DE69828042T2

DE69828042T2 - Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von krebs

Info

Publication number: DE69828042T2
Application number: DE69828042T
Authority: DE
Inventors: M. John PEZZUTO; K. Tapas DASGUPTA; S. Darrick KIM; Lou Mary SCHMIDT; Marc Konrad KUZMANOFF; Lydia Ling-Indeck
Original assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Current assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2018-05-15
Also published as: EP0981342B1; ATE284210T1; EP0981342A2; DE69828042D1; WO1998051294A2; EP1495754A2; EP1495754A3; WO1998051294A3; US5962527A; CA2289684A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Behandlung bösartiger Tumoren mit von pflanzenstammenden Verbindungen und deren Derivate.
Hintergrund der Erfindung
Im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte hat die Häufigkeit der Melanome mit einer höheren Rate zugenommen als jeder andere Krebstyp. Es wird spekuliert, dass einer von 90 kaukasischen Amerikanern in seinem Leben malignes Melanom entwickeln wird. Während eine zunehmende Anzahl der Melanome genügend früh diagnostiziert werden, um auf eine chirurgische Behandlung anzusprechen und eine zehn Jahres Überlebensrate grösser 90% zu erreichen, wird geschätzt, dass dieses Jahr in den USA beinahe 7000 Individuen, welche an metastasierendem Melanom leiden, sterben werden.
Die Behandlungsoptionen für Patienten mit metastasierendem Melanom, die keiner chirurgischen Exstirpation zugänglich sind, sind beschränkt. 5-(3,3-Dimethyl-1-triazenyl)-1-H-imidazol-4-carboxamid (Dacarbazin, DTIC) ist das wirksamste chemotherapeutische Einzelmittel für Melanome mit einer Gesamtantwortsrate von 24%. Die Antwortsdauer auf DTIC ist im allgemeinen recht dürftig. Kombinationstherapie mit anderen synthetischen und rekombinanten Mitteln beinhaltend N,N'-bis(2-Chlorethyl)-N-Nitrosoharnstoff (Carmustin, BCNU), Cisplatin, Tamoxifen, Interferon-alpha (INF-α) und Interleukin-2 (IL-2), haben in einigen Untersuchungen eine höhere Antwortsrate (z.B. 30–50%), aber eine dauerhafte, vollständige Antwortsrate ist ungewöhnlich und die Toxizität wird erhöht. Sequentielle Chemotherapie ist vielversprechend, aber die jetzi gen Behandlungsoptionen für Individuen, die an metastasierendem Melanom leiden, sind unbefriedigend.
Verschiedene Medikamente, welche sich von Naturprodukten ableiten wie z.B. Adriamycin (Doxorubicin)-Derivate, Bleomycin, Etoposid und Vincristin und deren Derivate wurden auf ihre Wirksamkeit gegen Melanome entweder als Einzelmittel oder in der Kombinationstherapie getestet. Jedoch, ähnlich wie die synthetischen und rekombinanten Verbindungen, zeigen diese Verbindungen tiefe Antwortsraten, transiente vollständige Antworten und hohe Toxizitäten.
Trotzdem, wie mittels bekannten und gegenwärtig gebrauchten Krebschemotherapeutikas gezeigt, stellen von pflanzenstammende Naturstoffe eine bewährte Quelle für wirksame Arzneimittel dar. Zwei solche nützlichen Naturproduktearzneimittel sind Paclitaxel (Taxol) und Camptothecin. Paclitaxel stammt ursprünglich aus der Rinde der pazifischen Eibe Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae) und wird gegenwärtig zur Behandlung von hartnäckigem oder Residualeierstockkrebs verwendet. Kürzlich wurden klinische Versuche durchgeführt, um die mögliche Rolle von Paclitaxel in der Behandlung des metastasierenden Melanoms zu untersuchen. Als Einzelmittel zeigt Taxol eine vergleichbare Aktivität wie Cisplatin und IL-2. Taxol funktioniert via einer einzigartigen Wirkungsweise und fördert die Polymerisierung von Tubulin. Daher beruht die durch Taxol vermittelte Antitumorwirkung auf seiner antimitotischen Aktivität. Das zweite Arzneimittel von Bedeutung, Camptothecin, wurde aus der Stammrinde eines chinesischen Baums, Camptotheca acuminata Decaisne (Nyssaceae), isoliert. Campothectin funktioniert auch via eines neuen Wirkmechanismus d.h. der Hemmung der Topoisomerase I. In Japan wurden Phase III Versuche eines wasserlöslichen Camptothecin Vorarzneimittelanalogas, Irinotican (CPT-11), gegen eine Vielzahl von Tumoren mit Antwortsraten, die von 0% (Lymphoma) bis 50% (kleinzelliger Lungenkrebs) reichen, abgeschlossen. Topotecan, ein anderes wasserlösliches Camptothecinanaloga, wird gegenwärtig in den Vereinigten Staaten klinischen Studien der Phase III unterzogen.
Frühere Antitumordaten aus verschiedenen Tiermodellen, welche Betulinsäure verwendeten, waren extrem variabel und offensichtlich inkonsistent. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Betulinsäure eine dosisabhängige Aktivität gegen das Walker 256 Mäusecarcinosarkomatumorsystem bei Dosishöhen von 300 und 500 mg/kg (Milligramm per Kilogramm) Körpergewicht aufweist. Ein folgender Bericht wies im Gegensatz daraufhin, dass die Verbindung im Walker 256 (400 mg/kg) und im L1210 Mäuselymphozytenleukämie Model (200 mg/kg) inaktiv ist. Versuche, die am nationalen Krebsinstitut durchgeführt wurden, bestätigten diese negativen Daten.
