DE69928375T2

DE69928375T2 - Analgetikum aus schlangengift

Info

Publication number: DE69928375T2
Application number: DE69928375T
Authority: DE
Inventors: Aharon Di Shulov; Naftali Primor
Original assignee: Shulov Institute for Science (SIS) Ltd
Current assignee: Shulov Institute for Science (SIS) Ltd
Priority date: 1998-01-20
Filing date: 1999-01-13
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-01-14
Also published as: EP1049479A1; AU1888799A; EP1049479A4; CA2318279A1; IL123001A0; AU754119B2; EP1049479B1; US6555109B1; ATE309811T1; JP2002509110A; DE69928375D1; WO1999036078A1; IL123001A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Obwohl Schmerz als eine überaus wichtige physiologische Reaktion gilt, verursacht er auch unnötiges Leiden und Qual. Die Schmerzbekämpfung ist ein wichtiger Zweig der Medizin. Schmerz kann sowohl als Ausdruck einer Erkrankung als auch infolge ärztlicher Behandlung, wie etwa Chemotherapie, entstehen. In jedem Fall ist es wichtig, dem Schmerz so weit wie möglich entgegen zu wirken, um dem Leidenden die Möglichkeit zur normalen Funktion zu gewähren.
Es sind zwei mit dem Schmerz zusammenhängende Nervenbahnen gleichzeitig im Körper tätig: (1) die sensorische Bahn, welche Gewebeschaden wahrnimmt und folglich ein Schmerzgefühl entstehen lässt; (2) die analgetische Bahn, welche die Schmerzempfindung reduziert und die Flut der Information über Schmerz zum zentralen Nervensystem (ZNS) blockiert, wodurch trotz der Verletzung der Organismus seine normale Funktion aufrecht erhalten kann. Anästhesie kann entweder durch die Anwendung eines Medikaments erzielt werden, welches die peripheren, als Schmerzsensoren wirkenden Nerven blockiert, oder aber auch durch die Potenzierung des natürlichen analgetischen Systems. Weil es sich um verschiedene Bahnen handelt, sind sie auch durch unterschiedliche Substanzen beeinflussbar. Als Beispiel wirken Aspirin oder Lidocain auf die periphere sensorische Bahn, während Morphin und verwandte Stoffe im analgetischen System angreifen.
Als die wirksamsten derzeit verwendeten analgetischen Substanzen gelten Morphin und morphinähnliche Stoffe opiatischen Ursprungs. Es ist bekannt, dass eine Vielzahl von endogenen Opiaten im Gehirn produziert werden, was auch ihre starke Wirksamkeit erklärt. Ihre Wirkung auf Neurone erfolgt unter Vermittlung von spezialisierten Rezeptoren. Signale, welche von diesen Rezeptoren reguliert werden, verhindern die Überflutung von Schmerzinformation von den peripheren Neuronen zum zentralen Nervensystem. Die gleichen Neurone im ZNS sind auch auf eine Vielzahl von anderen chemischen Substanzen empfindlich, darunter auf Katecholamine (Serotonin, Noradrenalin u. a.), neuroaktive Peptide (Neurotensin) und inhibitorische Aminosäuren (Glycin und GABA).
Von den derzeit lebenden 4000 Arten von Schlangen sind etwa 400 giftig. Die giftigen Arten sind in 5 Unterfamilien aufgeteilt, von denen eine die Viperidae-Familie ist, allgemein als Vipern bekannt. Schlangen der Viperidae-Familie leben in Europa, Asien und Afrika und bilden 8 Arten; eine davon wird Vipera genannt. Die Art Vipera enthält die nachfolgenden 8 Arten: V. berus V. lebantina, V. russelii, V. superciliaris, V. ursinii, V. aspis, V. latifi, V. bormulleri, V. ammodytes, V. xanthina und V. mauritanica. Die Art V. xanthina wird weiter in drei Unterarten unterteilt: V. xanthina raddei, V. xanthina xanthina, die hauptsächlich im Süden Europas zu finden ist, und V. xanthina palestinae, welche in Israel lebt.
