(従って、NSAIDs、即ち抗-炎症性化合物
ではない)として報告されている、スルフォニル化合物
が、予想外のことに、結腸ポリープ細胞を含む、種々の
腫瘍形成細胞の成長を阻害することを記載している。こ
れらスルフォニル誘導体は、結腸発癌のラットモデルに
おいて有効であることが立証されており、かつ一変種
(今ではエキシシュリンド(exisulind)と呼ばれている)
が、FAP患者に関するヒト臨床試験において有効である
ことが立証されており、またより一層顕著なことに、以
下に示される、制御された臨床的研究において、顕症性
癌：前立腺癌自体において有効であることさえも示され
ている。更に、ごく最近の研究は、COXIおよび/またはC
OXIIが、あらゆる腫瘍形成において実質上発現されない
ことを、説得力をもって確立し、このことは、COXIまた
はCOXII特異的阻害が、腫瘍性疾患の治療において明ら
かに治療上有用であろうという望みを減じた(リム等，
「スリンダク誘導体は、ヒト前立腺癌細胞系の成長を阻
害しかつ該細胞系にアポトーシスを誘発する(Sulindac
Derivatives Inhibit Growth and InduceApoptosis in
Human Prostate Cancer Cell Lines)」，Biochem, Pharm
acology,1999, Vol. 58, pp. 1097-1107,印刷中を参照
のこと)。
ットからの撤退に導いた。というのは、これらターゲッ
トは、長期的な観点から、首尾良く腫瘍疾患患者の治療
にとって、根本的なものではない(恐らく、二義的なも
のでもない)からである。パムク(Pamukcu)等は、米国特
許第5,401,774号において、実際にはPGE2およびCOX阻害
性に欠けるもの(従って、NSAIDs、即ち抗-炎症性化合物
ではない)として報告されている、スルフォニル化合物
が、予想外のことに、結腸ポリープ細胞を含む、種々の
腫瘍形成細胞の成長を阻害することを記載している。こ
れらスルフォニル誘導体は、結腸発癌のラットモデルに
おいて有効であることが立証されており、かつ一変種
(今ではエキシシュリンド(exisulind)と呼ばれている)
が、FAP患者に関するヒト臨床試験において有効である
ことが立証されており、またより一層顕著なことに、以
下に示される、制御された臨床的研究において、顕症性
癌：前立腺癌自体において有効であることさえも示され
ている。更に、ごく最近の研究は、COXIおよび/またはC
OXIIが、あらゆる腫瘍形成において実質上発現されない
ことを、説得力をもって確立し、このことは、COXIまた
はCOXII特異的阻害が、腫瘍性疾患の治療において明ら
かに治療上有用であろうという望みを減じた(リム等，
「スリンダク誘導体は、ヒト前立腺癌細胞系の成長を阻
害しかつ該細胞系にアポトーシスを誘発する(Sulindac
Derivatives Inhibit Growth and InduceApoptosis in
Human Prostate Cancer Cell Lines)」，Biochem, Pharm
acology,1999, Vol. 58, pp. 1097-1107,印刷中を参照
のこと)。
【０００８】従って、腫瘍形成において過発現される、
極めて多数の他のタンパクと同様に、PGE2/COXの過発現
は、幾つかの腫瘍形成の原因ではなく、寧ろ他のタンパ
クの幾つかの結果であると思われる。しかし、これら発
見の組み合わせは、エキシスリンド等の化合物(COXおよ
び非-COX発現性腫瘍形成両者に対してある範囲の活性を
もつ)が、どのように作用するか、このような化合物が
腫瘍形成細胞に対して何をするのかに関連する疑問を提
示した。ピアザ(Piazza)等(米国特許出願第08/866,027
号および09/046,739号)は、化合物(例えば、エキシスリ
ンド)が、環-特異的GMPホスホジエステラーゼ(例えば、
PDE5)を阻害すること、およびその他のこのような化合
物が、該酵素を利用してスクリーニングすることができ
ることを見出し、結果として抗−腫瘍疾患性薬理組成物
を開発しかつこれに処方することの出来る、更に別の化
合物を発見することが出来た。
極めて多数の他のタンパクと同様に、PGE2/COXの過発現
は、幾つかの腫瘍形成の原因ではなく、寧ろ他のタンパ
クの幾つかの結果であると思われる。しかし、これら発
見の組み合わせは、エキシスリンド等の化合物(COXおよ
び非-COX発現性腫瘍形成両者に対してある範囲の活性を
もつ)が、どのように作用するか、このような化合物が
腫瘍形成細胞に対して何をするのかに関連する疑問を提
示した。ピアザ(Piazza)等(米国特許出願第08/866,027
号および09/046,739号)は、化合物(例えば、エキシスリ
ンド)が、環-特異的GMPホスホジエステラーゼ(例えば、
PDE5)を阻害すること、およびその他のこのような化合
物が、該酵素を利用してスクリーニングすることができ
ることを見出し、結果として抗−腫瘍疾患性薬理組成物
を開発しかつこれに処方することの出来る、更に別の化
合物を発見することが出来た。
【０００９】このような薬理組成物は、著しく抗−腫瘍
形成性であり、かつこのような副作用を回避したい場合
には、従来の化学療法剤またはCOXmPGE2阻害の副作用に
も関連する、副作用を実際に示さない可能性がある。そ
の上、抗−腫瘍形成性cGMP-特異的PDE-阻害性化合物
は、正常な細胞ではなく、腫瘍形成細胞中にアポトーシ
ス(プログラム化された細胞死または自殺)を誘発する。
従って、このような新規化合物は、選択的アポトーシス
抗-腫瘍性疾患薬物(SAANDs)として知られる、新規な組
の抗−腫瘍剤と呼ばれる。従って、SAANDsは、幾つかの
公知の知識に関して疑いが持たれた：(1) 抗−腫瘍形成
化合物は、正常な細胞をも殺すこと無しに有効ではあり
得ない；(2) COXは腫瘍形成の原因である；および(3) N
SAIDsによる結腸癌の予防は、COXの一種またはその両型
の阻害によって媒介されるものと思われる。
形成性であり、かつこのような副作用を回避したい場合
には、従来の化学療法剤またはCOXmPGE2阻害の副作用に
も関連する、副作用を実際に示さない可能性がある。そ
の上、抗−腫瘍形成性cGMP-特異的PDE-阻害性化合物
は、正常な細胞ではなく、腫瘍形成細胞中にアポトーシ
ス(プログラム化された細胞死または自殺)を誘発する。
従って、このような新規化合物は、選択的アポトーシス
抗-腫瘍性疾患薬物(SAANDs)として知られる、新規な組
の抗−腫瘍剤と呼ばれる。従って、SAANDsは、幾つかの
公知の知識に関して疑いが持たれた：(1) 抗−腫瘍形成
化合物は、正常な細胞をも殺すこと無しに有効ではあり
得ない；(2) COXは腫瘍形成の原因である；および(3) N
SAIDsによる結腸癌の予防は、COXの一種またはその両型
の阻害によって媒介されるものと思われる。
【００１０】以下に提示される新たな研究は、しかしな
がら、古典的なPDE5阻害性を示す化合物全てが、腫瘍形
成細胞におけるアポトーシスを誘発する訳ではないこと
を示した。周知のPDE5阻害剤、ザプリナストおよびシル
デナフィル(sildenafil)は、単純にアポトーシスを誘発
せず、あるいは進行中の腫瘍形成細胞成長さえも阻害す
る。しかしながら、プロ−アポトーシス性PDE5阻害剤
は、選択的に(即ち、正常な細胞ではなく、腫瘍形成細
胞において)アポトーシスを誘発し、かつ実質的にCOXを
阻害せずに、選択的にアポトーシスを誘発するので、所
定の抗−腫瘍形成性化合物の、スクリーニング手段とし
てのPDE5の有用性には、疑義はない。しかしながら、抗
−腫瘍形成性、プロ−アポトーシス性かつ安全な化合物
を見出すための、該PDE5スクリーニング法の強調が望ま
しく、結果として新規な薬理組成物を、前癌および癌を
包含する腫瘍性疾患の治療における、治療上の利用の目
的で処方できる。
がら、古典的なPDE5阻害性を示す化合物全てが、腫瘍形
成細胞におけるアポトーシスを誘発する訳ではないこと
を示した。周知のPDE5阻害剤、ザプリナストおよびシル
デナフィル(sildenafil)は、単純にアポトーシスを誘発
せず、あるいは進行中の腫瘍形成細胞成長さえも阻害す
る。しかしながら、プロ−アポトーシス性PDE5阻害剤
は、選択的に(即ち、正常な細胞ではなく、腫瘍形成細
胞において)アポトーシスを誘発し、かつ実質的にCOXを
阻害せずに、選択的にアポトーシスを誘発するので、所
定の抗−腫瘍形成性化合物の、スクリーニング手段とし
てのPDE5の有用性には、疑義はない。しかしながら、抗
−腫瘍形成性、プロ−アポトーシス性かつ安全な化合物
を見出すための、該PDE5スクリーニング法の強調が望ま
しく、結果として新規な薬理組成物を、前癌および癌を
包含する腫瘍性疾患の治療における、治療上の利用の目
的で処方できる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題およびその解決手段】幾
つかのPDE5阻害剤が何故単純にアポトーシスを誘発し、
その他の阻害剤がこれを誘発しないかについての研究途
上において、我々は以前には記載されていない、環状GM
P−特異的ホスホジエステラーゼ活性の一形態を明らか
にした。この新規なホスホジエステラーゼ活性は、これ
までに特徴付けされていなかった。特定の理論に拘泥す
るつもりはないが、我々は、この新規なPDE活性が、実
質的にcAMP-加水分解活性を欠いている、即ちcGMP-特異
的である、PDE2の新規な構造によるものであると考えて
いる。古典的なPDE2は、cGMP-特異的ではなく(これは、
またcAMPを加水分解する)、古典的なPDE2は、また腫瘍
形成細胞中にも見出されている。この新規なPDEおよびP
DE2は、望ましい抗-腫瘍形成特性について、薬理的化合
物をスクリーニングする上で有用である。基本的には、
腫瘍形成性細胞において、PDE5およびPDE2活性(その新
規なおよび公知の構造において)が、抗−腫瘍形成性PDE
5-阻害性化合物によって阻害される場合、結果はアポト
ーシスである。PDE5のみが阻害される(PDE2の幾つかの
形態のものではなく)場合、アポトーシスは発生しな
い。
つかのPDE5阻害剤が何故単純にアポトーシスを誘発し、
その他の阻害剤がこれを誘発しないかについての研究途
上において、我々は以前には記載されていない、環状GM
P−特異的ホスホジエステラーゼ活性の一形態を明らか
にした。この新規なホスホジエステラーゼ活性は、これ
までに特徴付けされていなかった。特定の理論に拘泥す
るつもりはないが、我々は、この新規なPDE活性が、実
質的にcAMP-加水分解活性を欠いている、即ちcGMP-特異
的である、PDE2の新規な構造によるものであると考えて
いる。古典的なPDE2は、cGMP-特異的ではなく(これは、
またcAMPを加水分解する)、古典的なPDE2は、また腫瘍
形成細胞中にも見出されている。この新規なPDEおよびP
DE2は、望ましい抗-腫瘍形成特性について、薬理的化合
物をスクリーニングする上で有用である。基本的には、
腫瘍形成性細胞において、PDE5およびPDE2活性(その新
規なおよび公知の構造において)が、抗−腫瘍形成性PDE
5-阻害性化合物によって阻害される場合、結果はアポト
ーシスである。PDE5のみが阻害される(PDE2の幾つかの
形態のものではなく)場合、アポトーシスは発生しな
い。
【００１２】広義の局面において、この新規なPDE構造
は、以下の点によって特徴付けられる活性を有する:(a)
cAMPを越えるcGMP特異性、(b) cGMP基質の存在下
で、正の協働的運動学的な挙動、(c) cGMPに対するサ
ブミクロモルアフィニティー、および(d) 精製cGMP−
依存性プロテインキナーゼとのインキュベーションに対
して不活性。この新規なPDEのその他の特徴は、ザプリ
ナストおよびE4021による阻害に対して低い感受性を持
ち、アニオン交換クロマトグラフィーによって、古典的
なPDE5活性をもつものから分離でき、カルシウム/カル
モジュリンによって活性化されず、かつロリプラム、ビ
ンポセチンおよびインドリダンに対して非−感受性であ
る。
は、以下の点によって特徴付けられる活性を有する:(a)
cAMPを越えるcGMP特異性、(b) cGMP基質の存在下
で、正の協働的運動学的な挙動、(c) cGMPに対するサ
ブミクロモルアフィニティー、および(d) 精製cGMP−
依存性プロテインキナーゼとのインキュベーションに対
して不活性。この新規なPDEのその他の特徴は、ザプリ
ナストおよびE4021による阻害に対して低い感受性を持
ち、アニオン交換クロマトグラフィーによって、古典的
なPDE5活性をもつものから分離でき、カルシウム/カル
モジュリンによって活性化されず、かつロリプラム、ビ
ンポセチンおよびインドリダンに対して非−感受性であ
る。
【００１３】本発明のもう一つの態様は、ある化合物
が、腫瘍形成細胞において、cGMP-依存性プロテインキ
ナーゼG(PKG)活性の増大、および/またはβ-カテニンの
低下を生じるか否かを、評価することをも包含する。SA
ANDの予想外の特性が、SAANDに暴露された腫瘍形成細胞
における、PKG活性の増大およびβ-カテニンの低下を包
含することを見出した。我々は、このPKG活性の増大
が、少なくとも部分的に、上記の如く適当なPDEのSAAND
s阻害によって生じたcGMPの増加によるものであると考
える。SAANDsのその他の特徴は、(1) 上記の‘694特許
に報告されているような、PDE5の阻害、(2) 該新規なcG
MP-特異的PDE立体配座の阻害、(3) PDE2の阻害、(4)こ
れらが、腫瘍形成細胞中の細胞内cGMPを増大するという
事実、および(5) これらが、幾つかの型の腫瘍形成細胞
におけるcAMPレベルを減じるという事実である。
が、腫瘍形成細胞において、cGMP-依存性プロテインキ
ナーゼG(PKG)活性の増大、および/またはβ-カテニンの
低下を生じるか否かを、評価することをも包含する。SA
ANDの予想外の特性が、SAANDに暴露された腫瘍形成細胞
における、PKG活性の増大およびβ-カテニンの低下を包
含することを見出した。我々は、このPKG活性の増大
が、少なくとも部分的に、上記の如く適当なPDEのSAAND
s阻害によって生じたcGMPの増加によるものであると考
える。SAANDsのその他の特徴は、(1) 上記の‘694特許
に報告されているような、PDE5の阻害、(2) 該新規なcG
MP-特異的PDE立体配座の阻害、(3) PDE2の阻害、(4)こ
れらが、腫瘍形成細胞中の細胞内cGMPを増大するという
事実、および(5) これらが、幾つかの型の腫瘍形成細胞
におけるcAMPレベルを減じるという事実である。
【００１４】かくして、本発明の新規な方法の一態様
は、ある化合物が、腫瘍形成細胞内のPKG活性を高める
か否か、および該化合物がPDE5を阻害するか否かを評価
することにある。本発明の新規なスクリーニング法のも
う一つの態様は、ある化合物が、腫瘍形成細胞内のPKG
活性を高めるか否か、および上記の新規なcGMP-特異的P
DEおよび/またはPDE2を阻害するか否かを評価すること
である。その第3の態様は、腫瘍形成細胞内のPKG活性を
高めるか否か、および該化合物が腫瘍形成細胞内のcGMP
を高めるか否か、および/またはcAMPレベルを減じるか
否かを評価することである。このようにして首尾良く評
価された化合物は、SAANDsとしての用途をもつ。本発明
は、特に、前癌病変を含む腫瘍形成性を、安全に治療し
かつ予防する能力について、化合物を選別するための、
新規なインビトロおよびインビボ法に関する。特に、本
発明は前癌病変を含む腫瘍形成性を治療しかつ予防する
ために使用できる化合物を選別する方法に関する。この
ようにして同定された化合物は、COX阻害および従来の
化学療法剤に関連する他の非特異的な相互作用に帰せら
れる、最小の副作用を示す可能性がある。対象とする化
合物は、上記の新規なPDEを、該化合物に暴露すること
によってテストすることができ、またある化合物が、こ
の新規なPDEを阻害する場合、次いで該化合物を更にそ
の抗-腫瘍形成特性について評価する(例えば、インビボ
およびインビトロ動物またはヒトテストモデルまたは試
験)。
は、ある化合物が、腫瘍形成細胞内のPKG活性を高める
か否か、および該化合物がPDE5を阻害するか否かを評価
することにある。本発明の新規なスクリーニング法のも
う一つの態様は、ある化合物が、腫瘍形成細胞内のPKG
活性を高めるか否か、および上記の新規なcGMP-特異的P
DEおよび/またはPDE2を阻害するか否かを評価すること
である。その第3の態様は、腫瘍形成細胞内のPKG活性を
高めるか否か、および該化合物が腫瘍形成細胞内のcGMP
を高めるか否か、および/またはcAMPレベルを減じるか
否かを評価することである。このようにして首尾良く評
価された化合物は、SAANDsとしての用途をもつ。本発明
は、特に、前癌病変を含む腫瘍形成性を、安全に治療し
かつ予防する能力について、化合物を選別するための、
新規なインビトロおよびインビボ法に関する。特に、本
発明は前癌病変を含む腫瘍形成性を治療しかつ予防する
ために使用できる化合物を選別する方法に関する。この
ようにして同定された化合物は、COX阻害および従来の
化学療法剤に関連する他の非特異的な相互作用に帰せら
れる、最小の副作用を示す可能性がある。対象とする化
合物は、上記の新規なPDEを、該化合物に暴露すること
によってテストすることができ、またある化合物が、こ
の新規なPDEを阻害する場合、次いで該化合物を更にそ
の抗-腫瘍形成特性について評価する(例えば、インビボ
およびインビトロ動物またはヒトテストモデルまたは試
験)。
【００１５】従って、本発明の一局面は、腫瘍形成に対
して有効な、化合物を同定するためのスクリーニング/
選別方法を包含し、該方法は、該化合物によるこの新規
なPDEおよび/またはPDE2の阻害並びにそのCOXの阻害を
確認する工程を含む。好ましくは、本発明の該スクリー
ニングおよび選別方法は、更に該化合物が、インビトロ
またはインビボにおいて腫瘍細胞の成長を阻害するか否
かを決定する工程を含む。このようにして化合物を選別
することによって、腫瘍性疾患の治療用の潜在的に有益
かつ改善された化合物を、薬理組成物の開発および腫瘍
性疾患の治療の目的で、過去において可能であった以上
に、迅速にかつより正確に同定することが出来る。これ
以外の利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであ
ろう。本発明は、またこのような化合物を含有する薬理
組成物並びにこのような化合物の使用を含む治療法をも
包含する。
して有効な、化合物を同定するためのスクリーニング/
選別方法を包含し、該方法は、該化合物によるこの新規
なPDEおよび/またはPDE2の阻害並びにそのCOXの阻害を
確認する工程を含む。好ましくは、本発明の該スクリー
ニングおよび選別方法は、更に該化合物が、インビトロ
またはインビボにおいて腫瘍細胞の成長を阻害するか否
かを決定する工程を含む。このようにして化合物を選別
することによって、腫瘍性疾患の治療用の潜在的に有益
かつ改善された化合物を、薬理組成物の開発および腫瘍
性疾患の治療の目的で、過去において可能であった以上
に、迅速にかつより正確に同定することが出来る。これ
以外の利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであ
ろう。本発明は、またこのような化合物を含有する薬理
組成物並びにこのような化合物の使用を含む治療法をも
包含する。
【００１６】
【好ましい態様の詳細な説明】I. 腫瘍形成細胞由来の
新規なcGMP-特異的ホスホジエステラーゼおよびPDE2 A. 新規なPDE立体配座の単離 該単離されたcGMP-特異的ホスホジエステラーゼ(これは
PDE2の新規な立体配座であると思われる)は、まずU.S.
A. メリーランド州ロックビルのアメリカンティッシュ
タイプコレクション(the American Tissue Type Collec
tion)から入手した一般的にSW480と呼ばれている、ヒト
カルシノーマ細胞系から調製した。SW480は、穏やかに
分化した上皮腺癌を由来とする、ヒト結腸癌細胞系であ
る。以下で議論するように、類似の立体配座も乳癌(即
ち、HTB-26細胞系)および前立腺癌(即ち、LNCAP細胞系)
の腫瘍形成細胞から単離される。
新規なcGMP-特異的ホスホジエステラーゼおよびPDE2 A. 新規なPDE立体配座の単離 該単離されたcGMP-特異的ホスホジエステラーゼ(これは
PDE2の新規な立体配座であると思われる)は、まずU.S.
A. メリーランド州ロックビルのアメリカンティッシュ
タイプコレクション(the American Tissue Type Collec
tion)から入手した一般的にSW480と呼ばれている、ヒト
カルシノーマ細胞系から調製した。SW480は、穏やかに
分化した上皮腺癌を由来とする、ヒト結腸癌細胞系であ
る。以下で議論するように、類似の立体配座も乳癌(即
ち、HTB-26細胞系)および前立腺癌(即ち、LNCAP細胞系)
の腫瘍形成細胞から単離される。
【００１７】「単離(された)(isolated)」なる用語によっ
て、我々は、(当分野で理解されているように)腫瘍形成
細胞から単離されたものばかりでなく、組み換え法によ
って作られた(例えば、バクテリアまたはヒト以外の宿
主ベクター細胞系において発現された)物をも意味す
る。しかし、我々は、現時点において、該ヒト腫瘍形成
細胞から単離されたものが好ましいと考えている。とい
うのは、このようにして単離された該ターゲットタンパ
クが、同一ではないにしても、可能な限り該腫瘍形成細
胞中の本来の立体配座の一つにより近い、構造(即ち、
立体配座またはトポグラフィー)を有していると考える
からである。この立体配座は、インビボで該ターゲット
酵素を阻害するであろう、抗−腫瘍形成化合物の選別に
役立つ。
て、我々は、(当分野で理解されているように)腫瘍形成
細胞から単離されたものばかりでなく、組み換え法によ
って作られた(例えば、バクテリアまたはヒト以外の宿
主ベクター細胞系において発現された)物をも意味す
る。しかし、我々は、現時点において、該ヒト腫瘍形成
細胞から単離されたものが好ましいと考えている。とい
うのは、このようにして単離された該ターゲットタンパ
クが、同一ではないにしても、可能な限り該腫瘍形成細
胞中の本来の立体配座の一つにより近い、構造(即ち、
立体配座またはトポグラフィー)を有していると考える
からである。この立体配座は、インビボで該ターゲット
酵素を阻害するであろう、抗−腫瘍形成化合物の選別に
役立つ。
【００１８】新規なPDE活性は、最初にSW480結腸癌細胞
系において見出された。この新規なホスホジエステラー
ゼを、SW480から単離するために、約400,000,000個のSW
480細胞を密集的に育成し、10mlの冷PBSで2回洗浄した
後に150cm2の組織培養皿から掻き出し、かつ遠心分離処
理によってペレット化した。これら細胞を、再度ホモジ
ナイゼーションバッファー(20mlのTMPI-EDTA-トライト
ン(Triton)(pH 7.4): 20mMトリス(Tris)-HOAc、5mMのMg
Ac2、0.1mMのEDTA、0.8%のトライトン-100、10μMのベ
ンズアミジン、10μMのTLCK、2000U/mlのアプロチニ
ン、2μMのロイペプチン、2μMのペプスタチンA)に懸濁
し、ポリトロンティッシュマイザー(polytron tissumiz
er)を使用して、氷浴中でホモジナイズした(3回、20秒/
パルス)。このホモジナイズした材料を、4℃にて60分
間、105,000gにて、ベックマン(Beckman) L8超遠心機で
遠心分離処理し、得られた上澄をTMPI-EDTA(60ml)で希
釈し、TMPI-EDTAバッファーで予め平衡化した10mlDEAE-
トリスアクリル(Trisacryl) Mカラム処理に付した。こ
のカラムを60mlのTM-EDTAで洗浄し、PDE活性を示す画分
を、線形勾配をもつTM-EDTA中のNaOAC(0-0.5M)120ml
で、流量0.95ml/分にて、1.4ml/画分で溶出した。80個
の画分を集め、即座に(即ち、数分以内に) cGMP加水分
解についてアッセイした。図1は、該カラムの溶出プロ
フィールを示し、ここには2つのcGMP PDE活性を示すピ
ーク、即ちピークAおよびBが見られ、これらは夫々40-5
0mMおよび70-80mMのNaOACによって溶出されたものであ
った。以下に説明するように、ピークAはPDE5であり、
一方ピークBは、新規なcGMP-特異的ホスホジエステラー
ゼ活性を示すものである。
系において見出された。この新規なホスホジエステラー
ゼを、SW480から単離するために、約400,000,000個のSW
480細胞を密集的に育成し、10mlの冷PBSで2回洗浄した
後に150cm2の組織培養皿から掻き出し、かつ遠心分離処
理によってペレット化した。これら細胞を、再度ホモジ
ナイゼーションバッファー(20mlのTMPI-EDTA-トライト
ン(Triton)(pH 7.4): 20mMトリス(Tris)-HOAc、5mMのMg
Ac2、0.1mMのEDTA、0.8%のトライトン-100、10μMのベ
ンズアミジン、10μMのTLCK、2000U/mlのアプロチニ
ン、2μMのロイペプチン、2μMのペプスタチンA)に懸濁
し、ポリトロンティッシュマイザー(polytron tissumiz
er)を使用して、氷浴中でホモジナイズした(3回、20秒/
パルス)。このホモジナイズした材料を、4℃にて60分
間、105,000gにて、ベックマン(Beckman) L8超遠心機で
遠心分離処理し、得られた上澄をTMPI-EDTA(60ml)で希
釈し、TMPI-EDTAバッファーで予め平衡化した10mlDEAE-
トリスアクリル(Trisacryl) Mカラム処理に付した。こ
のカラムを60mlのTM-EDTAで洗浄し、PDE活性を示す画分
を、線形勾配をもつTM-EDTA中のNaOAC(0-0.5M)120ml
で、流量0.95ml/分にて、1.4ml/画分で溶出した。80個
の画分を集め、即座に(即ち、数分以内に) cGMP加水分
解についてアッセイした。図1は、該カラムの溶出プロ
フィールを示し、ここには2つのcGMP PDE活性を示すピ
ーク、即ちピークAおよびBが見られ、これらは夫々40-5
0mMおよび70-80mMのNaOACによって溶出されたものであ
った。以下に説明するように、ピークAはPDE5であり、
一方ピークBは、新規なcGMP-特異的ホスホジエステラー
ゼ活性を示すものである。
【００１９】各画分の環状ヌクレオチドPDE活性は、以
下に更に詳細に説明するように、トムソン(Thompson)等
の改良二段階放射性同位元素法(Thompson W.J. 等, Ad
v. Cyclic Nucleotide Res., 1979, 10:69-92)を利用し
て測定した。この反応は、Tris-HCl(40mM; pH 8.0)、Mg
Cl2(5mM)、2-メルカプトエタノール(4mM)、ウシ血清ア
ルブミン(30μg)、cGMP(0.25μM-5μM)を含み、一定の
トリチウム化基質(200,000cpm)を含む400μl中で行っ
た。インキュベーション時間は、15%未満の加水分解を
与えるように調節した。この混合物を、30℃にてインキ
ュベートし、次いで45秒間煮沸して、該反応を停止させ
た。次に、この混合物を冷却し、ヘビ毒(50μg)を添加
し、該混合物を30℃にて10分間インキュベートした。Me
OH(1ml)を添加して、この反応を停止させ、該混合物を
アニオン交換カラム(ダウエックス(Dowex)1-X8、2.5ml
樹脂)に移した。得られた溶出液を、第二の1mlのMeOHと
併合し、該樹脂に適用し、6mlのシンチレーション流体
を添加した後、ベックマンLS 6500を使用して、1分間ト
リチウム活性を測定した。
下に更に詳細に説明するように、トムソン(Thompson)等
の改良二段階放射性同位元素法(Thompson W.J. 等, Ad
v. Cyclic Nucleotide Res., 1979, 10:69-92)を利用し
て測定した。この反応は、Tris-HCl(40mM; pH 8.0)、Mg
Cl2(5mM)、2-メルカプトエタノール(4mM)、ウシ血清ア
ルブミン(30μg)、cGMP(0.25μM-5μM)を含み、一定の
トリチウム化基質(200,000cpm)を含む400μl中で行っ
た。インキュベーション時間は、15%未満の加水分解を
与えるように調節した。この混合物を、30℃にてインキ
ュベートし、次いで45秒間煮沸して、該反応を停止させ
た。次に、この混合物を冷却し、ヘビ毒(50μg)を添加
し、該混合物を30℃にて10分間インキュベートした。Me
OH(1ml)を添加して、この反応を停止させ、該混合物を
アニオン交換カラム(ダウエックス(Dowex)1-X8、2.5ml
樹脂)に移した。得られた溶出液を、第二の1mlのMeOHと
併合し、該樹脂に適用し、6mlのシンチレーション流体
を添加した後、ベックマンLS 6500を使用して、1分間ト
リチウム活性を測定した。
【００２０】ピークAおよびBのcGMP加水分解活性を更に
分画するために、元の80個の画分を、再度該DEAE-トリ
スアクリルMカラムに適用し、線形勾配をもつTM-EDTA中
のNaOAC(0-0.5M)で溶出した。画分を、即座にcGMP加水
分解について(0.2、2.5μM基質を使用した、上記の手順
を利用して)、再度アッセイし、その結果を図2にグラフ
として示した。図2に示されたピークBに関する一観測
は、cGMP基質濃度の増大が、ピークAと対比した場合
に、著しく高い活性を示すことにある。この観測は、PD
E2の場合と一致するが、図2によって特徴付けられる酵
素が、cGMP-特異的であるという事実(以下を参照のこ
と)は、文献に報告された古典的なPDE2と比較して、こ
れが新規な立体配座をもつことを示唆している。ピーク
A活性は、高アフィニティー触媒サイトの見掛け上の基
質飽和を示す。
分画するために、元の80個の画分を、再度該DEAE-トリ
スアクリルMカラムに適用し、線形勾配をもつTM-EDTA中
のNaOAC(0-0.5M)で溶出した。画分を、即座にcGMP加水
分解について(0.2、2.5μM基質を使用した、上記の手順
を利用して)、再度アッセイし、その結果を図2にグラフ
として示した。図2に示されたピークBに関する一観測
は、cGMP基質濃度の増大が、ピークAと対比した場合
に、著しく高い活性を示すことにある。この観測は、PD
E2の場合と一致するが、図2によって特徴付けられる酵
素が、cGMP-特異的であるという事実(以下を参照のこ
と)は、文献に報告された古典的なPDE2と比較して、こ
れが新規な立体配座をもつことを示唆している。ピーク
A活性は、高アフィニティー触媒サイトの見掛け上の基
質飽和を示す。
【００２１】B. SW480からの古典的なPDE2の単離「 ピークB」のSW480からの単離を可能とし、結果として該
酵素が古典的なPDE2活性を示す(即ち、cGMP-特異的では
ないが、cGMP刺激性である)ものとする2つの方法を見出
した。その第一の方法は、150 cm2の組織培養フラスコ
の代わりに850 cm2のコーニング(Corning)回転ボトル中
で、該SW480を育成することを含む。SW480を、回転ボト
ル中で、0.5 rpmにて生育させた。ここで各ボトルは200
mlのRPMI1640、2 mMのグルタミンおよび25 mMのHEPESを
含む。細胞を以下の手順で収穫した。即ち、PBS培地を3
7℃にて即ち5分間加温した。200mlの5%FBS/RPMI 1640完
全培地を、調製し、5mlのグルタミンを添加した。5mlの
抗生物質/有糸分裂阻害剤をも添加した。
酵素が古典的なPDE2活性を示す(即ち、cGMP-特異的では
ないが、cGMP刺激性である)ものとする2つの方法を見出
した。その第一の方法は、150 cm2の組織培養フラスコ
の代わりに850 cm2のコーニング(Corning)回転ボトル中
で、該SW480を育成することを含む。SW480を、回転ボト
ル中で、0.5 rpmにて生育させた。ここで各ボトルは200
mlのRPMI1640、2 mMのグルタミンおよび25 mMのHEPESを
含む。細胞を以下の手順で収穫した。即ち、PBS培地を3
7℃にて即ち5分間加温した。200mlの5%FBS/RPMI 1640完
全培地を、調製し、5mlのグルタミンを添加した。5mlの
抗生物質/有糸分裂阻害剤をも添加した。
【００２２】70mlの該PBS溶液を、10mlの4Xパンクレア
チンに添加した。この混合物を室温に維持した。該培地
を除去し、該フラスコを4mlのPBSで洗い、該フラスコの
底部を確実に被覆した。全ての溶液をピペットで除去し
た。4mlの希釈したパンクレアチンを、該フラスコに添
加し、該フラスコを振とうして、その底部を被覆した。
該フラスコを37℃にて8-10分間インキュベートした。こ
のインキュベーションの後に、該フラスコを、倒立顕微
鏡下で迅速にチェックして、全ての細胞を確実に成長さ
せた。該フラスコの側部を注意深く数回たたいて、細胞
の分離を助けた。10mlの冷完全培地を、該フラスコに添
加して、パンクレアチンのタンパク分解を停止させた。
この溶液を該フラスコの底部で回転させて、細胞を集め
た。該培地を25mlのピペットを使用して除去し、該細胞
を、氷上の50ml遠沈管に入れた。該管を、4℃にて5分
間、臨床用の遠心分離器で、1000 rpmにて遠心処理し
て、細胞を集めた。得られた上澄を、流し出し、各ペレ
ットを15秒間液体窒素で凍結させた。この収穫した細胞
を、−70℃にて冷凍庫内に保存した。
チンに添加した。この混合物を室温に維持した。該培地
を除去し、該フラスコを4mlのPBSで洗い、該フラスコの
底部を確実に被覆した。全ての溶液をピペットで除去し
た。4mlの希釈したパンクレアチンを、該フラスコに添
加し、該フラスコを振とうして、その底部を被覆した。
該フラスコを37℃にて8-10分間インキュベートした。こ
のインキュベーションの後に、該フラスコを、倒立顕微
鏡下で迅速にチェックして、全ての細胞を確実に成長さ
せた。該フラスコの側部を注意深く数回たたいて、細胞
の分離を助けた。10mlの冷完全培地を、該フラスコに添
加して、パンクレアチンのタンパク分解を停止させた。
この溶液を該フラスコの底部で回転させて、細胞を集め
た。該培地を25mlのピペットを使用して除去し、該細胞
を、氷上の50ml遠沈管に入れた。該管を、4℃にて5分
間、臨床用の遠心分離器で、1000 rpmにて遠心処理し
て、細胞を集めた。得られた上澄を、流し出し、各ペレ
ットを15秒間液体窒素で凍結させた。この収穫した細胞
を、−70℃にて冷凍庫内に保存した。
【００２３】該収穫したSW480細胞由来のPDEを、FPLC手
順を利用して単離した。ファルマシア(Pharmacia) AKTA
FPLCを使用して、サンプルのカラムへの適用および18m
l DEAEトリスアクリルMカラム上で溶出した。約600,00
0,000個のSW480細胞を、このプロフィールのために使用
した。細胞をホモジナイゼーションバッファー(20mlのT
MPI-EDTA-トライトンpH 7.4: 20mMトリス-HOAc、5mM の
MgAc2、0.1mMのEDTA、0.8%のトライトン-100、10μMの
ベンズアミジン、10μMのTLCK、2000U/mlのアプロチニ
ン、2μMのロイペプチン、2μMのペプスタチンA)中に再
懸濁した後に、サンプルを手作業でホモジナイズした。
FPLCバッファーAは、8mMのトリス-アセテート、5mMのMg
アセテート、0.1mMのEDTAを含み、pH 7.5であり、バッ
ファーBは、8mMのトリス-アセテート、5mMのMgアセテー
ト、0.1mMのEDTA、1MのNaアセテートを含み、pH 7.5で
ある。上澄を1ml/分にて該カラムに適用し、次いで1ml/
分にて60mlのバッファーAで洗浄した。勾配溶出は、60m
l中0-15%のバッファーB、60ml中15-50%のバッファーBお
よび16ml中50-100%のバッファーBにて行った。この勾配
溶出中、1.5mlづつの画分を集めた。
順を利用して単離した。ファルマシア(Pharmacia) AKTA
FPLCを使用して、サンプルのカラムへの適用および18m
l DEAEトリスアクリルMカラム上で溶出した。約600,00
0,000個のSW480細胞を、このプロフィールのために使用
した。細胞をホモジナイゼーションバッファー(20mlのT
MPI-EDTA-トライトンpH 7.4: 20mMトリス-HOAc、5mM の
MgAc2、0.1mMのEDTA、0.8%のトライトン-100、10μMの
ベンズアミジン、10μMのTLCK、2000U/mlのアプロチニ
ン、2μMのロイペプチン、2μMのペプスタチンA)中に再
懸濁した後に、サンプルを手作業でホモジナイズした。
FPLCバッファーAは、8mMのトリス-アセテート、5mMのMg
アセテート、0.1mMのEDTAを含み、pH 7.5であり、バッ
ファーBは、8mMのトリス-アセテート、5mMのMgアセテー
ト、0.1mMのEDTA、1MのNaアセテートを含み、pH 7.5で
ある。上澄を1ml/分にて該カラムに適用し、次いで1ml/
分にて60mlのバッファーAで洗浄した。勾配溶出は、60m
l中0-15%のバッファーB、60ml中15-50%のバッファーBお
よび16ml中50-100%のバッファーBにて行った。この勾配
溶出中、1.5mlづつの画分を集めた。
【００２４】得られたプロフィールは、上で得た新規な
PDE活性をもつものに対するプロフィール(例えば、図1
を参照のこと)と類似している(図26)が、このようにし
て単離したピークBは、5μMのcGMPによって2-3倍に活性
化された、0.25μMの基質濃度において、cAMP加水分解
活性を示した。SW480からの古典的なPDE2の単離に使用
した第二の方法は、上記(第IA章参照)の非-FPLC DEAE手
順を利用して実施した。但し、該バッファーが30%のエ
チレングリコール、10mMのTLCKおよび3.6mMのβ-メルカ
プトエタノールを含むように変更した。これら試薬の該
バッファーへの添加は、酢酸ナトリウム濃度の低い部分
から高い部分への、溶出プロフィールにおけるシフト
(図25参照)を生じ、結果としてピークAは、40から150mM
に移動し、ピークBは75から280mMに移動し、またピーク
Cは200から500mMに移動した(図25を参照のこと)。図25
におけるピークBは、2μMのcAMP基質を使用してアッセ
イし、5μMのcGMPによって2倍に活性化されることを示
した(図‐Yを参照)。該選択的PDE2阻害剤EHNAは、IC
501.6μMにて、このピークBの2μM cGMP PDE活性を阻害
し、かつ IC503.8μM(および10μMのロリプラムの添加
によって、2.5μMのIC50)にて、このピークBの2.0μM c
AMP PDE活性を阻害した。
PDE活性をもつものに対するプロフィール(例えば、図1
を参照のこと)と類似している(図26)が、このようにし
て単離したピークBは、5μMのcGMPによって2-3倍に活性
化された、0.25μMの基質濃度において、cAMP加水分解
活性を示した。SW480からの古典的なPDE2の単離に使用
した第二の方法は、上記(第IA章参照)の非-FPLC DEAE手
順を利用して実施した。但し、該バッファーが30%のエ
チレングリコール、10mMのTLCKおよび3.6mMのβ-メルカ
プトエタノールを含むように変更した。これら試薬の該
バッファーへの添加は、酢酸ナトリウム濃度の低い部分
から高い部分への、溶出プロフィールにおけるシフト
(図25参照)を生じ、結果としてピークAは、40から150mM
に移動し、ピークBは75から280mMに移動し、またピーク
Cは200から500mMに移動した(図25を参照のこと)。図25
におけるピークBは、2μMのcAMP基質を使用してアッセ
イし、5μMのcGMPによって2倍に活性化されることを示
した(図‐Yを参照)。該選択的PDE2阻害剤EHNAは、IC
501.6μMにて、このピークBの2μM cGMP PDE活性を阻害
し、かつ IC503.8μM(および10μMのロリプラムの添加
によって、2.5μMのIC50)にて、このピークBの2.0μM c
AMP PDE活性を阻害した。
【００２５】C. PDEピークAのcGMP-特異性および該新規
ピークBの活性 また、第IA章の該DEAEカラムからの各画分を、Ca++また
はCa++-CaMおよび/またはEDTAの存在下または不在下に
おけるcGMP-加水分解活性(0.25μM cGMP)および5μMのc
GMPの存在下または不在下におけるcAMP(0.25μM cAMP)
加水分解活性についてもアッセイした。PDEピークAもピ
ークBも(画分5-22; 図1を参照のこと)、有意にcAMPを加
水分解せず、このことはこれら何れもがPDEの古典的なc
AMP-加水分解群(即ち、PDE1、2、3)の活性をもたないこ
とを立証している。(カルモジュリンの存在下または不
在下で) Ca++は、ピークAまたはピークB何れかの、cAMP
またはcGMP加水分解活性を活性化せず、またcGMPはcAMP
加水分解を活性化または阻害しなかった。このような結
果は、ピークAおよびピークBが、cGMP-特異的活性を構
成するが、古典的なまたは以前に知られていたPDE1、PD
E2、PDE3またはPDE4活性を構成しないことを立証してい
る。以下で論ずるように、該新規なPDEピークBに関連し
て、環状GMPは、該酵素の該cGMP加水分解活性を活性化
するが、(上記第IB章と対照的に)如何なるcAMP加水分解
活性をも活性化しなかった。このことは、該新規なPDE
ピークB、即ち本発明の新規なホスホジエステラーゼ
