DE60106604T2

DE60106604T2 - Verwendung von aloe-emodin zur behandlung von neuroektodermalen tumoren

Info

Publication number: DE60106604T2
Application number: DE60106604T
Authority: DE
Inventors: Giorgio Palu'; Modesto Carli; Teresa Pecere
Original assignee: Universita degli Studi di Padova
Current assignee: Universita degli Studi di Padova
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2021-05-31
Also published as: ES2232634T3; US20040102526A1; DE60106604D1; ITMI20001216A0; CA2410595A1; ITMI20001216A1; EP1289513A2; AU6749401A; IT1318547B1; ATE279918T1; WO2001091735A3; EP1289513B1; US6812255B2; CA2410595C; DK1289513T3; WO2001091735A2; AU2001267494B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung, die als Aloe-Emodin (AE) bekannt ist als ein aktives Mittel für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung von neuroektodermalen Tumoren.
Stand der Technik
Es ist bekannt, daß die therapeutischen Strategien, die derzeit bei der Behandlung von neoplastischen pathologischen Zuständen angewandt werden, im wesentlichen darauf gerichtet sind, alle malignen Zellen sowohl an den primären als auch den metastatischen Plätzen zu eliminieren. Zu diesem Zweck können unterschiedliche therapeutische Ausführungsarten angewandt werden, von chirurgischen Eingriffen bis zur Radiotherapie für Tumore, welche lokalisiert sind, bis zur Chemotherapie für lokale oder systemische Erkrankungen, bis zur endokrinen Therapie für hormonabhängige Tumore, bis zur Immunotherapie und bis zur Thermotherapie. Alle diese therapeutischen Ausführungsformen können einzeln angewandt werden, oder sie können auch mit den anderen kombiniert werden, was von dem Typ von neoplastischen Zellen und der Stufe des pathologischen Zustandes abhängig ist, um eine wirksame Therapie der Ausrottung von Neoplasie zu erhalten.
Chemotherapie ist sicherlich einer der üblichsten therapeutischen Versuche, sowohl alleine als auch kombiniert mit den zuvor genannten therapeutischen Ausführungsformen. Ein ideales Mittel für die Chemotherapie sollte selektiv für die Tumorzellen sein, ohne irgendwelche relevanten schädlichen Effekte auf normale Zellen oder toxische Effekte vom systemischen Typ zu induzieren; trotz der langen und komplexen For schung mit dem Ziel zum Auffinden von Antikrebsmitteln dieser Art hat sich bislang dennoch bei keiner Verbindung, welche einzeln oder kombiniert mit anderen Mitteln eingesetzt wurde, herausgestellt, daß sie einen zufriedenstellenden therapeutischen Index besitzt, d.h. das Effektivverhältnis auf die Tumorzellen gegenüber dem Fehlen von cytotoxischen Effekten auf nicht-maligne Zellen. Mehrere Antitumormittel sind bekannt und in der Anwendung, und es gibt sehr differenzierte Mechanismen, welche ihre Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen bewirken. Die ersten Mittel, welche angewandt wurden, waren alkylierende Wirkstoffe, wie Stickstoff-Senfgas, gefolgt von antimetabolischen Wirkstoffen, Folatantagonisten wie Methotrexat oder Purinantagonisten wie 6-Mercaptopurin, oder Pirimidinantagonisten wie 5-Fluorouracil, Substanzen von pflanzlichem Ursprung, welche Zellmitose blockieren, wie Vincristin und Vinblastin, und Podophyllotoxine, Antibiotika wie Mitomycin, Adriamycin und Bleomycin, Nitrosoharnstoffe, Platinkoordinationsverbindungen und in neuerer Zeit die sogenannten biologischen Ansprechmodifikatoren wie α-Interfereon und ein Enzym wie Asparaginase. Alle diese Wirkstoffe, alleine oder in Kombination, werden für mehrere pathologische Tumorzustände angewandt, von Tumoren, die in spezifischen Organen lokalisiert sind, bis zu ausgestreuten Tumoren. Im Fall von neuroektodermalen Tumoren, beispielsweise für Neuroblastoma, primitiven peripheren neuroektodermischen Tumor (pPNET), Ewing-Sarcoma, Melanoma, Microcytoma etc., können die chemotherapeutischen Mittel, welche normalerweise, jedoch nicht spezifisch eingesetzt werden, beispielsweise Vincristine und Vinblastine, Platinkoordinationsverbindungen und andere geeignete Stoffe für diesen Zweck sein.
