DE60216979T2

DE60216979T2 - Synergistische hepatoprotektive Zusammensetzung aus trans-Tetracos-15-ensäure und Apocynin und Verwendung davon

Info

Publication number: DE60216979T2
Application number: DE60216979T
Authority: DE
Inventors: Sukhdev Swami Handa; Parkash Om SURI; V.N. Gupta; Avtar Krishan SURI; Kumar Naresh SATTI; Vikram Bhardwaj; Bupinder Singh; Krishan Bal CHANDAN
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2002-03-25
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2022-03-26
Also published as: JP4299147B2; JP2005526098A; EP1509285A2; CN1269475C; WO2003080081A3; AU2002253445A8; DE60216979D1; AU2002253445A1; CN1625422A; ATE348648T1; EP1509285B1; WO2003080081A2

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine synergistische hepatoprotektive Zusammensetzung, umfassend trans-Tetracos-15-ensäure (TCA) und Apocynin (APO). Die vorligende Erfindung bezieht sich auch auf eine Verwendung bei der Behandlung von Hepatotoxizität in Säugetieren.
STAND DER TECHNIK
Es wurde berichtet, dass Apocynin, ein herzstärkender Bestandteil des Rhizoms bzw. Wurzelstocks von Apocyanum cannabium [Finnemore Horace, J. Chem. Soc. 93 (1908) 1513–1520] und A. androsaemifolium [Naves Yves-Rene, Helv Chim Acta 32 (1949) 1351] und essentielle Öle des Rhizoms von Iris Arten für choleretische Aktivität von Picrorhiza kurroa [Basu, K., Dasgupta B., Bhattacharya, S. K. and Debnath, P. K. Curr Sci, 40 (1971) 603] verantwortlich sind. Der Bestandteil wurde synthetisiert und pharmakologisch bewertet. [Suri, O. P., Bindra, R. S., Satti, N. K. und Khajuria, R. K. Indian Journal of Chemistry, 26B (1987), p 587–88]. Apocynin wurde auch bezüglich antioxidierender und freier Radikalfänger-Aktivität bewertet.
Wurzeln von Picrorhiza kurroa wurden therapeutisch in der traditionellen Medizin nahezu aller Asiatischer Länder verwendet, um eine Vielzahl von Krankheitszuständen, beinhaltend Leber-, Lungen- & Milzbeschwerden [Rajaram, D. (1976) Bomb. Hosp. Journal, 18, 66–69; Pandey, G. S. (1979) Indian Materia Medica, Chaukhamba Sanskrit Sansthan, Varanasi pp 70–71; Langar, J. G., Gupta, O. P. and Atal, C. K. (1981), Ind. J. Pharm. 13, 98–99; Handa, S. S., Sharma, A. and Chakraborty, K. K. (1986), Fitotherapia, 58, 307–351; Ansari, R. R., Kapoor, N. K., Kulshreshta, D. K., Mehta, H., Mehrotra, B. N., Patnaik, G. K. and Shanna, S. K. (1988), Indian J. Med. Plants, 87, 401–404] und entzündliche Erkrankungen [Nadkarni, K. M. (1954), Indian Materia Medica, vol. 1, Popular Book Depot, Bombay pp. 25–27, 619–622, 634–651, 953–955, 1220–1221, 1252–53; Dey, A. C. (1981), Indian Medicinal Plants used in Ayurvedic Preparations, Bishan Singh & Mahendra Pal Singh, Dehra Dun, India pp 81–82; Jayaweera, D. M. A. (1982) Medicinal Plants used in Ceylon, The National Science Council of Sri Lanka, Colombo, Sri Lanka, part 5, pp 76] zu behandeln. Hepatoprotektive, immunstimulierende & immunrestorative Formulierungen basierend auf chemischen Bestandteilen von P. Kurroa, hauptsächlich iridoide Glycoside, wurden bei CDRI Lucknow & RRL Jammu [450/DEL/89 & 845/DEL/92] entwickelt.
