DE60310742T2

DE60310742T2 - Extrakt mit antitumoraler und antitoxischer wirkung

Info

Publication number: DE60310742T2
Application number: DE60310742T
Authority: DE
Inventors: Francis Darro; Jean-Claude Braekman; Pierre Guissou; Germaine Odile NACOULMA; Mohamed El Yazidi; Janique Dewelle; Rob Van Ginkel; Marc Van Damme; Robert Kiss
Original assignee: Unibioscreen SA; Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Unibioscreen SA; Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: ZA200502790B; DE60310742D1; CN1711099A; CN100522184C; EP1549329B1; WO2004032947A1; EP1549329A1; ES2279157T3; DK1549329T3; PT1549329E; CA2501240A1; WO2004032948A1; AU2002342808A1; US20060057237A1; AU2003273973A1; AU2003273973B2; MXPA05003634A; ATE349221T1; HK1082663A1; JP4944380B2

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das medizinische Fachgebiet. Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt die Extrakte der Pflanze Calotropis procera, die eine pharmakologische Wirkung besitzen, insbesondere eine antitumorale Wirkung und/oder eine antitoxische Wirkung, und die Wirkstoffe, die daraus isoliert werden. In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren für das Erhalten der Extrakte. Die Erfindung betrifft des weiteren in einem dritten Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs, welches eine wirksame Menge der Extrakte oder einen Wirkstoff davon umfasst. In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der Extrakte oder eines Wirkstoffs davon als ein Medikament und die Verwendung der Extrakte oder eines Wirkstoffs davon für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs entwickelt sich in einem bestimmten Gewebe, wenn eine genomische Mutation die Kinetik des Zellzyklus durch die Erhöhung des Zellwachstums oder durch die Verminderung des Zelltods oder durch beides stört. Die Störung führt zu dem ungehinderten Wachstum einer genomisch transformierten Zellpopulation. Einige Zellen dieser transformierten Zellpopulation können zu einem angiogenetischen Phänotyp wechseln, was ihnen ermöglicht, Endothelzellen aus dem gesunden Gewebe zu rekrutieren, und was zu dem anhaltenden Wachstum des sich entwickelnden neoplastischen Tumorgewebes führt. Anschließend wandern einige Zellen aus dem neoplastischen Tumorgewebe aus und siedeln sich in neuen Geweben an, wobei Blutgefäße oder andere Gefäße als Hauptwege der Migration verwendet werden. Dieser Prozess ist auch als der metastatische Prozess bekannt.
In der Praxis sind die meisten der Arzneimittel, die zur Zeit in Krankenhäuser verwendet werden, um Patienten mit Krebs zu behandeln, Arzneimittel, die mehr oder weniger direkt auf die Zellkinetik, das heißt das Zellwachstum, des Krebs, der bekämpft werden soll, zielen. Der Wirkungsmechanismus solcher Antikrebsmittel betrifft im Wesentlichen die Unterbrechung der Entwicklung der bösartigen Zellen durch eine Wirkung auf die Zellkinetik. Diese Arzneimittel schließen alkylierende Wirkstoffe, interkalierende Wirkstoffe, Antimetaboliten, etc. ein, wobei die meisten auf die DNA zielen oder auf Enzyme, welche die Duplikation der DNA und den Prozess der Verlängerung regulieren. Diese Arzneimittel greifen die DNA an.
Ein deutlicher Nachteil dieser Arzneimittel beinhaltet, dass diese Arzneimittel nicht auf eine selektive Weise wirken, das heißt, dass sie nicht zwischen normalen und neoplastischen Zellen unterscheiden. Sie werden gemäß der Tatsache verwendet, dass die DNA von schnell wachsenden Zellen, das heißt Krebszellen, sensitiver gegen diese Art der Wirkstoffe ist als die DNA von weniger schnell wachsenden Zellen, das heißt von normalen Zellen. Schnell wachsende Tumore sind jedoch nicht immer Tumore, die hohe Werte des Zellwachstums zeigen. Schnell wachsende Tumore können ebenfalls Tumore einschließen, die niedrige Werte des Zelltods im Vergleich zu der normalen Zellpopulation zeigen, von der diese Tumorzellen abstammen. Für diese Arten von schnell wachsenden Tumoren sind die erwähnten Arzneimittel nicht wirksam.
Zusätzlich besitzt die große Mehrzahl der Arzneimittel, die in der Standardbehandlung von Krebs verwendet werden, wobei der Ansatz der Zellkinetik verwendet wird, den Nachteil, dass sie toxisch oder sogar hochtoxisch ist, das heißt, dass sie viele schädliche Nebenwirkungen auf gesunde Zellen, Gewebe und Organe beinhaltet, und dieses begrenzt ihre klinische Verwendung auf eine relativ geringe Anzahl der Verabreichungen pro Patient. Zusätzlich müssen mehrere dieser Verbindungen zu einer poly-chemotherapeutischen Behandlung zusammengefasst werden, um eine zu beobachtende Wirkung gegen den Krebs zu erhalten. Solche Kombinationen der Antikrebsmittel verstärken nachweislich auf eine schädliche Weise die Toxizität der Behandlung und begrenzen ebenfalls die Anzahl der Verabreichungen, die angewendet werden können.
Einige Antikrebsmittel mit einem natürlichen Ursprung, wie z.B. Anti-Tubulin-Verbindungen, die einen therapeutischen Ansatz verwenden, der sich von dem Ansatz der Zellkinetik unterscheidet, wurden vorgeschlagen. Diese Arzneimittel zielen darauf, die Migration der Krebszellen zu verhindern, die aus der Tumormasse entkommen und zuerst in benachbartes Gewebe eindringen, wodurch Metastasen etabliert werden. Die Verbindungen dieser Art, die zur Zeit bekannt sind, zeigen jedoch starke toxische Nebenwirkungen, welche ihre Verwendung über lange Zeiträume der Behandlung begrenzen.
Daher bleibt auf dem Fachgebiet ein dringender Bedarf bestehen, verbesserte Antikrebsmittel zu finden, die wenigstens einige der vorstehend erwähnten Nachteile überwinden. Daher ist eine allgemeine Aufgabe der Erfindung, verbesserte Antikrebsmittel zur Verfügung zu stellen. Insbesondere zielt die Erfindung darauf, ein verbessertes Antikrebsmittel zur Verfügung zu stellen, das nur minimale Nebenwirkungen zeigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extrakt der Pflanze Calotropis procera, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Extrakt eine pharmakologische Wirkung besitzt, insbesondere eine antitoxische Wirkung. In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher die Verwendung einer Zusammensetzung, die einen Extrakt von Calotropis procera gemäß Anspruch 1 umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Prozess der Extraktion zum Erhalt eines Extrakts, der biologisch aktive Komponenten gemäß Anspruch 12 besitzt. In noch einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen aktiven Extrakt gemäß Anspruch 13.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extrakt, wie vorstehend beschrieben wird, der durch ein Extraktionsverfahren erhalten wird, das die Schritte umfasst:

a) Extrahieren des Ausgangsmaterials von der Calotropis procera-Pflanze, wobei das Ausgangsmaterial ausgewählt ist aus Früchten, oberirdischen Teilen, unterirdischen Teilen und ihren Gemischen in einem aliphatischen Alkohol durch Auflösen des Ausgangsmaterials in dem Alkohol, wobei eine Suspension des Materials in Alkohol erhalten wird, Rühren der Suspension und Filtrieren der Suspension durch eine Glasfritte wobei ein erstes Filtrat und ein erster fester Anteil erhalten werden;
b) Extrahieren des ersten festen Anteils in einem aliphatischen Alkohol, wobei ein zweites Filtrat und ein zweiter fester Anteil erhalten werden;
c) Vereinigen des ersten und zweiten Filtrats, wobei ein vereinigtes Filtrat erhalten wird und Eindampfen des vereinigten Filtrats unter Vakuum, wobei der Extrakt erhalten wird.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extrakt, wie vorstehend beschrieben wird, der erhalten wird, wobei ein Extraktionsverfahren verwendet wird, das die nachfolgenden Schritte umfasst:

a) Zerreiben des Ausgangsmaterials von Blättern, Stielen, Rinden und Wurzeln von Calotropis procera, um ein feines Pulver der Pflanze zu erhalten,
b) Extrahieren des Pulvers aus Schritt a) mit Dichlormethan für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
c) Abgießen des Dichlormethans aus Schritt b) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extrakt, wie vorstehend beschrieben wird, der erhalten wird, wobei ein Extraktionsverfahren verwendet wird, das die Schritte umfasst:

a) Zerreiben des Ausgangsmaterials von Blättern, Stielen, Rinden und Wurzeln von Calotropis procera, um ein feines Pulver der Pflanze zu erhalten,
b) Extrahieren des Pulvers aus Schritt a) mit Dichlormethan für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
c) Abgießen des Dichlormethans aus Schritt b) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
d) Extrahieren des Reststoffs aus Schritt c) mit Methanol für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
e) Abgießen des Methanols aus Schritt d) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
f) Unterwerfen des Gummis aus Schritt e) einer Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Dichlormethan-Methanol als Lösungsmittel verwendet wird, und
g) Sammeln einer ersten Fraktion und Eindampfen der Fraktion, um ein Gummi zu erhalten, das biologisch aktive Komponenten besitzt.

a) Zerreiben des Ausgangsmaterials von Blättern, Stielen, Rinden und Wurzeln von Calotropis procera, um ein feines Pulver der Pflanze zu erhalten,
b) Extrahieren des Pulvers aus Schritt a) mit Dichlormethan für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
c) Abgießen des Dichlormethans aus Schritt b) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
d) Extrahieren des Reststoffs aus Schritt c) mit Methanol für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
e) Abgießen des Methanols aus Schritt d) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
f) Unterwerfen des Gummis aus Schritt e) einer Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Dichlormethan-Methanol als Lösungsmittel verwendet wird,
g) Sammeln einer ersten Fraktion, die biologisch aktive Komponenten besitzt,
h) Verwenden der konzentrierten Fraktion aus Schritt g) für eine Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Hexan-Aceton als Lösungsmittel verwendet wird, um zwei Fraktionen zu erhalten, und
i) Waschen der Säule nach Schritt h) mit Methanol, um eine dritte Fraktion zu erhalten, die biologisch aktive Komponenten besitzt.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, die umfasst:

– ein Extrakt von Calotropis procera, wie vorstehend beschrieben wird, und
– mindestens eine therapeutische Verbindung und/oder eine physikalische Behandlung, die relevante, schädliche Nebenwirkungen auf normale Zellen, Gewebe oder Organe, die nicht dem Krebs angehören, ausübt.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Produkt, das enthält:

– ein Extrakt von Calotropis procera, wie vorstehend beschrieben wird, und
– mindestens eine therapeutische Verbindung und/oder eine physikalische Behandlung, die relevante, schädliche Nebenwirkungen auf normale Zellen, Gewebe oder Organe, die nicht dem Krebs angehören, als Kombinationspräparat für die gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verabreichung an einen Patienten ausübt.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei eines der Extrakte mindestens zwei Wirkstoffe umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Asclepin, Calactin, Vorusharin, Calotropin, Calotropagenin, Uzarigenin, Calotoxin, Usharin, Usharidin und 2''-Oxo-Vorusharin umfassen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei einer der Extrakte mindestens eine der Verbindungen umfasst, die in Tabelle 1 dargestellt sind.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei das Gewichtsverhältnis von Extrakt : therapeutischer Verbindung im Bereich 0001 : 1 bis 1000 : 1 liegt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend bechrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, für die Verwendung als ein Medikament.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, für die Verwendung als ein Medikament für die Behandlung von Krebs.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Brustkrebs, Lymphom, Sarkom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom, Dickdarmkrebs, Gliom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Hautkrebs, Knochenkrebs, Eierstockkrebs, Krebs des Zentralnervensystems, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs, hämatologische Krebserkrankungen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, die des weiteren eine oder mehrere zusätzliche therapeutische Verbindungen umfassen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische(n) Verbindung(en) ein Antikrebswirkstoff ist(sind).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Adriamycin, Alkeran, Ara-c, Bleomycin, biCNU (Carmustin), Busulfan, CCNU (Lomustin), Camptothecin, Carboplatin, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cytoxan, Daunorubicin, DTIC (Dacarbazin), 5-FU (Fluoruracil), Fludarabin, Gemcitabin (Gemzar), Herceptin, Hexamethylmelamin, Hydrea, Idarubicin, Ifosfamid, Irinotecan (Camptosar, CPT-11), Leustatin, Methotrexat, Mithramycin, Mitomycin, Mitoxantron, Muphoran, Navelbin, Stickstoff-Lost, Oxaliplatin, Rituxan, STI-571 (Imatinib), Streptozocin, Taxol, Taxotere, Topotecan (Hycamtin), Velban, Vincristin, VP-16 (Etoposid), Xeloda (Capecitabin) oder Zevelin.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Adriamycin, Vincristin, Camptothecin und Oxaliplatin.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische(n) Verbindungen) ein cytotoxischer Antikörper oder ein Fragment davon ist(sind).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische(n) Verbindung(en) ein cytotoxisches Peptid oder ein Fragment davon ist(sind).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben wird, die des weiteren einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, oder ein Produkt, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die Zusammensetzung und/oder die therapeutische(n) Verbindung(en) des weiteren einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst(umfassen).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts von Calotropis procera, wie vorstehend beschrieben wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Linderung der Nebenwirkungen von einem oder von mehreren therapeutischen Verbindungen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts von Calotropis procera, wie vorstehend beschrieben wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Steigerung der Dosis, die einem Individuum von einer oder von mehreren therapeutischen Verbindungen verabreicht wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische(n) Verbindung(en) eine Antikrebsaktivität besitzt(besitzen).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische Verbindung(en) ausgewählt ist(sind) aus der Gruppe umfassend Adriamycin, Alkeran, Ara-c, Bleomycin, biCNU, Busulfan, CCNU, Carboplatin, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cytoxan, Daunorubicin, DTIC, 5-FU, Fludarabin, Gemcitabin (Gemzar), Herceptin, Hexamethylmelamin, Hydrea, Idarubicin, Ifosfamid, Irinotecan (Camptosar, CPT-11), Leustatin, Methotrexat, Mithramycin, Mitomycin, Mitoxantron, Muphoran, Navelbin, Stickstoff-Lost, Oxaliplatin, Rituxan, STI-571, Streptozocin, Taxol, Taxotere, Topotecan (Hycamtin), Velban, Vincristin, VP-16, Xeloda (Capecitabin) oder Zevelin.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische Verbindung(en) ausgewählt ist(sind) aus der Gruppe umfassend Adriamycin, Vincristin, Camptothecin und Oxaliplatin.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische(n) Verbindung(en) ein cytotoxischer Antikörper oder ein Fragment davon ist(sind).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische(n) Verbindung(en) ein cytotoxisches Hormon oder ein Fragment davon ist(sind).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die therapeutische(n) Verbindung(en) ein cytotoxisches Peptid oder ein Fragment davon ist(sind).
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei der Extrakt mindestens zwei Wirkstoffe umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Asclepin, Calactin, Vorusharin, Calotropin, Calotropagenin, Uzarigenin, Calotoxin, Usharin und Usharidin umfassen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei der Extrakt des weiteren mindestens eine der Verbindungen enthält, die in Tabelle 1 dargestellt werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei der Extrakt vor der(den) therapeutischen Verbindung(en) verabreicht wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei der Extrakt nach der(den) therapeutischen Verbindung(en) verabreicht wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei der Extrakt zur gleichen Zeit wie die therapeutische(n) Verbindung(en) verabreicht wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, wobei das Gewichtsverhältnis von Extrakt : therapeutischer Verbindung im Bereich 0,001 : 1 bis 1000 : 1 liegt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extraktionsprozess für das Erhalten eines Extrakts, der biologisch aktive Komponenten besitzt, der die Schritte umfasst:

a) Extrahieren des Ausgangsmaterials von der Calotropis procera-Pflanze, wobei das Ausgangsmaterial ausgewählt ist aus Früchten, oberirdischen Teilen, unterirdischen Teilen und ihren Gemischen in einem aliphatischen Alkohol durch Auflösen des Ausgangsmaterials in dem Alkohol, wobei eine Suspension des Materials in Alkohol erhalten wird, Rühren der Suspension und Filtrieren der Suspension durch eine Glasfritte wobei ein erstes Filtrat und ein erster fester Anteil erhalten werden;
b) Extrahieren des ersten festen Anteils in einem aliphatischen Alkohol, wobei ein zweites Filtrat und ein zweiter fester Anteil erhalten werden; und
c) Vereinigen des ersten und zweiten Filtrats, wobei ein vereinigtes Filtrat erhalten wird; und
d) Eindampfen des vereinigten Filtrats unter Vakuum, wobei der Extrakt erhalten wird.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extraktionsprozess für das Erhalten mehrerer Extrakte, die biologisch aktive Komponenten besitzen, welche im Wesentlichen in den Blättern, Stielen, Rinden und Wurzeln von Calotropis procera vorliegen, der die Schritte umfasst:

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extraktionsprozess, wie vorstehend beschrieben wird, der die Schritte umfasst:

d) Extrahieren des Reststoffs aus Schritt c) mit Methanol für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
e) Abgießen des Methanols aus Schritt d) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
f) Unterwerfen des Gummis aus Schritt e) einer Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Dichlormethan-Methanol als Lösungsmittel verwendet wird, und
g) Sammeln einer ersten Fraktion, die biologisch aktive Komponenten besitzt, und Eindampfen des Eluents, um das Extrakt zu erhalten.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Extraktionsprozess, wie vorstehend beschrieben wird, der die weiteren Schritte umfasst:

h) Verwenden der Fraktion aus Schritt g) für eine Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Hexan-Aceton als Lösungsmittel verwendet wird, um zwei Fraktionen zu erhalten, und
i) Waschen der Säule nach Schritt h) mit Methanol, um eine dritte Fraktion zu erhalten, die biologisch aktive Komponenten besitzt.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei Schritt b) mit einer Arbeitstemperatur zwischen 20 und 80°C durchgeführt wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei Schritt b) zwischen einmal und fünfmal wiederholt wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die Dauer von Schritt b) zwischen 4 Stunden und 48 Stunden beträgt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die feste Phase von Schritt d) ein Kieselsäuregel ist.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei das Eluent aus Schritt d) ein binäres Eluent ist, wobei das Verhältnis zwischen den zwei Verbindungen des Eluents zwischen 100 : 0 und 0 : 100 beträgt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die Komponenten des binären Eluents ein alkoholisches Lösungsmittel und ein nichtpolares Lösungsmittel umfassen.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei Schritt e) bei einer Arbeitstemperatur zwischen 20 und 50°C durchgeführt wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die feste Phase aus Schritt f) ein Kieselsäuregel ist.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei das Eluent aus Schritt f) ein binäres Eluent ist, wobei das Verhältnis zwischen den zwei Verbindungen des Eluents zwischen 100 : 0 und 0 : 100 beträgt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei die Komponenten des binären Eluents ein nichtpolares und ein stärker polares Lösungsmittel sind.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei das Verhältnis zwischen den zwei Komponenten des Eluents nichtpolar : polar zwischen 50 : 50 und 100 : 0 liegt.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei das Lösungsmittel aus Schritt h) Methanol ist.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess, wie vorstehend beschrieben wird, wobei Schritt e) bei einer Arbeitstemperatur zwischen 20 und 50°C durchgeführt wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein aktiver Extrakt, der von dem Prozess isoliert wird, wie vorstehend beschrieben wird.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines aktiven Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, als ein Medikament.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines aktiven Extrakts, wie vorstehend beschrieben wird, zur Herstellung eines Medikaments bei der Behandlung von Krebs.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Brustkrebs, Lymphom, Sarkom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom, Dickdarmkrebs, Gliom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Hautkrebs, Knochenkrebs, Eierstockkrebs, Krebs des Zentralnervensystems, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs, hämatologische Krebserkrankungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren einen Kit gemäß Anspruch 14. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, der einen Container umfasst, in welchem ein Extrakt von Calotropis procera, wie vorstehend beschrieben wird, vorliegt, und einen Container, in welchem eine therapeutische Verbindung vorliegt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Extrakte der Pflanze Calotropis procera. In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung Extrakte der Pflanze Calotropis procera, die eine pharmakologische Aktivität besitzen, insbesondere eine antitumorale Aktivität und/oder eine antitoxische Aktivität. Überraschenderweise vereinigt mindestens einer der Extrakte gemäß der Erfindung eine antitumorale Wirkung mit einer antitoxischen Aktivität.
Gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck "antitumorale Aktivität" die antitumoralen Wirkungen sowohl in vitro als auch in vivo, die von mindestens einem der Extrakte oder der davon isolierten Verbindungen ausgeübt werden. Die antitumoralen Wirkungen schließen im Wesentlichen eine dramatische Verminderung des Zellwachstums und eine pro-apoptotische Wirkung ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Bedeutenderweise zeigen die Extrakte gemäß der Erfindung eine antitumorale Wirkung auf eine große Anzahl von Krebsarten wie z.B. Brustkrebs, Melanom- oder Lymphomkrebserkrankung unter anderen Krebserkrankungen.
Ein anderes Merkmal der Extrakte gemäß der Erfindung umfasst ihre antitoxische Aktivität. Der Ausdruck "antitoxische Aktivität" betrifft die Fähigkeit der Extrakte gemäß der Erfindung oder der isolierten Verbindungen davon, die Wirkungen von therapeutischen Verbindungen oder Behandlungen zu mildern oder umzukehren. Eine "therapeutische Verbindung", wie der Ausdruck hierin verwendet wird, betrifft eine Verbindung, die eine starke schädliche, toxische Wirkung oder Wirkungen auf normale Zellen, Geweben oder Organen, das heißt, die nicht dem Krebs angehören, ausübt. Der Ausdruck therapeutische Verbindung kann daher ebenfalls eine Verbindung, einen Arzneistoff, eine physikalische Behandlung oder ein Medikament einschließen, die verwendet werden, um eine bestimmte Erkrankung zu behandeln, die schädliche toxische Nebenwirkungen ausüben. Solche Nebenwirkungen sind dem Fachmann bekannt und schließen Müdigkeit, Übelkeit, Erbrechen, Schmerzen, Schmerzen im Mund, trockene Haut, empfindliche Haut, das Ausfallen der Haare, verminderte Anzahl der roten und weißen Blutkörperchen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche therapeutischen Verbindungen schließen Mittel der Chemotherapie, Antikörper und Hormone ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Therapeutische Verbindungen, die gemäß der Erfindung nützlich sind, schließen solche ein, die in der Chemotherapie verwendet werden oder die cytotoxisch sind. Sie schließen ein beliebiges von Adriamycin, Alkeran, Ara-c, Bleomycin, biCNU, Busulfan, CCNU, Carboplatin, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cytoxan, Daunorubicin, DTIC, 5-FU, Fludarabin, Gemcitabin (Gemzar), Herceptin, Hexamethylmelamin, Hydrea, Idarubicin, Ifosfamid, Irinotecan (Camptosar, CPT-11), Leustatin, Methotrexat, Mithramycin, Mitomycin, Mitoxantron, Muphoran, Navelbin, Stickstoff-Lost, Oxaliplatin, Rituxan, STI-571, Streptozocin, Taxol, Taxotere, Topotecan (Hycamtin), Velban, Vincristin, VP-16, Xeloda (Capecitabin) oder Zevelin, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es ist ein anderer Aspekt der Erfindung, dass der therapeutische Wirkstoff einen oder mehrere Antikrebsmittel umfasst, die von einem Extrakt der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind. Mögliche Antikrebsverbindungen gemäß der Erfindung sind jede der Verbindungen, die aus Calotropis procera extrahiert sind, wie z.B. Asclepin, Calactin, Vorusharin, Calotropin, Calotropagenin, Uzarigenin, Calotoxin, Usharin und Usharidin.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Antikrebsverbindungen eine beliebige der Verbindungen, die aus Calotropis procera extrahiert sind, wie z.B. 2''-Oxo-Vorusharin und Derivate davon, wie in Tabelle 2 gezeigt werden.
Es ist ein anderer Aspekt der Erfindung, dass ein therapeutischer Wirkstoff ein Extrakt der Erfindung ist. Der Extrakt kann identisch zu einem Extrakt sein, der eine antitoxische Aktivität besitzt. In einer anderen Ausführungsform kann der Extrakt identisch zu einem Extrakt sein, der eine antitoxische Aktivität besitzt, mit der Ausnahme, dass eine oder mehrere zusätzliche aktive Verbindungen in beiden Extrakten vorhanden sind. In einer anderen Ausführungsform kann der Extrakt identisch zu einem Extrakt sein, der eine antitoxische Aktivität besitzt, mit der Ausnahme von einer oder von mehreren zusätzlichen Verbindungen in beiden Extrakten. In einer anderen Ausführungsform kann der Extrakt identisch zu einem Extrakt sein, der eine antitoxische Aktivität besitzt mit der Ausnahme des Unterschieds bei der Konzentration von einer oder von mehreren aktiven Verbindungen in beiden Extrakten.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass die therapeutische Verbindung ein Antikörper oder ein Fragment davon ist. Der Antikörper zeigt eine cytotoxische Aktivität. Beispiele von therapeutischen Antikörpern schließen HerceptinR, Prostascint, Rituximab und Trastuzumab ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, dass die therapeutische Verbindung ein Hormon oder ein Fragment davon ist. Das Hormon zeigt eine cytotoxische Aktivität. Beispiele von therapeutischen Hormonen schließen Buserelin, Fluoxymesteron, Flutamid, Formestan, Norethandrolon, Norethisteron, Prednisolon, Prednison und Tamoxifen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es ist ein anderer Aspekt der Erfindung, dass die therapeutische Verbindung ein Peptid oder ein Fragment davon ist. Das Peptid zeigt eine cytotoxische Aktivität.
Bei einem Fragment mit Bezug auf einen Antikörper, ein Hormon oder ein Peptid ist ein Peptid gemeint, das einen Anteil des Antikörpers, Hormons der Peptids umfasst, der in der Lage ist, das Ziel des gesamten Antikörpers, Hormons oder Peptids zu erkennen. Das Fragment ist ebenfalls in der Lage, das Ziel des gesamten Antikörpers, Hormons oder Peptids zu erkennen. Der Anteil kann Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren umfassen, welche die Erkennung des Ziels durch den Anteil im Wesentlichen nicht verändern. Die Anzahl der Substitutionen, Deletionen oder Insertionen kann weniger als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 oder 500 sein.
Es ist ein anderer Aspekt der Erfindung, dass die antitoxische Aktivität der Extrakte die Verabreichung einer höheren Dosis der therapeutischen Verbindung erlaubt. Durch die Verabreichung einer höheren Dosis der therapeutischen Verbindung, kann der Krebs schneller und effektiver behandelt werden. Ein Individuum, das eine höhere Dosis in Verbindung mit einem Extrakt der Erfindung erhält, würde von den verminderten Nebenwirkungen der therapeutischen Verbindung profitieren.
Es ist ein anderer Aspekt der Erfindung, dass die antitoxische Aktivität der Extrakte, die Verabreichung einer Kombination von therapeutischen Verbindungen erlaubt. Eine Kombinationstherapie würde gleichzeitig auf unterschiedliche Aspekte des Krebs zielen und daher zu einer wirksameren und effizienteren Behandlung führen. Durch die Verabreichung der Kombination gemäß der Erfindung würde der Patient unter geringeren Nebenwirkungen leiden und von der Effizienz der Kombinationstherapie profitieren.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die aktiven Verbindungen, die aus den Extrakten isoliert werden. Der Ausdruck "aktive Verbindungen" oder "aktive Bestandteile" des Extakts werden hierin als Synonyme verwendet und beziehen sich auf die Verbindungen, die in den Extrakten vorliegen, die eine Aktivität ausüben, die ähnlich zu mindestens einer der vorstehend definierten Aktivitäten der Extrakten ist.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erhalt der Extrakte der Pflanze Calotropis procera.
Aufgrund der Tatsache, dass mindestens einer der Extrakte gemäß der Erfindung eine antitumorale Aktivität ausübt, sind die Extrakte gemäß der Erfindung besonders nützlich zur Behandlung von Erkrankungen wie z.B. Krebs. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung daher pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen der vorstehend beschriebenen Extrakte oder mindestens eine aktive Verbindung davon umfasst.
Weil die Extrakte gemäß der Erfindung ebenfalls eine antitoxische Aktivität ausüben, ist es des weiteren besonders geeignet, sie mit anderen therapeutischen Verbindungen wie z.B. anderen therapeutischen Verbindungen zu kombinieren, die toxische Nebenwirkungen zeigen. In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen der vorstehend beschriebenen Extrakte oder mindestens eine aktive Verbindung davon und eine zweite Verbindung, die eine pharmakologische Aktivität ausübt, die toxische Nebenwirkungen besitzt, umfasst.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem der Extrakte und/oder mindesten einer aktiven Verbindung davon als ein Medikament. Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung von einem der Extrakte oder von mindestens einer aktiven Verbindung davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere von Krebs.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die nachfolgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen offensichtlich werden.
FIGUREN
1 beschreibt das allgemeine Wachstum von verschieden Arten von Tumoren als eine Funktion der Konzentration eines Extrakts gemäß der Erfindung.
