DE69627153T2

DE69627153T2 - Zusammensetzungen zur erzielung von analgesie und zur hemmung der progression neuropathischer schmerzerkrankungen

Info

Publication number: DE69627153T2
Application number: DE69627153T
Authority: DE
Inventors: Isadore Adriaenssens; Arthur Amstutz; Scott Bowersox; Theresa Gadbois; Kishorchandra Gohil; Ramasharma Kristipati; R. Luther; Raymond Pettus
Original assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2016-06-27
Also published as: EP1336409A1; FR05C0027I1; ES2194998T3; DE122005000043I2; DE69637021D1; PT1336409E; DE69627153D1; HK1058146A1; ES2283671T3; NL300201I1; DK1336409T3; ATE359086T1; FR05C0027I2; PT835126E; CA2224795A1; DK0835126T3; WO1997001351A1; DE69637021T2; CA2224795C; AU695166B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Omega-Conopeptiden zur Herstellung von Medikamenten zur Hemmung der Progression neuropathischer Schmerzerkrankungen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Omega-Conopeptiden zur Herstellung von Medikamenten, die zur epiduralen Verabreichung bei einem Patienten geeignet sind und Formulierungen, die geeignet sind, Omega-Conopeptid-Peptide zu stabilisieren, die in solchen Medikamenten verwendet werden.