Literaturrecherche offenbarte, dass frühere Berichte die Anwesenheit von trans-Tetracos-15-ensäure in Jojobaöl ex. Simmondsia chinensis Samen (0,62–1,11%) zeigten und das cis-Isomer der Säure wird in Fettsäuren des Samenöls von Microula sikkimensis (1.2%) [Wang Huiying, Yu Xuefian, Yi Yuanfen und Ding Jingkai Yunnan Zhiwu-Yanjiu 1989, 11 (1), 60-4 (Ch.), L. JingJingmin, Wang Jingping, Yu Fenglan. Zhiwu Xuebao, 1989, 31 (1), 50-3 (Ch.)] beschrieben. Diese Berichte erwähnen nicht die Isolierung des Bestandteils und der Gehaltsbestimmung basierend auf GLC Daten.
Indigofera tinctoria fand in der Eingeborenenmedizin Verwendung bei Epilepsie, nervösen Störungen & Bronchitis [Wealth of India, vol. 5. (Council of Scientific & Industrial Research, New Delhi) 182, (1959)]. Die Pflanze wird außerdem als Heilsalbe bei Wunden, alten Gewüren and Hämorriden verwendet [R. N. Chopra, S. L. Nayar and I. C. Chopra, Glossary of Indian Medicinal Plants, 141 (1956)]. Die Blätter der Pflanzen wurden bei Leberbeschwerden verwendet. [Nadkarni, K. M., Indian Materia Medica, vol. 1 (Popular Book Depot, Bombay, 680 (1954)]. Ein Extrakt der Blätter der Pflanze wies eine merkliche hepatoprotektive Wikung gegenüber CCl₄ induzierter Leberverletzung bei Kaninchen, Ratten und Mäusen am Regional Research Laboratory (RRL) Jammu auf. [Anand, K. K., Chand Dewan and Ghatak, B. J. Ray, Indian J. Exp. Biol., 17, 685 (1979); Anand, K. K., Chand Dewan, Ghatak, B. J. Ray and Arya, R. K., Indian J. Expl. Biol., 19, 298 (1981)].
Eine neue Studie bei RRL Jammu bezüglich der hepatoprotektiven Wirkung des Pflanzenextrakts und weiterer bioactivitäts-geführten Fraktionierung ist auf die Identifizierung der trans-Tetracos-15-enosäure als aktivem Grundbestandteil hinausgelaufen. Der Bestandteil ist synthetisiert und beobachtet worden, um über die dosisbezogene hepatoprotektive Wirkung gegen Galactosamine, Paracetamol und CCl₄ als Hepatotoxine zu verfügen, unter Verwendung kommerziell verfügbaren Silymarins als Referenzmaterial.
Eine Aktivität der Formulierung, die in der Erfindung beschrieben wird, ist nicht exakt gleich der Summe der Aktivitäten der zwei individuellen Bestandteile, und Aktivitätserhöhungerhöhung erfolgt nicht einfach wegen des Mischens der zwei Zusammensetzungen. Das ist durch Mischen der Formulierung mit RLJ-NE-299A, einer standardisierten Mischung von iridoiden Glycosiden von Picrorhiza kurroa bestätigt worden, die hepatoprotektive, immunstimulierende und immunorestorative Wirkungen besitzt [Indisches Patent Nr. 178866].
Das Mischung von Apocynin, trans-Tetracos-15-ensäure, die in vielen anderen Gewichtsverhältnissen bereitet wurde, hat keine Erhöhung in der hepatoprotektiven Wirkung gezeigt und in einigen Experimenten ist die biologische Aktivität der Mischung viel geringer, als die der individuellen Bestandteile.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die Hauptaufgabe der Erfindung besteht darin, eine synergistische Zusammensetzung aus trans-Tetracos-15-ensäure und Apocynin bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Verwendung in der Behandlung von Hepatotoxizität bereitzustellen.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin eine Zusammensetzung bereitzustellen, welche ein breiteres Spektrum hepatoprotektiver Aktivität aufweist, als etablierte, verwendete Pflanzenprodukt, d.h. Silymarin.