2 bis 11 zeigen die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung in vitro auf verschieden Arten von menschlichen Krebszelllinien, wobei Brustkrebszelllinien in 2, Sarkomkrebszelllinien in 3, Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien in 4, Melanomkrebszelllinien in 5, Dickdarmkrebszelllinien in 6, Gliomkrebszelllinien in 7, Lungenkrebszelllinien in 8, Blasenkrebszelllinien in 9, Prostatakrebszelllinien in 10 und Kopf- und Nackenkrebszelllinien in 11 gezeigt werden.
12 bis 16 stellen die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung in vitro auf die Zellzykluskinetik von Zellen dar, die den fünf verschiedenen menschlichen Zelllinien HCT-15 (12), RPMI (13), A172 (14), J82 (15) und Hs683 (16) entsprechen. Der obere Teil der Figuren zeigt das allgemeine Zellwachstum als den prozentualen Anteil der lebenden Krebszellen im Vergleich zu den Kontrollzellen bei verschiedenen Dosen des Extrakts. Die mittleren und unteren Teile der Figuren zeigen die Wirkung auf die Zellzykluskinetik des Extrakts bei verschiedenen Konzentrationen nach 24 Stunden oder beziehungsweise 72 Stunden. Die statistische Bedeutung wurde mittels des Student's T-Test evaluiert, wobei * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001 ist.
17 bis 20 stellen die Apoptose-induzierenden und Nekrose-induzierenden Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung in vitro auf Zellen dar, die den vier menschlichen Zelllinien HCT-15 (17), A172 (18), J82 (19) und Hs683 (20) entsprechen. Der obere Teil der Figuren zeigt die Apoptose-induzierenden und Nekrose-induzierenden Wirkungen des Extrakts bei verschiedenen Dosen nach 24 Stunden, der untere Teil der Figuren nach 72 Stunden.
21 stellt die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung auf ein In-vivo-Lymphomkrebsmodell dar. Der Extrakt wurde durch eine intraperitoneale Injektion mit Dosen von 2,5 mg/kg; 5 mg/kg und 10 mg/kg Extrakt in Mäuse mit P388-Lymphomtumor verabreicht. 21A stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Gewicht der Kontrollmäuse (unbehandelt) und bei behandelten Mäusen dar. 21B stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Tumorwachstum in Kontrollmäusen und behandelten Mäusen dar.
22 stellt die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung auf ein In-vivo-Lymphomkrebsmodell dar. Der Extrakt wurde durch eine intraperitoneale Injektion mit Dosen von 0,63 mg/kg; 1,25 mg/kg und 2,5 mg/kg Extrakt in Mäuse mit P388-Lymphomtumor verabreicht. 22A stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Gewicht der Kontrollmäuse (unbehandelt) und bei behandelten Mäusen dar. 22B stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Tumorwachstum in Kontrollmäusen und behandelten Mäusen dar.
23 stellt die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung auf ein In-vivo-Melanomkrebsmodell dar. Der Extrakt wurde durch eine intraperitoneale Injektion mit Dosen von 2,5 mg/kg; 1,25 mg/kg und 0,63 mg/kg Extrakt in Mäuse mit B16-Melanom verabreicht. 23A stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Gewicht der Kontrollmäuse (unbehandelt) und bei behandelten Mäusen dar. 23B stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Tumorwachstum in Kontrollmäusen und behandelten Mäusen dar.
24 stellt die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung auf ein In-vivo-Melanomkrebsmodell dar. Der Extrakt wurde mit Dosen von 0,63 mg/kg; 1,25 mg/kg und 2,5 mg/kg Extrakt in Mäuse mit B16-Melanom verabreicht. 24A stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Gewicht der Kontrollmäuse und bei behandelten Mäusen dar. 24B stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Tumorwachstum in Kontrollmäusen und behandelten Mäusen dar.
25 stellt die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung auf ein In-vivo-Brustkrebsmodell dar. Der Extrakt wurde durch eine intraperitoneale Injektion mit Dosen von 2,5 mg/kg; 5 mg/kg und 10 mg/kg Extrakt in Mäuse mit MXT-HI-Brustkrebs verabreicht. 25A stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Gewicht der Kontrollmäuse (unbehandelt) und bei behandelten Mäusen dar. 25B stellt die Wirkungen des Extrakts auf das Tumorwachstum in Kontrollmäusen und behandelten Mäusen dar.
26 stellt die allgemeine statistische Anpassung für die Mäuse mit MXT-HI-Brustkrebs der Testgruppen (das heißt, eine intraperitoneale Injektion der Mäuse mit Dosen von 2,5 mg/kg; 5 mg/kg und 10 mg/kg Extrakt) und der Kontrollgruppe mit Bezug auf das Überleben (statistische Analyse nach Kaplan-Meier) dar.
27 stellt die Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung mit Dosen von 5 mg/kg und 1,25 mg/kg auf die Menge der weißen Blutkörperchen, der roten Blutkörperchen, des Hämoglobins und der Hämatokritkonzentration am dritten Tag nach der intraperitonealen Injektion in Mäuse im Vergleich zu den Kontrollmäusen dar (in der Figur beträgt die Dosis des "weißen" Extrakts 1,25 mg/kg).
28 bis 35 stellen die antitoxischen Wirkungen der Extrakte gemäß der Erfindung dar, wenn sie mit den antitumoralen Verbindungen Adriamycin oder Vincristin oder Camptothecin oder Oxaliplatin vereinigt werden.
Eigenschaften des EXTRAKTS
Die Calotropis procera-Pflanze, die zu der Familie der Asclepiadaceae gehört, ist eine Pflanze, die in Afrika und Asien wächst. Diese Pflanze wird in der traditionellen Volksmedizin verwendet und wurde mit Bezug auf eine erhebliche Anzahl von Verwendungen wie z.B. als fiebersenkendes Mittel, Antimalariamittel, Mittel gegen Durchfall, schmerzlinderndes Mittel, entzündungshemmendes Mittel für den Magen, die Schleimhaut schützendes Mittel und als ein insektentötendes Mittel, Hustenmittel, antibakterielles Mittel, Mittel zur Wundheilung und als Muskelrelaxans untersucht. Es ist bekannt, dass die Stiele, Blüten und Blätter der Calotropis procera-Pflanze bestimmte Verbindungen enthalten, die als Cardenolide bekannt sind, und sie werden in Therapien für Menschen zur Behandlung einer Herzinsuffizienz verwendet.
Überraschenderweise betrifft die vorliegende Erfindung mindestens ein Extrakt gemäß der Erfindung der Calotropis procera-Pflanze, der eine andere Art der Aktivität zeigt, insbesondere eine "antitumorale Aktivität". Des weiteren wurde gezeigt, dass mindestens ein Extrakt gemäß der Erfindung sowohl in vitro als auch in vivo antitumorale Wirkungen zeigt. Der Extrakt gemäß der Erfindung schließt eine dramatische Verminderung des Zellwachstums ein und zeigt eine pro-apoptotische Wirkung. Diese Eigenschaften werden des weiteren in den Beispielen 3 und 4 dargestellt. Zusätzlich wurde von den Erfindern in vivo gezeigt, dass mindestens einer der Extrakte gemäß der Erfindung hoch aktiv gegen verschiedene Arten von Kreberkrankungen ist. Wie in den Beispielen, die nachfolgend beschrieben werden, gezeigt wird, übt der Extrakt gemäß der Erfindung deutliche antitumorale Wirkungen auf verschiedene Tumormodelle aus, die getestet wurden und die ein weites Feld histologischer Tumorarten einschließlich Brustkrebs, Lymphome, Melanome einschließen. Diese Modelle sind klinisch relevant, weil sie spezifische klinische Stadien von menschlichen Krebserkrankungen nachahmen.
Überraschenderweise ist der Extrakt gemäß der Erfindung hochaktiv bei relativ niedrigen Dosen. Der Extrakt kann eine antitumorale Wirkung bei niedrigen Dosen in dem Bereich von 0,4 bis 2,2 mg/kg und vorzugsweise in dem Bereich von 0,5 bis 2 mg/kg ausüben. Die hohe antitumorale Aktivität bei niedrigen Dosen deutet darauf hin, dass der Extrakt hochaktiv ist. Überraschenderweise zeigt der Extrakt gemäß der Erfindung deutlich höhere antitumorale Wirkungen, wenn er bei chronisch niedrigen Dosen, das heißt 0,6 mg/kg bis 1,25 mg/kg, anstelle von hohen Dosen, das heißt Dosen von 5 mg/kg bis 10 mg/kg überprüft wird, wie ebenfalls deutlich werden wird, wenn die Beispiele gelesen werden, die nachfolgend gegeben werden. Der Index der maximal tolerierten Dosis (MTD) des Extrakts gemäß der Erfindung, der die maximale Menge des Extrakts betrifft, die akut an gesunden Tieren verabreicht werden kann, beträgt 20 mg/kg Extrakt. Dieser Wert deutet darauf hin, dass der Extrakt gemäß der Erfindung ein breites therapeutisches Fenster besitzt.
Der Ausdruck "Toxizität" oder "toxische Wirkungen" betrifft (eine) schädliche Wirkung(en), die eine Verbindung auf gesunde Zellen, Gewebe oder Organe haben kann. Eine andere wichtige Eigenschaft eines Extrakts gemäß der Erfindung schließt seinen niedrigen Toxizitätsspiegel ein. Es wurde gezeigt, dass der Extrakt in vivo keine hämatologischen Veränderungen hervorruft, keinen Gewichtsverlust hervorruft oder geringere Nebenwirkungen auf verschiedene Arten von Organen und Geweben zeigt. Tatsächlich ist der Toxizitätsspiegel des Extrakts gemäß der Erfindung überraschend niedrig. Der Extakt gemäß der Erfindung vereinigt die essentiellen Merkmale einer guten antitumoralen Aktivität, einem niedrigen Spiegel der Toxizität und einer minimalen Induktion von schädlichen Nebenwirkungen.
Des weiteren zeigen die Extrakte der Pflanze Calotropis procera gemäß der Erfindung ebenfalls eine "antitoxische Aktivität". Wie vorstehend erwähnt wurde, betrifft der Ausdruck "antitoxische Aktivität", wie er hierin verwendet wird, die Fähigkeit der Extrakte gemäß der Erfindung die schädlichen Nebenwirkungen von Verbindungen zu mildern oder umzukehren. Überraschenderweise haben die Erfinder gezeigt, dass die Kombination eines Extrakts gemäß der Erfindung mit anderen therapeutischen Verbindungen, die schädliche Nebenwirkungen besitzen, ermöglicht, die unerwünschten Nebenwirkungen der therapeutischen Verbindung zu vermindern. Zum Beispiel stellt Beispiel 8 die Kombination eines Extrakts gemäß der Erfindung mit gut bekannten Antikrebsmitteln wie z.B. Vincristin oder Adriamycin, Camptothecin oder Oxaliplatin dar, welche die Reduktion einiger Nebenwirkungen ermöglicht, die durch die Toxizität gegenüber normalen Zellen hervorgerufen wird, die durch diese Antikrebsverbindungen hervorgerufen werden.
Die antitoxische Aktivität ist offensichtlich, wenn mindestens einer der Extrakte gemäß der Erfindung vor der therapeutischen Verbindung verabreicht wird, das heißt, sie werden nacheinander verabreicht. Es ist ein Aspekt der Erfindung, ein Extrakt zu einem Zeitpunkt zu verabreichen, bevor die therapeutische Verbindung verabreicht wird. Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Extrakt nicht früher als 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1 oder 0,5 Stunden zu verabreichen, bevor die therapeutische Verbindung verabreicht wird.
Die antitoxische Aktivität wird ebenfalls offensichtlich, wenn mindestens einer der Extrakte gemäß der Erfindung zum gleichen Zeitpunkt wie die therapeutische Verbindung verabreicht wird, das heißt, als eine Zusammensetzung, durch gleichzeitige oder durch getrennte Verabreichungen.
Die antitoxische Wirkung wird ebenfalls offensichtlich, wenn mindestens einer der Extrakte gemäß der Erfindung nach der therapeutischen Verbindung verabreicht wird, das heißt, sie werden nacheinander verabreicht. Es ist ein Aspekt der Erfindung, ein Extrakt zu einem Zeitpunkt zu verabreichen, nachdem die therapeutische Verbindung verabreicht wird. Es ist ein weitere Aspekt der Erfindung den Extrakt nicht länger als 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312 oder 366 Stunden zu verabreichen, nachdem die therapeutische Verbindung verabreicht wurde.
Bei der sequentiellen Verabreichung können die Extrakte einmal verabreicht werden oder in jeder beliebigen Anzahl in verschiedenen Dosen vor und/oder nach der Verabreichung der therapeutischen Verbindung. Die sequentielle Verabreichung kann mit einer gleichzeitigen oder sequenziellen Verabreichung kombiniert werden.
Zusammensetzung des Extrakts
Die Extrakte gemäß der Erfindung umfassen eine oder mehrere aktive Verbindungen, das heißt Verbindungen, die eine Aktivität zeigen, die ähnlich zu mindestens einer der vorstehend definierten Aktivitäten eines Extrakts gemäß der Erfindung ist. Die Hauptaktivitäten von mindestens einem der Extrakte sind eine antitumorale Aktivität und eine antitoxische Aktivität. Wie es vom Fachmann verstanden werden wird, kann eine aktive Verbindung, die in den Extrakten vorliegt, nur eine dieser Eigenschaften ausüben oder sogar beide dieser Eigenschaften ausüben.
In einer anderen Ausführungsform umfasst mindestens einer der Extrakte gemäß der Erfindung mindestens zwei der aktiven Verbindungen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Asclepin, Calactin, Vorusharin, Calotropin, Calotropagenin, Uzarigenin, Calotoxin, Usharin, Usharidin und 2''-Oxo-Vorusharin umfassen.
Es wird selbstverständlich sein, dass die Extrakte gemäß der Erfindung des weiteren eine oder mehrere aktive Verbindungen enthalten können, die nicht zu der Gruppe der Cardenoliden gehören, und andere Verbindungen. In einer anderen Ausführungsform enthalten die Extakte mindestens eine der Verbindungen, die in Tabelle 1 dargestellt werden.
TABELLE 1 Einige der Verbindungen, die in mindestens einem der Extrakte gemäß der Erfindung enthalten sind.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegenden Erfindung eine aktive Verbindung, die aus den Extrakten gemäß der Erfindung isoliert wurde.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist eine aktive Verbindung des Extrakts 2''-Oxo-Vorusharin. Ein Aspekt der Erfindung ist eine antitumorale und/oder antitoxische Aktivität der Verbindung (Verbindung A) und der Derivate (Verbindungen B bis H) davon, wie in Tabelle 2 gezeigt wird.
TABELLE 2 Die chemische Struktur von 2''-Oxo-Vorusharin (Verbindung A) und von Derivaten davon (Verbindungen B bis H).

* bedeutet eine Doppelbindung zwischen dem N-Atom und dem C-Kohlenstoffatom des N-enthaltenen heterozyklischen Rings von Formel 1.