Trotz der anerkannten Wirksamkeit von zahlreichen dieser Verbindungen hat sich dennoch keine hiervon als das zuvor genannte ideale Profil besitzend herausgestellt, und in mehreren Fällen kann eine bestimmte Resistenz, auch Mehrfachresistenz, von Tumorzellen gegenüber diesen Mitteln beobachtet werden, obwohl toxische Effekte auf andere Zellen nicht erscheinen.
Daher konzentrierten die Erfinder mit dem Ziel zur Entwicklung von neuen Antikrebswirkstoffen, welche durch selektive Zielauffindung und niedrige Toxizität für die Teilung von normalen Wirtszellen gekennzeichnet sind, ihre Aufmerksamkeit auf natürliche Verbindungen, welche traditionellerweise seit Jahrhunderten zur Behandlung eines breiten und variierenden Bereiches von hoch heterogenen pathologischen Zuständen verwendet wurden, und welche dadurch gekennzeichnet sind, daß sie keinen relevanten toxischen Effekt besitzen, wobei insbesondere ihre Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen von menschlichem Ursprung untersucht wurde und wobei sie üblicherweise nicht bei Prüfungen zur Verifizierung des potentiellen Antitumoreffektes von bekannten und neuen Verbindungen eingesetzt wurden.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach diesen Untersuchungen haben die Erfinder jetzt gefunden, daß eine natürliche Substanz von pflanzlichem Ursprung, Aloe-Emodin, überraschenderweise eine starke cytotoxische Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo gegenüber Zellen von neuroektodermalen Tumoren besitzt, ohne daß sie eine vergleichbare cytotoxische Aktivität für die Teilung von normalen Wirtszellen zeigt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung von Aloe-Emodin für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche bei der Behandlung von neuroektodermalen Tumoren verwendet werden können.
Aloe-Emodin kann als chemotherapeutisches Mittel wirken, welches eine selektive Cytotoxizität gegenüber diesen Zellen durch einen apoptotischen Mechanismus induziert.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1A erläutert das Dosisansprechen der Cytotoxizität von AE auf neuroektodermale Tumorzelllinien: IMR5
, IMR32⎕, AF8
, SJ-N-KP ♦, TC32 x, TC106
, Me123
, und
1B auf Tumorzellen von unterschiedlichem Ursprung LoVo 109
, LoVo DX
, CEM ♦, CEM VBL x, HeLa
und auf normale menschliche Lungenfibroblasten MRC5
.
1C erläutert den Prozentsatz des Koloniewachstums von Proben von Neuroblastomazellen (SJ-N-KP
) und CFU-GM, erhalten aus Proben von Knochenmark (BM
) von gesunden Spendern und von Nabelschnurblut (CB ⎕), inkubiert mit unterschiedlichen Konzentrationen von AE nach 14 Tagen.
