DE69634951T2

DE69634951T2 - Topische verwendung von betulinsäure zur behandlung bösartiger melanome

Info

Publication number: DE69634951T2
Application number: DE69634951T
Authority: DE
Inventors: K. Tapas DASGUPTA; M. John PEZZUTO
Original assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Current assignee: University of Illinois; University of Illinois at Urbana Champaign
Priority date: 1995-03-21
Filing date: 1996-03-19
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2016-03-20
Also published as: DE69634951D1; JP4052485B2; WO1996029068A2; EP0814795B1; US5658947A; CA2215067C; EP0814795A2; CA2215067A1; WO1996029068A3; JPH11502525A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Betulinsäure zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines malignen Melanoms, wobei das Medikament zur topischen Applikation auf das Melanom ausgebildet ist.
Während der vergangenen vier Jahrzehnte hat das Auftreten von Melanomen mit höherer Rate als jede andere Krebsart zugenommen. Die Theorie ist nunmehr, daß einer von 90 Amerikanern kaukasischer Abstammung in seinem Leben ein malignes Melanom entwickelt. Ein zunehmender Anteil an Melanomen wird zwar ausreichend frühzeitig diagnostiziert, so daß eine chirurgische Behandlung erfolgreich ist und eine Zehnjahres-Überlebensrate von mehr als 90% erreicht wird, es wird jedoch geschätzt, daß in den Vereinigten Staaten dieses Jahr nahezu 7000 Menschen, die an Melanommetastasen leiden, sterben werden.
Für Patienten mit Melanommetastasen, die chirurgisch nicht entfernt werden können, gibt es nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten. 5-(3,3-Dimethyl-1-triazenyl)-1-H-imidazol-4-carboxamid (Dacarbazin, DTIC) ist das wirkungsvollste Einzel-Chemotherapeutikum für Melanome und hat eine Gesamtansprechrate von 24%. Die Dauer der Reaktion auf DTIC ist jedoch im allgemeinen relativ kurz. Eine Kombinationstherapie mit anderen synthetischen und Rekombinationsagenzien, umfassend N,N'-Bis(2-chlorethyl)-N-nitrosoharnstoff (Carmustin, BCNU), Cisplatin, Tamoxifen, Interferon-alpha (INF-α) und Interleukin-2 (IL-2), hat in einigen Versuchen eine höhere Reaktionsrate (z. B. 30 bis 50%), aber eine dauerhafte vollständige Reaktionsrate ist unüblich, und die Toxizität nimmt zu. Eine sequentielle Chemotherapie mag Erfolg versprechen, aber es ist ersichtlich, daß heutige Behandlungsoptionen für Personen, die an Melanommetastasen leiden, unbefriedigend sind.
Zahlreiche Arzneistoffe, die von natürlichen Produkten abgeleitet sind, wie Adriamycin(Doxorubicin)-Derivate, Bleomycin, Etoposid und Vincristin und deren Derivate sind auf ihre Wirksamkeit gegen Melanome entweder als Einzelagenzien oder in einer Kombinationstherapie getestet worden. Aber ähnlich wie bei den synthetischen und Rekombinationsverbindungen zeigen diese Verbindungen niedrige Reaktionsraten, vorübergehende vollständige Reaktionen und hohe Toxizität.