Verfahren der Extraktion
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann ein Extrakt gemäß der Erfindung durch eine alkoholische Extraktion, insbesondere durch eine Methanolextraktion, erhalten werden.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalten eines Extrakts gemäß der Erfindung, das die Schritte umfasst:

a) Extrahieren des Ausgangsmaterials von der Calotropis procera-Pflanze, wobei das Ausgangsmaterial ausgewählt ist aus Früchten, oberirdischen Teilen, unterirdischen Teilen und ihren Gemischen in einem aliphatischen Alkohol durch Auflösen des Ausgangsmaterials in dem Alkohol, wobei eine Suspension des Materials in Alkohol erhalten wird, Rühren der Suspension und Filtrieren der Suspension durch eine Glasfritte wobei ein erstes Filtrat und ein erster fester Anteil erhalten werden;
b) Extrahieren des ersten festen Anteils in einem aliphatischen Alkohol, wobei ein zweites Filtrat und ein zweiter fester Anteil erhalten werden;
c) Vereinigen des ersten und zweiten Filtrats, wobei ein vereinigtes Filtrat erhalten wird; und
d) Eindampfen des vereinigten Filtrats unter Vakuum, wobei ein öliger Reststoff erhalten wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ausgangsmaterial der Calotropis procera-Pflanze von den unterirdischen Teilen, insbesondere von den Wurzeln, ausgewählt.
In einer anderen Ausführungsform ist der aliphatische Alkohol, der verwendet wird, um das Ausgangsmaterial gemäß der Erfindung zu extrahieren, Methanol. In einer noch anderen Ausführungsform wird der Reststoff, der durch den Extraktionsprozess erhalten wird, in einem Lösungsmittel aufgenommen, insbesondere in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalt von Extrakten gemäß der Erfindung, das die Schritte umfasst:

a) Zerreiben des Ausgangsmaterials von Blättern, Stielen, Rinden und Wurzeln von Calotropis procera, um ein feines Pulver der Pflanze zu erhalten,
b) Extrahieren des Pulvers aus Schritt a) mit Dichlormethan für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
c) Abgießen des Dichlormethans aus Schritt b) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
d) Extrahieren des Reststoffs aus Schritt c) mit Methanol für mindestens 6, 12, 18 oder vorzugsweise 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
e) Abgießen des Methanols aus Schritt d) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
f) Unterwerfen des Gummis aus Schritt e) einer Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Dichlormethan-Methanol als Lösungsmittel verwendet wird,
g) Sammeln einer ersten Fraktion,
h) Unterwerfen der konzentrierten Fraktion aus Schritt g) einer Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Hexan-Aceton als Lösungsmittel verwendet wird, um zwei Fraktionen zu erhalten,
i) Waschen der Säule nach Schritt h) mit Methanol, um eine dritte Fraktion zu erhalten.

Die Extrakte gemäß der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die aus Schritt c), Schritt g) und Schritt i) erhalten werden.
Es ist ein Aspekt der Erfindung, dass die Extraktionen in einer Weise durchgeführt werden, die mit dem Bewahren der Integrität der biologisch aktiven Verbindungen vereinbar ist, die in dem Extrakt enthalten sind. Solche Vorsichtsmaßnahmen sind dem Fachmann bekannt.
Anwendbarkeit der Extrakte
Aufgrund der interessanten Eigenschaften von mindestens einem der Extrakte, die hierin offenbart werden, insbesondere ihrer antitumoralen Aktivität, ihrer antitoxischen Aktivität, ihrer geringen Menge an Toxizität und/oder ihrer hohen Aktivität bei niedrigen Dosen, sind der/die Extrakt(e) gemäß der Erfindung oder die aktiven Verbindungen davon besonders geeignet zur Verwendung als ein Medikament zur Behandlung von Erkrankungen und insbesondere zur Behandlung von Krebs.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Extrakts gemäß der Erfindung oder einer aktiven Verbindung davon als ein Medikament.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung von mindestens einem Extrakt gemäß der Erfindung oder einer aktiven Verbindung davon für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs. Insbesondere wird der Extrakt gemäß der Erfindung oder eine aktive Verbindung davon für die Herstellung eines Medikaments bei der Behandlung von Krebs verwendet. Beispiele von Krebserkrankungen, die gemäß der Erfindung behandelt werden können, schließen Brustkrebs, Lymphom, Sarkom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom, Dickdarmkrebs, Gliom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Hautkrebs, Knochenkrebs, Eierstockkrebs, Krebs des Zentralnervensystems, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs und hämatologische Krebserkrankungen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Wie vorstehend erwähnt wurde, umfassen die Extrakte gemäß der Erfindung ebenfalls eine antitoxische Aktivität. Die Erfinder haben gezeigt, dass eine Kombination eines Extrakts gemäß der Erfindung oder von aktiven Verbindungen davon mit einer zweiten Verbindung, die wichtige schädliche Nebenwirkungen besitzt, eine Verminderung der toxischen Aktivität dieser zweiten Verbindung ermöglicht, ohne ihre therapeutische Aktivität zu vermindern. Daher können die Calotropis procera-Extrakte gemäß der Erfindung in einem Medikament mit anderen Verbindungen vereint werden, insbesondere mit anderen Antikrebsverbindungen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die den Extrakt umfassen In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Extrakts von Calotropis procera gemäß der Erfindung oder eine aktive Verbindung davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs umfassend

– eine therapeutisch wirksame Menge eines Extrakts von Calotropis procera gemäß der Erfindung oder eine aktive Verbindung davon,
– eine therapeutisch wirksame Menge einer therapeutischen Verbindung und
– ein pharmazeutisch verträglicher Träger.

Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", wie er hierin verwendet wird, bedeutet die Menge von mindestens einem Extrakt oder von einer aktiven Verbindung oder von einem pharmazeutischen Wirkstoff, welcher/welche die biologische oder medizinische Antwort in einem Gewebe, einem System, einem Tier oder einem Menschen ausübt, die von einem Forscher, Tierarzt, Arzt oder einem anderen Kliniker erstrebt wird, der/die eine Linderung der Symptome der Erkrankung die behandelt wird, einschließt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer Weise hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt ist. Für diesen Zweck werden ein Extrakt gemäß der Erfindung und/oder eine aktive Verbindung davon, ein oder mehrere feste oder flüssige pharmazeutische Träger und, falls erwünscht, in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen in eine geeignete Verabreichungsform oder Dosisform gebracht, die anschließend als ein Arzneimittel in der Humanmedizin oder der Veterinärmedizin verwendet werden kann.
Bestimmte Formen der pharmazeutischen Zusammensetzung können zum Beispiel Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Tabletten, Kapseln, Nasensprays, Liposome oder Mikroreservoirs, insbesondere Zusammensetzungen in einer oral verdaubaren oder steril injizierbaren Form, zum Beispiel als steril injizierbare wässrige oder ölhaltige Suspensionen oder Zäpfchen sein. Die bevorzugte Form der Zusammensetzung, die in Betracht gezogen wird, ist die trockene feste Form, welche Kapseln, Granulate, Tabletten, Pillen, Bolusinjektionen und Pulver einschließt. Der feste Träger kann einen oder mehrere Träger wie z.B. Lactose, Füllstoffe, Zerfallsmittel, Bindemittel wie z.B. Cellulose, Carboxymethylcellulose oder Stärke oder Antiklebemittel wie z.B. Magnesiumstearat umfassen, um die Tabletten davor zu bewahren, an der Tablettenverpackung zu haften. Tabletten, Pillen und Bolusinjektionen können so gebildet werden, dass sie sich schnell auflösen oder dass sie ein langsames Austreten des aktiven Bestandteils zeigen.
Aufgrund ihrer antitoxischen Aktivität sind die Extrakte gemäß der Erfindung oder die aktiven Verbindungen davon des weiteren besonders geeignet, um mit anderen therapeutischen Verbindungen kombiniert zu werden, die eine pharmakologische Aktivität ausüben, die toxische Nebenwirkungen besitzt, wie zum Beispiel mit anderen Medikamenten, die toxische Nebenwirkungen zeigen.
Die "therapeutische Verbindung, die eine pharmakologische Aktivität ausübt, die toxische Nebenwirkungen besitzt" kann jede Verbindung einschließen, die zur Behandlung von jeder Erkrankung verwendet wird, die aber ungewollte toxische Wirkungen induziert. Vorzugsweise sind solche Verbindungen Verbindungen, die bei der Behandlung von Krebs verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Extrakt gemäß der Erfindung oder aktive Verbindungen davon mit einer oder mit mehr als einer anderen Verbindung kombiniert werden, die eine antitumorale Wirkung besitzt. Da zwei oder mehrere Verbindungen, die eine antitumorale Wirkung besitzen, kombiniert werden, kann eine verbesserte antitumorale Aktivität erhalten werden. Zusätzlich ermöglichen solche Kombinationen, eine Verminderung der toxischen Nebenwirkungen, die durch eine oder durch mehrere der antitumoralen Verbindungen induziert werden.
Eine Kombination eines Extrakts gemäß der Erfindung oder von aktiven Verbindungen davon mit einer anderen therapeutischen Verbindung kann eine getrennte Verwendung des Extrakts oder der aktiven Verbindung davon und der anderen therapeutischen Verbindung einschließen. Insbesondere kann die Kombination die Verwendung eines Extrakts gemäß der Erfindung oder von aktiven Verbindungen davon vor (Vorbehandlung), zum gleichen Zeitpunkt oder nach (Nachbehandlung) der Verwendung der anderen therapeutischen Verbindung einschließen.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Kombination eines Extrakts oder von aktiven Verbindungen davon mit einer anderen therapeutischen Verbindung ein Gemisch von beiden Elementen einschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine erste Komponente umfasst, wobei die erste Komponente der vorstehend beschriebene Extrakt oder mindestens eine aktive Verbindung davon ist, und eine zweite Komponente, wobei die zweite Komponente eine therapeutische Verbindung umfasst, die eine pharmakologische Aktivität ausübt, die toxische Nebenwirkungen besitzt.
Produkt
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Produkt, das ein Extrakt von Calotropis procera und einer therapeutischen Verbindung für eine gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verabreichung an einem Patienten enthält. Es ist ein Aspekt der Erfindung, dass das Produkt gemäß der Erfindung verwendet werden kann.
Eine gleichzeitige Verabreichung bedeutet, dass die zwei Komponenten einem Patienten zum selben Zeitpunkt verabreicht werden. Zum Beispiel als ein Gemisch der zwei Komponenten. Beispiele schließen eine Lösung, die intravenös verabreicht wird, eine Tablette, Flüssigkeit, äußerliche Creme, etc. ein, sind aber nicht darauf beschränkt, wobei jede Herstellung beide Komponenten umfasst.
Eine getrennte Verabreichung bedeutet, dass die zwei Komponenten einem Patienten zur gleichen Zeit oder im Wesentlichen zur gleichen Zeit verabreicht werden, dass aber die Komponenten in dem Produkt als getrennte, nicht gemischte Präparate vorliegen. Die zwei Komponenten können zum Beispiel in dem Produkt als individuelle Tabletten vorliegen. Die Tabletten können dem Patienten durch das Schlucken der beiden Tabletten zum gleichen Zeitpunkt oder von einer Tablette, direkt gefolgt von der anderen verabreicht werden.
Eine sequentielle Verabreichung bedeutet, dass die zwei Komponenten einem Patienten nacheinander verabreicht werden und dass die Komponenten in dem Produkt als getrennte, nicht gemischte Präparate vorliegen. Es besteht ein Zeitintervall zwischen den Dosen. Eine Komponente kann zum Beispiel 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1 oder 0,5 Stunden nach der anderen Komponente verabreicht werden.
Bei der sequentiellen Verabreichung kann der Extrakt einmal oder beliebig häufig und in verschiedenen Dosen vor und/oder nach der Verabreichung der therapeutischen Verbindung verabreicht werden. Die sequentielle Verabreichung kann mit einer gleichzeitigen oder einer sequentiellen Verabreichung kombiniert werden.
Kit
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, der einen Container, in dem ein Extrakt von Calotropis procera vorliegt, und einen Container, in dem eine therapeutische Verbindung vorliegt, umfasst. Ein Extrakt gemäß der Erfindung und eine therapeutische Verbindung gemäß der Erfindung werden vorstehend beschrieben.
Durch die Erwähnung eines Kits, der einen Container, in dem ein Extrakt von Calotropis procera vorliegt, und einen Container, in dem eine therapeutische Verbindung vorliegt, umfasst, sollte es selbstverständlich sein, dass der Kit eine einzelne Dosis oder eine Vielzahl von Dosen enthalten kann, die in den zwei Containern wiedergespiegelt sind, wobei die zwei einzelnen Container in der Lage sind, eine Vielzahl von Dosen oder eine Vielzahl von einzelnen Containern zu enthalten, die in der Lage sind, eine einzelne Dosis zu enthalten. Es sollte selbstverständlich sein, dass der Kit mehr als eine therapeutische Verbindung umfassen kann, wobei jede therapeutische Verbindung in einem getrennten Container oder ein Gemisch von therapeutischen Verbindungen in einem einzelnen Container vorliegen kann.
Die Container können beliebige Container sein, die auf dem Fachgebiet der Medizin bekannt sind. Sie können Ampullen, Blisterpackungen, Injektionsspritzen, wiederverschließbare Flaschen, Flaschen mit Spender, Aspiratoren, Tropfflaschen, Pflaster, Applikatoren, Zäpfchen sein.
Die getrennten Container ermöglichen, dass der Extrakt und die therapeutische Verbindung gleichzeitig, getrennt oder sequentiell verabreicht werden können.
Verwendungen
Aufgrund der günstigen antitumoralen Eigenschaften von mindestens einem der Extrakte gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Extrakte besonders nützlich bei der Behandlung von Individuen, die an einer Krebserkrankung leiden. Aufgrund seines geringen Werts der Toxizität und seiner minimalen Nebenwirkungen wird die Verwendung von einem der Extrakte in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs minimale Nebenwirkungen einschließen. Als eine Folge davon kann der Extrakt gemäß der Erfindung über einen längeren Zeitraum während der Behandlung der Krebserkrankung verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung insbesondere die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Brustkrebs, Lymphom, Sarkom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom, Dickdarmkrebs, Gliom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Hautkrebs, Knochenkrebs, Eierstockkrebs, Krebs des Zentralnervensystems, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs und hämatologische Krebserkrankungen, aber nicht darauf beschränkt ist.
Für diese Zwecke kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung oral, parenteral, das heißt einschließlich subkutaner Injektionen, intravenöser, intramuskulärer, intrasternaler Injektions- oder Infusionstechniken, durch Inhalationsspray oder rektal in Dosis-Einheitsformulierungen verabreicht werden, die konventionelle, nicht toxische, pharmazeutisch verträgliche Träger, Hilfssubstanzen und Vehikel enthalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die pharmazeutische Zusammensetzung getrennt an verschiedenen Zeitpunkten während der Therapie oder gleichzeitig in geteilten oder einzelnen Formen verabreicht werden. Es sollte daher selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung alle Schemata der gleichzeitigen oder abwechselnden Behandlung umspannt und dass der Ausdruck "Verabreichung" dementsprechend interpretiert werden muss.
Im Wesentlichen umfassen die primären Formen der Behandlung von soliden Tumorkrebserkrankungen die chirurgische Entfernung, die Strahlungstherapie und Chemotherapie, getrennt und in Kombination. Die Extrakte gemäß der Erfindung sind für die Verwendung in Kombination mit diesen medizinischen Techniken geeignet. Die Extrakte gemäß der Erfindung können bei der Erhöhung der Sensitivität der Tumorzellen auf die Bestrahlung und ebenfalls bei der Potenzierung oder der Verstärkung des Schadens gegen die Tumore durch die chemotherapeutischen Wirkstoffe nützlich sein. Die Extrakte gemäß der Erfindung können ebenfalls für die Sensibilisierung von multiresistenten Tumorzellen nützlich sein. Die Extrakte gemäß der Erfindung sind nützliche therapeutische Verbindungen zur Verabreichung in Verbindung mit anderen DNA-schädigenden therapeutischen Verbindungen, um deren Wirkung zu potenzieren.
Es wird selbstverständlich sein, dass die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung Menschen in spezifischen Dosismengen und mit einer spezifischen Frequenz der Dosen, die von einer Vielfalt von Faktoren einschließlich dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährungsgewohnheiten, Art und Zeitpunkt der Verabreichung, Ausscheidungsrate, Kombination der Arzneimittel, die Schwere der besonderen Kondition des Patienten, welcher der Therapie ausgesetzt ist, verabreicht werden können.
Die nachfolgenden Beispiele sollten die vorliegende Erfindung veranschaulichen. Diese Beispiele sollen nicht den Umfang der Erfindung einschränken. Ein erstes Beispiel stellt die Extraktion der Extrakte gemäß der Erfindung von der Pflanze Calotropis procera dar. Die Beispiele 2 bis 4 betreffen die In-vitro-Charakterisierung der antitumoralen Eigenschaften eines Extrakts gemäß der Erfindung. Die Beispiele 5 bis 7 beschreiben die In-vivo-Charakterisierung der antitumoralen Eigenschaften eines Extrakts gemäß der Erfindung. Beispiel 8 stellt die antitoxischen Wirkungen der Extrakte gemäß der Erfindung dar.
BEISPIELE
Beispiel Extraktionsprozess gemäß der Erfindung von der Pflanze Calotropis procera
Ein Extrakt (Extrakt A) gemäß der Erfindung wurde aus den Wurzeln der Calotropis procera-Pflanze (Familie der Asclepiadiaceae) durch Methanol extrahiert. Der Extrakt wird des weiteren als Extrakt A (anpassen) bezeichnet. Etwa 10 Gramm der Pflanze wurden in einen Erlenmeyer mit 150 ml Methanol gegeben. Die Suspension wurde magnetisch für 12 Stunden geschüttelt und anschließend auf einer Glasfritte gefiltert. Der zurückbleibende Feststoff wurde ein zweites Mal durch Methanol für 2 Stunden extrahiert. Beide Filtrate wurde vereint und unter Vakuum unter Verwendung eines Rotavapors eingedampft. Der Reststoff, der durch die Methanolextraktion gebildet wird, wird nachfolgend als Extrakt A bezeichnet.
Die Analyse von Extrakt A zeigte das Vorhandensein von verschiedenen Arten von Verbindungen an. Eine besondere Gruppe von Verbindungen, die in dem Extrakt A identifiziert wurde, umfasst Cardenolide wie z.B. Asclepin, Calactin, Vorusharin, Calotropin, Calotropagenin, Uzarigenin, Calotoxin, Usharin und Usharidin. Zusätzlich umfassen andere Verbindungen, die in Extrakt A vorliegen, 3-O-ACETYL-CALOTROPIN, ALPHA-AMYRIN, ALPHA-AMYRIN-BENZOAT, ALPHA- CALOTROPEOL, ALPHA-LACTUCEROL, ALPHA-LACTUCERYL-ACETAT, ALPHA-LACTUCERYL-ISOVALERAT, ARABINOSE, BENZOYLISOLINEOLON, BENZOYLLINEOLON, BETA-AMYRIN, BETA-AMYRIN-BENZOAT, BETA-CALOTROPEOL, BETA-SITOSTEROL, KAUTSCHUK, COROGLAUCOGENIN, COROTOXIGENIN, D-GLUCOSAMIN, FRUGOSID, GIGANTEOL, GIGANTIN, GLUCOSE, HISTAMIN, ISOGIGANTEOL, ISOLACTUCEROL, ISOLINEOLON, LAURAN, LINEOLON, LINOLSÄURE, LINOLENSÄURE, MELISSYL-ALKOHOL, MUDARIN, ÖLSÄURE, PALMITINSÄURE, PROCEROSID, PSEUDOCALOTROPAGENIN, RHAMNOSE, STIGMASTEROL, SYRIOGENIN, TARAXASTEROL, TARAXASTEROL-BENZOAT und TRYPSIN, sind aber nicht darauf beschränkt.
Andere Extrakte gemäß der Erfindung, die durch Methanol extrahiert wurden, umfassen die Schritte:

a) Zerreiben des Ausgangsmaterials von Blättern, Stielen, Rinden und Wurzeln von Calotropis procera, um ein feines Pulver der Pflanze zu erhalten,
b) Extrahieren des Pulvers aus Schritt a) mit Dichlormethan für 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
c) Abgießen des Dichlormethans aus Schritt b) und Eindampfen des Filtrats nach der Filtration, um ein Gummi zu erhalten,
d) Extrahieren des Reststoffs aus Schritt c) mit Methanol für 24 Stunden, wobei ein Soxhlet-Extraktor verwendet wird,
e) Abgießen des Methanols aus Schritt d) und Eindampfen des Filtrats (nach der Filtration), um ein Gummi zu erzeugen,
f) Verwenden des Gummis aus Schritt e) für eine Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Dichlormethan-Methanol als Lösungsmittel verwendet wird,
g) Sammeln einer ersten Fraktion,
h) Verwenden der konzentrierten Fraktion aus Schritt g) für eine Säulenchromatographie, wobei ein Flash-Kieselsäuregel und Hexan-Aceton als Lösungsmittel verwendet wird, um zwei Fraktionen zu erhalten,
i) Waschen der Säule nach Schritt h) mit Methanol, um eine dritte Fraktion zu erhalten.

Der Extrakt, der als Schritt c) isoliert wird, wird nachfolgend als Extrakt B bezeichnet. Der Extrakt, der als Schritt g) isoliert wird, wird nachfolgend als Extrakt C bezeichnet. Der Extrakt, der als Schritt i) isoliert wird, wird nachfolgend als Extrakt D bezeichnet.
Beispiel 2 Wirkung eines Extrakts gemäß der Erfindung auf das allgemeine Zellwachstum einer Zelllinie
Dieses Beispiel stellt die antitumoralen Aktivitäten des Extrakts A gemäß der Erfindung auf verschieden Arten von Krebs dar.
Um die Aktivitäten von Extrakt A in vitro zu charakterisieren, wurden MTT-Tests durchgeführt. Der MTT-Test, der auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, ist eine indirekte Technik, welche die Wirkung eines Produkts auf das allgemeine Wachstum einer Zelllinie schnell, das heißt innerhalb von 5 Tagen, misst. Dieser Test misst die Anzahl der metabolisch aktiven, lebenden Zellen, die in der Lage sind, das MTT-Produkt (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), das eine gelbliche Farbe besitzt, zu dem blauen Produkt Formazan durch eine durch Mitochondrien vermittelte Reduktion umzuwandeln, die nur von lebenden Zellen durchgeführt wird. Die Menge an Formazan, die am Ende des Experiments erhalten wird, wird mittels eines Spektrophotometers gemessen und ist direkt proportional zu der Anzahl der lebenden Zellen.
Achtundvierzig menschliche Krebszelllinien, die in Tabelle 2 beschrieben werden, wurden in der Gegenwart von Extrakt A getestet. Diese Zelllinien umfassen zehn histologische Arten, wobei es sich um Bauchspeicheldrüsenkrebs, Sarkom, Brustkrebs, Melanom, Dickdarmkrebs, Gliom, Lungenkrebs, Blasenkrebs, Prostatakrebs, Kopf- und Nackenkrebs handelt. Man ließ die Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden mit 100 μl Zellsuspension pro Vertiefung und zwischen 3000 und 5000 Zellen/Vertiefung in Abhängigkeit vom Zelltyp wachsen. Jede Zelllinie wurde in ihr eigenes Zellkulturmedium ausgesät, wie in Tabelle 2 angezeigt wird. TABELLE 2 Menschliche Krebszelllinien und das entsprechende Zellkulturmedium, das für die MTT-Experimente verwendet wurde.