Noch eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die eine potentielle therapeutische Anwendung in obstruktiver und viraler Hepatitis bereitstellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine synergistische hepatoprotektive Zusammensetzung, die trans-Tetracos-15-ensäure (TCA) und Apocynin (APO) enthält. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der Behandlung von Hepatotoxiziät in Säugetieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine synergistische pharmazeutische Zusammensetzung mit verbesserter hepatoprotektiver Aktivität bzw. Wirksamkeit auf Probanden bereit, erhältlich aus der Pflanze Indigofera tinctoria, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge aufweist von:

(a) trans-Tetracos-15-ensäure (TCA), erhältlich aus der Pflanze Indigofera tinctoria;
(b) Apocynin (APO), erhältlich aus den Pflanzen Apocyanum cannabium und A. androsaemifolium; und
(c) wobei das Verhältnis von APO und TCA im Bereich von 3:1 bis 1:3 liegt.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin besagte Zusammensetzung entweder einzeln oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Additiven verwendet wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die pharmazeutisch akzeptablen Additive aus der Gruppe, bestehend aus Trägern, Verdünnungsmitteln, Lösungsmitteln, Filtern, Gleitmitteln, Hilfsstoffen bzw. Arzneimittelträgern, Bindemitteln und Stabilisatoren, ausgewählt werden.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin besagte Zusammensetzung sowohl für präventive, als auch für kurative Eigenschaften verwendet wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin besagte Zusammensetzung systemisch, oral oder durch jede andere klinisch medizinisch akzeptierte Verwendungen verwendet wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Zusammensetzung verwendet wird, um Funktionsstörungen der Leber, die klinisch, biochemisch und histologisch denen viraler Hepatitis, chronischer Hepatitis, Fettleber, Zirrhose und verschiedenen Gefäßverletzungen der Leber gleichen, zu behandeln.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin besagte Zusammensetzung verwendet wird, um den Leberschaden, der durch Hepatotoxine verursacht wird, zu behandeln.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Hepatotoxine aus der Gruppe bestehend aus Galactosamin, Paracetamol, und Tetrachlorkohlenstoff ausgewählt sind.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin Probanden aus der Gruppe, bestehend aus Säugetieren, ausgewählt sind.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Dosierung der Zusammensetzung für die Behandlung von CCl₄-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Zusammensetzung eine verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit in CCl₄-induzierten hepatoxischen Säugetieren von bis zu 92% aufweist.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Dosierung der Zusammensetzung für die Behandlung von Acetaminophen-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Zusammensetzung verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Acetaminophen-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren von bis zu 86% aufweist.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Dosierung der Zusammensetzung für die Behandlung von Galactosamin-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Zusammensetzung verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Galactosamin-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren von bis zu 75%.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Dosierung der Zusammensetzung für choleretische Wirksamkeit in Säugetieren zur Kontrolle von Gallenfluss und Gallensteinen 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Zusammensetzung verbesserte choleretische Wirksamkeit von bis zu 39% aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verwendung zur Behandlung von Probanden mit Lebererkrankungen mit einer wirksamen Menge der synergistischen pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, um verbesserte hepatoprotektive Aktivität zu induzieren, besagte Zusammensetzung umfassend:

(a) trans-Tetracos-15-ensäure (TCA), erhältlich aus der Pflanze Indigofera tinctoria;
(b) Apocynin (APO), erhältlich aus den Pflanzen Apocyanum cannabium und A. androsaemifolium; und
(c) das Verhältnis von APO und TCA liegt im Bereich von 3:1 bis 1:3

Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin besagte Verwendung verwendet wird, um Lebererkrankungen zu behandeln, welche durch Galactosamin, Paracetamol, und Tetrachlorkohlenstoff verursacht wurden.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die Dosierung für die Behandlung von CCl₄-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber CCl₄-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren bis zu 92% beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die Dosierung für die Behandlung von Acetaminophen-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Acetaminophen-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren bis zu 86% beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die Dosierung für die Behandlung von Galactosamin-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Galactosamin-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren bis zu 75% beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die Dosierung für choleretische Wirksamkeit in Säugetieren zur Kontrolle von Gallenfluss und Gallensteinen 50mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die verbesserte choleretische Wirksamkeit in Säugetieren bis zu 39% beträgt.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin besagte Zusammensetzung entweder einzeln oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern verwendet wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die Zusammensetzung einem Probanden in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Additiven, Trägern, Verdünnungsmitteln, Lösungsmitteln, Filtern, Gleitmitteln, Hilfsstoffen, Bindemitteln und Stabilisatoren verabreicht wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin die gewünschte Dosis sowohl für präventive, als auch für kurative Eigenschaften verabreicht wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin besagte Zusammensetzung systemisch, oral oder durch jede anderen klinisch/medizinisch akzeptierten Verwendungen verabreicht wird.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung, worin der Proband aus Tieren, Säugetieren ausgewählt ist.