Hinterrund der Erfindung

Analgetische Therapien sind zur Behandlung von Zuständen angezeigt, die die Wahrnehmung von Schmerzen durch einen Patienten gemein haben. Die häufigste Form von Schmerzen, somatischer oder nociceptiver Schmerz, lassen sich auf einen aus einer Reihe von schädlichen oder schmerzhaften Reizen zurückführen, die ihren Ursprung in der Haut, dem Unterhautgewebe oder den inneren Organen haben. Nociceptiver Schmerz entsteht aus der Aktivierung von peripheren nociceptiven afferenten C- und A-Nervenfasern, die zum dorsalen Horn des Rückenmarks verlaufen und mit afferenten Fasern Synapsen bilden, die in spezifische Hirnareale führen.
Beispiele von Reizen, die nociceptive Schmerzantworten hervorrufen, sind schädliche Reizungen der Haut (Hitze, Kälte), Verletzung der Gewebe durch Fleischwunden in Haut und unterliegenden Geweben und Verbrennung. Erlösung von nociceptivem Schmerz kann durch nicht-narkotische Analgetika wie etwa Aspirin, Ibuprofen oder Indomethacin oder durch Opiate, die eine direkte hemmende Aktivität auf die feuernden C-Fasern haben, erreicht werden. Bestimmte örtliche Anesthetika (z. B. Bupivicain), Antihistamine, Amphetamine und Antidepressiva können verwendet werden, um die Wirkungen dei Opiate zu verstärken. Zusätzlich offenbart das eigene US-Patent Nr. 5.364.842 die Wirksamkeit von N-Typ- Calciumkanal blockierenden Omega-Conopeptid-Verbindungen durch die Herstellung von Analgesien oder unterstützenden Opiat-Analgesien.
Neuropathischer Schmerz ist ein Schmerz, der von Verletzung oder chronischen Veränderungen von peripheren oder zentralen somatosensorischen Schaltwegen herrührt, hierin zusammenfassend als "neuropathische Schmerzerkrankungen" bezeichnet. Im Allgemeinen ist es ein chronischer Zustand, der eine komplexe und variable Etiologie aufweist. Die zugrunde liegende Verletzung eines peripheren Nervs, die einen neuropathischen Schmerz verursacht, kann typischerweise einem Trauma oder einer Verletzung des peripheren Nervs, Nervenplexus oder des weichen Gewebes, das den Nerv umgibt, zugeordnet werden. Neuropathischer Schmerz kann auch die Folge einer oder mehrerer zugrunde liegender Krankheiten, einschließlich Krebserkrankungen, Knochenschwund-Krankheiten und AIDS sein.
Neuropathischer Schmerz äußert sich in verschiedenen Formen und weist sowohl provozierte als auch unprovozierte (spontane) Bestandteile auf. Der provozierte Bestandteil eines neuropathischen Schmerzes umfasst gewöhnlich Hypersensitivität auf sensorische Reize und kann Hyperalgesie (außerordentliche Antwort auf einen schädlichen Reiz), Hyperesthesie (außerordentliche Antwort auf Berührung) und Allodynie (Schmerzwahrnehmung bei harmlosen mechanischen oder thermischen Reizen) einschließen. Patenten können auch spontanen Schmerz empfinden, der eine Reihe von Ausprägungen hat. Eine Ausprägung, "Causalgie" genannt, ist typisch für eine Nervenverletzung und wird durch anhaltenden, stark brennenden Schmerz und Allodynie gekennzeichnet. Neuralgie ist eine Form des neuropathischen Schmerzes, die durch ein Trauma oder eine Entzündung eines peripheren Nervs hervorgerufen wird und Symptome aufweist, die mit der örtlichen Etiologie übereinstimmen. In einigen Fällen (wie etwa der Trigeminus-Neuralgie) empfindet der Patient plötzlich auftretende, stechende Schmerzen. Diffuse sensorische Nervenerkrankungen zeigen dagegen symmetrische, distale Schmerzen, die typischerweise die Füße und Hände betreffen. Neuropathischer Schmerz entsteht auch nach Beschädigung zentraler somatosensorischer Wege, wie etwa der aufsteigenden Wege an der Basis des Rückenmarks, des Hirnstamms, Thalamus oder der Hirnrinde. Solche Verletzungen können ein Syndrom von andauerndem, spontanem Schmerz hervorrufen, der in der Peripherie wahrgenommen wird.
Zur Zeit können die Ärzte versuchen, neuropathischen Schmerz mit den gleichen Medikamenten zu beherrschen, die bei der Behandlung von nociceptivem Schmerz wirksam sind; die Ergebnisse sind im Allgemeinen jedoch enttäuschend. Zusätzlich zu nicht- narkotischen Analgetika, Opiaten und örtlichen Anesthetika schlossen Versuche zur Behandlung des neuropathischen Schmerzes die Anwendung von Anticonvulsantien (Phenytoin), Antisympathetika, trizyklischen Antidepressiva und transkutaner Nervenstimulation ein. WO 93/13128 offenbarte, dass N-Typ-Calciumkanal blockierende Omega-Conopeptide Erleichterung von neuropathischem Schmerz verschaffen.
Eine Komplikation bei einer neuropathischen Schmerzerkrankung ist seine fortschreitende Natur, die in einer Verschlimmerung der Symptome des neuropathischen Schmerzes mit der Zeit zur Folge hat. Die Etiologie dieser Degeneration ist nicht gut verstanden; es scheint jedoch so zu sein, dass beschädigte Nerven und benachbarte Nerven empfindlicher für niedrige Reizschwellen werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die spannungsempfindlichen N- Typ-Calciumkanal (VSCC) blockierenden Omega-Conopeptide das Fortschreiten von neuropathischen Schmerzerkrankungen verhindern, besonders wenn solche Verbindungen an der Stelle des neuropathischen Schmerzes verabreicht werden, so dass die Schmerzsymptome sich nicht mit der Zeit verschlimmern.
Die vorliegende Erfindung legt auch eine neuartige Verabreichungsform der Omega- Conopeptide zur Schmerzkontrolle offen. Im Hinblick auf die hydrophile, elektrisch geladene Natur der Omega-Conopeptide und den Permeationseigenschaften der spinalen Meningnen glaubte man bisher, dass bei der epiduralen Verabreichung von Omega-Conopeptiden das Hinzufügen eines Verstärkers für die Membran-Durchdringung erforderlich sein würde. Nach einer Entdeckung der vorliegenden Erfindung können Omega-Conopeptide Schmerzerleichterung bewirken, wenn sie epidural bei Abwesenheit eines Verstärkers für die Membrandurchdringung verabreicht werden, und zwar in Dosierungen, die wirksamen analgetischen Dosierungen bei intrathekaler Verabreichung (z B. direkte Injektion in die Rückenmarksflüssigkeit) vergleichbar sind. Wie hierin beschrieben ist eine solche epidurale Verabreichung besonders wirksam, wenn sie in der Weise durchgeführt wird, dass die verabreichte Verbindung in verlängertem Kontakt mit dem epiduralen Spalt, und noch wirksamer mit den Meningnen platziert ist. Die verbesserte Methode hat den Vorteil, dass epidurale Verabreichung technisch weniger anspruchsvoll als intraspinale Verabreichung der Verbindung ist und weniger Risiken für den Patienten birgt.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch verbesserte Formulierungen für Omega- Conopeptide, die die Verbindungen enthaltenden Lösungen stabilisieren. Solche Formulierungen sind bei den Behandlungsmethoden über längere Zeiträume (kontinuierliche Verabreichung) besonders hilfreich. Diese stabilisierten Formulierungen sind auch bei der Langzeitlagerung von Conopeptid-Lösungen von Nutzen.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt beinhaltet die Erfindung die Verwendung eines N-Typ-Calciumkanal antagonistischen Omega-Conopeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Progresion einer neuropatioschen Schmerzerkrankung, die durch neuropathischen Schmerz gekennzeichnet ist, wenn die Verbindung einem Individuum an der Stelle der Progression der Verletzung des Nervs verabreicht wird. Das Omega-Conopeptid ist durch seine Fähigkeit gekennzeichnet, (a) elektrisch stimulierte Kontraktion des Meerschweinchen-Ileums zu verhindern und (b) selektiv an die Omega-Conopeptid-MVIIA-Bindungsstelle, die in Nervengewebe vorhanden ist, zu binden, was durch die Fähigkeit der Verbindungen, MVIIA von der Stelle zu verdrängen, ersichtlich wird.
Nach bevorzugten Ausführungsformen ist das im Medikament verwendete Omega-Conopeptid weiterhin gekennzeichnet durch
(i) Aktivitäten für jene Kontraktionshemmung des Meerschweinchen-Ileums und die selektive Bindung an einer MVIIA-Bindungsstelle, die im Bereich jener Aktivitäten der Omega-Conotoxine MVIIA und TVIA liegen;
(ii) Aktivität für selektive Bindung an der MVIIA-Bindungsstelle, die durch ein Selektivitätsverhältnis von Bindungsaffinität für die MVIIA-Bindungsstelle zur Bindungsaffinität für eine "Stelle 2"-Omega-Conopeptid-Bindungsstelle, die innerhalb des Bereiches der Selektivitätsverhältnisse liegt, die für die Omega- Conopeptide MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX-236, SNX-239 und TVIA/SNX- 185 bestimmt wurden, ersichtlich wird;
(iii) Einschluss eines Antioxidans, das Methionin-Oxidation wirksam verhindert;
(iv) Verwendung durch perineurale Verabreichung zur Hemmung von Progression einer neuropathischen Schmerzerkrankung an der Stelle eines verletzten Nervs; oder
(v) Auswahl aus den Omega-Conopeptiden TVIA/SNX-185, MVIIA/SNX-111, SNX- 236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, SNX-279 und Derivaten hiervon.
In einem weiteren Aspekt umschließt die Erfindung eine stabile Omega-Conopeptid- Formulierung, die ein Omega-Conopeptid und eine antioxidierende Karboxylsäure-Puffer- Zusammenstellung umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Karboxylsäure- Puffer ein Lactat-Puffer und kann auch freies Methionin einschließen.
In einem weiteren Aspekt umschließt die Erfindung die Verwendung eines spannungsempfindlichen N-Typ-Calciumkanal-blockierenden Omega-Conopeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung von Analgesie in einem Individuum durch epidurale Verabreichung. Das in diesem Medikament verwendete Omega-Conopeptid hat die gleichen in vitro-Aktivitäten wie vorstehend beschrieben. Das epidurale Medikament wird in einer Dosierung gegeben, die im Bereich einer wirksamen intrathekalen analgetischen Dosierung liegt, die über einen äquivalenten Zeitraum verabreicht wird. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Omega-Conopeptid, das zur Verwendung im Medikament ausgewählt ist, durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:
(i) ein Selektivitätsverhältnis der Bindung an eine MVIIA-Bindungsstelle und der Bindung an eine "Stelle 2"-Omega-Conopeptid-Bindungsstelle, die innerhalb des Bereiches der Selektivitätsverhältnisse liegen, die für die Omega-Conopeptide MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX-236, SNX-239 und TVIA/SNX-185 bestimmt wurden;
(ii) Einschluss eines Omega-Conopeptids, ausgewählt aus der aus MVIIA/SNX-111, TVIA/SNX-185, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, SNX-279 und Derivaten hiervon bestehenden Gruppe in das Medikament;
(iii) Verabreichung des Medikaments durch kontinuierliche Infusion; oder
(iv) Einschluss einer Formulierung für anhaltende Freisetzung, um verlängerten Kontakt des Conopeptids mit der epiduralen Region zu bewirken.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das Medikament zur epiduralen Verabreichung eines oder mehrere der Omega-Conopeptide MVIIA/SNX-111, TVIA/SNX-185, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, SNX-279 und Derivaten hiervon einschließen.
In wieder anderen, verwandten Ausführungsformen umschließt die Erfindung das Omega- Conopeptid SNX-273, das die Sequenz CKGKGAKCSRLAYDCCTGSCRSGKC aufweist. Die Erfindung umschließt auch ein Omega-Conopeptid SNX-279, das die Sequenz CKGKGAKCSRLM(O)YDCCTGSCRSGKC aufweist, wobei M(O) einen oxidierten Methionin-Rest bezeichnet. Diese beiden Conopeptide haben analgetische Eigenschaften und sind zum Einschluss in die vorstehend beschriebenen Medikamente geeignet.
Diese und andere Gegenstände und Aspekte der Erfindung werden besser ersichtlich, wenn die nachstehende genaue Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 und 2 zeigen Primärsequenzen von einigen natürlichen Omega-Conopeptiden, MVIIA/SNX-111 (SEQ. ID. NR: 01), MVIIB/SNX-159 (SEQ. ID. NR: 02), GVIA/SNX-124 (SEQ. ID. NR: 03), GVIIA/SNX-178 (SEQ. ID. NR: 04), RVIA/SNX- 182 (SEQ. ID. NR: 05), SVTA/SNX-157 (SEQ. ID. NR: 06), TVIA/SNX-185 (SEQ. ID. NR: 07), SVIB/SNX-183 (SEQ. ID. NR: 08) und MV11C/SNX-230 (SEQ. ID. NR: 29) und SNX-231 (SEQ. ID. NR: 21);
Fig. 3 und 4 zeigen Primärsequenzen von MVIIA/SNX-111, einschließlich seiner Disulfidbrücken und die SNX-111-analogen Omega-Conopeptide SNX-190 (SEQ. ID. NR: 09), SNX-191 (SEQ. ID. NR: 10), SNX-193 (SEQ. ID. NR: 11), SNX-194 (SEQ. ID. NR: 12), SNX-195 (SEQ. ID. NR: 13), SNX-196 (SEQ. ID. NR: 14), SNX-197 (SEQ. ID. NR: 15), SNX-198 (SEQ. ID. NR: 16), SNX-199 (SEQ. ID. NR: 33), SNX-200 (SEQ. ID. NR: 17), SNX-201 (SEQ. ID. NR. 18), SNX-239 (SEQ. ID. NR: 32), SNX-240 (SEQ. ID. NR: 34) , SNX-273 ([ala¹²-SNX-111; SEQ. ID. NR: 35) und SNX-279 (Met(0)¹²-SNX-111; SEQ. ID. NR: 36), wobei Nle Norleucin bezeichnet und Met(O) eine Sulfoxy-Methionin-Substitution bezeichnet;
Fig. 5 zeigt das SVIB/SNX-183-Analog SNX-202 und die TVIA/SNX-185-Analoga SNX- 201 und SNX-236;
Fig. 6 zeigt die Omega-Conopeptid-Gruppierungen: I: MVIIA, SNX-199 (SEQ. ID. NR: 33), MVIIB und SNX-239 (SEQ. ID. NR: 32), II: TVIA, SNX-207 und SNX-236 und III: RVIA, SVIA, GVIIA, SVIB, MVIIC, SNX-231;
Fig. 7 zeigt spannungsabhängige Calciumstrom-Ableitungen, hervorgerufen durch eine Spannungsstufe in unbehandelten N1E-115-Neuroblastomzellen (Kurve a) und in Neuroblastomzellen, die steigenden Konzentrationen von MVIIA (SNX-111) ausgesetzt waren (Kurven b-d);
Fig. 8 zeigt Computer-generierte kompetetive Bindungskurven für Omega-Conopeptid- Bindung an die MVIIA (SNX-111)-Bindungsstelle in Synaptosomen des Rattenhirns;
Fig. 9 zeigt Computer-generierte kompetetive Bindungskurven für Omega-Conopeptid- Bindung an die MVIIC (SNX-230)-Bindungsstelle in Synaptosomen des Rattenhirns;
Fig. 10 zeigt analgetische Wirksamkeit einer SNX-111-Formulierung, die Methionin in Lactat-Puffer vereint;
Fig. 11 zeigt eine Verdrängungskurve der [¹²&sup5;I]SNX-111-Bindung an homogenisiertes Pia arachnoida-Material vom Affen durch [Nie¹²]SNX-111;
Fig. 12 zeigt Histogramme von Reizschwellen mechanischer Allodynie als % MPE zu verschiedenen Zeitpunkten nach epiduraler Bolus-Injektion von 30 ug SNX-111;
Fig. 13 zeigt Histogramme von Reizschwellen mechanischer Allodynie als % MPE nach 24, 72, 120 oder 168 Stunden kontinuierlicher Infusion von Kochsalzlösung oder 0,1 ug/Stunde SNX-111; und
Fig. 14 zeigt Histogramme von Reizschwellen mechanischer Allodynie als % MPE nach 24, 48 oder 72 Stunden konstanter epiduraler Infusion von Kochsalzlösung oder unterschiedlichen Mengen von SNX-111 in den spinalen, lumbalen epiduralen Spalt von Ratten.