Schlangengift besteht aus einer Vielzahl verschiedener Substanzen. Von einigen hundert erforschten Stoffen werden nur 4 bis 8 als Träger des toxischen Effekts des Schlangengifts vermutet. Trotz ihrer funktionalen Ähnlichkeit unterscheiden sich die Schlangengifte voneinander beträchtlich in ihrem chemischen Aufbau. Jede Art besitzt ihre charakteristische Giftzusammensetzung. Bis jetzt sind nur einige wenige hundert Substanzen aus etwa 400 Giftschlangen definiert worden. Darunter zu nennen sind Enzyme, Toxine, Wachstumsfaktoren usw. Die meisten bekannten giftigen Substanzen sind bezüglich ihrer exakten Wirkungsweise noch nicht geklärt.
Üblicherweise wird Schlangengift als eine Quelle toxischer Substanzen angesehen. Es enthält allerdings auch analgetische Stoffe. Ärzte, die Patienten behandelten, welche von der südamerikanischen Viper (Crotalus durissus terrificus) gebissen worden waren, berichteten, dass diese Patienten, obwohl in Lebensgefahr, keinerlei Schmerz empfanden. Ein aus dem Schlangengift isoliertes neurotoxinähnliches Produkt wurde im Ersten Neurotoxikologie Kongress, welcher im Jahre 1997 in Jugoslawien stattfand, als ein neuartiges Analgeticum erkannt. Diese und auch ähnliche Beobachtungen führten zu Versuchen, analgetische Substanzen aus Schlangengift zu isolieren.
Bevan, P. und Hiestand, P. (1983), J. Biol. Chem. 285: 5319–5326 beschreiben ein Einzelketten-Polypeptid, welches mittels Kationenaustausch-Chromatografie aus dem Gift der Vipera russelli russelli isoliert wurde. Dieses Polypeptid konkurriert mit Liganden der Monoamin- und Opiatgruppe um die Bindung an entsprechende Rezeptoren und die intraventrikuläre Injektion in das Gehirn von Ratten bewirkt starke Sedierung. Die Autoren stellen fest, dass das Polypeptid ein großes Molekül mit starker elektrischer Ladung ist und daher eher nicht geeignet, die Blut-Hirnschranke zu überschreiten. Das Polypeptid erwies sich als ein mittelstarkes Toxin, ähnlich wie das unbehandelte Gift.
Dutta, A. S. und Chaudhuri, A. K. N. (1991), Indian J. Exp. Biol., 29: 937–942 beschreiben Experimente mit rohem, unbehandeltem Gift der Vipera russelli, welche an Mäusen und Ratten durchgeführt wurden. Das Gift wurde intraperitoneal und intravenös injiziert und bewirkte geändertes allgemeines Verhalten, wobei die Änderungen der Verhaltensmuster auf das ZNS zurückzuführen waren. In einem Experiment zeigte das Gift signifikante analgetische Wirkung, obwohl in zwei anderen Versuchen solche Wirkung nicht bewiesen werden konnte.
Die Offenlegungsschrift WO 91/01740, veröffentlicht am 21. Februar 1991, enthüllt den Gebrauch von lyophilisiertem, vollständigem Gift der Schlange Crotalus atrox in einer pharmazeutischen Zusammensetzung für äußerliche Anwendung. Die Zusammensetzung zeichnet sich durch analgetische, hyperämisierende und smasmolytische Wirkung aus.
Giorgi, R., Bernardi, M. M. und Cury, Y. (1993) Toxicon 31: 1257–1265, beschreiben einen analgetischen Effekt von Substanzen niedrigmolekularen Gewichts, die aus dem Gift der Schlange Crotalus durissus terrificus durch Ultrafiltration gewonnen wurden. Das Extrakt wurde Mäusen subkutan, intraperitoneal und oral verabreicht.
Im Patent CN 1,072,344 , veröffentlicht am 26. Mai 1993, wird der Gebrauch einer Salbe offen gelegt, welche aus einem kommerziell erhältlichen Schlangengift-Enzym (wobei die Quelle nicht angegeben wird), aus einem leukozytären Peptidfaktor und aus Bingpian, einem bekannten chinesischen Anästheticum, besteht. Die Salbe soll als ein Antibioticum ohne Toxizität und ohne Nebenwirkungen dienen.