In ähnlicher Weise wurde die Antiturmoraktivität von Betulinsäure im P-388 Mäuselymphozytentestsystem vorgeschlagen. Die Aktivität wurde jedoch nicht gestützt durch Versuche, die durch das nationale Krebsinstitut durchgeführt wurden. Kürzlich wurde gezeigt, dass Betulinsäure phorbolesterinduzierte Entzündung und Epidermalornithin Decarboxylase Anhäufung im Mäuseohrmodel blockiert. Daher wurde von einigen schwachen Anzeichen einer Antitumoraktivität von Betulinsäure berichtet, aber bis zur vorliegenden Erfindung haben keine früheren Berichte oder Daten angedeutet, dass Betulinsäure zur selektiven Kontrolle oder Behandlung von menschlichem Melanoma verwendbar ist. Ausserdem wurden bis heute keine Informationen betreffend die selektive Aktivität von Beutlinsäuresderivaten gegen Melanomazellen publiziert.
Obwohl Betulinsäure eine selektive Hemmung von malignem Melanoma gezeigt hat, haben zusätzliche Studien gezeigt, dass Betulinsäure und Betulinsäurederivate andere Arten von Krebszellen wie z.B. Neuroblastoma, hemmen können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung einer Verbindung, welche eine Struktur aufweist
worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, HO-N, CH₃O-N, H₂N, OH und C₆H₄CO₂, R₂ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHO, CO₂H, CHNOCH₃, CHNOH und CH₂OH und R₃ ist C(CH₃)₃ oder C(CH₃)=CH₂
für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Neuroblastoma.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um Betulinsäure mit R₁ = OH, R₂ = CO₂H und R₃ = C(CH₃)=CH₂.
Die aktive Verbindung ist Betulinsäure oder ein Derivat der Betulinsäure. Die Betulinsäure kann mittels eines Verfahrens isoliert werden, welches die Schritte der Herstellung eines Extrakts aus der Stammrinde von Ziziphus mauritiana und die Isolation der Betulinsäure umfasst. Alternativ kann Betulin aus dem Extrakt isoliert werden und als Vorläufer für Betulinsäure verwendet werden, welche aus Betulin durch eine Reihe synthetischer Schritte hergestellt wird. Die Betulinsäure kann aus dem Extrakt isoliert werden durch Vermittlung eines selektiven zytotoxischen Profils gegen menschliches Melanom aus einer Typenliste menschlicher Krebszellen, Durchführung einer Bioassay gerichteten Fraktionierung basierend auf dem biologischen Aktivitätsprofil unter Verwendung kultivierter menschlicher Melanomzellen (MEL-2) als Monitor und daraus Erhalt der Betulinsäure als aktive Verbindung. Die erhaltene Betulinsäure kann zur Vorbeugung oder Hemmung des Tumorwachstums verwendet werden oder sie kann zu einem Derivat zur Vorbeugung oder Hemmung des Tumorwachstums umgesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Problem der ungenügenden Verfügbarkeit, welches mit synthetischen Krebsmitteln zusammenhängt, mittels Verwendung der leicht verfügbaren und in der Natur vorkommenden Betulinsäure oder eines Derivates davon zu überwinden.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Betulinsäurederivaten, welche eine Aktivität gegen Krebszellen aufweisen, und die physikalische Eigenschaften haben, welche dazuführen, dass die Derivate leichter in Zusammensetzungen eingebaut werden können, die an ein Individuum zur Vorbeugung oder Hemmung von Krebszellwachstum verabreicht werden können.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Patentbeschreibung, welche nicht beabsichtigen den Umfang der Erfindung einzuschränken, sondern stellen blosse Ausgestaltungen der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung dar.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Betulinsäure, 3β-Hydroxy-lup-20(29)-en-28-säure, ist ein Naturprodukt, welches aus mehreren Gattungen höherer Pflanzen isoliert wird. Mittels einer Bioassay gerichteten Fraktionierung der Stammrinde von Ziziphus mauritiana Lam. (Rhamnaceae) wurde Betulinsäure, ein pentazyklisches Triterpen, als aktive Verbindung isoliert, welche eine selektive Zytotoxizität gegen kultivierte menschliche Melanomzellen zeigte. Die für die Zytotoxizität beurteilten Zellinien waren A431 (squamo sus), BC-1 (Brust), COL-2 (Dickdarm), HT-1080 (Sarkoma), KB (menschliches Oralepidermoidkarzinom), LNCaP (Prostata), LU-1 (Lunge), U373 (Gliom) und MEL-1, -2, -3 und -4 (Melanom). Es wurde gefunden, dass Betulinsäure wegen ihres einzigartigen in vitro und in vivo Zytotoxizitätsprofils eine hervorragende Antitumorverbindung gegen menschliches Melanom ist. Betulinsäure zeigt eine starke selektive Antitumoraktivität gegen Melanome durch Induktion von Apoptose. Die selektive Zytotoxizität von Betulinsäure und ihre fehlende Toxizität gegen normale Zellen gewähren einen vorteilhaften therapeutischen Index. Zusätzlich wurde berichtet, dass Betulinsäure anti-HIV Aktivität aufweist.