が、cGMP-刺激cAMP加水分解(「cGS」)ではなく、あるいは
該古典的なまたは公知のPDE2群の活性でもないことを示
した。というのは、該公知のPDE2のイソ型は、cGMPおよ
びcAMP両者を加水分解するからである。
ピークBの活性 また、第IA章の該DEAEカラムからの各画分を、Ca++また
はCa++-CaMおよび/またはEDTAの存在下または不在下に
おけるcGMP-加水分解活性(0.25μM cGMP)および5μMのc
GMPの存在下または不在下におけるcAMP(0.25μM cAMP)
加水分解活性についてもアッセイした。PDEピークAもピ
ークBも(画分5-22; 図1を参照のこと)、有意にcAMPを加
水分解せず、このことはこれら何れもがPDEの古典的なc
AMP-加水分解群(即ち、PDE1、2、3)の活性をもたないこ
とを立証している。(カルモジュリンの存在下または不
在下で) Ca++は、ピークAまたはピークB何れかの、cAMP
またはcGMP加水分解活性を活性化せず、またcGMPはcAMP
加水分解を活性化または阻害しなかった。このような結
果は、ピークAおよびピークBが、cGMP-特異的活性を構
成するが、古典的なまたは以前に知られていたPDE1、PD
E2、PDE3またはPDE4活性を構成しないことを立証してい
る。以下で論ずるように、該新規なPDEピークBに関連し
て、環状GMPは、該酵素の該cGMP加水分解活性を活性化
するが、(上記第IB章と対照的に)如何なるcAMP加水分解
活性をも活性化しなかった。このことは、該新規なPDE
ピークB、即ち本発明の新規なホスホジエステラーゼ
が、cGMP-刺激cAMP加水分解(「cGS」)ではなく、あるいは
該古典的なまたは公知のPDE2群の活性でもないことを示
した。というのは、該公知のPDE2のイソ型は、cGMPおよ
びcAMP両者を加水分解するからである。
【００２６】D. ピークAは、古典的なPDE5であるが、該
新規なピークB、即ち新規なcGMP-特異的PDEは古典的な
ものではない 任意のPDEイソ型を特徴付けするためには、速度論的な
挙動および基質選択性を評価すべきである。ピークA
は、典型的な「PDE5」の特徴を示した。例えば、cGMPに対
する該酵素のK mは、1.07μMであり、またVmaxは、0.16n
M/分/mgであった。更に、以下に議論するように、ザプ
リナスト(IC50=1.37μM)およびE4021 (IC50=3nM)および
シルデナフィル(sildenafil)は、ピークAの活性を阻害
した。更に、ザプリナストは、ピークAのcGMP加水分解
活性に対する阻害性を示したが、これは文献に記載され
た結果と一致している。第IA章のPDEピークBは、PDEピ
ークAに比してかなり異なる速度論的特性を示した。例
えば、ピークAのイーディー-ホフスティー(Eadie-Hofst
ee)プロットにおいて、環状GMP加水分解は、増大する基
質濃度について、負の傾きをもつ単一のラインを示し、
このことはミハエリス-メンテンの速度論的な挙動を示
すことを意味する。しかしながら、ピークBは、増大す
るcGMP基質濃度について、減少し次いで増大するイーデ
ィー-ホフスティープロットの傾き(Km<1)を示す、cAMP
の不在下におけるcGMP加水分解に関して、新規な特性を
示す(図3を参照)。かくして、このことは、cGMPに対す
るピークBのサブミクロモルアフィニティー(即ち、ここ
ではKm<1)を立証している。
新規なピークB、即ち新規なcGMP-特異的PDEは古典的な
ものではない 任意のPDEイソ型を特徴付けするためには、速度論的な
挙動および基質選択性を評価すべきである。ピークA
は、典型的な「PDE5」の特徴を示した。例えば、cGMPに対
する該酵素のK mは、1.07μMであり、またVmaxは、0.16n
M/分/mgであった。更に、以下に議論するように、ザプ
リナスト(IC50=1.37μM)およびE4021 (IC50=3nM)および
シルデナフィル(sildenafil)は、ピークAの活性を阻害
した。更に、ザプリナストは、ピークAのcGMP加水分解
活性に対する阻害性を示したが、これは文献に記載され
た結果と一致している。第IA章のPDEピークBは、PDEピ
ークAに比してかなり異なる速度論的特性を示した。例
えば、ピークAのイーディー-ホフスティー(Eadie-Hofst
ee)プロットにおいて、環状GMP加水分解は、増大する基
質濃度について、負の傾きをもつ単一のラインを示し、
このことはミハエリス-メンテンの速度論的な挙動を示
すことを意味する。しかしながら、ピークBは、増大す
るcGMP基質濃度について、減少し次いで増大するイーデ
ィー-ホフスティープロットの傾き(Km<1)を示す、cAMP
の不在下におけるcGMP加水分解に関して、新規な特性を
示す(図3を参照)。かくして、このことは、cGMPに対す
るピークBのサブミクロモルアフィニティー(即ち、ここ
ではKm<1)を立証している。
【００２７】該速度論的研究(即ち、図3)およびcGMPの
存在下における正の協働的速度論的挙動と一致して、cG
MP基質の増大する濃度の存在下における、cGMP加水分解
活性は増大した。このことは、第二のDEAE分離後に、PD
EピークBの存在下で、cGMP濃度0.25μM、2μMおよび5μ
Mを比較し、cAMP加水分解を除外しかつ以前にPDE5であ
ると同定されたこの新規な酵素を除外することによって
見出された。より高いcGMP濃度は、図2に示すように、P
DEピークBと共に、不当に高いcGMP加水分解をもたらし
た。これら観測は、該ピークB酵素と結合したcGMPが、
該酵素中に立体配座の変化を生ずることを示唆してい
る。このことは、腫瘍形成細胞由来の該本来の酵素を使
用する利点を確証しているが、本発明は上に示した諸特
性を有する該酵素の本来の形状に制限されない。
存在下における正の協働的速度論的挙動と一致して、cG
MP基質の増大する濃度の存在下における、cGMP加水分解
活性は増大した。このことは、第二のDEAE分離後に、PD
EピークBの存在下で、cGMP濃度0.25μM、2μMおよび5μ
Mを比較し、cAMP加水分解を除外しかつ以前にPDE5であ
ると同定されたこの新規な酵素を除外することによって
見出された。より高いcGMP濃度は、図2に示すように、P
DEピークBと共に、不当に高いcGMP加水分解をもたらし
た。これら観測は、該ピークB酵素と結合したcGMPが、
該酵素中に立体配座の変化を生ずることを示唆してい
る。このことは、腫瘍形成細胞由来の該本来の酵素を使
用する利点を確証しているが、本発明は上に示した諸特
性を有する該酵素の本来の形状に制限されない。
【００２８】E. ピークAに対するPDEピークBのザプリナ
スト-およびシルデナフィル-不感受性および他のPDE阻
害剤に及ぼすその作用 種々のPDE阻害剤を、0.01-100μMなる範囲の薬物の、12
種の濃度および0.25μM 3H-cGMPなる基質濃度を使用し
て、研究した。IC50値を、種々の傾きについて計算し、
S字状のカーブを、プリズム(Prism) 2.01 (グラフパッ
ド(GraphPad))を使用して、適合させる。結果を表1に示
す。化合物E4021およびザプリナストは(高いアフィニテ
ィーで)ピークAを阻害したが、ピークBにおける該新規
なPDE活性に対して計算したIC50値(第IA章)は、有意に
増加する(>50倍)。このことは、ピークAがPDE5であるこ
とを確認している。これらデータは、更に本発明の新規
なPDE活性が、あらゆる実際の目的にとって、ザプリナ
スト-不感受性およびE4021-不感受性であることを示し
ている。
スト-およびシルデナフィル-不感受性および他のPDE阻
害剤に及ぼすその作用 種々のPDE阻害剤を、0.01-100μMなる範囲の薬物の、12
種の濃度および0.25μM 3H-cGMPなる基質濃度を使用し
て、研究した。IC50値を、種々の傾きについて計算し、
S字状のカーブを、プリズム(Prism) 2.01 (グラフパッ
ド(GraphPad))を使用して、適合させる。結果を表1に示
す。化合物E4021およびザプリナストは(高いアフィニテ
ィーで)ピークAを阻害したが、ピークBにおける該新規
なPDE活性に対して計算したIC50値(第IA章)は、有意に
増加する(>50倍)。このことは、ピークAがPDE5であるこ
とを確認している。これらデータは、更に本発明の新規
なPDE活性が、あらゆる実際の目的にとって、ザプリナ
スト-不感受性およびE4021-不感受性であることを示し
ている。
【００２９】
【表１】表1: ピークAおよび第IA章のピークBに対するP
DE阻害剤(cGMP加水分解)の比較
DE阻害剤(cGMP加水分解)の比較
【００３０】対比により、スリンダクスルフィドおよび
化合物Eは、同様な力価で(IC50=0.38μM(PDEヒ゜ークAに対
して); 0.37μM(PDEヒ゜ークBに対して))、両ピークAおよび
Bを競合的に阻害した。ピークB(その何れかの形態)が、
ザプリナスト不感受性であり、かつピークAおよびB両者
が、スリンダクスルフィドおよび化合物Eに対して感受
性であるという事実において、腫瘍形成の治療にとっ
て、およびこのような治療のための有用な化合物の選別
にとって、有意さが見られる。我々は、ザプリナスト、
E4021およびシルデナフィルをテストして、これらがア
ポトーシスを誘発するか否か、あるいは腫瘍形成細胞の
成長を阻害するか否かについて確認し、また同様な確認
を化合物Eについても実施した。以下に説明するよう
に、ザプリナスト自体は、有意なアポトーシス-誘発ま
たは成長-阻害特性を示さないが、スリンダクスルフィ
ドおよび化合物Eは、全く正反対である。換言すれば、
ある化合物のPDEピークAおよびB両者を阻害する能力
は、腫瘍形成細胞におけるそのアポトーシス誘発能力と
相関があり、一方ある化合物(例えば、ザプリナスト)が
PDEピークAのみに特異性を示す場合には、該化合物自体
はアポトーシスを誘発しないであろう。
化合物Eは、同様な力価で(IC50=0.38μM(PDEヒ゜ークAに対
して); 0.37μM(PDEヒ゜ークBに対して))、両ピークAおよび
Bを競合的に阻害した。ピークB(その何れかの形態)が、
ザプリナスト不感受性であり、かつピークAおよびB両者
が、スリンダクスルフィドおよび化合物Eに対して感受
性であるという事実において、腫瘍形成の治療にとっ
て、およびこのような治療のための有用な化合物の選別
にとって、有意さが見られる。我々は、ザプリナスト、
E4021およびシルデナフィルをテストして、これらがア
ポトーシスを誘発するか否か、あるいは腫瘍形成細胞の
成長を阻害するか否かについて確認し、また同様な確認
を化合物Eについても実施した。以下に説明するよう
に、ザプリナスト自体は、有意なアポトーシス-誘発ま
たは成長-阻害特性を示さないが、スリンダクスルフィ
ドおよび化合物Eは、全く正反対である。換言すれば、
ある化合物のPDEピークAおよびB両者を阻害する能力
は、腫瘍形成細胞におけるそのアポトーシス誘発能力と
相関があり、一方ある化合物(例えば、ザプリナスト)が
PDEピークAのみに特異性を示す場合には、該化合物自体
はアポトーシスを誘発しないであろう。
【００３１】F. cGMP-依存性プロテインキナーゼGとの
インキュベーションに対する、該新規なPDEピークBの不
感受性 PDEピークAと該新規なピークB(第IA章)との間の更なる
差違は、変動する濃度のcGMP-依存性プロテインキナー
ゼG(これは典型的なPDE5をホスホリル化する)の存在下
で、その各cGMP-加水分解活性においてみられた。具体
的には、第IA章からのピークAおよびピークB画分を、種
々の濃度のプロテインキナーゼGと共に、30℃にて30分
間インキュベートした。両ピークの環状GMP加水分解
は、ホスホリル化を試みた後にアッセイした。PDE5に関
する以前に公開された情報と一致して、ピークAは、プ
ロテインキナーゼGとのインキュベーションに応答し
て、cGMP加水分解活性の増大を示したが、これはピーク
Aが、ホスホリル化されることを示している。しかし、
ピークBは不変であった(即ち、ホスホリル化されず、か
つcGMP-依存性プロテインキナーゼGとのインキュベーシ
ョンに対して不感受性であった)。これらのデータは、
ピークAが公知のPDE5群と一致するイソ型であり、かつ
第IA章からのピークBが新規なcGMP-特異的PDE活性を持
つものであることと一致している。
インキュベーションに対する、該新規なPDEピークBの不
感受性 PDEピークAと該新規なピークB(第IA章)との間の更なる
差違は、変動する濃度のcGMP-依存性プロテインキナー
ゼG(これは典型的なPDE5をホスホリル化する)の存在下
で、その各cGMP-加水分解活性においてみられた。具体
的には、第IA章からのピークAおよびピークB画分を、種
々の濃度のプロテインキナーゼGと共に、30℃にて30分
間インキュベートした。両ピークの環状GMP加水分解
は、ホスホリル化を試みた後にアッセイした。PDE5に関
する以前に公開された情報と一致して、ピークAは、プ
ロテインキナーゼGとのインキュベーションに応答し
て、cGMP加水分解活性の増大を示したが、これはピーク
Aが、ホスホリル化されることを示している。しかし、
ピークBは不変であった(即ち、ホスホリル化されず、か
つcGMP-依存性プロテインキナーゼGとのインキュベーシ
ョンに対して不感受性であった)。これらのデータは、
ピークAが公知のPDE5群と一致するイソ型であり、かつ
第IA章からのピークBが新規なcGMP-特異的PDE活性を持
つものであることと一致している。
【００３２】G. 前立腺癌および乳癌細胞系における新
規なピークB この新規なピークBは、また上でSW480からこれを単離す
るのに使用した手順と同様な手順によって、2つの他の
腫瘍形成細胞系、即ち乳癌細胞系、HTB-26および前立腺
癌細胞系、LnCAPからも単離された。該プロトコール
は、幾つかの点で変更した。種々の細胞系の比較を可能
とする、より高い再現性を達成するために、ファルマシ
アAKTA FPLCを使用して、18mL DEAE トリスアクリルMカ
ラムへのサンプルの適用および溶出を制御した。SW480
をこれと同一の手順で多数回に渡り処理して、ピークB
の基準を得た。このプロフィールのために、200,000,00
0~400,000,000個のSW480細胞を使用した。このプロフィ
ールのために、LnCAP細胞70,000,000個を使用し(図22お
よび23を参照)、また別の実験では、このプロフィール
のために、HTB-26細胞32,000,000個を使用した(図20お
よび21参照)。細胞をホモジナイゼーションバッファー
に再懸濁した後に、サンプルを相互にホモジナイズし
た。FPLCバッファーAは、8mMのトリス-アセテート、5mM
のMgアセテート、0.1mMのEDTA、pH 7.5からなり、また
バッファーBは、8mMのトリス-アセテート、5mMのMgアセ
テート、0.1mMのEDTA、1MのNaアセテートpH 7.5からな
っていた。上澄を1ml/分にて該カラムに適用し、次いで
60mlのバッファーAで、1ml/分にて洗浄した。
規なピークB この新規なピークBは、また上でSW480からこれを単離す
るのに使用した手順と同様な手順によって、2つの他の
腫瘍形成細胞系、即ち乳癌細胞系、HTB-26および前立腺
癌細胞系、LnCAPからも単離された。該プロトコール
は、幾つかの点で変更した。種々の細胞系の比較を可能
とする、より高い再現性を達成するために、ファルマシ
アAKTA FPLCを使用して、18mL DEAE トリスアクリルMカ
ラムへのサンプルの適用および溶出を制御した。SW480
をこれと同一の手順で多数回に渡り処理して、ピークB
の基準を得た。このプロフィールのために、200,000,00
0~400,000,000個のSW480細胞を使用した。このプロフィ
ールのために、LnCAP細胞70,000,000個を使用し(図22お
よび23を参照)、また別の実験では、このプロフィール
のために、HTB-26細胞32,000,000個を使用した(図20お
よび21参照)。細胞をホモジナイゼーションバッファー
に再懸濁した後に、サンプルを相互にホモジナイズし
た。FPLCバッファーAは、8mMのトリス-アセテート、5mM
のMgアセテート、0.1mMのEDTA、pH 7.5からなり、また
バッファーBは、8mMのトリス-アセテート、5mMのMgアセ
テート、0.1mMのEDTA、1MのNaアセテートpH 7.5からな
っていた。上澄を1ml/分にて該カラムに適用し、次いで
60mlのバッファーAで、1ml/分にて洗浄した。
【００３３】勾配溶出を、60ml中0-15%のバッファーB、
60ml中15-50%のバッファーBおよび16ml中50-100%のバッ
ファーBで実施した。この勾配溶出中、1.5mlの画分を集
めた。cGMP PDE活性を示すピークは、画分65近傍にて溶
出され、これは400mM Naアセテートに相当した(図20-23
を参照)。この活性は、0.25μMのcGMPにて測定した(cGM
Pに対するサブミクロモルアフィニティーを示す)。PDE4
-特異的薬物であるロリプラムは、cAMP PDE活性の殆ど
を阻害した(即ち、該cAMP活性はPDE4によるものである)
が、このことは該ピークBのcGMP活性が、cAMPよりもcGM
Pに対して特異的であることを示している。３つ全ての
ピークB(SW480、HTB-26およびLnCAP由来の)は、カルシ
ウム/カルモジュリンによる刺激を示さず、またザプリ
ナストに類似する特異的PDE5-阻害剤である100nMのE402
1に対して抵抗性であった(図20および22を参照)。該ピ
ークBは、また基質の量を0.25μMから5μM cGMPに増加
した場合に、活性における著しい増加を示した(このこ
とは、正の協同的な速度論を示唆している)(図21および
23を参照)。また、これら３つのピークは、以下に示す
エグジスリンド(exisulind)および化合物Iによる同様な
阻害を示す。
60ml中15-50%のバッファーBおよび16ml中50-100%のバッ
ファーBで実施した。この勾配溶出中、1.5mlの画分を集
めた。cGMP PDE活性を示すピークは、画分65近傍にて溶
出され、これは400mM Naアセテートに相当した(図20-23
を参照)。この活性は、0.25μMのcGMPにて測定した(cGM
Pに対するサブミクロモルアフィニティーを示す)。PDE4
-特異的薬物であるロリプラムは、cAMP PDE活性の殆ど
を阻害した(即ち、該cAMP活性はPDE4によるものである)
が、このことは該ピークBのcGMP活性が、cAMPよりもcGM
Pに対して特異的であることを示している。３つ全ての
ピークB(SW480、HTB-26およびLnCAP由来の)は、カルシ
ウム/カルモジュリンによる刺激を示さず、またザプリ
ナストに類似する特異的PDE5-阻害剤である100nMのE402
1に対して抵抗性であった(図20および22を参照)。該ピ
ークBは、また基質の量を0.25μMから5μM cGMPに増加
した場合に、活性における著しい増加を示した(このこ
とは、正の協同的な速度論を示唆している)(図21および
23を参照)。また、これら３つのピークは、以下に示す
エグジスリンド(exisulind)および化合物Iによる同様な
阻害を示す。
【００３４】II. プロテインキナーゼGおよびβ-カテニ
ンの関与‐一般論 一連の実験を行って、あるとすれば、抗−腫瘍性cGMP-
特異的PDE阻害剤、例えばエグジスリンドが、腺腫様ポ
リープコリ遺伝子(「APC遺伝子」)欠陥またはβ-カテニン
をコードする遺伝子における欠陥を含む、腫瘍形成細胞
内の、cGMP-依存性プロテインキナーゼGに、如何なる作
用を及ぼすかを確認した。以下に説明するように、この
ような阻害剤は、かかる腫瘍形成細胞内のPKG活性の増
大を招く。この活性における増加は、何れかの欠陥を含
む細胞中のPKGの高い活性ばかりか、該APC欠陥を含む細
胞中のPKGの高い発現性によるものであった。更に、何
れかの欠陥を持つ腫瘍形成細胞由来のPKGが免疫沈殿し
た場合に、これはβ-カテニンと共に沈殿する。
ンの関与‐一般論 一連の実験を行って、あるとすれば、抗−腫瘍性cGMP-
特異的PDE阻害剤、例えばエグジスリンドが、腺腫様ポ
リープコリ遺伝子(「APC遺伝子」)欠陥またはβ-カテニン
をコードする遺伝子における欠陥を含む、腫瘍形成細胞
内の、cGMP-依存性プロテインキナーゼGに、如何なる作
用を及ぼすかを確認した。以下に説明するように、この
ような阻害剤は、かかる腫瘍形成細胞内のPKG活性の増
大を招く。この活性における増加は、何れかの欠陥を含
む細胞中のPKGの高い活性ばかりか、該APC欠陥を含む細
胞中のPKGの高い発現性によるものであった。更に、何
れかの欠陥を持つ腫瘍形成細胞由来のPKGが免疫沈殿し
た場合に、これはβ-カテニンと共に沈殿する。
【００３５】β-カテニンは、種々の異なる癌中に含ま
れる。というのは、多くの研究者が、該APC腫瘍-抑制遺
伝子内に変異を含む腫瘍に罹った患者中に、これを高濃
度で見い出したからである。誕生時点においてこの遺伝
子に変異を持つ人々は、しばしば結腸の内壁に、数千の
小さな腫瘍を発生する。これが、適当に機能すると、該
APC遺伝子は、β-カテニンと結合し、これを調節すると
考えられる正常なAPCタンパクをコードする。かくし
て、該APC遺伝子欠陥または該β-カテニン欠陥の何れか
を含む腫瘍形成細胞内のPKGが、β-カテニンと結合する
という発見は、実際に、癌へと導く主な細胞経路の一つ
におけるPKGと高い関連性を持つ。更に、PKGの増大とcG
MP-特異的阻害との間の相関関係のために、(SAANDで処
理した場合には)このような細胞中のPKG/β-カテニン/A
PC欠陥とcGMPとが結合する。この後者の結合は、更にβ
-カテニン自体が、該APC欠陥または該β-カテニン欠陥
を含む腫瘍形成細胞が、SAANDに暴露された場合に、減
少するという観測によって支持される。このβ-カテニ
ンの減少は、PKG自体によって開始される。PKGはβ-カ
テニンをホスホリル化するが、これは本発明に関連する
もう一つの新規な観測である。β-カテニンのホスホリ
ル化は、β-カテニンの、ユビキチン-プロテアソーム系
による分解を可能とする。
れる。というのは、多くの研究者が、該APC腫瘍-抑制遺
伝子内に変異を含む腫瘍に罹った患者中に、これを高濃
度で見い出したからである。誕生時点においてこの遺伝
子に変異を持つ人々は、しばしば結腸の内壁に、数千の
小さな腫瘍を発生する。これが、適当に機能すると、該
APC遺伝子は、β-カテニンと結合し、これを調節すると
考えられる正常なAPCタンパクをコードする。かくし
て、該APC遺伝子欠陥または該β-カテニン欠陥の何れか
を含む腫瘍形成細胞内のPKGが、β-カテニンと結合する
という発見は、実際に、癌へと導く主な細胞経路の一つ
におけるPKGと高い関連性を持つ。更に、PKGの増大とcG
MP-特異的阻害との間の相関関係のために、(SAANDで処
理した場合には)このような細胞中のPKG/β-カテニン/A
PC欠陥とcGMPとが結合する。この後者の結合は、更にβ
-カテニン自体が、該APC欠陥または該β-カテニン欠陥
を含む腫瘍形成細胞が、SAANDに暴露された場合に、減
少するという観測によって支持される。このβ-カテニ
ンの減少は、PKG自体によって開始される。PKGはβ-カ
テニンをホスホリル化するが、これは本発明に関連する
もう一つの新規な観測である。β-カテニンのホスホリ
ル化は、β-カテニンの、ユビキチン-プロテアソーム系
による分解を可能とする。
【００３６】PKGによるこのβ-カテニンのホスホリル化
は、腫瘍形成細胞において重要である。というのは、こ
れは該APCおよびβ-カテニンの変異の効果を阻害するか
らである。該変異を受けたAPCタンパクは、該変異APCタ
ンパクと結合した該β-カテニンの結合性に影響を与え
る。この結合における変化は、これまでGSK-3bによるβ
-カテニンのホスホリル化を妨害するものと考えられて
きた。変異β-カテニンの場合、PKG活性の増大が、該変
異β-カテニンのホスホリル化をも可能とする。CGMP-PD
E阻害による腫瘍におけるPKG活性を高めることによっ
て、何れかの型の変異を含む腫瘍形成細胞内の、β-カ
テニンの(その分解に導く)ホスホリル化が可能となる。
簡単に言えば、これらの発見は、更なるSAAND候補化合
物の同定のための新規な薬理的スクリーニング法に導く
のみならず、腫瘍形成に対する治療法における、cGMP-
特異的PDE阻害の役割をも補強する。この観測は、また
該APC欠陥を持つおよび持たない腫瘍形成両者が、上記
のように治療できることから、予想外に広い範囲の腫瘍
形成SAANDを阻害可能であることを説明できる。
は、腫瘍形成細胞において重要である。というのは、こ
れは該APCおよびβ-カテニンの変異の効果を阻害するか
らである。該変異を受けたAPCタンパクは、該変異APCタ
ンパクと結合した該β-カテニンの結合性に影響を与え
る。この結合における変化は、これまでGSK-3bによるβ
-カテニンのホスホリル化を妨害するものと考えられて
きた。変異β-カテニンの場合、PKG活性の増大が、該変
異β-カテニンのホスホリル化をも可能とする。CGMP-PD
E阻害による腫瘍におけるPKG活性を高めることによっ
て、何れかの型の変異を含む腫瘍形成細胞内の、β-カ
テニンの(その分解に導く)ホスホリル化が可能となる。
簡単に言えば、これらの発見は、更なるSAAND候補化合
物の同定のための新規な薬理的スクリーニング法に導く
のみならず、腫瘍形成に対する治療法における、cGMP-
特異的PDE阻害の役割をも補強する。この観測は、また
該APC欠陥を持つおよび持たない腫瘍形成両者が、上記
のように治療できることから、予想外に広い範囲の腫瘍
形成SAANDを阻害可能であることを説明できる。
【００３７】III. PDEを使用する薬理組成物のスクリー
ニング A. 一般論 本発明の新規なPDEおよびPDE2は、PDE5の存在下または
不在下で、腫瘍形成を治療しまたは予防することを可能
とし、かつ重度の副作用を特徴としない化合物を同定す
るために有用である。癌および前癌は、調節されない細
胞成長を含む疾患であると考えることが出来る。細胞成
長は、多数の異なる因子を含む。その因子の一つは、ど
の程度迅速に細胞が増殖するかであり、もう一つは、い
かに迅速に細胞が死滅するかである。細胞は、環境的な
刺激の型に依存して、壊死またはアポトーシスの何れか
によって死亡する可能性がある。細胞の分化は、腫瘍の
成長速度に影響を与えるもう一つの因子である。細胞成
長のこれら多数の局面の何れが、ある化合物によって影
響されるかを解明することは、薬理療法に関連するター
ゲットの発見にとって重要である。この技術に基づくス
クリーニングアッセイは、その他のテストと組み合わせ
て、成長阻害およびプロ-アポトーシス(pro-apoptotic)
活性を有する化合物を選別することを可能とする。
ニング A. 一般論 本発明の新規なPDEおよびPDE2は、PDE5の存在下または
不在下で、腫瘍形成を治療しまたは予防することを可能
とし、かつ重度の副作用を特徴としない化合物を同定す
るために有用である。癌および前癌は、調節されない細
胞成長を含む疾患であると考えることが出来る。細胞成
長は、多数の異なる因子を含む。その因子の一つは、ど
の程度迅速に細胞が増殖するかであり、もう一つは、い
かに迅速に細胞が死滅するかである。細胞は、環境的な
刺激の型に依存して、壊死またはアポトーシスの何れか
によって死亡する可能性がある。細胞の分化は、腫瘍の
成長速度に影響を与えるもう一つの因子である。細胞成
長のこれら多数の局面の何れが、ある化合物によって影
響されるかを解明することは、薬理療法に関連するター
ゲットの発見にとって重要である。この技術に基づくス
クリーニングアッセイは、その他のテストと組み合わせ
て、成長阻害およびプロ-アポトーシス(pro-apoptotic)
活性を有する化合物を選別することを可能とする。
【００３８】本発明は、幾つかの重大な発見の産物であ
る。まず、本発明者は、腫瘍細胞成長の望ましい阻害剤
が、アポトーシスによって癌細胞の早期の死を誘発する
ことを見出した(Piazza, G.A.等, Cancer Research, 19
95, 55(14):3110-16)。第二に、本発明者等の数名は、
予想外のことに、実質的なCOXの阻害なしに、選択的に
アポトーシスを誘発する化合物が、PDE5をも阻害するこ
とを発見した。殊におよび主流の科学的研究とは対照的
に、腫瘍性病変を治療するための所定の化合物が、PDE5
を阻害する(EC 3.1.4.17)。PDE5は、ホスホジエステラ
ーゼの少なくとも10群の遺伝子群の一つである。PDE5お
よび本発明の新規なPDEは、これらがcAMPではなく、環
状のGMPを選択的に分解させるという点で特有なもので
あり、一方PDEのその他の群は、cGMPではなく、cAMPを
選択的に分解/加水分解するか、非−選択的にcGMPおよ
びcAMP両者を分解する。好ましくは、腫瘍形成を治療す
るのに使用される所定の化合物は、実質上非−選択的に
阻害することはないか、あるいはcAMP分解性ホスホジエ
ステラーゼ型のものである。
る。まず、本発明者は、腫瘍細胞成長の望ましい阻害剤
が、アポトーシスによって癌細胞の早期の死を誘発する
ことを見出した(Piazza, G.A.等, Cancer Research, 19
95, 55(14):3110-16)。第二に、本発明者等の数名は、
予想外のことに、実質的なCOXの阻害なしに、選択的に
アポトーシスを誘発する化合物が、PDE5をも阻害するこ
とを発見した。殊におよび主流の科学的研究とは対照的
に、腫瘍性病変を治療するための所定の化合物が、PDE5
を阻害する(EC 3.1.4.17)。PDE5は、ホスホジエステラ
ーゼの少なくとも10群の遺伝子群の一つである。PDE5お
よび本発明の新規なPDEは、これらがcAMPではなく、環
状のGMPを選択的に分解させるという点で特有なもので
あり、一方PDEのその他の群は、cGMPではなく、cAMPを
選択的に分解/加水分解するか、非−選択的にcGMPおよ
びcAMP両者を分解する。好ましくは、腫瘍形成を治療す
るのに使用される所定の化合物は、実質上非−選択的に
阻害することはないか、あるいはcAMP分解性ホスホジエ
ステラーゼ型のものである。
【００３９】B. COXスクリーニング 本発明の好ましい態様は、与えられた化合物のシクロオ
キシゲナーゼ阻害活性を測定し、かつ該化合物のcGMP-
特異的PDE阻害活性を測定する工程を含む。該テスト化
合物を、直接または腫瘍性病変を治療するのに有用な公
知の化合物に対する、その活性を比較することによって
間接的に、その腫瘍性病変を治療する能力について評価
する。胃を刺激すること無しに、腫瘍性病変を治療する
のに有効であることが知られている標準的な化合物は、
5-フルオロ-2-メチル-1-(p-メチルスルフォニルベンジ
リデン)-3-インデニル酢酸(エグジスリンド)である。比
較の目的で、その他の有用な化合物は、COXを阻害する
ことが知られているものであって、例えばインドメタシ
ンおよびスリンダクの硫黄代謝物: 5-フルオロ-2-メチ
ル-1-(p-メチルスルフィニルベンジリデン)-3-インデニ
ル酢酸(スリンダクスルフィド)を包含する。比較の目的
で有用な他の化合物は、cGMP-特異的PDEを阻害する化合
物、例えば1-(3-クロロアニリノ)-4-フェニルフタラジ
ン(MY5445)を包含する。
キシゲナーゼ阻害活性を測定し、かつ該化合物のcGMP-
特異的PDE阻害活性を測定する工程を含む。該テスト化
合物を、直接または腫瘍性病変を治療するのに有用な公
知の化合物に対する、その活性を比較することによって
間接的に、その腫瘍性病変を治療する能力について評価
する。胃を刺激すること無しに、腫瘍性病変を治療する
のに有効であることが知られている標準的な化合物は、
5-フルオロ-2-メチル-1-(p-メチルスルフォニルベンジ
リデン)-3-インデニル酢酸(エグジスリンド)である。比
較の目的で、その他の有用な化合物は、COXを阻害する
ことが知られているものであって、例えばインドメタシ
ンおよびスリンダクの硫黄代謝物: 5-フルオロ-2-メチ
ル-1-(p-メチルスルフィニルベンジリデン)-3-インデニ
ル酢酸(スリンダクスルフィド)を包含する。比較の目的
で有用な他の化合物は、cGMP-特異的PDEを阻害する化合
物、例えば1-(3-クロロアニリノ)-4-フェニルフタラジ
ン(MY5445)を包含する。
【００４０】本明細書で使用する用語「前癌病変(precan
cerous lesion)」とは、形成異常、組織変化を包含す
る、異常な腫瘍形成によって示される症候群を包含す
る。その例は、結腸、胸部、前立腺または肺組織におけ
る形成異常、または形成異常母斑症候群等の状態、皮膚
の悪性メラノーマへの前駆症状を包含する。該病変の例
は、更に該病変が臨床的に同定可能であるか否かとは無
関係に、形成異常母斑症候群に加えて、ポリープ症候
群、結腸ポリープ、頚部の前癌性病変(即ち、頚部形成
異常)、食道、肺、前立腺形成異常、前立腺内部腫瘍形
成(intraneoplasia)、胸部および/または皮膚および関
連する状態(例えば、紫外線角化症)をも包含する。本明
細書で使用する用語「癌腫(carcinoma)または癌(cance
r)」とは、癌腫病変を意味する。その例は、悪性のメラ
ノーマ、乳癌、前立腺癌および結腸癌を包含する。本明
細書で使用する用語「腫瘍形成(neoplasia)」および「腫瘍
(neoplasm)」とは、癌腫および前癌病変両者を意味す
る。
cerous lesion)」とは、形成異常、組織変化を包含す
る、異常な腫瘍形成によって示される症候群を包含す
る。その例は、結腸、胸部、前立腺または肺組織におけ
る形成異常、または形成異常母斑症候群等の状態、皮膚
の悪性メラノーマへの前駆症状を包含する。該病変の例
は、更に該病変が臨床的に同定可能であるか否かとは無
関係に、形成異常母斑症候群に加えて、ポリープ症候
群、結腸ポリープ、頚部の前癌性病変(即ち、頚部形成
異常)、食道、肺、前立腺形成異常、前立腺内部腫瘍形
成(intraneoplasia)、胸部および/または皮膚および関
連する状態(例えば、紫外線角化症)をも包含する。本明
細書で使用する用語「癌腫(carcinoma)または癌(cance
r)」とは、癌腫病変を意味する。その例は、悪性のメラ
ノーマ、乳癌、前立腺癌および結腸癌を包含する。本明
細書で使用する用語「腫瘍形成(neoplasia)」および「腫瘍
(neoplasm)」とは、癌腫および前癌病変両者を意味す
る。
【００４１】本明細書で使用する略号PGはプロスタグラ
ンジンを、PSはプロスタグランジンシンセターゼを、PG
E2はプロスタグランジンE2を、PDEはホスホジエステラ
ーゼを、COXはシクロオキシゲナーゼを、環状ヌクレオ
チド、RIAはラジオイムノアッセイを表す。ある化合物
によるCOXの阻害は、２つの方法の何れかによって測定
できる。その一つの方法は、スクリーニングすべき化合
物に暴露した後に、完全なHL-60細胞によってPGE2分泌
を測定する工程を含む。もう一つの方法は、該化合物の
存在下にて、精製したシクロオキシゲナーゼ(COX)の活
性を測定する工程を含む。これら２つの方法は、以前に
文献に記載されたプロトコールを含むが、好ましいプロ
トコールは、以下に示すものである。
ンジンを、PSはプロスタグランジンシンセターゼを、PG
E2はプロスタグランジンE2を、PDEはホスホジエステラ
ーゼを、COXはシクロオキシゲナーゼを、環状ヌクレオ
チド、RIAはラジオイムノアッセイを表す。ある化合物
によるCOXの阻害は、２つの方法の何れかによって測定
できる。その一つの方法は、スクリーニングすべき化合
物に暴露した後に、完全なHL-60細胞によってPGE2分泌
を測定する工程を含む。もう一つの方法は、該化合物の
存在下にて、精製したシクロオキシゲナーゼ(COX)の活
性を測定する工程を含む。これら２つの方法は、以前に
文献に記載されたプロトコールを含むが、好ましいプロ
トコールは、以下に示すものである。
【００４２】化合物が、プロスタグランジンE2(PGE2)の
生産を阻害するか否かを、PGE2の測定によって決定する
ために、該化合物を評価することが出来る。PGE2用の酵
素イムノアッセイ(EIA)キット、例えば米国IL州、アー
リントンハイツの、アマーシャム(Amersham)から市販品
として入手できるキットを使用して、評価できる。適当
な細胞は、PGを大量に生成するもの、例えばHL-60細胞
を包含する。HL-60細胞は、DMSOによって成熟顆粒球に
分化する、ヒト前骨髄細胞である(コリンズ(Collins),
S.J.等,「ジメチルスルフォキシドによる分化誘発後の、
培養ヒト前骨髄細胞白血病細胞(HL-60)の正常な機能的
特徴(Normal Functional Characteristicsof Cultured
Human Promyelocytic Leukemia Cells)(HL-60), After
Inductionof Differentiation By Dimethylsulfoxide),
J. Exp. Med., 1979, 149:969-974を参照)。これらの
分化した細胞は、カルシウムイオノホア、A23187で刺激
した後に、PDE2を生成する(カーグマン(Kargman),S.等,
「HL-60細胞の5-リポキシゲナーゼの翻訳(Translation
of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase)」, J. Biol. Chem.,199
1, 266:23745-23752を参照のこと)。HL-60は、ATCCから
入手可能である(ATCC: CCL240)。これらは、20%の加熱-
不活性化子牛血清、50 U/mlのペニシリンおよび50μg/m
lのストレプトマイシンを補充した、RPMI 1640培地中
で、5%CO2雰囲気中で37℃にて生育できる。骨髄性細胞
の分化を誘発するために、細胞を1.3%のDMSOに9日間暴
露し、次いで洗浄し、3x106細胞/mlの濃度にてドルベコ
の燐酸緩衝塩水中に再懸濁した。
生産を阻害するか否かを、PGE2の測定によって決定する
ために、該化合物を評価することが出来る。PGE2用の酵
素イムノアッセイ(EIA)キット、例えば米国IL州、アー
リントンハイツの、アマーシャム(Amersham)から市販品
として入手できるキットを使用して、評価できる。適当
な細胞は、PGを大量に生成するもの、例えばHL-60細胞
を包含する。HL-60細胞は、DMSOによって成熟顆粒球に
分化する、ヒト前骨髄細胞である(コリンズ(Collins),
S.J.等,「ジメチルスルフォキシドによる分化誘発後の、
培養ヒト前骨髄細胞白血病細胞(HL-60)の正常な機能的
特徴(Normal Functional Characteristicsof Cultured
Human Promyelocytic Leukemia Cells)(HL-60), After
Inductionof Differentiation By Dimethylsulfoxide),
J. Exp. Med., 1979, 149:969-974を参照)。これらの
分化した細胞は、カルシウムイオノホア、A23187で刺激
した後に、PDE2を生成する(カーグマン(Kargman),S.等,
「HL-60細胞の5-リポキシゲナーゼの翻訳(Translation
of HL-60 Cell 5-Lipoxygenase)」, J. Biol. Chem.,199
1, 266:23745-23752を参照のこと)。HL-60は、ATCCから
入手可能である(ATCC: CCL240)。これらは、20%の加熱-
不活性化子牛血清、50 U/mlのペニシリンおよび50μg/m
lのストレプトマイシンを補充した、RPMI 1640培地中
で、5%CO2雰囲気中で37℃にて生育できる。骨髄性細胞
の分化を誘発するために、細胞を1.3%のDMSOに9日間暴
露し、次いで洗浄し、3x106細胞/mlの濃度にてドルベコ
の燐酸緩衝塩水中に再懸濁した。
【００４３】該分化したHL-60細胞(3x106細胞/ml)を、
所定濃度のテスト化合物の存在下で、37℃にて15分間イ
ンキュベートする。次いで、細胞をA23187(5x10-6M)で1
5分間刺激する。外部の培地に分泌されたPGE2を上記の
ようにして測定する。上に示したように、ある化合物の
COX阻害を評価する第二の方法は、テスト化合物の存在
下で、該COX活性を測定することである。シクロオキシ
ゲナーゼの２つの異なる形態(COX-1およびCOX-2)が、プ
ロスタグランジン合成を調節することが文献に報告され
ている。COX-2は、COXの誘導的形状であり、一方COX-1
は構成的形態である。COX-1活性は、ミッチェル等によ
って記載された方法(「構成的および誘導的シクロオキシ
ゲナーゼの阻害剤としての非ステロイド抗-炎症性薬物
の選択性(Selectivity of Nonsteroidal Anti-inflamma
tory Drugs as Inhibitors of Constitutive and Induc
ible Cyclooxygenase)」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1993, 90:11693-11697; この文献を本発明の参考とす
る)を利用し、ブーパシー&バラスブラマニアン(Boopath
y & Balasubramanian)によって記載(「ヒツジ血小板のシ
クロオキシゲナーゼの精製および特徴付け(Purificatio