2 erläutert die Antitumoraktivität von AE in SCIDMäusen, welche menschliche Neuroblastomazellen (IMR5 O) und Kolon-Adenocarcinomazellen (LoVo 109 O)tragen, im Vergleich mit einer Kontrollgruppe, welche, mit Träger (♦) behandelt wurden: A) SCID-Mäuse, injiziert s.c, mit Neuroblastomazellen und behandelt unmittelbar nach der Tumorzellinjektion und für 5 Tage mit AE für eine Gesamtmenge von 5 Dosen; B) SCID-Mäuse, injiziert s.c, mit Neuroblastomazellen und behandelt mit AE am Tag 15 während 5 Tagen für eine Gesamtzahl von 5 Dosen; C) SCID-Mäuse, injiziert s.c. mit Kolon-Adenocarcinomazellen und behandelt unmittelbar nach der Zellinjektion und für 5 Tage mit AE für eine Gesamtzahl von 5 Dosen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind besser aus der folgenden detaillierten Beschreibung verständlich.
Die hier diskutierte Verbindung, d.h. Aloe-Emodin, findet sich in Vacuolarsäften der epidermischen Zellen von Blättern von verschiedenen Spezies von Aloe, jedoch auch in anderen Pflanzen wie Senna und Rhabarber, aus welchen es in frei er oder glycosylierter Form zu Beginn des letzten Jahrhunderts isoliert wurde. Bis jetzt wurde diese Verbindung als Abführmittel verwendet. Unter Strukturgesichtspunkten ist es ein Hydroxyanthrachinon, welches in seiner freien Form die Formel 1,8-Dihydroxy-3-hydroxymethyl-9,10-anthracendion hat.
Die Aktivität von Aloe-Emodin (AE) als ein Antitumorwirkstoff mit einer spezifisch selektiven Aktivität gegenüber neuroektodermalen Tumoren wurde in vitro auf menschlichen Tumorzellen und in vivo in Mäusen mit einer starken kombinierten Immunodefizienz (SCID) untersucht. Weiterhin wurden die allgemeinen toxischen Effekte von AE an Swiss-Mäusen untersucht.
In vitro Bioversuche
Cytotoxizitätsversuche in vitro wurden an unterschiedlichen Tumorzelllinien sowohl von neuroektodermalen Tumoren und anderen menschlichen malignen Zellen aus Epitheltumoren und aus Blut abstammenden Tumoren, wie auch menschlichen hemoerzeugenden Vorläufern und normalen Fibroblasten durchgeführt, so daß die cytotoxische Aktivität und die Spezifität dieses Effektes der Verbindung verifiziert wurde:
Tumore von neuroektodermischem Ursprung: Neuroblastoma (IMR-32, IMR-5, AF8, SJ-N-KP), pPNET (TC32), Ewing-Sarcoma (TC106) , Melanoma (Me123) ;
Tumore von unterschiedlichem Ursprung: T-Zell-Leukämie (CEM) und T-Zell-Leukämie Vinblastine-resistent (CEM VBL), Colon-Adenocarcinoma (LoVo 109) und Colon-Adenocarcinoma Doxorubicin-resistent (LoVo DX), Cervixepitheloid-Carcinoma (HeLa);
Normale Zellen: menschliche Lungenfibroblasten (MRC5).
Die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase in vollständigem Medium werden abgestuften Dosen von 0 bis 100 μm von Aloe-Emodin (AE) während 72 Stunden ausgesetzt. Die erhaltenen Werte zeigen die Werte ED50 (halb-maximale wirksame Dosen), welche von 1 bis 13 μM (für Neuroblastoma bzw. Ewing- Sarcoma) variieren, und Werte, welche von 40 bis 100 μM (für Fibroblasten bzw. akute lymphocytische Leukämielinien) variieren. 1A zeigt die an neuroektodermalen Tumorzellen erhaltenen Ergebnisse als % des Überlebens von Zellen (IMR5
, IMR32 ⎕, AF8
, SJ-N-KP ♦, TC32 x, TC106 O, Me123
), und 1B zeigt die Ergebnisse als % des Überlebens von Zellen an Tumorzellen von unterschiedlichem Ursprung und normalen Zellen (LoVo 109
, LoVo DX
, CEM ♦, CEM VBL x, HeLa O und MRC5
.