Pu, X. C, Wong, P. T. H. und Gopalakrishnakone, P (1995), Toxicon 33: 1425–1431, beschreiben ein durch Gelfiltration und Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC) gereinigtes Neurotoxin aus dem Gift der Königskobra. Das Gift wurde intraperitoneal, per os oder intraventrikulär Mäusen injiziert und zeigte einen starken analgetischen Effekt.
Das UdSSR Patent Nr. 435,824 beschreibt eine analgetische Zusammensetzung aus dem trockenen Gift der Nayaksin-Kobra, die der Art Naja der Elapidae-Familie zugehörig ist.
Eine schmerzlindernde Salbe namens Viprosalum oder Viprosal ist seit über 20 Jahren in der früheren Sowjetunion und im Osteuropa bekannt. Bei dieser Salbe handelt es sich um ein Schlangengift (einer europäischen Art), welches in Vaselin zusammen mit Lanolin, Kampfer und Salizilat aufgelöst ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, eine aus Schlangengift isolierte analgetische Substanz zu liefern, welche im Wesentlichen nicht toxisch ist.
Hinsichtlich eines Gesichtspunkts der vorliegenden Erfindung, eine im Wesentlichen nicht toxische Fraktion mit analgetischer Wirkung ist durch Isolierung aus dem Gift der Vipera xanthina gegeben.
Weiterhin ist gemäß dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung als Analgeticum gegeben, die eine im Wesentlichen nicht toxische, aus dem Gift der Vipera xanthina isolierte Fraktion beinhaltet.
Die bevorzugte Verkörperung dieser Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung für lokale Anwendung.
Obwohl in allen weiter unten beschriebenen Experimenten zur Illustration der Erfindung die Unterart Vipera xanthina palestinae (im Folgenden V. palestinae) beteiligt war, muss klargestellt werden, dass diese Unterart lediglich als Beispiel für die gesamte Art Vipera xanthina dient. Wie bereits oben erwähnt, hat jede giftige Art ihre eigene charakteristische Gift-Zusammensetzung.
Die Fraktion, welche Gegenstand der Erfindung ist, vereinigt in ein und demselben Stoff einige neuartige, bisher nicht bekannte Eigenschaften, darunter: (1) Gemeinsame Herkunft aus dem Gift der Vipera xanthina; (2) analgetische Wirkung; (3) praktisch fehlende Toxizität: (4) wesentliche Reinheit; (5) Wirksamkeit bei örtlicher Anwendung. Die Substanz erhielt den Namen „Zephalin".
In der vorliegenden Spezifizierung ist der Terminus nicht toxisch definiert als kein Auftreten pathologischer Erscheinungen infolge Anwendung pharmakologischer Dosen von Zephalin, die aber einen analgetischen Effekt bewirken. Die Bezeichnung praktisch fehlende Toxizität bedeutet gänzliches Fehlen von Toxizität bzw. annehmbares toxisches Niveau.
Obwohl Zephalin eine gereinigte Fraktion des Rohgiftes ist, enthält es offensichtlich mehr als nur eine Substanz. Die vorliegende Erfindung besteht nicht aus Zephalin allein, sondern auch aus anderen Substanzen, welche daraus noch weiter gereinigt werden können und ebenfalls die Eigenschaften von Zephalin besitzen. Die Erfindung bezieht sich auch auf Derivate dieser Produkte, welche die Eigenschaften von Zephalin besitzen. Im Falle von eiweißähnlichem Material würden solche Derivate Proteine oder Polypeptide enthalten, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, abgebaut bzw. ersetzt wurden. Es kommen auch andere chemische Modifizierungen in Frage.