n and Characterization of Sheep Platelet Cyclooxyg
enase)」, Biochem. J., 1988,239:371-377; この文献を
本発明の参考とする)されたような、ラムの精嚢から精
製したCOX-1を使用して、測定することが出来る。COX-2
活性は、上記1993年のミッチェル等の文献に記載された
ように、ヒツジの胎盤から精製されたCOX-2を使用して
測定できる。
所定濃度のテスト化合物の存在下で、37℃にて15分間イ
ンキュベートする。次いで、細胞をA23187(5x10-6M)で1
5分間刺激する。外部の培地に分泌されたPGE2を上記の
ようにして測定する。上に示したように、ある化合物の
COX阻害を評価する第二の方法は、テスト化合物の存在
下で、該COX活性を測定することである。シクロオキシ
ゲナーゼの２つの異なる形態(COX-1およびCOX-2)が、プ
ロスタグランジン合成を調節することが文献に報告され
ている。COX-2は、COXの誘導的形状であり、一方COX-1
は構成的形態である。COX-1活性は、ミッチェル等によ
って記載された方法(「構成的および誘導的シクロオキシ
ゲナーゼの阻害剤としての非ステロイド抗-炎症性薬物
の選択性(Selectivity of Nonsteroidal Anti-inflamma
tory Drugs as Inhibitors of Constitutive and Induc
ible Cyclooxygenase)」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1993, 90:11693-11697; この文献を本発明の参考とす
る)を利用し、ブーパシー&バラスブラマニアン(Boopath
y & Balasubramanian)によって記載(「ヒツジ血小板のシ
クロオキシゲナーゼの精製および特徴付け(Purificatio
n and Characterization of Sheep Platelet Cyclooxyg
enase)」, Biochem. J., 1988,239:371-377; この文献を
本発明の参考とする)されたような、ラムの精嚢から精
製したCOX-1を使用して、測定することが出来る。COX-2
活性は、上記1993年のミッチェル等の文献に記載された
ように、ヒツジの胎盤から精製されたCOX-2を使用して
測定できる。
【００４４】ある薬物の該シクロオキシゲナーゼ阻害活
性は、当分野で公知の方法によって測定できる。例え
ば、上記の1988年のブーパシー&バラスブラマニアン上
記文献に記載された方法では、プロスタグランジンHシ
ンターゼI (ミシガン州、アルボアのケイマンケミカル
社(Cayman Chemical Ann))を、100μMのアラキドン酸
（シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)）、補因子
(例えば、100mMのトリス-HCl，pH 7.4中の、1.0mMのグ
ルタチオン、1.0mMのヒドロキノン、0.625μMのヘモグ
ロビンおよび1.25mMのCaCl2) およびテストすべき該薬
物と共に、37℃にて20分間インキュベートする。インキ
ュベートに引き続き、トリクロロ酢酸でこの反応を停止
する。該反応をチオバルビツル酸およびマロンアルデヒ
ドの添加によって停止させた後、酵素活性を、530nmに
て分光光学的に測定できる。明らかに、大きな結合した
PDE5/新規PDE/PDE2阻害活性に対して低いCOX-1またはCO
X-2阻害活性を示す化合物は、望ましい化合物であり得
る。COX阻害の程度は、該テスト化合物の存在下または
不在下で、該シクロオキシゲナーゼの活性を比較するこ
とによって測定される。約100μMの濃度にて、残留する
(即ち、約25%未満)または零のCOX阻害活性は、腫瘍形成
の治療における有用性につき、該化合物を更に評価する
必要があることを示す。
性は、当分野で公知の方法によって測定できる。例え
ば、上記の1988年のブーパシー&バラスブラマニアン上
記文献に記載された方法では、プロスタグランジンHシ
ンターゼI (ミシガン州、アルボアのケイマンケミカル
社(Cayman Chemical Ann))を、100μMのアラキドン酸
（シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)）、補因子
(例えば、100mMのトリス-HCl，pH 7.4中の、1.0mMのグ
ルタチオン、1.0mMのヒドロキノン、0.625μMのヘモグ
ロビンおよび1.25mMのCaCl2) およびテストすべき該薬
物と共に、37℃にて20分間インキュベートする。インキ
ュベートに引き続き、トリクロロ酢酸でこの反応を停止
する。該反応をチオバルビツル酸およびマロンアルデヒ
ドの添加によって停止させた後、酵素活性を、530nmに
て分光光学的に測定できる。明らかに、大きな結合した
PDE5/新規PDE/PDE2阻害活性に対して低いCOX-1またはCO
X-2阻害活性を示す化合物は、望ましい化合物であり得
る。COX阻害の程度は、該テスト化合物の存在下または
不在下で、該シクロオキシゲナーゼの活性を比較するこ
とによって測定される。約100μMの濃度にて、残留する
(即ち、約25%未満)または零のCOX阻害活性は、腫瘍形成
の治療における有用性につき、該化合物を更に評価する
必要があることを示す。
【００４５】C. ホスホジエステラーゼ阻害活性の測定 上記のように単離した酵素、その組み換えバージョンま
たは該新規なPDEおよび/またはPDE2をPDE5と共に使用し
て、化合物を、本発明の新規なホスホジエステラーゼの
活性に及ぼす阻害作用につきスクリーニングできる。あ
るいはまた、全細胞中の環状ヌクレオチドレベルを、RI
Aによって測定し、未処理およびザプリナスト-処理細胞
と比較することが出来る。ホスホジエステラーゼ活性
は、当分野で公知の方法、例えば該PDE酵素に対する基
質として、放射性3H環状GMP(cGMP)(環状3',5'-グアノシ
ンモノホスフェートを用いる方法を利用して測定できる
(トムソン(Thompson), W.J.等，Advances inCyclic Nuc
leotide Research, 1979, 10:69-92; これを補の参考文
献とする)。簡単に言えば、規定の基質3H-cGMP特異的活
性を示す溶液(0.2μM; 100,000 cpm;40mMのトリス-HCl
(pH 8.0)、5mMのMgCl2および1mg/mlのBSAを含む)を、全
体積400μlにて該テストすべき薬物と混合する。この混
合物を、本発明の単離されたPDEと共に30℃にて10分間
インキュベートする。反応を、例えばこの反応混合物
を、75秒間沸騰させることによって停止させる。氷上で
冷却した後、100μlの0.5mg/mlのヘビ毒(シグマ社から
入手できるO.ハナ(Hannah) ヘビ毒)を添加し、30℃にて
10分間インキュベートする。次いで、この反応を、100%
メタノール1ml等のアルコールの添加により停止させ
る。アッセイサンプルを、1mlのダウエックス1-X8カラ
ムに適用し、100%メタノール1mlで洗浄する。該カラム
の流出液および洗液の放射能の量は、これら液を併合
し、シンチレーションカウンターで測定する。該ホスホ
ジエステラーゼ阻害の程度は、薬物処理した反応液の放
射能の量を計算し、コントロールサンプル(該テスト化
合物を含まないが、薬物溶剤を含む反応混合物)と比較
することによって測定する。
たは該新規なPDEおよび/またはPDE2をPDE5と共に使用し
て、化合物を、本発明の新規なホスホジエステラーゼの
活性に及ぼす阻害作用につきスクリーニングできる。あ
るいはまた、全細胞中の環状ヌクレオチドレベルを、RI
Aによって測定し、未処理およびザプリナスト-処理細胞
と比較することが出来る。ホスホジエステラーゼ活性
は、当分野で公知の方法、例えば該PDE酵素に対する基
質として、放射性3H環状GMP(cGMP)(環状3',5'-グアノシ
ンモノホスフェートを用いる方法を利用して測定できる
(トムソン(Thompson), W.J.等，Advances inCyclic Nuc
leotide Research, 1979, 10:69-92; これを補の参考文
献とする)。簡単に言えば、規定の基質3H-cGMP特異的活
性を示す溶液(0.2μM; 100,000 cpm;40mMのトリス-HCl
(pH 8.0)、5mMのMgCl2および1mg/mlのBSAを含む)を、全
体積400μlにて該テストすべき薬物と混合する。この混
合物を、本発明の単離されたPDEと共に30℃にて10分間
インキュベートする。反応を、例えばこの反応混合物
を、75秒間沸騰させることによって停止させる。氷上で
冷却した後、100μlの0.5mg/mlのヘビ毒(シグマ社から
入手できるO.ハナ(Hannah) ヘビ毒)を添加し、30℃にて
10分間インキュベートする。次いで、この反応を、100%
メタノール1ml等のアルコールの添加により停止させ
る。アッセイサンプルを、1mlのダウエックス1-X8カラ
ムに適用し、100%メタノール1mlで洗浄する。該カラム
の流出液および洗液の放射能の量は、これら液を併合
し、シンチレーションカウンターで測定する。該ホスホ
ジエステラーゼ阻害の程度は、薬物処理した反応液の放
射能の量を計算し、コントロールサンプル(該テスト化
合物を含まないが、薬物溶剤を含む反応混合物)と比較
することによって測定する。
【００４６】また、所定の化合物が、本発明のホスホジ
エステラーゼを阻害する能力は、スクリーニングすべき
化合物に暴露した腫瘍形成細胞中のcGMPの増加によって
反映される。PDE活性の量は、ラジオイムノアッセイ(RI
A)を利用して、処理細胞の抽出液中の、環状GMPの量に
つきアッセイすることによって決定できる。この手順に
おいて、HT-29またはSW480細胞を塗布し、密集状態まで
生育させる。上記のように、SW480はPDE5および本発明
の新規なPDE両者を含み、従ってPDE活性がこのようにし
て評価された場合には、併合したcGMP加水分解活性は同
時にアッセイされる。次に、該テスト化合物を、約200
μM~約200pMの範囲の化合物濃度にて、細胞培養物と共
にインキュベートする。その約24~48時間後に、該培地
を該細胞から除去し、該細胞を可溶化する。この反応
を、0.2N HCl/50% MeOHを用いて停止する。サンプル
を、タンパクアッセイのために取り出す。環状GMPを、
アニオン交換クロマトグラフィー、例えばダウエックス
カラムを使用して、細胞の該酸/アルコール抽出物から
精製する。
エステラーゼを阻害する能力は、スクリーニングすべき
化合物に暴露した腫瘍形成細胞中のcGMPの増加によって
反映される。PDE活性の量は、ラジオイムノアッセイ(RI
A)を利用して、処理細胞の抽出液中の、環状GMPの量に
つきアッセイすることによって決定できる。この手順に
おいて、HT-29またはSW480細胞を塗布し、密集状態まで
生育させる。上記のように、SW480はPDE5および本発明
の新規なPDE両者を含み、従ってPDE活性がこのようにし
て評価された場合には、併合したcGMP加水分解活性は同
時にアッセイされる。次に、該テスト化合物を、約200
μM~約200pMの範囲の化合物濃度にて、細胞培養物と共
にインキュベートする。その約24~48時間後に、該培地
を該細胞から除去し、該細胞を可溶化する。この反応
を、0.2N HCl/50% MeOHを用いて停止する。サンプル
を、タンパクアッセイのために取り出す。環状GMPを、
アニオン交換クロマトグラフィー、例えばダウエックス
カラムを使用して、細胞の該酸/アルコール抽出物から
精製する。
【００４７】該cGMPを乾燥し、公開された手順に従っ
て、例えばトリエチルアミン中の無水酢酸を使用して、
アセチル化する(スタイナー(Steiner), A.L.等, J. Bio
l. Chem., 1971, 247(4):1106-13;これを本発明の参考
文献とする)。このアセチル化cGMPを、ラジオイムノア
ッセイ手順(ハーパー(Harper), J.等, Advances in Nuc
leotide Research, 1979, 10:1-33; これを本発明の参
考文献とする)を利用して定量する。誘導した環状GMPの
ヨウ素化されたリガンド(チロシンメチルエステル)を、
抗−血清および適当なバッファーの存在下で、標準物質
または未知物質と共にインキュベートする。抗−血清
は、環状ヌクレオチド−ヘプテン誘導技術を用いて製造
できる。この抗−血清は、サクシニル-cGMP-アルブミン
複合体を注入したヒツジから得られ、1/20,000に希釈さ
れる。以前に記載されたように(セイバート(Seibert),
A.F.等, J. Applied Physiol., 1992, 72:389-395; こ
れを本発明の参考文献とする)、標準曲線から、ドーズ
補間法および誤差分析を適用する。更に、該培地を酸性
にし、凍結(−70℃)し、かつcGMPおよびcAMPにつき分析
する。
て、例えばトリエチルアミン中の無水酢酸を使用して、
アセチル化する(スタイナー(Steiner), A.L.等, J. Bio
l. Chem., 1971, 247(4):1106-13;これを本発明の参考
文献とする)。このアセチル化cGMPを、ラジオイムノア
ッセイ手順(ハーパー(Harper), J.等, Advances in Nuc
leotide Research, 1979, 10:1-33; これを本発明の参
考文献とする)を利用して定量する。誘導した環状GMPの
ヨウ素化されたリガンド(チロシンメチルエステル)を、
抗−血清および適当なバッファーの存在下で、標準物質
または未知物質と共にインキュベートする。抗−血清
は、環状ヌクレオチド−ヘプテン誘導技術を用いて製造
できる。この抗−血清は、サクシニル-cGMP-アルブミン
複合体を注入したヒツジから得られ、1/20,000に希釈さ
れる。以前に記載されたように(セイバート(Seibert),
A.F.等, J. Applied Physiol., 1992, 72:389-395; こ
れを本発明の参考文献とする)、標準曲線から、ドーズ
補間法および誤差分析を適用する。更に、該培地を酸性
にし、凍結(−70℃)し、かつcGMPおよびcAMPにつき分析
する。
【００４８】所定の化合物によって引き起こされた、腫
瘍形成細胞中のcGMPの含有率における増加が観測された
ことに加えて、cAMPの含有率における減少も観測され
た。特に好ましい化合物(即ち、腫瘍形成細胞において
選択的にアポトーシスを誘発するが、正常な細胞では実
質的にこれを誘発しない化合物)は、数分内に高いcGMP
含有率をもたらす一つの初期作用として、cGMP−特異的
PDE阻害と一致する時間経過を辿る。第二に、所定の抗
−腫瘍性化合物による腫瘍形成細胞の処理は、24時間以
内に、cAMP含有率の低下に導く。薬物作用の細胞内ター
ゲットは、更に研究が続けられているが、一般的なデー
タは、cGMPにおける該初期の上昇およびその後のcAMPに
おける減少は、所定の化合物に暴露された腫瘍形成細胞
におけるアポトーシスに先行するという概念を支持して
いる。
瘍形成細胞中のcGMPの含有率における増加が観測された
ことに加えて、cAMPの含有率における減少も観測され
た。特に好ましい化合物(即ち、腫瘍形成細胞において
選択的にアポトーシスを誘発するが、正常な細胞では実
質的にこれを誘発しない化合物)は、数分内に高いcGMP
含有率をもたらす一つの初期作用として、cGMP−特異的
PDE阻害と一致する時間経過を辿る。第二に、所定の抗
−腫瘍性化合物による腫瘍形成細胞の処理は、24時間以
内に、cAMP含有率の低下に導く。薬物作用の細胞内ター
ゲットは、更に研究が続けられているが、一般的なデー
タは、cGMPにおける該初期の上昇およびその後のcAMPに
おける減少は、所定の化合物に暴露された腫瘍形成細胞
におけるアポトーシスに先行するという概念を支持して
いる。
【００４９】該２つの環状ヌクレオチドの比における変
化は、cGMPの絶対値のみ、cGMP-特異的ホスホジエステ
ラーゼ阻害のみ、またはcGMP加水分解レベルのみを測定
するよりも、テスト化合物の所定のcGMP-特異的ホスホ
ジエステラーゼ阻害活性を評価するための、より精度の
高い手段であり得る。抗-腫瘍形成化合物で処理されて
いない腫瘍形成細胞において、cGMP含有率/cAMP含有率
の比は、0.03-0.05の範囲内にある(即ち、300-500 fmol
/mgタンパクなるcGMP含有率／6000-8000 fmol/mgタンパ
クなるcAMP含有率)。所定の抗-腫瘍形成化合物に暴露し
た後には、この比は、環状GMPにおける初期の増加およ
び環状AMPにおける後期の減少のために、数倍(好ましく
は、少なくとも約３倍の増加)に増加する。
化は、cGMPの絶対値のみ、cGMP-特異的ホスホジエステ
ラーゼ阻害のみ、またはcGMP加水分解レベルのみを測定
するよりも、テスト化合物の所定のcGMP-特異的ホスホ
ジエステラーゼ阻害活性を評価するための、より精度の
高い手段であり得る。抗-腫瘍形成化合物で処理されて
いない腫瘍形成細胞において、cGMP含有率/cAMP含有率
の比は、0.03-0.05の範囲内にある(即ち、300-500 fmol
/mgタンパクなるcGMP含有率／6000-8000 fmol/mgタンパ
クなるcAMP含有率)。所定の抗-腫瘍形成化合物に暴露し
た後には、この比は、環状GMPにおける初期の増加およ
び環状AMPにおける後期の減少のために、数倍(好ましく
は、少なくとも約３倍の増加)に増加する。
【００５０】具体的には、特に好ましい化合物が、処理
された腫瘍形成細胞におけるcGMP含有率の、約500fmol/
mgタンパクを越えるcGMPレベルへの初期の増加を達成す
ることが観測された。更に、特に好ましい化合物は、処
理された腫瘍形成細胞におけるcAMP含有率の、約4000fm
ol/mgタンパク未満のcAMPレベルへの後期の減少を生ず
る。環状AMPの含有率を測定するために、cGMPにつき上
記したものと類似のラジオイムノアッセイ技術を利用す
る。基本的には、環状ヌクレオチドは、アニオン交換ク
ロマトグラフィーを利用して細胞の酸/アルコール抽出
物から精製され、乾燥され、公開された手順によってア
セチル化され、かつラジオイムノアッセイ手順を利用し
て定量される。誘導された環状AMPおよび環状GMPの、ヨ
ウ素化されたリガンドを、特異的抗-血清および適当な
バッファーの存在下で、標準物質または未知物質と共
に、インキュベートする。
された腫瘍形成細胞におけるcGMP含有率の、約500fmol/
mgタンパクを越えるcGMPレベルへの初期の増加を達成す
ることが観測された。更に、特に好ましい化合物は、処
理された腫瘍形成細胞におけるcAMP含有率の、約4000fm
ol/mgタンパク未満のcAMPレベルへの後期の減少を生ず
る。環状AMPの含有率を測定するために、cGMPにつき上
記したものと類似のラジオイムノアッセイ技術を利用す
る。基本的には、環状ヌクレオチドは、アニオン交換ク
ロマトグラフィーを利用して細胞の酸/アルコール抽出
物から精製され、乾燥され、公開された手順によってア
セチル化され、かつラジオイムノアッセイ手順を利用し
て定量される。誘導された環状AMPおよび環状GMPの、ヨ
ウ素化されたリガンドを、特異的抗-血清および適当な
バッファーの存在下で、標準物質または未知物質と共
に、インキュベートする。
【００５１】環状ヌクレオチド含有率の検定は、完全な
細胞内の環状ヌクレオチドの生産量または蓄積量を測定
することにより達成できる。完全な細胞のcAMPを測定す
るために、3H-アデニン予備標識を、公表された手順に
従って、使用する(ファリン(Whalin), M.E.等, 「細胞を
含まない脳の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活
性と、完全な脳のスライス中の環状AMP崩壊との相関関
係(Correlation of cell-free brain cyclic nucleotid
e phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay
in intact brain slices)」, Sec. Mess. And Phos. Pr
otein Research,1989, 12:311-325; これを本発明の参
考文献とする)。この手順は、標識されたATPから環状AM
Pへの流れを測定し、かつ特定のプロトコールに依存し
て、完全な細胞のアデニレートサイクラーゼまたは環状
ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を評価するのに
利用できる。環状GMPの蓄積量は低すぎて、公表された
手順に従って完全な細胞の予備標識について研究するこ
とは出来なかった(レイノルズ(Reynolds), P.E.等, 「完
全細胞予備標識によって測定した、肺の微細血管内皮細
胞における環状GMP蓄積量(Cyclic GMP accumulation In
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Measure
d By Intact Cell Prelabeling)」; これを本発明の参考
文献とする)。
細胞内の環状ヌクレオチドの生産量または蓄積量を測定
することにより達成できる。完全な細胞のcAMPを測定す
るために、3H-アデニン予備標識を、公表された手順に
従って、使用する(ファリン(Whalin), M.E.等, 「細胞を
含まない脳の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活
性と、完全な脳のスライス中の環状AMP崩壊との相関関
係(Correlation of cell-free brain cyclic nucleotid
e phosphodiesterase activities to cyclic AMP decay
in intact brain slices)」, Sec. Mess. And Phos. Pr
otein Research,1989, 12:311-325; これを本発明の参
考文献とする)。この手順は、標識されたATPから環状AM
Pへの流れを測定し、かつ特定のプロトコールに依存し
て、完全な細胞のアデニレートサイクラーゼまたは環状
ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を評価するのに
利用できる。環状GMPの蓄積量は低すぎて、公表された
手順に従って完全な細胞の予備標識について研究するこ
とは出来なかった(レイノルズ(Reynolds), P.E.等, 「完
全細胞予備標識によって測定した、肺の微細血管内皮細
胞における環状GMP蓄積量(Cyclic GMP accumulation In
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Measure
d By Intact Cell Prelabeling)」; これを本発明の参考
文献とする)。
【００５２】ある化合物の該PDE阻害活性作用は、組織
サンプルから測定することも可能である。ヒト由来の組
織生検または麻酔動物由来の組織を、該テスト化合物に
暴露した対象から集める。簡単に説明すれば、組織サン
プルを500μlの6%TCA中でホモジナイズする。既知量の
該ホモジネートを取り出して、タンパク分析に供する。
残りのホモジネートを、20分間氷上に置き、該タンパク
を沈殿させる。次に、該ホモジネートを、4℃にて30分
間、15,000gにて遠心分離処理にかける。得られる上澄
を回収し、ペレットも回収する。該上澄を、4回5容の水
で飽和したジエチルエーテルで洗浄する。上部のエーテ
ル相を、各洗浄操作間において捨てる。該水性エーテル
相を、高速真空引きによって乾燥する。一旦乾燥した後
には、該酸は、後の使用のために凍結するか、あるいは
即座に使用することが出来る。この乾燥した抽出物を、
500μlのアッセイバッファーに溶解する。cGMP-特異的
阻害の程度は、上記の如く、RIA手順を利用して、環状
ヌクレオチドの量につきアッセイすることによって測定
する。
サンプルから測定することも可能である。ヒト由来の組
織生検または麻酔動物由来の組織を、該テスト化合物に
暴露した対象から集める。簡単に説明すれば、組織サン
プルを500μlの6%TCA中でホモジナイズする。既知量の
該ホモジネートを取り出して、タンパク分析に供する。
残りのホモジネートを、20分間氷上に置き、該タンパク
を沈殿させる。次に、該ホモジネートを、4℃にて30分
間、15,000gにて遠心分離処理にかける。得られる上澄
を回収し、ペレットも回収する。該上澄を、4回5容の水
で飽和したジエチルエーテルで洗浄する。上部のエーテ
ル相を、各洗浄操作間において捨てる。該水性エーテル
相を、高速真空引きによって乾燥する。一旦乾燥した後
には、該酸は、後の使用のために凍結するか、あるいは
即座に使用することが出来る。この乾燥した抽出物を、
500μlのアッセイバッファーに溶解する。cGMP-特異的
阻害の程度は、上記の如く、RIA手順を利用して、環状
ヌクレオチドの量につきアッセイすることによって測定
する。
【００５３】阻害の程度は、該化合物の存在下および不
在下にて、該新規なPDE(またはPDE2)の活性を比較する
ことによって決定する。該新規なPDE(またはPDE2)の活
性は、該化合物が、腫瘍形成の治療のために使用できる
ことを示す。該基準物質、エグジスリンドの阻害活性よ
りも高い、好ましくは濃度10μMまたはそれ以下におい
て、50%を越える阻害活性は、ある化合物を、抗-腫瘍特
性につき更に評価すべきことを示す。好ましくは、新規
PDE阻害に関するIC50値は、更に有力な用途を持つもの
と考えられる化合物に対しては、50μM未満であるべき
である。
在下にて、該新規なPDE(またはPDE2)の活性を比較する
ことによって決定する。該新規なPDE(またはPDE2)の活
性は、該化合物が、腫瘍形成の治療のために使用できる
ことを示す。該基準物質、エグジスリンドの阻害活性よ
りも高い、好ましくは濃度10μMまたはそれ以下におい
て、50%を越える阻害活性は、ある化合物を、抗-腫瘍特
性につき更に評価すべきことを示す。好ましくは、新規
PDE阻害に関するIC50値は、更に有力な用途を持つもの
と考えられる化合物に対しては、50μM未満であるべき
である。
【００５４】D. ある化合物が腫瘍細胞の成長を減ずる
か否かの決定 別の態様において、本発明の方法は、更に化合物が腫瘍
細胞の成長を減ずるか否かを決定する工程を含む。テス
トすべき組織に依存して、サンプル中には種々の細胞系
を含むことができる。例えば、これら細胞系は、SW-480
−結腸腺癌; HT-29−結腸腺癌; A-427−肺腺腫様癌; MC
F-7−胸部腺癌; およびUACC-375−メラノーマ系; およ
びDU145−前立腺癌を包含する。これら細胞系を使用し
て得た細胞毒性データは、腫瘍性病変に対する阻害作用
の指標となる。これら細胞系は、十分に特徴付けされて
おり、新規制癌剤に関するスクリーニングプログラムに
おいて、ユナイテッドステーツナショナルキャンサーイ
ンスティチュート(the United States National Cancer
Institute)によって利用されている。
か否かの決定 別の態様において、本発明の方法は、更に化合物が腫瘍
細胞の成長を減ずるか否かを決定する工程を含む。テス
トすべき組織に依存して、サンプル中には種々の細胞系
を含むことができる。例えば、これら細胞系は、SW-480
−結腸腺癌; HT-29−結腸腺癌; A-427−肺腺腫様癌; MC
F-7−胸部腺癌; およびUACC-375−メラノーマ系; およ
びDU145−前立腺癌を包含する。これら細胞系を使用し
て得た細胞毒性データは、腫瘍性病変に対する阻害作用
の指標となる。これら細胞系は、十分に特徴付けされて
おり、新規制癌剤に関するスクリーニングプログラムに
おいて、ユナイテッドステーツナショナルキャンサーイ
ンスティチュート(the United States National Cancer
Institute)によって利用されている。
【００５５】腫瘍細胞成長を阻害する化合物の能力は、
ATCCから入手した該HT-29ヒト結腸癌細胞系を使用して
測定できる。HT-29細胞は、以前に関連する結腸腫瘍細
胞培養物モデルとして、特徴付けされている(フォー(Fo
gh), J.等, 「インビトロでのヒト腫瘍細胞(Human Tumo
r Cells In Vitro)」, J. フォー(編), プレナムプレス
(Plenum Press), NY, 1975, pp. 115-159）。HT-29細胞
は、5%子牛血清(CA州、カールスバッドの、ジェミニバ
イオプローダクツ社(Gemini Boiproducts, Inc.))およ
び2mlのグルタミンおよび1%抗生物質-抗-真菌剤を補充
したRPMI培地中で、95%空気および5%CO2の湿潤雰囲気中
で、37℃にて維持する。簡単に説明すると、HT-29細胞
を、96-ウエルマイクロタイタープレートに500細胞/ウ
エルなる密度で塗布し、化合物の添加前に、37℃にて24
時間インキュベートする。各細胞数の決定は、6回の追
試を含んでいた。培養物中で6日後に、該細胞を、冷ト
リクロロ酢酸を、最終濃度10%まで添加することにより
固定し、タンパク濃度を、スケハン(Skehan), P.等の
「制癌剤のスクリーニングのための新規な比色アッセイ
(New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screen
ing)」, J. Natl. Cancer Inst., 1990, 82:1107-1112
(これを本発明の参考文献とする)に記載されたような、
スルフォローダミンB(SRB)比色タンパク染色アッセイを
利用して測定する。
ATCCから入手した該HT-29ヒト結腸癌細胞系を使用して
測定できる。HT-29細胞は、以前に関連する結腸腫瘍細
胞培養物モデルとして、特徴付けされている(フォー(Fo
gh), J.等, 「インビトロでのヒト腫瘍細胞(Human Tumo
r Cells In Vitro)」, J. フォー(編), プレナムプレス
(Plenum Press), NY, 1975, pp. 115-159）。HT-29細胞
は、5%子牛血清(CA州、カールスバッドの、ジェミニバ
イオプローダクツ社(Gemini Boiproducts, Inc.))およ
び2mlのグルタミンおよび1%抗生物質-抗-真菌剤を補充
したRPMI培地中で、95%空気および5%CO2の湿潤雰囲気中
で、37℃にて維持する。簡単に説明すると、HT-29細胞
を、96-ウエルマイクロタイタープレートに500細胞/ウ
エルなる密度で塗布し、化合物の添加前に、37℃にて24
時間インキュベートする。各細胞数の決定は、6回の追
試を含んでいた。培養物中で6日後に、該細胞を、冷ト
リクロロ酢酸を、最終濃度10%まで添加することにより
固定し、タンパク濃度を、スケハン(Skehan), P.等の
「制癌剤のスクリーニングのための新規な比色アッセイ
(New Colorimetric Assay For Anticancer-Drug Screen
ing)」, J. Natl. Cancer Inst., 1990, 82:1107-1112
(これを本発明の参考文献とする)に記載されたような、
スルフォローダミンB(SRB)比色タンパク染色アッセイを
利用して測定する。
【００５６】SRBアッセイに加えて、成長阻害を測定す
るのに、幾つかの他の方法を利用することができ、該SR
Bアッセイの代わりに利用できる。これら方法は、トリ
パンブルー染色、DNA合成可能な細胞のBrdUまたは放射
性標識したチミジンによる標識、生育可能な細胞のニュ
ートラルレッド染色、または生育可能な細胞のMTT染色
に続く、生育可能な細胞の計数工程を含む。100μMまた
はそれ以下のドーズにおける、約50%を越える大幅な腫
瘍細胞成長阻害は、更に該化合物が腫瘍性病変の治療の
ために有用であることを示している。好ましくは、IC50
値を測定し、比較の目的で使用する。この値は、コント
ロールに対して、50%の腫瘍細胞成長阻害に必要な薬物
の濃度である。好ましくは、該IC50値は、腫瘍性病変の
治療に利用可能であると考えられる化合物にとっては、
100μM未満であるべきである。
るのに、幾つかの他の方法を利用することができ、該SR
Bアッセイの代わりに利用できる。これら方法は、トリ
パンブルー染色、DNA合成可能な細胞のBrdUまたは放射
性標識したチミジンによる標識、生育可能な細胞のニュ
ートラルレッド染色、または生育可能な細胞のMTT染色
に続く、生育可能な細胞の計数工程を含む。100μMまた
はそれ以下のドーズにおける、約50%を越える大幅な腫
瘍細胞成長阻害は、更に該化合物が腫瘍性病変の治療の
ために有用であることを示している。好ましくは、IC50
値を測定し、比較の目的で使用する。この値は、コント
ロールに対して、50%の腫瘍細胞成長阻害に必要な薬物
の濃度である。好ましくは、該IC50値は、腫瘍性病変の
治療に利用可能であると考えられる化合物にとっては、
100μM未満であるべきである。
【００５７】E. ある化合物がアポトーシスを誘発する
か否かの決定 第二の別の態様によれば、本発明のスクリーニング法
は、更に該化合物が、腫瘍細胞の培養物中で、アポトー
シスを誘発するか否かを決定する工程を含む。細胞死の
異なる２つの形態、即ち壊死およびアポトーシスを、形
態学的および生化学的基準によって説明することができ
る。壊死は、細胞質膜の高い透過性を伴い、該細胞は、
膨潤し、かつ該細胞質膜は、数分以内に破壊される。ア
ポトーシスは、膜の水疱形成、細胞質の凝縮および内在
性のエンドヌクレアーゼの活性化によって特徴付けられ
る。
か否かの決定 第二の別の態様によれば、本発明のスクリーニング法
は、更に該化合物が、腫瘍細胞の培養物中で、アポトー
シスを誘発するか否かを決定する工程を含む。細胞死の
異なる２つの形態、即ち壊死およびアポトーシスを、形
態学的および生化学的基準によって説明することができ
る。壊死は、細胞質膜の高い透過性を伴い、該細胞は、
膨潤し、かつ該細胞質膜は、数分以内に破壊される。ア
ポトーシスは、膜の水疱形成、細胞質の凝縮および内在
性のエンドヌクレアーゼの活性化によって特徴付けられ
る。
【００５８】アポトーシスは、正常な組織の生成中にお
よび器官および四肢胚発生中に自然に起こる。アポトー
シスは、また細胞毒性T-リンパ細胞およびナチュラルキ
ラー細胞によって、イオン化輻射によっておよびある種
の化学療法剤によっても起こる。アポトーシスの不適切
な調節は、癌、AIDS、またはアルツハイマー病等を包含
する多くの病理的状態における重要な役割を演ずるもの
と考えられる。化合物は、上記のような条件下におかれ
た腫瘍細胞の培養物を使用して、アポトーシスの誘発に
ついてスクリーニングすることができる。テスト化合物
による細胞の処置は、予備または後−密集培養、および
種々の濃度での２-６日間の治療を包含する。アポトー
シス状態にある細胞は、該培養物の付着および「浮遊(fl
oating)」区画両者において測定される。両区画は、該上
澄を除去し、付着した細胞をトリプシン処理し、かつ遠
心洗浄段階(10分間、2000rpm)を含む、これら両処方物
の併合によって集める。腫瘍細胞培養物を、スリンダク
および関連化合物で処理して、かなりの量のアポトーシ
スを発生させるためのプロトコールは、文献に記載され
ている(ピアザ(Piazza), G.A.等, Cancer Research, 19
95, 55:3110-16、これを本発明の参考文献とする)。新
規な特徴は、浮遊および付着細胞両者の捕集、最適処理
時間およびアポトーシスを観測するためのドーズ範囲の
決定および最適細胞培養条件の決定を包含する。
よび器官および四肢胚発生中に自然に起こる。アポトー
シスは、また細胞毒性T-リンパ細胞およびナチュラルキ
ラー細胞によって、イオン化輻射によっておよびある種
の化学療法剤によっても起こる。アポトーシスの不適切
な調節は、癌、AIDS、またはアルツハイマー病等を包含
する多くの病理的状態における重要な役割を演ずるもの
と考えられる。化合物は、上記のような条件下におかれ
た腫瘍細胞の培養物を使用して、アポトーシスの誘発に
ついてスクリーニングすることができる。テスト化合物
による細胞の処置は、予備または後−密集培養、および
種々の濃度での２-６日間の治療を包含する。アポトー
シス状態にある細胞は、該培養物の付着および「浮遊(fl
oating)」区画両者において測定される。両区画は、該上
澄を除去し、付着した細胞をトリプシン処理し、かつ遠
心洗浄段階(10分間、2000rpm)を含む、これら両処方物
の併合によって集める。腫瘍細胞培養物を、スリンダク
および関連化合物で処理して、かなりの量のアポトーシ
スを発生させるためのプロトコールは、文献に記載され
ている(ピアザ(Piazza), G.A.等, Cancer Research, 19
95, 55:3110-16、これを本発明の参考文献とする)。新
規な特徴は、浮遊および付着細胞両者の捕集、最適処理
時間およびアポトーシスを観測するためのドーズ範囲の
決定および最適細胞培養条件の決定を包含する。
【００５９】化合物による処理に続き、培養物を、アク
リジンオレンジおよびエチジウムブロミドで標識した後
に、蛍光顕微鏡で、アポトーシスおよび壊死についてア
ッセイすることができる。アポトーシス状態にある細胞
の測定方法は、以前にデューク&コーエン(Duke & Cohe
n)によって、「アポトーシスの形態学的および生化学的
アッセイ(Morphological and Biochemical Assays Of A
poptosis)」と題する論文：「免疫学における一般的なプ
ロトコール(Current Protocols In Immunology)」,コリ
ゲン(Coligen)等(編), 1992, 3.17.1-3.17.16によって
記載された(これを本発明の参考文献とする)。例えば、
付着および浮遊細胞は、トリプシン処理し、かつPBS中
で３回洗浄することによって集めることができる。細胞
のアリコートを遠心分離処理することができる。次に、
得られるペレットを、培地およびPBS中で調製したアク
リジンオレンジおよびエチジウムブロミドを含む染料混
合物に再懸濁し、穏やかに混合することができる。次い
で、この混合物を、顕微鏡のスライドガラスに載せ、ア
ポトーシスの形態学的な特徴について検査することがで
きる。
リジンオレンジおよびエチジウムブロミドで標識した後
に、蛍光顕微鏡で、アポトーシスおよび壊死についてア
ッセイすることができる。アポトーシス状態にある細胞
の測定方法は、以前にデューク&コーエン(Duke & Cohe
n)によって、「アポトーシスの形態学的および生化学的
アッセイ(Morphological and Biochemical Assays Of A
poptosis)」と題する論文：「免疫学における一般的なプ
ロトコール(Current Protocols In Immunology)」,コリ
ゲン(Coligen)等(編), 1992, 3.17.1-3.17.16によって
記載された(これを本発明の参考文献とする)。例えば、
付着および浮遊細胞は、トリプシン処理し、かつPBS中
で３回洗浄することによって集めることができる。細胞
のアリコートを遠心分離処理することができる。次に、
得られるペレットを、培地およびPBS中で調製したアク
リジンオレンジおよびエチジウムブロミドを含む染料混
合物に再懸濁し、穏やかに混合することができる。次い
で、この混合物を、顕微鏡のスライドガラスに載せ、ア
ポトーシスの形態学的な特徴について検査することがで
きる。
【００６０】アポトーシスは、またテスト化合物によっ
て処理されている、細胞中のDNAフラグメント化におけ
る増大を測定することによっても、定量できる。細胞質
性ヒストン-結合-DNA-フラグメント(モノ-およびオリゴ
ヌクレオソーム)の、定量的インビトロ測定用の市販の
測光EIAを利用できる（ベーリンガーマンハイム(Boehri
nger Mannheim)社のセルデスディテクション(Cell Deat
h Detection) ELIZAok ys, Cat. No. 1,774,425）。この
ベーリンガーマンハイムアッセイは、夫々DNAおよびヒ
ストンに対する、マウスモノクローナル抗体を使用し
た、サンドイッチ-酵素-イムノアッセイ原理に基づいて
いる。これは、細胞溶解物の該細胞質画分中の、モノ-
およびオリゴヌクレオソームの特異的測定を可能とす
る。販売業者によれば、アポトーシスは以下の様式に従
って測定される。該サンプル(細胞溶解物)を、ストレプ
タビジン-被覆マイクロタイタープレート(MTP)に入れ
る。引き続き、抗-ヒストン-ビオチンと抗-DNAパーオキ
シダーゼ複合体との混合物を添加し、２時間インキュベ
ートする。このインキュベーション時間中、該抗-ヒス
トン抗体は、該ヌクレオソームの該ヒストン-成分と結
合し、同時に該免疫複合体を該ストレプタビジン-被覆M
TPに、そのビオチン化を介して固定する。更に、該抗-D
NAパーオキシダーゼ抗体は、該ヌクレオソームの該DNA
成分と反応する。洗浄段階によって未結合の抗体を除去
した後、ヌクレオソームの量を、該免疫複合体中に残さ
れている該パーオキシダーゼによって定量する。パーオ
キシダーゼは、基質としてのABTS７(2,2'-アジド-[3-エ
チルベンズチアゾリン-スルフォネート])を使用して、
測光法により測定する。
て処理されている、細胞中のDNAフラグメント化におけ
る増大を測定することによっても、定量できる。細胞質