Die Erfindung wird ferner in Form bevorzugter Ausführungsformen erklärt.
i. Tiere:
Die pharmakologischen Studien wurden an Wistar Albinoratten (150–180g) und an Schweizer Albinomäusen (25–30g) beiderlei Geschlechts durchgeführt, koloniegezüchtet im Tierhaus des Instituts. Nach Beschaffung werden alle Tiere in verschiedene Gruppen geteilt und für eine Woche zum Akklimatisieren an den Experimentierraum gelassen und bei Standardbedingungen (23±2°C, 60–70% relative Luftfeuchtigkeit und 12 h Lichtperiode) gehalten. Die Tiere werden mit Standardnagtiertablettendiät und Wasser ad libitum gefüttert. Es sind sechs Tiere in jeder Gruppe ausgenommen für allgemeine Verhaltens- und akute Toxizitätsstudien, wo zehn Tiere in jeder Gruppe verwendet werden.
ii. Hepatotoxine:
Es wird hervorgehoben, dass Hepatotoxin, das akute Hepatitis verursacht, starke Ähnlichkeit mit der viralen Hepatitis haben sollte, klinisch, biochemisch und histologisch. Medikamente sind auch Ursachen chronisch hepatischer Krankheit, wie chronischer Hepatitis, Fettleber, Zirrhose und einiger Gefäßverletzungen der Leber. In vielen Fällen ist medikamentös verursachte Hepatitis nicht zu unterscheidenden von viraler Hepatitis. Chemisch induzierte hepatische Verletzung für experimentelle Studien sollte schwer genug sein, um Zelltod zu verursachen oder hepatische Funktionen zu verändern. Der Mechnismus der akuten hepatischen Verletzung hängt von der chemischen Verbindung und der Gattung der benutzten Tiere ab. Viele Chemikalien produzieren parenchymalen Schaden, blockieren den Gallenfluss und verursachen Gelbsucht (choleretische Verletzung). Hepatoprotektive Aktivität gegen CCl₄-, Paracetamol- und, D-Galaktosamin-induzierte Hepatotoxizität werden untersucht.
Tetrachlorkohlenstoff (CCl₄): CCl₄ ist eines der stärksten Hepatotoxine (in Bezug auf die Schwere der Verletzung). Es verursacht toxische Nekrose, welche zu biochemischen Veränderungen führt, die klinische Eigenschaften ähnlich denen von akuter viraler Hepatitis haben (Vogel, 1977, Bramanti et. al., 1978, Kumar et. al., 1992). Leberverletzung wird durch Gabe von CCl₄ gemischt mit flüssigem Parafin verursacht. Tieren wird eine einzelne Dosis von CCl₄ (50 μL kg ^–1, p.o.) in akuter Einzelbehandlung und (0,5 mL kg ^–1, p.o.) im Fall einer Mehrfachbehandlung mit Medikament gegeben. Es wird oral (p.o.) durch gastrische Intubation verabreicht. Die Kontrolltiere empfingen dasselbe Volumen an flüssigem Paraffin (Tabelle 3, 4).