Genaue Beschreibung der Erfindung

I. Definitionen:

Soweit nicht anders angegeben haben die nachfolgenden Ausdrücke folgende Definitionen:
"Schmerz" umschließt sowohl somatischen (nociceptiven) als auch neuropathischen Schmerz.
"somatischer Schmerz" und "nociceptiver Schmerz" werden austauschbar verwendet, und beziehen sich auf einen Schmerz, der seine Ursache in einem aus einer Reihe von noxischen oder schmerzvollen Reizen mit Ursprung in der Haut, dem darunter liegenden Gewebe oder den inneren Organen hat, und die periphere nociceptive afferente C- und A-Fasern aktivieren, die zur dorsalen Wurzel des Rückenmarks feuern, und die mit afferenten Fasern zu bestimmten Hirnregionen Synapsen bilden.
"Neuropathischer Schmerz" entsteht aus Verletzung oder chronischen Veränderungen von peripheren oder zentralen somatosensorischen Schaltkreisen komplexer und variabler Etiologie.
Die zugrunde liegende Schädigung eines peripheren Nervs, die neuropathischen Schmerz hervorruft, lässt sich typischerweise einem Trauma oder einer Verletzung eines peripheren Nervs, Nervenplexus oder des den Nerv umgebenden weichen Gewebes zuordnen. Neuropathischer Schmerz kann auch die Folge von einer oder einer Reihe von zugrunde liegenden Krankheiten sein, einschließlich Krebserkrankung, degenerativer Knochenkrankheiten und AIDS. Dieser Schmerztyp kann sich in einer Reihe von Formen äußern, wie vorstehend diskutiert; er umschließt allerdings typischerweise Überempfindlichkeit auf sensorische Reize, was von einer ständigen Schmerzempfindung in der betroffenen Region begleitet sein kann. Diese unterschiedlichen zugrunde liegenden Ursachen von neuropathischem Schmerz werden zusammenfassend als "neuropathische Schmerzerkrankungen" bezeichnet.
"Progression einer neuropathischen Schmerzerkrankung" bezieht sich auf die Verschlimmerung der Symptome des neuropathischen Schmerzes mit der Zeit. Man sagt, dass eine therapeutische Behandlung die Progression neuropathischer Schmerzerkrankungen hemmt oder rückgängig macht, wenn sie die Verschlimmerung solcher Symptome hemmt oder verhindert. Spezielle Beispiele neuropathischer Schmerzerkrankungen umschließen zentrale Neuropathien, wie sie durch Verletzung des Rückenmarks verursacht werden können, periphere Neuropathien, wie etwa Reflex-sympathische Dystrophie (RSD), Herpes zoster-Neuropathie und diabetische Neuropathie, Neuropathien als Folge von Verletzung peripherer Nerven, wie auch neuropathischer Schmerz, der unbekannte Ursachen hat, aber mit den klassischen Symptomen neuropathischen Schmerzes in Erscheinung tritt, wie etwa Hyperesthesie, Allodynie und Hyperalgesie, sind aber nicht auf diese begrenzt.
"Perineurale Verabreichung" bedeutet Applizierung des therapeutischen Agens in oder in die Umgebung eines Nervs, besonders eines beschädigten Nervs.
"Epidurale Verabreichung" bezieht sich auf die Verabreichung einer Verbindung in den epiduralen Zwischenraum, definiert als die Region zwischen der Dura mater und der Arachnoid-Membran, die das Rückenmark im Rückenmarkskanal umgibt.
"Intrathekale Verabreichung" bezieht sich auf die Verabreichung einer Verbindung in den subarachnoidalen Zwischenraum des Rückenmarks zwischen der Arachnoid-Membran und der Pia mater, die das Rückenmark umgeben.
Verabreichung eines Medikaments "an der Stelle der Progression einer Nervenverletzung" umschließt alle Verfahren, die das Medikament in enger Nachbarschaft zu einem afferenten Nerv, Ganglion, spinalen Synapsen oder der Region betroffenen Gewebes platzieren. Arten der Verabreichung, die von diesem Ausdnuck eingeschlossen sind, schließen perineurale, epidurale, intrathekale und intravenöse Verabreichung ein, sind aber nicht auf diese begrenzt.
Der Begriff "aktive Omega-Conopeptide" bezieht sich auf Peptide, die (a) spannungsempfindliche Calciumkanäle vom N-Typ blockieren, (b) sich bestimmten strukturellen Bedingungen anpassen und (c) spezielle in vitro-Eigenschaften aufweisen, nämlich (i) Hemmung von elektrisch stimulierten Kontraktionen des Meerschweinchen-Ileums und (ii) Bindung an MVIIA-Bindungsstellen in neuronalen Membranen. Die Peptide haben eine Länge von 25-35 Aminosäuren und unterliegen anderen Sequenz-Zwängen, wie im Abschnitt IIA hierin beschrieben. Die in vitro-Aktivitäten liegen bevorzugt innerhalb des Bereichs der Aktivitäten, die für die Omega-Conopeptide MVIIA und TVIA in den entsprechenden Untersuchungen gemessen wurden.