Klonogene Tests wurden ebenfalls an hemoerzeugenden Vorläuferzellen, erhalten aus Knochenmark (BM
) von gesunden Spendern und aus Nabelschnurblut (CB ⎕) und an Neuroblastomazellen (SJ-N-KP
) durchgeführt. Die Zellen waren in Methylcellulose mit abgestuften Dosen von AE in Konzentrationen zwischen 1 und 100 μM für 14 Tage gezüchtet worden. Die erhaltenen Werte zeigen die Werte ED50 für das Wachstum von Kolonien von CFU-GM (Kolonie, welche Einheits-Granulocyten/Macrophagen bildet), welche von 80 bis 120 μM variieren, für hemoerzeugende Zellen aus Knochenmark bzw. aus Nabelschnurblut, während die Kolonien bildende Aktivität von Neuroblastomazellen (NB
) bei niedrigeren Konzentrationen von AE gehemmt wird (1C).
In vivo Bioversuche
In vivo Tests auf Toxizität und Wirksamkeit wurden an Swiss-Mäusen und an Mäusen mit schwerer kombinierter Immunodefizienz (SCID) durchgeführt, um das Profil der allgemeinen Toxizität und die Antitumoraktivität zu verifizieren.
Im ersten Fall wurden Versuche auf akute und chronische Toxizität an Swiss-Mäusen (männiche Tiere mit Alter 8–10 Wochen) durchgeführt, um mögliche Effekte der allgemeinen Toxizität als Folge von AE auf Gewicht, neurologische Funktionen und Intestinalfunktionen und hematologische Parameter aufzuzeigen. Die Tiere wurden mit hohen Dosen auf intraperitonealem Weg, zwischen 30 mg/kg/Tag und 50 mg/kg/Tag bei einer Applikation und mit niedrigen Dosen, zwischen 1 mg/kg/Tag und 10 mg/kg/Tag für wiederholte Dosierungen behandelt.
Die Tiere wurden überwacht, um mögliche neurologische Schädigungen mittels periodisch wiederholter Verhaltenstests zu überprüfen, um die hematische Toxizität mittels wöchentlicher hemochromer Analysen zu überprüfen und um Intestinaltoxizität mittels täglicher Analysen der Fäzes zu überprüfen. Darüber hinaus wurden die Tiere ebenfalls zweimal pro Woche während des gesamten Tests gewogen. Am Ende des Tests wurden die Tiere getötet, und die Autopsie wurde durchgeführt.
Es wurde keine Toxizität während der Tests bemerkt, und die Autopsie zeigte überhaupt keine Schädigung der Hauptorgane.
Nach dem Toxizitätsversuch wurden als zweite Aufgabe Versuche auf Antitumoreffektivität an SCID-Mäusen durchgeführt.
Die Tiere (weibliche Tiere mit Alter von 6–8 Wochen) wurden subkutan zwischen den Schulterblättern mit einer Suspension von Zellen von Neuroblastoma IMR5 oder Kolon-Adenocarcinoma LoVo 109 (10×10⁶) geimpft, und sie wurden mit 50 mg/kg/Tag i.p. von AE (O) in DMSO und dann mit Salzlösung verdünnt, behandelt, während Kontrolltiere (♦) mit DMSO in Salzlösung auf intraperitonealem Weg behandelt wurden. Die Wirkstoffbehandlung wurde für 5 Tage bei einer Gesamtmenge von 5 Dosen in beiden Fällen wiederholt.