Die Rinde der weissen Birke, Betula alba, enthält Betulin (bis ungefähr 25%), lup-20(29)-en-3β,28-diol und Betulinsäure (0.025%), aber es ist schwierig, eine genügende Menge Betulinsäure zu isolieren, um einen umfangreichen Bioassay durchführen zu können. Es wurde gefunden, dass eine Menge Betulinsäure aus Betulin mittels eines einfachen synthetischen Ansatzes zur Verfügung gestellt werden kann. Von einer Anzahl synthetischer Mehrschritte-Umwandlungen von Betulin zu Betulinsäure wurde berichtet, aber diese synthetischen Sequenzen leiden an einer geringen Gesamtausbeute. Von einer übersichtlichen Zweischritteumwandlung von Betulin zu Betulinsäure mit guter Ausbeute wurde in Synthetic Communications, 27(9), S. 1607–1612 (1997) berichtet.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde das in vitro Wachstum von MEL-2 Zellen durch Betulinsäure gehemmt d.h. ein ED₅₀ Wert von ungefähr 2 μg/ml. Jedoch wurde keine der anderen mittels dieses Verfahrens d.h. Verfahren A, getesteten Zellinien durch Betulinsäure beeinflußt (d.h. ED₅₀ Werte von grösser als 20 μg/ml). Solch eine klar definierte Zelltypspezifität, die von Betulinsäure gezeigt wird, ist sowohl neu als auch unerwartet.
Zum Beispiel, wie in Tabelle 1 dargestellt, zeigen andere bekannte Antitumormittel wie Paclitaxel, Camptothecin, Ellipticin, Homoharringtonin, Mithramycin A, Podophyllotoxin, Vinblastin und Vincristin eine relativ starke, nicht selektive zytotoxische Aktivität mit keiner wahrnehmbaren Zelltypselektivität. Desweitern ist die durch Betulinsäure vermittelte zytotoxische Antwort nicht beschränkt auf MEL-2 Melanomzellinien. Dosis-Antwort-studien, die mit zusätzlichen Melanomzellinien durchgeführt wurden, welche als MEL-1, MEL-3 und MEL-4 bezeichnet werden, zeigten ED₅₀ Werte von 1.1, bzw. 3.3 und 4.8 μg/ml.
In der folgenden Tabelle 1 wurden die extrahierte Betulinsäure und die anderen reinen Verbindungen auf Zytotoxizität gegen die folgenden kultivierten menschlichen Zellen getestet: A431 (squamosus Zellen), BC-1 (Brust), COL-2 (Dickdarm), HT-1080 (Sarkoma), KB (menschliches Oralepidermoidkarzinom), LNCaP (Prostata), LU-1 (Lunge), U373 (Gliom) und ZR-75-1 (Brust).
Wie unten ausführlich diskutiert wird, zeigte Betulinsäure auch eine hervorragende zytotoxische Aktivität gegen menschliche Neuroblastomazellinien.
Betulinsäure (1) hat die Strukturformel
Betulinsäure ist ziemlich weitverbreitet im Pflanzenreich und als Verbindung, die oft angetroffen wird, wurden einige vorhergehende biologische Aktivitäten berichtet.
Betulinsäure wurde aus einer luftgetrockneten, gemahlenen Stammrindenprobe (450 g) von Z. mauritiana mittels Extraktion mit 80% wässrigem Methanol erhalten. Der wässrige Methanolextrakt wurde dann nacheinander mit Hexan und Ethylazetat getrennt, um Hexan, Ethylazetat und wässrigen Extrakt zu ergeben. Unter diesen Extrakten zeigte der Ethylazetatextrakt (13.5 g) eine zytotoxische Aktivität gegen eine kultivierte Melanomzellinie (MEL-2) mit einem ED₅₀ von 3.7 μg/ml. Der Ethylazetatextrakt wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung von Hexan-Ethylazetat (4:1 bis 1:4) als Eluent chromatographiert, um 10 Fraktionen zu ergeben. Fraktionen 3 und 4 wurden vereinigt und einer weiteren Fraktionierung unterworfen, um eine aktive Fraktion (Fraktion 16) zu liefern, welche in der Dünnschichtchromatographie [R_f 0.67:CHCl₃:MeOH (Chlorform:Methanol) (10:1] einen einzelnen Hauptfleck ergab und nach wiederholter Kristallisation aus Methanol 72 mg farblose Nadeln ergab (Gesamtausbeute aus getrocknetem Pflanzenmaterial: 0.016% w/w).
Die isolierte aktive Verbindung Betulinsäure (ED₅₀ von 2.0 μg/ml für MEL-2) hat eine Molekülformel von C₃₀H₄₈O₃ wie mittels hochauflösender Massenspektralanalyse bestimmt wurde, einen Schmelzpunktbereich von 292–293°C (Zerfall). Die in der Literatur angegebenen Schmelzpunkte bewegen sich zwischen 290–293°C. Ein gemischter Schmelzpunktbereich mit einer bekannten Probe von Betulinsäure wurde nicht gedrückt. Die optische Drehung der Verbindung wurde bei +7.3° (c = 1.2; Pyridin) (Lit. +7.5°) gemessen. Die Identität der isolierten Verbindung als Betulinsäure wurde mittels Vergleich der obigen physikalischen Eigenschaften sowie ¹H-NMR, ¹³C-NMR und Massenspektralanalyse der isolierten Verbindung mit physikalischen Daten und Spektren einer bekannten in der Literatur beschriebenen Probe von Betulinsäure bestätigt.
Es wurde berichtet, dass Betulinsäure nicht zytotoxisch ist hinsichtlich kultivierter KB Zellen, was durch die in der Tabelle 1 zusammengefassten Daten bestätigt wird. Zytotoxizität der ungereinigten Extrakte und gereinigter Verbindungen wurde für eine Anzahl kultivierter menschlicher Zellinien bestimmt. Tabelle 1 zeigt die verschiedenen Typen von Krebszellen, die bewertet wurden. Die Zellen wurden in geeigneten Medien und unter Standardbedingungen kultiviert. Um logarithmisches Wachstum zu erhalten, wurden die Medien 24 Stunden vor dem Zytotoxizitätstest gewechselt. Am Tage des Tests wurden die Zellen mittels Trypsinierung geerntet, gezählt, in Medium verdünnt und zu 96 Löcherplatten gegeben, welche die Testverbindungen in DMSO gelöst enthielten; die DMSA Endkonzentration war 0.05%.
