DE69912808T2

DE69912808T2 - Verwendung von Hymenialdisin und dessen Derivaten zur Herstellung therapeutischer Mittel

Info

Publication number: DE69912808T2
Application number: DE69912808T
Authority: DE
Inventors: Laurent Meijer
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: US20030105075A1; US7098204B2; EP1106180B1; WO2001041768A9; JP2004500356A; DE69912808D1; ATE253918T1; AU2365701A; EP1106180A1; WO2001041768A3; CA2384982A1; WO2001041768A2; EP1235578A2; ES2213996T3

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Hymenialdisin oder dessen Derivaten bei der Herstellung von therapeutischen Mitteln, die in der Lage sind, die Zellteilung oder die intrazellulare Signaltransduktion zu blockieren.
Besonders betrifft sie die Verwendung von Hymenialdisin (hiernach als HD bezeichnet) oder dessen Derivaten bei der Herstellung von Proteinkinaseinhibitoren.
Proteinkinasen sind beteiligt bei der Zellsteuerung, besonders bei der Proteinphosphorylierung.
Cyclin-abhängige Kinaseproteine (abgekürzt CDKs) sind beteiligt bei der Zellzyklussteuerung (CDK1, 2, 3, 4, 6 und 7), in der thyniocyten Apoptosis (CDK2) in neuronalen Funktionen (CDK5) in der Transkriptionssteuerung (CDK7, 8 und 9) (Übersichten in [1, 2, 3], wobei die Liste der Referenzen am Ende der Beschreibung folgt). In Nervengeweben phosphoryliert CDK5/p35 die Mikrotubulus-assoziierten Proteine tau und MAP-1B, die Pak1-Kinase und Neurofilament-Untereinheiten. Intensives Sieben hat innerhalb weniger Jahre zur Identifizierung einer Reihe von chemischen Inhibitoren von CDKs geführt, wie Olomucin, Roscovitin, Purvalanol, Flavopiridol, Indirubine, Paullone. Einige dieser Verbindungen zeigen eine bemerkenswerte Selektivität und Wirksamkeit. Viele wurden mit CDK2 ko-kristallisiert, und ihre Wechselwirkungen mit der ATP-bindenden Tasche der Kinase wurden im einzelnen analysiert (Übersicht in [4]).
Es wurde auch berichtet, daß HD die Proteinkinase C inhibiert (WO 93-16703 und WO 95-31462).
Es wurde jetzt gefunden, daß diese Verbindung und deren Derivate potente selektive Inhibitoren von CDKs 1, 2 und 5 und zwei anderen Hauptproteinkinasen sind, die an der Proteinphosphorylierung beteiligt sind, d. h. Glycogensynthasekinase 3-β (abgekürzt GSK-3β) und Caseinkinase 1.
Die Erfindung betrifft also die Verwendung von Hymenialdisin oder dessen Derivaten der Formel I
worin R¹ und R² gleich oder verschieden sind und H oder Br bedeuten, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes derselben bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung bei neurodegenerativen Krankheiten, bei denen die Deregulierung von Cyclin-abhängigen Kinasen, GSK3β und Caseinkinase 1 eine Rolle spielt.
Der in der Beschreibung verwendete Ausdruck "Derviate" umfaßt die oben definierten Salze.
In einer bevorzugten Verwendung ist die Verbindung 4-(2-Amino-4-oxo-2-imidazolin-5-yliden)-4,5,6,7-tetrahydropyrrolo(2,3-c)azepin-8-on oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben.
In einer anderen bevorzugten Verwendung ist die Verbindung 4-(2-Amino-4-oxo-2-imidazolin-5-yliden)-2-brom-4,5,6,7-tetrahydropyrrolo(2,3-c)azepin-8-on oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben.
Wie bei anderen CDK-Inhibitoren beobachtet, wirken HD und dessen Derivate durch Kompetition mit ATP. Sie interagieren mit der ATP-Bindungstasche über drei Wasserstoffbindungen mit den Glu-81- und Leu-83-Resten von CDK2.
Hymenialdisinderivate, die in der Lage sind, Wasserstoffbindungen mit den Glu-81- und Leu-83-Resten von CDK2 zu bilden, sind auch Teil der Erfindung.
Wie oben erwähnt, inhibieren diese Verbindungen stark CDK1, CDK2, CDK5, GSK-3β und Caseinkinase 1.
In vivo-Experimente in mehreren Modellen haben gezeigt, daß HD und dessen Derivate CDK5/p35 inhibieren, wie demonstriert durch das Fehlen von Phosphorylierung/Down-Regulierung von Pak1 Kinase in E18 Ratten-corticalen Neuronen.
Sie inhibieren auch GSK-3β in vivo, wie durch die Inhibierung der MAP-1B-Phosphorylierung an einer GSK-3β-spezifischen Stelle gezeigt. Sie blockieren auch die in vivo-Phosphorylierung des Mikrotubulus-bindenden Proteins tau an Stellen, die durch GSK-3β und CDK5/p35 hyperphosphoryliert werden in Alzheimer's Krankheit.
Durch Einwirkung auf die genannten Kinasen, welche die Hauptkinasen sind, die in der Hyperphosphorylierung von Substraten beteiligt sind, die in neurodegenerativen Krankheiten beteiligt sind, haben diese Verbindungen großes Interesse zur Herstellung von therapeutischen Mitteln zur Behandlung und Vorbeugung gegen entsprechende Zustände.
Demgemäß betrifft die Erfindung die Verwendung von HD und dessen Derivaten zur Herstellung von therapeutischen Mitteln, die zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten brauchbar sind.
Diese Medikamente können zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Alzheimer's Krankheit verwendet werden. Andere neuronale Störungen, wie Parkinson's Krankheit, multiple Systematrophie seien genannt oder, in Hunden, erbliche canine spinale muskuläre Atrophie.
Die Vorbeugung vor und Behandlung von Diabetes sei auch erwähnt und entzündungshemmende oder Krebsbehandlung oder Vorbeugung.
Die Verbindungen der Formel I können aus marinen Invertebraten isoliert werden [5].
HD wurde in Spezies von marinen Schwämmen gefunden, die zu den Familien Agelasidae, Axinellidae und Halichondriidae gehören. Diese Tiere enthalten eine Mehrzahl verschiedener Substanzen, die klar metabolisch mit HD verwandt sind (1).
Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Verbindungen der Formel I werden mit organischen oder anorganischen Säuren gemäß den üblichen Methoden gebildet.
Zu geeigneten Säuren gehören Essig-, Ascorbin-, Malein-, Phosphor-, Salicyl- und Weinsäure.
Die Medikamente umfassen eine wirksame Menge der oben erwähnten Verbindungen in Verbindung mit einem pharmakologisch annehmbaren Träger.
Dieser Träger kann fest oder flüssig sein, entsprechend der Verabreichungsform.
Die therapeutischen Mittel können in verschiedenen Formen verabreicht werden, parenteral, rektal, topisch, transdermal oder oral. Sie werden besonders auf oralem oder injizierbarem Weg verabreicht.
Für die Verabreichung mittels des oralen Weges können Lutschtabletten, komprimierte Tabletten, Pillen, Tabletten, Kapseln, Tropfen, Sirups, Suspensionen oder Emulsionen verwendet werden. Diese Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise 100 bis 1000 mg, vorzugsweise 300 bis 600 mg des aktiven Prinzips pro Dosiseinheit.
Zu anderen Formen der Verabreichung gehören injizierbare Lösungen für den intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Weg, die an sterilen oder steriliserbaren Lösungen formuliert sind. Sie können auch Suspensionen oder Emulsionen sein.
Diese injizierbaren Formen enthalten 100 bis 1000 mg, vorzugsweise 300 bis 600 mg einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes derselben pro Dosis Einheit.
Zur Indikation: Die Dosis, die bei einem Patienten verwendet werden kann, der sie benötigt, entspricht den folgenden Dosen: Beispielsweise werden so dem Patienten 1 bis 4 mal pro Tag 100 bis 1000 mg/Tag für die Behandlung von neurodegenerativen Störungen verabreicht.
Die Erfindung betrifft auch biologische Reagentien, deren aktive Prinzipien aus den Verbindungen der Formel I, wie oben definiert, bestehen.
Diese Reagentien können als Referenzen oder Standards in Untersuchungen der Mechanismen der Zellteilung und Phosphorylierung verwendet werden.