Dennoch sind, wie durch bekannte und heute eingesetzte Chemotherapeutika gegen Krebs demonstriert wird, aus Pflanzen gewonnene Naturprodukte eine bewährte Quelle für wirksame Arzneistoffe. Zwei solche nützlichen Naturprodukt-Arzneistoffe sind Paclitaxel (Taxol) und Camptothecin. Paclitaxel, das ursprünglich aus der Rinde der pazifischen Eibe Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae) gewonnen wurde, wird heute für die Behandlung von hartnäckigem oder Rest-Ovarialkarzinom eingesetzt. Vor kurzem wurden klinische Versuche durchgeführt, um die mögliche Rolle von Paclitaxel bei der Behandlung von Melanommetastasen zu untersuchen. Als Einzelmittel zeigt Taxol eine Wirksamkeit, die mit derjenigen von Cisplatin und IL-2 vergleichbar ist. Taxol funktioniert durch einen besonderen Wirkmodus und fördert die Polymerisation von Tubulin. Daher geht die durch Taxol vermittelte Antitumorreaktion auf seine mitosehemmende Wirksamkeit zurück. Der zweite wichtige Arzneistoff, Camptothecin, wurde aus der Rinde eines in China wachsenden Baums Camptotheca acuminata Decaisne (Nyssaceae) isoliert. Camptothecin funktioniert ebenfalls über einen neuen Wirkmechanismus, d. h. die Hemmung von Topoisomerase I. Versuche der Phase II eines wasserlöslichen Camptothecin-Prodrug-Analogons, Irinotican (CPT-11), sind in Japan abgeschlossen worden gegen eine Vielzahl von Tumoren, und zwar mit Reaktionsraten zwischen 0% (Lymphknotentumor) und 50% (Kleinzeller Lunge). Topotecan, ein anderes wasserlösliches Camptothecin-Analogon, durchläuft derzeit klinische Versuche der Phase II in den Vereinigten Staaten.
Frühere Antitumordaten von zahlreichen Tiermodellen unter Anwendung von Betulinsäure sind außerordentlich unterschiedlich und scheinbar inkonsistent. Beispielsweise wurde berichtet, daß Betulinsäure eine dosisabhängige Wirksamkeit gegen das Walker-256-Karcinosarkom-Tumorsystem bei Mäusen bei Dosiswerten von 300 und 500 mg/kg (Milligramm je Kilogramm) Körpergewicht zeigt. Dagegen zeigte ein späterer Bericht, daß die Verbindung in dem Walker-256-Modell (400 mg/kg) und in dem Modell L1210 lymphozytische Leukämie bei Mäusen (200 mg/kg) unwirksam war. Im National Cancer Institute durchgeführte Tests bestätigten diese negativen Daten.
Ebenso wurde eine tumorhemmende Wirksamkeit von Betulinsäure in dem P-388-Maus-Lymphozytentestsystem angedeutet. Aber Tests, die vom National Cancer Institute durchgeführt wurden, haben eine solche Wirksamkeit nicht gestützt. Kürzlich wurde gezeigt, daß Betulinsäure eine durch Phorbolester induzierte Entzündung und epidermale Akkumulation von Ornithindecarboxylase im Mäuseohrmodell blockiert. In Überein stimmung mit diesen Beobachtungen wurde die karzinogene Reaktion in dem Zweistufen-Mäusehautmodell gehemmt. So wird in Oncology 48(1), 1991, 72–76, berichtet, daß bestimmte Triterpene von medizinischen Pflanzen eine hemmende Wirkung auf die Tumorförderung durch 12-O-Tetradecanoylphorbol-l3-acetat bei der Zweistufen-Kanzerogenese in Mäusehaut haben. Ryu et al., Arch. Pharm. Res. 1994, 17, 375–377, berichtet, daß 13 Arten von natürlich vorkommenden oder derivatisierten Triterpenen in Experimenten in vitro eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von mehreren Humantumorzellinien haben. Somit sind einige schwache Anzeichen einer tumorhemmenden Wirksamkeit durch Betulinsäure berichtet worden, aber bis zu der vorliegenden Erfindung findet sich in keinen früheren Berichten oder Daten ein Hinweis darauf, daß Betulinsäure für die selektive Kontrolle oder Behandlung von Human-Melanomem brauchbar ist.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung von Betulinsäure zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines malignen Melanoms, wobei das Medikament zur topischen Applikation auf das Melanom ausgebildet ist. Die aktive Verbindung, Betulinsäure, wird durch ein Verfahren isoliert, das die folgenden Schritte aufweist: Präparieren eines Extrakts aus der Stammrinde von Ziziphus mauritiana zur Vermittlung eines selektiven zytotoxischen Profils gegen Human-Melanom in einem Panel von Humankrebszellinien, Durchführen einer durch Bioassay geleiteten Fraktionierung auf der Basis des Profils der biologischen Wirksamkeit unter Einsatz von gezüchteten Human-Melanomzellen (MEL-2) als Kontrolle, und Erhalten von Betulinsäure daraus als die wirksame Verbindung.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Behandlungsverfahrens unter Einsatz von Betulinsäure, um das Wachstum oder die Ausbreitung von Krebszellen zu verhindern, wobei die Betulinsäure in einer topischen Zusammensetzung appliziert wird.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Überwindung des Problems hoher Säuger-Toxizität, die mit synthetischen krebshemmenden Mitteln verbunden ist, durch Einsatz einer von einem Naturprodukt abgeleiteten Verbindung, z. B. Betulinsäure.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Überwindung des Problems einer ungenügenden Verfügbarkeit, die mit synthetischen krebshemmenden Agenzien verbunden ist, durch Verwendung der leicht verfügbaren, natürlich vorkommenden Betulinsäure.