性ヒストン-結合-DNA-フラグメント(モノ-およびオリゴ
ヌクレオソーム)の、定量的インビトロ測定用の市販の
測光EIAを利用できる（ベーリンガーマンハイム(Boehri
nger Mannheim)社のセルデスディテクション(Cell Deat
h Detection) ELIZAok ys, Cat. No. 1,774,425）。この
ベーリンガーマンハイムアッセイは、夫々DNAおよびヒ
ストンに対する、マウスモノクローナル抗体を使用し
た、サンドイッチ-酵素-イムノアッセイ原理に基づいて
いる。これは、細胞溶解物の該細胞質画分中の、モノ-
およびオリゴヌクレオソームの特異的測定を可能とす
る。販売業者によれば、アポトーシスは以下の様式に従
って測定される。該サンプル(細胞溶解物)を、ストレプ
タビジン-被覆マイクロタイタープレート(MTP)に入れ
る。引き続き、抗-ヒストン-ビオチンと抗-DNAパーオキ
シダーゼ複合体との混合物を添加し、２時間インキュベ
ートする。このインキュベーション時間中、該抗-ヒス
トン抗体は、該ヌクレオソームの該ヒストン-成分と結
合し、同時に該免疫複合体を該ストレプタビジン-被覆M
TPに、そのビオチン化を介して固定する。更に、該抗-D
NAパーオキシダーゼ抗体は、該ヌクレオソームの該DNA
成分と反応する。洗浄段階によって未結合の抗体を除去
した後、ヌクレオソームの量を、該免疫複合体中に残さ
れている該パーオキシダーゼによって定量する。パーオ
キシダーゼは、基質としてのABTS７(2,2'-アジド-[3-エ
チルベンズチアゾリン-スルフォネート])を使用して、
測光法により測定する。
【００６１】例えば、SW-480結腸腺癌細胞を、ウエル当
たり10,000細胞なる密度で、96-ウエルMTPに入れる。次
いで、細胞をテスト化合物で処理し、37℃にて48時間イ
ンキュベートする。このインキュベーションの後、該MT
Pを遠心分離処理し、得られる上澄を取り出す。次に、
各ウエル内の細胞ペレットを、溶解バッファー中に30分
間再懸濁する。次いで、得られる溶解物を、遠心分離処
理し、該上澄のアリコート(即ち、該細胞質画分)を、ス
トレプタビジン-被覆MTPに移す。該MTP中で該溶解され
たペレット(即ち、高分子量のフラグメント化されてい
ないDNAを含む細胞核)を振とうしないように注意する。
次いで、サンプルを分析する。比刺激(fold stimulatio
n; FS = ODmax/ODveh)、即ちアポトーシス応答の指標
を、所定濃度にてテストした各化合物について測定す
る。EC50値も、該テスト化合物の一連の濃度を評価する
ことによって決定することができる。アポトーシスにお
ける統計的に有意な増加(即ち、100μMなる濃度におけ
る2を越える比刺激)は、更に該化合物が腫瘍性病変の治
療のために有用であることを示している。好ましくは、
アポトーシス活性に関する、該EC50値は、腫瘍性病変の
治療のために使用可能であると考えられる化合物につい
ては、100μM未満であるべきである。本明細書では、EC
50値は、ビヒクル処理に対して、アポトーシスの50%誘
発を生ずる濃度として定義される。
たり10,000細胞なる密度で、96-ウエルMTPに入れる。次
いで、細胞をテスト化合物で処理し、37℃にて48時間イ
ンキュベートする。このインキュベーションの後、該MT
Pを遠心分離処理し、得られる上澄を取り出す。次に、
各ウエル内の細胞ペレットを、溶解バッファー中に30分
間再懸濁する。次いで、得られる溶解物を、遠心分離処
理し、該上澄のアリコート(即ち、該細胞質画分)を、ス
トレプタビジン-被覆MTPに移す。該MTP中で該溶解され
たペレット(即ち、高分子量のフラグメント化されてい
ないDNAを含む細胞核)を振とうしないように注意する。
次いで、サンプルを分析する。比刺激(fold stimulatio
n; FS = ODmax/ODveh)、即ちアポトーシス応答の指標
を、所定濃度にてテストした各化合物について測定す
る。EC50値も、該テスト化合物の一連の濃度を評価する
ことによって決定することができる。アポトーシスにお
ける統計的に有意な増加(即ち、100μMなる濃度におけ
る2を越える比刺激)は、更に該化合物が腫瘍性病変の治
療のために有用であることを示している。好ましくは、
アポトーシス活性に関する、該EC50値は、腫瘍性病変の
治療のために使用可能であると考えられる化合物につい
ては、100μM未満であるべきである。本明細書では、EC
50値は、ビヒクル処理に対して、アポトーシスの50%誘
発を生ずる濃度として定義される。
【００６２】F. 乳腺器官培養物モデルテスト 上記方法によって同定されたテスト化合物は、乳腺器官
培養物系における前-腫瘍性病変の発生を阻害する能力
によって、抗−腫瘍形成活性についてテストすることが
できる。このマウス乳腺器官培養物技術は、既知の抗−
腫瘍形成剤、例えば幾つかのNSAID、レチノイド、タモ
キシフェン、セレン、および幾つかの天然生成物の効果
を研究するために、他の研究者によって上首尾で利用さ
れており、しかも本発明のスクリーニング法の妥当性を
確認するのに有用である。例えば、雌BALB/cマウスを、
毎日エストラジオールおよびプロゲステロンの組み合わ
せで処理し、インビトロで、該腺をホルモンに対して応
答性とするように刺激することができる。これら動物を
殺し、胸部乳腺を無菌摘出し、10日間、インシュリン、
プロラクチン、ヒドロコルチゾン、およびアルドステロ
ンを補充した成長培地中でインキュベートする。DMBA
(7,12-ジメチルベンズアンスラセン)を培地に添加し
て、前悪性病変の形成を誘発する。次いで、十分に発育
した腺を、プロラクチン、ヒドロコルチゾン、およびア
ルドステロンに枯渇させ、該前悪性病変ではないが、該
腺を退行させた。
培養物系における前-腫瘍性病変の発生を阻害する能力
によって、抗−腫瘍形成活性についてテストすることが
できる。このマウス乳腺器官培養物技術は、既知の抗−
腫瘍形成剤、例えば幾つかのNSAID、レチノイド、タモ
キシフェン、セレン、および幾つかの天然生成物の効果
を研究するために、他の研究者によって上首尾で利用さ
れており、しかも本発明のスクリーニング法の妥当性を
確認するのに有用である。例えば、雌BALB/cマウスを、
毎日エストラジオールおよびプロゲステロンの組み合わ
せで処理し、インビトロで、該腺をホルモンに対して応
答性とするように刺激することができる。これら動物を
殺し、胸部乳腺を無菌摘出し、10日間、インシュリン、
プロラクチン、ヒドロコルチゾン、およびアルドステロ
ンを補充した成長培地中でインキュベートする。DMBA
(7,12-ジメチルベンズアンスラセン)を培地に添加し
て、前悪性病変の形成を誘発する。次いで、十分に発育
した腺を、プロラクチン、ヒドロコルチゾン、およびア
ルドステロンに枯渇させ、該前悪性病変ではないが、該
腺を退行させた。
【００６３】該テスト化合物をDMSOに溶解し、これを培
養期間全体を通して、該培地に添加する。該培養期間の
終了時点において、該腺を10%ホルマリン中で固定し、
ミョウバンカーミン染色し、スライドガラスに載せる。
乳腺病変形成の発生率は、乳腺病変を有する腺対病変を
もたない腺の比である。テスト化合物で処理した腺にお
ける乳腺病変の発生率を、未処理の腺の発生率と比較す
る。該乳腺病変によって占められる面積の程度は、指状
パッドに該腺の像を投影することによって定量できる。
該腺によって覆われた面積を、該パッド上でトレース
し、該面積の100%であると考える。非退行構造各々によ
って覆われた区域をも、該指状パッド上に明確化し、コ
ンピュータにより定量する。
養期間全体を通して、該培地に添加する。該培養期間の
終了時点において、該腺を10%ホルマリン中で固定し、
ミョウバンカーミン染色し、スライドガラスに載せる。
乳腺病変形成の発生率は、乳腺病変を有する腺対病変を
もたない腺の比である。テスト化合物で処理した腺にお
ける乳腺病変の発生率を、未処理の腺の発生率と比較す
る。該乳腺病変によって占められる面積の程度は、指状
パッドに該腺の像を投影することによって定量できる。
該腺によって覆われた面積を、該パッド上でトレース
し、該面積の100%であると考える。非退行構造各々によ
って覆われた区域をも、該指状パッド上に明確化し、コ
ンピュータにより定量する。
【００６４】実験結果 多数の化合物を、種々のプロトコールで検討し、腫瘍性
疾患の治療における可能な用途につき、スクリーニング
した。これらのテスト結果を、以下に報告する。以下、
これらテスト化合物は、下記の説明に対応する一文字コ
ードで表すものとする。 A: ラク(rac)-スレオ(threo)-(E)-1-(N,N'-ジエチルア
ミノエタンチオ)-1-(ブタン-1',4'-オリド(olido))-
[3',4':1,2]-6-フルオロ-2-メチル-3-(p-メチルスルフ
ォニルベンジリデン)-インダン; B: (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-(3,4,5-トリメトキシベ
ンジリデン)-3-酢酸; C: (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-(p-クロロベンジリデ
ン)-3-酢酸; D: ラク-(E)-1-(ブタン-1',4'-オリド)-[3',4':1,2]-6-
フルオロ-2-メチル-3-(p-メチルスルフォニルベンジリ
デン)-1S-インダニル-N-アセチルシステイン; E: N-ベンジル (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-(3,4,5-ト
リメトキシベンジリデン)-3-インデニルアセタミド; F: N,N'-ジシクロヘキシル (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1
-(p-メチルスルフォニルベンジリデン)-3-インデニルア
セタミド; G: リボ(ribo)-(E)-1-トリアゾロ-[2',3':1'',3'']-1-
(ブタン-1',4'-オリド)-[3',4':1,2]-6-フルオロ-2-メ
チル-3-(p-メチルスルフォニルベンジリデン)-インダ
ン;および H: ラク-(E)-1-(ブタン-1',4'-オリド)-[3',4':1,2]-6-
フルオロ-2-メチル-3-(p-メチルスルフォニルベンジリ
デン)-1S-インダニル-グルタチオン
疾患の治療における可能な用途につき、スクリーニング
した。これらのテスト結果を、以下に報告する。以下、
これらテスト化合物は、下記の説明に対応する一文字コ
ードで表すものとする。 A: ラク(rac)-スレオ(threo)-(E)-1-(N,N'-ジエチルア
ミノエタンチオ)-1-(ブタン-1',4'-オリド(olido))-
[3',4':1,2]-6-フルオロ-2-メチル-3-(p-メチルスルフ
ォニルベンジリデン)-インダン; B: (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-(3,4,5-トリメトキシベ
ンジリデン)-3-酢酸; C: (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-(p-クロロベンジリデ
ン)-3-酢酸; D: ラク-(E)-1-(ブタン-1',4'-オリド)-[3',4':1,2]-6-
フルオロ-2-メチル-3-(p-メチルスルフォニルベンジリ
デン)-1S-インダニル-N-アセチルシステイン; E: N-ベンジル (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1-(3,4,5-ト
リメトキシベンジリデン)-3-インデニルアセタミド; F: N,N'-ジシクロヘキシル (Z)-5-フルオロ-2-メチル-1
-(p-メチルスルフォニルベンジリデン)-3-インデニルア
セタミド; G: リボ(ribo)-(E)-1-トリアゾロ-[2',3':1'',3'']-1-
(ブタン-1',4'-オリド)-[3',4':1,2]-6-フルオロ-2-メ
チル-3-(p-メチルスルフォニルベンジリデン)-インダ
ン;および H: ラク-(E)-1-(ブタン-1',4'-オリド)-[3',4':1,2]-6-
フルオロ-2-メチル-3-(p-メチルスルフォニルベンジリ
デン)-1S-インダニル-グルタチオン
【００６５】実施例１: COX阻害アッセイ 基準化合物およびテスト化合物を、上記のCOXアッセイ
に関するプロトコールにしたがって、そのCOX阻害活性
につき分析した。図４は、種々の濃度のスリンダクスル
フィドまたはエグジスリンドの、精製されたシクロオキ
シゲナーゼ(タイプ１)活性に及ぼす作用を示す。シクロ
オキシゲナーゼ活性は、ヒツジ精嚢由来の精製シクロオ
キシゲナーゼを使用して、上記のように(ミッチェル等
の上記文献)測定した。スリンダクスルフィドに関するI
C50の値は、約1.76μMであるものと計算され、一方エグ
ジスリンドのその値は、10,000μMを越えるものであっ
た。これらデータは、エグジスリンドではなく、スリン
ダクスルフィドが、COX-I阻害剤であることを示してい
る。同様なデータが、COX-2イソ酵素についても得られ
た(トムソン(Thompson)等, Journal of the National C
ancer Institute, 1995, 87:1259-1260)。図５は、テス
ト化合物BおよびEのCOX阻害に及ぼす作用を示す。COX活
性は、図４に示した化合物に対するものと同様に測定し
た。得られたデータは、これらテスト化合物BおよびE
が、COX-Iを有意に阻害することを示している。
に関するプロトコールにしたがって、そのCOX阻害活性
につき分析した。図４は、種々の濃度のスリンダクスル
フィドまたはエグジスリンドの、精製されたシクロオキ
シゲナーゼ(タイプ１)活性に及ぼす作用を示す。シクロ
オキシゲナーゼ活性は、ヒツジ精嚢由来の精製シクロオ
キシゲナーゼを使用して、上記のように(ミッチェル等
の上記文献)測定した。スリンダクスルフィドに関するI
C50の値は、約1.76μMであるものと計算され、一方エグ
ジスリンドのその値は、10,000μMを越えるものであっ
た。これらデータは、エグジスリンドではなく、スリン
ダクスルフィドが、COX-I阻害剤であることを示してい
る。同様なデータが、COX-2イソ酵素についても得られ
た(トムソン(Thompson)等, Journal of the National C
ancer Institute, 1995, 87:1259-1260)。図５は、テス
ト化合物BおよびEのCOX阻害に及ぼす作用を示す。COX活
性は、図４に示した化合物に対するものと同様に測定し
た。得られたデータは、これらテスト化合物BおよびE
が、COX-Iを有意に阻害することを示している。
【００６６】
【表２】一連の化合物に関する、シクロオキシゲナーゼ
阻害活性
阻害活性
【００６７】上記プロトコールにしたがって、化合物A~
Eを、COX阻害活性について評価し、結果を上記表２に示
した。化合物Cは、100μMなる投与量において、25%を越
えるCOXの阻害性を示すことが分かり、従って更にスク
リーニングするために選択する必要はなかった。 実施例2: cGMP PDE阻害アッセイ 基準化合物およびテスト化合物を、上記アッセイのため
のプロトコールに従って、cGMP PDE阻害活性につき分析
した。図6は、種々の濃度のスリンダクおよびエグジス
リンドの、PDE4またはcGMP PDE活性に及ぼす作用を示
し、該PDE4またはcGMP PDEは、ヒト結腸HT-29培養腫瘍
細胞から、前に記載された(W.J. Thompson等の上記文
献)ように、精製したものである。PDE4の阻害に関する
スリンダクスルフィドのIC50値は、41μMであり、またc
GMP PDEの阻害に関するそのIC50値は、17μMであった。
PDE4の阻害に関するエグジスリンドのIC50値は、181μM
であり、またcGMP PDEの阻害に関するそのIC50値は、56
μMであった。これらのデータは、スリンダクスルフィ
ドおよびエグジスリンド両者が、ホスホジエステラーゼ
活性を阻害することを示している。これら両化合物は、
PDE4イソ型を越える、cGMP PDEイソ酵素型に対する選択
性を示す。
Eを、COX阻害活性について評価し、結果を上記表２に示
した。化合物Cは、100μMなる投与量において、25%を越
えるCOXの阻害性を示すことが分かり、従って更にスク
リーニングするために選択する必要はなかった。 実施例2: cGMP PDE阻害アッセイ 基準化合物およびテスト化合物を、上記アッセイのため
のプロトコールに従って、cGMP PDE阻害活性につき分析
した。図6は、種々の濃度のスリンダクおよびエグジス
リンドの、PDE4またはcGMP PDE活性に及ぼす作用を示
し、該PDE4またはcGMP PDEは、ヒト結腸HT-29培養腫瘍
細胞から、前に記載された(W.J. Thompson等の上記文
献)ように、精製したものである。PDE4の阻害に関する
スリンダクスルフィドのIC50値は、41μMであり、またc
GMP PDEの阻害に関するそのIC50値は、17μMであった。
PDE4の阻害に関するエグジスリンドのIC50値は、181μM
であり、またcGMP PDEの阻害に関するそのIC50値は、56
μMであった。これらのデータは、スリンダクスルフィ
ドおよびエグジスリンド両者が、ホスホジエステラーゼ
活性を阻害することを示している。これら両化合物は、
PDE4イソ型を越える、cGMP PDEイソ酵素型に対する選択
性を示す。
【００６８】図７は、上記アッセイに従って、培養HT-2
9細胞内で測定した如く、cGMPまたはcAMP産性の何れか
に及ぼされる、スリンダクスルフィドの作用を示す。HT
-29細胞は、スリンダクスルフィドで30分間処理され、
またcGMPまたはcAMPは、従来のラジオイムノアッセイ法
により測定した。示されたように、スリンダクスルフィ
ドは、50%を越えてcGMPのレベルを増大し、EC50値は7.3
μMであった(図7A)。cAMPのレベルは、この処理により
影響を受けないが、既知のPDE4阻害剤であるロリプラム
は、cAMPを増大した(図7B)。これらデータは、PDE4に相
対的に、cGMP PDEを阻害することの、薬理的な重要性を
立証している。図8は、指定した投与量のテスト化合物B
が、ホスホジエステラーゼのcGMP PDEまたはPDE４イソ
酵素何れかに及ぼす作用を示す。計算されたIC50値は、
cGMP PDEに対して18μMであり、かつPDE4に対して58μM
であった。図9は、指定した投与量のテスト化合物Eが、
ホスホジエステラーゼのcGMP PDEまたはPDE４イソ酵素
何れかに及ぼす作用を示す。計算されたIC50値は、cGMP
PDEに対して0.08μMであり、かつPDE4に対して25μMで
あった。
9細胞内で測定した如く、cGMPまたはcAMP産性の何れか
に及ぼされる、スリンダクスルフィドの作用を示す。HT
-29細胞は、スリンダクスルフィドで30分間処理され、
またcGMPまたはcAMPは、従来のラジオイムノアッセイ法
により測定した。示されたように、スリンダクスルフィ
ドは、50%を越えてcGMPのレベルを増大し、EC50値は7.3
μMであった(図7A)。cAMPのレベルは、この処理により
影響を受けないが、既知のPDE4阻害剤であるロリプラム
は、cAMPを増大した(図7B)。これらデータは、PDE4に相
対的に、cGMP PDEを阻害することの、薬理的な重要性を
立証している。図8は、指定した投与量のテスト化合物B
が、ホスホジエステラーゼのcGMP PDEまたはPDE４イソ
酵素何れかに及ぼす作用を示す。計算されたIC50値は、
cGMP PDEに対して18μMであり、かつPDE4に対して58μM
であった。図9は、指定した投与量のテスト化合物Eが、
ホスホジエステラーゼのcGMP PDEまたはPDE４イソ酵素
何れかに及ぼす作用を示す。計算されたIC50値は、cGMP
PDEに対して0.08μMであり、かつPDE4に対して25μMで
あった。
【００６９】
【表３】一連の化合物のcGMP PDE阻害活性
【００７０】表3中の上記化合物を、上記プロトコール
に記載したように、PDE阻害活性について評価した。COX
を阻害しなかった該化合物の中で、化合物Eのみが、10
μMにて50%を越える阻害を生じることが分かった。図8
に示したように、化合物Bは、20μMにおいて50%を越え
る阻害を示した。従って、単一投与テストにおいて使用
した投与レベルに依存して、幾つかの化合物は、幾分よ
り高い投与量において、活性である可能性があるものと
して、選別できる。使用した該投与量は、主観的なもの
であり、あるレベルにおいて活性な化合物が見出された
後には、該投与量を減じて、より一層有力な化合物を同
定することも可能である。
に記載したように、PDE阻害活性について評価した。COX
を阻害しなかった該化合物の中で、化合物Eのみが、10
μMにて50%を越える阻害を生じることが分かった。図8
に示したように、化合物Bは、20μMにおいて50%を越え
る阻害を示した。従って、単一投与テストにおいて使用
した投与レベルに依存して、幾つかの化合物は、幾分よ
り高い投与量において、活性である可能性があるものと
して、選別できる。使用した該投与量は、主観的なもの
であり、あるレベルにおいて活性な化合物が見出された
後には、該投与量を減じて、より一層有力な化合物を同
定することも可能である。
【００７１】実施例３: アポトーシスアッセイ 基準化合物およびテスト化合物を、上記アッセイに関す
るプロトコールに従って、その新規なPDE阻害活性につ
き解析した。これらプロトコールに従って、図10はスリ
ンダクスルフィドおよびエグジスリンドの、アポトーシ
スおよび壊死による細胞死に及ぼす効果を示す。HT-29
細胞は、指示した投与量のスリンダクスルフィドまたは
エグジスリンドで、6日間処理した。アポトーシスおよ
び壊死による細胞死は、以前に測定された(デューク&コ
ーエン(Duke and Cohen), Current Protocols in Immun
ology, 3.17.1-3.17.16, NY,ジョンウイリー&サンズ社,
1992)。これらデータは、スリンダクスルフィドおよび
エグジスリンド両者が、壊死を誘発せずに、アポトーシ
ス細胞死を生じ得ることを示している。全てのデータ
は、同一の実験から集められたものであった。
るプロトコールに従って、その新規なPDE阻害活性につ
き解析した。これらプロトコールに従って、図10はスリ
ンダクスルフィドおよびエグジスリンドの、アポトーシ
スおよび壊死による細胞死に及ぼす効果を示す。HT-29
細胞は、指示した投与量のスリンダクスルフィドまたは
エグジスリンドで、6日間処理した。アポトーシスおよ
び壊死による細胞死は、以前に測定された(デューク&コ
ーエン(Duke and Cohen), Current Protocols in Immun
ology, 3.17.1-3.17.16, NY,ジョンウイリー&サンズ社,
1992)。これらデータは、スリンダクスルフィドおよび
エグジスリンド両者が、壊死を誘発せずに、アポトーシ
ス細胞死を生じ得ることを示している。全てのデータ
は、同一の実験から集められたものであった。
【００７２】図11は、DNAフラグメント化により測定し
たように、腫瘍成長阻害およびアポトーシス誘発に及ぼ
す、スリンダクスルフィドおよびエグジスリンドの効果
を示す。上の図(図11A)は、エグジスリンドによる、成
長阻害(白抜きの記号、左軸)およびDNAフラグメント化
(黒塗りの記号、右軸)を示す。下の図(図11B)は、スリ
ンダクスルフィドによる、成長阻害(白抜きの記号)およ
びDNAフラグメント化(黒塗りの記号)を示す。成長阻害
は、処理の6日後に、該SRBアッセイにより測定した。DN
Aフラグメント化は、処理の48時間後に測定した。全て
のデータは、同一の実験から集めた。図12は、化合物E
のアポトーシス誘発特性を示す。HT-29結腸腺癌細胞
は、指示した濃度の化合物Eにより48時間処理し、アポ
トーシスを該DNAフラグメント化アッセイにより測定し
た。計算されたEC50の値は、0.05μMであった。図13
は、化合物Bのアポトーシス誘発特性を示す。HT-29結腸
腺癌細胞は、指示した濃度の化合物Bにより48時間処理
し、アポトーシスを該DNAフラグメント化アッセイによ
り測定した。計算されたEC50の値は、約175μMであっ
た。
たように、腫瘍成長阻害およびアポトーシス誘発に及ぼ
す、スリンダクスルフィドおよびエグジスリンドの効果
を示す。上の図(図11A)は、エグジスリンドによる、成
長阻害(白抜きの記号、左軸)およびDNAフラグメント化
(黒塗りの記号、右軸)を示す。下の図(図11B)は、スリ
ンダクスルフィドによる、成長阻害(白抜きの記号)およ
びDNAフラグメント化(黒塗りの記号)を示す。成長阻害
は、処理の6日後に、該SRBアッセイにより測定した。DN
Aフラグメント化は、処理の48時間後に測定した。全て
のデータは、同一の実験から集めた。図12は、化合物E
のアポトーシス誘発特性を示す。HT-29結腸腺癌細胞
は、指示した濃度の化合物Eにより48時間処理し、アポ
トーシスを該DNAフラグメント化アッセイにより測定し
た。計算されたEC50の値は、0.05μMであった。図13
は、化合物Bのアポトーシス誘発特性を示す。HT-29結腸
腺癌細胞は、指示した濃度の化合物Bにより48時間処理
し、アポトーシスを該DNAフラグメント化アッセイによ
り測定した。計算されたEC50の値は、約175μMであっ
た。
【００７３】
【表４】一連の化合物のアポトーシス誘発活性
【００７４】上記の誘発倍率プロトコールに従って、該
化合物A~Eを、上記表４で報告したように、アポトーシ
ス誘発活性についてテストした。化合物B、CおよびE
は、投与量100μMにおいて、2.0倍を越える、有意なア
ポトーシス誘発活性を示した。これら3種の化合物の中
で、この投与量において、化合物BおよびEのみが、COX
を阻害しないが、cGMP-特異的PDEを阻害した。一連のホ
スホジエステラーゼ阻害剤に関する、該アポトーシス誘
発活性を測定した。得られたデータは、以下の表5に示
す。HT-29細胞を、6日間、種々のホスホジエステラーゼ
阻害剤で処理した。アポトーシスおよび壊死を、上記ア
ッセイにしたがって、アクリジンオレンジおよびエチジ
ウムブロミドで標識した後に、形態学的に決定した。得
られたデータは、この新規なcGMP-特異的PDEが、HT-29
細胞のアポトーシスを誘発する化合物をスクリーニング
するために有用であることを示している。
化合物A~Eを、上記表４で報告したように、アポトーシ
ス誘発活性についてテストした。化合物B、CおよびE
は、投与量100μMにおいて、2.0倍を越える、有意なア
ポトーシス誘発活性を示した。これら3種の化合物の中
で、この投与量において、化合物BおよびEのみが、COX
を阻害しないが、cGMP-特異的PDEを阻害した。一連のホ
スホジエステラーゼ阻害剤に関する、該アポトーシス誘
発活性を測定した。得られたデータは、以下の表5に示
す。HT-29細胞を、6日間、種々のホスホジエステラーゼ
阻害剤で処理した。アポトーシスおよび壊死を、上記ア
ッセイにしたがって、アクリジンオレンジおよびエチジ
ウムブロミドで標識した後に、形態学的に決定した。得
られたデータは、この新規なcGMP-特異的PDEが、HT-29
細胞のアポトーシスを誘発する化合物をスクリーニング
するために有用であることを示している。
【００７５】
【表５】PDE阻害剤に関するアポトーシス誘発データ
【００７６】実施例４: 成長阻害アッセイ 上記アッセイに関するプロトコールに従って、基準化合
物およびテスト化合物を、そのPDE5阻害活性について分
析した。図14は、種々の濃度のスリンダクスルフィドお
よびエグジスリンドの、HT-29細胞の成長に及ぼす阻害
作用を示す。HT-29細胞は、指示したように、6日間に渡
り、種々の投与量のエグジスリンド(三角)またはスリン
ダクスルフィド(四角)により処理した。細胞数は、以前
に記載された(ピアザ(Piazza)等, Cancer Research, 19
95, 55:3110-3116)ような、スルフォローダミンアッセ
イによって測定した。スリンダクスルフィドのIC50値
は、約45μMであり、エグジスリンドのその値は、200μ
Mであった。これらデータは、スリンダクスルフィドお
よびエグジスリンド両者が、腫瘍細胞の成長を阻害でき
ることを示している。図15は、スリンダクスルフィドの
該成長阻害およびアポトーシス誘発活性を示す。1クー
ルの実験を示し、これはHT-29細胞を、ビヒクル即ち0.1
%DMSO (白抜きの記号)またはスリンダクスルフィド120
μM(黒塗りの記号)で処理することを含む。成長阻害(図
15A、上)は、トリパンブルー染色後に、生きた細胞を計
数することにより測定した。アポトーシス(図15B、下)
は、以前に記載された(デューク&コーエン(Duke and Co
hen), Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.1
7.16, NY,ジョンウイリー&サンズ社, 1992)ように、ア
クリジンオレンジおよびエチジウムブロミドで標識した
後に、形態学的に決定した。これらデータは、スリンダ
クスルフィドが、腫瘍細胞成長を阻害でき、かつその効
果が、アポトーシスの増大により達成されることを示し
ている。これらデータ全ては、同一の実験から集めた。
図16は、テスト化合物Eの成長阻害活性を示す。HT-29結
腸腺癌細胞を、指示した濃度の化合物Eにより6日間処理
し、細胞数を該SRBアッセイによって測定した。計算さ
れたIC50の値は、0.04μMであった。
物およびテスト化合物を、そのPDE5阻害活性について分
析した。図14は、種々の濃度のスリンダクスルフィドお
よびエグジスリンドの、HT-29細胞の成長に及ぼす阻害
作用を示す。HT-29細胞は、指示したように、6日間に渡
り、種々の投与量のエグジスリンド(三角)またはスリン
ダクスルフィド(四角)により処理した。細胞数は、以前
に記載された(ピアザ(Piazza)等, Cancer Research, 19
95, 55:3110-3116)ような、スルフォローダミンアッセ
イによって測定した。スリンダクスルフィドのIC50値
は、約45μMであり、エグジスリンドのその値は、200μ
Mであった。これらデータは、スリンダクスルフィドお
よびエグジスリンド両者が、腫瘍細胞の成長を阻害でき
ることを示している。図15は、スリンダクスルフィドの
該成長阻害およびアポトーシス誘発活性を示す。1クー
ルの実験を示し、これはHT-29細胞を、ビヒクル即ち0.1
%DMSO (白抜きの記号)またはスリンダクスルフィド120
μM(黒塗りの記号)で処理することを含む。成長阻害(図
15A、上)は、トリパンブルー染色後に、生きた細胞を計
数することにより測定した。アポトーシス(図15B、下)
は、以前に記載された(デューク&コーエン(Duke and Co
hen), Current Protocols in Immunology, 3.17.1-3.1
7.16, NY,ジョンウイリー&サンズ社, 1992)ように、ア
クリジンオレンジおよびエチジウムブロミドで標識した
後に、形態学的に決定した。これらデータは、スリンダ
クスルフィドが、腫瘍細胞成長を阻害でき、かつその効
果が、アポトーシスの増大により達成されることを示し
ている。これらデータ全ては、同一の実験から集めた。
図16は、テスト化合物Eの成長阻害活性を示す。HT-29結
腸腺癌細胞を、指示した濃度の化合物Eにより6日間処理
し、細胞数を該SRBアッセイによって測定した。計算さ
れたIC50の値は、0.04μMであった。
【００７７】
【表６】一連の化合物の成長阻害活性
【００７８】上記章のスクリーニングプロトコールに従
って、化合物A~Eを、上記表６に報告したように、成長
阻害活性についてテストした。全てのテスト化合物が、
単一投与テストにおいて、100μMを越える活性を示し
た。一連のホスホジエステラーゼ阻害剤に対する成長阻
害活性を測定した。得られた結果を、以下の表7に示
す。HT-29細胞を、6日間に渡り、種々のホスホジエステ
ラーゼ阻害剤により処理した。細胞の成長は、上記のSR
Bアッセイにより測定した。上記のデータと共に以下に
示すデータは、該新規PDEの阻害剤が腫瘍細胞成長を阻
害する上で有効であることを示している。
って、化合物A~Eを、上記表６に報告したように、成長
阻害活性についてテストした。全てのテスト化合物が、
単一投与テストにおいて、100μMを越える活性を示し
た。一連のホスホジエステラーゼ阻害剤に対する成長阻
害活性を測定した。得られた結果を、以下の表7に示
す。HT-29細胞を、6日間に渡り、種々のホスホジエステ
ラーゼ阻害剤により処理した。細胞の成長は、上記のSR
Bアッセイにより測定した。上記のデータと共に以下に
示すデータは、該新規PDEの阻害剤が腫瘍細胞成長を阻
害する上で有効であることを示している。
【００７９】
【表７】PDE阻害剤に関する成長阻害データ
【００８０】このスクリーニング法の、種々の形状の腫
瘍形成に対する有効性を見るために、多数の細胞系につ
き、化合物をテストした。スリンダクスルフィドおよび
エグジスリンドの、種々の細胞系に及ぼす効果を、測定
した。これらデータを、以下の表８に示す。該IC50値
は、該SRBアッセイにより測定した。これらのデータ
は、これら化合物の、広範囲の腫瘍形成に対する、幅広
い有効性を示し、匹敵する投与範囲における有効性を有
している。従って、本発明により同定されかつ選別され
た化合物は、腫瘍形成の多数の形態に対して有用である
はずである。
瘍形成に対する有効性を見るために、多数の細胞系につ
き、化合物をテストした。スリンダクスルフィドおよび
エグジスリンドの、種々の細胞系に及ぼす効果を、測定
した。これらデータを、以下の表８に示す。該IC50値
は、該SRBアッセイにより測定した。これらのデータ
は、これら化合物の、広範囲の腫瘍形成に対する、幅広
い有効性を示し、匹敵する投与範囲における有効性を有
している。従って、本発明により同定されかつ選別され
た化合物は、腫瘍形成の多数の形態に対して有用である
はずである。
【００８１】
【表８】種々の細胞系の成長阻害データ ＊：シュミット(Schmid)等, Proc. AACR, 1998, 39:195
に記載されているような、ニュートラルレッドアッセイ
により測定した。
に記載されているような、ニュートラルレッドアッセイ
により測定した。
【００８２】実施例5: 乳腺器官培養モデルにおける活
性 図17は、乳腺器官培養物中の前癌病巣の、スリンダク代
謝産物による阻害を示す。乳腺器官培養実験は、以前に
記載された(メータ&ムーン(Mehta & Moon), Cancer Res
earch, 1986, 46:5832-5835)ように実施した。これら結
果は、スリンダクおよびエグジスリンドが、前癌性病巣
の形成を効果的に阻害し、一方スリンダクスルフィド
は、不活性であることを示した。これらデータは、シク
ロオキシゲナーゼ阻害が、所定の化合物の抗−腫瘍形成
特性にとって不要であるという仮説を支持している。腫
瘍性疾患を治療するための化合物を選別するために、本
発明は、数種のプロトコールからのテスト化合物の実験
データを比較するための原理を提供する。本発明の構成
の範囲内においては、テスト化合物を、ヒトの腫瘍性疾
患を治療するための使用可能性に従ってランク付けする
ことができる。所定の効果を持つこれら化合物は、付随
的なテストおよびその後のヒトでの使用のために、選別
することができる。種々のテスト化合物の定性的なデー
タおよびこれら幾つかのプロトコールは、以下の表9に
示されている。これらデータは、エグジスリンド、化合
物Bおよび化合物Eが、４つのアッセイ、即ちCOX阻害性
のないこと、効果的なcGMP-特異的PDE阻害の存在、成長
阻害およびアポトーシスの誘発によるスクリーニングを
パスする、適当な能力を持つことを示している。該乳腺
器官培養物中におけるこれら化合物の活性は、本発明の
有効性を立証している。該スクリーニングプロトコール
の定性的な評価は、化合物Eが最良であり、次に化合物B
であり、更にエグジスリンドであることを示している。
性 図17は、乳腺器官培養物中の前癌病巣の、スリンダク代
謝産物による阻害を示す。乳腺器官培養実験は、以前に
記載された(メータ&ムーン(Mehta & Moon), Cancer Res
earch, 1986, 46:5832-5835)ように実施した。これら結
果は、スリンダクおよびエグジスリンドが、前癌性病巣
の形成を効果的に阻害し、一方スリンダクスルフィド
は、不活性であることを示した。これらデータは、シク
ロオキシゲナーゼ阻害が、所定の化合物の抗−腫瘍形成
特性にとって不要であるという仮説を支持している。腫
瘍性疾患を治療するための化合物を選別するために、本
発明は、数種のプロトコールからのテスト化合物の実験
データを比較するための原理を提供する。本発明の構成
の範囲内においては、テスト化合物を、ヒトの腫瘍性疾
患を治療するための使用可能性に従ってランク付けする
ことができる。所定の効果を持つこれら化合物は、付随
的なテストおよびその後のヒトでの使用のために、選別
することができる。種々のテスト化合物の定性的なデー
タおよびこれら幾つかのプロトコールは、以下の表9に
示されている。これらデータは、エグジスリンド、化合
物Bおよび化合物Eが、４つのアッセイ、即ちCOX阻害性
のないこと、効果的なcGMP-特異的PDE阻害の存在、成長
阻害およびアポトーシスの誘発によるスクリーニングを
パスする、適当な能力を持つことを示している。該乳腺
器官培養物中におけるこれら化合物の活性は、本発明の
有効性を立証している。該スクリーニングプロトコール
の定性的な評価は、化合物Eが最良であり、次に化合物B
であり、更にエグジスリンドであることを示している。
【００８３】
【表９】種々の化合物の活性のプロフィール 表９のコード: 化合物の活性は、最大活性および能力に
関するテストを包含する、一連の実験による評価に基づ
く:‐：不活性; +: 僅かに活性; ++: 中程度に活性; ++
+: 強い活性; ++++:高度に活性。
関するテストを包含する、一連の実験による評価に基づ
く:‐：不活性; +: 僅かに活性; ++: 中程度に活性; ++
+: 強い活性; ++++:高度に活性。
【００８４】同様に、PKG活性を測定するための新規な
アッセイをも開示し、該アッセイは、本発明のスクリー
ニング法で使用され、かつその他の目的(例えば、正常
な細胞機能におけるPKGの役割に関する研究)のために、
PKG活性のアッセイにおいても、より一般的な有用性を
有している。説明の目的で、ある化合物が腫瘍形成にお
いて潜在的に有用であるか否かを確認する上で、該PKG
活性が如何に有用であり得るかを説明する前に、まず該
PKGアッセイを説明することが有利である。
アッセイをも開示し、該アッセイは、本発明のスクリー
ニング法で使用され、かつその他の目的(例えば、正常
な細胞機能におけるPKGの役割に関する研究)のために、
PKG活性のアッセイにおいても、より一般的な有用性を
有している。説明の目的で、ある化合物が腫瘍形成にお
いて潜在的に有用であるか否かを確認する上で、該PKG
活性が如何に有用であり得るかを説明する前に、まず該
PKGアッセイを説明することが有利である。
【００８５】該新規なPKGアッセイ 本発明の新規なPKGアッセイは、固相に複数のアミノ酸
配列を結合することを含み、該アミノ酸配列各々は、少
なくとも該cGMP結合ドメインと、ホスホジエステラーゼ
タイプ5(「PDE5」)の該ホスホリル化サイトとを含む。該
配列は公知であり、以下の文献に記載されている。好ま
しくは、この結合PDE5配列は、以下に記載するように、
PDE5の該触媒ドメインを含まない。該PDE5配列を固相に
結合するための一方法は、これら配列を、該PDE5配列
と、アミノ酸結合対の一構成員との融合タンパクとして
発現し、および該アミノ酸結合対の他の構成員と固相
(例えば、ビーズ)とを化学的に結合することである。使
用できる結合対の一つは、グルタチオンS-トランスフェ
ラーゼ(「GST」)およびグルタチオン(「GSH」)であり、該GS
Tは、上記のPDE5配列との融合タンパクとして発現さ
れ、また該GSHは該固相と共有結合する。このように、
該PDE5配列/GST融合タンパクは、単に該融合タンパクを
含有する溶液を、以下に記載するように、該固相上に通
すことにより、結合することができる。
配列を結合することを含み、該アミノ酸配列各々は、少
なくとも該cGMP結合ドメインと、ホスホジエステラーゼ
タイプ5(「PDE5」)の該ホスホリル化サイトとを含む。該
配列は公知であり、以下の文献に記載されている。好ま
しくは、この結合PDE5配列は、以下に記載するように、
PDE5の該触媒ドメインを含まない。該PDE5配列を固相に
結合するための一方法は、これら配列を、該PDE5配列
と、アミノ酸結合対の一構成員との融合タンパクとして
発現し、および該アミノ酸結合対の他の構成員と固相
(例えば、ビーズ)とを化学的に結合することである。使
用できる結合対の一つは、グルタチオンS-トランスフェ
ラーゼ(「GST」)およびグルタチオン(「GSH」)であり、該GS
Tは、上記のPDE5配列との融合タンパクとして発現さ
れ、また該GSHは該固相と共有結合する。このように、
該PDE5配列/GST融合タンパクは、単に該融合タンパクを
含有する溶液を、以下に記載するように、該固相上に通
すことにより、結合することができる。
【００８６】RT-PCR法を使用して、ウシPDE5A cDNA配列
(マックアリスター-ルーカス(McAllister-Lucas) L.M.