Andere Eigenschaften und Vorteile werden in den folgenden Beispielen mit Bezug auf die 1 bis 13 beschrieben, worin
1 zeigt die Struktur von Hymenialdisin und verwandten Metaboliten, die aus marinen Schwämmen isoliert wurden,
2 zeigt die CDK1/Cyclin B-Kinaseaktivität in Gegenwart steigender Konzentrationen von HD und Analogen,
3 zeigt die Autoradiographie, die mit einem Presenilin-MBP-Fusionsprotein erhalten wird, das in vitro mit Caseinkinase 1 in Gegenwart steigender HD-Konzentration phosphoryliert und durch SDS-PAGE aufgetrennt wurde,
4A zeigt die Inhibierung durch HD der Pak1 Phosphorylierung durch CDK5/p35 in vitro und in vivo (4A zeigt das Niveau der H4 Phosphorylierung nach SDS-PAGE des Substrats und 5B die Western Blots, welche Mengen des Pak1 und p35 zeigen),
5A zeigt die Autoradiographie von r-htau phosphoryliert in vitro mit GSK-3β in Gegenwart steigender HD-Konzentrationen und aufgetrennt durch SDS-PAGE, und
5B zeigt die Immunoblotergebnisse, die erhalten wurden durch Umsetzung mit verschiedenen Antikörpern von Präparationen von htau 23, die gegen CDK-Inhibitoren in vivo exponiert oder nicht exponiert waren,
6A zeigt kinetische Daten von Assays von CDK/1 Cyclin B-Proteinkinaseaktivität bei verschiedenen Konzentration von HD, und
6B zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn immobilisertes CDK1/Cyclin B gegen HD exponiert wird, und Western Blotting mit Anticyclin B und Anti-PSTAIRE Antikörpern,
7 zeigt eine Stereoansicht der Verteilung der Elektronendichte für HD im Komplex mit CDK2,
8A zeigt in einem Stereodiagramm die Feinstruktur von HD in der ATP-Bindungstasche von CDK2, und
8B zeigt schematisch die Wechselwirkungen zwischen CDK2 und HD,
9 zeigt in Stereoansichten den Vergleich der HD-CDK2-Bindung mit den Bindungen anderer CDK2-Liganden,
10 zeigt die Ergebnisse, die durch doppelte Immunofluoreszenzfärbung für GAP-43 und MAP-1B-P in Abhängigkeit von HD-Konzentrationen (A-H), erhalten werden, und Western Blot-Ergebnisse mit Zell-Lysaten in Response zu steigenden Dosen HD,
11 zeigt den Effekt von HD auf das Wachstum von HT 29-18-C1-Zellen,
12 und 13 zeigen die zellularen Effekte von HD mit der Arretierung in S-Phase (12) und beim G2/M-Übergang (13).
I/Materialien und Methoden
Chemikalien und Reagenzien
Natriumorthovanadat EGTA, EDTA, RNAse A, Mops, β-Glycerophosphat, Phenylphosphat, Natriumfluorid, Glutathion-agarose, Dithiothreitol (DTT), Rinderserumalbumin (BSA), Nitrophenylphosphat, Leupeptin, Aprotinin, Mikrocystinpepstatin, Sojabohnentrypsinhibitor, Benzamidin, Histon H1 (Typ III-S), Basic-Myelinprotein, Casein wurden erhalten von Sigma Chemicals, [γ-³²P]-ATP (PC 168) von Amersham.
Das GS-1-Peptid (YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE) wurde durch Synthese erhalten.
Hymenialdisin wurde isoliert wie früher beschrieben [6,7] und gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) als eine 10 bis 50 mM Stammlösung. Es wurde in Me₂SO auf 5 bis 10 mM verdünnt unmittelbar bevor es in wäßrigen Puffern verwendet wurde. Die DMSO-Endkonzentration in der Reaktionsmischung lag unter 1% (v/v).
Axinohydantoin [7], Hymenialdisin-Platinkomplex, Diacetylhymenialdisin, Diacetyl-Debromhymenialdisin, Dibromphakellstatin [6], Agelastatin A [8], Dibromageliferin, Clathrodin, Hymenidin, Dibromcantharellin [9] wurden im Laboratorium hergestellt. Agelongin [10], Dispacamid B [11], Sceptrin [12], Oroidin [13] und Stevensin (Odilin) [14,9] wurden aus Agelas sp. gereinigt.
GST-Retinoblastomaprotein wurde exprimiert in Bakterien und an Glutathion-Sepharoseperlen wie zuvor beschrieben gereinigt [15]. p9^CKshsl-Sepharoseperlen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [16].
Puffer
Homogenisierungspuffer: 60 mM β-Glycerophosphat, 15 mM p-Nitrophenylphosphat, 25 mM Mops (pH 7.2), 15 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM Natriumvanadat, 1 mM NaF, 1 mM Phenylphosphat, 10 μg Leupeptin/ml, 10 μg Aprotinin/ml, 10 μg Sojabohnen-Trypsininhibitor/ml und 100 μM Benzamidin.
Puffer A: 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 μg Heparin/ml.
Puffer C: Homogenisierungspuffer, aber 5 mM EGTA, kein NaF und keine Proteaseinhibitoren.
Hypotonischer Lysispuffer (HLB): 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 120 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Nonidet-P40, 5 mM DTT, 1 mM EGTA, 20 mM NaF, 1 mM Orthovanadat, 5 μg Mikrocystin, 100 μg/ml jeweils von Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin.
Trisgepufferte Salzlösung-Tween-20 (TBST): 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20.
STM-Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M Sucrose, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, Protease und Phosphataseinhibitoren [17).
Kinase-Präparate und Assays
Kinaseaktivitäten wurden in Puffer A oder C (falls nicht anders angegeben) bei 30°C bei einer ATP-Endkonzentration von 15 μM getestet. Blindwerte wurde abgezogen, und Aktivitäten wurden als pMol von eingebautem Phosphat für eine 10 Minuten Inkubationsdauer berechnet (gewöhnlich ausgedrückt in % der maximalen Aktivität, d. h. ohne Inhibitoren). Kontrollen wurden mit geeigneten Verdünnungen von Me₂SO durchgeführt. In einigen Fällen wurde die Phosphorylierung des Substrats gemessen durch Autoradiographie nach SDS-PAGE. IC₅₀-Werte wurden aus den Dosis-Response-Kurven abgeleitet.
CDK1/Cyclin B wurde aus M-Phase Seestern (Marthasterial glacialis) Oozyten in Homogenisierungspuffer extrahiert und durch Affinitätschromatographie an p9^CKshsl-Sepharoseperlen gereinigt, von denen es mit freiem p9^CKshsl eluiert wurde, wie beschrieben [15,16]. Die Kinaseaktivität wurde getestet in Puffer C mit 1 mg Histon H1/ml in Gegenwart von 15 μM [γ-³²P] ATP (3,000 Ci/mmmol; 1 mCi/ml) in einem Endvolumen von 30 μl. Nach 10 Minuten Inkubation bei 30°C wurden 25 μl Aliquots des Überstands auf 2.5 × 3 cm Stücke von Whatman P81-Phosphozellulosepapier aufgetragen und 20 Sekunden später wurden die Filter fünfmal (jeweils für wenigstens 5 Minuten) in einer Lösung von 10 ml Phosphorsäure/Liter Wasser gewaschen. Die feuchten Filter wurden in Gegenwart von 1 ml ACS (Amersham) Szintillationsfluid gezählt.
GSK-3β wurde entweder aus Kaninchenmuskel gereinigt oder in Insekten-Sf9-Zellen exprimiert und daraus gereinigt [18]. Es wurde nach einer 1/100-Verdünnung in 1 mg BSA/ml 10 mM DTT mit 5 μl 40 μM GS-1-Peptid als Substrat in Puffer A in Gegenwart von 15 μM [γ-³²P] ATP (3,000 Ci/mmol; 1 mCi/ml) in einem Endvolumen von 30 μl getestet. Nach 30 Minuten Inkubation bei 30°C wurden 25 μl Aliquots des Überstands auf P81-Phosphozellulosepapiere aufgetragen und wie oben beschrieben behandelt.
CDK5/p25 wurde rekonstituiert durch Mischen gleicher Mengen von rekombinantem CDK5 und p25 exprimiert in E. coli als GST (Glutathion-S-Transferase)-Fusionsproteine und gereinigt durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Agarose (p25 ist eine trunkierte Version des CDK5-Aktivators). Seine Aktivität wurde in Puffer C getestet, wie für CDK1/Cyclin B beschrieben.
CDK2/Cyclin A, CDK2/Cyclin E, CDK3/Cyclin E, CDK4/Cyclin D1, CDK6/Cyclin D2, mit His-Tag versehene erk1 und erk2, Proteinkinase-C-Isoformen, die katalytische Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase, cGMP-abhängige Proteinkinase, Myosin-Leichtketten-Kinase, Casein-Kinase 1 & 2, ASK-γ (ein Pflanzenhomolog von GSK-3), Insulinrezeptor-Tyrosinkinasedomain (CIRK-41), c-raf MAPKK, c-jun-N-Terminalkinase (erhalten von Promega), c-src-Kinase und y-abl-Kinase wurden getestet wie beschrieben [15].