II. Herstellung eines therapeutischen Medikaments

Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung einer Omega-Conopeptid-Verbindung zur Verwendung für die Hemmung der Progression einer neuropathischen Schmerzerkrankung im Einklang mit der Erfindung.

A. Aktive Omega-Conopeptide

Omega-Conopeptide sind Bestandteile oder Derivate von Peptid-Toxinen von Meeresschnecken der Gattung Conus, die als Calciumkanal-Blocker wirken (Gray et al., 1988). Die Primärsequenz der acht natürlich vorkommenden Omega-Conopeptide werden in den Fig. 1 und 2 dargestellt, wobei SNX-231 eine alternative Form von MVIIC/SNX-230 ist. Für die Aminosäure-Reste werden die üblichen Anfangsbuchstaben verwendet, und X steht für 4-Hydroxyprolin, auch mit 4Hyp abgekürzt. Alle in der Abbildung gezeigten Peptide sind an ihren C-Termini amidiert.

1. Strukturelle Kennzeichen von aktiven Omega-Conopeptiden

Omega-Conopeptide, die zur Bildung von Medikamenten der vorliegenden Erfindung nützlich sind, unterliegen bestimmten physikalischen und chemischen Zwängen, wie nachstehend beschrieben. Grundsätzlich haben Omega-Conopeptide, die in der Behandlungsmethode nützlich sind, eine Länge von 25-35 Aminosäuren und besitzen drei Disulfid-Bindungen an bestimmten Positionen. Dieser Abschnitt liefert weitere Anleitung zur Auswahl von analgetischen Omega-Conopeptiden; es wird jedoch angemerkt, dass sich die nachstehend angegebenen Richtlinien auf die zukunftsweisenden in vitro Untersuchungen beziehen, die hierin beschrieben werden.
Basierend auf einer Analyse der Sequenzhomologie der Peptide, deren Sequenzen vollständig bekannt sind (Fig. 6), können die natürlich auftretenden Omega-Conopeptide in zwei abgegrenzte Gruppen I und II unterteilt werden, von denen jede für diese Gruppe kennzeichnende interne Homologien aufweist, wie aus Fig. 6 ersehen werden kann. Eine dritte Gruppe umschließt die inaktiven Peptide SNX-231, und SVIA (SNX-157) und Omega-Conopeptide, deren Bindungsaktivitäten für die MVIIA-Stelle auf neuronalen Membranen und/oder die Aktivität für die Hemmung von Norepinephrin außerhalb des Bereichs der aktiven Verbindungen liegen.
Die drei Gruppen der Omega-Conopeptide sind in Fig. 6 aufgeführt, ausgerichtet nach ihren sechs Cys-Resten, wodurch diese Reste an den Positionen 1, 8, 15, 16, 20 und 28 platziert sind. Um diese Ausrichtung vorzunehmen, wurden Lücken an den gezeigten Positionen in den drei Gruppen eingeführt. In der nachstehenden Analyse behalten die Lücken ihre in der Abbildung angegebene Nummer, selbst wenn sie Deletionen von Aminosäuren in den entsprechenden Gruppen aktiver Omega-Conopeptide darstellen.
Sequenzvariationen, die allein auf der Primärstruktur beruhen, wurden mit der Annahme der folgenden Voraussetzungen analysiert:
1. Die Peptide in beiden aktiven Gruppen (I und II) schließen die Cys-Reste an Position 1, 8, 15, 16, 20 und 28 ein.
2. Die Peptide in den aktiven Gruppen schließen drei Disulfid-Bindungen ein, die die Cys- Reste an den Positionen 1 und 16, 8 und 20 und 15 und 28 verbinden. Diese Voraussetzung schließt Aminosäure-Variationen an anderen Positionen, die die Bildung dieser drei ausgewählten Brücken unmöglich machen oder in anderer Weise behindern, aus.
3. Innerhalb der Gruppe I sind die Aminosäure-Variationen, die an den sieben nicht festgelegten Resten auftreten, erlaubt und schließt Peptide ein, bei denen das Carboxyl- Ende amidiert ist oder als freie Säure vorliegt. Das heißt, die Derivate der Verbindungen der ersten Gruppe umschließen die Peptidstrukturen, die folgende Form haben: C K G K G A-X&sub1;-C-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;-X&sub5;-Y D C C T G S C-X&sub6;-R-X&sub7;-G K C-t, dabei ist X&sub1; = K oder S; X&sub2; = S oder H; X&sub3; = R, L oder A; X&sub4; = L oder T; X&sub5; = M oder S; X&sub6; = N oder eine Deletion; X&sub7; = S oder Deletion und t = eine Carboxyl- oder amidierte Carboxyl-Endgruppe.
4. Innerhalb der Gruppe II sind die Aminosäure-Variationen, die an den vier nicht festgelegten Resten auftreten, erlaubt, und schließen Peptide ein, deren Carboxyl-Ende amidiert ist oder als freie Säure vorliegt. Daher umschließen die Derivate der zweiten Gruppe die Peptidstrukturen, die folgende Form haben:
C L S X G S S C S-X&sub1;X&sub2;X&sub3;-Y N C C R S C N-X&sub4;-Y S R K C R-t, dabei ist X&sub1; = X oder R; X&sub2; = T oder L; X&sub3; = S oder M, X&sub4; = X oder P; und t= eine Carboxyl- oder amidierte Carboxyl-Endgruppe.
5. Betrachtet man beide aktiven Gruppen zusammen, bleiben die Aminosäurepositionen, die in allen aktiven Arten erhalten werden, unverändert. So bleiben zum Beispiel das Glycin an Position 5, das Tyrosin an Position 13, das Serin an Position 19 und das Lysin an Position 26 alle unverändert. Bevorzugte OCT-Analoge oder Derivate können zum Zweck der Intersequenz-Erhaltung und Substitution ausgewählt werden, indem man jene Sequenzen, die bekanntermaßen aktiv sind, miteinander vergleicht.
6. Betrachtet man beide Gruppen zusammen, gibt es Aminosäurepositionen, die innerhalb des Bereichs der aktiven Formen variabel sein können. Zum Beispiel kann die Aminosäure an Position 2 Lysin oder Leucin sein, die Aminosäure an Position 3 kann Glycin oder Serin sein und die Aminosäure an Position 4 Hydroxyprolin oder Arginin. Wenn die zwei oder mehr Aminosäuren einer variablen Position einer gemeinsamen Substitutionsklasse angehören, kann die Substitution innerhalb dieser Klasse zusätzlich bevorzugt sein. Standard-Substitutionsklassen sind die sechs Klassen, deren Einteilung auf gemeinsamen Eigenschaften der Seitenketten und höchster Substitutionsfrequenz bei natürlich vorkommenden homologen Proteinen beruht, was zum Beispiel durch eine Standard-Frequenz-Austauschmatix nach Dayhoff (Dayhoff) bestimmt wird. Diese Klassen sind Klasse I: Cys; Klasse II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala und Gly, die kleine aliphatische Seitenketten und OH-Gruppen-Seitenketten aufweisen; Klasse III: Asn, Asp, Glu und Gln, die neutrale und negativ geladene Seitenketten aufweisen, die Sauerstoffbrücken-Bindungen ausbilden können; Klasse IV: His, Arg, und Lys, die basisch polare Seitenketten aufweisen; Klasse V: Ile, Val, und Leu, die verzweigte aliphatische Seitenketten aufweisen und Met; und Klasse VI: Phe, Tyr und Trp, die aromatische Seitenketten aufweisen. Zusätzlich kann jede Gruppe verwandte Aminosäure-Analoge enthalten, wie etwa Ornithin, Homoarginin, N-Methyl-Lysin, Dimethyl-Lysin oder Trimethyl-Lysin in Klasse IV und ein halogeniertes Tyrosin in Gruppe VI. Weiter können die Klassen die beiden L- und D-Stereoisomere enthalten, obwohl L-Aminosäuren bei Substitutionen bevorzugt werden.
7. Betrachtet man die bekannten inaktiven Arten (Gruppe III), können Substitutionen von Aminosäuren, die in den inaktiven Arten, nicht aber in den aktiven Arten vorkommen, an jeder gewählten Position den Erhalt der Aktivität in den aktiven Bestandteilen nicht gewährleisten.
Die vorstehenden Regeln 6-7 zur Auswahl von Aminosäuren sind als Anleitung für erlaubte Substitutionen von Aminosäuren innerhalb von aktiven Omega-Conopeptiden gedacht. Wurde eine Aminosäure-Substitution oder -Modifikation vorgenommen, wird das Peptid im Folgenden auf die unerlässlichen in vitro-Eigenschaften durchmustert, die durch die vorliegende Erfindung identifiziert wurden und mit deren Hilfe die antagonistische Calciumkanal-Aktivität vorausgesagt werden kann, und auf die unerlässlichen in vivo- Aktivitäten in geeigneten Schmerzmodollen beim Tier.