Zephalin kann für die Zubereitung pharmakologischer Zusammensetzungen, die als Analgetica dienen, verwendet werden. Solche Zusammensetzung würde auch eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz oder einen Hilfsstoff enthalten, wie etwa eine Mischung aus Vaselin und Lanolin. Die Zusammensetzung kann auch parenteral verabreicht werden, wie etwa in physiologischer Kochsalzlösung gelöst oder zum örtlichen Gebrauch als Salbe, Balsam bzw. Creme. Um dem Leidenden Schmerzlinderung zu gewähren, kann die pharmakologische Zusammensetzung injiziert oder an der entsprechenden Stelle örtlich aufgetragen werden. Andere mögliche Verabreichungsarten können rektal oder oral sein. Jede pharmazeutische Zusammensetzung würde ganz allgemein außer der aktiven Substanz auch eine akzeptable Trägersubstanz oder einen Hilfsstoff enthalten. Da Zephalin manchmal erst nach einer Latenzperiode seine Wirkung entfaltet, muss angenommen werden, dass es besonders geeignet für die Behandlung von chronischem Schmerz ist, obwohl es bei jeder Art von Schmerzen eingesetzt werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung kann besser anhand der nachfolgenden genauen Beschreibung unter gleichzeitiger Betrachtung der nachstehenden Bilder verstanden werden, wobei:
1 ein Diagramm ist, welches die UV-Absorption bei Wellenlänge 280 nm der eluierten QAE Sephadex-Säulenfraktionen, worauf das Gift der V. palestinae geladen worden war, darstellt und
2A und 2B graphische Darstellungen der Ergebnisse sind, welche während der Reinigung von Zephalin auf einer Mono Q-Säule erhalten wurden. Die Y-Achse stellt die UV-Absorption bei 280 nm dar, während die X-Achse die in Minuten ausgedrückte Elutionszeit darstellt. Diagramm B ist eine Vergrößerung des Diagramms A im Bereich von 9–31 Minuten bei niedrigerem Absorptionsbereich.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN VERKÖRPERUNGEN
Material und Methoden
Das Gift der V. palestinae wurde durch das Melken von einigen Hundert Schlangen gewonnen. Das Gift wurde gefroren und lyophilisiert.
A. Analgesie-Versuch
In jedem Versuch wurden einige Dutzend Hamster gleichen Gewichts und Alters verwendet. Die Hamster wurden in Gruppen unterteilt, entsprechend der Anzahl der zu prüfenden Proben. Eine Salbe (50% Lanolin und 50% Vaselin), welche die getestete Substanz enthielt, wurde den Tieren am Rückenfell aufgetragen, ohne Entfernung des Fells, um die Haut nicht zu schädigen. Eine Kontrollgruppe von Hamstern wurde mit einer Salbe ohne Zephalin-Gehalt behandelt. Die Hamster wurden auf diese Art örtlich 6, 14 bzw. 21 aufeinander folgende Tage lang behandelt. Der Analgesie-Test wurde am folgenden Tag nach der letzten Applikation durchgeführt.
In einem typischen Versuch wird eine fixe Menge der Salbe mit analgetischer Substanz oder ohne sie den Versuchstieren für eine bestimmte Anzahl von Tagen aufgetragen. Nach dieser Periode wird eine Schmerznoxe eingeführt, und zwar mittels einer subkutanen Injektion von 0,8 ml 1 N HCl/0,1 kg Körpergewicht in die femorale Region. Die Hamster reagieren auf die HCl-Injektionen durch Berühren der betroffenen Gegend mit der Zunge, was als „Lecken" bezeichnet wird. 20 Minuten nach der Injektion werden die Hamster 40 Minuten lang beobachtet und es wird gezählt, wie oft sie die Stelle lecken. Die Anzahl der Leck-Bewegungen wird als quantitative Indikation des durch die HCl-Injektion verursachten Schmerzes angesehen.
Die analgetische Wirkung wird mittels des Vergleichs der durchschnittlichen Anzahl dieses Leckens bei behandelten Versuchstieren und der Anzahl des Leckens bei den Tieren der Kontrollgruppe ausgewertet. Die Signifikanz der Differenz wird mithilfe des t-Tests errechnet.