Es wurde auch gefunden, dass Betulinsäure in Neuroblastomazellinien Apoptose induziert und daher als Verbindung zur Hemmung und Behandlung von Neuroblastoma dienen kann. Im allgemeinen kann Neuroblastoma sich in gewisser klinischen Situationen spontan durch Apoptose zurückentwickeln. Es wird seit langem anerkannt, dass Neuroblastoma während der fötalen Entwicklung und in der Mehrzahl der 4S Stadien Kinder mit disseminerter Krankeit, welche weniger als 1 Jahr alt sind, spontane Regression zeigt. Die Krankheit des Stadiums IV bildet sich in 50% der Patienten ohne Chemotherapie zurück.
Die Mechanismen, durch welche dies geschieht werden nicht vollständig verstanden, wurden aber als programmierter Zelltod oder Apoptose theoretisiert. Die Fähigkeit von Betulinsäure in menschlichem Melanoma Apoptose zu induzieren, wurde oben mit in vitro und in vivo Modellsystemen diskutiert.
Wie Neuroblastoma stammt Melanoma von Zellen der Neuralleiste ab. Es wurde daher theoretisiert, dass Neuroblastomazellen die Maschinerie für programmierten Zelltod besitzen und dass mittels Betulinsäure Apoptose induziert werden könnte.
Die Wirkung der Betulinsäure auf NB Zellen beruhend auf: (a) den obigen Melanomadaten, (b) der Herkunft von Melanoma und Neuroblastoma aus der Neuralleiste, und dem Potential der NB Zellen Apoptose zu untergehen, wurde untersucht. Neun menschliche Neuroblastomazellinien wurden in vitro mit 0 bis ungefähr 20 μg/ml Konzentrationen Betulinsäure für 0–6 Tage behandelt. Merkliche morphologische Veränderungen wurden innerhalb von 3 Tagen festgestellt. Insbesondere zogen die Zellen ihre axonähnlichen Ausläufer zurück, wurden nicht-adhärent und kondensierten zu irregulären, dichten Spheroiden, die für den apoptotischen Zelltod typisch sind (ED₅₀ = 14–17 μg/ml). DNA Fragmentierungsanalyse zeigte Leiterbildung in der Region von 100–1200 bp in 3/3 mit Betulinsäure für 24–72 Stunden behandelten Neuroblastomazellinien. Betulinsäure induziert daher in vitro in Neuroblastoma Apoptose. Keine unspezifische Toxizitäten oder negative Wirkungen wurden beobachtet.
Neuroblastoma ist der am häufigsten auftretende feste Tumor der frühen Kindheit und entwickelt sich in der adrenalen Medulla oder sympathischen Ganglien. Die Einführung von aggressiven Kombinationschemotherapieprotokollen hat die Überlebensrate für viele Formen von Kindheitsneoplasmen, beinhaltend z.B. akute Leukämie, Wilm's Tumor und Osteosarkoma, erhöht. Neuroblastome in einem fortgeschrittenen Stadium bleibt durch Chemotherapie nicht behandelbar. Neuroblastoma hat eine besonders tiefe Prognose (d.h. weniger als 30% Überlebenschance) in Patienten, die älter als 2 Jahre sind, in Patienten in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium und/oder Krankheiten, die durch N-myc Genamplifikation charakterisiert sind. N-myc ist ein Onkogen, das ein entwicklungsabhängiges Expressionsmuster aufweist, das auf die embryonale und fötale Entwicklung beschränkt ist. Expression von N-myc ist in normalen, adulten Gewebe nicht nachweisbar. N-myc Amplifikation in Neuroblastomatumorzellen ergibt eine schlechte Prognose, unabhängig vom Alter und Stadium.
Im Gegensatz dazu werden mehr als 75% der Neuroblastomapatienten einer frühen Krankheitsphase, die bei der Diagnose weniger als 2 Jahre alt sind, und diejenigen, deren Tumoren nur eine einzige Kopie von N-myc haben, geheilt. Ausserdem gibt es ein einzigartiges fortgeschrittenes Neuroblastomastadium, welches in Kindern, die jünger als 1 Jahr sind, vorkommt d.h. Stadium IV-S, das eine bemerkenswert hohe spontane Regressionsrate von beinahe 100 mal derjenigen von anderem menschlichem Krebs zeigt. Dies weist daraufhin, dass mindestens eine Form von Neuroblastoma einen verzögerten Beginn von Apoptose durch einen noch zu definierenden Mechanismus zeigen kann. Kürzlich wurde die Expression verschiedener Gene, beinhaltend N-myc, mit der Induktion oder Supression von Apoptose assoziiert. Expression von bcl-2 (und des verwandten bcl-x Gens) korrelieren mit der Suppression von Apoptose. Überexpression von bcl-2 und bcl-x korreliert mit der Überexpression von N-myc und beeinflusst die durch Chemotherapie induzierte Apoptose, möglicherweise mittels Interaktion mit dem „Multidrug resitance associated" Protein Gen MRP (Muldidrug resistant Protein). MRP ist in Neuroblastoma mit einer schlechten Prognose exprimiert, welches auch Überexpression von N-myc zeigt. Während bcl-2 Apoptose unterdrückt, beschleunigt sein heterodimerer Partner bax Apoptose und sein Homolog bak wirkt der durch bcl-2 unterdrückten Apoptosemachinerie entgegen. Sowohl bcl-2 und myc scheinen unter der Kontrolle des Tumorsuppressors p53 zu sein.