等, J. Biol. Chem., 1993, 268:22863-22873)およびPD
E1-10群からの選別に基づいて設計された、前進および
逆プライマーをもつPDE5のcGBドメインを得る。mRNAの
オリゴ(dT)カラム精製を伴う、全RNA用の5'-3',Inc.キ
ットを、HT-29細胞と共に使用する。前進プライマー(GA
A-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G、203-227)
および逆プライマー(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC- TTC-CT
C-TGC-TG、1664-1686)を使用して、該ホスホリル化サイ
トおよびヒトPDE5Aの低および高アフィニティーcGMP結
合サイト両者をコードする、該1484bpのフラグメント(2
03-1686bp、cGB-PDE5)を合成する。この合成されたcGB-
PDE5は、ウシPDE5Aに対して97%の相同性を有する、494
アミノ酸をコードする。次に、これをtacプロモータお
よびEcoRIおよびXhoI切断サイトを含む、pGEX-5X-3グル
タチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合ベクター(フ
ァルマーシアバイオテック(Pharmacia Biotech))にクロ
ーニングする。次いで、この融合ベクターを、E.Coli B
L21(DE3)バクテリア(インビトロゲン(Invitrogen))内に
トランスフェクションする。このトランスフェクション
したBL21バクテリアを、対数増殖期まで育成し、次にIP
TGを誘導物質として添加する。この誘導は、20℃にて24
時間実施する。このバクテリアを収穫し、かつ溶解す
る。可溶性のこの細胞溶解物を、GSH複合化セファロー
ス4B(GSH-セファロース4B)と共にインキュベートする。
このGST-cGB-PDE5融合タンパクは、該GSH-セファロース
ビーズと結合することができ、また他のタンパクは、過
剰量の冷PBSによりビーズから洗い流される。
(マックアリスター-ルーカス(McAllister-Lucas) L.M.
等, J. Biol. Chem., 1993, 268:22863-22873)およびPD
E1-10群からの選別に基づいて設計された、前進および
逆プライマーをもつPDE5のcGBドメインを得る。mRNAの
オリゴ(dT)カラム精製を伴う、全RNA用の5'-3',Inc.キ
ットを、HT-29細胞と共に使用する。前進プライマー(GA
A-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G、203-227)
および逆プライマー(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC- TTC-CT
C-TGC-TG、1664-1686)を使用して、該ホスホリル化サイ
トおよびヒトPDE5Aの低および高アフィニティーcGMP結
合サイト両者をコードする、該1484bpのフラグメント(2
03-1686bp、cGB-PDE5)を合成する。この合成されたcGB-
PDE5は、ウシPDE5Aに対して97%の相同性を有する、494
アミノ酸をコードする。次に、これをtacプロモータお
よびEcoRIおよびXhoI切断サイトを含む、pGEX-5X-3グル
タチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合ベクター(フ
ァルマーシアバイオテック(Pharmacia Biotech))にクロ
ーニングする。次いで、この融合ベクターを、E.Coli B
L21(DE3)バクテリア(インビトロゲン(Invitrogen))内に
トランスフェクションする。このトランスフェクション
したBL21バクテリアを、対数増殖期まで育成し、次にIP
TGを誘導物質として添加する。この誘導は、20℃にて24
時間実施する。このバクテリアを収穫し、かつ溶解す
る。可溶性のこの細胞溶解物を、GSH複合化セファロー
ス4B(GSH-セファロース4B)と共にインキュベートする。
このGST-cGB-PDE5融合タンパクは、該GSH-セファロース
ビーズと結合することができ、また他のタンパクは、過
剰量の冷PBSによりビーズから洗い流される。
【００８７】この発現されたGST-cGB-PDE5融合タンパク
は、85Kdタンパクとして、7.5%SDS-PAGEゲル上に表示さ
れる。これは、そのcGMP結合およびプロテインキナーゼ
GおよびAによるホスホリル化によって特徴付けられる。
これは、２つのcGMP結合サイトを表示し、そのKdは1.6
±0.2μmであり、これは本来のウシPDE5のKd =1.3μmに
近いものである。GSH複合化セファロースビーズ上のGST
-cGB-PDE5は、cGMP-依存性プロテインキナーゼおよびcA
MP-依存性プロテインキナーゼAにより、インビトロでホ
スホリル化できる。PKGによるGST-cGB-PDE5ホスホリル
化のKmは、2.7μMであり、またVmaxは、2.8μMであり、
一方BPDEチド(BPDEtide)ホスホリル化のKmは、68μMで
ある。このPKGによるホスホリル化は、モル比で一モル
のGST-cGB-PDE5に1モルの燐酸根が組み込まれたことを
示す。上記のPDE5-結合固体相を使用して、PKGを含むも
のと考えられる液体サンプルをアッセイするために、該
サンプルと該固相とを、32P-γ-ATPを含むホスホリル化
バッファーと混合する。この溶液を、30分間30℃にてイ
ンキュベートし、PKGが存在する場合には、PKGによる該
PDE5配列のホスホリル化を可能とする。次いで、該固相
を、(例えば、遠心分離または濾過により)該溶液から分
離し、燐酸緩衝塩水(PBS)で洗浄して、あらゆる残留溶
液を除去し、かつ全ての未反応の32P-γ-ATPを除去す
る。
は、85Kdタンパクとして、7.5%SDS-PAGEゲル上に表示さ
れる。これは、そのcGMP結合およびプロテインキナーゼ
GおよびAによるホスホリル化によって特徴付けられる。
これは、２つのcGMP結合サイトを表示し、そのKdは1.6
±0.2μmであり、これは本来のウシPDE5のKd =1.3μmに
近いものである。GSH複合化セファロースビーズ上のGST
-cGB-PDE5は、cGMP-依存性プロテインキナーゼおよびcA
MP-依存性プロテインキナーゼAにより、インビトロでホ
スホリル化できる。PKGによるGST-cGB-PDE5ホスホリル
化のKmは、2.7μMであり、またVmaxは、2.8μMであり、
一方BPDEチド(BPDEtide)ホスホリル化のKmは、68μMで
ある。このPKGによるホスホリル化は、モル比で一モル
のGST-cGB-PDE5に1モルの燐酸根が組み込まれたことを
示す。上記のPDE5-結合固体相を使用して、PKGを含むも
のと考えられる液体サンプルをアッセイするために、該
サンプルと該固相とを、32P-γ-ATPを含むホスホリル化
バッファーと混合する。この溶液を、30分間30℃にてイ
ンキュベートし、PKGが存在する場合には、PKGによる該
PDE5配列のホスホリル化を可能とする。次いで、該固相
を、(例えば、遠心分離または濾過により)該溶液から分
離し、燐酸緩衝塩水(PBS)で洗浄して、あらゆる残留溶
液を除去し、かつ全ての未反応の32P-γ-ATPを除去す
る。
【００８８】次に、該固相を直接(例えば、液体シンチ
レーションカウンターにより)テストして、32Pが組み込
まれたか否かを確認することができる。この組み込みが
見られた場合には、この組み込みは、該サンプルがPKG
を含有することを示す。というのは、PKGはPDE５をホス
ホリル化するからである。該PDE5が上記のように融合タ
ンパクを介して結合している場合、該PDE5-含有融合タ
ンパクは、SDS緩衝液で該固相から溶出され、また該溶
離液を、32Pの取り込みについてアッセイできる。これ
は、他のタンパクが存在する場合には、特に有利であ
る。というのは、該溶出液を、種々のタンパクを相互に
分離するために処理(例えば、ゲル分離)して、該融合タ
ンパク画分を32Pの取り込みについてアッセイできるか
らである。該ホスホリル化融合タンパクは、SDS緩衝液
で該固相から溶出することができ、更に電気泳動法によ
り解像できる。ゲル分離を実施する場合、該タンパクを
染色して、該タンパクの位置を知り、かつPKGによる該
融合タンパクの該PDE5部分の32Pホスホリル化を、該ゲ
ルに暴露されたX-線フィルムによって測定することがで
きる。32PのX-線フィルム上で可視化した場合、可視化
は、PKGを含有する元のサンプル中におけるPKGの存在を
示しており、PKGは、該固相から溶出された該融合タン
パクの該PDE5部分をホスホリル化した。
レーションカウンターにより)テストして、32Pが組み込
まれたか否かを確認することができる。この組み込みが
見られた場合には、この組み込みは、該サンプルがPKG
を含有することを示す。というのは、PKGはPDE５をホス
ホリル化するからである。該PDE5が上記のように融合タ
ンパクを介して結合している場合、該PDE5-含有融合タ
ンパクは、SDS緩衝液で該固相から溶出され、また該溶
離液を、32Pの取り込みについてアッセイできる。これ
は、他のタンパクが存在する場合には、特に有利であ
る。というのは、該溶出液を、種々のタンパクを相互に
分離するために処理(例えば、ゲル分離)して、該融合タ
ンパク画分を32Pの取り込みについてアッセイできるか
らである。該ホスホリル化融合タンパクは、SDS緩衝液
で該固相から溶出することができ、更に電気泳動法によ
り解像できる。ゲル分離を実施する場合、該タンパクを
染色して、該タンパクの位置を知り、かつPKGによる該
融合タンパクの該PDE5部分の32Pホスホリル化を、該ゲ
ルに暴露されたX-線フィルムによって測定することがで
きる。32PのX-線フィルム上で可視化した場合、可視化
は、PKGを含有する元のサンプル中におけるPKGの存在を
示しており、PKGは、該固相から溶出された該融合タン
パクの該PDE5部分をホスホリル化した。
【００８９】好ましくは、このアッセイにおいて、該ア
ッセイバッファーに、過剰量(例えば、100倍)のプロテ
インキナーゼ阻害剤(PKI)を添加すべきであり、該阻害
剤は、PKGを阻害することなしに、特異的かつ強力にプ
ロテインキナーゼA(PKA)を阻害する。PKAの阻害は、望
ましいことである。というのは、これが該PKG基質(例え
ば、PDE5)のホスホリル化に寄与する可能性があるから
である。PKIを添加することにより、PKAによるホスホリ
ル化のあらゆる寄与が排除され、また検出されたホスホ
リル化全てが、高い確率でPKGのみによるものと考えら
れる。本発明のアッセイのためにキットを作成すること
ができ、このキットは、別々の容器に、以下のような予
備包装試薬を含む: 1. 細胞溶解バッファー：50mMのトリス(Tris)-HCl、1%
のNP-40、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのNa3VO4、1mM
のNaF、500μMのIBMX、プロテイナーゼ阻害剤。 2. プロテインキナーゼG固相基質：組み換えGST-cGB-PD
E5結合セファロース4B(50%スラリー)。 3. 2xホスホリル化バッファー: 32P-γ-ATP (3000 mCi/
mM、5~10μCi/アッセイ)、10 mMのKH2PO4、10 mMのK2H
PO4、200μMのATP、5mMのMgCl2。 4. PKAプロテインキナーゼ阻害剤。
ッセイバッファーに、過剰量(例えば、100倍)のプロテ
インキナーゼ阻害剤(PKI)を添加すべきであり、該阻害
剤は、PKGを阻害することなしに、特異的かつ強力にプ
ロテインキナーゼA(PKA)を阻害する。PKAの阻害は、望
ましいことである。というのは、これが該PKG基質(例え
ば、PDE5)のホスホリル化に寄与する可能性があるから
である。PKIを添加することにより、PKAによるホスホリ
ル化のあらゆる寄与が排除され、また検出されたホスホ
リル化全てが、高い確率でPKGのみによるものと考えら
れる。本発明のアッセイのためにキットを作成すること
ができ、このキットは、別々の容器に、以下のような予
備包装試薬を含む: 1. 細胞溶解バッファー：50mMのトリス(Tris)-HCl、1%
のNP-40、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのNa3VO4、1mM
のNaF、500μMのIBMX、プロテイナーゼ阻害剤。 2. プロテインキナーゼG固相基質：組み換えGST-cGB-PD
E5結合セファロース4B(50%スラリー)。 3. 2xホスホリル化バッファー: 32P-γ-ATP (3000 mCi/
mM、5~10μCi/アッセイ)、10 mMのKH2PO4、10 mMのK2H
PO4、200μMのATP、5mMのMgCl2。 4. PKAプロテインキナーゼ阻害剤。
【００９０】上記反応を実施するために、使い捨て容器
等をも、該キットに組み込むことができる。上記のこと
から、分析技術にたずさわる専門家は、上記のアッセイ
フォーマットを、更に別のフォーマットに適合させる種
々の方法を容易に見出すであろう。簡単に説明すれば、
PDE５の少なくとも一部(またはPKGによって選択的にホ
スホリル化できる任意の他のタンパク)を使用すること
により、PKGの存在および(コントロールと比較した)相
対的な量は、標識されたホスホリル化試薬を用いて、該
ホスホリル化可能なタンパクのホスホリル化を評価する
ことによって、確認することができる。
等をも、該キットに組み込むことができる。上記のこと
から、分析技術にたずさわる専門家は、上記のアッセイ
フォーマットを、更に別のフォーマットに適合させる種
々の方法を容易に見出すであろう。簡単に説明すれば、
PDE５の少なくとも一部(またはPKGによって選択的にホ
スホリル化できる任意の他のタンパク)を使用すること
により、PKGの存在および(コントロールと比較した)相
対的な量は、標識されたホスホリル化試薬を用いて、該
ホスホリル化可能なタンパクのホスホリル化を評価する
ことによって、確認することができる。
【００９１】SAANDは、腫瘍形成細胞におけるPKG活性を
高める 上記のPKGアッセイを利用して、以下の実験を行い、SAA
ND で処理した腫瘍形成細胞における、PKG発現の増加ま
たはcGMPレベルの増大の何れかによって、SAANDがPKG活
性を高めることを立証した。テスト手順 ２つの異なるPDE阻害剤を、腫瘍形成細胞における、PKG
に及ぼすその効果について評価した。SAAND、即ちエグ
ジスリンドを、評価した。というのは、これが腫瘍形成
性であるからである。また、非-SAANDの古典的なPDE5阻
害剤であるE4021を、PKGの増加が単に古典的なPDE5阻害
によるものか否か、またはPKGの増加がPDE5および1998
年10月15日付けで出願された、リュー(Liu)等の米国特
許出願No.09/173,375に記載されている新規なPDEの、SA
ANDのプロ-アポトーシス作用に関与するか否かを確認す
るために、評価した。該APC変異を含む腫瘍形成に及ぼ
される、cGMP-特異的PDE阻害作用をテストするために、
SW480結腸細胞を使用した。SW480は、該APC変異を含む
ことが知られている。5%の血清を含むRPMI中の、約5,00
0,000個のSW480細胞を、8個のシャーレ各々に添加し
た。 2-10cmのシャーレ：30μLのDMSOビヒクルコントロール
(薬物なし)、 3-10cmのシャーレ：200μM、400μM、600μMのエグジス
リンドのDMSO溶液、および 3-10cmのシャーレ：E4021; 0.1μM、1μMおよび10μMの
DMSO溶液。 これらのシャーレを、37℃にて5%CO2インキュベータ中
で48時間インキュベートした。
高める 上記のPKGアッセイを利用して、以下の実験を行い、SAA
ND で処理した腫瘍形成細胞における、PKG発現の増加ま
たはcGMPレベルの増大の何れかによって、SAANDがPKG活
性を高めることを立証した。テスト手順 ２つの異なるPDE阻害剤を、腫瘍形成細胞における、PKG
に及ぼすその効果について評価した。SAAND、即ちエグ
ジスリンドを、評価した。というのは、これが腫瘍形成
性であるからである。また、非-SAANDの古典的なPDE5阻
害剤であるE4021を、PKGの増加が単に古典的なPDE5阻害
によるものか否か、またはPKGの増加がPDE5および1998
年10月15日付けで出願された、リュー(Liu)等の米国特
許出願No.09/173,375に記載されている新規なPDEの、SA
ANDのプロ-アポトーシス作用に関与するか否かを確認す
るために、評価した。該APC変異を含む腫瘍形成に及ぼ
される、cGMP-特異的PDE阻害作用をテストするために、
SW480結腸細胞を使用した。SW480は、該APC変異を含む
ことが知られている。5%の血清を含むRPMI中の、約5,00
0,000個のSW480細胞を、8個のシャーレ各々に添加し
た。 2-10cmのシャーレ：30μLのDMSOビヒクルコントロール
(薬物なし)、 3-10cmのシャーレ：200μM、400μM、600μMのエグジス
リンドのDMSO溶液、および 3-10cmのシャーレ：E4021; 0.1μM、1μMおよび10μMの
DMSO溶液。 これらのシャーレを、37℃にて5%CO2インキュベータ中
で48時間インキュベートした。
【００９２】該液体培地を、該シャーレから吸引除去す
る(細胞は該シャーレに付着している)。該付着した細胞
を、冷PBSで各シャーレ内で洗浄し、２００μLの細胞溶
解バッファー(即ち、50mMのトリス-HCl、1%のNP-40、15
0mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのNa3VO4、1mMのNaF、500μ
MのIBMX、プロテイナーゼ阻害剤)を各シャーレに添加す
る。該細胞溶解バッファーを添加した直後に、溶解した
細胞を、各シャーレから該細胞を掻き落とすことによっ
て集める。各シャーレからの細胞溶解物を微量遠沈管に
移し、該微量遠沈管を4℃にて15分間インキュベート
し、一方該微量遠沈管を穏やかに攪拌して、該細胞を完
全に溶解させる。この溶解の完了後に、該微量遠沈管を
フルスピード(14,000rpm)で15分間遠心分離処理する。
各遠沈管からの上澄を、新たな微量遠沈管に移す。次
に、各遠沈管の内容物についてタンパクアッセイを行
う。というのは、該薬物が細胞の成長を阻害する場合に
は、全タンパク量は、該薬物処理サンプルにおけるより
も、コントロールにおいてより高いからである。明らか
に、該薬物が機能した場合には、該薬物処理したサンプ
ル中の全タンパク量は、事実上コントロールと同一であ
るはずである。上記の状況においては、該コントロール
および該E-4021微量遠沈管は、これらを規格化して高投
与量エグジスリンド-処理サンプルとするために、希釈
する必要がある(エグジスリンドの低投与量群は、規格
化して最大投与量エグジスリンドサンプルとする必要が
あった)。かくして、このタンパクアッセイを実施した
後、種々のサンプルの全タンパク濃度は、(希釈などに
よって)規格化される必要がある。
る(細胞は該シャーレに付着している)。該付着した細胞
を、冷PBSで各シャーレ内で洗浄し、２００μLの細胞溶
解バッファー(即ち、50mMのトリス-HCl、1%のNP-40、15
0mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのNa3VO4、1mMのNaF、500μ
MのIBMX、プロテイナーゼ阻害剤)を各シャーレに添加す
る。該細胞溶解バッファーを添加した直後に、溶解した
細胞を、各シャーレから該細胞を掻き落とすことによっ
て集める。各シャーレからの細胞溶解物を微量遠沈管に
移し、該微量遠沈管を4℃にて15分間インキュベート
し、一方該微量遠沈管を穏やかに攪拌して、該細胞を完
全に溶解させる。この溶解の完了後に、該微量遠沈管を
フルスピード(14,000rpm)で15分間遠心分離処理する。
各遠沈管からの上澄を、新たな微量遠沈管に移す。次
に、各遠沈管の内容物についてタンパクアッセイを行
う。というのは、該薬物が細胞の成長を阻害する場合に
は、全タンパク量は、該薬物処理サンプルにおけるより
も、コントロールにおいてより高いからである。明らか
に、該薬物が機能した場合には、該薬物処理したサンプ
ル中の全タンパク量は、事実上コントロールと同一であ
るはずである。上記の状況においては、該コントロール
および該E-4021微量遠沈管は、これらを規格化して高投
与量エグジスリンド-処理サンプルとするために、希釈
する必要がある(エグジスリンドの低投与量群は、規格
化して最大投与量エグジスリンドサンプルとする必要が
あった)。かくして、このタンパクアッセイを実施した
後、種々のサンプルの全タンパク濃度は、(希釈などに
よって)規格化される必要がある。
【００９３】各薬物濃度およびコントロールに対して、
２つのPKGアッセイを実施した。即ち、以下に詳細に説
明するように、その一つではcGMPを添加し、他方ではcG
MPを添加しなかった。これら２つのPKGアッセイを行っ
た理由は、cGMPが特異的にPKGを活性化することにあ
る。本発明の新規なPKGアッセイを使用して、PKG活性を
アッセイした場合、該PKG活性の任意の増加が、該細胞
中の高いcGMP(cGMP-特異的PDE阻害によって引き起こさ
れるものと考えられる)によるものか否か、あるいは該P
KG活性レベルが、PKGタンパクの高い発現性によるもの
か否かを、確認することはできない。cGMPを添加したま
たは添加してない、同一のサンプル両者におけるPKG活
性を測定することにより、該PKG活性が増加する場合に
は、その増加が高いPKG発現性によるものであるか否か
を確認することができる。かくして、抗−腫瘍形成剤
が、コントロールに対して相対的にPKG活性を高める場
合には、(1)過剰のcGMPを含む該薬物処理サンプルが、
過剰のcGMPを含むコントロールサンプルに比して、より
高いPKG活性を示す場合、および(2) 過剰のcGMPを含ま
ない該薬物処理サンプルが、コントロールに相対的に高
いPKG活性を示す場合、この薬物によって誘起された増
加が、該薬物処理サンプルにおける高いPKGタンパク発
現性(活性化とは逆に)によるものであるか否かを確認で
きる。
２つのPKGアッセイを実施した。即ち、以下に詳細に説
明するように、その一つではcGMPを添加し、他方ではcG
MPを添加しなかった。これら２つのPKGアッセイを行っ
た理由は、cGMPが特異的にPKGを活性化することにあ
る。本発明の新規なPKGアッセイを使用して、PKG活性を
アッセイした場合、該PKG活性の任意の増加が、該細胞
中の高いcGMP(cGMP-特異的PDE阻害によって引き起こさ
れるものと考えられる)によるものか否か、あるいは該P
KG活性レベルが、PKGタンパクの高い発現性によるもの
か否かを、確認することはできない。cGMPを添加したま
たは添加してない、同一のサンプル両者におけるPKG活
性を測定することにより、該PKG活性が増加する場合に
は、その増加が高いPKG発現性によるものであるか否か
を確認することができる。かくして、抗−腫瘍形成剤
が、コントロールに対して相対的にPKG活性を高める場
合には、(1)過剰のcGMPを含む該薬物処理サンプルが、
過剰のcGMPを含むコントロールサンプルに比して、より
高いPKG活性を示す場合、および(2) 過剰のcGMPを含ま
ない該薬物処理サンプルが、コントロールに相対的に高
いPKG活性を示す場合、この薬物によって誘起された増
加が、該薬物処理サンプルにおける高いPKGタンパク発
現性(活性化とは逆に)によるものであるか否かを確認で
きる。
【００９４】平行してcGMPを含むまたは含まないサンプ
ルを調製した後、50μLの各細胞溶解物を、20μLの上記
PDE5/GST固相基質スラリーに添加する。各コントロール
および評価すべき薬物細胞溶解物サンプルについて、10
μCi32P-γ-ATP溶液(200μMのATP、4.5mMのMgCl、5mMの
KH2PO4、5mMのK2H PO4) を含有するホスホリル化バッフ
ァーを各混合物に添加することによって、該反応を開始
する。得られる混合物を30℃にて30分間インキュベート
する。次いで、この混合物を遠心分離処理して、該固相
を分離し、上澄を捨てる。各管の該固相を、700μLの冷
PBSで洗浄する。この固相に、ラエムリ(Laemmli)サンプ
ルバッファー(バイオラド(Bio-Rad))(30μL)を添加す
る。これら混合物を5分間煮沸し、7.5%SDS-PAGE上に重
層する。このゲルを、150Vにて1時間泳動させる。得ら
れるバンドを、クーマシー(commassie)ブルーで染色し
て、存在する可能性のある85KdのGST-PDE5融合タンパク
バンドを可視化する。該ゲルを乾燥し、かつこのゲルを
X-線フィルム上に載せる。このフィルムは、該PDE5がホ
スホリル化されている場合には、対応する暗色のバンド
を示すであろう。各バンドの暗色の程度は、ホスホリル
化の程度に関連している。
ルを調製した後、50μLの各細胞溶解物を、20μLの上記
PDE5/GST固相基質スラリーに添加する。各コントロール
および評価すべき薬物細胞溶解物サンプルについて、10
μCi32P-γ-ATP溶液(200μMのATP、4.5mMのMgCl、5mMの
KH2PO4、5mMのK2H PO4) を含有するホスホリル化バッフ
ァーを各混合物に添加することによって、該反応を開始
する。得られる混合物を30℃にて30分間インキュベート
する。次いで、この混合物を遠心分離処理して、該固相
を分離し、上澄を捨てる。各管の該固相を、700μLの冷
PBSで洗浄する。この固相に、ラエムリ(Laemmli)サンプ
ルバッファー(バイオラド(Bio-Rad))(30μL)を添加す
る。これら混合物を5分間煮沸し、7.5%SDS-PAGE上に重
層する。このゲルを、150Vにて1時間泳動させる。得ら
れるバンドを、クーマシー(commassie)ブルーで染色し
て、存在する可能性のある85KdのGST-PDE5融合タンパク
バンドを可視化する。該ゲルを乾燥し、かつこのゲルを
X-線フィルム上に載せる。このフィルムは、該PDE5がホ
スホリル化されている場合には、対応する暗色のバンド
を示すであろう。各バンドの暗色の程度は、ホスホリル
化の程度に関連している。
【００９５】図18Aおよび図18Bに示したように、該SAAN
Dエグジスリンドは、cGMPを添加したおよび添加してな
いサンプル両者において、過剰のcGMPを含むおよび含ま
ない混合物サンプルに対して、投与量依存様式で、PKG
活性を増大する。このことは、該薬物処理サンプル各々
における、該85Kdのバンドのより暗色の外観によって明
らかである。更に、エグジスリンドで処理した該SW480
サンプルは、エグジスリンドのみで処理した(即ち、cGM
Pを添加してない)サンプルに対して、このアッセイにお
いて、添加されたcGMPを含むものでは、より高いPKGホ
スホリル化活性を示す。従って、該薬物処理したサンプ
ルにおけるPKG活性の増大は、該SAANDがcGMP-特異的PDE
を阻害する場合の、細胞性cGMPの増加によるPKGの活性
化のみによるものではなく、該APC変異をもつ腫瘍形成
における、PKG活性の増加は、高いPKG発現性にもよるも
のである。また、該E4021-処理したSW480サンプルが、
コントロールに相対的なPKG活性(図18Aおよび18Bを参照
のこと)を示さないという事実は、該APC変異をもつ腫瘍
形成においてSAANDにより引き起こされた該高いPKG活性
化が、古典的なPDE5の阻害のみによるものではないこと
を示している。
Dエグジスリンドは、cGMPを添加したおよび添加してな
いサンプル両者において、過剰のcGMPを含むおよび含ま
ない混合物サンプルに対して、投与量依存様式で、PKG
活性を増大する。このことは、該薬物処理サンプル各々
における、該85Kdのバンドのより暗色の外観によって明
らかである。更に、エグジスリンドで処理した該SW480
サンプルは、エグジスリンドのみで処理した(即ち、cGM
Pを添加してない)サンプルに対して、このアッセイにお
いて、添加されたcGMPを含むものでは、より高いPKGホ
スホリル化活性を示す。従って、該薬物処理したサンプ
ルにおけるPKG活性の増大は、該SAANDがcGMP-特異的PDE
を阻害する場合の、細胞性cGMPの増加によるPKGの活性
化のみによるものではなく、該APC変異をもつ腫瘍形成
における、PKG活性の増加は、高いPKG発現性にもよるも
のである。また、該E4021-処理したSW480サンプルが、
コントロールに相対的なPKG活性(図18Aおよび18Bを参照
のこと)を示さないという事実は、該APC変異をもつ腫瘍
形成においてSAANDにより引き起こされた該高いPKG活性
化が、古典的なPDE5の阻害のみによるものではないこと
を示している。
【００９６】上記のX-線フィルムへの暴露に代わる、PK
G活性化を評価するための解析法として、該SDS-PAG由来
の85Kdのバンドを、該ゲルから該バンドを切り出すこと
により、ホスホリル化の程度を評価することもでき、ま
た該分離されたバンドに組み込まれた全ての32Pを、該
32Pウインドウ内で、シンチレーション(ベータ)カウン
ターにより計数することも可能である。β-カテニン変
異含有腫瘍形成に及ぼす、cGMP-特異的PDEの効果をテス
トするために、HCT116結腸癌細胞を使用した。HCT116
は、該β-カテニン変異を含むことが知られているが、
該APC変異を含まないことも知られている。同一の手順
を使用して、上記のSW480の取り扱いにおいて使用した
ように、該HCT116細胞を生育させる。この実験において
は、エグジスリンドおよびコントロールのみを使用し
た。該エグジスリンドで処理した細胞は、PKGを生成し
たが、このPKGは、対応するコントロールよりも高度に
ホスホリル化されており、このことは、該APC変異とは
無関係に、該薬物-処理細胞中でPKG活性化が生じたこと
を示している。かくして、本発明の目的にとって、特許
請求の範囲における「減少するβ-カテニン」とは、該タ
ンパクの野生型および/または変異型を意味するものと
する。
G活性化を評価するための解析法として、該SDS-PAG由来
の85Kdのバンドを、該ゲルから該バンドを切り出すこと
により、ホスホリル化の程度を評価することもでき、ま
た該分離されたバンドに組み込まれた全ての32Pを、該
32Pウインドウ内で、シンチレーション(ベータ)カウン
ターにより計数することも可能である。β-カテニン変
異含有腫瘍形成に及ぼす、cGMP-特異的PDEの効果をテス
トするために、HCT116結腸癌細胞を使用した。HCT116
は、該β-カテニン変異を含むことが知られているが、
該APC変異を含まないことも知られている。同一の手順
を使用して、上記のSW480の取り扱いにおいて使用した
ように、該HCT116細胞を生育させる。この実験において
は、エグジスリンドおよびコントロールのみを使用し
た。該エグジスリンドで処理した細胞は、PKGを生成し
たが、このPKGは、対応するコントロールよりも高度に
ホスホリル化されており、このことは、該APC変異とは
無関係に、該薬物-処理細胞中でPKG活性化が生じたこと
を示している。かくして、本発明の目的にとって、特許
請求の範囲における「減少するβ-カテニン」とは、該タ
ンパクの野生型および/または変異型を意味するものと
する。
【００９７】ウエスタンブロットによるSW480中の増大
したPKG発現および低下されたβ-カテニンの確認 上で明らかにしたように、SAANDは、PKG発現の増大およ
びcGMPレベルの増大をもたらし、これら両者は、SAAND-
処理腫瘍形成細胞におけるPKG活性の増大をもたらす。
このPKGタンパク発現における増加は、以下に説明する
ように、比較的定量的なウエスタンブロットにより、更
に明確にされた。上記のようにエグジスリンドで処理し
たSW480細胞を、氷冷したPBSで一回洗浄することによっ
て、該微量遠沈管から回収する。これら細胞を、改良RI
PAバッファーにより、攪拌しつつ15分間溶解する。この
細胞溶解物を、低温室で遠沈させる。得られる上澄を、
遠沈後即座に新たな微量遠沈管に移す。バイオラドDCプ
ロテインアッセイ(Bio-Rad DC Protein Assay)(CA州、
テメクラ)を実施して、サンプル中のタンパク濃度を測
定した。該サンプルは、上記のようにタンパク濃度につ
いて規格化する。各サンプル50μgを、10%SDSゲルに重
層する。SDS-PAGEを実施し、次いで該タンパクをニトロ
セルロース膜に転写する。このブロット処理したニトロ
セルロース膜を、5%の脱脂乾燥ミルクを含む新たに調製
したTBST中で、一定速度で攪拌しつつ、室温にて1時間
遮断する。
したPKG発現および低下されたβ-カテニンの確認 上で明らかにしたように、SAANDは、PKG発現の増大およ
びcGMPレベルの増大をもたらし、これら両者は、SAAND-
処理腫瘍形成細胞におけるPKG活性の増大をもたらす。
このPKGタンパク発現における増加は、以下に説明する
ように、比較的定量的なウエスタンブロットにより、更
に明確にされた。上記のようにエグジスリンドで処理し
たSW480細胞を、氷冷したPBSで一回洗浄することによっ
て、該微量遠沈管から回収する。これら細胞を、改良RI