B. Feststellen der letalen Dosis
Es wurden 4 verschiedene Konzentrationen der getesteten Substanz Mäusen von 20–25 Gramm Körpergewicht intraperitoneal injiziert. Acht Mäuse erhielten je eine Konzentration. Die Auswertungsmethode der 50% Mortalität (LD₅₀) war die von Reed, L. J. und Muench, H. (1938), Am. J. Hygiene 27: 493 beschriebene Methode. Eine LD₅₀-Einheit ist definiert als die Menge der getesteten Substanz, die den Tod von 50% der injizierten Mäuse per 20 g Körpergewicht (mg/20g) bewirkte.
C. Feststellen der Toxizität
Hamster wurden für kurzfristige (bis zu 10 Tagen) Bestimmungen verwendet. Den Versuchstieren wurde 10 Tage lang die getestete Substanz intraperitoneal injiziert. Ratten dienten als Versuchstiere im Langzeitversuch, wobei die Salbe ihnen örtlich 4 Monate lang 6 Mal in der Woche (insgesamt 100 Applikationen) aufgetragen wurde.
D. Eiweißbestimmung
Die Konzentration von eiweißähnlichem Material in Zephalin und dessen Gehalt in jeder Abtrennung wurden spektroskopisch bei 280 nm Wellenlänge unter Anwendung des Ovalbuminstandards einer bekannten Konzentration bestimmt.
Beispiele
1. Reinigung von Zephalin
In einer typischen Reinigungsfolge wurden 0,4 g des vollständigen Schlangengifts der Vipera palestinae in Ammoniumazetatpuffer (0,05 M; pH 8,0) gelöst und auf eine Ionenaustausch-QAE Sephadex-Säule (Pharmacia) (1,3 × 50 cm) aufgetragen. Die Sephadex-Säule wurde mit dem genannten Puffer äquilibriert. Die Elutionsfraktionen wurden in 5 ml-Proberöhrchen gesammelt (S. 1). Der Eiweißgehalt der Fraktionen wurde durch die Messung der optischen Dichte bei 280 nm bestimmt. Nach Eluieren des zweiten Protein-Peaks wurde ein Gefälle von 2 M Ammoniumazetat angeschlossen, was zur Elution von weiteren A₂₈₀ absorbierenden Fraktionen führte. Fünf Gruppen von A₂₈₀ absorbierenden Fraktionen wurden gepoolt und alle 5 Fraktionsmischungen wurden auf ihre Toxizität bei Mäusen und auf ihre analgetische Wirksamkeit (siehe unten) getestet.
In der bevorzugten Isolationsmethode wird die QAE-Säule durch eine FPLC Mono Q-Säule (Pharmacia) ersetzt. Im typischen Experiment wurden 50–80 mg V. palestinae-Gift in 20 mM, pH 7,5 Tris-Puffer in der Endkonzentration von 0,1 g/ml gelöst. Nach Zentrifugieren und Entfernung von Präzipitat wurde der Überstand durch einen Mikrofilter (40 Mikron) filtriert und 0,1–0,2 ml wurden auf die 1 × 10 Mono Q-Säule aufgetragen. Das Lösungsmittel A bestand aus 20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, und der Puffer B aus 20 mM Tris und 0,5 M NaCl. Puffer A allein wurde während der ersten 20 Minuten der Elution verwendet. Im Laufe der folgenden 45 Minuten wurde die Mischung von Puffer A und B zu gleichen Teilen (50%:50%) angewandt, während in den letzten 5 Minuten kam 100% Puffer B zur Anwendung. Zephalin eluierte im Bereich von 20–25 Minuten (S. 2B), wie durch verschiedene Versuche ermittelt wurde (s. unten). Die Elution kann auch unter Anwendung von Puffer A allein erfolgen, und dieser kann auch durch 20 mM Ammoniumazetat ersetzt werden. Dreißig Reinigungsvorgänge unter Einsatz der Mono Q-Säule wurden während der Zeitspanne von 18 Monaten vorgenommen und alle zeigten die gleichen Ergebnisse.