Das Testprogramm lieferte für die sofortige Behandlung nach dem Impfen des Tumors oder die Behandlung danach das Auftreten der Tumormasse (15 Tage nach der Impfung mit Tumorzellen). In beiden Fällen waren die Mäuse während 5 Tagen behandelt worden und dann wurden sie getötet, wenn die Kontrollmasse 1,5 cm³ erreicht hatte. Die gleichen Tests, durch geführt an Swiss-Mäusen wurden durchgeführt, und die Tumormassen wurden mit einem Greifzirkel zweimal die Woche ausgemessen. Die erhaltenen Daten für SCID-Mäuse zeigen, daß AE das Auftreten von Neuroblastoma für 15 Tage von der Impfung an hemmt (2A) und das Wachstum der entwickelten Masse blockiert, selbst wenn sie am Tag 15 nach der Injektion der Tumorzellen (2B) während der Behandlungsperiode behandelt worden waren. Andererseits veränderte sich das Tumorwachstum bei Mäusen, welche mit Kolon-Adenocarcinoma geimpft worden waren, nicht nach der Behandlung mit AE (2C).
Die erhaltenen und kurz angegebenen Ergebnisse zeigen, daß freies und nicht glycosyliertes AE als ein kräftiges chemotherapeutisches Mittel, spezifisch für neuroektodermale Tumore wirkt. Tatsache ist, daß es das Wachstum von menschlichen neuroektodermalen Tumoren sowohl während der Stufe der Massenbildung hemmt als auch nach bereits entwickelter Masse. Darüber hinaus ist der Antitumoreffekt in keiner Weise mit Cytotoxizitätsprozessen auf die andere Teilung von normalen Zellen verbunden und ist ohne relevante toxische Effekte bei Tieren. Die Verbindung hemmt nicht das in vitro Wachstum von normalen Fibroblasten oder von menschlichen hemoerzeugenden Vorläufern.
Im Gegensatz dazu hat Aloine, die glycosylierte Form von AE mit der Formel 10-1',5'-Anhydroglucosyl-1,8-dihydroxy-3-hydroxymethyl-9-anthron keinen cytotoxischen Effekt auf die in Betracht gezogenen neuroektodermalen Tumorzellen.
Der identifizierte Mechanismus der Cytotoxizität ist besonders interessant und neu für Antitumorwirkstoffe im allgemeinen, und er besteht in der Induzierung eines Mechanismus von apoptotischen Zelltod, während die Selektivität gegen neuroektodermale Tumorzellen auf einem durch Rezeptor begünstigten, zellspezifischen Einbau des Moleküls basiert.
Die Schlußfolgerung ist, daß die Testergebnisse deutlich zeigen, daß die in Betracht gezogene Verbindung als hemotherapeutisches Mittel gegen neuroektodermale Tumoren verwendet werden kann, wobei ihre Vorteile beides sind, nämlich daß sie einen relevanten spezifischen pharmakologischen Effekt in vitro als auch in vivo gegen diese Zellen haben, und daß sie keinen toxischen Effekt im allgemeinen besitzen. Darüber hinaus hat AE den weiteren Vorteil, daß es keinen schädlichen Einfluß auf die sehr wichtigen Vermehrungszellen, wie hemoerzeugende Vorläufer hat.
Aloe-Emodin erweist sich daher als eine geeignete annehmbare Verbindung für die Behandlung von pathologischen Tumorzuständen von neuroektodermalem Ursprung (wie beispielsweise Neuroblastoma, primitiven peripheren neuroektodermischen Tumor (pPNET), Ewing-Sarcoma, Melanom und Mikrocytoma etc.), da es einen vorteilhaften potentiellen therapeutischen Index besitzt. Dies ist noch wichtiger bei der Betrachtung, daß ein neuroektodermaler Tumor wie Neuroblastoma einer der häufigsten festen Tumoren bei Kindern mit einem Auftreten von 10% unter allen Tumoren im Kindesalter ist. Es sei ebenfalls festgestellt, daß während der Diagnose 50% der Kinder ein klinisches Bild von metastatischem Leiden mit einer stark negativen Prognose zeigen.
Es kann für diesen Zweck bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, welche Patienten in Form der pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche üblicherweise für parenterale und orale Applikation von Wirkstoffen verwendet werden, appliziert werden kann, wie auch in Formulierungen für die lokale Applikation, möglicherweise an dem primären und/oder sekundären Ort des Tumors. Die Verbindung Aloe-Emodin kann ebenfalls für diesen Zweck für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, welche für Spülvorgänge bei der autologen Verpflanzung von Knochenmark geeignet sind.