wobei AA "Aminosäuren" bedeutet.
Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C wurde das Kulturmedium durch 100 μl frisches Medium, in dem der Extrakt A in verschiedenen Konzentrationen von 0,01 μg/ml, 0,05 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml und 100 μg/ml aufgelöst war, ausgetauscht. Jede experimentelle Bedingung wurde in sechsfacher Ausfertigung durchgeführt.
Nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden bei 37°C mit dem Arzneimittel, das heißt unter experimentellen Bedingungen, oder ohne dem Arzneimittel, das heißt als Kontrolle, wurde das Medium durch 100 μl MTT mit einer Konzentration von 1 mg/ml, das in RPMI aufgelöst wurde, ausgetauscht. Die Mikrovertiefungen wurden anschließend für 3 Stunden bei 37°C inkubiert und bei 400 g für 10 Minuten zentrifugiert. Das MTT wurde entfernt und die gebildeten Formazankristalle wurden in 100 μl DMSO aufgelöst. Die Mikrovertiefungen wurden für 5 Minuten geschüttelt und in einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 570 nm, welches der Wellenlänge mit der maximalen Absorption für Formazan entspricht, und von 630 nm, welches der Wellenlänge für das Hintergrundrauschen entspricht, gelesen.
Für jede experimentelle Bedingung wurde die mittlere OD zusammen mit dem Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für jede Bedingung, das heißt für 6 Vertiefungen, berechnet. Der prozentuale Anteil der verbleibenden lebenden Zellen wurde im Vergleich mit der Kontrolle berechnet. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den 1 bis 11 dargestellt.
1 stellt die allgemeinen Ergebnisse für die 10 histologischen Typen dar. Wie gezeigt wird, übte Extrakt A eine antitumorale Wirkung auf alle histologischen Typen, die getestet wurden, aus. Die menschlichen Tumorzelllinien, die von der Blase stammten, zeigten eine Sensitivität gegenüber dem Extrakt A, die geringer war als die übrigen neuen histologischen Typen. Die Konzentration, bei welcher der Pflanzenextrakt 50% der Zellpopulation tötete, der so genannte IC₅₀-Wert, wurde bestimmt. Der IC₅₀-Wert umfasste zwischen 0,5 μg/ml und 1 μg/ml für die Zelllinien, die von der Brust stammten, und für die Pankreaszelllinien. Eine wichtigere antitumorale Wirkung mit einem IC₅₀-Wert von 0,5 – 0,1 μg/ml wurde für Sarkom-, Melanom-, Gliom-, Lungen-, Kopf- und Nacken- und Dickdarmkrebszelllinien erhalten. Die Prostatakrebszellen PC3 zeigten eine deutliche Sensitivität mit einem IC₅₀-Wert in einem Bereich von 0,01 bis 0,05 μg/ml.
Wie in 1 dargestellt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 5 Brustkrebszelllinien in einem Bereich von 0,5 und 1 μg/ml. Das allgemeine Wachstum der 5 individuellen Brustkrebszelllinien, T-47D, MDA-MB-231, ZR-75-1, MCF-7, Hs578T, wird des weiteren in 2 dargestellt. Die Zelllinien T-47D, MDA-MB-231, ZR-75-1 und Hs578T zeigten eine ähnliche Sensitivität gegenüber dem Extrakt A, während das allgemeine Wachstum der MCF-7-Zellen schneller als bei den übrigen vier Brustkrebsmodelle vermindert wurde.
Wie in 1 gezeigt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 7 Sarkomzelllinien (vergl. Tabelle 2) in einem Bereich von 0,5 und 0,1 μg/ml. Das allgemeine Wachstum der individuellen Zelllinien wird des weiteren in 3 dargestellt. Der Extrakt A induzierte die wichtigste antitumorale Wirkung bei der Zelllinie A204. Der IC₅₀-Wert schien tatsächlich zwischen 0,1 und 0,05 μg/ml zu liegen. Die Hs729-Zelllinie stellte sich als die am wenigsten sensitive der 7 Sarkomzelllinien dar. Trotzdem zeigte sie IC₅₀-Werte für Extrakt A in einem Bereich von 1 und 5 μg/ml.
Wie in 1 gezeigt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 7 Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien (vergl. Tabelle 2) in einem Bereich von 0,5 und 0,1 μg/ml. Ein ähnliches, allgemeines Wachstum wurde für 6 der 7 Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinien beobachtet (4). Von diesen 7 Zelllinien schien Panc-1 am stärksten und Hs766T am wenigsten sensitiv gegenüber dem Extrakt A zu sein. Die IC₅₀-Werte für diese zwei Linien lagen in einem Bereich von 0,1 und 0,5 μg/ml oder beziehungsweise zwischen 1 und 5 mg/ml.
Wie in 1 gezeigt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 5 Melanomkrebszelllinien (vergl. Tabelle 2) in einem Bereich von 0,5 und 0,1 μg/ml. Der Extrakt gemäß der Erfindung verminderte das allgemeine Wachstum von allen Melanomzelllinien um mehr als 60% bei Konzentrationen, die gleich oder höher als 5 μg/ml waren (5). Malme-3M und G-361 waren die am stärksten sensitiven von den 5 Melanomzelllinien. Sie zeigten ein ähnliches allgemeines Wachstum mit einem IC₅₀-Wert, der in einem Bereich von 0,1 und 0,5 μg/ml lag.
Wie in 1 gezeigt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 7 Dickdarmkrebszelllinien (vergl. Tabelle 2) in einem Bereich von 0,5 und 0,1 μg/ml. Von den unterschiedlichen Dickdarmkrebszelllinien, die getestet wurden (6) besaß die Linie LoVo einen IC₅₀-Wert von etwa 0,1 μg/ml und wurde als die am stärksten sensitive Dickdarmlinie angesehen. Die Tumorzelllinie SW 948 mit einem IC₅₀-Wert in einem Bereich von 0,5 und 1 μg/ml wurde als die am wenigsten sensitive angesehen.
Wie in 1 dargestellt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 7 menschlichen Gliomzelllinien (vergl. Tabelle 2) in einem Bereich von 0,5 und 0,1 μg/ml. Hs683 war die am stärksten sensitive Zelllinie gegenüber dem Extrakt (7). Ihr IC₅₀-Wert lag bei 0,05 μg/ml. Im Gegensatz hierzu wurde das Wachstum der A172-Zellen durch den Extrakt A bei Konzentrationen von 0,01 bis 10 μg/ml nicht beeinflusst. Der IC₅₀-Wert lag in einem Bereich von 10 und 50 μg/ml.
Wie in 1 dargestellt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 2 menschlichen nicht-kleinzelligen Lungenkrebszelllinien (NSCLC) in einem Bereich zwischen 0,1 und 0,5 μg/ml. 8 zeigt, dass beide Linien sensitiv gegenüber dem Extrakt A waren.
Wie in 1 dargestellt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 2 menschlichen Blasenkrebszelllinien (vergl. Tabelle 2) in einem Bereich von 50 und 100 μg/ml. Die zwei Linien zeigten deutliche Unterschiede bezüglich der Sensitivität gegenüber dem Extrakt A (9). Tatsächlich verminderte der Extrakt A bei 5 μg/ml das allgemeine Wachstum der Zelllinie T24 um mehr als 80%, während das allgemeine Wachstum der Zelllinie J82 nur um 32% bei 100 μg/ml vermindert wurde. Die J82-Zelllinie scheint sehr wenig sensitiv gegenüber dem Extrakt A zu sein.
Das allgemeine Wachstum der 1 Prostatazelllinie (die Zelllinie PC3) wurde mittels MTT-Analyse beurteilt, wenn die Zellen mit dem Extrakt A behandelt wurden. Extrakt A induzierte eine Hemmung des allgemeinen Wachstums um etwa 90% bei einer Konzentration zwischen 100 μg/ml und 0,5 μg/ml. Der IC₅₀-Wert lag bei etwa 0,1 μg/ml (10).
Wie in 1 dargestellt wird, lag der mittlere IC₅₀-Wert der 5 Kopf- und Nackenkrebszelllinien in einem Bereich von 0,1 und 0,5 μg/ml. Ein ähnliches allgemeines Wachstum wurde für 4 der 5 Kopf- und Nackenkrebszelllinien beobachtet (11). Von diesen 5 Zelllinien erschien SCC9 am wenigsten sensitiv. Trotzdem zeigte sie IC₅₀-Werte für Extrakt A von etwa 5 μg/ml.
Zusammenfassend üben die Extrakte A gemäß der Erfindung eine dramatische antitumorale Wirkung auf die 46 der 48 menschlichen Krebszelllinien aus, die in den vorstehend beschriebenen Experimenten untersucht wurden. Diese antitumoralen Wirkungen entsprechen eine deutliche Verminderung des allgemeinen Wachstums dieser menschlichen Krebsmodelle, die ein breites Feld histologischer Typen repräsentieren.
Beispiel 3 Wirkung eines Extrakts gemäß der Erfindung auf Zellkinetiken
Dieses Beispiel stellt die zytostatische Wirkung des Extrakts A gemäß der Erfindung dar. Gemäß der Experimente, die mittels einer kolorimetrischen MTT-Analyse durchgeführt wurde, die in Beispiel 2 beschrieben wurde, ist es deutlich, dass der Extrakt A das allgemeine Wachstum der meisten der achtundvierzig menschlichen Krebszelllinien, die für die MTT-Analyse verwendet wurden, dramatisch vermindert. In den nachfolgenden Beispielen wurde untersucht, ob das durch diesen Extrakt verminderte allgemeine Wachstum entweder Veränderungen entspricht, die auf dem Level der Zellzykluskinetik geschehen (Beispiel 3), oder durch die Induktion von Apoptose (vergl. Beispiel 4) oder durch beides.
Der Zellzyklus ist im Allgemeinen in verschiedene Phasen aufgeteilt, die eine G0/G1-, S- und G2/M-Phase umfassen. Veränderungen, die bei Proteinen stattfinden, die das Zellwachstum und/oder den Zelltod kontrollieren, können ein Ziel der aktiven Verbindungen, die im Extrakt A vorliegen, darstellen. Veränderungen der Zellzykluskinetik können mittels der Durchflusszytometrie untersucht werden, wobei verschiedene Fluorophore, das heißt Propidium-Jodid, Acridin-Orange und Ethidiumbromid, verwendet werden. Die Durchflusszytometrie ermöglicht, jede Krebszelle (wobei mehrere tausend Zellen untersucht werden) im Zellzyklus zu lokalisieren. Die Veränderungen in den DNA-Histogramm-Mustern werden daher verwendet, um den Mechanismus der Wirkung von verschiedenen therapeutischen Verbindungen zu charakterisieren. Die Daten, die von der Durchflussanalyse stammen, werden graphisch oder mathematisch verarbeitet, um aussagekräftige Schätzungen der G1-, der S- und der G2/M-Anteile abzuleiten. Die mathematische Bearbeitung basiert meistens auf bestimmt Modelle und Thesen.
Die Zelllinien wurden in Flaschen (Bodenfläche 25 cm²) ausgesät, die 7 ml Kulturmedium enthielten. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 37°C wurde das Zellkulturmedium durch frisches Medium ausgetauscht, in dem der Extrakt A in Konzentrationen aufgelöst war, die 50% (IC₅₀), 30% (= IC₃₀) und 10% (= IC₁₀) der Zellpopulation tötet. Nach 24 oder 72 Stunden der Behandlung wurden die Zellen in der Suspension geerntet, in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4°C gewaschen und mit 70% Ethanol (4°C) übernacht bei -20°C durchlässig gemacht. Die Zellen wurden anschließend mit PBS gewaschen und mit einer Propidium-Jodid-Lösung (80 μg/ml) für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend bei 4°C übernacht gehalten. Ribonuclease A (3% V/V) wurde zugegeben, um einen Bruch der doppelsträngigen DNA zu induzieren. Das Portrait des Zellzyklus wurde für jede Probe etabliert. Ein spezifisches Software-Programm, das in dem Durchflusszytometer eingebaut war, wurde verwendet, um den prozentualen Anteil der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen präzise zu bestimmen. Jede Zellzyklusphase wurde in Form von Scheitelpunktoberflächen dargestellt und als ein prozentualer Anteil berechnet. Die Oberfläche des gesamten Zellzyklus betrug 100%. Jedes Experiment wurde 3 mal durchgeführt. Der mittlere prozentuale Anteil von jeder unterschiedlichen Phase und der Standardfehler des entsprechenden Mittelwerts wurden berechnet. Jede Zellzyklusphase einer Bedingung wurde mit der gleichen Zellzyklusphase der Kontrollzellen, das heißt nicht behandelten Zellen, verglichen.
Der Extrakt A ist hoch wirksam gegen menschliche Tumorzelllinien. Die Konzentrationen, die in unseren Experimenten der Durchflusszytometrie verwendet wurden, wurden gemäß der Ergebnisse der MTT-Analyse (Beispiel 2) ausgewählt. Die fünf menschlichen Krebszelllinien Hs683 (Gliom), J82 (Blase), A172 (Gliom), RPMI (Kopf- und Nacken) und HCT-15 (Dickdarm) wurden getestet und die Dosen, die 10, 30 und 50 Prozent der Zellen töteten, wurden bestimmt (Tabelle 3), um zu untersuchen, ob der Extrakt A eine Anreicherung in einer der Zellphasen förderte, wenn die Kulturen für 24 oder 72 Stunden mit steigenden Konzentrationen des Extrakts A behandelt wurden.
TABELLE 3 Dosen des Extrakts A gemäß der Erfindung, die 10, 30 und 50% der Zellen in den fünf Zelllinien töteten.
Die Zellzyklusanalysen von HCT-15 (12) zeigten, dass die Verteilung der Zellpopulation nach einer Behandlung von 24 Stunden unabhängig zu den getesteten Konzentrationen ähnlich zu der Verteilung der Kontrolle war. Andererseits erschien eine prominente S-Population in den Zellen, die mit 0,25 μg/ml Extrakt für 72 Stunden behandelt wurden. Die S-Fraktion stellte 21% der Zellen in der Kontrolle dar und erreichte 59% nach der Behandlung mit dem Extrakt A bei 0,25 μg/ml. Der Anstieg in der S-Fraktion wurde von einem Verlust von Zellen in der G0/G1-Phase begleitet. Die G0/G1-Population durchlief eine deutliche Verminderung von 71% auf 29%.
Die Zellzyklusanalyse von RPMI (13) zeigte, dass die Verteilung der Zellpopulation, die mit dem Extrakt A mit 0,05 μg/ml behandelt wurde, ähnlich zu der Verteilung der Kontrolle nach 24 Stunden der Behandlung war. Ein schwacher Anstieg in der S-Phase wurde beobachtet bei 0,1 und 0,25 μg/ml. Im Gegensatz dazu erfolgte ein großer Anstieg in der S-Population, wenn die Zelllinie RPMI für 72 Stunden mit dem Extrakt A in den drei getesteten Konzentrationen inkubiert wurde. Es waren etwa 71%, 69% und 62% der Zellen in der S-Phase, wenn der Extrakt A bei 0,05 μg/m, 0,1 μg/ml oder beziehungsweise 0,25 μg/ml untersucht wurde. Begleitend sank der prozentuale Anteil der Zellen in der G0/G1-Phase deutlich und stieg leicht in der G2/M-Phase, wobei 29% der Zellpopulation erreicht wurde.
Die Zelllinie A172 wurde mit dem Extrakt A bei 10 und 25 μg/ml getestet, was dem IC₁₀ und dem IC₅₀ entsprach. Die Ergebnisse (14) zeigten, dass der Extrakt A unabhängig von den getesteten Konzentrationen einen Anstieg in der G0/G1-Phase nach 24 Stunden der Behandlung induzierte. Neununddreißig Prozent der Zellen waren in der G0/G1-Phase in der Kontrolle, während die Zellen, die mit dem Extrakt A behandelt wurden, 60% erreichten. Begleitend mit der Anreicherung in der G0/G1-Phase beobachteten wir eine leichte Anreicherung in der G2/M-Phase bei der größten getesteten Konzentration. Die Wirkung, die nach 24 Stunden der Behandlung beobachtet wurde, ging nach 72 Stunden verloren. Tatsächlich wurde keine deutliche Veränderung in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen beobachtet.
Die Zelllinie J82 ist kaum sensitiv gegenüber dem Extrakt (vergl. MTT-Analyse). Die Konzentrationen, die für die Durchflusszytometrie ausgewählt wurden, entsprachen etwa dem IC₁₀ und IC₃₀ (15). Nach 24 Stunden der Behandlung wurde eine leichte Anreicherung in der G0/G1-Phase unabhängig von den getesteten Konzentrationen erhalten. Andererseits waren 30 oder beziehungsweise 47% der Zellpopulation in der S-Phase, wenn die Zellen für 72 Stunden mit dem Extrakt A bei 50 und 100 μg/ml behandelt wurden, während die Kontrollbedingungen nur 18% erreichten. Bei 100 μg/ml konnte eine Anreicherung in der G2/M-Phase ebenfalls bemerkt werden.
Nach 24 Stunden der Behandlung mit dem Extrakt A bei 0,05 μg/ml sammelten sich die Hs683-Zellen in der G0/G1-Phase an und erreichten 70% im Vergleich zur Kontrolle (58%) (16). Begleitend haben wir eine Abnahme in dem prozentualen Anteil der Zellen in der S-Phase beobachtet. In der gleichen Weise waren bei beiden Konzentrationen die meisten der Zellen in der G0/G1-Phase nach 72 Stunden der Behandlung. Tatsächlich waren mehr als 60% der Zellen in dieser Phase, während die Zellen in dieser Phase bei der Kontrolle 46% der Zellpopulation darstellten.
Zusammenfassend induziert der Extrakt A prinzipiell eine Anreicherung in der G0/G1-Phase und unter solchen Umständen deutet dies darauf hin, dass der Extrakt A eine cytostatische Wirkung besitzt.
Beispiel 4 Pro-apoptotische Wirkung eines Extrakts gemäß der Erfindung
Dieses Beispiel zeigt die pro-apoptotische Wirkung von Extrakt A gemäß der Erfindung.
Der Zelltod kann auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen, entweder zufällig oder genetisch programmiert. Der zufällige Zelltod, der ebenfalls als Nekrose bezeichnet wird, erfolgt im Wesentlichen als das Ergebnis von z.B. einer physikalischen oder biologischen Aggression. Die Apoptose betrifft die Art des Zelltods, die genetisch programmiert ist und die unter normalen physiologischen Bedingungen erfolgt. Nach der Induktion der Apoptose wird eine Kaskade von Ereignissen in der Zelle induziert, welche die Aktivierung von Zelltodrezeptoren, die Aktivierung einer Serie von cytosolischen Proteasen, die Erzeugung von apoptotischen Körpern, die Fragmentierung der DNA umfasst.
Die Wirkung des Extrakts A auf den Signalweg der Apoptose wurde an den vier menschlichen Krebszelllinien Hs683 (Gliom), J82 (Blase), A172 (Gliom) und HCT-15 (Dickdarm) untersucht.
Die Zelllinien wurden in Flaschen (Bodenfläche 25 cm²) ausgesät, die 7 ml Kulturmedium enthielten. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 37°C wurde das Zellkulturmedium durch frisches Medium ausgetauscht, in dem der Extrakt A gemäß der Erfindung in unterschiedlichen Konzentrationen aufgelöst war, die 50% und 30% der Zellpopulation tötet. Nach 24 oder 72 Stunden der Behandlung wurden die Zellen in der Suspension geerntet und gezählt. 250.000 Zellen wurden für 10 Minuten mit 1700 UpM bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in PBS bei 4°C gewaschen und mit Annexin V-FITC und einer Propidium-Jodid-Lösung für 15 Minuten bei 4°C in der Dunkelheit inkubiert. Für jede Probe wurden Daten von etwa 10.000 Zellen auf einer logarhitmischen Skalierung aufgetragen. Die Software, die in dem Durchflusszytometer eingebaut war, wurde verwendet, um den prozentualen Anteil der Zellen auf dem Signalweg der Apoptose und/oder der Nekrose und der normalen Zellen präzise zu bestimmen. Jedes Experiment wurde zweimal durchgeführt. Der mittlere prozentuale Anteil sowohl des apoptotischen als auch des nekrotischen Signalwegs und der Standardfehler der entsprechenden Mittelwerte wurden berechnet. Jede Bedingung wurde mit der Kontrolle, die aus nicht behandelten Zellen bestand, verglichen.
Ein vierfacher Anstieg der apoptotischen HCT-15-Zellen wurde im Vergleich zu den Kontrollzellen beobachtet, wenn die Zellen mit dem Extrakt A bei 0,25 μg/ml für 24 Stunden behandelt wurden (17). Die A172-Zellen schienen in einem apoptotischen und nekrotischen Signalweg beteiligt zu sein, wenn die Zellen für 24 Stunden mit dem Extrakt A bei 25 μg/ml (18) behandelt wurden. Diese Tendenz wurde nach 72 Stunden der Behandlung beibehalten. Die Behandlung mit dem Extrakt A induzierte die Apoptose von J82-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise, was besonders deutlich nach 72 Stunden der Behandlung war (19). Ein Anstieg in dem prozentualen Anteil der nekrotischen Zellen wurde ebenfalls bei beiden Konzentrationen nach 72 Stunden beobachtet. Ein 2,5facher Anstieg in dem prozentualen Anteil der apoptotischen Zellen von Hs683 wurde nach 24 Stunden der Behandlung mit dem Extrakt A bei 0,025 μg/ml erhalten (20). Nach 72 Stunden der Behandlung stieg der prozentuale Anteil der apoptotischen Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise.
Zusammenfassend induziert der Extrakt A prinzipiell ein Anstieg in dem prozentualen Anteil der apoptotischen Zellen. Eine Wirkung auf den nekrotischen Signalweg wurde unter bestimmten Bedingungen erhalten.
Beispiel 5 Maximal tolerierte Dosis eines Extrakts gemäß der Erfindung
In dem vorliegenden Beispiel wurde der MTD-Index für den Extrakt A gemäß der Erfindung bestimmt. Die maximal tolerierte Dosis (MTD) eines Arzneimittels wird als die maximale Menge eines Arzneimittels definiert, die gesunden Tieren, das heißt Tieren, die keine Tumore eingepflanzt bekommen haben, akut verabreicht werden kann, das heißt intraperitoneal, intravenös, subkutan oder per os als Einzeldosis.
Die experimentellen Bedingungen, um den MTD-Index von Extrakt A zu bestimmen, waren die nachfolgenden. Die Überlebenszeiten der Mäuse, die keinen Tumor eingepflanzt bekamen, wurde bis zu 14 Tagen nach der Injektion aufgezeichnet. Sechs verschiedene Dosen des Extrakts A wurden für die Bestimmung des MTD-Indexes verwendet. Die höchste Dosis, die Tumor tragenden Mäusen verabreicht wurde, betrug 160 mg/kg. Andere Dosen umfassten 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg und 80 mg/kg. Jede experimentelle Gruppe wurde für die Bestimmung des MTD-Indexes aus zwei Mäusen gebildet. Tabelle 4 zeigt nachfolgend die Daten, die für den MTD-Index unter Verwendung von Extrakt A erhalten wurden. TABELLE 4 Bestimmung des MTD-Indexes für Extrakt A gemäß der Erfindung
wobei x eine tote Maus bedeutet und – bedeutet, dass alle Tiere am Leben blieben.
Gemäß der Definition, die vorstehend gegeben wurde, beträgt der MTD-Index für den Extrakt A 20 mg/kg für eine Einzeldosis bei Mäusen. Die maximal tolerierte Dosis (MTD) für Extrakt A, welche die maximale Menge von Extrakt A betrifft, die akut gesunden Tieren verabreicht werden kann, beträgt 20 mg/kg. Dieser Wert deutet darauf, dass Extrakt A ein breites therapeutisches Fenster besitzt.
BEISPIEL 6 In-vivo-Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung, die in drei Krebsmodellen ermittelt wurden.
Dieses Beispiel stellt die In-vivo-Wirkungen des Extrakts A gemäß der Erfindung bei drei unterschiedlichen Krebsmodellen dar.
Die In-vivo-Wirkungen des Extrakts A wurden an Mäusen untersucht, die verschiedene Arten von Tumoren einschließlich einem Lymphomkrebs, einem Melanomkrebs und einem Brustkrebs eingepflanzt bekamen. Die In-vivo-Wirkungen wurden mit drei Arten von Parametern evaluiert:

– Die kumulative Toxizität, die durch das Aufzeichnen der Gewichte der Tumor tragenden Mäuse während der Behandlung evaluiert wird.
– Die tatsächliche antitumorale Wirkung, die auf dem Level des Tumorwachstums ausgeübt wird, die durch das Messen der Tumorgröße dreimal pro Woche mittels eines Messtasters gemessen wird. Das tatsächliche Tumorwachstum wird als ein Gebiet (mm²) durch die Multiplikation der zwei größten senkrechten Durchmesser ausgedrückt.
– Der Steigerung des Überlebens für die behandelten Mäuse, die durch den T/C-Index berechnet wird. Dieser Index ist das Verhältnis zwischen der mittleren Überlebenszeit der Gruppe der behandelten Mäuse (T) und der Überlebenszeit der Kontrollgruppe (C). Der Extrakt wird als aktiv eingestuft, wenn der T/C-Wert über 130% liegt (P < 0,005), als sehr aktiv für einen Wert der größer als 150% (P < 0,01) ist, und als toxisch für einen Wert, der kleiner als 70% ist.

In-vivo-Wirkungen von Extrakt A auf ein Lymphomkrebsmodell
Der Extrakt A wurde für das aggressive p388-Lymphomkrebsmodell evaluiert. In einem ersten Experiment wurden drei Dosen, 10 mg/kg, 5 mg/kg und 2,5 mg/kg mit einer Kontrolle verglichen. Die Mäuse wurden subkutan mit 10⁶ P388-Zellen am Tag D0 beimpft und neunmal während den drei nachfolgenden Wochen an den Tagen D5, D7, D9, D12, D14, D16, D19, D21 und D23 nach der Beimpfung behandelt. Jede experimentelle Gruppe enthielt neun Mäuse.
21A stellt dar, dass der Extrakt A keinen Einfluss auf das Körpergewicht der Mäuse ausübt. 21B zeigt, dass der Extrakt A eine deutliche Verminderung des Wachstums des P388-Lymphoms induziert. Die T/C-Indexwerte für den 7 × 10 mg/kg Verabreichungsplan ergaben einen T/C-Index von 111 %, die T/C-Indexwerte für den 6 × 5 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 100% und die T/C-Indexwerte für den 8 × 2,5 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 121%. Zusammenfassend deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Verabreichung von Extrakt A das Wachstum des P388-Lymphomkrebs verminderte, aber nicht deutlich das Überleben der p388-Lymphom tragenden Mäuse bei den getesteten Konzentrationen verlängerte.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurde die Anzahl der Verabreichungen von neun Mäuse auf sechszehn erhöht, was gleichzeitig von einer Verminderung bei der Dosis pro Einzelverabreichung begleitet wurde. Die subkutan verabreichten Dosen betrugen 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg und 0,63 mg/kg. Der Extrakt A wurde täglich für fünf Tage pro Woche für fünf aufeinanderfolgende Wochen verabreicht (5 × 5 = 25).
22B zeigt, dass diese aktiven Dosen von Extrakt A von 0,63 mg/kg und 1,25 mg/kg vernachlässigbare toxische Wirkungen hatten, da die P388-Lymphom tragenden Mäuse kein Gewicht während der Verhandlung verloren haben. 22A zeigt, dass der Extrakt A deutlich das Wachstum des P388-Lymphoms bei Dosen sowohl von 0,63 mg/kg als auch 1,25 mg/kg vermindert. Zusätzlich ergaben die T/C-Indexwerte für den 15 × 2,5 mg/kg Verabreichungsplan einen T/C-Index von 137%, die T/C-Indexwerte für den 15 × 1,25 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 137% und die T/C-Indexwerte für den 13 × 0,63 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 116%. Daher erhöhten die 15 Verabreichungen von 2,5 mg/kg von Extrakt A und die 15 Verabreichungen von 1,25 mg/kg von Extrakt A deutlich das Überleben dieser P388-Lymphom tragenden Mäuse um 37%. Dementsprechend verlängern die Behandlungen mit Dosen von 2,5 mg/kg und 1,25 mg/kg von Extrakt A das Überleben von p388-Lymphom tragenden Mäusen.
Zusammenfassend übt der Extrakt A gemäß der Erfindung deutliche antitumorale Wirkungen auf ein aggressives P388-Lymphomkrebsmodell ohne eine Verminderung des Körpergewichts bei den betreffenden Tieren aus. Überraschenderweise übt der Extrakt A gemäß der Erfindung eine höhere antitumorale Aktivität aus, wenn er chronisch mit niedrigen Dosen, das heißt etwa 1,25 bis 0,63 mg/kg, und nicht mit hohen Dosen, das heißt etwa 10 mg/kg bis 5 mg/kg untersucht wird.
In-vivo-Wirkungen des Extrakts A auf ein Melanomkrebsmodell
Der Extrakt A wurde für das aggressive B16-Melanomkrebsmodell evaluiert. Der Extrakt A wurde subkutan Mäusen mit Dosen von 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg und 0,63 mg/kg verabreicht. Der Extrakt A wurde täglich für fünf Tage pro Woche für fünf aufeinanderfolgende Wochen verabreicht.
23A zeigt, dass die verabreichten Dosen vernachlässigbare toxische Wirkungen hatten, da die B16-Melanom tragenden Mäuse kein Körpergewicht während der Behandlung verloren haben. 23B zeigt, dass die Verabreichungen von Extrakt A, der mit 2,5 oder 1,25 mg/kg verabreicht wurde, deutlich das Wachstum des B16-Melanoms verminderte. Zusätzlich ergaben die T/C-Indexwerte für den 20 × 2,5 mg/kg Verabreichungsplan einen T/C-Index von 117%, die T/C-Indexwerte für den 20 × 1,25 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 117% und die T/C-Indexwerte für den 25 × 0,63 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 140%. Daher verminderte der Extrakt A das Wachstum des B16-Melanoms und verlängerte deutlich das Überleben der B16-Melanom tragenden Mäuse, besonders wenn der Extrakt A 25mal mit einer Dosis von 0,63 mg/kg verabreicht wurde, wenn ein signifikanter Wert erreicht wird.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurde der Extrakt A oral (per os) verabreicht. 24A zeigt, dass die verabreichten Dosen vernachlässigbare toxische Wirkungen hatten, da die B16-Melanom tragenden Mäuse kein Körpergewicht während der Behandlung verloren haben. 24B zeigt, dass die Verabreichungen von Extrakt A per os mit 2,5 oder 1,25 mg/kg deutlich das Wachstum des B16-Melanoms bis 25 Tage nach der Beimpfung verminderte. Zusätzlich ergaben die T/C-Indexwerte für den 19 × 2,5 mg/kg Verabreichungsplan einen T/C-Index von 114%, die T/C-Indexwerte für den 15 × 1,25 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 100% und die T/C-Indexwerte für den 16 × 0,63 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 104%. Daher verminderte der Extrakt A das Wachstum des B16-Melanomtumors und verlängerte leicht das Überleben der B16-Melanom tragenden Mäuse bei 2,5 mg/kg.
Zusammenfassend stellen die zwei experimentellen Reihen einen Beweis zur Verfügung, dass der Extrakt A gemäß der Erfindung unabhängig von der Art der Verabreichung deutliche antitumorale Wirkungen auf das B16-Melanommodell ausübt.
In-vivo-Wirkungen des Extrakts A auf ein Brustkrebsmodell
Der Extrakt A wurde für ein MXT-HI-Brustkrebsmodell evaluiert, das heißt eine Hormon unempfindliche Variante des Brustkrebses. Das MXT-HI-Modell entspricht einem undifferenzierten Karzinom mit dramatischen metastatischen Verläufen zur Leber. Es entspricht daher den späten klinischen Stadien des menschlichen Brustkrebses. Der MXT-HI stellt ein sehr aggressives biologisches Tumormodell dar.
Der MXT-HI-Brustkrebs wird in Mäusen durch die subkutane Injektion eines MXT-Tumorfragments in der Flanke von B6D2F1-Mäusen induziert. Ohne Behandlung sterben die beimpften Mäuse zwischen der vierten und der siebten Woche nach der Beimpfung. Der Extrakt A wurde bei 10 mg/kg, 5 mg/kg und 2,5 mg/kg mit neun Verabreichungen getestet, das heißt dreimal pro Woche für drei aufeinanderfolgende Wochen
25A zeigt, dass die verschiedenen Behandlungspläne mit Extrakt A, die in den vorliegenden Experimenten verwendet wurden, im Wesentlichen keine größeren toxischen Wirkungen hatten, da die MXT-HI tragenden Mäuse kein Körpergewicht verloren haben. 25B zeigt, dass die neun Verabreichungen mit 2,5 deutlich das Wachstum des MXT-HI-Tumors verminderten. Die T/C-Indexwerte für den 9 × 10 mg/kg Verabreichungsplan ergaben einen T/C-Index von 103%, die T/C-Indexwerte für den 9 × 5 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 103% und die T/C-Indexwerte für den 9 × 2,5 mg/kg Plan ergaben einen T/C-Index von 119%. Daher verminderte der Extrakt A bei einer Dosis von 2,5 mg/kg das Überleben der MXT-HI tragenden Mäuse.
In 26 wird die Anzahl der MXT-HI-Brustkrebs tragenden Mäuse, die während des Experiments in der Kontrolle (unbehandelt) und der Testgruppe (behandelt mit dem Extrakt) starben, gezeigt. Eine statistische Analyse nach Kaplan-Meier wurde verwendet und stellt die Todesrate der neun Mäuse in jeder Gruppe dar. Der statistische Wert unterstreicht die allgemeine Passform der Testgruppe im Vergleich mit der allgemeinen Passform der Kontrollgruppe in Bezug auf das Überleben.
Zusammenfassend stellen die vorstehend beschriebenen Experimente den Nachweis zur Verfügung, dass der Extrakt A deutliche antitumorale Wirkungen auf den MXT-HI-Brustkrebstumor ausübt.
Schlussfolgerungen aus Beispiel 6
Der Extrakt A gemäß der Erfindung besitzt eine deutliche antitumorale Wirkung auf die getesteten Krebsmodelle. Diese Modelle stellen ein breites Feld von histologischen Tumorarten, einschließlich Karzinome, Lymphome und Melanome, dar. Diese Modelle sind klinisch relevant, weil sie spezifische klinische Stadien von menschlichen Krebserkrankungen wiederspiegeln. Abgesehen davon sind sie ebenfalls aggressiv und invasiv, weit zwei von ihnen dramatisch schnell Metastasen in der Leber bilden.
Während er eine sehr deutliche antitumorale Wirkung besitzt, zeigt der Extrakt A gemäß der Erfindung vernachlässigbare toxische Wirkungen, da die Tumor tragenden Mäuse während den Behandlungen kein Körpergewicht verlieren. Der teilweise gereinigte Extrakt kann daher zusätzlich zu der antitumoralen Verbindung, die für alle antitumoralen Aktivitäten verantwortlich ist, von denen hier berichtet wird, ein "Gegenmittel" einschließen.
Überraschenderweise induziert der Extrakt A deutlich höhere antitumorale Aktivitäten, wenn er chronisch bei niedrigen Dosen, das heißt etwa bei 1,25 bis 0,63 mg/kg, anstelle von höheren Dosen, das heißt, bei etwa 10 mg/kg bis 5 mg/kg, untersucht wird.
BEISPIEL 7 Toxikologische Wirkungen eines Extrakts gemäß der Erfindung in vivo.
Dieses Beispiel stellt die toxikologischen Wirkungen des Extrakts A gemäß der Erfindung dar, insbesondere in vivo die Hämatotoxizität und die allgemeine Toxizität.
Hämatotoxizität
Die Hämatotoxizität wird durch die Etablierung von hämatologischen Profilen für jede Tierart evaluiert. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Anzahl der Blutplättchen, der roten Blutkörperchen und der Leukozyten geschenkt. Die Wirkung von Extrakt A wurde für zwei Dosen, das heißt für 5 mg/kg und 1,25 mg/kg, durch die intraperitoneale Verabreichung an Mäusen evaluiert. Der Verabreichungsplan war fünf Verabreichungen pro Woche für fünf aufeinanderfolgende Wochen, was zu einer Gesamtzahl der Injektionen von fünfundzwanzig führt. Die Tiere wurden drei Tage nach der letzten Injektion getötet. Es waren zehn Mäuse pro Gruppe.
Im Vergleich zur Kontrolle (27) wurden keine statistisch signifikanten Veränderungen mit Bezug auf hämatologische Parameter nach der Behandlung mit dem Extrakt A beobachtet. Keine signifikanten Veränderungen wurden für das mittlere Zellvolumen der roten Blutkörperchen, das mittlere korpuskulare Hämoglobin, die mittlere korpuskulare Hämoglobinkonzentration und die Blutplättchen nach der Behandlung beobachtet.
Allgemeine Toxizität
Die allgemeine Toxizität von Extrakt A wurde histologisch bei Mäusen mittels konventionellen histopathologischen Analysen von Hämatoxilin-Eosin gefärbten histologischen Schnitten, die von verschiedenen Arten von Organen und Geweben erhalten wurden, getestet. Die Wirkung von Extrakt A wurde bei 5 mg/kg und 1,25 mg/kg durch eine intraperitoneale Verabreichung evaluiert. Der Verabreichungsplan war fünf Verabreichungen pro Woche für fünf aufeinanderfolgende Wochen, was zu einer Gesamtzahl von Injektionen von fünfundzwanzig führt. Die Tiere wurden drei Tage nach der letzten Injektion getötet. Das Gehirn, das Herz, die Leber, die Bauchspeicheldrüse, der Magen, die Därme und die Eierstöcke wurden entnommen. Es waren 10 Mäuse pro Gruppe.
Die Untersuchung der entnommenen Organe zeigte, dass die Kontrollgruppe (unbehandelt) keine besondere Veränderung in den Organen aufwies. Ebenfalls in den behandelten Mäusen waren das Gehirn, das Herz, die Leber, die Bauchspeicheldrüse, der Magen, die Därme und die Eierstöcke nicht durch die Behandlungen mit Extrakt A mit Dosen von 5 mg/kg oder 1,25 mg/kg betroffen, was darauf hinweist, dass der Extrakt A keine allgemein toxische Wirkung besitzt.
BEISPEIL 8 Antitoxische Wirkungen der Extrakte gemäß der Erfindung
Dieses Beispiel stellt die antitoxische Wirkung der Extrakte gemäß der Erfindung dar. Weibliche Mäuse in einem Alter von 4 bis 5 Wochen wurden mit der zweifachen oder der vierfachen maximal tolerierten Dosis von zwei gut bekannten und klinisch verwendeten Antitumormitteln Adriamycin (MTD × 4) und Vincristin (MTD × 2) injiziert. Die Mäuse bekamen eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 40 mg Adriamycin/kg Körpergewicht oder eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 20 mg Vincristin/kg Körpergewicht an Tag 0. Lot 1 in 28 zeigt die Überlebenskurve der Mäuse, die entweder mit der MTD × 2 von Vincristin oder mit der MTD × 4 von Adriamycin injiziert wurden.
Extrakt A gemäß der Erfindung wurde intraperitoneal mit einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht vor der Injektion der Antitumormittel injiziert. Die nachfolgenden unterschiedlichen Pläne wurden angewendet:

– Extrakt A wurde am gleichen Tag (das heißt Tag 0), aber 4 Stunden vor der Injektion der therapeutischen Verbindung Adriamycin oder Vincristin injiziert. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden durch Lot 2 in 28 dargestellt.
– Extrakt A wurde einmal pro Tag während der acht Tage vor dem Tag der Injektion der therapeutischen Verbindung Adriamycin oder Vincristin injiziert. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden durch Lot 3 in 28 dargestellt.
– Extrakt A wurde einmal pro Tag während der acht Tage vor dem Tag der Injektion der therapeutischen Verbindung Adriamycin oder Vincristin und einmal pro Tag während der sieben Tage nach der Injektion der Antitumormittel injiziert. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden durch Lot 4 in 28 dargestellt.

Wie in 28 gesehen werden kann, verlängern alle Pläne, in denen der Extrakt A in Kombination mit einer therapeutischen Verbindung verwendet wird, das Überleben der Mäuse im Vergleich zu den Injektionen den therapeutischen Verbindungen als einziger Wirkstoff.
Ein zweites Beispiel stellt die antitoxische Wirkung des Extrakts A mit einem anderen Verabreichungsplan dar. Die Mäuse bekommen eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 20 mg Vincristin/kg Körpergewicht an Tag 0. Lot 1 in 29 zeigt die Überlebenskurve der Mäuse, die mit Vincristin injiziert wurden.
Der Extrakt A wurde intraperitoneal mit einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht vor oder zum gleichen Zeitpunkt der Injektion des Antitumormittels injiziert. Die nachfolgenden unterschiedlichen Pläne wurden verwendet.

– Extrakt A wurde am gleichen Tag (das heißt Tag 0), aber 6 Stunden vor der Injektion der therapeutischen Verbindung Vincristin injiziert. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden durch Lot 2 in 29 dargestellt.
– Extrakt A wurde am gleichen Tag (das heißt Tag 0), aber 4 Stunden vor der Injektion der therapeutischen Verbindung Vincristin injiziert. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden durch Lot 3 in 29 dargestellt.
– Extrakt A wurde am gleichen Tag (das heißt Tag 0), aber 2 Stunden vor der Injektion der therapeutischen Verbindung Vincristin injiziert. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden durch Lot 4 in 29 dargestellt.
– Extrakt A wurde am gleichen Tag (das heißt Tag 0) und zum gleichen Zeitpunkt wie die Injektion der therapeutischen Verbindung Vincristin injiziert. Die Ergebnisse dieser Behandlung werden durch Lot 5 in 29 dargestellt.

Die Parameter, die zur Bestimmung der schützenden, das heißt antitoxischen, Wirkung von Extrakt A auf die toxischen Wirkungen angewendet wurden, die durch die antitumoralen Arzneimittel induziert wurden, bestanden aus der "Verlängerung" des Überlebens. Die statistische Analyse wurde mittels der Statistik nach Kaplan-Meier durchgeführt. Die Größe der Signifikanz betrug p < 0,05.
Wie in 29 gesehen werden kann, verlängert der Plan, in dem der Extrakt A 4 Stunden von der Injektion von Vincristin (Lot 3) injiziert wird, deutlich das Überleben der Mäuse im Vergleich zu der Injektion der therapeutischen Verbindung als einziger Wirkstoff.
Es kann daher daraus geschlossen werden, dass der Extrakt A in der Lage ist, Mäuse vor den toxischen Wirkungen einer tödlichen Dosis einer häufig verwendeten antitumoralen Verbindung wie z.B. Adriamycin oder Vincristin zu schützen. Der Extrakt A gemäß der Erfindung besitzt eine antitoxische Wirkung, die es ermöglicht, die toxischen Wirkungen von gut bekannten Antitumorverbindungen zu vermindern.
Ein drittes Beispiel stellt die antitoxische Wirkung von Extakt B dar. Weibliche Mäuse in einem Alter von 4 bis 5 Wochen wurden mit vier gut bekannten und klinisch verwendeten Antitumorverbindungen injiziert: Adriamycin, Vincristin, Oxaliplatin und Camptothecin. Die Mäuse bekamen eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 20 mg Adriamycin/kg Körpergewicht oder eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 20 mg Vincristin/kg Körpergewicht oder eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 40 mg Oxaliplatin/kg Körpergewicht oder eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 20 mg Camptothecin/kg Körpergewicht am Tag 0.
Lot 1 in 30, 31, 32, 33 zeigt die Überlebenskurve von Mäusen, die entweder mit Adriamycin oder mit Vincristin oder mit Oxaliplatin oder mit Camptothecin injiziert wurden.
Lot 2 in den 30 bis 33 zeigt den "Überlebenspunkt" der Mäuse, die mit dem Extrakt B mit 10 mg/kg injiziert wurden.
Lot 3 in den 30 bis 33 zeigt die Überlebenskurve der Mäuse, die intraperitoneal mit dem Extrakt B mit 10 mg/kg Körpergewicht am gleichen Tag (das heißt Tag 0), aber 4 Stunden vor der Injektion der therapeutischen Verbindung injiziert wurden.
Wie in den 30 bis 33 gesehen werden kann, verlängert der Extrakt B, der in Kombination mit einer therapeutischen Verbindung verwendet wird, deutlich das Überleben der Mäuse im Vergleich zu der Injektion der therapeutischen Verbindung als einziger Wirkstoff. Der Extrakt B zeigte keine cytotoxischen Eigenschaften. Tatsächlich starb keine Maus, wenn sie mit dem Extrakt B als einziger Wirkstoff injiziert wurde. Statistische Analysen wurden mittels einer Statistik nach Kaplan-Meier durchgeführt. Die Größe der Signifikanz betrug p < 0,05 für jede Kombination von Extakt B und einer therapeutischen Verbindung.
Es kann daher daraus geschlossen werden, dass der Extrakt B Mäusen einen deutlichen Schutz vor den toxischen Wirkungen einer tödlichen Dosis von häufig verwendeten antitumoralen Verbindungen zur Verfügung stellt. Der Extrakt B besitzt daher eine antitoxische Wirkung, die es ermöglicht, die toxischen Wirkungen von gut bekannten Antitumorverbindungen zu vermindern. Die antitoxische Aktivität wurde in Extrakt B genau wie in Extrakt A bewahrt.
Ein viertes Beispiel stellt die antitoxische Wirkung von Extakt C dar. Der Extrakt C wurde in Kombination mit Adriamycin mit 20 mg/kg Körpergewicht verwendet.
Lot 1 in 34 zeigt die Überlebenskurve von Mäusen, die mit 20 mg Adriamycin/kg Körpergewicht injiziert wurden.
Lot 2 in 34 zeigt die Überlebenskurve der Mäuse, die mit dem Extrakt C mit 10 mg/kg Körpergewicht am gleichen Tag (das heißt Tag 0), aber 4 Stunden vor der Injektion der therapeutischen Verbindung injiziert wurden.
Wie in 34 gesehen werden kann, induziert die Injektion mit dem Extrakt C eine deutliche Verlängerung des Überlebens der Mäuse im Vergleich zu der Injektion der therapeutischen Verbindung als einziger Wirkstoff. Es kann daher daraus geschlossen werden, dass Extrakt C eine antitoxische Eigenschaft wie zuvor der Extrakt B zeigt.
Ein fünftes Beispiel stellt die antitoxische Wirkung von Extakt D dar. Weibliche Mäuse in einem Alter von 4 bis 5 Wochen wurden mit Adriamycin injiziert. Die Mäuse bekamen eine einzelne intraperitoneale Injektion mit 20 mg Adriamycin/kg Körpergewicht am Tag 0 (Lot 1 in 35). Lot 2 in 35 zeigt die Überlebenskurve der Mäuse, die intraperitoneal mit dem Extrakt D mit 5 mg/kg Körpergewicht am gleichen Tag (das heißt Tag 0), aber 4 Stunden vor der Injektion der therapeutischen Verbindung Adriamycin injiziert wurden.
Wie in 35 gesehen werden kann, induziert die Injektion mit dem Extrakt D eine deutliche Verlängerung des Überlebens der Mäuse im Vergleich zu der Injektion der therapeutischen Verbindung als einziger Wirkstoff. Es kann daher daraus geschlossen werden, dass Extrakt D eine antitoxische Eigenschaft wie zuvor der Extrakt C zeigt.
Zusammenfassend stellen diese Experimente dar, das die gereinigten Extrakte gemäß der Erfindung deutlich das Überleben der Mäuse im Vergleich zu den Mäusen, die mit der therapeutischen Verbindung als einzelnen Wirkstoff injiziert wurden, verlängern. Der Extrakt D, der am stärksten gereinigte Extrakt, zeigte eine antitoxische Eigenschaft gegenüber den toxischen Wirkungen, die durch die Antitumorarzneistoffe injiziert wurden.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung umfassend einen Extrakt von Calotropis procera und mindestens einer therapeutischen Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend ein Antikrebsmittel, einen cytotoxischen Antikörper oder ein Fragment davon, ein cytotoxisches Hormon oder ein Fragment davon und ein cytotoxisches Peptid oder ein Fragment davon für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Extrakt durch ein Extraktionsverfahren erhalten wird, das die Schritte umfasst: a) Extrahieren des Ausgangsmaterials von der Calotropis procera-Pflanze, wobei das Ausgangsmaterial ausgewählt ist aus Früchten, oberirdischen Teilen, unterirdischen Teilen und ihren Gemischen in einem aliphatischen Alkohol durch Auflösen des Ausgangsmaterials in dem Alkohol, wobei eine Suspension des Materials in Alkohol erhalten wird, Rühren der Suspension und Filtrieren der Suspension durch eine Glasfritte, wobei ein erstes Filtrat und ein erster fester Anteil erhalten werden; b) Extrahieren des ersten festen Anteils in einem aliphatischen Alkohol, wobei ein zweites Filtrat und ein zweiter fester Anteil erhalten werden; c) Vereinigen des ersten und zweiten Filtrats, wobei ein vereinigtes Filtrat erhalten wird und Eindampfen des vereinigten Filtrats unter Vakuum, wobei der Extrakt erhalten wird.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Extrakt mindestens zwei Wirkstoffe umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Asclepin, Calactin, Vorusharin, Calotropin, Calotropagenin, Uzarigenin, Calotoxin, Usharin, Usharidin, und 2''-Oxo-Vorusharin.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gewichtsverhältnis von Extrakt : therapeutischer Verbindung im Bereich von 0,001 : 1 bis 1000 : 1 liegt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Brustkrebs, Lymphom, Sarcom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom, Dickdarmkrebs, Gliom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, Hautkrebs, Knochenkrebs, Eierstockkrebs, Krebs des Zentralnervensystems, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs, hämatologische Krebserkrankungen.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die therapeutische Verbindung/en ein Antikrebswirkstoff ist/sind.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Adriamycin, Alkeran, Ara-c, Bleomycin, Carmustin, Busulfan, Lomustin, Camptothecin, Carboplatin, Cisplatin, Cyclophosphamid, Cytoxan, Daunorubicin, Dacarbazin, Fluoruracil, Fludarabin, Gemcitabin (Gemzar), Herceptin, Hexamethylmelamin, Hydrea, Idarubicin, Ifosfamid, Irinotecan (Camptosar, CPT-11), Leustatin, Methotrexat, Mithramycin, Mitomycin, Mitoxantron, Muphoran, Navelbin, Stickstoff-Lost, Oxaliplatin, Rituxan, Imatinib, Streptozocin, Taxol, Taxotere, Topotecan (Hycamtin), Velban, Vincristin, Etoposid, Xeloda (Capecitabin) oder Zevelin.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die therapeutische Verbindung(en) ein cytotoxischer Antikörper oder ein Fragment davon ist/sind.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die therapeutische Verbindung(en) ein cytotoxisches Hormon oder ein Fragment davon ist/sind.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die therapeutische Verbindung(en) ein cytotoxisches Peptid oder ein Fragment davon ist/sind.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Extrakt vor, nach oder gleichzeitig mit der (den) therapeutischen Verbindung(en) verabreicht wird.
Extraktionsverfahren zum Erhalten eines Extrakts, der biologisch aktive Komponenten enthält, umfassend die Schritte: a) Extrahieren des Ausgangsmaterials der Calotropis procera-Pflanze, wobei das Ausgangsmaterial ausgewählt wird aus Früchten, oberirdischen Teilen, unterirdischen Teilen und ihren Gemischen in einem aliphatischen Alkohol durch Auflösen des Ausgangsmaterials in dem Alkohol, wobei eine Suspension des Materials in Alkohol erhalten wird, Rühren der Suspension; und Filtrieren der Suspension durch eine Glasfritte, wobei ein erstes Filtrat und ein erster fester Anteil erhalten werden; b) Extrahieren des ersten festen Anteils in einem aliphatischen Alkohol, wobei ein zweites Filtrat und ein zweiter fester Anteil erhalten werden; c) Vereinen des ersten und zweiten Filtrats, wobei ein vereintes Filtrat erhalten wird; und d) Eindampfen des vereinten Filtrats unter Vakuum, wobei der Extrakt erhalten wird.
Aktiver Extrakt erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 12.
Kit umfassend einen Container, in welchem ein Extrakt von Calotropis procera, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert, vorliegt, und einen Container, in welchem eine therapeutische Verbindung, wie in Anspruch 1 definiert, vorliegt.