II. Die Charakterisierung von Zephalin
A. Bestimmung der Mischung der analgetischen Fraktion
In der Präliminärtestung wurden sehr hohe Konzentrationen des Gemisches der Fraktionen 1–5 (aus der QAE Sephadex-Säule, s. 1 oben) verwendet, um das Gemisch mit den analgetischen Eigenschaften zu identifizieren. Deswegen wurde die analgetische Wirksamkeit erst nach 6-tägiger Applikation erkannt. Das lyophilisierte Material aus den gepoolten Fraktionen 1–5 wurde in der Konzentration von 2 mg/g in einer Salbe mit 50% Vaselin- und 50% Lanolin-Inhalt aufgelöst. 0,2 g dieser Salbe wurden täglich 6 Tage lang bei Hamstern verwendet, indem diese auf eine 2–3 cm² große Fläche der behaarten Haut (wie im Absatz „Methoden" oben geschildert) appliziert wurde. Unter Anwendung der oben geschilderten Methode wurden Protein, Toxizität und analgetische Wirksamkeit für jede gepoolte Fraktion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1

* Protein wurde nach der Lowry-Methode unter Verwendung des Ovalbumin-Standards bestimmt.

Die Zahlen in Klammern bedeuten Wahrscheinlichkeitswerte (p), die sich im t-Test aus dem Vergleich zur Kontrolle ergaben.
Die analgetische Wirksamkeit war hauptsächlich in den gepoolten Fraktionen 1 und 2 zu erkennen. Im Pool 2 waren lediglich 11% der Proteine enthalten, die Toxizität betrug aber nur 0,002%. Diese Fraktion wies die niedrigste Toxizität und den niedrigsten Eiweißgehalt von den beiden gepoolten analgetischen Fraktionen auf. Daher wurde in den weiteren Versuchen diese Fraktion als Zephalin verwendet. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Toxizität und die analgetische Wirkung unterschiedlichen Komponenten des Schlangengiftes zuzuschreiben sind und dass Zephalin praktisch nicht toxisch ist (s. auch weiter unten).
Das Zephalin, welches mithilfe der Mono Q-Säule vorbereitet wurde, ist vollkommen von toxischen Komponenten des Giftes getrennt, wie in Absatz IV, A1 weiter unten erörtert.
In den fortan beschriebenen Studien wurde das Zephalin mithilfe der QAE-Säule zubereitet, falls nicht ausdrücklich anders angegeben.
B. Beschaffenheit von Zephalin
Zwecks Bestimmung der Beschaffenheit von Zephalin, wurden 0,1 mg Zephalin, welches mithilfe der Mono Q-Säule zubereitet wurde, im Lösungspuffer gelöst. Es wurde parallel dazu Pronase E zubereitet, und zwar durch Auflösen von 2,4 mg Pronase E im Elutionspuffer (20 mM Tris, pH 7,5). Es wurden 3 Proberöhrchen bereitgestellt: eins enthielt nur Protease, das zweite nur Zephalin und in dem dritten wurde Zephalin mit 5 μl (0,17 μg) Pronase E inkubiert. Alle Proberöhrchen wurden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und auf ihre analgetische Eigenschaft getestet.
Das Ergebnis zeigte, dass nur dem Inhalt des Proberöhrchens 2 analgetische Wirkung zukam. Dieser Test wurde dreimal wiederholt und das Resultat war jeweils identisch. So kann angenommen werden, dass Zephalin ein eiweißähnlicher Stoff ist und dass ein Protein für die analgetische Wirkung verantwortlich ist.
C. Reinheit von Zephalin
Die 20–25 Minuten-Fraktion an der Mono Q-Säule (S. 1 oben) enthielt 0,02 ± 0,05 S. A. mg/ml Protein, basiert auf 10 Trennungsabläufen. Jeder Lauf ergab die Ausbeute von 0,1 mg Zephalin. Diese Menge entspricht 0,6% des gesamten, der Kolonne angereicherten Giftproteins. Diese Tatsache weist auf den hohen Reinheitsgrad des Zephalins hin.