Zu diesem Zweck können alle pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel/Träger verwendet werden, einschließlich Trägern oder Einrichtungen für die kontrollierte Freisetzung bei lokaler Applikation.
Die Zusammensetzungen, welche AE als aktives Mittel für die Behandlung von neuroektodermalen Tumoren enthalten, können in besonderen Formulierungen vorliegen, welche eine solche Dosierung von aktivem Mittel halten, damit der gewünschte therapeutische Effekt entsprechend den Zielen der vorliegenden Erfindung erreicht wird. Diese Formulierungen können in Übereinstimmung mit bekannten Methoden oder neuen pharmazeutischen Technologien unter Verwendung von Trägermaterialien, Bindemitteln, Verdünnungsmitteln, Emulgatoren, wässrigen oder öligen oder polymeren Trägern, etc., welche für pharmazeutische Anwendung annehmbar sind, hergestellt werden.
Die Formulierungen für parenterale Applikation können alle traditionellen pharmazeutischen Formen sein, wie Ampullen mit wässrigen oder öligen Trägern in gepufferten Lösungen oder Lösungen, welche geeignete Suspendiermittel enthalten, ebenfalls in Form von lyophilisiertem Produkt, welches vor der Applikation dispergiert werden muß.
Die Formulierungen für orale Applikation können Tabletten, ölige oder beschichtete Kapseln aus Hart- oder Weichgelatine, Pillen, dispergierbare Pulver, Suspensionen und Emulsionen sein.
Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenfalls aus Formulierungen für topische oder transdermale Anwendung in Trägern oder Vorrichtungen bestehen, welche für die Applikation des aktiven Mittels auf den primären oder sekundären Platz des Tumors geeignet sind.
Träger, Bindemittel, Gleitmittel, Disintegratoren, etc. können von beliebiger Art sein und ansonsten für pharmazeutische Anwendung geeignet und für den Zweck der vorliegenden Erfindung geeignet sein, beispielsweise lösliche Zucker (beispielsweise Mannit, Lactose, Dextrose, Saccharose, Fructose), natürliche Polysaccharide wie Cellulose und ihre Derivate wie Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Stärken und Alginate neben anderen bekannten polymeren Trägern, welche auf dem pharmazeutischen Gebiet eingesetzt werden, Silizium dioxid, Talk, Magnesiumoxid, Stearate, Polyethylenglycole, Acacia, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol.

Claims

Verwendung der Verbindung mit der Formel 1,8-Dihydroxy-3-hydroxymethyl-9,10-anthracendion (Aloe-Emodin) zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von neuroektodermalen Tumoren.
Verwendung gemäß Anspruch 1, in welcher die Tumore Neuroblastome, primitiver peripherer neuroektodermischer Tumor (pPNET), Ewings Sarkome, Melanome und Microzytome sein können.
Verwendung gemäß Anspruch 1, in welcher die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, in Form von wässrigen oder öligen Lösungen oder in Suspension in geeigneten Dispersionsmitteln auch in Form von lyophilisierten Produkten, die vor der Verabreichung dispergiert werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, in welcher die Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung geeignet sind, in Form von Tabletten, öligen oder beschichteten Kapseln aus Hart- oder Weichgelatine, Pillen, dispergierbare Pudern, Suspensionen oder Emulsionen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, in welcher die Zusammensetzungen geeignete Formulierungen für Spüloperationen in der Auto-Transplantation von Knochenmark sind.
Verwendung gemäß Anspruch 1, in welcher die Zusammensetzungen zur topischen oder transdermalen Verabreichung geeignet sind, in geeigneten Formen und in Trägern oder Vorrichtungen, die zur Verabreichung des Wirkstoffs an der primären und/oder sekundären Tumorstelle geeignet sind.