Elektrophorese und Western Blotting
An p9^CKsnsl-Sepharoseperlen gebundene Proteine (Seestern CDK1/Cyclin B) wurden mit 2 × Laemmli-Probenpuffer denaturiert. Proben ließ man auf 10% SDS-Polyacrylamidgelen laufen. Proteine wurden von dem Gel auf eine 0.1 μm Nitrozellulosefolie in einem Milliblot-SDE-System (Millipore) 30 Minuten bei 2.5 mA/cm² in Transferpuffer transferiert. Anschließend wurde das Filter mit 5% Magermilch in TBST 1 Stunde blockiert. Das Filter wurde dann mit TBST gewaschen und 1 Stunde mit den ersten Antikörpern (Anti-PSTAIRE, 1 : 2000; Anti-Cyclin B, 1 : 1000) inkubiert. Nach 4 Waschungen (1 × 20 Minuten, 3 × 5 Minuten) mit TBST wurde die Nitrozellulosefolie 1 Stunde mit mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörpern verdünnt in TBST (1 : 1000) behandelt. Das Filter wurden dann 5 Mal (1 × 20 Minuten, 4 × 5 Minuten) mit TBST gewaschen und durch gesteigerte Chemolumineszenz mit ECL-Detektionsreagentien und Hyperfilm MP analysiert.
Herstellung von CDK2/HD-Kristallen
Human-CDK2 wurde gereinigt und kristallisiert wie zuvor beschrieben [19]. Ein Verfahren mit chemischer Vernetzung wurde verwendet, um das Zerbrechen der Kristalle zu verhindern. Die Kristalle wurden zuerst 2 Stunden in einer Lösung eingeweicht, die 0.5 mM ATP, 1 mM MgCl₂ enthielt, dann mit 0.1% Glutaraldehyd 1 Stunde bei 4°C vernetzt. Nach gründlichem Waschen wurden die Kristalle in eine Inhibitorlösung in 0.2 M HEPES, 5% Ethylenglykol und 1% DMSO transferiert. Diese Maßnahmen erlaubten Kristalle bei Inhibitorkonzentrationen bis zu 0.5 mM mehrere Tage ohne irgendwelche Schäden einzuweichen.
Bestimmung der CDK2/HD-Kristallstruktur
Röntgenbeugungsdaten für 2,1 Å-Auflösung wurden an einem einzigen CDK2/HD-Kristall gewonnen unter Verwendung eines R-Achse II-Bildplattendetektionssystems montiert an einem Rigaku-Drehanodengenerator. Die Daten wurden bei 120 K gewonnen, um Strahlungsschäden des Kristalls zu vermeiden. Unmittelbar vor dem Einfrieren wurde der Kristall in eine Gefrierschutzlösung transferiert, die 25% Ethylenglykol enthielt. Blitzgefrieren wurde in einen trockenen Stickstoffstrom unter Verwendung eines Kryoapparats von Molecular Structure Corporation erreicht. Das Einfrieren veränderte die Einheitszellenabmessungen geringfügig und erhöhte die Mosaikspreizung von 0.2 auf 0.6°. Das Vernetzen selbst veränderte die Beugungscharakteristika nicht wesentlich. Die Intensitätsdaten wurden mit dem DENZO- und SCALEPACK-Programmen [20] verarbeitet. Das Programm TRUNCATE, wie in der CCP4-Folge [21] implementiert, wurde verwendet, um den endgültigen Satz der Strukturfaktoramplituden zu erhalten. Eine Zusammenfassung der Datenverarbeitungsstatistiken ist in Tabelle 3 angegeben. Eine Verfeinerung des CDK2/HD-Komplexes wurde begonnen von den Koordinaten des hoch-verfeinerten CDK2/ATP-Modells. Alle Verfeinerungsstufen wurden unter Verwendung des Programms X-PLOR durchgeführt [22]. Molekularer Ersatz gefolgt von Starrkörperverfeinerung war notwendig, um das CDK2-Molekül in der Einheitszelle des gefrorenen Kristalls erfolgreich zu reorientieren und zu repositionieren. Das Modell wurde dann weiter verfeinert unter Verwendung mehreren Runden von Minimierung der konjugierten Gradientenenergie. Nach dieser Stufe zeigte eine klare Elektronendichte, berechnet von 2F₀ bis 2F_c und F₀ bis F_c-Fourier-Darstellungen, den Bindungsmodus des Hymenialdisin-Inhibitors an. Ursprüngliche Koordinaten und geometrische Einschränkungsterme für Hymenialdisin wurden aus der kleinen Molekülstruktur von Mattia et al. genommen [23]. Eine Verfeinerung des CDK2/HD-Modells wurde dann mit mehreren Runden von sowohl eingeschränkter Röntgenenergieminimierung und molekularer Dynamik abwechselnd mit Modellbau verfolgt. Gegen das Ende der Verfeinerung wurden mehrere Wassermoleküle und einige Moleküle Ethylenglykol dem Modell zugefügt. Die Stereochemie des CDK2/HD-Modells wurde verifiziert unter Verwendung des Softwarepakets PROCHECK [24].
In vitro-Phosphorylierung von Presenilin-2
Die große hydrophile Schleife des Presenilin-2 zwischen Transmembram-Domänen 6 und 7 wurde exprimiert in E. coli als ein Presenilin-2-Schleifen-Maltose-Bindungsprotein (MBP)-Fusionsprotein [25]. Anschließend an Affinitätschromatographie zur Reinigung wurde Presinilin-2-MBP als ein Substrat für CK1 verwendet. Nach 30 Minuten Inkubation in Gegenwart verschiedener HD-Konzentrationen wurde die Kinasereaktion durch Zugabe von Laemmli-Probenpuffer gestoppt. MBP-Presenilin-2 wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und sein Phosphorylierungsniveau durch Autoradiographie erkennbar gemacht.
In vitro- und in vivo-Pak1-Phosphorylierung durch CDK5/p35
In vitro-Pak1-Phosphorylierung
CDK5/p35 wurde aus P02-Rattencortices immunogefällt unter Verwendung des C-endständigen Santa Cruz-Antikörpers (400 μg Gesamtprotein pro Kinasemessung). Das Immunopräzipitat wurde aufgeteilt in gleiche Aliquots und die Kinasemessungen wurden unter Verwendung von GST-Pak1K299 als ein Substrat durchgeführt. Roskovitin, HD oder DMSO wurden zu den Perlen unmittelbar vor der Kinasemessung zugefügt, wie beschrieben [17]. Die Phosphorylierung wurde durch Autoradiographie verfolgt.
In vivo Pak1-Phosphorylierung
HD wurde zu kultivierten Neuronen zugesetzt, die von E18-Rattenembryocortices erhalten waren, wenn die Kulturen vier Tage alt waren. Als eine Kontrolle wurde DMSO mit dem maximalen Volumen der verwendeten Droge verwendet (7,5 μl). Die Droge wurde auf den Zellen 1 Stunde belassen. Die Zellen wurden dann auf Eis in STM-Puffer lysiert, und die Membranfraktion mit STM mit Gehalt an 0,5% NP-40 isoliert [17].
Pak1 Immunofällungen wurden unter Verwendung eines spezifischen polyklonalen Antikörpers durchgeführt, gefolgt von Kinase-Assays unter Verwendung von Histon H4 als ein Substrat. Die Menge der H4-Phosphorylierung, welche das Niveau der Pak1-Aktivität widerspiegelt, wurde bestimmt durch Messung der Intensität der Banden auf Autoradiographiefilm und Quantifizierung mit NIH-Bildgebungsprogramm.
Als Ladungskontrollen wurden Pak1 und p35 Western Blots gemacht. Die Menge des letzteren Proteins steigt mit dem Niveau der CDK5/p35 Kinaseinhibierung.
In vivo MAP-1B Phosphorylierung durch GSK-3 und Immunochemie
Cerebellare Granulat-Zellen wurden von neugeborenen Mäusen isoliert und nach der Methode von Hatten [26] unter Verwendung von Percollgradienten gereinigt. Die Zellen wurden auf Platten ausgebreitet, die mit Poly-D-Lysin (100 μg/ml) und Laminin (50 μg/ml) beschichtet waren, und in serumfreiem Medium 1 Tag gezüchtet. Die Kulturen wurden dann mit HD (1–100 mM) 20 Stunden behandelt. Die Kulturen wurden fixiert mit 4% Formaldehyd in PBS und in PBS bei 4°C aufbewahrt. Die Zellen wurden mit 100% Methanol permeabilisiert und mit primären Antikörpern gegen GAP-43 und MAP-1B-P (SMI-31, Affiniti) bei 4°C über Nacht inkubiert. FITC und Texas Red-konjugierte sekundäre Antikörper wurden verwendet (Vektor). Zur Western Blot-Analyse wurde Zellen in Probenpuffer lysiert und durch 8% SDS-PAGE analysiert. Proteine wurden auf Nitrozellulosemembrane transferiert und mit einem Antikörper für MAP-1B-P (SMI-31) verdünnt in Blocklösung (0,1% Tween-20, 3% getrocknete Magermilch in TBS) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. HRP-konjugierte sekundäre Antikörper (Amersham) wurden verwendet und Proteine wurden unter Verwendung des ECL-Systems (Pierce) sichtbar gemacht. Blots wurden gescannt unter Verwendung eines Flachbettscanners (UMAX Astra 1200S).