Paracetamol (APAP, Acetaminophen): Es ist ein therapeutisches Agens, das häufig als schmerzlinderndes/fiebersenkendes Medikament verwendet wird. Wenn es in großen Dosen eingenommen wird, verursacht es hepatische Nekrose welche zu biochemischen Veränderungen führt, die klinische Eigenschaften ähnlich denen von akuter viraler Hepatitis haben. Die selbe Wirkung wird bei Tieren beobachtet. Die toxische Wirkung kann potentiert werden, wenn es mehrere Stunden nach der anästhetischen Etherinhalation gegeben wird (Wells et.al., 1986).
Leberverletzung wird durch Injizieren von Paracetamol (200 mg kg ^–1), interaperitoneal in Normalkochsalzlösung (pH 9,4), sechs Stunden nach Inhalation von anästhetischem Ether (4 mL/4 min/6 Tiere) in einer geschlossenen Kammer induziert. Die Kontrolltiere empfingen dasselbe Volumen an Vehikel (Tabelle 2).
D-Galactosamin: Es ist eines der Toxine, das hepatische entzündliche Bedingungen in der Rattenleber verursacht, die klinisch viraler Hepatitis ähneln. Der Mechanismus von GalN induzierter Leberverletzung wurde ausführlich erforscht und dies Modell ist nun als eines der authentischen Systeme des Leberschadens akzeptiert (Bauer et. al., 1974, Al-Tuwaijiri et. al. 1981). (Tabelle 1)
Hepatischer Schaden wird durch subkutanes Injizieren von GalN (300 mg kg)^–1 in Normalkochsalzlösung erzeugt. Die Kontrolltiere empfingen das selbe Volumen an Vehikel.
iii. Behandlung mit bioaktiver Verbindung und Silymarin:
Eine frisch zubereitete Suspension (1%, w/v) in 0,2% Gummi Arabicum in Normalkochsalzlösung wird für alle die Experimente verwendet, außer für Toxizitätsstudien, wo eine (10%, w/v) Suspension verwendet wird. Silymarinsuspension (1%, w/v) in 0,2% Gummi Arabicum wird als ein Referenzstandard verwendet (positive Kontrolle).
iv. Experimentelle Modelle:
Effekt auf Serum und hepatische biochemische Parameter:
CCl₄ induzierte Hepatotoxizität:
Behandlung von Testmaterial vor und nach Hepatotoxin: Die Dosen von TCA und APO, individuell und in Mischungen Silymarin (50 mg/kg, p.o. jeweils) und Vehikel (Normalkochsalzlösung) werden an verschiedene Gruppen von Ratten 48 Stunden, 24 Stunden und 2 Stunden vor und 6 Stunden nach Intoxikation mit Hepatotoxin (CCl₄, 0,5 mL kg^–1, p.o.) verfüttert. Blut wird von allen Tieren von der Augenhöhlenkurve 18 Stunden nach der letzten Behandlung gesammelt und das Serum für unterschiedliche Untersuchungen getrennt. Alle Tiere werden dann durch Enthauptung getötet, ihre Lebern schnell entnommen, von anheftendem Gewebe gesäubert, gewogen und in Phosphatpuffer-Normalkochsalzlösung zur Analyse von hepatischen Parametern homognisiert (Agarwal und Mehendale, 1983, Klingensmith und Mehendale, 1982, Zimmerman, 1973, Edmondson und Peter, 1985, Mitchell et al. 1973). (Tabelle 3–4).
Paracetamol-induzierte Hepatotoxizität:
Behandlung von Testmaterial vor und nach Hepatotoxin:
Die Dosen von TCA und APO, individuell und in Mischungen, Silymarin (50 mg/kg, p.o. jeweils) und Vehikel (Normalkochsalzlösung) werden an verschiedene Gruppen von Mäusen nach 72 Stunden, 48 Stunden und 24 Stunden verfüttert, 1 Stunde vor Diethylether-Inhalation und 1 Stunde nach Hepatotoxin (Paracetamol, 200 mg kg ^–1, i.p.) verabreicht 6 Stunden nach Exposition gegenüber Diethylether. Blut wird von allen Tieren von der Augenhöhlenkurve 18 Stunden nach der letzten Behandlung gesammelt und das Serum für unterschiedliche Untersuchungen getrennt. Ein Teil ihrer Lebern wird für histopathlogische Untersuchungen verarbeitet (Tabelle 2).