2. In vitro und pharmakologische Eigenschaften von aktiven Omega-Conopeptiden

Dieser Abschnitt beschreibt die in vitro-Eigenschaften von aktiven Omega-Conopeptiden. Aktive Omega-Conopeptide (i) blockieren spannungsempfindliche N-Typ-Calciumkanäle, (ii) binden selektiv spezifisch an die Omega-Conopeptid MVIIA- (Stelle 1) Bindungsstelle in neuronalen Membranen und (iii) hemmen die Freisetzung von Neurotransmittern im Kontraktionstest am Meerschweinchen-Ileum, wie nachstehend diskutiert.

a. Antagonistische Calciumkanal-Aktivität

Aktive Omega-Conopeptide hemmen den Durchtritt von Calcium-Ionen durch spannungsempfindliche N-Typ-Calciwnkanäle (VSCC). Die Blockierung von N-Typ-VSCC kann in einem isolierten Zellsystem gemessen werden, wie etwa der mausstämmigen Neuroblasten-Zelllinie Stamm N1E115 oder der menschlichen Neuroblasten-Zelllinie IMR32, wie im US-Patent Nr. 5.364.842 beschrieben. N-Typ-Calciumströme werden durch das Omega-Conopeptid MVIIA blockiert, nicht aber durch Dihydropyridine. Membranströme werden gewöhnlich mit dem gesamten Zellaufbau der Patch-clamp-Methode gemessen, entsprechend des in Beispiel 1 angeführten Verfahrens.
Fig. 7 zeigt die Ableitung eines Calciumeinstroms, hervorgerufen durch einen Spannungsprung von -80 mV auf -20 mV, wobei Calcium (Ca) durch Barium (Ba) als Ladungsträger durch die Calciumkanäle ersetzt wurde (McCleskey, E. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 4327-31 (1987). Kurve a zeigt eine Kontrollableitung bei Anwesenheit von Nifedipin, einem Blocker von L-Typ-Calciumkanälen, was keine Auswirkung auf die Strömungseigenschaften des Kanals hatte. Kurven b-d zeigen Blockierungen des Kanals durch Zugabe des Omega-Conopeptides MVIIA in ansteigenden Konzentrationen. Die in den Medikamenten der vorliegenden Erfindung verwendeten Conopeptide blockieren diesen Einstrom gleichfalls.