III. Die analgetische Wirksamkeit
Die analgetische Wirkung von Zephalin wurde anhand von Präparaten getestet, welche während einer Zeit von 2 Jahren vorbereitet wurden. 0,2 ml der Zephalinfraktion mit 0,01 mg Proteininhalt wurden in 50 g Salbe aufgelöst, was die Konzentration von 0,0002 mg Zephalin per 1 g Salbe ergibt. Hamster wurden mit dieser Salbe 21 Tage lang örtlich behandelt, wie im Absatz Methoden oben erörtert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2

* Durchschnittliche Zahl des „Leckens" in 7 Experimenten ± S. A.

Diese Versuche zeigen, dass die mit Zephalin behandelten Hamster weniger schmerzempfindlich im Vergleich zu den Kontrollen auf die HCl-Injektion waren.
IV. Toxikologische Studien
A. Zephalin-Injektion
A1. Mäusen (20–25 g Körpergewicht) wurde subkutan 0,05 mg Zephalin (zubereitet auf der Mono Q-Säule) injiziert. Diese Menge ist 250 Mal größer als die, welche notwendig ist, um einen analgetischen Effekt bei Hamstern zu bewirken. In dieser Dosierung war Zephalin für die Mäuse nicht toxisch und es wurden keine sichtbaren Symptome registriert. Im Gegensatz dazu führte die Injektion von 0,02 mg der ersten Fraktionen (Proberöhrchen 2–7), welche von der Kolonne eluiert wurden, zum sofortigen Tod aller 5 Mäuse. Dieser Befund zeigt die praktisch fehlende Toxizität der analgetischen Fraktion.
A2. In einem weiteren Experiment wurde die Injektion an 3 Gruppen von 8 Hamstern (Körpergewicht 100–120 g) vorgenommen. Lyophilisiertes Zephalin wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst mit einer Endkonzentration von 0,002 mg/ml.
0,1 ml bzw. 0,2 ml dieser Lösung wurden täglich intraperitoneal 10 Tage lang den Hamstern der Gruppe 1 und 2 injiziert. Die dritte Gruppe diente als Kontrolle und erhielt 0,2 ml reine physiologische Kochsalzlösung. Nach 10 Tagen wurde Blut allen 3 Gruppen entnommen, um biochemische und histopathologische Parameter zu bestimmen.
Unter den biochemischen Proben wurde der Anstieg von Cholesterol und Amylase in den ersten zwei Gruppen verzeichnet (die Ergebnisse werden nicht gezeigt). Es wurden jedoch keine signifikanten Veränderungen der Leberenzyme (LDH, SGOT, SGPT) festgestellt.
A3. Die histopathologischen Befunde der Versuchstiere, wie in Absatz A2 angegeben, wurden geprüft. Es fanden sich keine signifikanten histopathologischen Unterschiede zwischen den mit Zaphalininjektionen behandelten Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe.
B. Lokale Behandlung
Zephalin wurde als Salbe in der oben beschriebenen Weise zubereitet (Absatz Methoden – analgetischer Versuch). 3 Gruppen mit jeweils 10 (männlichen und weiblichen) Ratten (120–140 g Körpergewicht) wurden verwendet. Die Salbe wurde, wie im Absatz Methoden erörtert, lokal appliziert. Die Salbe, welche die Gruppen 1 und 2 erhielten, enthielt Zephalin in der Konzentration von 0,0002 und 0,001 mg/kg, respektive. Gruppe 3 wurde nur mit 0,2 g Lösungsmittel behandelt und diente als Kontrolle. Die Salbe wurde jeweils täglich aufgetragen. Die Dauer dieses Versuchs war 4 Monate, wobei jedes Tier der Gruppe 1 die Gesamtdosis von 0,03 mg/kg Körpergewicht erhielt, während jedes Tier der Gruppe 2 0,15 mg/kg Körpergewicht erhielt. Während der ganzen Versuchsperiode konnten keine Änderungen im Körpergewicht der Ratten oder in ihrem Verhalten beobachtet werden.