D-Galactosamin-induzierte Hepatotoxizität
(a) Behandlung von Testmaterial vor und nach Hepatotoxin:
Die Dosen von TCA und APO, individuell und in Mischungen, Silymarin (50 mg/kg, p.o. jeweils) und Vehikel (Normalkochsalzlösung) werden an verschiedene Gruppen von Mäusen 48 Stunden, 24 Stunden und 2 Stunden vor und 6 Stunden nach Intoxikation mit Hepatotoxin (GalN, 300 mg kg^–1, s.c.) verfüttert. Blut wird von allen Tieren von der Augenhöhlenkurve 18 Stunden nach der letzten Behandlung gesammelt und das Serum für unterschiedliche Untersuchungen getrennt. Alle Tiere werden dann durch Enthauptung getötet, ihre Lebern schnell entnommen, von anheftendem Gewebe gesäubert, gewogen und in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung zur Analyse von hepatischen Parametern homognisiert. Ein Teil der Leber wird für histopathlogische Untersuchungen verarbeitet (Tabelle 1)
Untersuchte Parameter:
GPT und GOT: Durch Transaminierungsreaktion gebildetes Pyruvat wird spektrophotometrisch nach Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin bestimmt (Reitmann und Frankel, 1957).
ALP: p-Nitrophenol, das in alkalischen Medium gebildet wurde, wird spektrophotometrisch unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat erfasst (Walter und Schutt, 1974).
Bilirubin: Gesamtbiliburin wird durch Diazoierungsreaktion mit NaNO₂ erfasst (Malloy und Evelyn, 1937).
Triglyceride: Triglyceride aus dem Serum werden mit Isopropanol extahiert und mit KOH verseift. Das freigesetzte Glycerin wird durch Periodat zu Formaldehyd konvertiert und nach der Reaktion mit Acetylaceton bestimmt. Triolein wird als Standard verwendet (Neri und Firings, 1973).
Glutathion: Es wird nach Deproteinierung durch Reaktion mit DTNB bestimmt (Ellman 1959, wie von David 1987 modifiziert).
Lipidperoxidation: Mit Thiobarbitursäure reagierende Substanzen werden spektrophotometrisch bei 535 nm bestimmt (Buege und Aust, 1978).
Hepatoprotektive Aktivität:
Hepatoprotektive Aktivität (H) wird mit der folgenden Formel berechnet: H = [1 – (TC-V/VC-V)] × 100Wo TC, VC und V jeweils Medikament + Toxin, Vehikel + Toxin und Vehikel behandelte Gruppen von Tieren sind.
Effekt auf Gallenfluss und Gallensteine
Die Leber spielt, durch die Produktion von Galle, eine wichtige Rolle bei der Verdauung. Das Vorhandensein der Galle im Darm ist notwendig, um die Verdauung und die Absorption der Fette sowie die Absorption der fettlöslichen Vitamine A, D, E & K zu vollenden. Galle ist auch ein wichtiges Vehikel der Ausscheidung. Es entfernt viele Medikamente, Giftstoffe, Gallenpigmente und verschiedene anorganische Substanzen, jede von der Ernährung abgeleitet oder vom Körper als Cholesterin oder Cholsäure synthetisiert. Zunahme des Gallenflusses deutet angeregte Tätigkeit der mikrosomalen Enzyme der Leber an.
Wirkung auf den Lebergallenfluss des Testmedikaments und den des Vehikels wird, nachdem man den Gallenweg normal anästhesierter Ratten punktiert hat, durchgeführt. Die gesammelte Galle ist von jedem Tier von 0–5 Stunden (Klaassen, 1969, Donal et. al. 1953) (Tabelle 5).