b. Bindung an Omega-Conopeptid-Rezeptoren mit spezifischer, hoher Affinität

Ein Kennzeichen aktiver Omega-Conopeptide ist ihre Fähigkeit, sich an eine spezifische Population von Bindungsstellen, die hauptsächlich in Nervengewebe vorkommen, zu binden. Dihydropyridine und andere Blocker von Kanälen des L-Typs verdrängen Omega-Conotoxin- Bindungen von diesen Stellen nicht.
Diese Bindungsaffinität kann entweder durch die Bindungskonstante der Verbindung für die Hoch-Afflnitäts-MVIIA-(SNX-111) Bindungsstelle, hierin auch als "Stelle 1" bezeichnet, charakterisiert werden und/oder durch die Bindungskonstante der Verbindung für die Hoch- Affinitäts-SVIB- (SNX-183) oder die MVIIC-(SNX-230) Bindungsstelle, hierin auch als "Stelle 2" bezeichnet. Kennzeichen dieser beiden speziellen Bindungsstellen werden nachstehend zusammengefasst. Es ist ebenfalls sinnvoll, Omega-Conopeptide nach dem Verhältnis ihrer Bindungskonstanten, gemessen für die Bindung an die beiden Bindungsstellen, zu charakterisieren.
Die Bindung an die MVIIA-Bindungsstelle im Nervengewebe kann an einer Reihe von Zelltypen und synaptosomatiaschen Zellfraktionen gezeigt werden. Eine bevorzugte synaptosomale Fraktion ist eine synaptosomale Membranpräparation aus Säugerhirn, wie etwa die hierin in Beispiel 2 beschriebene synaptosomale Präparation aus Rattenhirn. Die Bindungskonstante einer Verbindung für die MVIIA-Bindungsstelle wird typischerweise mit einem kompetitiven Verdrängungstest ermittelt, worin eine Testverbindung mit radiomarkiertem MVIIA (SNX-111) um die Bindung an der synaptosomalen Präparation konkurriert.
Unter Anwendung der herkömmlichen Scatchard-Analyse für ein Experiment zur Sättigungsbindung im Gleichgewicht wurde für die Bindung vom Omega-Conopeptid MVIIA an synaptosomale Membranen von Raffen eine Kd-Bindungskonstante von annähernd 10 pM errechnet. In ähnlicher Weise wurden Kd-Werte für die Bindung von radiomarkiertem SVIB (SNX-183) und MVIIC (SNX-230) an Bindungsstellen in synaptosomalen Membranen ermittelt.
Um die Bindungskonstante für eine N-Typ-VSCC-blokckierende Testverbindung zu bestimmen, wird die Testverbindung in steigenden Konzentrationen zu einer Membranpräparation, wie etwa einer synaptosomalen Präparation, in Anwesenheit einer standardisierten Konzentration von radiomarkiertem Omega-Conopeptid MVIIA (SNX-111) zugegeben. Das synaptosomale Material wird darauf schnell gefiltert, gewaschen und auf gebundene Radiomarkierungen untersucht. Bindungskurven kompetitiver Verdrängung, wie in Fig. 8 für die Verdrängung von MVIIA-Bindung gezeigt, werden analysiert, um zuerst den IC&sub5;&sub0;-Wert der Verbindung für die MVIIA-Bindungsstelle zu bestimmen, d. h., die Konzentration, die 50% Verdrängung von markiertem MVIIA-Peptid ergibt. Ein Ki wird nach Standardverfahren aus dem Kd-Wert von MVIIA und dem IC&sub5;&sub0;-Wert der Verbindung bestimmt, wie in Beispiel 2 ausgeführt. Ein relativer Potenzwert kann ebenfalls aus diesen Daten, wie beschrieben, errechnet werden. Wie der Ki-Wert erlaubt dieser Wert den Vergleich zwischen Untersuchungen, die unter leicht unterschiedlichen Bedingungen oder zu verschiedenen Zeiten durchgeführt wurden. Während der spezielle IC&sub5;&sub0;-Wert für eine bestimmte Verbindung von Präparation zu Präparation unterschiedlich sein kann, sollte bei den Experimenten die Rangordnung der Bindungsaffinitäten zwischen den Verbindungen im Wesentlichen unverändert bleiben. Beim Testen einer Verbindung, ob sie sich für die Aufnahme in ein Medikament der vorliegenden Erfindung eignet, wir die Potenz einer Verbindung innerhalb einer gegebenen Präparation mit Standardverbindungen (wie etwa MVIIA und GVIA) verglichen, um zu bestimmen, ob die Verdrängung der MVIIA-Bindung von der Testverbindung in einem Potenzbereich liegt, der für die Verfahren der Erfindung als nützlich angesehen wird, wie nachstehend diskutiert.
Berechnete IC&sub5;&sub0;-Werte für eine Reihe von Omega-Conopeptiden für die Bindung von MVIIA (SNX-111) an eine MVIIA- ("Stelle 1") Bindungsstelle in einer synaptosomalen Präparation von Ratten werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Verbindungen sind nach steigenden IC&sub5;&sub0;-Werten geordnet, wobei niedrigere Werte mit höherer Affinität für die Bindungsstelle verbunden sind.

Tabelle 1

KOMPETITION VON ¹²&sup5;I-MVIIA (SNX-111)-BINDUNG DURCH OMIEGA-CONOPEPTIDE

IC&sub5;&sub0; (nM)
SNX-207 .007
SNX-194 .008
SNX-195 .009
MVIIA(SNX-111) .010
SNX-190 .027
SNX-236 .030
SNX-200 .039
SNX-201 .046
SNX-202 .046
SNX-193 .070
SNX-194 .090
SNX-239 .090
MVIIC(SNX-230) .32
MVIIB(SNX-19) .101
GVIA(SNX-124) .134
SNX-198 .160
SNX-191 .165
TVIA(SNX-185) .228
SNX-196 .426
RVIA(SNX-182) .893
SVIB(SNX-183) 1.5
GVIIA(SNX-178) 3.70
SNX-197 11.3
SVIA(SNX-157) 1460.
In ähnlicher Weise können die IC&sub5;&sub0;-Werte und Ki-Werte der Verbindung für die Bindung an die "Stelle 2" (SVIB/SNX-183 oder MVIIC/SNX-230) -Bindungsstelle berechnet werden, indem, wie vorstehend, der Kd-Wert der Bindung von markiertem SVIB (SNX-183) oder MVIIC (SNX-230) an einer synaptosomalen Präparation bestimmt wird, um dann mit Hilfe der kompetitiven Verdrängung der markierten Verbindung durch die zu testende Verbindung die IC&sub5;&sub0;-Werte und Ki-Werte oder relativen Potenzwerte der zu testenden Verbindung zu bestimmen. Fig. 9 zeigt Computergestützte Kurven für die kompetitive Bindung verschiedener Omega-Conopeptide, deren Bindung an die SVIB- (SNX-183) und/oder MVIIC- (SNX-230) Bindungsstellen untersucht worden war. Aus diesen Kurven wurden die IC&sub5;&sub0;-Werte bestimmt.
Die Tabellen 2 und 3 listen die relativen Potenzen für die Bindung verschiedener Omega- Conopeptide an die "Stelle 1"- und "Stelle 2"-Bindungsstellen auf. Diese Daten zeigen, wie entweder die Ki-Werte (Tabelle 2) oder die IC&sub5;&sub0;-Werte (Tabelle 3) verwendet werden können, um die Selektivitätsverhältnisse für die Bindung an diese Stellen zu berechnen.
Im Allgemeinen werden Omega-Conopeptide, die für die Herstellung der Medikamente der vorliegenden Erfindung nützlich sind, Bindungsaffinitäten für die MVIIC-Bindungsstelle aufweisen oder ein Selektivitätsverhältnis für die MVIIC-Bindungsstelle in Bezug auf die "Stelle 2", das innerhalb des Bereiches der Affinitäten liegt, die für die Omega-Conopeptide MVIIA und TVIA bestimmt wurden. Noch allgemeiner wird der Bereich der Selektivitätsverhältnisse von den Omega-Conopeptiden MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX- 236, SNX-239 und TVIA/SNX-185 bestimmt. Tabelle 2 SELEKTIVITÄT VON CONOPEPTIDEN FÜR "STELLE 1" UND "STELLE 2"
aKi-Werte wurden aus der Analyse der kompetitiven Bindung erhalten, die durchgeführt wurde wie in Fig. 8 beschrieben.
bSelektivität wird ausgedrückt als das Verhältnis des Ki-Wertes, der für die Verdrängungskonkurrenz mit [¹²&sup5;I]-SNX-230-Bindung mit hoher Affinität bestimmt wurde, geteilt durch den Ki-Wert für die Konkurrenz mit der [¹²&sup5;I]-SNX-111-Bindung. Tabelle 3 SELEKTIVITÄT VON CONOPEPTIDEN FÜR STELLE 1 UND STELLE 2
aSelektivität wird ausgedrückt als das Verhältnis des IC&sub5;&sub0;-Wertes, bestimmt für die Bindungskonkurrenz mit [¹²&sup5;I]-SbNX-230, geteilt durch den IC&sub5;&sub0;-Wert für die Bindungskonkurrenz mit [¹²&sup5;I]-SNX-111.