In vitro und in vivo tau-Phosphorylierung
Zellen und Viren. Sf9 Zellen (InVitrogen, San Diego, CA) wurden bei 27°C in Einschichtkultur Grace's Medium (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) ergänzt mit 10% Fötalrinderserum und 50 μg Gentamycin/ml und 2,5 μg Amphotericin/ml gezüchtet. BaculoGold wurde von PharMingen (San Diego, CA) pFL1392 von InVitrogen erhalten.
Tau Transfektion. Das Gen für htau23, die kürzeste humane tau Isoform [27] wurde vom bakteriellen Expressionsvektor pNG2 [28] mit Xbal und BamHI herausgeschnitten und in den Baculovirus-Transfervektor pVL1392 eingesetzt, der mit den gleichen Restriktions-Endonucleasen geschnitten war. Das BaculoGoldsystem wurde verwendet, um den tau- Baculovirus-enthaltenden Vektor zu konstruieren. Die BaculoGold DNA ist ein modifizierter Typ von Baculovirus, der eine lethale Deletion enthält. Ko-Transfektion der BaculoGold DNA mit einem komplementierenden Baculovirus-Transfervektor rettet die lethale Fehlstelle dieser Virus DNA und rekonstituiert lebensfähige Viruspartikel, welche die htau23 Codierungssequenz tragen. Die für Transfektionen verwendete Plasmid DNA wurde gereinigt unter Verwendung von QIAGEN Kartuschen (Hilden, Deutschland). Einschichtig gezüchtete Sf9-Zellen (2 × 10⁶ Zellen auf einer 60 mm Zellkulturplatte) wurden ko-transfiziert mit Baculovirus DNA (0,5 μg BaculoGold DNA) und mit Vektorderivaten von pVL1392 (2 μg) unter Verwendung einer Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode. Die Gegenwart des rekombinanten Proteins wurde in den infizierten Zellen 5 Tage nach der Infektion untersucht durch SDS-PAGE und Western Blotting.
Tau Phosphorylierung in Sf9 Zellen
Zur Bestimmung der Effekte von Kinaseinhibitoren auf die tau Phosphorylierung wurden Sf9 Zellen, die mit htau23 exprimierendem Baculovirus infiziert waren, 36 Stunden nach der Infektion mit 50 μm HD oder Flavopiridol 5 Stunden behandelt, bevor sie geerntet wurden. Um Kontroll-Tau-Proben mit gesteigerter Phosphorylierung zu erhalten, wurden die htau23 exprimierenden Sf9 Zellen 5 Stunden vor der Ernte mit 0,2 μM Okadasäure behandelt.
Tau Western Blotting
Sf9 Zellen wurden infiziert mit rekombinantem Virus bei einem MOI von 1–5. Zell-Lysate wurden hergestellt in hypotonischem Lysispuffer (HLB). Nach 15 Minuten Zentrifugieren bei 16.000 g wurde der Überstand abgetrennt und seine NaCl-Konzentration auf 500 mM erhöht. Er wurde dann 10 Minuten gekocht und 15 Minuten erneut zentrifugiert bei 16.000 g. Proteine (3 μg) wurden aufgetrennt durch SCS-PAGE, auf eine PVDF Membrane übertragen und Western blottet mit den folgenden Antikörpern: AT-8 (1 : 2000), AT-180 (1 : 1000), AT-100 (1 : 500), PHF-1 (1 : 600) und polyklonalem anti-tau Antikörper K9JA.
Tau Phosphorylierung in vitro wurde durchgeführt unter Verwendung von gereinigtem GSK-3β und rekombinantem tau-32 als Substrat. Nach 30 Minuten Inkubation in Gegenwart verschiedener HD-Konzentrationen unter den oben beschriebenen GSK-3β Assaybedingungen wurde die Kinasereaktion durch Zugabe von Laemmli Proben-Puffer gestoppt. Tau wurde aufgetrennt durch SDS-PAGE und sein Phosphorylierungsniveau wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
II/Erlebnisse
Kinaseinhibitionsselektivität des Hymenialdisins
Enzymaktivitäten wurden in Gegenwart steigender HD-Konzentrationen getestet, wie im Abschnitt der experimentellen Verfahren beschrieben. IC₅₀-Werte wurden aus den Dosis-Response-Kurven berechnet – keine Wirkung bei der höchsten geprüften Dosis (in Klammern). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Es wurde gefunden, daß HD in Gegenwart von 15 μm ATP CDK1/Cyclin B, CDK2/Cyclin A, CDK2/Cyclin E, CDK3/Cyclin E und CDK5/p35 mit IC₅₀-Werten von 22, 70, 40, 100 bzw. 28 nM inhibiert (Tabelle 1). Wie beobachtet mit Olomoucin [29], Roscovitin [15], Indirubin-3'-monoxim [30], Kenpaullon [31] und im Gegensatz zu Flavopiridol [32] hat HD eine begrenzte Wirkung auf CDK4(Cyclin D1 und CDK6/Cyclin D2 (IC₅₀-Werte von 600 bzw. 700 nM).
HD wurde sodann an einer Mehrzahl verschiedener hoch gereinigter Kinasen getestet (Tabelle 1). Kinaseaktivitäten wurde getestet mit geeigneten Substraten (Histon H1, Casein, basic Myelinprotein, Peptide usw.) mit 15 μM ATP (die Konzentration wurde aus praktischen Gründen gewählt: Vergleich mit früher veröffentlichten Artikeln; hohe Spezifität des ATP) und in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von HD. IC₅₀-Werte sind auch in Tabelle 1 dargestellt. Die meisten getesteten Kinasen wurden schlecht oder nicht inhibiert (IC₅₀ > 1 μM). Jedoch waren zwei Kinasen, Glykogensynthase-Kinase-3β (GSK-3β) und Caseinkinase 1 (CK1) stark sensitiv für HD (IC₅₀-Werte von 10 bzw. 35 nM).
Inhibierung von CDK1/Cyclin B durch HD-Analoge
CDK1(Cyclin B wurde assayed wie im Abschnitt experimentelle Verfahren beschrieben in Gegenwart steigender Konzentrationen von HD und Analogen. Die Aktivität ist wiedergegeben als Prozent der maximalen Aktivität, d. h. gemessen in Abwesenheit von Inhibitoren. Die Ergebnisse sind in 2 angegeben.
In vitro Assay von HD-sensitiven Kinasen mit relevanten Substraten
Die HD-sensitiven Kinasen wurden auch in vitro mit physiologisch relevanten Substraten getestet: Einem Fragmen von Presenilin-2 [25] für Caseinkinase 1, Pak1 [17] für CDK5/p35, das Insulinrezeptorsubstrat IRS-1 [33] oder tau für GSK-3β. Die Ergebnisse sind in den 3 bis 5 dargestellt.
3 zeigt die Inhibitorwirkung von HD auf die Phosphorylierung von Presenilin-2 durch Caseinkinase 1 in vitro. Ein bakteriell exprimiertes Fusionsprotein zwischen Presenilin-2 und Maltosebindungsprotein (PS-2.MBP) wurde in vitro mit Caseinkinase 1 in Gegenwart steigender HD-Konzentrationen phosphoryliert und durch SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von Autoradiographie.
4 zeigt den Inhibierungseffekt von HD auf Pak1 Phosphorylierung durch CDK5/p35 in vitro und in vivo. Corticale Rattenembryoneuronen wurden verschiedenen HD-Konzentrationen 1 Stunde lang ausgesetzt. Pak1 wurde dann immunopräzipitiert und seine Kinaseaktivität gegen Histon H4 gemessen. Die obere Zeile zeigt das Niveau der H4-Phosphorylierung nach SCS-PAGE des Substrats. Die Zahlen entsprechen den Quantifizie rungen der Autoradiographie. Western Blots zeigen Mengen von Pak1 (untere Zeile) und p35. Ein Anstieg in p35-Niveaus ist eine Konsequenz der CDK5-Inhibierung. 5 zeigt den Inhibierungseffekt der Phsophorylierung durch tau Phosphorylierung durch GSK-3β in vitro und in vivo.
5A zeigt die Ergebnisse der folgenden Experimente: Bakteriell exprimiertes rekombinantes Human-tau wurde in vitro mit GSK-3β in Gegenwart steigender HD-Konzentrationen phosphoryliert und aufgetrennt durch SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie.