Einige Krebsmittel scheinen mittels Induktion der Apoptose zu wirken. Wie oben diskutiert wurde, induziert Betulinsäure in kultivierten Melanomazellen Apoptose und führt zu einer beinahe vollständigen Regression von menschlichen Melanomatumoren in athymischen Mäusen. Diese Beobachtung steht im Widerspruch zu den wenigen früheren Berichten der tumorhemmenden Eigenschaften von Betulinsäure, welche höchstens eine marginale Wirkung nahelegen. Die Resultate von vielen der frühen Betulinsäurestudien wurden durch nachfolgende Studien widerlegt. Der ED₅₀ für Betulinsäure gegen Melanomazellen in Kultur war ungefähr 1.1 bis ungefähr 4.8 μg/ml. Betulinsäure zeigte keine Toxizität in athymischen Mäusen bei 500 mg/kg Körpergewicht (ungefähr 35 g pro Behandlung für eine durchschnittliche Person). Betulinsäure ist ein hervorragendes antineoplastisches Mittel, weil es eine geringe nicht spezifische Toxizität und eine hohe spezifische Toxizität für Neoplasmen aufweist und weil es selektiven programmierten Zelltod in Tumorzellen auslöst.
Wie unten dargestellt, besitzen Neuroblastomazellen eine funktionale, programmierte Zelltodmaschinerie und Apoptose kann durch Betulinsäure induziert werden. Diese Schlussfolgerungen basieren auf den folgenden Beobachtungen:
(a) Neuroblastoma und Melanoma teilen eine gemeinsame Neuralleisteherkunft, (b) Neuroblastoma des Stadiums IV zeigt eine offensichtlich spontane Apoptoseregression und (c) Betulinsäure induziert in vitro und in vivo Apoptose in Melanoma.
Die Materialien und Verfahren, die verwendet wurden, um die Fähigkeit von Betulinsäure in Neuroblastoma Apoptose zu induzieren zu testen, waren wie folgt:
Etablierte, menschliche Neuroblastomazellinien wurden verwendet. N-myc amplifizierte Zellinien (LAN-5; IMR-5; und NBL-W und die entsprechende Zellinie NBL-WR, etabliert zum Zeitpunkt des Rückfalls) und nicht amplifizierte Zellinien (SKNSH und SHSY5Y) ebenso wie die Einzelkopie N-myc Zellinie NBL-S mit einer erhöhten N-myc Proteinexpression wurden verwendet. Zusätzlich wurden zwei N-myc Zellinien, die Antisense RNA exprimieren, (NBAS 5 und NBAS 6), die von NBL-S Zellen abstammen, in die Studie miteinbezogen. Diese Zellinien sind dadurch einzigartig, dass die N-myc Proteinexpression auf 50% herunter reguliert wurde, was zu einer verringerten Klonbildung im Weichagar führt. Alle Zellinien wurden in Zellkultur bei 5% Kohlendioxid (CO₂), 37°C in RPMI-1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum und Zusatzstoffen beinhaltend Penizillin-Streptomycin, Amphotericin B und Glutamin, gehalten.
Lichtmikroskopie: 1 × 10⁵ Neuroblastomazellen wurden in 24 Löcher Platten ausplattiert. Die Zellen wurden mit 0, 1, 3, 6, 10 und 20 μg/ml Betulinsäure für sechs Tage behandelt. Die Wirkung der Betulinsäurebehandlung auf die Ablösung und die Anhäufung von frei schwimmenden, nicht adhärenten Zellen wurde aufgezeichnet.
Sulforhodamin B Versuch: ED₅₀ Werte, welche aus den Betulinsäurebehandlungen resultierten, wurden mittels der Sulforhodamin (SRB) Farbstofffreisetzungstechnik gemessen. Vier Neuroblastomazellinien (SKNSH, IMR-5, NBL-S, und LAN-5) wurden mit 0, 6 und 20 μg/ml Betulinsäure behandelt. Die Zellen wurden nach 0, 6, 24 und 48 Stunden nach Beginn der Betulinsäurebehandlung gesammelt. Zellen wurden mit 50% Trichloressigsäure (bei 4°C) fixiert und mit 0.4% SRB in 1% Essigsäure gefärbt. Das gebundene SRB wurde mit 0.1 M Tris Base freigesetzt und die Absorption bei A₅₇₀ gemessen. Resultate wurden als „Hemmungsrate" aufgezeichnet ((1-Behandlung/Kontrolle) × 100%).