1 ist ein Diagramm eines mittleren Tumorvolumens (in cm³) über der Zeit für nicht-etablierte MEL-2-Tumoren in Kontrollmäusen und in Mäusen, die mit steigenden Dosen von Betulinsäure behandelt wurden;
2 ist ein Diagramm eines mittleren Tumorvolumens (in cm³) über der Zeit für etablierte MEL-2-Tumoren in Kontrollmäusen und in Mäusen, die mit DTIC oder Betulinsäure behandelt wurden;
3(A) ist ein Diagramm des 50 Kbp-Bandbereichs als % Gesamt-DNA über der Zeit für die Behandlung von MEL-2-Zellen mit 2 μg/ml Betulinsäure;
3(B) ist ein Diagramm des 50 Kbp-Bandbereichs als % Gesamt-DNA über der Konzentration von Betulinsäure (μg/ml); und
4 und 5 sind Diagramme des mittleren Tumorvolumens (cm³) über der Zeit für etablierte und nicht-etablierte MEL-1-Tumoren in Kontrollmäusen und Mäusen, die mit steigenden Dosen von Betulinsäure behandelt wurden.
Wie die Tabelle 1 zeigt, wurde das in vitro Wachstum von MEL-2-Zellen durch Betulinsäure, d. h. einen ED50-Wert von ca. 2 μg/ml, gehemmt. Keine der anderen getesteten Krebszellinien wurde jedoch von Betulinsäure (d. h. ED50-Werten von größer als 20 μg/ml) beeinflußt. Eine derart deutlich definierte Zelltyp-Spezifität, die durch Betulinsäure demonstriert wird, ist sowohl neu als auch unerwartet.
Wie die Tabelle 1 zeigt, zeigten andere bekannte tumorhemmende Mittel wie etwa Paclitaxel, Camptothecin, Ellipticin, Homoharringtonin, Mithramycin A, Podopyllotoxin, Vinblastin und Vincristin, eine relativ intensive, nichtselektive zytotoxische Wirksamkeit ohne erkennbare Zelltyp-Selektivität. Ferner ist die durch Betulinsäure vermittelte zytotoxische Reaktion nicht ausschließlich auf die MEL-2-Melanomzellinie beschränkt. Dosis-Antwort-Untersuchungen, die mit zusätzlichen Human-Melanomzellinien durchgeführt wurden, die mit MEL-1, MEL-3 und MEL-4 bezeichnet sind, demonstrierten ED50-Werte von 1,1 bzw. 3,3 bzw. 4,8 μg/ml.
In der nachfolgenden Tabelle 1 wurden die extrahierte Betulinsäure und die anderen Reinverbindungen auf Zytotoxizität gegen die folgenden gezüchteten Humanzellinien getestet: A431 (Plattenepithelzellen), BC-1 (Brust), COL-2 (Kolon), HAT-1080 (Sarkom), KB, LNCaP (Prostata), LU-1 (Lunge), MEL-2 (Melanom), U373 (Gliom) und ZR-75-1 (Brust).