c. Selektive Hemmung der Freisetzung von Neurotransmittern

Aktive Omega-Conopeptide hemmen auch die Freisetzung von Neurotransmittern in verschiedenen Regionen des Nervensystems. Neurotransmitter, die gemessen werden können, umschließen im Einklang mit verschiedenen Aspekten der vorliegendem Erfindung Dopamin, Norepinephrin, Acetylcholin, GABA, Glutamat und eine Reihe von Peptid-Neurotransmittern wie etwa Calcitonin-Gen reguliertes Peptid, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Isolierte Gewebeuntersuchungen sind die traditionellen pharmakologischen Verfahren, um Folgen der Freisetzung von Neurotransmittern zu messen. Eine solcher Präparationen ist das Meerschweinchen-Ileum, bei dem die Hemmung von elektrisch stimulierten Kontraktionen mit der Hemmung der Freisetzung von Acetylcholin korreliert. Beispiel 4 beschreibt die Präparation und Untersuchung im Detail. Tabelle 4 zeigt die IC&sub5;&sub0;-Werte für verschiedene Omega-Conopeptide für die Kontraktion des Meerschweinchen-Ileums als Reaktion auf elektrische Reizung. Die aktiven Omega-Conopeptide SNX-111 und SNX-185 hemmen solche Kontraktionen am wirksamsten, während die inaktiven Verbindungen SNX-183 und SNX-157 wesentlich weniger wirksam sind.

Tabelle 4

EINFLUSS VON CONOPEPTIDEN AUF ELEKTRISCH STIMULIERTE KONTRAKTION DES MEERSCHWEINCHEN-ILEUMS

Verbindung IC&sub5;&sub0;-Wert (nM)
SNX-111 13
SNX-185 29
SNX-183 91
SNX-157 > 100
Zusammenfassend zeigen die VSCC des N-Typs blockierenden Omega-Conopeptide, die für die Herstellung von Medikamenten der vorliegenden Erfindung nützlich sind, bestimmte in vitro und pharmakologische Eigenschaften der Hemmung von elektrisch stimulierten Kontraktionen des Meerschweinchen-Ileums und der selektiven Bindung an MVIIA- Bindungsstellen in neuronalem Gewebe, wie dies für die Omega-Conopeptide MVIIA/SNX- 111, TVIA/SNX-185, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273 und SNX-279 beobachtet wurde.
Sind die aktiven Omega-Conopeptide erst einmal nach den vorstehenden in vitro-Kriterien zur Verwendung in einem Medikament ausgewählt, können sie mit jedem einzelnen aus einer Reihe von experimentellen Tiermodellen der Neuropathie getestet werden, um die Dosierungsbereiche für Menschen zu bestimmen.

B. Herstellung von Omega-Conopeptiden

Omega-Conopeptide können mit herkömmlichen synthetischen Verführen hergestellt oder aus natürlichen Quellen isoliert werden. Synthetische und natürlich vorkommende Peptide, die die gleiche Sequenz haben, verhalten sich weitgehend identisch, wenn sie in den hierin beschriebenen Medikamenten eingesetzt werden. Alle der gezeigten Omega-Conopeptide haben drei Disulfid-Brücken, die die Cystein-Reste 1 und 4, 2 und 5 und 3 und 6 verbinden, wie es für das MVIIA-Peptid in Fig. 3 angegeben ist. Fig. 3-5 zeigen Analoge oder Derivate der natürlichen Omega-Conopeptide MVIIA, TVIA und SVIB die im Einklang mit der Erfindung synthetisiert und untersucht worden sind. In den Figuren werden die Standard-Abkürzungen für die einzelnen Aminosäuren verwendet; zusätzlich werden die folgenden Abkürzungen verwendet: X = Hydroxyprolin; Nle = Norleucin; Met(O) = Sulfoxy- Methionin; eine NH&sub2;-Gruppe am C-Ende zeigt an, dass das Peptid am C-Ende amidiert ist; G-OH bezeichnet die Terminierung mit einem unveränderten Glycin-Fest.
Viele Omega-Conopeptide sind über kommerzielle Quellen erhältlich (z. B. sind MVIIA, GVIA, MVIIC bei Bachem, Torrance, CA, erhältlich; SVIB ist bei Peninsula Laboratories, Belmont, CA, erhältlich). Omega-Conopeptide können auch mit herkömmlichen Einzelphasen-Verfahren, wie bereits beschrieben, synthetisiert werden (Olivera, B., et al., Biochemistry 23: 5087-5090 (1984); US-Patente Nr. 5.051.403 und 5.364.842). Die drei Disulfid-Brücken in den Peptiden können durch Luftoxidation unter Anwesenheit von Dithiothreitol (DTT) oder wahlweise anderen Thiol-beinhaltenden Verbindungen (z. B. Cystein, Glutathion) gebildet und weiter nach Verfahren gereinigt werden, die an anderer Stelle beschrieben sind (WO 9313128)

C. Omega-Conopeptid-Formulierungen

SNX-111-Lösungen, in denen die Peptidkonzentration weniger als etwa 0,1 mg/ml beträgt, oxidieren sofort, wenn sie in Wasser, Kochsalzlösung oder einer aus einer Reihe von den im Fachgebiet der Peptidchemie verwendeten Pufferlösungen gelöst werden. Solche Oxidation führt zu einer Reduktion oder dem Verlust der bioloschen Aktivität. Im Einklang mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass Omega- Conopeptide in Lösungen signifikant stabilisiert werden können, wenn die Oxidation von Methionin-Resten, die in der Peptidstruktur vorkommen, verhindert wird. Besonders SNX- 111, das ein Methionin an Position 12 enthält, ist etwa 10-fach weniger wirksam bei der Bindung an die Omega-Conopeptid-MVIIA-Bindungsstellen, wenn sein Methionin in der Sulfoxy-Form vorliegt.
In Experimenten, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, stellte sich heraus, dass Oxidation von SNX-111 durch die Zugabe von Carboxylsäure (Lactat-) Puffer zur Peptidlösung verhindert werden kann. SNX-111-Lösungen im Bereich von 0,01-0,1 mg/ml sind bei 45ºC für mehrere Wochen stabil, wenn sie mit Lactat (150 mM, pH-Wert 4-4,5) stabilisiert werden. Zusätzlich bewirken Pufferlösungen, die 50 ug/ml Methionin enthalten, ebenfalls eine Stabilisierung von SNX-111. Hier kann entweder 150 mM Lactat-Pufferlösung oder mit Säure versetzte Kochsalzlösung (pH-Wert 4-4,5) verwendet werden, um die Lösung abzupuffern.
Solche stabilen Formulierungen von Omega-Conopeptiden sind nützlich für die Lagerung oder bei der Verwendung von Verfahren, die eine langsame Infusion der Verbindung erfordern. Die Lösung kann direkt verabreicht oder vor der Verabreichung neutralisiert werden, entsprechend der jeweiligen Verabreichungsarten, in der die Formulierung verwendet wird. Zum Beispiel wurden etwa 10 ul SNX-111 in Laktat-Pufferlösung (150 mM, pH-Wert 4-4,5) direkt in das Rückenmark von Ratten (intrathekal) verabreicht, ohne dass ungünstige Wirkungen erkennbar waren. Fig. 10 stellt die Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass SNX-111, das in einer Methionin-Lactat-Formulierung verabreicht wurde, ebenso wirksam in der Verminderung von neuropathischem Schmerz ist wie SNX-111 allein.
Zusätzliche Formulierungen können Mittel enthalten, die zur Beschleunigung des Durchtritts des Conopeptids durch die Hirnhautgewebe, die den beschädigten oder Zielnerv umgeben, dienen Mittel zur Beschleunigung des Transports von Verbindungen sind in dem Fachgebiet bekannt und können Einkapselung des Conopeptids in liposomale Membranen, Zugabe eines Oberflächen-aktiven Stoffs zu der Verbindung, Zugabe eines Ionen bindenden Agens und dergleichen beinhalten. Transport durch die Hirnhäute kann auch erleichtet werden, indem dem Individuum eine hypertonisch dosierte Lösung verabreicht wird, die bewirkt, dass die Hirnhaut-Barrieren aufgehoben werden, nach den Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Alternativ kann transmeningnaler oder transkutaner Transport weiter erleichtert werden, indem man die Primärsequenz der Omega- Conopeptide verändert, zum Beispiel durch Substitution von neutralen Aminosäure- Seitenketten oder hydrophoben Einheiten durch kationische Reste.