Histopathologische Studien:
Histopathologische Studien: Ein Teil der Leber nach Behandlung von Hepatotoxin (GalN, CCl₄, und Paracetamol) und Testmaterial wird für histopathologische Studien durch Standard-Hematoxylin- und Eosin-gefärbte Abschnitte verarbeitet (Krajian, A. A., 1963).
Allgemeines Verhalten und akute Toxizität:
Unter Verwendung unterschiedlicher Dosen (10, 30, 100, 1200, 1400, 1600, 1800, und 2000 mg kg^–1) der besagten Zusammensetzung, oral an die Gruppen von 10 Mäusen für jede Dosis verabreicht, während eine Gruppe mit derselben Anzahl an Mäusen als Kontrolle diente. Die Tiere werden kontinuierlich für 1 Stunde beobachtet und dann halbstündlich für 4 Stunden auf Änderungen des Allgemeinverhaltens und allgemeine motorische Aktivität, und sich krümmen, Krämpfe, Antwort auf in den Schwanz kneifen, Nagen, Piloarrektion, Pupillengröße, fäkalen Abgang, Futterverhalten etc. und ferner bis zu 72 Stunden auf jegliche Sterblichkeit. Akute LD₅₀-Werte in Mäusen werden unter Verwendung von Miller und Tainter (1944) errechnet. Die Sterblichkeit der Tiere in allen Gruppen, die in den unterschiedlichen Modellen für die Bestimmung von hepatoprotektive Tätigkeit während der Periode der Behandlung verwendet werden, wird auch als grober Index der subakuten Toxizität festgehalten.
Statistische Analyse:
Die erhaltenen Daten werden statistischer Analyse unter Verwendung von ANOVA zum Vergleich unterschiedlicher Gruppen (Armitage, 1987) und Dunnett's t Test für Kontroll- und Testgruppen (Dunnett, 1964) unterworfen. Der Regressionskoeffizient (Steigung b) Korrellationskoeffizient (r) mit seinem p Wert und ED₅₀ mit 95% Zuverlässigkeitsgrenze (CL) werden durch Regressionsanalyse unter Verwendung von log Dosis und prozentualem Wirkung adaptogenischer Aktivität bestimmt (Swinscow, 1980). Der ungerichtete Student t Test für Vergleichsmittel vor und nach Behandlung und gerichtete Student t Test zum Vergleich von Kontrolle und medikamentenbehandelter Gruppe (Ghosh, 1984) werden verwendet. Der p Wert von < 0,05 oder weniger wird als das Kriterium von Signifikanz genommen.
VORTEILE
Die meisten auf dem Markt erhältlichen hepatoprotektiven Präparate/Formulierungen sind pflanzenbasiert und demnach sowohl chemisch als auch biologisch unstandardisiert. Die Aktivität der pflanzlichen Formulierungen ist bekannterweise abhängig von sekundären Metaboliten und deren Zuverlässigkeit kann nur sichergestellt werden, wenn Standardisierung (chemisch und pharmakologisch) von Charge zu Charge durchgeführt wird. In der vorliegenden Erfindung

a) ist die chemische Zusammensetzung der Formulierung gut beschrieben, weshalb reproduzierbare biologische Aktivität sichergestellt wird.
b) sind Aktivitätsparameter von einem breiteren Spektrum, und daher Wirksamkeit der Formulierung in obstruktiver und viraler Hepatitis.
c) weisen pharmakologische Evaluierungsdaten der Formulierung klar auf synergistische Wirkung der Bestandteile der Formulierung hin.