Betulinsäure hat die Strukturformel:
Betulinsäure ist im Pflanzenreich relativ weit verbreitet, und da es sich um eine häufig angetroffene Verbindung handelt, sind einige frühere biologische Wirksamkeiten berichtet worden.
Betulinsäure wurde erhalten durch Extraktion einer Probe von luftgetrockneter gemahlener Stammrinde (450 g) von Z. mauritiana mit 80% wäßrigem Methanol. Der wäßrige Methanolextrakt wurde dann nacheinander mit Heran und Ethylacetat aufgetrennt unter Bildung von Hexan-, Ethylacetat- und wäßrigen Extrakten. Von diesen Extrakten zeigte der Ethylacetatextrakt (13,5 g Ethylacetat) zytotoxische Wirksamkeit gegen eine gezüchtete Melanomzellinie (MEL-2) mit einer ED50 von 3,7 μg/ml. Der Ethylacetatextrakt wurde an einer Silikagelsäule chromatographiert unter Einsatz von Hexan-Ethylacetat (4:1 bis 1:4) als Eluent und ergab 10 Fraktionen. Die Fraktionen 3 und 4 wurden kombiniert und einer weiteren Fraktionierung unterzogen zum Erhalt einer aktiven Fraktion (Fraktion 16), die einen einzelnen Hauptfleck durch Dünnschicht-Chromatographie zeigte [Rf 0,67: CHCl3:MeOH (Chloroform:Methanol) (10:1)], was 72 mg farblose Nadeln nach wiederholter Kristallisation aus Methanol ergab (Gesamtausbeute aus getrocknetem Pflanzenmaterial: 0,016% w/w).
Wie durch die in Tabelle 1 zusammengefaßten Daten bestätigt wird, ist Betulinsäure als nicht-zytotoxisch in bezug auf gezüchtete KB-Zellen berichtet worden. Die Zytotoxizität der Rohextrakte und der gereinigten Verbindungen wurde in einer Reihe von gezüchteten Human-Krebszellinien bestimmt. Die Tabelle 1 listet die verschiedenen Arten von ausgewerteten Krebszellen auf. Die Zellen wurden in geeignetem Medium und unter Standardbedingungen gezüchtet. Zur Aufrechterhaltung von logarithmischem Wachstum wurden die Medien 24 h vor den zytotoxischen Assays gewechselt. Am Tag des Assays wurden die Zellen durch Trypsinisieren geerntet, gezählt, in Medium verdünnt und in Schalen mit 96 Vertiefungen verbracht, die Testverbindungen enthielten, die in DMSO gelöst waren; die endgültige DMSO-Konzentration war 0,05%.
Die Schalen wurden für drei Tage inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden die Zellen fixiert und mit dem Farbstoff Sulforhodamin B (SRB) angefärbt. Der gebundene Farbstoff wurde mit Tris-Base freigesetzt, und der OD515 wurde auf einem ELISA-Meßgerät gemessen. Das Wachstum der mit Betulinsäure behandelten Zellen wurde durch die OD515-Werte bestimmt, und das Wachstum wurde mit den OD515-Werten von mit DMSO behandelten Kontrollzellen verglichen. Dosis-Antwort-Untersuchungen wurden durchgeführt, um ED50-Werte zu erzeugen.
Die isolierte wirksame Verbindung, Betulinsäure (ED50 von 2,0 μg/ml für MEL-2) hat eine Molekülformel C30H48O3, bestimmt durch hochauflösende Massenspektroskopanalyse, einen Schmelzpunktbereich von 292–293°C (Abbau). Der in der Literatur angegebene Schmelzpunktbereich für Betulinsäure ist 290 bis 293°C. Ein gemischter Schmelzpunktbereich mit einer bekannten Betulinsäureprobe wurde nicht unterdrückt. Die optische Drehung der Verbindung wurde als +7,3° gemessen (c = 1,2; Pyridin) (Lit. +7,5°). Die Identität der isolierten Verbindung als Betulinsäure wurde bestätigt durch Vergleich der obigen physikalischen Eigenschaften sowie 1H-nmr, 13C-nmr und massenspektroskopische Daten der isolierten Verbindung, mit physikalischen Daten und Spektren einer bekannten Betulinsäureprobe gemäß den Angaben in der Literatur.