In Versuchen, deren Ergebnisse in 5B gezeigt sind, wurden htau23 exprimierende Sf9-Zellen unbehandelt gelassen (–) oder 5 Stunden Okadasäure (OA), Hymenialdisin (HD) oder Flavopiridol (FL) ausgesetzt. Zell-Lysate (3 μg htau 23) wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, mit Coomassieblau gefärbt oder immunoblottet mit verschiedenen Antikörpern: K9JA (ein pan-tau Antikörper) erkennt alle Präparate, welche tau enthalten; AT8, AT180 und PHF1 sind spezifisch für verschieden phosphorylierte SP oder TP Motive; AT100 erkennt tau, das bei T212 und S214 phosphoryliert ist, eine hochspezifische Reaktion für Alzheimer tau.
Die Empfindlichkeit der Kinasen gegen HD blieb recht vergleichbar der Empfindlichkeit der gleichen Kinasen assayed mit stärker künstlichen Substraten.
Inhibierung von CDK1, CDK5 und GSK-3β und CK1 durch Hymenialdisin-Analoge
Einige natürliche HD-verwandte Verbindungen, die aus marinen Schwämmen isoliert wurden, und einige synthetisch modifizierte Analoge wurden auf CDK1/Cyclin B, CDKS/p35, GSK-3β und CK1 geprüft. Die Ergebnisse sind in 2 und Tabelle 2 angegeben. Die Zahlen beziehen sich auf in 1 gezeigte Strukturen. Enzymaktivitäten wurden in Gegenwart von steigenden HD-Konzentrationen getestet, wie im Abschnitt experimentelle Verfahren beschrieben. IC₅₀-Werte wurden aus den Dosis-Response-Kurven berechnet. Wenn kein Inhibitoreffekt gefunden wurde (–), ist die höchste getestete Konzentration in Klammern angegeben.
Tabelle 2
HD blieb die aktivste Verbindung. Von Interesse ist, daß Dibromcantharellin (10) einen signifikanten Inhibitoreffekt gegen GSK-3β (IC₅₀ von 3 μM) zeigte. Hymenidin (13) war selektiv für CDK5.
Hymenialdisin ist ein kompetitiver Inhibitor der ATP-Bindung
Um den Mechanismus der HD-Wirkung zu untersuchen, wurden kinetische Experimente durchgeführt unter Veränderung sowohl der ATP-Niveaus und der HD-Konzentrationen (6A): Doppelt reziprokes Aufzeichnen der kinetischen Daten von Assays der CDK1/Cyclin B Proteinkinaseaktivität bei verschiedenen Konzentration von Hymenialdisin. Enzymaktivitäten wurden assayd wie im Abschnitt experimentelle Verfahren beschrieben. Die Ergebnisse sind in 6A dargestellt: 1/v gegen 1/ATP Primärplot. ATP-Konzentrationen in der Reaktionsmischung variierten von 0,05 bis 0,25 mM, Histon H1-Konzentrationen wurden konstant bei 0,7 mg/ml gehalten. Ein Einschub zeigt sekundäre Re-Plots von Steigungen gegen Konzentrationen von primären Plots. Die scheinbare Inhibitorkonstante (K₁) ist durch einen Pfeil angegeben. Die durch 6B wiedergegebenen Ergebnisse: Hymenialdisin setzt kein Cyclin B von CDK1 frei. p^9CKShsl-Sepharose-immobilisiertes CDK1/Cyclin B wurde 30 Minuten HD ausgesetzt, gewaschen und durch Western Blotting mit Anticyclin B und anti-PSTAIRE-Antikörpern analysiert.
Die Daten zeigen, daß HD als ein kompetitiver Inhibitor für ATP wirkt. Die Linearität der Steigung gegen HD-Konzentration re-plots qualifiziert HD als einen linearen Inhibitor (6A, Einschub). Die scheinbare Inhibitorkonstante (Ki) betrug 50 nM. HD wirkt nicht durch Verdrängung von Cyclin B von CDK1 (6B): CDK1/Cyclin B wurde immobilisiert auf p^9CKShsl-Sepharose wurde HD-Konzentrationen ausgesetzt; die Perlen wurden dann ausgiebig gewaschen und anschließend eine Western Blot-Analyse vorgenommen. Die beiden Untereinheiten waren immer noch zusammen detektierbar.
Kristallstruktur des CDK2/Hymenialdisin-Komplexes
Die Struktur eines in HD eingeweichten CDK2 Kristalls wurde bestimmt und bei 2,1 Å Auflösung verfeinert. die Behandlung mit einem Vernetzungsmittel vor dem Einweichen war erforderlich, um ein Zerbrechen des Kristalls zu verhindern. Einzelheiten der Strukturbestimmung sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Das Endmodell besteht aus 274 Aminosäureresten, einem gebundenen HD, 85-Lösungsmittelmolekülen und 4 Molekülen Ethylenglykol mit einem kristallographischen R- Faktor von 19.2% (R_free von 26.7%) und einer guten Geometrie. Die Reste 36–44 und 149–163 von CDK2, die Teil von zwei hoch-flexiblen Schleifen sind, wurden aus dem Endmodell weggelassen wegen schwacher oder fehlender Elektronendichte. Alle Nicht-Glycin-Reste im CDK2-Modell haben Hauptketten-Torsionswinkel, die gut innerhalb der energetisch günstigen Bereiche des Ramachandran-Plots liegen [26], ausgenommen zwei Reste Glu-73 und Arg-126, die Rückgrat-Konformationen haben, die gerade außerhalb des „additional allowed"-Bereichs im Φ-ψ-Raum liegen.
Eine Stereoansicht der Elektronendichte für HD ist in. 7 gegeben. HD konnte zweifelsfrei in einer Fourier-Differenzdarstellung (map) lokalisiert werden, die bestätigte, daß dieser Inhibitor auch in der ATP-Bindungstasche bindet (7A). Eine schematische Darstellung der Bindungsstellen-Wechselwirkungen zeigen 7B und 8.
8a ist ein Stereodiagramm, das die verfeinerten Strukturen von HD in der ATP-Bindungstasche des CDK2 zeigt. Angenommene Wasserstoffbindungen sind als dünne punktierte Linien gezeigt.
8b ist eine schematische Illustration der Wechselwirkungen zwischen CDK2 und HD. Proteinseitenkettenkontakte sind durch Linien angegeben, welche die Verbindung zur jeweiligen Rest-box herstellen, während Interaktion mit Hauptkettenatomen als Linien zum spezifischen Hauptkettenatom gezeigt sind. Van der Waals-Kontakte sind durch punktierte Linien und Wasserstoffbindungen durch unterbrochene Linien angegeben.
Das Pyrroloazepin-Doppelringsystem des HD füllt eine flache hydrophobische Tasche, die gebildet ist von Ile-10, Val-18, Ala-31, Val-64, Phe-80 und Leu-134, wobei es mehrere Van der Waals-Kontakte mit den Seitenkettenatomen dieser Reste bildet. Zusätzlich werden drei Waserstoffbindungen mit dem Rückgrat des CDK2 zwischen dem N1-Atom des Pyrrolrings und dem Carbonylsauerstoff von Leu-83, zwischen dem O1-Carbonylsauerstoff des Azepinrings und dem Rückgrat-Amid von Leu-83 und zwischen dem N2-Amid des Azepinrings und dem Carbonylsauerstoff von Glu-81 gebildet. Das an den Pyrroloring des HD gebundene Bromatom zeigt in Richtung der Außenseite der ATP-Bindungstasche, wo es gegenüber dem Lösungsmittel teilweise exponiert jedoch auch gegen die Hauptketten-Carbonylsauerstoffe von Ile-10 und His-84 und die Seitenketten von Ile-10 und Leu-134 gepackt ist. Die Bindung des Guanidinringsystems des HD erfolgt mit einigen wenigen Van der Waals-Kontakten, hauptsächlich mit der Seitenkette von Val-18, zusätzlich zu einer direkten und zwei durch Wasser vermittelten Wasserstoffbindungen. Die direkte Wasserstoffbindung wird gebildet zwischen der N5-Aminogruppe des Guanidins und einem der Seitenkettensauerstoffe von Asp-145. Die zwei durch Wasser vermittelten Wasserstoffbindungen sind zwischen dem O2 von HD und dem Hauptketten-NH des Asp-145 und zwischen dem N5 des HD und dem Hauptkettencarbonyl von Gln-131. Ein Vergleich mit den Strukturen von apo-CDK2 und CDK2/ATP zeigt eine große Bewegung von Asp-145 bei der Bindung von HD, die aus einer 1 Å-Verschiebung des Cα-Atoms und einer Drehung der Seitenkette von ungefähr 90° um die Cα-Cβ-Bindung weg vom HD-Guadininring besteht. Alle anderen in Kontakt mit dem Inhibitor stehenden Reste haben Konformationen sehr ähnlich derjenigen, die in den apo-CDK2 und CDK2/ATP-Strukturen beobachtet werden.