Propidiumiodid Versuch: Der Nachweis von apoptotischen Zellen wurden mittels der modifizierten Propidiumiodidtechnik von R. D. Jacobson et al., Nature, 361 (1993), Seiten 365–369, durchgeführt. Drei Neuroblastomazellinien (SKNSH, IMR-5 und LAN-5) wurden mit 0, 6, und 20 μg/ml Betulinsäure für 0, 6, 24 und 48 Stunden behandelt und mittels der Standardtechnik gesammelt. Die Zellen (5 × 105) wurden bei tiefer Geschwindigkeit (400 × g) für 10 Minuten zentrifugiert, dann mit Kaliumchlorid (KCl) (75 mM) für 10 Minuten gespült. Die Zellen wurden pelletiert und zweimal mit Methanol/Essigsäure (MeOH/AcH) (3:1) für 15 Minuten behandelt und pelletiert. Zellen wurden auf Objektträgern fixiert und für 72 Stunden luftgetrocknet. Die Objektträger wurden mit 0.05 μg/ml Propidiumiodid in gepufferter Phosphatsaline (PBS) und 100 μg/ml RNAse A für 30 Minuten im Dunkeln inkubiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
DNA Fragmentierung: Internukleosomale Fragmentierung bildet ganzzahlige Mehrfache von 180–200 bp Fragmenten. Eine Ca²⁺ abhängige Endonuklease spaltet internukleosomale Linker DNA auf die Grösse der DNA, die um eine einzelnes Histonoctamer gewickelt ist. Dieses Abbaumuster kann mittels Agarosegelelektrophorese als DNA Leiter beobachtet werden. Drei Neuroblastomazellinien (SKNSH, IMR-5, und LAN-5) wurden auf internukleosomale Fragmentierung nach Behandlung mit 20 μg/ml Betulinsäure untersucht und nach 0, 6, 24 und 48 Stunden nach Beginn der Betulinsäurebehandlung gesammelt. Das Verfahren von M. K. Ritke et al., Mol. Pharmacol., 46 (1994), Seiten 605–611, wurde zur Sichtbarmachung der DNA Fragmentierung verwendet. Nach in vitro Behandlung mit Betulinsäure wurden ungefähr 2 × 10⁶ Zellen mittels Zentrifugation für 5 Minuten bei tiefer Geschwindigkeit (ungefähr 100fache Schwerkraft) pelletiert. Die Zellen wurden mit normaler Saline (0.85% NaCl) gewaschen, dann für 1 Stunde bei 50°C in Lysispuffer (20 μl/Zellpellet; 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0.5% Natriumlaurylsarkosin, 10 μg Proteinase K, pH 8.0) solubilisiert. Nach anfänglicher Lyse (1 Stunde) wurde RNase A (10 μg mit 0.5 mg/ml) zugegeben und für 1 Stunde bei 50°C inkubiert. Proteolyse und RNA Degradation wurden durch Erhöhung der Probentemperatur auf 70°C für 5 Minuten beendet. Agarosegele (2 Gew-%) wurden vorbereitet und mit TBE Puffer fahren gelassen, um die DNA Fragmentierung sichtbar zu machen. Proben wurden mittels 1% Agarosezapfen in die Vertiefungen geladen und über Nacht bei 40 V (Raumtemperatur) gefahren. Die Neuroblastoma Zellinien wurden mit menschlichen Sarkomazellen HT1080 und Mel-2 Melanomazellen unter den beschriebenen Bedingungen verglichen.
Die Resultate dieser Testverfahren sind unten in der Tabelle 3 zusammengefasst.
Lichtmikroskopie: Anfängliche Untersuchungen von Betulinsäure für zytotoxische Aktivität auf menschliche Neuroblastoma Zellinien zeigten klassische Apoptose. Ein Zeitverlauf von sechs Tagen mit einer Konzentrationsreihe von 1 bis 20 μg/ml Betulinsäure zeigte, dass alle neun getesteten Neuroblastoma Zellinien auf die zytotoxische Aktivität von Betulinsäure empfindlich waren, wie in der Tabelle 3 dargestellt ist. Bei der höchsten getesteten Konzentration (d.h. 20 μg/ml) wurden alle Neuroblastomazellen innerhalb von 72 Stunden getötet. Nach der Betulinsäurebehandlung zeigten Neuroblastomazellen, welche Apoptose durchmachten, ein charakteristisches Aussehen. Adhärente Zellen, welche eine Einzelschicht bilden, zogen ihre axonähnlichen Fortsätze ein und lösten sich ab. Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen wurden die behandelten Zellen sphäroid mit Ausstülpungen.
Neuroblastomazellen (1 × 105) wurden in 24 Löcher Platten gegeben und wurden mit Betulinsäure in Standardkulturmedium für 3 Tage behandelt. Die Wirkung von Betulinsäure auf die Ablösung und Anhäufung von frei schwimmenden, nicht adhärenten Zellen wurde aufgezeichnet. Eine sechs Punkte Skala wurde verwendet mit (–) für keine beobachtbare Zytotoxizität, (+/–) für mögliche aber keine eindeutige Zytotoxizität, und eine Abstufungsform (+ bis ++++), um eine klar beobachtbare zytotoxische Wirkung mit zunehmender Zahl eingestülpter, abgelöster Zellen mit zunehmenden Zelltrümmern anzugeben.
Sulforhodamin B Versuch: SRB Quantifizierung zeigte eine zunehmende Hemmungsrate sowohl für erhöhte Betulinkonzentrationen wie auch für erhöhte Behandlungszeiten mit Betulinsäure. Der ED₅₀ war ungefähr 14 bis 17 μg/ml für eine Betulinsäurebehandlung von 48 Stunden.
Propidiumiodid: Drei menschliche Neuroblastoma Zellinien (SKNSH, IMR-5 und LAN-5) wurden mit 0, 6, und 20 μg/ml Betulinsäure behandelt und die Zellen wurden bei 0 und 48 Stunden nach Beginn der Betulinsäurebehandlung gesammelt. Bei 20 μg/ml waren die Mehrheit der Zellkerne der Neuroblastomazellen zerstört und restliche Zellkernfragmente waren im Einklang mit apoptotischen Körpern.
DNA Fragmentierungsanalyse: Basierend auf mikrographischen Beobachtungen wurden drei Zellinien (i.e SKNSH, IMR-5 und LAN-5) auf das Vorhandensein von internukleosomaler Fragmentierung untersucht. DNA Fragmentierung, die für Apoptose typisch ist, war nach Behandlung mit 20 μg/ml Betulinsäure für 72 Stunden in allen drei Zellinien offensichtlich. SKNSH zeigte das ausgeprägteste Bandenmuster.