Claims

Synergistische pharmazeutische Zusammensetzung mit verbesserter hepatoprotektiver Wirksamkeit auf Probanden, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge aufweist von: (a) trans-Tetracos-15-ensäure (TCA), erhältlich aus der Pflanze Indigofera tinctoria; (b) Apocynin (APO), erhältlich aus den Pflanzen Apocyanum cannabium und A. androsaemifolium; und (c) wobei das Verhältnis von APO und TCA im Bereich von 3:1 bis 1:3 liegt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin besagte Zusammensetzung entweder einzeln oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Additiven verwendet wird.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, worin die pharmazeutisch akzeptablen Additive aus der Gruppe, bestehend aus Trägern, Verdünnungsmitteln, Lösungsmitteln, Filtern, Gleitmitteln, Hilfsstoffen, Bindemitteln und Stabilisatoren, ausgewählt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin besagte Zusammensetzung sowohl für präventive, als auch für kurative Eigenschaften verwendet wird.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin besagte Zusammensetzung systemisch, oral oder durch jede andere klinisch/medizinisch akzeptierte Verwendung verabreicht werden soll.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Zusammensetzung verwendet wird, um Funktionsstörungen der Leber, die klinisch, biochemisch und histologisch denen viraler Hepatitis, chronischer Hepatitis, Fettleber, Zirrhose und verschiedenen Gefäßverletzungen der Leber gleichen, zu behandeln.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin besagte Zusammensetzung verwendet wird, um den Leberschaden, der durch Hepatotoxine verursacht wird, zu behandeln.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Hepatotoxine aus der Gruppe bestehend aus Galactosamin, Paracetamol, und Tetrachlorkohlenstoff ausgewählt sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin Probanden aus der Gruppe, bestehend aus Säugetieren, ausgewählt sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, worin die Dosierung für die Behandlung von Tetrachlorkohlenstoff-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit in CCl₄-induzierten hepatoxischen Säugetieren 92% beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, worin die Dosierung für die Behandlung von Acetaminophen-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Acetaminophen-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren 86% beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, worin die Dosierung für die Behandlung von Galactosamin-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Galactosamin-induzierter Hepatotoxizität in Säugetieren 75% beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Dosierung für choleretische Wirksamkeit in Säugetieren zur Kontrolle von Gallenfluss und Gallensteinen 50mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die verbesserte choleretische Wirksamkeit 39% beträgt.
Verwendung einer synergistischen pharmazeutischen Zusammensetzung, zur Herstellung eines Medikaments, zur Behandlung von Probanden mit Lebererkrankungen mit einer wirksamen Menge der synergistischen pharmazeutischen Zusammensetzung um verbesserte hepatoprotective Wirksamkeit zu induzieren, besagte Zusammensetzung umfassend: (a) trans-Tetracos-15-ensäure (TCA) erhältlich aus der Pflanze Indigofera tinctoria; (b) Apocynin (APO) erhältlich aus den Pflanzen Apocyanum cannabium und A. androsaemifolium; und (c) das Verhältnis von APO und TCA liegt im Bereich von 3:1 bis 1:3
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin besagte Zusammensetzung verwendet wird, um Lebererkrankungen zu behandeln, welche durch Galactosamin, Paracetamol, und Tetrachlorkohlenstoff verursacht wurden.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die Dosierung für die Behandlung von CCl₄-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber CCl₄-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 92% beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die Dosierung für die Behandlung von Acetaminophen-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Acetaminophen-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 86% beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die Dosierung für die Behandlung von Galactosamin-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 50 mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die verbesserte hepatoprotektive Wirksamkeit gegenüber Galactosamin-induzierter Hepatoxizität in Säugetieren 75% beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin die Dosierung für choleretische Wirksamkeit in Säugetieren zur Kontrolle von Gallenfluss und Gallensteinen 50mg/kg-Körpergewicht beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin die verbesserte choleretische Wirksamkeit in Säugetieren 39% beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 18 worin besagte Zusammensetzung entweder einzeln oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin die Zusammensetzung einem Probanden in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Additiven, Trägern, Verdünnungsmitteln, Lösungsmitteln, Filtern, Gleitmitteln, Hilfsstoffen, Bindemitteln und Stabilisatoren verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin die gewünschte Dosis sowohl für präventive, als auch für kurative Eigenschaften verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin besagte Zusammensetzung systemisch, oral oder durch jede andere klinisch/medizinisch akzeptierte Verwendung verabreicht wird.
Verwendung gemäß Anspruch 18, worin der Proband aus Tieren und Säugetieren ausgewählt ist.