Vergleich von CDK2/Hymenialdisin mit anderen CDK2/Inhibitorkomplexen
Um eine strukturelle Basis zum Verständnis der Potenz von HD zu liefern, wurde die Struktur des CDK2/HD-Komplexes verglichen mit den Strukturen von Komplexen von CDK2 mit ATP, Staurosporin, Flavopiridol und mit den Purin-Analogen Olomoucin, Roscovitin und Purvalanol sowie mit den Strukturen des Cyclin A/CDK2/ATP-Komplexes. Stereoansichten, die den Vergleich zeigen, sind in 9 dargestellt.
9A gibt die Überlagerung von HD (schwarze Bindungen) auf ATP (weiße Bindungen) in apo-CDK2 und auf ATP (gelbe Bindung) in Cyclin A-CDK2 an.
9B gibt die Überlagerung von HD auf Olomoucin (weiß) und Purvalanol an.
9C gibt die Überlagerung von HD auf Flavopiridol an. Die CDK2-Rückgratatome der Reste 81–84 und die Seitenketten von Asp-145 im CDK2/HD-Komplex sind in Kugel- und -Stecken-Darstellung mit schwarzen Bindungen gezeigt. Die gleichen Reste des überlagerten CDK2-Ligandenkomplexes sind als Bindungen gezeigt. In A) betreffen die dünnen Bindungen das apo-Enzym, die dicken Bindungen die Cyclin A-CDK2-Dimeren.
Das hydrophobe Doppelringsystem des HD bindet an etwa der gleichen Position in CDK2 wie der Purinring von ATP im CDK2/ATP-Komplex, ähnlich den Positionen des Doppelringsystems in den anderen CDK2-Inhibitorkomplexen (9). Obgleich die Orientierung der verschiedenen Doppelringsysteme unter den verschiedenen Inhibitoren signifikant verändert ist, bleibt sie begrenzt durch die Notwendigkeit, eine optimale Form komplementär zur flachen ATP-Purin-Bindungstasche zu liefern und dabei die Bildung einer Anzahl von Wasserstoffbindungen mit dem Rückgrat der Reste 81–83 an der Crossover-Verbindung in CDK2 zu erlauben. Die Wasserstoffbindungs-Wechselwirkungen im CDK2/HD-Komplex scheinen die günstigsten zu sein von allen bisher untersuchten CDK2-Inhibitorkomplexen. Die Wasserstoffbindungen zwischen N2 und dem Peptid-Sauerstoff von Glu-81 und zwischen O1 und dem Peptid-Amid von Leu-83 ähneln stark denjenigen zwischen der Adeninbasis von ATP und CDK2 und denjenigen in den CDK2-Inhibitorkomplexen mit Staurosporin und Flavopiridol. Die dritte Wasserstoffbindung im CDK2/HD-Komplex mit dem Hauptkettencarbonyl von Leu-83 fehlt in diesen Komplexen und kann nur in den Komplexen mit den drei Inhibitoren mit Purinbasis: Olomoucin, Roscovitin und Purvalanol beobachtet werden. Wie HD bilden diese letztgenannten drei Inhibitoren auch drei Wasserstoffbindungen mit der Crossover-Verbindung, jedoch ist ihre Wechselwirkung mit dem Glu-81-Peptid-Sauerstoff viel schwächer und umfaßt eine seltene C-H-O-Wasserstoffbindung mit dem saueren C8-Atom des Purinrings.
Das Bromatom des HD ist eng an eine Region im CDK2 gebunden, die in den anderen CDK2-Inhibitorkomplexen von einer Benzylgruppe eingenommen wird. Die Bindung einer hydrophoben Gruppe in diesem Bereich, wo sie gegen die Seitenketten von Ile-10, Phe-82 und das Rückgrat der Reste 82–84 anliegen kann, ist wichtig zur Erhöhung der Spezifizität der Inhibitoren für CDK2. Obgleich das Brom in HD nicht die gleiche Anzahl von Wechselwirkungen wie ein Benzylring liefern kann, trägt die Anwesenheit dieses Atoms in HD wahrscheinlich signifikant zu seiner Bindungsaffinität und Spezifizität gegen CDK2 bei, wie aus den Inhibitoraktivitäten verschiedener HD-Analoge in Tabelle 2 und 2 ersichtlich ist.
Von Interesse ist auch der vom Guadininring des HD besetzte Bereich des CDK2. Eine Überlagerung mit den anderen CDK2-Inhibitor-Komplexen zeigt, daß nur die Flavopiridol- und Staurosporin-Inhibitoren Gruppen haben, die in dieser Region des CDK2 gebunden sind, die teilweise mit der Tasche überlappt, wo das α-Phosphat des ATP gebunden ist. Ein Vergleich der Struktur des CDK2/HD-Komplexes mit der des CDK2/Flavopiridol-Komplexes [34] zeigt eine Anzahl von auffallenden Ähnlichkeiten zwischen den Bindungsarten dieser strukturell verschiedenen Inhibitoren. Der O2-Carbonylsauerstoff des HD ist nah bei der Position der O7-Hydroxylgruppe des Flavopiridol lokalisiert, die vom Benzopyranring vorspringt, der an die ATP-Purin-Bindungstasche gebunden ist.
In beiden Inhibitoren bilden die Sauerstoffatome eine durch Wasser vermittelte Wasserstoffbindung mit dem Hauptketten-Amid von Asp-145. Außerdem ist die N5-Aminogruppe am Guanidinring des HD nahe der Position der positiv geladenen Amingruppe des Piperidinylrings im CDK2/Flavopiridol-Komplex lokalisiert. Beide Atome sind in Wasserstoffbindungsabstand mit dem Seitenkettencarboxylat von Asp-145. Die energetisch günstige Wechselwirkung zwischen der positiv geladenen Amingruppe des Flavopiridols und dem negativ geladenen Carboxylat von Asp-145 würde einen wichtigen Beitrag zur Bindungskraft dieses Inhibitors an CDK2 liefern. Eine ähnliche Wechselwirkung scheint möglich im CDK2/HD-Komplex, da unter physiologischen Bedingungen der Guanidinring wahrscheinlich wenigstens teilweise bei N3 protoniert ist, wodurch eine (teilweise) positive Ladung geliefert wird, die zwischen N3, C11, N4 und N5 delokalisiert ist. Auch die Bewegung von Asp-145 wird in beiden CDK2/Inhibitor-Komplexen beibehalten. Sie ist auch ersichtlich in der Indirubin-5-sulfonat/CDK2-Struktur. Asp- 145 ist Teil des konservierten DFG-Motivs, das in den meisten Proteinkinase gefunden wird. Obgleich signifikant verschieden von denjenigen im CDK2/ATP-Komplex sind die Position und Konformation von Asp-145 in beiden CDK2/Inhibitor-Komplexen tatsächlich sehr ähnlich denjenigen im funktionell bedeutenderen Cyclin A/CDK2/ATP-Komplex (9A.)
In vitro-Hemmung der Presenilin-Phosphorylierung
Die Effekte von HD auf die in vitro und in vivo Phosphorylierung verschiedener Proteinsubstanzen, die für Alzheimers Krankheit von Bedeutung sind, wurden ebenfalls untersucht. Die große hydrophile Schleife von Presenilin-2 zwischen den Transmembrandomänen 6 und 7 ist ein Substrat für beide Casein-Kinase 1 und 2 in vitro; diese Domäne wird in vivo phosphoryliert [25]. Unter Verwendung eines Presenilin-2-MBP-Fusionsproteins als ein in vitro-Substrat wird CK1 oder eine dosisabhängige Inhibierung von Presenilin-2-Phosphorylierung durch HD beobachtet (3). MBP allein wurde durch CK1 nicht phosphoryliert.
In vitro und in vivo-Inhibierung der Pak1-Phosphorylierung durch neuronales CDK5/p35
Unter den physiologischen Substraten von CDK5/p35 befindet sich die neuronale Kinase Pak1 [17]. Beide Pak1 und p35 assoziieren mit Rac, einer kleinen GTPase der Rho-Familie. Pak1-Phosphorylierung durch CDK5/p35 führt zu einer Inhibierung der Pak1-Kinaseaktivität. Roscovitin inhibiert CDKS/p35 und die folgende Down-Regulierung von Pak1 sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Versuche wurden wiederholt mit HD (4). Zuerst wurde CDK5/p35 von P02-Ratten-Cortices immunogefällt und seine Kinaseaktivität gegen GST-Pak1K299 (kinase-toter Pak1-Mutant) in Gegenwart von HD, Roscovitin oder DMSO getestet, wie in [17]. Eine dosisabhängige Inhibierung von CDK5 durch HD wurde beobachtet (IC₅₀ zwischen 10 und 100 nM) (4A). Dann wurden in vivo-Versuche unter Verwendung von gezüchteten Neuronen durchgeführt, die von E18-Rattenembryo-Cortices erhalten wurden (4B). HD wurde zugesetzt, wenn die Kulturen vier Tage alt waren und auf den Zellen eine Stunde gelassen. DMSO wurde als eine Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden dann auf Eis in STM-Puffer lysiert und die Membranfraktion wurde isoliert [17]. Pak1 wurde dann immunogefällt und unter Verwendung von Histon H4 getestet. Die Menge der H4-Phosphorylierung gemessen durch die Intensität der Bänder auf dem Autoradiographiefilm wurde mit dem NIH-Bildgebungsprogramm quantitativ bestimmt. Als Kontrollen zur Beladung wurden Anti-Pak1 und Anti-p35-Western Blots durchgeführt. Wie früher gezeigt [35] steigt die Menge an p35 mit dem Ausmaß der CDK5/p35-Kinase-Inhibierung. Ein Anstieg der Pak1-Aktivität wurde beobachtet, der konsistent ist mit einer Inhibierung von endogener CDKS-Aktivität (4B).