Es wurden Blut- und Harnproben laboratorisch untersucht. Für das Sammeln des Harns wurden die Tiere auf einer Kunststoffunterlage gelegt und der Urin wurde sofort nach dem Urinieren gesammelt und mittels Multistick getestet. Zwecks Blutentnahme wurden die Tiere anästhetisiert und es wurde arterielles Blut entnommen. Plasma wurde durch Zentrifugation entfernt, bei 4°C aufbewahrt und auf biochemische Parameter untersucht.
B1. Zephalin verursachte einen signifikanten Anstieg des Spiegels folgender Enzyme: Alanin-Aminotransferase (SGPT), Aspartat-Aminotransferase (SGOT) und Laktat-Dehydrogenase (LDH). Als der Versuch allerdings mit der weiter gereinigten Mono Q-Fraktion wiederholt wurde, konnte kein Anstieg der Enzyme SGPT oder SGOT festgestellt werden. Die folgenden Laborparameter zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungs- und Kontrollgruppen: Kreatinin, Ca⁺⁺, P (anorg.), Glukose, Harnstoff, Cholesterol, Gesamtproteine, Albumin, Bilirubin, alkalische Phosphatase, Amylase (Ergebnisse hier nicht gezeigt).
B2. Die Ergebnisse der verschiedenen biochemischen Parameter im Harn sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3

1. Gereinigt auf QAE Sephadex-Säule
2. Gereinigt auf Mono Q-Säule
3. Männliche und weibliche Ratten
4. Nur männliche Ratten
Die analytischen Parameter sind in der Tabelle folgendermaßen dargestellt: (–) negativ; (0) Spuren; (+) niedrig; (++) mäßig; (+++) hoch. Die Ziffer nach der Klammer bedeutet die Anzahl der getesteten Tiere.

Es wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden.
B3. Es wurden die histopathologischen Befunde der erwachsenen Ratten, welche örtlich mit Zephalin behandelt wurden, untersucht. Am Tag nach der beendeten Behandlung wurden die Tiere geopfert und die Haut sowie innere Gewebe wurden entfernt und in Formalin fixiert. Die Gewebe wurden in Paraffin eingebettet und in 6 Mikronen dünne Schnitte geschnitten. Als Färbung wurden Hämatoxylin und Eosin verwendet. Untersucht wurden: (1) Haut aus der behandelten Region; (2) Haut aus einer unbehandelten Region; (3) Herz; (4) Nieren und (5) Gehirn.
Gewebe wurden entnommen aus: (1) 8 von 10 Ratten, die mit 0,0002 mg/g der analgetischen Fraktion behandelt wurden; (2) 6 von 10 Ratten, die mit 0,001 mg/g der analgetischen Fraktion behandelt wurden; (3) 8 Kontrollratten. Alle Tiere wurden für diese Untersuchungen randomal gewählt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
Abschließend kann man sagen, dass keine signifikanten histopathologischen Veränderungen unter den Gruppen der behandelten Tiere und den Kontrollen beobachtet wurden.
Dies bedeutet, dass Zephalin mit keiner signifikanten Toxizität behaftet ist.
Nach dem Ermessen von Fachleuten auf diesem Gebiet ist die vorliegende Erfindung nicht nur auf das bisher Gesagte begrenzt. Vielmehr ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die weiter unten angeführten Ansprüche begrenzt:

Claims

Eine praktisch nicht toxische Fraktion, welche aus dem Gift der Vipera xanthina isoliert wird, wobei die genannte Fraktion einen analgetischen Effekt ausübt.
Eine Fraktion gemäß Anspruch 1, welche dadurch charakterisiert ist, dass diese Fraktion aus dem genannten Gift mittels Ionenaustausch-Chromatografie gereinigt ist.
Eine Fraktion gemäß Anspruch 1, wobei die genannte Vipera xanthina die Vipera xanthina palestinae ist.
Der Gebrauch einer Fraktion gemäß Anspruch 1 zur Vorbereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als Analgeticum dient.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Fraktion gemäß Anspruch 1 sowie eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz oder Füllmaterial enthält.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 für die örtliche Anwendung.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 für parenterale Zufuhr.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei die genannte Vipera xanthina die Vipera xanthina palestinae ist.