PAバッファーにより、攪拌しつつ15分間溶解する。この
細胞溶解物を、低温室で遠沈させる。得られる上澄を、
遠沈後即座に新たな微量遠沈管に移す。バイオラドDCプ
ロテインアッセイ(Bio-Rad DC Protein Assay)(CA州、
テメクラ)を実施して、サンプル中のタンパク濃度を測
定した。該サンプルは、上記のようにタンパク濃度につ
いて規格化する。各サンプル50μgを、10%SDSゲルに重
層する。SDS-PAGEを実施し、次いで該タンパクをニトロ
セルロース膜に転写する。このブロット処理したニトロ
セルロース膜を、5%の脱脂乾燥ミルクを含む新たに調製
したTBST中で、一定速度で攪拌しつつ、室温にて1時間
遮断する。
【００９８】ヤギ-抗-PKG一次抗体を、推奨された濃度
まで、新たなTBST/5%脱脂乾燥ミルクで希釈する。該ニ
トロセルロース膜を、該一次抗体溶液中に入れ、攪拌し
つつ室温にて1時間インキュベートする。該ニトロセル
ロース膜を、TBSTで3回夫々10分間洗浄する。該ニトロ
セルロース膜を、第二のPOD複合化ウサギ抗-ヤギ抗体を
含有する溶液中で、攪拌しつつ室温にて1時間インキュ
ベートする。該ニトロセルロース膜を、TBSTで3回夫々1
0分間洗浄する。ベーリンガーマンハイム(Boehringer M
annheim) BMブルーPOD基質を使用して、検出を行った。
図19にグラフで示したように、エグジスリンドは、β-
カテニンの減少およびPKGの増大をもたらす。これらの
データは、ウエスタンブロット法により得た。SW480細
胞を、エグジスリンドまたはビヒクル(0.1% DMSO)で48
時間処理した。50μgの各細胞溶解物上澄を、10%SDSゲ
ルに重層し、ニトロセルロース膜でブロッティング処理
し、該膜をウサギ-抗-β-カテニンおよびウサギ-抗-PKG
抗体について検査した。
まで、新たなTBST/5%脱脂乾燥ミルクで希釈する。該ニ
トロセルロース膜を、該一次抗体溶液中に入れ、攪拌し
つつ室温にて1時間インキュベートする。該ニトロセル
ロース膜を、TBSTで3回夫々10分間洗浄する。該ニトロ
セルロース膜を、第二のPOD複合化ウサギ抗-ヤギ抗体を
含有する溶液中で、攪拌しつつ室温にて1時間インキュ
ベートする。該ニトロセルロース膜を、TBSTで3回夫々1
0分間洗浄する。ベーリンガーマンハイム(Boehringer M
annheim) BMブルーPOD基質を使用して、検出を行った。
図19にグラフで示したように、エグジスリンドは、β-
カテニンの減少およびPKGの増大をもたらす。これらの
データは、ウエスタンブロット法により得た。SW480細
胞を、エグジスリンドまたはビヒクル(0.1% DMSO)で48
時間処理した。50μgの各細胞溶解物上澄を、10%SDSゲ
ルに重層し、ニトロセルロース膜でブロッティング処理
し、該膜をウサギ-抗-β-カテニンおよびウサギ-抗-PKG
抗体について検査した。
【００９９】SAANDは腫瘍形成細胞におけるβ-カテニン
レベルを低下する この観察は、200、400または600μMのエグジスリンドま
たはビヒクル(0.1%DMSO)と共にSW480細胞を培養するこ
とによって行った。この細胞を、48時間の後処理後に収
穫し、イムノブロット処理した。免疫反応性タンパク
は、ウエスタンブロット法により検出できる。ウエスタ
ンブロット分析は、β-カテニンの発現が、コントロー
ルと比較して、該エグジスリンド処理した細胞において
50%減じることを明らかにした。これらの結果は、β-カ
テニンが、SAAND処理によって減じられることを示して
いる。これらの結果と共に、上で明らかにされたPKG活
性は、このような処理に伴って増大し、また以下の結果
は、β-カテニンが、PKGによってホスホリル化されるこ
とを明らかにし、これら結果は、腫瘍形成細胞中のβ-
カテニンの減少が、PKGの活性化により開始されること
を示す。従って、腫瘍性疾患におけるPKG活性をスクリ
ーニング手段として利用して、抗−腫瘍形成剤としての
化合物を選別することは、有益である。
レベルを低下する この観察は、200、400または600μMのエグジスリンドま
たはビヒクル(0.1%DMSO)と共にSW480細胞を培養するこ
とによって行った。この細胞を、48時間の後処理後に収
穫し、イムノブロット処理した。免疫反応性タンパク
は、ウエスタンブロット法により検出できる。ウエスタ
ンブロット分析は、β-カテニンの発現が、コントロー
ルと比較して、該エグジスリンド処理した細胞において
50%減じることを明らかにした。これらの結果は、β-カ
テニンが、SAAND処理によって減じられることを示して
いる。これらの結果と共に、上で明らかにされたPKG活
性は、このような処理に伴って増大し、また以下の結果
は、β-カテニンが、PKGによってホスホリル化されるこ
とを明らかにし、これら結果は、腫瘍形成細胞中のβ-
カテニンの減少が、PKGの活性化により開始されること
を示す。従って、腫瘍性疾患におけるPKG活性をスクリ
ーニング手段として利用して、抗−腫瘍形成剤としての
化合物を選別することは、有益である。
【０１００】PKGによるβ-カテニンのホスホリル化 インビトロで、PKGは、β-カテニンをホスホリル化す
る。このことを明らかにした実験は、SW480細胞(如何な
る薬物によっても処理されていない)から、該β-カテニ
ン含有複合体を、「β-カテニン免疫沈殿」と題する章で
以下に説明するようにして、免疫沈殿させることを含
む。依然として固相(即ち、ビーズ)上にトラップされて
いる、この免疫沈殿された複合体を、32P-γ-ATPおよび
純粋なPKG(100単位)と混合する。PKGが添加されていな
い対応するコントロールを調製する。該タンパクを、SD
Sバッファーによって該固相から遊離させ、このタンパ
ク含有混合物を、7.5%SDS-PAGEゲル上で泳動させる。該
ゲル上での該混合物の泳動は、該混合物からの過剰な32
P-γ-ATPを除去する。従って、93Kdのβ-カテニンバン
ド中に検出された全ての32P-γ-ATPは、該β-カテニン
のホスホリル化によるものである。過剰のPKGを含まな
いコントロールに対する、過剰なPKGで処理された93Kd
のβ-カテニンバンド中に検出された32P-γ-ATPにおけ
る増加は、該過剰のPKGによる、該処理バンドにおけ
る、該β-カテニンのホスホリル化によるものである。
我々の得たこれらの結果は、該コントロールと比較し
て、PKGで処理した該バンドには、検知し得るホスホリ
ル化の増大が見られることであり、該コントロールで
は、最小の、事実上検出不可能なホスホリル化を示し
た。この結果は、β-カテニンが、PKGによってホスホリ
ル化し得ることを示している。変異β-カテニンのPKGによるホスホリル化 直前の章で記載したものと同一の手順を、HCT116細胞を
使用して実施した。該細胞は、APC変異を含まないが、
β-カテニンを含む。これら実験の結果も、変異β-カテ
ニンが、PKGによってホスホリル化されることを示す。
従って、本発明の目的にとって、特許請求の範囲におけ
るβ-カテニンのホスホリル化とは、該タンパクの野生
型および/または変異型のホスホリル化をいうものとす
る。
る。このことを明らかにした実験は、SW480細胞(如何な
る薬物によっても処理されていない)から、該β-カテニ
ン含有複合体を、「β-カテニン免疫沈殿」と題する章で
以下に説明するようにして、免疫沈殿させることを含
む。依然として固相(即ち、ビーズ)上にトラップされて
いる、この免疫沈殿された複合体を、32P-γ-ATPおよび
純粋なPKG(100単位)と混合する。PKGが添加されていな
い対応するコントロールを調製する。該タンパクを、SD
Sバッファーによって該固相から遊離させ、このタンパ
ク含有混合物を、7.5%SDS-PAGEゲル上で泳動させる。該
ゲル上での該混合物の泳動は、該混合物からの過剰な32
P-γ-ATPを除去する。従って、93Kdのβ-カテニンバン
ド中に検出された全ての32P-γ-ATPは、該β-カテニン
のホスホリル化によるものである。過剰のPKGを含まな
いコントロールに対する、過剰なPKGで処理された93Kd
のβ-カテニンバンド中に検出された32P-γ-ATPにおけ
る増加は、該過剰のPKGによる、該処理バンドにおけ
る、該β-カテニンのホスホリル化によるものである。
我々の得たこれらの結果は、該コントロールと比較し
て、PKGで処理した該バンドには、検知し得るホスホリ
ル化の増大が見られることであり、該コントロールで
は、最小の、事実上検出不可能なホスホリル化を示し
た。この結果は、β-カテニンが、PKGによってホスホリ
ル化し得ることを示している。変異β-カテニンのPKGによるホスホリル化 直前の章で記載したものと同一の手順を、HCT116細胞を
使用して実施した。該細胞は、APC変異を含まないが、
β-カテニンを含む。これら実験の結果も、変異β-カテ
ニンが、PKGによってホスホリル化されることを示す。
従って、本発明の目的にとって、特許請求の範囲におけ
るβ-カテニンのホスホリル化とは、該タンパクの野生
型および/または変異型のホスホリル化をいうものとす
る。
【０１０１】β-カテニンはPKGにより沈殿する SW480およびHCT116細胞溶解物両者の上澄は、ウエスタ
ンブロット法において、上記と同様な方法で調製され
る。該細胞溶解物を、細胞溶解物500μg当たり150μLの
タンパクAセファロースビーズスラリー(50%)を添加し、
チューブシェーカー上で4℃にて10分間インキュベート
することにより、予め透明化する。該タンパクAビーズ
を、4℃にて10分間14,000xgで遠心分離処理することに
より除去する。得られる上澄を新たな遠沈管に移す。10
μgのウサギポリクローナル抗-β-カテニン抗体(NY州、
レークプラシッドの、アップステートバイオテクノロジ
ー(Upstate Biotechnology))を、500μgの細胞溶解物に
添加する。この細胞溶解物/抗体混合物を、チューブシ
ェーカーで4℃にて2時間混合する。この免疫複合体を、
150μLのタンパクAセファロースビーズスラリー(75μl
の充填ビーズ)を添加し、この混合物を4℃にて一夜、チ
ューブシェーカーで穏やかに振とうすることにより、捕
集する。該セファロースビーズをパルス遠心分離(14,00
0 rpmにて、微量遠沈管内で5秒間)することにより集め
る。得られる上澄画分を捨て、該ビーズを、800μlの氷
冷PBSバッファーで3回洗浄する。該セファロースビーズ
を、150μl2xサンプルバッファー中に再懸濁し、穏やか
に攪拌する。このセファロースビーズを5分間煮沸し、
該ビーズから該免疫複合体を分離する。該ビーズを遠心
分離処理により集め、得られた上澄につきSDS-PAGEを実
施する。該上澄についてウエスタンブロットを実施し、
次いで該膜をウサギ抗-β-カテニン抗体で検査する。次
に、この膜を、TBSTで夫々10分間、3回に渡り洗浄し
て、過剰量のβ-カテニン抗体を除去する。ホースラデ
ィシュパーオキシダーゼと錯化したヤギ抗-ウサギ抗体
を添加し、次いで1時間室温にてインキュベートする。
これを実施する際に、HRPO基質で、該β-カテニンの存
在を可視化することができる。この実験において、我々
は、該β-カテニンの存在を完全に可視化することがで
きた。
ンブロット法において、上記と同様な方法で調製され
る。該細胞溶解物を、細胞溶解物500μg当たり150μLの
タンパクAセファロースビーズスラリー(50%)を添加し、
チューブシェーカー上で4℃にて10分間インキュベート
することにより、予め透明化する。該タンパクAビーズ
を、4℃にて10分間14,000xgで遠心分離処理することに
より除去する。得られる上澄を新たな遠沈管に移す。10
μgのウサギポリクローナル抗-β-カテニン抗体(NY州、
レークプラシッドの、アップステートバイオテクノロジ
ー(Upstate Biotechnology))を、500μgの細胞溶解物に
添加する。この細胞溶解物/抗体混合物を、チューブシ
ェーカーで4℃にて2時間混合する。この免疫複合体を、
150μLのタンパクAセファロースビーズスラリー(75μl
の充填ビーズ)を添加し、この混合物を4℃にて一夜、チ
ューブシェーカーで穏やかに振とうすることにより、捕
集する。該セファロースビーズをパルス遠心分離(14,00
0 rpmにて、微量遠沈管内で5秒間)することにより集め
る。得られる上澄画分を捨て、該ビーズを、800μlの氷
冷PBSバッファーで3回洗浄する。該セファロースビーズ
を、150μl2xサンプルバッファー中に再懸濁し、穏やか
に攪拌する。このセファロースビーズを5分間煮沸し、
該ビーズから該免疫複合体を分離する。該ビーズを遠心
分離処理により集め、得られた上澄につきSDS-PAGEを実
施する。該上澄についてウエスタンブロットを実施し、
次いで該膜をウサギ抗-β-カテニン抗体で検査する。次
に、この膜を、TBSTで夫々10分間、3回に渡り洗浄し
て、過剰量のβ-カテニン抗体を除去する。ホースラデ
ィシュパーオキシダーゼと錯化したヤギ抗-ウサギ抗体
を添加し、次いで1時間室温にてインキュベートする。
これを実施する際に、HRPO基質で、該β-カテニンの存
在を可視化することができる。この実験において、我々
は、該β-カテニンの存在を完全に可視化することがで
きた。
【０１０２】同一の膜上のPKGを検出するために、まず
該抗-β-カテニン抗体複合体を、2%SDSおよび100μMの2
β-メルカプトエタノールを含む、62mMのトリス-HClバ
ッファー(pH 7.6)によって、55℃の水浴中で、0.5時間
処理して、該膜から取り去る。次に、この除去処理した
膜を、5%の脱脂乾燥ミルクを含む、TBST中で室温にて1
時間遮断し、一方で該膜を攪拌する。この遮断しかつ除
去処理した膜を、次にウサギポリクローナル抗-PKG抗体
(CA州、ラジョラのカルビオケム(CalBiochem))で検査
し、該抗体をHRPOと複合化したヤギ抗-ウサギ二次抗体
で検出する。該ブロット膜上に存在するPKGは、HRPO基
質で可視化される。この実験において、該PKGは実際に
可視化された。該膜上の唯一のタンパクが、該細胞上澄
中のβ-カテニンと共に免疫沈殿したものであったこと
から、この結果は、PKGが該細胞上澄中で、該β-カテニ
ンを含む該タンパク複合体と物理的に結合しことを明確
に立証している。また、同一のウエスタンブロット膜
を、ストリッピングした後に、抗-GSK3-β抗体で検査し
て、これがβ-カテニンと共沈するか否かを確認した。
この実験において、我々はまた該膜上にGSK3-βをも検
出したが、このことは該GSK3-βが、GSK3-βおよびPKG
と共に沈殿することを示し、これは、これら3種のタン
パクが、同一の錯体の部分である可能性を示唆してい
る。GSK3-βおよびβ-カテニンが、正常な細胞において
該APC錯体の一部を形成するので、該PKGは、その同一の
錯体の一部であり得、また該錯体の一部として、β-カ
テニンの該ホスホリル化に関与する可能性がある。
該抗-β-カテニン抗体複合体を、2%SDSおよび100μMの2
β-メルカプトエタノールを含む、62mMのトリス-HClバ
ッファー(pH 7.6)によって、55℃の水浴中で、0.5時間
処理して、該膜から取り去る。次に、この除去処理した
膜を、5%の脱脂乾燥ミルクを含む、TBST中で室温にて1
時間遮断し、一方で該膜を攪拌する。この遮断しかつ除
去処理した膜を、次にウサギポリクローナル抗-PKG抗体
(CA州、ラジョラのカルビオケム(CalBiochem))で検査
し、該抗体をHRPOと複合化したヤギ抗-ウサギ二次抗体
で検出する。該ブロット膜上に存在するPKGは、HRPO基
質で可視化される。この実験において、該PKGは実際に
可視化された。該膜上の唯一のタンパクが、該細胞上澄
中のβ-カテニンと共に免疫沈殿したものであったこと
から、この結果は、PKGが該細胞上澄中で、該β-カテニ
ンを含む該タンパク複合体と物理的に結合しことを明確
に立証している。また、同一のウエスタンブロット膜
を、ストリッピングした後に、抗-GSK3-β抗体で検査し
て、これがβ-カテニンと共沈するか否かを確認した。
この実験において、我々はまた該膜上にGSK3-βをも検
出したが、このことは該GSK3-βが、GSK3-βおよびPKG
と共に沈殿することを示し、これは、これら3種のタン
パクが、同一の錯体の部分である可能性を示唆してい
る。GSK3-βおよびβ-カテニンが、正常な細胞において
該APC錯体の一部を形成するので、該PKGは、その同一の
錯体の一部であり得、また該錯体の一部として、β-カ
テニンの該ホスホリル化に関与する可能性がある。
【０１０３】cGMP PDE阻害剤を含む抗−腫瘍形成性薬理
組成物 上記のように、エグジスリンドは、望ましい抗−腫瘍性
を示す化合物の一つである。その有効性および抗−腫瘍
形成剤としての用途は、この化合物が、cGMP-特異的PDE
活性を阻害することによって、腫瘍形成細胞内で作用す
ることが理解される以前に、見出されていた。特に、本
発明の選別法がヒトの治療のために、化合物を選別する
のに使用できることの証明は、腫瘍性疾患に罹った患者
における、ヒトの臨床的試みで得た。エグジスリンド
が、(インビトロで)抗−腫瘍形成性であり、本発明の選
別基準を満たす望ましい化合物のプロフィールをもつ、
という事実を理解することによって、２つのヒトの臨床
的試みにおける、該化合物の成功は、その他の化合物
が、本発明の選別基準を満たすものとして選別し得る可
能性があることを明らかにしている。
組成物 上記のように、エグジスリンドは、望ましい抗−腫瘍性
を示す化合物の一つである。その有効性および抗−腫瘍
形成剤としての用途は、この化合物が、cGMP-特異的PDE
活性を阻害することによって、腫瘍形成細胞内で作用す
ることが理解される以前に、見出されていた。特に、本
発明の選別法がヒトの治療のために、化合物を選別する
のに使用できることの証明は、腫瘍性疾患に罹った患者
における、ヒトの臨床的試みで得た。エグジスリンド
が、(インビトロで)抗−腫瘍形成性であり、本発明の選
別基準を満たす望ましい化合物のプロフィールをもつ、
という事実を理解することによって、２つのヒトの臨床
的試みにおける、該化合物の成功は、その他の化合物
が、本発明の選別基準を満たすものとして選別し得る可
能性があることを明らかにしている。
【０１０４】上記のように、多数の腫瘍性疾患が、該AP
C変異を含んでいる。特に、本発明の選別法の立証は、
このAPC変異を含んでいる腫瘍性疾患に罹った患者にお
ける、ヒトの臨床的な試みにおいて確立された。該APC
変異は、遺伝性の腫瘍性疾患、腺腫様結腸ポリポーシス
症(APC)に罹った患者において最初に発見された。このA
PC疾患は、結腸内に、数百~数千個のポリープが、十代
のヒトにおいて出現することにより特徴付けられ、また
一般的な治療法は20歳前に該結腸を外科的に切除するこ
とである。この最初の臨床的試みは、APCに罹った患者
を、エグジスリンドを使用して、治療することを含んで
いた。この研究において、各患者は、その結腸が既に切
除されていたが、(小腸が結合している)直腸に隣接する
小部分の結腸のみが残され、直腸の機能を保持してい
る。しかし、このような患者は、一般的に該残された小
さな結腸部分にポリープを形成する可能性があり、この
ポリープは(例えば、電気的焼灼によって)周期的に除去
する必要がある。
C変異を含んでいる。特に、本発明の選別法の立証は、
このAPC変異を含んでいる腫瘍性疾患に罹った患者にお
ける、ヒトの臨床的な試みにおいて確立された。該APC
変異は、遺伝性の腫瘍性疾患、腺腫様結腸ポリポーシス
症(APC)に罹った患者において最初に発見された。このA
PC疾患は、結腸内に、数百~数千個のポリープが、十代
のヒトにおいて出現することにより特徴付けられ、また
一般的な治療法は20歳前に該結腸を外科的に切除するこ
とである。この最初の臨床的試みは、APCに罹った患者
を、エグジスリンドを使用して、治療することを含んで
いた。この研究において、各患者は、その結腸が既に切
除されていたが、(小腸が結合している)直腸に隣接する
小部分の結腸のみが残され、直腸の機能を保持してい
る。しかし、このような患者は、一般的に該残された小
さな結腸部分にポリープを形成する可能性があり、この
ポリープは(例えば、電気的焼灼によって)周期的に除去
する必要がある。
【０１０５】エグジスリンドが選択されたこの試みは、
該薬物およびプラシーボ投与群によって、12ヶ月に渡り
形成された新たなポリープの累積数を比較することによ
る、該薬物の該抗−腫瘍形成特性を評価するように工夫
された、予防的な試みであった。適格な患者は、1年当
たり9~44個のポリープを形成する患者であった。患者
は、この研究の開始時点、6ヶ月経過時点および12ヶ月
経過時点において、完全な摘出手術を受けた(即ち、全
てのポリープが除去された)。本研究には、34名の適格
患者を参加させた。歴史的に1年当たり9~44個のポリー
プを形成するAPC患者において、1年間に渡り形成された
ポリープの見積もられた平均数に基づけば、エグジスリ
ンドは、ポリープ形成率の減少において、プラシーボよ
りも臨床的かつ統計的により一層有意であった。本研究
の初めの6ヶ月中に形成されたポリープの平均数によれ
ば、エグジスリンドで治療した患者は、プラシーボで治
療した患者のポリープ数の約1/3であった(平均値は夫々
9ポリープ/年および26ポリープ/年であり、p=0.013であ
った)。本研究の全12ヶ月に渡り形成されたポリープ数
の中央値によれば、エグジスリンドで治療した患者は、
プラシーボで治療した患者のポリープ数の約半分であっ
た(中央値は夫々18ポリープ/年および38ポリープ/年で
あり、p=0.020であった)。
該薬物およびプラシーボ投与群によって、12ヶ月に渡り
形成された新たなポリープの累積数を比較することによ
る、該薬物の該抗−腫瘍形成特性を評価するように工夫
された、予防的な試みであった。適格な患者は、1年当
たり9~44個のポリープを形成する患者であった。患者
は、この研究の開始時点、6ヶ月経過時点および12ヶ月
経過時点において、完全な摘出手術を受けた(即ち、全
てのポリープが除去された)。本研究には、34名の適格
患者を参加させた。歴史的に1年当たり9~44個のポリー
プを形成するAPC患者において、1年間に渡り形成された
ポリープの見積もられた平均数に基づけば、エグジスリ
ンドは、ポリープ形成率の減少において、プラシーボよ
りも臨床的かつ統計的により一層有意であった。本研究
の初めの6ヶ月中に形成されたポリープの平均数によれ
ば、エグジスリンドで治療した患者は、プラシーボで治
療した患者のポリープ数の約1/3であった(平均値は夫々
9ポリープ/年および26ポリープ/年であり、p=0.013であ
った)。本研究の全12ヶ月に渡り形成されたポリープ数
の中央値によれば、エグジスリンドで治療した患者は、
プラシーボで治療した患者のポリープ数の約半分であっ
た(中央値は夫々18ポリープ/年および38ポリープ/年で
あり、p=0.020であった)。
【０１０６】前立腺癌に罹っており、結果としてその前
立腺を切除した男性の患者についても、別の臨床的試み
を行った。この研究は、検出可能なPSA(前立腺特異的抗
原)レベルをもつ患者において行った。該PSAレベルは、
根治的前立腺切除後に上昇し、このことは、前立腺癌の
再発を示す。この前立腺癌の評価では、96名の患者が参
加し、二重ブラインド、プラシーボ制御、多中心トライ
アル(multi-center trial)は、500mg/日にて、薬物投与
患者群に対するエグジスリンドの投与を含んでいた。以
下に示すように、これらのデータは、該エグジスリンド
投与群と該プラシーボ処置群との間で、PSAレベルに統
計的に有意な差違が存在することを示している。該エグ
ジスリンド投与群におけるPSAレベルは、該プラシーボ
投与群のPSAレベルと比較して、有意に減少した。PSAレ
ベルの上昇自体は、疾患の条件ではないが、これは医療
の分野においては、このような男性における、前立腺癌
再発を示す代表的なマーカーであると、広く認識されて
いる。
立腺を切除した男性の患者についても、別の臨床的試み
を行った。この研究は、検出可能なPSA(前立腺特異的抗
原)レベルをもつ患者において行った。該PSAレベルは、
根治的前立腺切除後に上昇し、このことは、前立腺癌の
再発を示す。この前立腺癌の評価では、96名の患者が参
加し、二重ブラインド、プラシーボ制御、多中心トライ
アル(multi-center trial)は、500mg/日にて、薬物投与
患者群に対するエグジスリンドの投与を含んでいた。以
下に示すように、これらのデータは、該エグジスリンド
投与群と該プラシーボ処置群との間で、PSAレベルに統
計的に有意な差違が存在することを示している。該エグ
ジスリンド投与群におけるPSAレベルは、該プラシーボ
投与群のPSAレベルと比較して、有意に減少した。PSAレ
ベルの上昇自体は、疾患の条件ではないが、これは医療
の分野においては、このような男性における、前立腺癌
再発を示す代表的なマーカーであると、広く認識されて
いる。
【０１０７】全体として、該エグジスリンド投与群と、
プラシーボ投与群との間の、平均PSAレベルにおける差
違に基づいて評価を行うことに加えて、中間的な(inter
im)分析は、サブグループの解析を含んでいた。本研究
の患者は、転移性疾患発現の危険性によって、高、中お
よび低危険率群に分割した。この分類は、ジャーナルオ
ブザアメリカンメジカルアッソシエーション(Journal o
f the American MedicalAssociation)(JAMA, 1999, 5月
5日, pp. 1591-97)に記載された方法を利用して行っ
た。どの患者がどの危険率群に入るかを確認するため
に、医学的履歴を、患者が薬物投与群またはプラシーボ
投与群の何れに属するかに関して知らされていない研究
者に、与えられた。この研究者が、上で引用した刊行物
に記載の方法により、本研究の患者を適当な危険率群に
割り振った。その統計的な分析は、高および中危険率群
両者において、エグジスリンドおよびプラシーボ投与群
間の、平均PSAレベルにおける、統計的に有意な差違を
明らかにした。この前立腺癌に関する研究データは、以
下の通りである。
プラシーボ投与群との間の、平均PSAレベルにおける差
違に基づいて評価を行うことに加えて、中間的な(inter
im)分析は、サブグループの解析を含んでいた。本研究
の患者は、転移性疾患発現の危険性によって、高、中お
よび低危険率群に分割した。この分類は、ジャーナルオ
ブザアメリカンメジカルアッソシエーション(Journal o
f the American MedicalAssociation)(JAMA, 1999, 5月
5日, pp. 1591-97)に記載された方法を利用して行っ
た。どの患者がどの危険率群に入るかを確認するため
に、医学的履歴を、患者が薬物投与群またはプラシーボ
投与群の何れに属するかに関して知らされていない研究
者に、与えられた。この研究者が、上で引用した刊行物
に記載の方法により、本研究の患者を適当な危険率群に
割り振った。その統計的な分析は、高および中危険率群
両者において、エグジスリンドおよびプラシーボ投与群
間の、平均PSAレベルにおける、統計的に有意な差違を
明らかにした。この前立腺癌に関する研究データは、以
下の通りである。
【０１０８】
【表１０】上昇するPSAレベルをもつ前立腺摘出術後の
男性における、平均PSAレベルに及ぼすエグジスリンド
の影響
男性における、平均PSAレベルに及ぼすエグジスリンド
の影響
【０１０９】これらエグジスリンドを用いた試みおよび
他の徴候における該薬物の使用を含む幾つかのその他の
試みにおいて、安全性を、悪影響(AEs)、臨床的実験室
テスト(血液学、血清化学、および尿検査)、生命徴候
(血圧、脈拍、呼吸数、体温、および体重)、身体的検
査、および上部内視鏡検査等の追跡によって評価した。
400例の患者についてこれまでにエグジスリンドを使用
して行った、臨床的試みにおいて、何等顕著な安全性に
係わる問題がないことが立証されている。エグジスリン
ドは、従前の化学療法に関連する、如何なる血液性疾
患、投与量制限性嘔吐、または神経学的もしくは腎性毒
性も示さなかった。これは、また生命徴候における如何
なる臨床的に有意な変更も生じなかった。事実、APC患
者におけるポリープおよび正常な結腸組織の組み合わせ
られた生検において、エグジスリンドは、ポリープにお
けるアポトーシス速度を高めるが、正常な組織のアポト
ーシスを促進しないことを見出しており、このことは該
薬物が正常な組織には最小の作用しか及ぼさないことを
示唆している。最大許容投与量を超える投与量において
(部分的結腸切除患者においてMTD=600mg、完全な結腸を
もつ患者については400mg、小児患者については350m
g)、観測された唯一の投与量を制限する悪影響は、治療
初期に見られる肝機能テスト(LFT)における上昇であっ
た。これが見られた場合、LFTの上昇は、迅速に回復さ
れ、その投与量を減じた場合には再発しない。その他の
影響(例えば、不定期の腹痛)が、典型的には短期間継続
し、その強度を緩和することは容易であり、従って該エ
グジスリンドの投与を中断または該投与量を減じる必要
はなかった。
他の徴候における該薬物の使用を含む幾つかのその他の
試みにおいて、安全性を、悪影響(AEs)、臨床的実験室
テスト(血液学、血清化学、および尿検査)、生命徴候
(血圧、脈拍、呼吸数、体温、および体重)、身体的検
査、および上部内視鏡検査等の追跡によって評価した。
400例の患者についてこれまでにエグジスリンドを使用
して行った、臨床的試みにおいて、何等顕著な安全性に
係わる問題がないことが立証されている。エグジスリン
ドは、従前の化学療法に関連する、如何なる血液性疾
患、投与量制限性嘔吐、または神経学的もしくは腎性毒
性も示さなかった。これは、また生命徴候における如何
なる臨床的に有意な変更も生じなかった。事実、APC患
者におけるポリープおよび正常な結腸組織の組み合わせ
られた生検において、エグジスリンドは、ポリープにお
けるアポトーシス速度を高めるが、正常な組織のアポト
ーシスを促進しないことを見出しており、このことは該
薬物が正常な組織には最小の作用しか及ぼさないことを
示唆している。最大許容投与量を超える投与量において
(部分的結腸切除患者においてMTD=600mg、完全な結腸を
もつ患者については400mg、小児患者については350m
g)、観測された唯一の投与量を制限する悪影響は、治療
初期に見られる肝機能テスト(LFT)における上昇であっ
た。これが見られた場合、LFTの上昇は、迅速に回復さ
れ、その投与量を減じた場合には再発しない。その他の
影響(例えば、不定期の腹痛)が、典型的には短期間継続
し、その強度を緩和することは容易であり、従って該エ
グジスリンドの投与を中断または該投与量を減じる必要
はなかった。
【０１１０】簡単に言えば、これら試みは、エグジスリ
ンドが、腫瘍性疾患の臨床的な管理のための有効かつ十
分に許容される継続的な治療法を与えることを明らかに
した。かくして、これらの結果は、特にcGMP-特異的PDE
活性を阻害し(並びに本発明のその他の選別基準を満た
す)付随的な化合物の選択が、インビボでの治療上有効
な薬物を与え得ることを示している。薬物の作用機構
が、cGMP阻害に関与していることが見出される前に、か
つ該薬物が本発明の選別基準を満足することが知られる
前に、開発された第二の薬物は、(Z)-5-フルオロ-2-メ
チル-(4-ピリジリデン)-3-(N-ベンジル)インデニルアセ
タミド塩酸塩(化合物I)である。この化合物は、インビ
トロおよびインビボ両評価において、広範囲に渡る腫瘍
性疾患に対する活性を持つ、抗−腫瘍形成剤として有用
であることが立証されている。この化合物は、また動物
実験および単一の、漸増する投与量によるヒトの研究に
おいても安全である。
ンドが、腫瘍性疾患の臨床的な管理のための有効かつ十
分に許容される継続的な治療法を与えることを明らかに
した。かくして、これらの結果は、特にcGMP-特異的PDE
活性を阻害し(並びに本発明のその他の選別基準を満た
す)付随的な化合物の選択が、インビボでの治療上有効
な薬物を与え得ることを示している。薬物の作用機構
が、cGMP阻害に関与していることが見出される前に、か
つ該薬物が本発明の選別基準を満足することが知られる
前に、開発された第二の薬物は、(Z)-5-フルオロ-2-メ
チル-(4-ピリジリデン)-3-(N-ベンジル)インデニルアセ
タミド塩酸塩(化合物I)である。この化合物は、インビ
トロおよびインビボ両評価において、広範囲に渡る腫瘍
性疾患に対する活性を持つ、抗−腫瘍形成剤として有用
であることが立証されている。この化合物は、また動物
実験および単一の、漸増する投与量によるヒトの研究に
おいても安全である。
【０１１１】当業者は、以下に示すデータから、化合物
Iが、従来の化学療法剤または抗−腫瘍形成剤NSAIDsの
許容される(並びに多くの場合には有害な)投与量を、大
幅に越える投与量で動物に与えても安全であり得ること
を認識するであろう。例えば、ラットにおける急性毒性
の研究において、2000mg/kg(この量を含む)までの投与
量で、化合物Iを一回経口投与(0.5%カルボキシメチルセ
ルロースビヒクル中)した場合には、毒性の徴候は何等
見られなかった。4000mg/kgでは、体重増は僅かに減少
した。腹腔内経路での投与量1000mg/kgでの一回の投与
は、体重増の減少をもたらし、剖検において、この群に
属する幾つかの動物には、腸間膜の融着が見られた。イ