HD-Inhibiert MAP-1B-Phosphorylierung durch GSK-3 in cerebellaren Granulat-Zellneuronen
GSK-3β wird inhibiert durch sowohl WNT-7a als auch Lithium in cerebellaren Granulat-Zellneuronen [49, 50]. WNT-7a und Lithium induzieren axonales Remodelling und Verlust einer phosphorylierten Form von MAP-1B, einem mit Protein assoziierten Mikrotubulus, der eine Rolle beim axonalen Auswachsen spielt. Da GSK-3β MAP-1B an einer vom Antikörper SMI-31 erkannten Stelle phosphoryliert, führt Inhibierung von GSK-3β durch WNT oder Lithium zum Verlust eines phosphorylierten MAP-1B, MAP-1B-P: Um den Effekt von HD auf neuronale Morphologie und MAP-1B-Phosphorylierung zu untersuchen, wurden cerebellare Granulatzellen in verschiedenen Konzentrationen von HD kultiviert.
Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Doppelimmuno-Fluoreszenzfärbung für GAP-43 und MAP-1B-P zeigt, daß MAP-1B-P längs des Axons vorhanden ist (A und B). 20-stündige Behandlung mit 10 μM HD hat keine offensichtliche Wirkung auf die Zellmorphologie (C) oder MAP-1B-P (D). Pfeile zeigen die gleichen Zellen an. 50 μM HD-Behandlung induziert axonale Ausbreitung, Axonverkürzung (E) und Verlust von MAP-1B-P von axonalen Prozessen (F). Pfeile zeigen die gleichen Zellen. 100 μM HD-Behandlung verursacht eine dramatischere Veränderung in der Zellmorphologie mit Ausbreitung und Verzweigung längs des Axons, einer vergrößerten Zahl von Filopodia und Verkürzung des Axons (G). MAP-1B-P geht bei den meisten axonalen Prozessen verloren (H). Pfeile zeigen Axons an, wo MAP-1B-P verloren ist. Maßstab (Bar) = 20 μM.
Western Blotting-Analyse von Zelllysaten zeigt eine allmähliche Abnahme an MAP-1B-P in Response auf steigende Dosen HD (I).
In Kontrollzellen mit langen Verfahren und sehr wenigen Filopodia (10A) ist MAP-1B-P längs der gesamten Länge des Axon vorhanden (10B). Bei niedrigen Konzentrationen (1 μM, 10 μM, 25 μM) hatte HD keine merkliche Wirkung auf die Morphologie der Zellen (10C) oder die Verteilung des MAP-1B-P (10D). Jedoch induzierte eine 50 μM HD-Behandlung axonale Ausbreitung und Verzweigung und eine Verkürzung der Axonlänge (10E) mit einem gleitenden Verlust von MAP-1B-P von den meisten der axonalen Vorgänge (10F). Eine Behandlung von Kulturen mit 100 μM HD verursachte eine dramatischere Veränderung in der Zellmorphologie, gekennzeichnet durch ausgiebiges Ver zweigen und Ausbreiten, Verkürzung der Axonlänge, und eine größere Zahl von Filopodia wurden beobachtet (10G), zusammen mit einem Verlust an MAP-1B-P von Vorgängen (10H). Das beobachtete axonale Remodelling ging einher mit einem Verlust an stabilen Microtubuli von Ausbreitungsbereichen der Axons. HD induziert den Verlust des MAP-1B-P in einer dosisabhängigen Weise, wie durch Western Blotting bestimmt (10I). Dieser Effekt ist ähnlich dem der mit Lithium oder WNT-7a-Behandlung beobachteten [37]. Da gezeigt wurde, daß HD direkt GSK-3β inhibiert, lassen diese Ergebnisse vermuten, daß in gezüchteten Neuronen der Verlust von MAP-1B-P und axonales Remodelling, die durch HD induziert werden, eine Konsequenz der GSK-3β-Inhibierung ist.
Inhibierung der tau Phosphorylierung durch GSK-3 in vivo und in vitro
Das Mikrotubulus-bindende Protein tau ist das Substrat mehrerer Kinasen, einschließlich GSK-3β und CDK5/p35. Bakteriell exprimiertes rekombinantes Human-tau wurde tatsächlich in vitro durch GSK-3β phosphoryliert, und diese Phosphorylierung wurde in einer Dosis-abhängigen Weise durch HD mit einem IC₅₀ bei etwa 33 nM inhibiert (5A). Die Wirkung von HD auf die in vivo Phosphorylierung des in Sie Zellen exprimierten Human-tau23 wurde dann untersucht (5B). Zellen wurde unbehandelt gelassen (–) oder sie wurden 0,2 μM Okadasäure (OA), 50 μM HD oder 50 μM Flavopiridol (FL), einem CDK-Inhibitor, der auch GSK-3β inhibiert, ausgesetzt. Htau 23 wurde aufgetrennt durch SDS-PAGE gefolgt von Immuno-Blotting mit verschiedenen Antikörpern. K9JA (ein pan-tau Antikörper) erkennt alle Präparate, welche tau enthalten. AT8, AT180 und PHF1 sind spezifische verschiedene phosphorylierte SP- oder TP-Motive, jeweils Ser202 & Thr205, Thr231 & Ser234 und Ser396 & Ser404 (numeriert wie in htau40, der längsten Human-tau-Isoform). AT100 erkennt an T212 und 5214 phosphoryliertes tau; diese Reaktion ist hochspezifisch für Alzheimer tau, tritt jedoch auch in Sf9-Zellen auf, vorausgesetzt, daß beide Stellen phosphoryliert sind. Das Verschwinden des AT100-Signals infolge einer Behandlung mit HD oder Flavopiridol zeigt an, daß beide Verbindungen in der Lage sind, GSK-3β-ähnliche Aktivitäten in Sf9-Zellen zu inhibieren.
III/Herstellung von CDK1,2,5, GSK-3β und Casein-Kinase 1-Inhibitoren.
Flüssige Formulierung
Eine Suspension oder Lösung von HD wird hergestellt durch Zugabe von 100 bis 1000 mg HD zu einem flüssigen Träger, wie Ethanol, Glycerin, einem nicht-wäßrigen Lösungs mittel, wie Polyethylenglykol, Ölen oder Wasser mit einem Suspensionsmittel, Konservierungsstoff, Geschmacksstoff oder Färbemittel, wobei die Menge des flüssigen Trägers so eingestellt wird, daß die geforderte Konzentration an aktivem Prinzip erhalten wird.
Tablette
Das 2-Brom-HD-Derivat wird in einen Träger, wie Magnesiumstearat, Stärke, Lactose, Sucrose oder Cellulose eingearbeitet und komprimiert.
Die jeweiligen Mengen werden in Abhängigkeit von der gewünschten Konzentration an aktivem Prinzip gewählt.
IV Untersuchung der zellularen Effekte des HD.
METHODEN
In vitro-Screen, orientiert auf NCI-Krankheit
Sechzig Humantumor-Zell-Linien, welche 9 Tumortypen umfaßten (Boyd und Paull, 1995) wurden 24 Stunden lang kultiviert, bevor sie während 48 Stunden kontinuierlich 0,01–100 μM Roscovitin ausgesetzt wurden. Ein Sulforhodaminin B-Protein-Assay wurde verwendet, um die Cytotoxizität abzuschätzen.
Thymidinaufnahme. HT29-18-C1-Zellen wurden in einer 24 Schachtplatte mit einer Zelldichte von 2105 Zellen/500 μl Medium/Schacht kultiviert. Subkonfluente Zellen wurden gespült und in ein serumfreies Medium 48 Stunden lang gegeben zur Hungersynchronisation. Die Freisetzung von der Wachstumsunterbrechung wurde durch Zugabe von 5% Serum in Gegenwart von HD vorgenommen. 2 μCi von Methyl-3-H-thymidin (spezifische Aktivität 50 Ci/mMol) (ICN Biomedical) wurden zu jedem Schacht während der letzten 4 Stunden einer 24 Stunden Behandlungsperiode zugesetzt. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und mit kalter 5%-iger Trichloressigsäure 45 Minuten bei 4°C behandelt. Die Zellen wurden mit Wasser gespült und mit 0,3 M NaOH 1 Stunde bei 37°C löslich gemacht. Die Radioaktivität wurde mit einem Beckman Beta Counter gemessen.