Um die in vivo Fähigkeit von Betulinsäure für den Einsatz als antineoplastisches Mittel gegen malignes Melanom zu testen, wurde eine Serie von Untersuchungen mit athymischen (nackten) Mäusen durchgeführt, denen Human-Melanomzellen (MEL-2) subkutan injiziert wurden. Die ursprüngliche Studie untersuchte die Wirksamkeit von Betulinsäure gegen nichtetablierte Tumore. Die Behandlung mit Betulinsäure begann am Tag 1, d. h. 24 h nach der Tumorzellinjektion. Bei Dosierungen von 50, 250 und 500 mg/kg Körpergewicht zeigte Betulinsäure eine effektive Hemmung des Tumorwachstums mit p-Werten von 0,001 für jede Dosis gegen eine Kontrolle (1).
Insbesondere wurden die in 1 aufgetragenen Daten von Experimenten gewonnen, wobei vier Wochen alten athymischen Mäusen subkutan in die rechte Flanke 3,0 × 108 UISO MEL-2-Zellen injiziert wurden. UISO MEL-2 ist eine Zellinie, die von Melanommetastasen aus Humanflüssigkeit im Pleuraraum gewonnen ist. Die medikamentöse Behandlung wurde am Tag nach der Tumorzellinjektion begonnen und jeden vierten Tag für insgesamt sechs Dosen fortgesetzt. Vier Kontrolltiere erhielten intraperitoneal (IP) 0,5 ml PVP-Kontrollösung, wogegen behandelte Tiere (4 pro Gruppe) 50, 250 oder 500 mg/kg/Dosis IP Betulinsäure/PVP in entionisiertem H2O erhielten. Betulinsäure wurde mit PVP kopräzipitiert, um die Löslichkeit und Bioverfügbarkeit zu erhöhen. Die Mäuse wurden während der gesamten Untersuchung jeden zweiten Tag gewogen und die Tumore mit einem Mikrometer gemessen. Alle Tiere wurden am Tag 33 geopfert und autopsiert, wobei das mittlere Tumorvolumen in den Kontrolltieren ungefähr ein cm3 war.
Es zeigte sich eine größere Hemmung von Tumorwachstum bei der höchsten Dosis von Betulinsäure gegenüber der kleinsten Dosis (p = 0,04). Eine Toxizität wurde mit der Betulinsäurebehandlung nicht in Zusammenhang gebracht, weil Toxizität durch Körpergewichtsverluste oder andere Formen der akuten Toxizität angezeigt wird. Es wurde kein Gewichtsverlust beobachtet.
Als nächstes wurde eine in vivo Untersuchung von Betulinsäure an etablierten Melanomen durchgeführt. Bei dieser Studie wurde die Behandlung bis zum Tag 13 aufgeschoben; zu diesem Zeitpunkt war bei sämtlichen Mäusen ein tastbarer Tumor vorhanden. Wie 2 zeigt, stoppte Betulinsäure unter diesen Bedingungen erfolgreich das Tumorwachstum (p = 0,0001). Ferner glich das Tumorwachstum selbst 14 Tage nach Beendigung der Behandlung nicht demjenigen der (unbehandelten) Kontrollgruppe.