ヌにおいて、カプセル状の化合物Iの投与量1000mg/kgで
の投与は、2匹の雄および2匹の雌からなる単一群には、
毒性の何の徴候も見られなかった。化合物Iのカプセル
剤の特性のために、この投与量は、各動物に少なくとも
13カプセルを使用する必要があり、この数は、動物にス
トレスを感じさせない最大の数であると判断された。従
って、これらイヌには、引き続き7回に渡る、1000mg/kg
なる量での継続的な投与が行われた。投与段階の如何な
る時点においても、明確な薬物関連作用の如何なる徴候
も観測されなかった。
Iが、従来の化学療法剤または抗−腫瘍形成剤NSAIDsの
許容される(並びに多くの場合には有害な)投与量を、大
幅に越える投与量で動物に与えても安全であり得ること
を認識するであろう。例えば、ラットにおける急性毒性
の研究において、2000mg/kg(この量を含む)までの投与
量で、化合物Iを一回経口投与(0.5%カルボキシメチルセ
ルロースビヒクル中)した場合には、毒性の徴候は何等
見られなかった。4000mg/kgでは、体重増は僅かに減少
した。腹腔内経路での投与量1000mg/kgでの一回の投与
は、体重増の減少をもたらし、剖検において、この群に
属する幾つかの動物には、腸間膜の融着が見られた。イ
ヌにおいて、カプセル状の化合物Iの投与量1000mg/kgで
の投与は、2匹の雄および2匹の雌からなる単一群には、
毒性の何の徴候も見られなかった。化合物Iのカプセル
剤の特性のために、この投与量は、各動物に少なくとも
13カプセルを使用する必要があり、この数は、動物にス
トレスを感じさせない最大の数であると判断された。従
って、これらイヌには、引き続き7回に渡る、1000mg/kg
なる量での継続的な投与が行われた。投与段階の如何な
る時点においても、明確な薬物関連作用の如何なる徴候
も観測されなかった。
【０１１２】かくして、単一投与を基準とすれば、化合
物Iは急性毒性を示さない。これら研究の結果によれ
ば、化合物Iの経口経路でのLD50は、イヌでは1000mg/kg
を越え、ラットでは4000mg/kgを越えるものであり、ま
た腹腔内経路でのLD50は、ラットでは1000mg/kgを越え
るものと考えられた。7日間の、投与量範囲探索を、ラ
ットにおいて研究した。ここでは、化合物Iを、0、50、
500または2000mg/kg/日なる投与量で投与することによ
って評価し、その結果50mg/kg/日では毒性の徴候は何等
観測されなかった。500 mg/kg/日では、治療関連作用
は、雌ラットにおける絶対および相対的肝重量増に限ら
れていた。2000 mg/kg/日では、投与の影響は、呼吸困
難および/または異常な呼吸音、雄ラットにおける低い
体重増および飼料消費、および雌ラットにおける高い肝
重量を含んでいた。どの投与レベルにおいても、血液学
的または血液化学的な変化も、如何なる微視的な病理的
変化も見られなかった。
物Iは急性毒性を示さない。これら研究の結果によれ
ば、化合物Iの経口経路でのLD50は、イヌでは1000mg/kg
を越え、ラットでは4000mg/kgを越えるものであり、ま
た腹腔内経路でのLD50は、ラットでは1000mg/kgを越え
るものと考えられた。7日間の、投与量範囲探索を、ラ
ットにおいて研究した。ここでは、化合物Iを、0、50、
500または2000mg/kg/日なる投与量で投与することによ
って評価し、その結果50mg/kg/日では毒性の徴候は何等
観測されなかった。500 mg/kg/日では、治療関連作用
は、雌ラットにおける絶対および相対的肝重量増に限ら
れていた。2000 mg/kg/日では、投与の影響は、呼吸困
難および/または異常な呼吸音、雄ラットにおける低い
体重増および飼料消費、および雌ラットにおける高い肝
重量を含んでいた。どの投与レベルにおいても、血液学
的または血液化学的な変化も、如何なる微視的な病理的
変化も見られなかった。
【０１１３】ラットにおける28-日間に渡る研究も、0、
50、500および2000mg/kg/日なる投与量で実施した。CP-
461に帰せられる異常な臨床的な観測は何等見られず、
また体重変化、検眼鏡検査、血液学的および血液化学的
な値、および尿検査の結果は、顕著ではなかった。剖検
において、如何なる巨視的な組織変化も見られなかっ
た。器官重量のデータは、2000 mg/kg/日における肝重
量における統計的に有意な増加を示し、また該2000 mg/
kg/日投与群に関して、甲状腺重量における統計的に有
意な増加を示した。低投与量におけるこれら僅かな増加
は、統計的には有意ではなかった。組織の組織病理学的
評価は、痕跡の小胞細胞肥大、甲状腺における有糸分裂
数(可能な細胞増殖の示唆)の増加、および肝臓における
穏やかな小葉中心の肥大の存在を示した。これら変化
は、一般的に2000 mg/kg/日投与群の少数の動物に限ら
れていたが、500 mg/kg/日投与群の一匹の雌は、甲状腺
における高い有糸分裂数を有していた。肝臓に関するこ
の発見は、ミクロソーム酵素の極めて穏やかな刺激を表
す可能性があり、これは甲状腺ホルモンの高い代謝性を
結果し、更に甲状腺の刺激をもたらした。かくして、当
業者は、これらの効果が、従来の化学療法剤またはNSAI
Dsの同様な投与量において予想されるものと比較して、
極めて僅かなものであることを認識するであろう。
50、500および2000mg/kg/日なる投与量で実施した。CP-
461に帰せられる異常な臨床的な観測は何等見られず、
また体重変化、検眼鏡検査、血液学的および血液化学的
な値、および尿検査の結果は、顕著ではなかった。剖検
において、如何なる巨視的な組織変化も見られなかっ
た。器官重量のデータは、2000 mg/kg/日における肝重
量における統計的に有意な増加を示し、また該2000 mg/
kg/日投与群に関して、甲状腺重量における統計的に有
意な増加を示した。低投与量におけるこれら僅かな増加
は、統計的には有意ではなかった。組織の組織病理学的
評価は、痕跡の小胞細胞肥大、甲状腺における有糸分裂
数(可能な細胞増殖の示唆)の増加、および肝臓における
穏やかな小葉中心の肥大の存在を示した。これら変化
は、一般的に2000 mg/kg/日投与群の少数の動物に限ら
れていたが、500 mg/kg/日投与群の一匹の雌は、甲状腺
における高い有糸分裂数を有していた。肝臓に関するこ
の発見は、ミクロソーム酵素の極めて穏やかな刺激を表
す可能性があり、これは甲状腺ホルモンの高い代謝性を
結果し、更に甲状腺の刺激をもたらした。かくして、当
業者は、これらの効果が、従来の化学療法剤またはNSAI
Dsの同様な投与量において予想されるものと比較して、
極めて僅かなものであることを認識するであろう。
【０１１４】化合物Iの安全性プロフィールを更に確立
するために、ある研究を行って、前立腺癌細胞系の化合
物I-誘発アポトーシスが、正常な組織由来の前立腺表皮
細胞に及ぼすその効果に匹敵するか否かを評価した。こ
のアンドロゲン-感受性前立腺癌細胞系、LNCaP(MD州、
ロックビルのATCCから入手)を、5%の子牛血清および2mM
のグルタミンを含むRPMI160培地を使用して、標準的な
条件下で増殖させた。正常な前立腺(CA州、サンジエゴ
の、クローンティック社(Clonetics Inc.))から入手し
た、一次前立腺表皮細胞培養物(PrEC)を、このような培
養物の成長にとって最適化された、血清を含まない培地
(クローンティック社)を使用したことを除き、上記の腫
瘍細胞系と同一の条件下で生育させた。この実験のため
に、LNCaPまたはPrEC細胞を、ウエル当たり10,000細胞
なる密度にて、96ウエルプレートに播種した。24時間後
に、該細胞をビヒクル(0.1% DMSO)または50μMの化合物
I(遊離塩基)をDMSOに溶解した溶液の何れかで処理し
た。種々の薬物処理時間(4、24、48、72または99時間)
の経過後に、該細胞を溶解し、かつアポトーシス細胞死
の指示薬であるヒストン-結合DNAの測定のために処理し
た(ピアザ等, Cancer Research, 1997, 57:2457-2459を
参照のこと)。
するために、ある研究を行って、前立腺癌細胞系の化合
物I-誘発アポトーシスが、正常な組織由来の前立腺表皮
細胞に及ぼすその効果に匹敵するか否かを評価した。こ
のアンドロゲン-感受性前立腺癌細胞系、LNCaP(MD州、
ロックビルのATCCから入手)を、5%の子牛血清および2mM
のグルタミンを含むRPMI160培地を使用して、標準的な
条件下で増殖させた。正常な前立腺(CA州、サンジエゴ
の、クローンティック社(Clonetics Inc.))から入手し
た、一次前立腺表皮細胞培養物(PrEC)を、このような培
養物の成長にとって最適化された、血清を含まない培地
(クローンティック社)を使用したことを除き、上記の腫
瘍細胞系と同一の条件下で生育させた。この実験のため
に、LNCaPまたはPrEC細胞を、ウエル当たり10,000細胞
なる密度にて、96ウエルプレートに播種した。24時間後
に、該細胞をビヒクル(0.1% DMSO)または50μMの化合物
I(遊離塩基)をDMSOに溶解した溶液の何れかで処理し
た。種々の薬物処理時間(4、24、48、72または99時間)
の経過後に、該細胞を溶解し、かつアポトーシス細胞死
の指示薬であるヒストン-結合DNAの測定のために処理し
た(ピアザ等, Cancer Research, 1997, 57:2457-2459を
参照のこと)。
【０１１５】図27は、50μMの化合物I(遊離塩基)で処理
した後の、LNCaP細胞培養物における、ヒストン-結合DN
Aフラグメントの量における時間依存性の増加を示す。D
NAフラグメントの有意な増加は、処理の24時間後に検出
され、またこの誘発性は連続処理の4日まで持続した。
これとは対照的に、PrEC(「正常な」前立腺)細胞の化合物
I(50μM)による処理は、処理の4日目まで、DNAのフラグ
メント化に影響はなかった。これら結果は、正常な細胞
とは逆に、腫瘍形成細胞におけるアポトーシスの選択的
誘発を立証している。このことは、迅速に成長している
正常な細胞および腫瘍形成細胞においてアポトーシスま
たは壊死を誘発する、従来の化学療法剤とは顕著な対比
をなしている。最後に、単一の漸増する投与量によるヒ
トの臨床的試みにおける安全性に関連して、薬物を経口
的に投与した患者、即ちヒトの安全性に係わる研究にお
いて、化合物Iは、制癌作用を得るのに必要であると予
想されたレベルを超える投与量を包含する、如何なる投
与量においても、有意な副作用を示さなかった。
した後の、LNCaP細胞培養物における、ヒストン-結合DN
Aフラグメントの量における時間依存性の増加を示す。D
NAフラグメントの有意な増加は、処理の24時間後に検出
され、またこの誘発性は連続処理の4日まで持続した。
これとは対照的に、PrEC(「正常な」前立腺)細胞の化合物
I(50μM)による処理は、処理の4日目まで、DNAのフラグ
メント化に影響はなかった。これら結果は、正常な細胞
とは逆に、腫瘍形成細胞におけるアポトーシスの選択的
誘発を立証している。このことは、迅速に成長している
正常な細胞および腫瘍形成細胞においてアポトーシスま
たは壊死を誘発する、従来の化学療法剤とは顕著な対比
をなしている。最後に、単一の漸増する投与量によるヒ
トの臨床的試みにおける安全性に関連して、薬物を経口
的に投与した患者、即ちヒトの安全性に係わる研究にお
いて、化合物Iは、制癌作用を得るのに必要であると予
想されたレベルを超える投与量を包含する、如何なる投
与量においても、有意な副作用を示さなかった。
【０１１６】上記のように、化合物Iは、また有力な抗
−腫瘍形成特性をも示す。化合物Iについて得られた成
長阻害IC50値は、該SW-480細胞系において0.7μMであっ
た。この結果は、発癌の指標である、異常クリプトフォ
シ(aberrant crypt foci (ACF))を使用した、げっ歯類
における化合物Iの評価によって確認されている(バード
(Bird), Cancer Lett., 1987, 37:147-151を参照のこ
と)。アゾキシメタン(AOM)-誘発性発癌の、この確立さ
れたげっ歯類モデルを、インビボでの結腸癌の発現に及
ぼされる化合物I(遊離塩基および塩)の作用を評価する
のに使用した。ACFは、結腸癌の先駆体であり、またACF
の阻害は、化学的予防効果の有効性を予測する。
−腫瘍形成特性をも示す。化合物Iについて得られた成
長阻害IC50値は、該SW-480細胞系において0.7μMであっ
た。この結果は、発癌の指標である、異常クリプトフォ
シ(aberrant crypt foci (ACF))を使用した、げっ歯類
における化合物Iの評価によって確認されている(バード
(Bird), Cancer Lett., 1987, 37:147-151を参照のこ
と)。アゾキシメタン(AOM)-誘発性発癌の、この確立さ
れたげっ歯類モデルを、インビボでの結腸癌の発現に及
ぼされる化合物I(遊離塩基および塩)の作用を評価する
のに使用した。ACFは、結腸癌の先駆体であり、またACF
の阻害は、化学的予防効果の有効性を予測する。
【０１１７】この実験におけるラットにおいて、ACFの
阻害は、該発癌性物質の連続する2週間の注入によって
達成された。化合物Iを、該ACF開始の1週間前に、実験
の継続のために投与した。処理の5週間後に、ACFを点数
により評価した。化合物Iは、ラットの餌を通して、雄
フィッシャー(Fisher) 344ラットに経口投与した。毎日
の食物消費量(mg/kg体重)を、この研究全体を通して変
化させ、従って化合物Iの投与量は、投与量間の比較の
基礎を得るために、g/kg飼料で表した。化合物Iが、成
長および/または給餌挙動に及ぼす悪影響をもつか否か
を確認するために、この実験中ずっと、体重の測定を行
った。これら実験群は、コントロール群と比較して、体
重増は少なかったが、これは生体利用性の指標である。
しかしながら、体重差は、10%未満であり、ACFの形成に
影響するとは考えられなかった。化合物Iの遊離塩基
は、結腸当たりのクリプト(crypts)数の減少によって測
定した如く、ACF形成を阻害した。これらデータを以下
の表11にまとめた。低投与群(僅か0.5g/kg飼料)を除
き、処理群とコントロール群との間の差違は、かなりの
ものであり、1.0 g/kg飼料および2.0 g/kg飼料給餌群の
場合には、統計的に有意であった。
阻害は、該発癌性物質の連続する2週間の注入によって
達成された。化合物Iを、該ACF開始の1週間前に、実験
の継続のために投与した。処理の5週間後に、ACFを点数
により評価した。化合物Iは、ラットの餌を通して、雄
フィッシャー(Fisher) 344ラットに経口投与した。毎日
の食物消費量(mg/kg体重)を、この研究全体を通して変
化させ、従って化合物Iの投与量は、投与量間の比較の
基礎を得るために、g/kg飼料で表した。化合物Iが、成
長および/または給餌挙動に及ぼす悪影響をもつか否か
を確認するために、この実験中ずっと、体重の測定を行
った。これら実験群は、コントロール群と比較して、体
重増は少なかったが、これは生体利用性の指標である。
しかしながら、体重差は、10%未満であり、ACFの形成に
影響するとは考えられなかった。化合物Iの遊離塩基
は、結腸当たりのクリプト(crypts)数の減少によって測
定した如く、ACF形成を阻害した。これらデータを以下
の表11にまとめた。低投与群(僅か0.5g/kg飼料)を除
き、処理群とコントロール群との間の差違は、かなりの
ものであり、1.0 g/kg飼料および2.0 g/kg飼料給餌群の
場合には、統計的に有意であった。
【０１１８】
【表１１】化合物Iによる異常クリプトフォシの阻害
【０１１９】また、化合物Iは、遡及的に本発明の該選
別基準を満たし、かつこの化合物は、この選別基準の妥
当性を確立するのに使用した化合物の一つであった。例
えば、前に記載されたプロトコールを使用して、化合物
Iは、HT29細胞抽出物由来のcGMP-特異的PDEを使用して
得た、cGMP-特異的PDEIC50値は、0.68μMであった。そ
の(100μMにおける)COX I阻害は、25%未満であった。プ
ロ-アポトーシス性に関連して、化合物IのDNAフラグメ
ント化EC50は、15μMであった。更に、SW-480における
化合物Iに関する、種々の薬物濃度におけるアポトーシ
スの割合は、以下の表12に示されている。
別基準を満たし、かつこの化合物は、この選別基準の妥
当性を確立するのに使用した化合物の一つであった。例
えば、前に記載されたプロトコールを使用して、化合物
Iは、HT29細胞抽出物由来のcGMP-特異的PDEを使用して
得た、cGMP-特異的PDEIC50値は、0.68μMであった。そ
の(100μMにおける)COX I阻害は、25%未満であった。プ
ロ-アポトーシス性に関連して、化合物IのDNAフラグメ
ント化EC50は、15μMであった。更に、SW-480における
化合物Iに関する、種々の薬物濃度におけるアポトーシ
スの割合は、以下の表12に示されている。
【０１２０】
【表１２】形態学的に決定された、化合物Iによる、HT-
29細胞、SW-480結腸腺癌細胞のアポトーシス誘発性
29細胞、SW-480結腸腺癌細胞のアポトーシス誘発性
【０１２１】化合物Iの活性は、結腸癌細胞系または結
腸癌の動物モデルに対する活性のみに限定されない。種
々の腫瘍形成細胞系における、広い範囲の抗−腫瘍形成
作用を有する。種々の型のヒト癌細胞系を、10%子牛血
清、2mMのL-グルタミンおよび重炭酸ナトリウムを含むR
PMI 1640培地中で、無菌条件下で増殖させた。化合物I
の成長阻害作用を測定するために、細胞を、ウエル当た
り1000細胞なる密度にて、96-ウエルプレートに播種し
た。接種の24時間後に、該細胞に、種々の濃度の、DMSO
に溶解した化合物Iの遊離塩基を投与した(最終濃度0.1
%)。腫瘍細胞成長に及ぼすこの薬物の効果を、5日間の
連続する処理後に、ニュートラルレッド細胞毒性アッセ
イを利用して測定した。ニュートラルレッドは、ATP-依
存性輸送機構によって、生細胞により選択的に取り込ま
れる染料である。
腸癌の動物モデルに対する活性のみに限定されない。種
々の腫瘍形成細胞系における、広い範囲の抗−腫瘍形成
作用を有する。種々の型のヒト癌細胞系を、10%子牛血
清、2mMのL-グルタミンおよび重炭酸ナトリウムを含むR
PMI 1640培地中で、無菌条件下で増殖させた。化合物I
の成長阻害作用を測定するために、細胞を、ウエル当た
り1000細胞なる密度にて、96-ウエルプレートに播種し
た。接種の24時間後に、該細胞に、種々の濃度の、DMSO
に溶解した化合物Iの遊離塩基を投与した(最終濃度0.1
%)。腫瘍細胞成長に及ぼすこの薬物の効果を、5日間の
連続する処理後に、ニュートラルレッド細胞毒性アッセ
イを利用して測定した。ニュートラルレッドは、ATP-依
存性輸送機構によって、生細胞により選択的に取り込ま
れる染料である。
【０１２２】表13にまとめたように、化合物I(遊離塩
基)は、種々の組織起源由来の、培養ヒト細胞系のパネ
ルに対して評価した場合に、高い成長阻害活性を示し
た。化合物Iは、該細胞系の由来する、該腫瘍の組織発
生とは無関係に、比較に耐える成長阻害活性を示した。
全ての細胞系について算出した、GI50値(ビヒクルコン
トロールに対して、50%の成長を阻害するための薬物濃
度は、1-2μMであった。以下の表に示されたデータに加
えて、我々は、ヒト白血病細胞系(CCRF-CEM、K562、お
よびMolt-4)、ミエローマ細胞系(RPMI8226)、膵臓癌細
胞系(PAN-1)および卵巣腫瘍細胞系(OVCAR-3)の、化合物
I(HCl塩)に対する、比較に耐え得る感受性をも観測し
た。
基)は、種々の組織起源由来の、培養ヒト細胞系のパネ
ルに対して評価した場合に、高い成長阻害活性を示し
た。化合物Iは、該細胞系の由来する、該腫瘍の組織発
生とは無関係に、比較に耐える成長阻害活性を示した。
全ての細胞系について算出した、GI50値(ビヒクルコン
トロールに対して、50%の成長を阻害するための薬物濃
度は、1-2μMであった。以下の表に示されたデータに加
えて、我々は、ヒト白血病細胞系(CCRF-CEM、K562、お
よびMolt-4)、ミエローマ細胞系(RPMI8226)、膵臓癌細
胞系(PAN-1)および卵巣腫瘍細胞系(OVCAR-3)の、化合物
I(HCl塩)に対する、比較に耐え得る感受性をも観測し
た。
【０１２３】
【表１３】化合物Iによる種々のヒト腫瘍細胞系の成長
阻害
阻害
【０１２４】
【表１４】表13(続き)：化合物Iによる種々のヒト腫瘍
細胞系の成長阻害 ＊: テストは、アステリスクで示されていない限り、該
化合物の遊離塩基を使用して実施し、該アステリスクで
示された場合には、テストはHCl塩を使用して実施し
た。
細胞系の成長阻害 ＊: テストは、アステリスクで示されていない限り、該
化合物の遊離塩基を使用して実施し、該アステリスクで
示された場合には、テストはHCl塩を使用して実施し
た。
【０１２５】化合物Iの、動物およびヒトに対する安全
特性、並びに動物および極めて広範囲に及ぶ細胞培養物
に対する有効性が、与えられたので、本発明の選別基準
(cGMP-特異的PDE阻害性を含む)を満足する化合物が、抗
-腫瘍形成療法において有用であることは明白である。
抗-腫瘍形成剤として治療上有効であり得る、付随的にc
GMP-特異的PDEを阻害する化合物の、構造上の同定に関
連して、当業者はここに記載された多数の有用なモデル
化合物(並びに参考として組み込まれた類似体)を有して
おり、該モデル化合物は、同一の立体配座をもつが、化
学的に異なっている付随的な化合物の、コンピュータモ
デル化の基礎として使用できる。例えば、モレキュラー
シミュレーション社(Molecular Simulations Inc.)によ
り、発売されているWebLabR ViewerProTM等のソフトウ
エアは、分子の可視化およびケミカルコミュニケーショ
ン能を含む。このようなソフトウエアは、スケッチされ
もしくは挿入された化学構造を正確に確認するための、
既知の活性化合物の3D図式化を含む機能を備えている。
その上、このソフトウエアは、ユーザーが指定した特徴
に基づいて、構造を重ねあわせることをも可能とし、か
つユーザーは距離、角度または二面角を測定することが
できる。
特性、並びに動物および極めて広範囲に及ぶ細胞培養物
に対する有効性が、与えられたので、本発明の選別基準
(cGMP-特異的PDE阻害性を含む)を満足する化合物が、抗
-腫瘍形成療法において有用であることは明白である。
抗-腫瘍形成剤として治療上有効であり得る、付随的にc
GMP-特異的PDEを阻害する化合物の、構造上の同定に関
連して、当業者はここに記載された多数の有用なモデル
化合物(並びに参考として組み込まれた類似体)を有して
おり、該モデル化合物は、同一の立体配座をもつが、化
学的に異なっている付随的な化合物の、コンピュータモ
デル化の基礎として使用できる。例えば、モレキュラー
シミュレーション社(Molecular Simulations Inc.)によ
り、発売されているWebLabR ViewerProTM等のソフトウ
エアは、分子の可視化およびケミカルコミュニケーショ
ン能を含む。このようなソフトウエアは、スケッチされ
もしくは挿入された化学構造を正確に確認するための、
既知の活性化合物の3D図式化を含む機能を備えている。
その上、このソフトウエアは、ユーザーが指定した特徴
に基づいて、構造を重ねあわせることをも可能とし、か
つユーザーは距離、角度または二面角を測定することが
できる。
【０１２６】このような状況において、他の活性化合物
の構造は、上に記載されているので、このようなソフト
ウエアを使用して、クラスター解析および2Dおよび3D類
似性探索技術を適用して、付随的な有力な新規化合物を
同定し、次いでこれを本発明の選別基準に従って、スク
リーニングし、かつ選別することができる。これらソフ
トウエア法は、類似しておりもしくは類似の特性を有す
る化合物が、より一層類似する活性を持つと考えられ、
これが本発明の該選別基準を利用して確認できるという
原理によっている。
の構造は、上に記載されているので、このようなソフト
ウエアを使用して、クラスター解析および2Dおよび3D類
似性探索技術を適用して、付随的な有力な新規化合物を
同定し、次いでこれを本発明の選別基準に従って、スク
リーニングし、かつ選別することができる。これらソフ
トウエア法は、類似しておりもしくは類似の特性を有す
る化合物が、より一層類似する活性を持つと考えられ、
これが本発明の該選別基準を利用して確認できるという
原理によっている。
【０１２７】同様に、このような付随的な化合物が、コ
ンピュータで設計された場合、多くのこのような化合物
およびその変形が、公知の結合化学的技術を利用して合
成でき、該技術は、製薬工業における当業者によって通
常使用されているものである。幾つかのフォーハイヤー
(for-hire)結合化学サービスの例は、ワシントン、ボー
テルのニューケミカルエンティティー社(New Chemical
Entities Inc.)、CA州、パロアルトのプロトゲンラボラ
トリーズ社(Protogene Laboratories Inc.)、CA州、サ
ウスサンフランシスコのアクシス社(Axys Inc.)、アリ
ゾナ州、タクソンのナノシン社(Nanosyn Inc.)、CA州、
サンジエゴのトレガ社(Trega Inc.)、Mass州、ナティッ
クのRBI社(RBI Inc.)を含む。幾つかの他のフォーハイ
ヤーも存在する。多数の大製薬会社は、優れているとは
いえなくとも、同様な社内能力を有している。簡単に言
えば、当業者は、ここに記載した化合物の属性を持つ、
腫瘍性疾患を治療するための顕著な化合物を選別すべく
スクリーニングするための多くの化合物を容易に製造で
きる。本発明の基準を利用して、スクリーニングし、か
つ選別することのできる化合物を同定する際に、更に役
立てるためには、選別された抗−腫瘍形成性化合物の、
PDE5タンパクに対する結合性を知ることが重要である。
以下に論じる手順によって、本発明の該選別基準を満た
す、好ましく、望ましい化合物が、PDE5のcGMP触媒領域
と結合することを見出した。
ンピュータで設計された場合、多くのこのような化合物
およびその変形が、公知の結合化学的技術を利用して合
成でき、該技術は、製薬工業における当業者によって通
常使用されているものである。幾つかのフォーハイヤー
(for-hire)結合化学サービスの例は、ワシントン、ボー
テルのニューケミカルエンティティー社(New Chemical
Entities Inc.)、CA州、パロアルトのプロトゲンラボラ
トリーズ社(Protogene Laboratories Inc.)、CA州、サ
ウスサンフランシスコのアクシス社(Axys Inc.)、アリ
ゾナ州、タクソンのナノシン社(Nanosyn Inc.)、CA州、
サンジエゴのトレガ社(Trega Inc.)、Mass州、ナティッ
クのRBI社(RBI Inc.)を含む。幾つかの他のフォーハイ
ヤーも存在する。多数の大製薬会社は、優れているとは
いえなくとも、同様な社内能力を有している。簡単に言
えば、当業者は、ここに記載した化合物の属性を持つ、
腫瘍性疾患を治療するための顕著な化合物を選別すべく
スクリーニングするための多くの化合物を容易に製造で
きる。本発明の基準を利用して、スクリーニングし、か
つ選別することのできる化合物を同定する際に、更に役
立てるためには、選別された抗−腫瘍形成性化合物の、
PDE5タンパクに対する結合性を知ることが重要である。
以下に論じる手順によって、本発明の該選別基準を満た
す、好ましく、望ましい化合物が、PDE5のcGMP触媒領域
と結合することを見出した。
【０１２８】このことを確立するために、該触媒ドメイ
ンを含まないPDE5配列を使用した。このような配列を製
造するための一つの方法は、該配列を、以下において明
らかになる理由から、好ましくはグルタチオンS-トラン
スフェラーゼ(GST)との融合タンパクとして発現するこ
とである。RT-PCR法を使用して、ウシPDE5A cDNA配列か
ら設計した、前進および逆プライマーをもつPDE5のcGB
ドメインを得、PDE1-10群から選別するのに利用した。
全RNA用の5'-3' Inc.キットおよびこれに続くmRNAのオ
リゴ(dT)カラム精製を、HT-29細胞と共に使用した。前
進プライマー(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-A
AT-G、203-227)および逆プライマー(CTC-GAG-CTC-TCT-T
GT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG、1664-1686)を使用して、ヒトP
DE5A(203-1686bp、cGB-PDE5)の、該ホスホリル化サイト
および低および高アフィニティーcGMP結合サイトをコー
ドする該1484bpをもつフラグメントを合成する。この合
成されたcGB-PDE5ヌクレオチドフラグメントは、ウシの
PDE5Aと97%の類似性をもつ、494アミノ酸をコードす
る。次いで、これを、tacプロモータおよびEcoRIおよび
XhoI切断サイトをもつ、pGEX-5X-3グルタチオン-S-トラ
ンスフェラーゼ(GST)融合ベクター(ファルマーシア バ
イオテック)に、クローニングする。次に、この融合ベ
クターを、E.Coli BL21(DE3)バクテリア(インビトロゲ
ン)内にトランスフェクションする。このトランスフェ
クションされたBL21バクテリアを、対数増殖期まで生育
させ、次いで誘導物質としてIPTGを添加する。この誘導
は、20℃にて24時間行う。該バクテリアを、収穫し、か
つ溶解させる。得られる可溶性細胞溶解物は、GSH複合
化セファロース4B(GSH-セファロース4B)と共にインキュ
ベートする。このGST-cGB-PDE5融合タンパクは、GSH-セ
ファロースビーズと結合でき、また他のタンパクを、過
剰量の冷PBSで、該ビーズから洗い流す。
ンを含まないPDE5配列を使用した。このような配列を製
造するための一つの方法は、該配列を、以下において明
らかになる理由から、好ましくはグルタチオンS-トラン
スフェラーゼ(GST)との融合タンパクとして発現するこ
とである。RT-PCR法を使用して、ウシPDE5A cDNA配列か
ら設計した、前進および逆プライマーをもつPDE5のcGB
ドメインを得、PDE1-10群から選別するのに利用した。
全RNA用の5'-3' Inc.キットおよびこれに続くmRNAのオ
リゴ(dT)カラム精製を、HT-29細胞と共に使用した。前
進プライマー(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-A
AT-G、203-227)および逆プライマー(CTC-GAG-CTC-TCT-T
GT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG、1664-1686)を使用して、ヒトP
DE5A(203-1686bp、cGB-PDE5)の、該ホスホリル化サイト
および低および高アフィニティーcGMP結合サイトをコー
ドする該1484bpをもつフラグメントを合成する。この合
成されたcGB-PDE5ヌクレオチドフラグメントは、ウシの
PDE5Aと97%の類似性をもつ、494アミノ酸をコードす
る。次いで、これを、tacプロモータおよびEcoRIおよび
XhoI切断サイトをもつ、pGEX-5X-3グルタチオン-S-トラ
ンスフェラーゼ(GST)融合ベクター(ファルマーシア バ
イオテック)に、クローニングする。次に、この融合ベ
クターを、E.Coli BL21(DE3)バクテリア(インビトロゲ
ン)内にトランスフェクションする。このトランスフェ
クションされたBL21バクテリアを、対数増殖期まで生育
させ、次いで誘導物質としてIPTGを添加する。この誘導
は、20℃にて24時間行う。該バクテリアを、収穫し、か
つ溶解させる。得られる可溶性細胞溶解物は、GSH複合
化セファロース4B(GSH-セファロース4B)と共にインキュ
ベートする。このGST-cGB-PDE5融合タンパクは、GSH-セ
ファロースビーズと結合でき、また他のタンパクを、過
剰量の冷PBSで、該ビーズから洗い流す。
【０１２９】この発現されたGST-cGB-PDE5融合タンパク
は、7.5%SDS-PAGEゲル上に、85Kdのタンパクとして示さ
れる。これは、そのcGMP結合性およびプロテインキナー
ゼGおよびAによるホスホリル化によって特徴付けられ
る。これは、２つのcGMP結合サイトを示し、またKdは1.
6±0.2μMであり、これは本来のウシPDE5のKd=1.3μMに
近いものである。GSH-複合化セファロースビーズ上の該
GST-cGB-PDE5は、インビトロにて、cGMP-依存性プロテ
インキナーゼおよびcAMP-依存性プロテインキナーゼAに
より、ホスホリル化できる。PKGによるGST-cGB-PDE5の
ホスホリル化のKmは、2.7μMであり、またVmaxは2.8μM
であり、一方でBPDEチドホスホリル化のKmは、68μMで
ある。PKGによるこのホスホリル化は、1:1の比でGST-cG
B-PDE5タンパクに組み込まれた分子状燐酸根を示す。
は、7.5%SDS-PAGEゲル上に、85Kdのタンパクとして示さ
れる。これは、そのcGMP結合性およびプロテインキナー
ゼGおよびAによるホスホリル化によって特徴付けられ
る。これは、２つのcGMP結合サイトを示し、またKdは1.