Die oben beschriebene morphologische und biochemische Analyse zeigt, dass Betulinsäure in Neuroblastomazellen Apoptose induziert. Behandlung mit 10–20 μg/ml Betulinsäure führte zu mehr als 90% Zelltod nach 72 Stunden. Zytotoxizitätsstudien zeigten ED₅₀ Werte im Bereich von 14–17 μg/ml bei 48 Stunden. Lichtmikroskopische Beobachtungen enthüllten, dass axonähnliche Projektionen eingezogen wurden und Propidiumiodid Färbung zeigte Fragmentierung des Kerns nach Behandlung mit Betulinsäure. Schlussendlich wurde eine molekulare Analyse der Apoptose mittels DNA Fragmentierung untersucht und die DNA Leiter, die für Apoptose charakteristisch ist, war nach der Behandlung mit Betulinsäure in drei verschiedenen Neuroblastoma Zellinien offensichtlich.
Die Prognose für Neuroblastoma in einem fortgeschrittenen Stadium in Kindern, die älter als 2 Jahre sind, bleibt trotz multimodaler, aggressiver Therapie mit einer Gesamtüberlensrate von weniger als 30% düster. Einige Krebsmittel beinhaltend Vincristin, Stoposid und Cisplatin, induzieren Apoptose. Jedes dieser Mittel wird in gängigen Protokollen zur Behandlung von Neuroblastoma in einem fortgeschrittenen Stadium oft verwendet, jedoch weisen alle eine signifikante nicht spezifische Toxizität auf. Weil eine weitere Intensivierung der Therapie eine nicht tolerierbare Toxizität erzeugen kann, sind alternative pharmakologische Ansätze, welche eine minimale nicht spezifische Toxizität aufweisen, wünschenswert. Betulin säure ist für menschliche Neuroblastomazellen in vitro offenbar durch Induktion von Apoptose zytotoxisch. Betulinsäure ist daher ein wertvolles Krebsmittel, weil es in empfänglichen Zellen Apoptose induziert und keine nicht spezifische Toxizitäten zeigt.
Zusätzlich zu Betulinsäure können Betulinsäurederivate zur Behandlung oder Hemmung von Tumorwachstum verwendet werden. Betulinsäurederivate beinhalten sind aber nicht beschränkt auf Betulinsäureester, wie z.B. Betulinsäure verestert mit einem Alkohol, der ein bis sechzehn Kohlenstoffatome, bevorzugt ein bis sechs Kohlenstoffatome aufweist, oder Amide der Betulinsäure wie z.B. Betulinsäure, die mit Ammoniak oder einem primären oder sekundären Amin mit Alkylgruppen, die ein bis zehn und bevorzugt ein bis sechs Kohlenstoffatome aufweisen, zur Reaktion gebracht wird.
Ein anderes Betulinsäurederivat ist ein Salz der Betulinsäure. Beispielhaft aber nicht einschränkend beinhalten Betulinsäuresalze ein Alkalimetallsalz wie ein Natrium- oder Kaliumsalz; ein Erdalkalisalz wie ein Kalzium- oder Magnesiumsalz; ein Ammonium- oder Alkylammoniumsalz, wobei das Alkylammoniumkation eine bis drei Alkylgruppen aufweist und jede Alkylgruppe hat unabhängig ein bis vier Kohlenstoffatome; oder Übergangsmetallsalz.
Andere Betulinsäurederivate können auch in der Zusammensetzung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein anderes Derivate ist das Aldehyd, welches der Betulinsäure oder Betulin entspricht. Ein anderes Derivate ist azetylierte Betulinsäure, wobei eine Azetylgruppe sich an der Stelle der Hydroxylgruppe der Betulinsäure befindet.
Betulinsäurederivate wurden synthetisiert und biologisch bewertet, um zu zeigen, dass Betulinsäurederivate selektive Antitumoraktivität in vitro gegen Krebszellinien besitzen. Es wurde gezeigt, dass die Modifizierung der Grundstruktur von Betulinsäure zahlreiche Betulinsäurederivate liefert, welche zu Antitumormitteln ent wickelt werden können, insbesondere hinsichtlich menschlichem Melanom und Neuroblastoma. Die Antitumoraktivität der Betulinsäurederivate ist wichtig, da Betulinsäure, obwohl sie eine hoch selektive Aktivität gegen Melamome zeigt, auch eine geringe Wasserlöslichkeit besitzt. Die geringe Wasserlöslichkeit von Betulinsäure kann jedoch überwunden werden, indem geeignete Betulinsäurederivate zur Verfügung gestellt werden. Die Modifikation der Betulinsäuregrundstruktur kann auch die Antitumoraktivität gegen verschiedene Krebszellen weiter verbessern.
Eine Untersuchung der Betulinsäurestruktur d.h. der Verbindung (1) zeigt, dass Betulinsäure drei Stellen d.h. die C-3, C-20 und C-28 Stellen enthält, an welchen funktionelle Gruppen eingeführt werden können. Zusätzlich können die eingeführten funktionellen Gruppen, falls gewünscht, auch modifiziert werden. Durch eine Reihe von Reaktionen an diesen drei Stellen können eine grosse Anzahl Betulinsäurederivate hergestellt und auf Biowirksamkeit gegen eine Reihe von Tumorzellinien bewertet werden, insbesondere gegen menschliche Melanomzellinien.