Insbesondere wurden unter Bezugnahme auf 2 vier Wochen alten athymischen Mäusen in die rechte Flanke 5 × 108 MEL-2-Zellen subkutan injiziert. Es wurden vier Behandlungsgruppen von jeweils fünf Mäusen untersucht. In einer Gruppe erhielten die Mäuse 250 mg/kg/Dosis von IP Betulinsäure/PVP jeden dritten Tag bei insgesamt sechs Dosen, beginnend mit dem Tag nach der Tumorzellinjektion. Die Kontrollgruppe erhielt 0,5 ml IP Kochsalzlösung. Eine DTIC-Behandlungsgruppe erhielt 4 mg/kg/Dosis IP DTIC jeden dritten Tag ab Tag 13 bis Tag 28 der Untersuchung. Die Betulinsäure-Behandlungsgruppe erhielt 250 mg/kg/Dosis IP Betulinsäure/PVP jeden dritten Tag von Tag 13 bis Tag 27. Die Kontrollmäuse und die mit DTIC behandelten Mäuse wurden am Tag 36 wegen ihrer hohen Tumorbelastung geopfert und autopsiert. Die übrigen Mäuse wurden am Tag 41 geopfert und autopsiert.
Wie 2 zeigt, wurde die Wirksamkeit von Betulinsäure auch mit DTIC verglichen, das für die Behandlung von Melanommetastasen klinisch verfügbar ist. Die DTIC-Dosis, die durch die Toxizität begrenzt ist, wurde so gewählt, daß sie äquivalent zu derjenigen war, die an menschliche Patienten verabreicht wird. Das Tumorwachstum in der mit Betulinsäure behandelten Gruppe war signifikant geringer als dasjenige, das in den mit DTIC behandelten Tieren beobachtet wurde (p = 0,0001). Verglichen mit Kontrollen erzeugte DTIC eine signifikante, jedoch weniger deutliche Reduzierung des Tumorwachstums mit einem p-Wert von 0,01. Eine vierte Gruppe bei dieser Untersuchung wurde nach einem Plan behandelt, der ähnlich demjenigen der Erststudie war. Unter diesen Bedingungen hemmte Betulinsäure, wie vorher gezeigt wurde, die Tumorentwicklung signifikant (p = 0,0001) und führte zu einer Langzeitreduzierung des Tumorwachstums von bis zu drei Wochen nach Beendigung der Behandlung.
Die 4 und 5 zeigen, daß Betulinsäure auch eine Wirksamkeit gegen MEL-1-Zellen zeigte. Unter Bezugnahme auf die 4 und 5 wurden dabei vier Wochen alten athymischen Mäusen in die rechte Flanke 5,0 × 108 UISO MEL-1-Zellen subkutan injiziert. Die medikamentöse Behandlung wurde am Tag nach der Tumorzellinjektion begonnen und für insgesamt sechs Dosen jeden vierten Tag fortgesetzt. Vier Kontrolltiere erhielten 0,5 ml Kochsalzlösung intraperitoneal (IP), wogegen behandelte Tiere (4 pro Gruppe) 5, 50 oder 250 mg/kg/Dosis IP Betulinsäure/VP in dd H2O erhielten. Die Mäuse wurden während der gesamten Studiendauer jeden dritten Tag gewogen und die Tumore mit einem Mikrometer vermessen. Behandelte Tiere wurden am Tag 41 geopfert und autopsiert, nachdem das mittlere Tumorvolumen in den Kontrollmäusen ungefähr 0,5 cm³ war. Die Kontrollmäuse erhielten dann sechs Dosen von 50 mg/kg jeden vierten Tag, beginnend am Tag 41, und wurden am Tag 71 geopfert und autopsiert.
Die in den 4 und 5 gezeigten Ergebnisse in bezug auf MEL-1-Zellen waren ähnlich den in den 1 und 2 gezeigten Ergebnissen. Somit ist Betulinsäure sowohl gegen MEL-1- als auch MEL-2-Zellen wirksam.