Zellkultur und Behandlung. HT29-18-C1, ein Subklon der Human-Colon-Adenocarcinoma-Zell-Linie HT29, wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (Gibco-BRL) ergänzt mit 10% FCS, 2 mM L-Glutramin (Eurobio) und 50 mg/ml Gentamycin (Gibco-BRL) bei 37°C, 10% CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden synchronisiert durch 48 Stunden Serumverweigerung. Sie wurden dann von der Wachstumsunterbrechung freigesetzt durch Zugabe von 5% fötalem Kalbsserum (FCS). In DMSO zubereitetes HD wurde sofort für 24 Stunden und mit Endkonzentrationen von 0 bis 80 μM dem Medium zugesetzt. In einigen Versuchen wurde HD 22 Stunden nach der Serumzugabe für weitere 24 Stunden zugesetzt. In anderen Versuchen wurde HD unsynchronisiert den Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden dann gewaschen und in 5% FCS-Medium kultiviert und gezählt oder analysiert durch FACS zu verschiedenen Zeiten.
Zellzählungen und fließcytometrische Zellzyklusanalyse. Die Zellen wurden mit einem Hämocytometer gezählt. Die Zellzyklusverteilung wurde durch Fließcytometrie analysiert. Die haftenden Zellen (1 × 10⁶) wurden trypsinisiert und in kaltem 70%-igen Ethanol 4 Stunden fixiert. Die fixierten Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und mit 5 μg RNAse-A (Sigma Chemicals) pro ml inkubiert und mit 25 μg/ml Propidiumiod (Aldrich) 1 Stunde bei 37°C gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden auf einem FACScancycofluorimeter unter Verwendung des cellFit Software-Programms (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) analysiert.
ERGEBNISSE
Zellulare Effekte von Hymenialdisin: Inhibierung der Proliferation
HD (0,01–100 μM; 48 Stunden Einwirkung) wurde in einem NCI-krankheitsorientierten in vitro Screening geprüft, d. h. an 60 Humantumor-Zell-Linien, welche 9 Tumortypen umfaßten (Leukämie, Nicht-kleine-Zellen-Lungenkrebs, Krebs des Zentralnervensystems, Melanome, Ovarialkrebs, Nierenkrebs, Prostatakrebs, Brustkrebs). Alle Linien zeigten eine ähnliche Empfindlichkeit gegen HD. Das durchschnittliche IC₅₀ war 15,1 μM (Roscovitin: 16 μM (Meijer et al., 1997); Olomoucin: 60,3 μM (Abraham et al., 1995)). Keine Korrelation wurde zwischen der Empfindlichkeit der Zellinien gegen Roscovitin und der Gegenwart von Wildtyp- oder mutiertem p53 gefunden.
Zelleigenschaften Inhibitor der Zellproliferation
IC₅₀ (μg/ml)
Zellulare Effekte von Hymenialdisin: Unterbrechung in S-Phase und beim G2/M-Übergang
Hymenialdisin verursacht Wachstumsinhibierung von HT29-18-C1
HT29-18-C1-Zellen wurden in G1 durch Serumentzug synchronisiert. Zum Zeitpunkt 0 wurden 5% FCS zugesetzt, und die Zellen wurden gleichzeitig behandelt (0) mit 10 μM HD oder diesem nicht ausgesetzt (0). Während 24 Stunden und danach wurden sie in 5% FCS-haltigem Medium kultiviert. Die Zellzahl wurde während einer 72 Stunden Periode alle 12 Stunden unter Verwendung eines Hämocytometers bestimmt. Die Kinetik der Wachstumsinhibierung ist in 11A angegeben. Die HD-Behandlung führte zu einer starken Wachstumsinhibierung, die sich durch den verringerten Anstieg der Zellzahl während einer 72 Stunden Periode im Vergleich mit der Kontrolle anzeigt. Serumbehandelte Zellen (Zeit 0) wurden verschiedenen HD-Konzentrationen ausgesetzt und nach 24 Stunden gezählt. Die Ergebnisse sind in 11B angegeben. Die Anzahl der nicht serumstimulierten Zellen (⎕) ist zum Vergleich angegeben. Der Inhibitoreffekt war HD-Dosis-abhängig mit einem IC₅₀ von 5 μM (11B). Trypanblaufarbstoffausschluß zeigte eine geringe Toxizität mit 10 und 80 μM HD bei 24 Stunden (> 95% bzw. 90% Lebensfähigkeit). Dieser antiproliferative Effekt von HD scheint reversibel zu sein. Tatsächlich begannen die Zellen nach 72 Stunden Kultur wieder zu proliferieren.
Hymenialdisin verursacht eine S-Phasen-Unterbrechung
Die Ergebnisse betreffend die Zellzyklusverteilung der HD-behandelten Zellen sind in 12A angegeben. HT29-18-C1 wurde 48 Stunden lang Serum-ausgehungert. Dann wurden 5% Serum zugesetzt (Zeit 0) und die Zellen wurden gleichzeitig mit 5 oder 40 μM HD für die nächsten 24 Stunden behandelt oder nicht behandelt. Die Zellen wurden dann fixiert und ihr Zellzyklusphasenstatus wurde bestimmt durch FACScan-Analyse, wie im Abschnitt Versuchsverfahren beschrieben. Die Zahlen geben % der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen an. 12B zeigt die Kinetik der S-Phasenakkumulierung in HD-behandelten Zellen. Serum wurde zum Zeitpunkt 0 zu Serum-ausgehungerten HT29-18-C1-Zellen zugegeben, die gleichzeitig für die folgenden 24 Stunden mit 10 μM HD behandelt wurden oder nicht. Die Zellzyklusverteilung wurde alle 24 Stunden während einer 72 Stunden Periode analysiert.
Eine Analyse mit dem fluoreszenzaktivierte Zellen-Sorter zeigte, daß die HD-Behandlung zu einer Ansammlung von Zellen in S-Phase relativ zu den unbehandelten Zellen führt. In Abwesenheit des HD schreiten Serum-stimulierte Zellen rasch voran, um in G2/M einzutreten (12A). Dagegen schritten HD-behandelte Zellen nach der Serumstimulation nicht in G2/M fort, sondern blieben in der S-Phase arretiert. Der Effekt von HD auf die Zellzyklusverteilung der HT29-18-C1-Kultur wurde auch im Verlauf der Zeit untersucht ( 12B). Synchronisierte Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μm HD 24 Stunden lang in 5% FCS-Medium gegeben. Die Zellen wurden dann weitere 48 Stunden in 5 % FCS-Medium kultiviert. In Übereinstimmung mit Zellzahlen wurde beobachtet, daß HD die Zellproliferation der Zellkultur während 72 Stunden inhibiert, wobei sich Zellen in S-Phase ansammeln (12B).
Hymenialdisin verursacht eine G2/M-Unterbrechung
In einem anderen Typ von Versuchen wurde HT29-18-C1 48 Stunden an Serum ausgehungert. 5% Serum wurden zum Zeitpunkt 0 zugesetzt und 10 μM HD wurden 22 Stunden später zugesetzt. Die Zellzyklusverteilung wurde 14 Stunden später, d. h. 36 Stunden nach der Serumstimulierung bestimmt durch FACScan-Analyse, wie im Abschnitt experimentelle Verfahren beschrieben. In diesem Fall hatten die Zellen eine Möglichkeit, in die S-Phase einzutreten, und die HD-Behandlung führte zu einer Ansammlung von Zellen in G2/M (13).
BIBLIOGRAPHIE

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Claims

Verwendung von Hymenialdisin oder dessen Derivaten der Formel I
worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und H oder Br bedeuten, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes derselben, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Anwendung bei neurodegenerativen Krankheiten bei denen die Deregulierung von Cyclin-abhängigen Kinasen, GSK-3β und Caseinkinase 1 eine Rolle spielt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Verbindung 4-(2-Amino-4-oxo-2-imidazolin-5-yliden)-4,5,6,7-tetrahydropyrrolo(2,3-c)azepin-8-on oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Verbindung 4-(2-Amino-4-oxo-2-imidazolin-5-yliden)-2-brom-4,5,6,7-tetrahydropyrrolo(2,3c)azepin-8-on oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Vorbeugung und Behandlung neurodegenerativer Krankheiten.
Verwendung nach Anspruch 4 zur Vorbeugung und Behandlung von Alzheimer's Krankheit.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Arzneimittel für eine orale Verabreichung zubereitet sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 wobei die Arzneimitel für eine injizierbare Verabreichung zubereitet sind.