Bezüglich der Modifikationen an der C-3 Stelle von Betulinsäure kann die Hydroxylgruppe an der C-3 Stelle durch eine Oxidationsreaktion in eine Carbonylgruppe umgewandelt werden. Die daraus resultierende Verbindung ist Betulonsäure d.h. die Verbindung (2). Die Ketonfunktionalität der Betulonsäure kann durch synthetische Standardverfahren in ein Oxim umgewandelt werden (3). Ausserdem können eine grosse Anzahl Derivate (4) durch Susbstitutionsreaktionen, welche an der Hydroxylgruppe des Oxims (3) mit Elektrophilen durchgeführt werden, wie in der Gleichung (a) dargestellt, hergestellt werden:
worin R_a = H oder C₁-C₁₆ Alkyl oder R_a = COC₆H₄X, worin X = H, F, Cl, Br, I, NO₂, CH₂ oder OCH₃ oder R_a = COCH₂Y worin Y = H, F, Cl, Br, oder I oder R_a = CH₂CHCH₂ oder CH₂CCR₁ worin R₁ H oder C₁-C₆ Alkyl ist. Wenn R_a C₁-C₁₆ Alkyl ist, sind C₁-C₆ Alkylgruppen bevorzugte Alkylgruppen.
Die Ketonfunktionalität der Betulonsäure kann eine reduktive Aminierungsreaktion mit verschiedenen aliphatischen und aromatischen Aminen in Anwesenheit von Natriumcyanborhydrid (NaBrH₃CN) durchmacher, um ein entsprechendes substituiertes Amin (5) an der C-3 Stelle wie in der Gleichung (b) dargestellt, zu liefern.
worin R_b = H oder C₁-C₁₀ Alkyl oder R_b = C₆H₄X ist.
Eine Anzahl von Estern können auch hergestellt werden, indem die Hydroxylgruppe der Betulinsäure mit einer Auswahl von Acyhchloriden oder Anhydriden (8), wie in der Gleichung (e) dargestellt, zur Reaktion gebracht wird
worin R_e = R₁CO oder XC₆H₄CO.
Die aktivierte C-28 Hydroxylgruppe der Betulinsäure kann Substitutionsreaktionen wie SN-2 Reaktionstypen, mit Nukleophilen untergehen, um ein Amino- (11) oder Etherderivat (12), wie in den Gleichungen (h) und (i) dargestellt, zu ergeben.
worin R_g = H oder C₁-C₆alkyl oder R_q = C₆H₄X ist und worin R_h = C₁-C₆alkyl oder C₆H₄X ist.
Die Hydroxylgruppe an der Position C-28 kann zu einem Aldehyd oxidiert werden, welches wiederum mit einem Hydroxylamin reagieren kann, um eine Hydroxyloximverbindung zu ergeben. Das Hydroxyloxim kann mit einer Auswahl von Elektrophilen reagieren, um die Oximderivate (13) wie in der Gleichung (j) dargestellt, zu ergeben.
worin R_i = H oder C₁-C₆alkyl oder R_i = COC₆H₄X ist oder R_i = CH₂CHCH₂ oder CH₂CCR₁ ist.
Das Aldehyd an der Position C-28 kann auch mit einer Reihe von Lithiumacetylidverbindungen reagieren, um eine Anzahl von Alkinbetulinderivaten (14), wie in der Gleichung (k) dargestellt, zu ergeben.
worin R_j = CCR₁, wobei R_l = H oder C₁-C₆alkyl ist.
Im Hinblick auf die Modifikationen an der Position C-20, die Isoprenylgruppe an der Stelle C-20 kann ozonisiert werden, um ein Keton (15) an der Stelle C-20, wie in der Gleichung (1) dargestellt, zu ergeben. Eine Vielzahl von Reaktionen, die an der Kentonfunktionalität durchgeführt werden, können eine Reihe von verschiedenen Derivaten ergeben. Zum Beispiel kann die Ketonfunktionalität der Verbindung (15) leicht in eine Vielzahl von Oximen umgewandelt werden. Ausserdem können eine Vielzahl von zusätzlichen Oximderivaten (16) mittels Substitutionsreaktionen an der Hydroxylgruppe der Hydroxyloxime mit Elektruphilen, wie in der Gleichung (m) dargestellt, hergestellt werden.
worin R_k = H oder C₁-C₆alkyl oder R_k = COC₆H₄X oder COCH₂Y oder R_k = CH₂CHCH₂ oder CH₂CCR₁ ist.
Die Ketonfunktionalität kann auch eine reduktive Aminierungsreaktion mit einer Reihe aliphatischer und aromatischer Amine in Anwesenheit von NaBH₃CN untergehen, um ein entsprechend substituiertes Amin (17) an der Stelle C-20, wie in der Gleichung (n) dargestellt, zu ergeben.
worin R_l = C₁-C₆alkyl oder R_l = C₆H₄X oder R_l = COC₆H₄X oder R_l = COCH₂Y oder R_l = CH₂CHCH₂ oder CH₂CCR₁.
Das Keton kann mit einer Reihe von Lithiumacetyliden zur Reaktion gebracht werden, um Alkinalkoholderivate (18) an der Stelle C-20, wie in der Gleichung (o) dargestellt, zu ergeben.
wobei R_m = CCR₁ ist.
Das Keton kann weiter zu einem sekundären Alkohol (19) reduziert werden, um mit einem Acylchlorid zu reagieren und eine Reihe von Estern (20) an der Stelle C-20, wie in der Gleichung (p) dargestellt, zu ergeben.
worin R_n = H, C₁-C₆alkyl, CH₂CCR₁ oder R_n = CH₃CO oder XC₆H₄CO ist.

Claims

Verwendung einer Verbindung, welche eine Struktur aufweist
worin R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, HO-N, CH₃O-N, H₂N, OH und C₆H₄CO₂, R₂ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHO, CO₂H, CHNOCH₃, CHNOH und CH₂OH und R₃ ist C(CH₃)₃ oder C(CH₃)=CH₂, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Neuroblastoma.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei es sich bei der Verbindung um Betulinsäure mit R₁ = OH, R₂ = CO₂H und R₃ = C(CH₃)=CH₂ handelt.