Der Mechanismus, nach dem Antitumoragenzien ihre Wirksamkeit vermittelten, ist von hoher theoretischer und klinischer Wichtigkeit. Daher wurde der Wirkmodus untersucht, nach dem Betulinsäure den Melanom-spezifischen Effekt vermittelt. Die Sichtprüfung von mit Betulinsäure behandelten Melanomzellen zeigte zahlreiche Oberflächenbläschen. Diese Beobachtung im Gegensatz zu einem Kollaps der Zellmembran wies auf die Induktion von Apoptosis hin. Eines der häufigsten molekularen und zellulären anatomischen Anzeichen von Apoptosis ist die Bildung von "DNA-Leitern", die den Produkten des zufälligen endonukleolytischen Aufschließens von Internukleosomen-DNA entsprechen. Neue Studien haben zwar gezeigt, daß ein Mangel an DNA- Leiterbildung nicht unbedingt bedeutet, daß keine Apoptosis stattfindet, aber es wurde gezeigt, daß die Spaltung der doppelsträngigen DNA, die ein Fragment von ungefähr 50 Kbp ergibt, durch verschiedenartige Behandlungen bei einer Vielzahl von Zellinien gleichbleibend mit der Induktion von Apoptosis korreliert. Somit ist die Erzeugung des 50 Kbp-Fragments ein zuverlässiger und allgemeiner Indikator von Apoptosis. Die Erzeugung des Fragments erfolgt an der Aufstromseite des Prozesses, der zu den DNA-Leitern führt, und repräsentiert einen frühen Schlüsselschritt bei der Festlegung auf Apoptosis.
Daher ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung eine Methode zum Analysieren und Quantifizieren der Bildung des 50 Kbp-Fragments als Biomarker für die Induktion von Apoptosis in Human-Krebszellinien. Diese Methode umfaßt die Behandlung von Zellen in Kultur, gefolgt von der Analyse des gesamten zellulären DNA-Gehalts unter Anwendung von Agarosegel-Elektrophorese mit Feldinversion. Unter diesen Bedingungen wird das 50 Kbp-Fragment als diffuse Zone aufgelöst. Die durch das 50 Kbp-Fragment repräsentierte gesamte Zell-DNA wird densitometrisch an der Kontur dieser Zone bestimmt.
Zur Untersuchung der Fähigkeit von Betulinsäure, Apoptosis zu induzieren, wurde die oben beschriebene Methode zum Gebrauch mit der MEL-2-Zellinie adaptiert. Wie 3A zeigt, wurde eine zeitabhängige Ausbildung eines 50 Kbp-DNA-Fragments durch Betulinsäure mit MEL-2-Zellen induziert. Die Induktion war nach einer Behandlungsperiode von 56 h maximal. Nach diesem Zeitraum wurde eine Abnahme der relativen Menge des 50 Kbp-Fragments beobachtet, was wahrscheinlich durch inneren Abbau erfolgte. Außerdem wurden in dem Agarosegel DNA-Fragmente von ungefähr 146 und ungefähr 194 Kbp beobachtet, die theoretisch als Vorläufer in dem Prozeß angesehen werden, der zur Bildung des 50 Kbp-Fragments führt. Außerdem war die durch Betulinsäure vermittelte Induktion von Apoptosis (50 Kbp-Fragment) dosisabhängig ( 3B), und der ED50-Wert (ungefähr 1,5 μg/ml), der in der apoptotischen Antwort beobachtet wurde, lag sehr nahe an dem ED50-Wert, der vorher für die zytotoxische Antwort bestimmt worden war (Tabelle 1).
Unter weiterer Bezugnahme auf 3A wurden kultivierte MEL-2-Zellen (106 Zellen pro 25 cm³ Kolben inokuliert) für 24, 32, 48, 56 und 72 h mit 2 g/ml Betulinsäure (200 μg/ml DMSO, verdünnt 1:100 in Medium) behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen geerntet, mittels Zentrifugierung gesammelt, dann in Flüssigstickstoff für die spätere Analyse schnellgefroren. Proben wurden auf einem 1% Agarosegel in einer Hoefer HE100 SuperSub-Vorrichtung analysiert, die durch ein zirkulierendes Wasserbad auf 10°C gekühlt wurde. Der Elektrodenpuffer war 0,5 × TBE-Puffer, der 0,25 μg/ml Ethidiumbromid enthielt und während der Elektrophorese umgewälzt wurde. Jedes Gel enthielt 20 μl Sigma Pulse Marker 0,1–200 KbP DNA-Größenmarker. Vor dem Beschicken mit den Proben wurde jeder Probenvertiefung 50 μl 2% SDS zugefügt. Jedes Probenröhrchen wurde rasch aufgetaut, dann wurden die pelletierten Zellen sofort in einem Volumen von ungefähr 50 μl in die SDS enthaltende Vertiefung überführt. Über jede Vertiefung wurde dann geschmolzene LMP-Agarose gelegt, die man gelieren ließ, bevor die Gelschale in die SuperSub-Vorrichtung verbracht wurde.