6±0.2μMであり、これは本来のウシPDE5のKd=1.3μMに
近いものである。GSH-複合化セファロースビーズ上の該
GST-cGB-PDE5は、インビトロにて、cGMP-依存性プロテ
インキナーゼおよびcAMP-依存性プロテインキナーゼAに
より、ホスホリル化できる。PKGによるGST-cGB-PDE5の
ホスホリル化のKmは、2.7μMであり、またVmaxは2.8μM
であり、一方でBPDEチドホスホリル化のKmは、68μMで
ある。PKGによるこのホスホリル化は、1:1の比でGST-cG
B-PDE5タンパクに組み込まれた分子状燐酸根を示す。
【０１３０】対象とする化合物に関するcGMP結合アッセ
イ(フランシス(Francis) S.H.等, J. Biol. Chem., 198
0, 255-620-626)は、5mMの燐酸ナトリウムバッファー(p
H=6.8)、1mMのEDTA、0.25mg/mlのBSA、H3-cGMP(2μM、N
EN)、および該GST-cGB-PDE5融合タンパク(30μg/アッセ
イ)を含有する、全体積100μL中で実施する。テストす
べき各化合物は、H3-cGMP基質と同時に添加し、またこ
の混合物を22℃にて1時間インキュベートする。次い
で、この混合物を、フィルタ膜としてGF/Bを備えた、ブ
ランデル(Brandel)MB-24細胞収穫装置に移し、次に10ml
の冷5mMカリウムバッファー(pH 6.8)で2回洗浄する。次
いで、この膜を切り取り、シンチレーションバイアルに
移し、引き続き各バイアルに、1mlの水および6mlのレデ
ィーセーフ(Ready SafeTM)液体シンチレーションカクテ
ルを添加する。これらバイアルを、ベックマン(Beckma
n)LS 6500シンチレーションカウンターで計数する。
イ(フランシス(Francis) S.H.等, J. Biol. Chem., 198
0, 255-620-626)は、5mMの燐酸ナトリウムバッファー(p
H=6.8)、1mMのEDTA、0.25mg/mlのBSA、H3-cGMP(2μM、N
EN)、および該GST-cGB-PDE5融合タンパク(30μg/アッセ
イ)を含有する、全体積100μL中で実施する。テストす
べき各化合物は、H3-cGMP基質と同時に添加し、またこ
の混合物を22℃にて1時間インキュベートする。次い
で、この混合物を、フィルタ膜としてGF/Bを備えた、ブ
ランデル(Brandel)MB-24細胞収穫装置に移し、次に10ml
の冷5mMカリウムバッファー(pH 6.8)で2回洗浄する。次
いで、この膜を切り取り、シンチレーションバイアルに
移し、引き続き各バイアルに、1mlの水および6mlのレデ
ィーセーフ(Ready SafeTM)液体シンチレーションカクテ
ルを添加する。これらバイアルを、ベックマン(Beckma
n)LS 6500シンチレーションカウンターで計数する。
【０１３１】計算のために、ブランクサンプルを、該結
合タンパクを5分間煮沸することによって調製し、その
結合カウントを、煮沸されていないタンパクと比較し
て、<1%となるようにする。濾過膜または他のデブリス
によるクエンチングについても、キャリブレーションし
た。PDE5阻害剤、スルフィド、エグジスリンド、化合物
B、化合物E、E4021およびザプリナスト、および環状ヌ
クレオチド類似体、cAMP、環状IMP、8-ブロモ-cGMP、環
状UMP、環状CMP、8-ブロモ-cAMP、2'-O-ブチル-cGMPお
よび2'-O-ブチル-cAMPを選択して、これらが該GST-cGB-
PDE5タンパクの該cGMP結合サイトに、競合的に結合でき
るか否かをテストする。その結果を図24に示した。cGMP
は、特異的にGST-cGB-PDE5タンパクと結合する。環状AM
P、cUMP、cCMP、8-ブロモ-cAMP、2'-O-ブチル-cAMPおよ
び2'-O-ブチル-cGMPは、結合においてcGMPと競合しなか
った。環状IMPおよび8-ブロモ-cGMPは、高濃度(100μM)
において、部分的にcGMP(2μM)の結合と競合できる。該
PDE5阻害剤の何れも、GST-cGB-PDE5の結合において、cG
MPと競合しなかった。従って、これらは、PDE5の該cGMP
結合サイトと結合しない。
合タンパクを5分間煮沸することによって調製し、その
結合カウントを、煮沸されていないタンパクと比較し
て、<1%となるようにする。濾過膜または他のデブリス
によるクエンチングについても、キャリブレーションし
た。PDE5阻害剤、スルフィド、エグジスリンド、化合物
B、化合物E、E4021およびザプリナスト、および環状ヌ
クレオチド類似体、cAMP、環状IMP、8-ブロモ-cGMP、環
状UMP、環状CMP、8-ブロモ-cAMP、2'-O-ブチル-cGMPお
よび2'-O-ブチル-cAMPを選択して、これらが該GST-cGB-
PDE5タンパクの該cGMP結合サイトに、競合的に結合でき
るか否かをテストする。その結果を図24に示した。cGMP
は、特異的にGST-cGB-PDE5タンパクと結合する。環状AM
P、cUMP、cCMP、8-ブロモ-cAMP、2'-O-ブチル-cAMPおよ
び2'-O-ブチル-cGMPは、結合においてcGMPと競合しなか
った。環状IMPおよび8-ブロモ-cGMPは、高濃度(100μM)
において、部分的にcGMP(2μM)の結合と競合できる。該
PDE5阻害剤の何れも、GST-cGB-PDE5の結合において、cG
MPと競合しなかった。従って、これらは、PDE5の該cGMP
結合サイトと結合しない。
【０１３２】しかしながら、化合物Eは、(cGMPと)競合
的にPDE5と結合する(即ち、ピークA)。(化合物Eは、ま
た(cGMPと)競合的にPDEと結合する(ピークB))。化合物E
が、PDE5のcGMP-結合サイトと結合しないことが明らか
にされているので、化合物EとcGMPとの競合的結合が存
在するという事実は、所定の化合物、例えば化合物E
が、PDE5の該cGMP触媒サイトと結合することを意味す
る。この情報は、(従来の競合的結合実験により)当業者
は容易に得ることができるが、これらは当業者が他の化
合物の設計を、より一層容易にするのに役立つ。かくし
て、ここに提示された所定の化合物の化学構造および該
cGMPの結合サイトに関する情報によって、当業者は、治
療において使用するための、他の化合物を、(本発明の
該選別基準を利用して)モデル化し、同定し、かつ選別
することができる。本発明の方法にしたがって選別され
た化合物は、「薬理組成物」なる用語の通常の意味から十
分に理解されるような、薬理組成物、即ち化合物(例え
ば、上記のような固体)と、固体または液体状態にあ
る、経口投与によって患者に放出するための、液体形状
で、IVまたはIP経路で投与するための、軟膏形状で局所
的に投与するための、あるいは坐剤処方物として経直腸
または局所投与するための製薬上許容される担体とを含
む組成物に処方することができる。経口投与用の担体
が、最も好ましい。
的にPDE5と結合する(即ち、ピークA)。(化合物Eは、ま
た(cGMPと)競合的にPDEと結合する(ピークB))。化合物E
が、PDE5のcGMP-結合サイトと結合しないことが明らか
にされているので、化合物EとcGMPとの競合的結合が存
在するという事実は、所定の化合物、例えば化合物E
が、PDE5の該cGMP触媒サイトと結合することを意味す
る。この情報は、(従来の競合的結合実験により)当業者
は容易に得ることができるが、これらは当業者が他の化
合物の設計を、より一層容易にするのに役立つ。かくし
て、ここに提示された所定の化合物の化学構造および該
cGMPの結合サイトに関する情報によって、当業者は、治
療において使用するための、他の化合物を、(本発明の
該選別基準を利用して)モデル化し、同定し、かつ選別
することができる。本発明の方法にしたがって選別され
た化合物は、「薬理組成物」なる用語の通常の意味から十
分に理解されるような、薬理組成物、即ち化合物(例え
ば、上記のような固体)と、固体または液体状態にあ
る、経口投与によって患者に放出するための、液体形状
で、IVまたはIP経路で投与するための、軟膏形状で局所
的に投与するための、あるいは坐剤処方物として経直腸
または局所投与するための製薬上許容される担体とを含
む組成物に処方することができる。経口投与用の担体
が、最も好ましい。
【０１３３】当分野において周知の如く、経口投与用の
薬理組成物における、製薬上許容される担体は、カプセ
ル、錠剤、ピル、粉剤、トローチおよび顆粒剤を包含す
る。このような固体投与剤形において、該担体は、少な
くとも一種の不活性な希釈剤、例えばスクロース、ラク
トースまたは澱粉を含むことができる。このような担体
は、また通常の実務であるように、希釈剤以外の付随的
な物質、例えばステアリン酸マグネシウム等の滑剤を含
む。カプセル、錠剤、トローチおよびピルの場合には、
該担体はまた緩衝剤を含むこともできる。錠剤、ピルお
よび顆粒剤等の担体は、該錠剤、ピルまたは顆粒剤の表
面に、腸溶性被覆をもつように調製することもできる。
あるいはまた、該腸溶性被覆を有する化合物を圧縮し
て、錠剤、ピルまたは顆粒剤とすることも可能であり、
またこの錠剤、ピルまたは顆粒剤を患者に投与すること
ができる。好ましい腸溶性被覆は、結腸のpHにおいて溶
解または崩壊する、シェラックまたはユードラゲット(E
udraget) S等を含む。
薬理組成物における、製薬上許容される担体は、カプセ
ル、錠剤、ピル、粉剤、トローチおよび顆粒剤を包含す
る。このような固体投与剤形において、該担体は、少な
くとも一種の不活性な希釈剤、例えばスクロース、ラク
トースまたは澱粉を含むことができる。このような担体
は、また通常の実務であるように、希釈剤以外の付随的
な物質、例えばステアリン酸マグネシウム等の滑剤を含
む。カプセル、錠剤、トローチおよびピルの場合には、
該担体はまた緩衝剤を含むこともできる。錠剤、ピルお
よび顆粒剤等の担体は、該錠剤、ピルまたは顆粒剤の表
面に、腸溶性被覆をもつように調製することもできる。
あるいはまた、該腸溶性被覆を有する化合物を圧縮し
て、錠剤、ピルまたは顆粒剤とすることも可能であり、
またこの錠剤、ピルまたは顆粒剤を患者に投与すること
ができる。好ましい腸溶性被覆は、結腸のpHにおいて溶
解または崩壊する、シェラックまたはユードラゲット(E
udraget) S等を含む。
【０１３４】薬理組成物中の製薬上許容される担体は、
経口投与用の液状投与形式、例えば当分野で通常使用さ
れる水等の不活性希釈剤を含む、製薬上許容されるエマ
ルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを
包含する。このような不活性希釈剤以外に、組成物は湿
潤剤、乳化剤および懸濁剤、並びに甘味料、香味料およ
び芳香剤等の添加剤を含むこともできる。IVまたはIP投
与用の薬理組成物における製薬上許容される担体は、一
般的な製薬用塩水溶液を含む。局所投与用の薬理組成物
における製薬上許容される担体は、DMSO、アルコールま
たはプロピレングリコール等を含み、これらは該薬物
を、乾燥することなく、皮膚上の所定の位置に保持する
ためのパッチまたはその他の液体保持材料と共に使用す
ることができる。経直腸投与用の薬理組成物における製
薬上許容される担体は、好ましくは坐剤であり、これは
本発明の化合物に加えて、ココアバターまたは坐剤ワッ
クスもしくはゲル等の賦形剤を含むことができる。
経口投与用の液状投与形式、例えば当分野で通常使用さ
れる水等の不活性希釈剤を含む、製薬上許容されるエマ
ルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを
包含する。このような不活性希釈剤以外に、組成物は湿
潤剤、乳化剤および懸濁剤、並びに甘味料、香味料およ
び芳香剤等の添加剤を含むこともできる。IVまたはIP投
与用の薬理組成物における製薬上許容される担体は、一
般的な製薬用塩水溶液を含む。局所投与用の薬理組成物
における製薬上許容される担体は、DMSO、アルコールま
たはプロピレングリコール等を含み、これらは該薬物
を、乾燥することなく、皮膚上の所定の位置に保持する
ためのパッチまたはその他の液体保持材料と共に使用す
ることができる。経直腸投与用の薬理組成物における製
薬上許容される担体は、好ましくは坐剤であり、これは
本発明の化合物に加えて、ココアバターまたは坐剤ワッ
クスもしくはゲル等の賦形剤を含むことができる。
【０１３５】本発明の製薬上許容される担体および化合
物は、患者に投与するための単位投与形式で薬理組成物
に処方される。該単位投与剤における活性成分(即ち、
本発明に従って選別された化合物)の投与レベルは、所
定の投与方法(経口または経直腸)に従って、腫瘍形成-
排除活性を達成するのに有効な活性成分の量を保証する
ように変えることができる。従って、選択された投与レ
ベルは、投与される該活性化合物の特性(例えば、そのI
C50、これは容易に確認できる)、投与経路、所定の治療
期間、およびその他の因子に依存する。望ましい場合に
は、該単位投与形は、活性化合物の1日当たりの必要量
を、単一の投与剤に含むか、あるいは複数の投与量に分
割、例えば1日当たり2~4回に分割するように処方でき
る。IV投与については、投与のための初期投与量は、平
均的な成人の男性の血漿含量(即ち、約4L)中にIC50を達
成するような投与量に基づいて、確認することができ
る。本発明に従って選別された活性化合物の初期投与量
は、0.5~600mgの範囲であり得る。本発明の薬理組成物
は、適用、使用上の指示等を含む適当な印刷された資料
(包装用の差込等)と共に、容器(例えば、箱またはビン
もしくはその両者)内に収容することが好ましい。上記
の教示に照らして、明らかに、本発明の種々の改良並び
に変更が可能である。従って、上記本発明の特許請求の
範囲内で、本明細書に具体的に記載した以外の方法で本
発明を実施できるものと理解すべきである。
物は、患者に投与するための単位投与形式で薬理組成物
に処方される。該単位投与剤における活性成分(即ち、
本発明に従って選別された化合物)の投与レベルは、所
定の投与方法(経口または経直腸)に従って、腫瘍形成-
排除活性を達成するのに有効な活性成分の量を保証する
ように変えることができる。従って、選択された投与レ
ベルは、投与される該活性化合物の特性(例えば、そのI
C50、これは容易に確認できる)、投与経路、所定の治療
期間、およびその他の因子に依存する。望ましい場合に
は、該単位投与形は、活性化合物の1日当たりの必要量
を、単一の投与剤に含むか、あるいは複数の投与量に分
割、例えば1日当たり2~4回に分割するように処方でき
る。IV投与については、投与のための初期投与量は、平
均的な成人の男性の血漿含量(即ち、約4L)中にIC50を達
成するような投与量に基づいて、確認することができ
る。本発明に従って選別された活性化合物の初期投与量
は、0.5~600mgの範囲であり得る。本発明の薬理組成物
は、適用、使用上の指示等を含む適当な印刷された資料
(包装用の差込等)と共に、容器(例えば、箱またはビン
もしくはその両者)内に収容することが好ましい。上記
の教示に照らして、明らかに、本発明の種々の改良並び
に変更が可能である。従って、上記本発明の特許請求の
範囲内で、本明細書に具体的に記載した以外の方法で本
発明を実施できるものと理解すべきである。
【図１】DEAE-トリスアクリル(Trisacryl) Mカラムから
の溶出液をアッセイして得た、SW480腫瘍形成細胞由来
の、cGMPホスホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラフ
である。
の溶出液をアッセイして得た、SW480腫瘍形成細胞由来
の、cGMPホスホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラフ
である。
【図２】DEAE-トリスアクリルMカラムからの溶出液をア
ッセイして得た、SW480腫瘍形成細胞由来の、再重層処
理したcGMPホスホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラ
フである。
ッセイして得た、SW480腫瘍形成細胞由来の、再重層処
理したcGMPホスホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラ
フである。
【図３】本発明の新規なPDEの速度論的な挙動を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図４】精製されたシクロオキシゲナーゼ活性に及ぼ
す、スリンダクのスルフィド誘導体およびスリンダクの
スルフォン誘導体(a.k.a.エグジスリンド)の作用を示
す。
す、スリンダクのスルフィド誘導体およびスリンダクの
スルフォン誘導体(a.k.a.エグジスリンド)の作用を示
す。
【図５】COX阻害に及ぼす、テスト化合物BおよびEの作
用を示す。
用を示す。
【図６】スリンダクスルフィドおよびエグジスリンド
の、培養した腫瘍細胞から精製したPDE4およびPDE5に及
ぼす阻害作用を示す。
の、培養した腫瘍細胞から精製したPDE4およびPDE5に及
ぼす阻害作用を示す。
【図７Ａ】HT-29細胞中の環状ヌクレオチドレベルに対
する、スリンダクスルフィドの作用を示す。
する、スリンダクスルフィドの作用を示す。
【図７Ｂ】HT-29細胞中の環状ヌクレオチドレベルに対
する、スリンダクスルフィドの作用を示す。
する、スリンダクスルフィドの作用を示す。
【図８】化合物Bのホスホジエステラーゼ阻害活性を示
す。
す。
【図９】化合物Eのホスホジエステラーゼ阻害活性を示
す。
す。
【図１０Ａ】HT-29細胞のアポトーシスおよび壊死に与
える、スリンダクスルフィドの作用を示す。
える、スリンダクスルフィドの作用を示す。
【図１０Ｂ】HT-29細胞のアポトーシスおよび壊死に与
える、エグジスリンドの作用を示す。
える、エグジスリンドの作用を示す。
【図１１Ａ】エグジスリンドの、HT-29細胞成長阻害お
よびDNAフラグメント化により測定されたアポトーシス
誘発に及ぼす作用を示す。
よびDNAフラグメント化により測定されたアポトーシス
誘発に及ぼす作用を示す。
【図１１Ｂ】スリンダクスルフィドの、HT-29細胞成長
阻害およびDNAフラグメント化により測定されたアポト
ーシス誘発に及ぼす作用を示す。
阻害およびDNAフラグメント化により測定されたアポト
ーシス誘発に及ぼす作用を示す。
【図１２】化合物Eのアポトーシス誘発特性を示す。
【図１３】化合物Bのアポトーシス誘発特性を示す。
【図１４】スリンダクスルフィドおよびエグジスリンド
の、腫瘍細胞成長に及ぼす作用を示す。
の、腫瘍細胞成長に及ぼす作用を示す。
【図１５Ａ】スリンダクスルフィドおよびコントロール
(DMSO)の、成長阻害活性を示す。
(DMSO)の、成長阻害活性を示す。
【図１５Ｂ】スリンダクスルフィドおよびコントロール
(DMSO)の、アポトーシス誘発活性を示す。
(DMSO)の、アポトーシス誘発活性を示す。
【図１６】化合物Eの成長阻害活性を示す。
【図１７】スリンダク代謝産物による、マウス乳腺器官
培養物における前癌性、腫瘍性病巣の阻害を示す。
培養物における前癌性、腫瘍性病巣の阻害を示す。
【図１８Ａ】cGMPの添加されていない、薬物処理細胞溶
解物由来の、SW480細胞溶解物のSDSタンパクゲルを示
し、ここで細胞は、培養物中で48時間、DMSO (0.03%、
レーン1および2)、エグジスリンド(200、400および600
μM、レーン3、4、5)、およびE4021(0.1、1および10μ
M、レーン6、7、8)で処理した。
解物由来の、SW480細胞溶解物のSDSタンパクゲルを示
し、ここで細胞は、培養物中で48時間、DMSO (0.03%、
レーン1および2)、エグジスリンド(200、400および600
μM、レーン3、4、5)、およびE4021(0.1、1および10μ
M、レーン6、7、8)で処理した。
【図１８Ｂ】添加されたcGMPの存在下で、薬物処理細胞
溶解物由来の、SW480細胞溶解物の、SDS(X-線フィルム
暴露)ゲルPKGアッセイを示し、ここでは細胞を、培養物
中で48時間、DMSO (0.03%、レーン1および2)、エグジス
リンド(200、400および600μM、レーン3、4、5)、およ
びE4021(0.1、1および10μM、レーン6、7、8)で処理し
た。
溶解物由来の、SW480細胞溶解物の、SDS(X-線フィルム
暴露)ゲルPKGアッセイを示し、ここでは細胞を、培養物
中で48時間、DMSO (0.03%、レーン1および2)、エグジス
リンド(200、400および600μM、レーン3、4、5)、およ
びE4021(0.1、1および10μM、レーン6、7、8)で処理し
た。
【図１９】腫瘍形成細胞中のβ-カテニンおよびPKGレベ
ルに与える、エグジスリンドの効果に関する、ウエスタ
ンブロット実験の結果を、コントロールと比較して示し
た棒グラフである。
ルに与える、エグジスリンドの効果に関する、ウエスタ
ンブロット実験の結果を、コントロールと比較して示し
た棒グラフである。
【図２０】DEAE-トリスアクリルMカラムからの溶出液を
アッセイして得た、HTB-26腫瘍形成細胞由来の、cGMPホ
スホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラフである。
アッセイして得た、HTB-26腫瘍形成細胞由来の、cGMPホ
スホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラフである。
【図２１】低および高基質濃度をもつ、DEAE-トリスア
クリルMカラムからの溶出液をアッセイして得た、HTB-2
6腫瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジエステラーゼのcGM
P活性を示すグラフである。
クリルMカラムからの溶出液をアッセイして得た、HTB-2
6腫瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジエステラーゼのcGM
P活性を示すグラフである。
【図２２】DEAE-トリスアクリルMカラムからの溶出液を
アッセイして得た、LnCAP腫瘍形成細胞由来の、cGMPホ
スホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラフである。
アッセイして得た、LnCAP腫瘍形成細胞由来の、cGMPホ
スホジエステラーゼのcGMP活性を示すグラフである。
【図２３】低および高基質濃度をもつ、DEAE-トリスア
クリルMカラムからの溶出液をアッセイして得た、LnCAP
腫瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジエステラーゼのcGMP
活性を示すグラフである。
クリルMカラムからの溶出液をアッセイして得た、LnCAP
腫瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジエステラーゼのcGMP
活性を示すグラフである。
【図２４】環状ヌクレオチド類似体および選別されたPD
E5阻害剤に対する、PDE5の非-触媒性cGMP結合サイト
の、特異的結合性を示すグラフである。
E5阻害剤に対する、PDE5の非-触媒性cGMP結合サイト
の、特異的結合性を示すグラフである。
【図２５】バッファー中にエチレングリコールを使用し
た、DEAE-トリスアクリルMカラムからの溶出液をアッセ
イして得た、SW480腫瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジ
エステラーゼのcGMP活性を示すグラフである。
た、DEAE-トリスアクリルMカラムからの溶出液をアッセ
イして得た、SW480腫瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジ
エステラーゼのcGMP活性を示すグラフである。
【図２６】DEAE-トリスアクリルMカラムからの溶出液を
アッセイして得た、回転ボトル中で生育させたSW480腫
瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジエステラーゼのcGMP活
性を示すグラフである。
アッセイして得た、回転ボトル中で生育させたSW480腫
瘍形成細胞由来の、cGMPホスホジエステラーゼのcGMP活
性を示すグラフである。
【図２７Ａ】50μMの化合物Iで処理した後の、LNCaP細
胞培養物中の、ヒストン-結合フラグメント化DNAの量に
おける、時間依存性の増加を示す。
胞培養物中の、ヒストン-結合フラグメント化DNAの量に
おける、時間依存性の増加を示す。
【図２７Ｂ】処理の4日目までDNAフラグメント化に影響
を与えなかった、化合物I(50μM)による、PrEC前立腺細
胞の処理過程を示す。
を与えなかった、化合物I(50μM)による、PrEC前立腺細
胞の処理過程を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 33/574 Ｚ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/54 (72)発明者 ビン ズー アメリカ合衆国 アラバマ州 36608 モ ービル ヒルクレスト ロード 207 ア パートメント 123 (72)発明者 ハン リ アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19067 ヤードリー コーナーストーン ドライヴ 21102 (72)発明者 ダブリュー ジョセフ トンプソン アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 18901 ドイルスタウン メイプル アベ ニュー 443 (72)発明者 リファット パムック アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19477 スプリング ハウス ポンプ ハ ウス ドライヴ ２ (72)発明者 ゲアリー エイ ピアッツァ アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 18901 ドイルスタウン エヴァーヴィユ ー ドライヴ 4600
Claims (61)
- 【請求項１】 腫瘍性疾患の治療用組成物であって、製
薬上許容される担体と、ある化合物のシクロオキシゲナ
ーゼ(COX)阻害活性を決定し、該化合物のPDE阻害活性を
測定し、ここで該PDEは、(a) cAMPを越えるcGMP特異
性、(b) cGMP基質の存在下で、正の協働的運動学的な
挙動、(c) cGMPに対するサブミクロモルアフィニティ
ー、および(d) 精製cGMP−依存性プロテインキナーゼ
とのインキュベーションに対して不活性であることによ
って特徴付けられ、および腫瘍性疾患の治療に対して、
該PDE活性よりも低いCOX阻害活性をもつ化合物を選択す
ることによって、選別される化合物とを含むことを特徴
とする、上記薬理組成物。 - 【請求項２】 更に、該化合物が、腫瘍性細胞培養物中
での、腫瘍細胞の生育を阻害するか否かを決定し、かつ
腫瘍性細胞成長を阻害する化合物を、腫瘍性疾患治療の
ために選別することによって、該化合物を選別する、請
求項1記載の薬理組成物。 - 【請求項３】 該化合物が、アポトーシスを誘発するか
否かを評価することによって、成長阻害を確認する、請
求項2記載の薬理組成物。 - 【請求項４】 腫瘍性疾患の治療用組成物であって、製
薬上許容される担体と、ある化合物の腫瘍性細胞成長阻
害活性を決定し、該化合物のPDE阻害活性を測定し、こ
こで該PDEは、(a) cAMPを越えるcGMP特異性、(b) cGM
P基質の存在下での、正の協働的運動学的な挙動、(c)
cGMPに対するサブミクロモルアフィニティー、および
(d) 精製cGMP−依存性プロテインキナーゼとのインキ
ュベーションに対して不活性であることによって特徴付
けられ、および(e) 腫瘍性細胞成長阻害活性および該P
DE阻害活性をもつ化合物の選択によって、選別される化
合物とを含むことを特徴とする、上記薬理組成物。 - 【請求項５】 更に、該化合物が腫瘍性細胞内でアポト
ーシスを誘発するか否かを決定し、かつアポトーシスを
誘発する化合物を選別する工程をも含む、請求項4記載
の薬理組成物。 - 【請求項６】 更に、該化合物の該COX阻害活性を測定
し、かつ該PDEに対する該化合物の阻害活性に対して、
低いCOX阻害活性を示す化合物を選別する工程を含む、
請求項5記載の薬理組成物。 - 【請求項７】 腫瘍性疾患の治療用組成物であって、製
薬上許容される担体と、ある化合物のPDE阻害活性を測
定し、ここで該PDEは、(a) cAMPを越えるcGMP特異性、
(b) cGMP基質の存在下での、正の協働的運動学的な挙
動、(c) cGMPに対するサブミクロモルアフィニティ
ー、および(d) 精製cGMP−依存性プロテインキナーゼ
とのインキュベーションに対して不活性であることによ
って特徴付けられ、および(e) 該阻害活性をもつ化合
物の選択によって、選別される化合物とを含むことを特
徴とする、上記薬理組成物。 - 【請求項８】 更に、該化合物が腫瘍性細胞内でアポト
ーシスを誘発するか否かを決定し、かつアポトーシス−
誘発活性を有する化合物を選択することによって、該化
合物を選別する、請求項7記載の薬理組成物。 - 【請求項９】 腫瘍性疾患の治療用組成物であって、製
薬上許容される担体と、ある化合物のシクロオキシゲナ
ーゼ(COX)阻害活性を決定し、該化合物のPDE2阻害活性
を決定し、かつ腫瘍性疾患の治療のために、該PDE活性
よりも低いCOX阻害活性をもつ化合物を選択することに
よって、選別される化合物とを含む、上記薬理組成物。 - 【請求項１０】 更に、該化合物が、腫瘍性細胞培養物
中で腫瘍細胞を阻害するか否かを決定し、かつ腫瘍性疾
患の治療のために、腫瘍性細胞成長を阻害する化合物を
選択することによって、該化合物を選別する、請求項9
記載の薬理組成物。 - 【請求項１１】 該化合物がアポトーシスを誘発するか
否かを評価することによって、該成長阻害性を確認す
る、請求項10記載の薬理組成物。 - 【請求項１２】 腫瘍性疾患の治療用組成物であって、
製薬上許容される担体と、ある化合物の腫瘍性細胞成長
阻害活性を決定し、該化合物のPDE2阻害活性を決定し、
かつ腫瘍性細胞成長阻害活性およびPDE阻害活性をもつ
化合物を選択することによって、選別される化合物とを
含む、上記薬理組成物。 - 【請求項１３】 更に、該化合物が、腫瘍性細胞内でア
ポトーシスを誘発するか否かを決定し、かつアポトーシ
スを誘発する化合物を選択することを含む、請求項12記
載の薬理組成物。 - 【請求項１４】 更に、該化合物がCOX阻害活性をもつか
否かを決定し、かつ該化合物の、該PDEに対する阻害活
性に対して低い、COX阻害活性をもつ化合物を選択する
ことをも含む、請求項13記載の薬理組成物。 - 【請求項１５】 腫瘍性疾患の治療用組成物であって、
製薬上許容される担体と、ある化合物のPDE2阻害活性を
決定し、かつ該阻害活性をもつ化合物を選択することに
よって、選別される化合物とを含む、上記薬理組成物。 - 【請求項１６】 更に、該化合物が、腫瘍性細胞内でア
ポトーシスを誘発するか否かを決定し、かつアポトーシ
ス−誘発活性をもつ化合物を選択することを含む、請求
項15記載の薬理組成物。 - 【請求項１７】 腫瘍性疾患の治療用化合物を選別する
方法であって、該化合物のシクロオキシゲナーゼ(COX)
阻害活性を測定する工程と、該化合物のPDE2阻害活性を
測定する工程と、腫瘍性疾患の治療のために、該PDE活
性よりも低いCOX阻害活性をもつ化合物を選別する工程
を含むことを特徴とする、上記方法。 - 【請求項１８】 更に、該化合物が、腫瘍性細胞培養物
中で、腫瘍細胞の生育を阻害するか否かを決定し、かつ
腫瘍性細胞成長を阻害する化合物を、腫瘍性疾患治療の
ために選択することによって、該化合物を選別する、請
求項17記載の方法。 - 【請求項１９】 該化合物が、アポトーシスを誘発する
か否かを評価することによって、成長阻害性を確認す
る、請求項18記載の方法。 - 【請求項２０】 腫瘍性疾患の治療用化合物を選別する
方法であって、該化合物の腫瘍性細胞の成長阻害活性を
測定する工程と、該化合物のPDE2阻害活性を測定する工
程と、該腫瘍性細胞の成長阻害活性および該PDEの阻害
活性を呈する化合物を選別する工程とを含む、ことを特
徴とする、上記方法。 - 【請求項２１】 更に、該化合物が腫瘍性細胞内でアポ
トーシスを誘発するか否かを決定し、かつアポトーシス
を誘発する化合物を選別する工程をも含む、請求項20記
載の方法。 - 【請求項２２】 更に、該化合物の該COX阻害活性を測
定し、かつ該PDEに対する該化合物の阻害活性に対し
て、低いCOX阻害活性を示す化合物を選別する工程をも
含む、請求項21記載の方法。 - 【請求項２３】 腫瘍性疾患の治療用化合物を選別する
方法であって、該化合物のPDE2阻害活性を測定する工程
と、該阻害活性をもつ化合物を選別する工程とを含む、
ことを特徴とする上記方法。 - 【請求項２４】 更に、該化合物が腫瘍性細胞内でアポ
トーシスを誘発するか否かを決定し、かつアポトーシス
−誘発活性を有する化合物を選択することによって、該
化合物を選別する、請求項23記載の方法。 - 【請求項２５】 腫瘍性疾患の治療用化合物を同定する
方法であって、該化合物のシクロオキシゲナーゼ(COX)
阻害活性を測定する工程と、該化合物のPDE阻害活性を
測定する工程と、ここで該PDEは、(a) cAMPを越えるcG
MP特異性、(b) cGMP基質の存在下で、正の協働的運動
学的な挙動、(c) cGMPに対するサブミクロモルアフィ
ニティー、および(d) 精製cGMP−依存性プロテインキ
ナーゼとのインキュベーションに対して不活性であるこ
とによって特徴付けられる、該PDE活性よりも低いCOX阻
害活性をもつ化合物を選択する工程、を含むことを特徴
とする、上記方法。 - 【請求項２６】 更に、該化合物が、培養物中で、腫瘍
細胞の生育を阻害するか否かを決定する工程と、腫瘍細
胞成長を阻害する化合物を、腫瘍性疾患治療のために選
別する工程を含む、請求項25記載の方法。 - 【請求項２７】 更に、(a) 該化合物が腫瘍細胞のアポ
トーシスを誘発するか否かを決定する工程と、(b) 腫瘍
性疾患治療のために、アポトーシスを誘発する化合物を
選別する工程をも含む、請求項25記載の方法。 - 【請求項２８】 腫瘍性疾患の治療用化合物を選択する
方法であって、該化合物の成長阻害活性を測定する工程
と、該化合物のPDE阻害活性を測定する工程と、ここで
該PDEは、(a) cAMPを越えるcGMP特異性、(b) cGMP基
質の存在下で、正の協働的運動学的な挙動、(c) cGMP
に対するサブミクロモルアフィニティー、および(d)
精製cGMP−依存性プロテインキナーゼとのインキュベー
ションに対して不活性であることによって特徴付けられ
る、該PDE阻害活性および成長阻害活性を呈する化合物
を選択する工程、を含むことを特徴とする、上記方法。 - 【請求項２９】 腫瘍性疾患の治療能力をもつ化合物を
スクリーニングする方法であって、テスト化合物のPDE
阻害活性を測定する工程、ここで該PDEは、(a) cAMPを
越えるcGMP特異性、(b) cGMP基質の存在下で、正の協
働的運動学的な挙動、(c) cGMPに対するサブミクロモ
ルアフィニティー、および(d) 精製cGMP−依存性プロ
テインキナーゼとのインキュベーションに対して不活性
であることによって特徴付けられる、および該阻害活性
をもつ化合物を選択する工程を含むことを特徴とする、
上記方法。 - 【請求項３０】 更に、該化合物が細胞内でアポトーシ
スを誘発するか否かを決定し、かつアポトーシス−誘発
活性を有する化合物を選択する工程をも含む請求項29記
載の方法。 - 【請求項３１】 更に、該選択された化合物が、プロス
タグランジン合成を阻害するか否かを決定する工程およ
び微弱なプロスタグランジン阻害活性もをつ化合物を選
別する工程をも含む、請求項29記載の方法。 - 【請求項３２】 cGMP−特異的PDE活性を、PDE5および該
新規なPDEを含有する腫瘍性細胞系から分離し、該結合
したPDE単離体を、該新規なPDEを阻害しない濃度にて、
PDE5阻害剤に暴露することによって、該PDE5活性を阻害
し、かつ残りのcGMP活性に対する該テスト化合物の阻害
活性を確認することによって、該PDE活性を確認し、か
くして該テスト化合物の、該新規なPDEに対する阻害活
性を確認する、請求項29記載の方法。 - 【請求項３３】 (a) cAMPを越えるcGMP特異性、(b) c
GMP基質の存在下で、正の協働的運動学的な挙動、(c)
cGMPに対するサブミクロモルアフィニティー、および
(d) 精製cGMP−依存性プロテインキナーゼとのインキ
ュベーションに対して不活性であることによって特徴付
けられる、ことを特徴とする、単離されたホスホジエス
テラーゼ。 - 【請求項３４】 更に、ザプリナストおよびE4021による
阻害に対する、低い感受性によって特徴付けられる、請
求項33記載の単離されたホスホジエステラーゼ。 - 【請求項３５】 更に、アニオン交換クロマトグラフィ
ーによって、古典的なPDE5活性から分離できる、請求項
33記載の単離されたホスホジエステラーゼ。 - 【請求項３６】 更に、カルシウム/カルモジュリンによ
って実質上活性化されない、請求項35記載の単離された
ホスホジエステラーゼ。 - 【請求項３７】 更に、ロリプラム、ビンポセチンおよ
びインドリダンに対して感受性を持たない、請求項36記
載の単離されたホスホジエステラーゼ。 - 【請求項３８】 腫瘍性疾患の治療用の薬理組成物であ
って、製薬上許容される担体と、治療すべき該腫瘍性疾
患に対する、ある化合物の抗−腫瘍活性を評価し、該化
合物が、治療すべき該腫瘍性疾患におけるPKG活性を高
めるか否かを評価し、かつ抗−腫瘍活性および治療すべ
き該腫瘍性疾患におけるPKG活性を高める能力を呈する
化合物を選択することによって、選別される化合物とを
含むことを特徴とする、上記薬理組成物。 - 【請求項３９】 更に、該化合物が、PDE5を阻害するか
否かを評価し、かつPDE5を阻害する化合物を選択するこ
とによって、該化合物を選別する、請求項38記載の薬理
組成物。 - 【請求項４０】 更に、該化合物が、治療すべき該腫瘍
性疾患におけるβ-カテニンを還元するか否かを評価
し、かつβ-カテニンを還元する化合物を選択すること
によって、該化合物を選別する、請求項38記載の薬理組
成物。 - 【請求項４１】 更に、該化合物が、cGMP-特異的ホスホ
ジエステラーゼ(PDE)を阻害するか否かを評価し、かつ
該PDEを阻害する化合物を選択することによって、該化
合物を選別する、請求項38記載の薬理組成物。 - 【請求項４２】 更に、該化合物が、PKG発現性を高める
か否かを決定し、かつPKG発現を高める場合に、該化合
物を選択することによって、該化合物を選別する、請求
項38記載の薬理組成物。 - 【請求項４３】 更に、該化合物が、PKG活性化能を高め
るか否かを決定し、かつPKG活性化能を高める場合に、
該化合物を選択することによって、該化合物を選別す
る、請求項38記載の薬理組成物。 - 【請求項４４】 更に、該化合物が、PDE2を阻害するか
否かを決定し、かつPDE2を阻害する化合物を選択するこ
とによって、該化合物を選別する、請求項38記載の薬理
組成物。 - 【請求項４５】 腫瘍性疾患の治療用薬理組成物であっ
て、製薬上許容される担体と、ある化合物とを含み、該
化合物の選択が、治療すべき該腫瘍性疾患における、完
全な腫瘍性細胞内のPKG活性を高めるか否かを評価し、
腫瘍性細胞内のβ-カテニンを還元するか否かを評価
し、および完全な腫瘍性細胞内のPKG活性を高め、かつ
治療すべき該腫瘍性疾患におけるβ-カテニンを減ずる
化合物を選択することによって行われることを特徴とす
る、上記薬理組成物。 - 【請求項４６】 腫瘍性疾患の治療用薬理組成物であっ
て、製薬上許容される担体と、ある化合物とを含み、該
化合物の選別が、該腫瘍性疾患内のPKG活性を高める化
合物を選択し、かつ該化合物の、該腫瘍性増殖阻害活性
を評価することによって行われ、PKG活性を高め、かつ
腫瘍性増殖阻害活性をもつ化合物が、正常な細胞の成長
を実質的に阻害すること無しに、腫瘍形成を阻害する能
力を有する、ことを特徴とする、上記薬理組成物。 - 【請求項４７】 腫瘍性疾患の治療用薬理組成物であっ
て、製薬上許容される担体と、ある化合物とを含み、該
化合物の選別が、そのシクロオキシゲナーゼ(COX)阻害
活性を測定し、腫瘍細胞内でPKG活性を高めるか否かを
決定し、腫瘍性疾患を治療するために、該化合物のPKG
活性を高める能力よりも低いCOX阻害活性をもつ化合物
を選択することによって行われる、ことを特徴とする上
記薬理組成物。 - 【請求項４８】 腫瘍性疾患の治療用薬理組成物であっ
て、製薬上許容される担体と、ある化合物とを含み、該
化合物の選別が、その腫瘍形成細胞の成長阻害活性を測
定し、腫瘍細胞内でPKG活性を高めるか否かを決定し、
かつ腫瘍形成細胞の成長阻害活性および腫瘍細胞内でPK
G活性の増大を示す化合物を選択することによって行わ
れる、ことを特徴とする上記薬理組成物。 - 【請求項４９】 腫瘍性疾患の治療用薬理組成物であっ
て、製薬上許容される担体と、PKGが、ある化合物で処
置された腫瘍増殖において、β-カテニンのホスホリル
化を生じるか否かを評価し、かつ治療すべき腫瘍形成を
治療するための化合物として、PKGがβ-カテニンのホス
ホリル化を生じる化合物を選択することによって、選別
される化合物とを含むことを特徴とする、上記薬理組成
物。 - 【請求項５０】 治療すべき腫瘍形成を治療するための
化合物の選別方法であって、(a) 治療すべき腫瘍形成に
対する、該化合物の抗-腫瘍形成活性を評価し、(b) 該
化合物が、治療すべき該腫瘍形成におけるPKG活性を高
めるか否かを評価し、および(c) 抗-腫瘍形成活性およ
び治療すべき該腫瘍形成におけるPKG活性を高める能力
を示す化合物を選択する工程を含む、ことを特徴とする
上記方法。 - 【請求項５１】 更に、該化合物が、PDE5を阻害するか
否かを評価し、かつPDE5を阻害する化合物を選別する工
程をも含む、請求項50記載の方法。 - 【請求項５２】 更に、該化合物が、治療すべき該腫瘍
形成における、β-カテニンを還元するか否かを評価
し、かつβ-カテニンを還元する化合物を選別する工程
をも含む、請求項50記載の方法。 - 【請求項５３】 更に、該化合物が、cGMP-特異的ホスホ
ジエステラーゼ(PDE)を阻害するか否かを評価し、かつ
該PDEを阻害する化合物を選別する工程をも含む、請求
項50記載の方法。 - 【請求項５４】 更に、該化合物が、PKG発現性を高める
か否かを評価し、かつPKG発現性を高める場合には、該
化合物を選択する工程をも含む、請求項50記載の方法。 - 【請求項５５】 更に、該化合物が、PKG活性化能を高め
るか否かを評価し、かつPKG活性化能を高める場合に
は、該化合物を選択する工程をも含む、請求項50記載の
方法。 - 【請求項５６】 更に、該化合物が、PDE2を阻害するか
否かを評価し、かつPDE2を阻害する化合物を選択する工
程をも含む、請求項50記載の方法。 - 【請求項５７】 治療すべき腫瘍形成を治療するための
化合物の選別方法であって、(a) 該化合物が、治療すべ
き該腫瘍形成における、完全な腫瘍形成細胞中のPKG活
性を高めるか否かを評価し、(b) 該化合物が、腫瘍形成
細胞中のβ-カテニンを還元するか否かを評価し、およ
び(c) 完全な腫瘍形成細胞中のPKG活性を高め、かつ治
療すべき該腫瘍形成における、β-カテニンを減少させ
る化合物を選択する工程を含む、ことを特徴とする上記
方法。 - 【請求項５８】 腫瘍形成を治療する能力を持つ化合物
を同定する方法であって、該腫瘍形成におけるPKG活性
を高める化合物を選別し、および該化合物の腫瘍形成細
胞の増殖阻害活性を評価する工程を含み、PKG活性を高
め、かつ腫瘍形成細胞の増殖阻害活性をもつ化合物が、
正常な細胞の成長を実質的に阻害すること無しに、腫瘍
形成を阻害する能力を持つ、ことを特徴とする上記同定
方法。 - 【請求項５９】 腫瘍形成を治療する能力を持つ化合物
を同定する方法であって、該化合物のシクロオキシゲナ
ーゼ(COX)阻害活性を測定し、および該化合物が、腫瘍
形成細胞中のPKG活性を高めるか否かを決定する工程を
含み、低いCOX阻害活性およびPKG活性における増大が、
該化合物が、腫瘍形成に対する治療能を有する指標であ
る、ことを特徴とする上記同定方法。 - 【請求項６０】 腫瘍形成を治療するための化合物を選
別する方法であって、該化合物の腫瘍形成細胞の成長阻
害活性を測定し、該化合物が、腫瘍形成細胞における、
PKG活性を高めるか否かを決定し、および腫瘍形成細胞
の成長阻害活性および腫瘍形成細胞における、PKG活性
の増加を示す化合物を選別する工程を含む、ことを特徴
とする、上記選別方法。 - 【請求項６１】 治療すべき腫瘍形成を処置するための
化合物を選別する方法であって、該化合物で治療すべき
該腫瘍形成において、PKGがβ-カテニンをホスホリル化
するか否かを評価し、および治療すべき該腫瘍形成を処
置するための化合物として、PKGがβ-カテニンをホスホ
リル化する化合物を選択することを特徴とする、上記選
別方法。
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