Die Elektrophorese erfolgte bei 172 V über eine Gesamtzeit von 18 h unter Verwendung von zwei sequentiellen Feldinversionsprogrammen mit stufenweisem Impulsanstieg. Die DNA/Ethidiumbromid-Fluoreszenz wurde an einem UV-Txansilluminator angeregt und unter Verwendung von Polaroidfilm Typ 55 P/N fotografiert. Das Negativ wurde analysiert unter Verwendung eines PDI-Abtastdensitometers und von Quantity-One-Software. Die Intensität des 50 Kbp-Fragments wurde bestimmt durch Messen der optischen Konturdichte (OD × mm²) als Prozentsatz der optischen Gesamtdichte in der Probenbahn einschließlich der Probenvertiefung. Die Abnahme in der 50 Kbp-Zonendefinition war durch inneren Abbau verursacht und repräsentiert keine Umkehrung des Prozesses.
Es wird weiter auf 3B Bezug genommen; gezüchtete MEL-2-Zellen wurden für 56 h mit den folgenden Konzentrationen von Betulinsäure behandelt: 0, 0,1, 1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μg/ml. Die Zellen wurden geerntet, und die Apoptosis wurde gemessen, wie es für 3A beschrieben wurde. Das Experiment wurde wiederholt, und eine gleichartige Dosis-Antwort-Kurve wurde beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Diese Daten weisen auf eine kausale Beziehung hin, und die Theorie ist, daß eine durch Betulinsäure vermittelte Apoptosis für die Antitumorwirkung verantwortlich ist, die bei athymischen Mäusen beobachtet wurde. Zeitliche Verlaufsexperimente mit Human-Lymphozyten, die auf die gleiche Weise mit Betulinsäure in Konzentrationen von 2 und 20 μg/ml behandelt wurden, zeigten keine Bildung des 50 Kbp-Fragments (Daten nicht gezeigt), was auf die Spezifität und mögliche Sicherheit der Testverbindung hinweist.
In Anbetracht eines besonderen Zytotoxizitätsprofils in vitro, einer signifikanten Wirksamkeit in vivo und des Wirkmodus ist Betulinsäure eine ausgesprochen attraktive Verbindung für die Behandlung von malignem Human-Melanom. Betulinsäure ist in Bezug auf Toxizität außerdem relativ harmlos, wie die wiederholte Verabreichung von 500 mg/kg-Dosen Betulinsäure ohne akute Anzeichen von Toxizität oder Abnahme des Körpergewichts beweist. Betulinsäure war früher in einem hippokratischen Screening mit 200 und 400 mg/kg-Dosen als unwirksam festgestellt worden.
Es gibt ferner auch keinen Mangel an Betulinsäure. Betulinsäure ist ein allgemein vorkommendes Triterpen, das im gesamten Pflanzenreich von vielen Spezies zur Verfügung gestellt wird. Dabei ist ganz wichtig, daß ein Betulinsäure-Analogon, Betulin, der Hauptbestandteil der Spezies Birken mit weißer Rinde (bis zu 22% Ausbeute) ist und daß Betulin leicht zu Betulinsäure oxidiert werden kann.

Claims

Verwendung von Betulinsäure, welche die folgende Struktur hat
zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines malignen Melanoms, wobei das Medikament zur topischen Applikation auf das Melanom ausgebildet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Melanom ein Human-Melanom ist.