III. Behandlungsmethoden

A. Medikamente zur Hemmung der Progression von neuropathischen Schmerzerkrankungen.

Es ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass die Progression neuropathischer Schmerzerkrankungen in einem Individuum gestoppt werden kann, das Symptome neuropathischen Schmerzes in frühem Stadium zeigt, indem dem Individuum ein aktives, VSCC des N-Typs blockierendes Omega-Conopeptid mit den vorstehend beschriebenen physikalischen und pharmazeutischen Eigenschaften verabreicht wird, besonders, wenn eine solche Verabreichung an der neuropathischen Stelle erfolgt.
Dieser Abschnitt beschreibt die verschiedenen Arten der Verabreichung, die zur Hemmung der Progression von neuropathischen Schmerzerkrankungen eingesetzt werden können. Dieser Abschnitt beschreibt auch ein exemplarisches Modell einer neuropathischen Schmerzerkrankung, charakterisiert durch Allodynie (Empfindlichkeit auf schwachen Reiz), in dem ein Omega-Conopeptid-Medikament eingesetzt wird, um die Progression der Erkrankung zu hemmen.

1. Hemmung der Progression von neuropathischem Schmerz

Das in Beispiel 5 beschriebene Ratten-Modell der Allodynie ist ein exemplarisches Modell einer neuropathischen Schmerzerkrankung. Dieses Modell liefert ein Beispiel, wie die Medikamente der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, um die Progression von neuropathischem Schmerz zu hemmen. Zusätzlich ist das Modell verwendet worden, um Zwischenfälle und therapeutische Wirkungen zur Hemmung der Progression von neuropathischem Schmerz zu bewerten.
In dem Modell wuchsen die Symptome des neuropathischen Schmerzes nach experimenteller Verletzung eines Nervs über die Tage 1-7 nach der Verletzung des Nervs an, danach zeigte sich ein Plateau der Schmerzantwort. Ein aktives Omega-Conopeptid, das in Übereinstimmung mit den in vorstehendem Abschritt II genannten Prinzipien ausgewählt wurde, wurde auf seine Fähigkeit bewertet, eine solche Progression von Neuropathie während der Tage 1-7 zu hemmen oder zu verhindern, indem dem Testindividuum die Verbindung direkt vor, während oder nach der Nervenverletzung verabreicht wurde. Reizschwellen-Schmerzreaktionen werden in einer standardisierten Vorgehensweise an den Tagen 1-7 oder länger nach der Verletzung gemessen. Eine solche Verabreichung von Omega-Conopeptid wird nach einem der im Unterabschnitt 2, nachstehend, beschriebenen Verfahren durchgeführt.
In diesem exemplarischen Modell wird die Hemmung der Progression der neuropathischen Schmerzerkrankung beobachtet, wenn, verglichen mit neuropathischen Kontrolltieren, eine erhöhte Reizschwelle auf den Schmerzreiz während der Tage 1-7 besteht, oder wenn es eine Verlängerung der Plateau-Zeit gibt.
Wirksame Dosierungen und Formulierungen, die in diesem Modell bestimmt wurden, können nach den im Fachgebiet wohlbekannten Verfahren auf Dosierungen für äquivalent große Tiere und Menschen extrapoliert werden.

2. Verabreichungsarten von Omega-Conopeptiden zur Hemmung der Progression von neuropathischen Schmerzerkrankungen

Dieser Abschnitt beschreibt verschiedene Arten der Verabreichung, die angewendet werden können, aktive Omega-Conopeptide an die Stelle der Progression neuropathischen Schmerzes zu bringen, um, im Einklang mit der vorliegenden Erfindung, eine solche Progression zu hemmen.
Perineurale Verabreichung. Medikamente, die VSCC des N-Typs blockierende Omega- Conopeptide enthalten, können perineural verabreicht werden, um Progression neuropathischer Schmerzerkrankungen zu verhindern. Hierbei werden die Verbindungen entweder direkt in den betroffenen Nerv verabreicht oder in die betroffenen Hautregionen, die durch Proliferation von Neuritenwachstum als Folge der Nervenschädigung gekennzeichnet sind. Zur Verabreichung in die betroffenen Hautregionen kann die Verbindung örtlich angewendet werden, entweder direkt oder mit Hilfe eines transdermalen Applikators.
Alternativ kann das Medikament subdermal in die Region des Nervs injiziert werden. In einer anderen Form der perineuralen Verabreichung wird eine Manschette um den beschädigten Nerv gelegt, wobei die Manschette aus einer biologisch abbaubaren Matrix besteht, die eine therapeutische N-Typ-Calciumkanal blockierende Verbindung enthält. Alternativ oder zusätzlich kann die therapeutische Verbindung in enge Nachbarschaft zu dem beschädigten Nerv platziert werden, indem die Verbindung an eine Nervenschiene, die zur Reparatur beschädigter Nerven entwickelt wurde, gebunden wird, oder die Nervenschiene mit der Verbindung ummantelt wird. Beispiele solcher Nervenschienen werden in den US-Patenten Nr. 4.534.349 und 4.920.962 gegeben. Perineurale Einbringung kann auch erreicht werden, indem aktive Omega-Conopeptide in Nahtmaterialien eingebunden werden, wie etwa in Nahtmaterial auf Collagenbasis, das im US-Patent Nr. 5.308.889 beschrieben ist. Dieses Material wird dann verwendet, um verletzte Gewebe zu nähen, etwa nach einem Trauma oder einer Operation.
Die Verbindung kann auch über transdermale Einbringung an perineurale Stellen gebracht werden. Allgemein beinhaltet transdermale Einbringung die Verwendung eines transdermalen "Pflasters", das eine langsame Freisetzung der Verbindung in einer bestimmten Hautregion erlaubt. Zur transdermalen Einbringung von Omega-Conopeptiden kann die transdermale Einbringung bevorzugt unter Verwendung iontophoretischer Verfahren durchgeführt werden, wie sie im US-Patent Nr. 5.032.109 (elektrolytisches transdermales Einbringungssystem) und im US-Patent Nr. 5.314.502 beschrieben werden. Es kann wünschenswert sein, Substanzen, die die Durchdringung verstärken, einzuschließen, wie etwa fettlösliche Substanzen (z. B. Alcan-Polyole wie Ethylenglycol, 1,3-Propandiol, Glycerin, Propylenglycol und dergleichen). Alternativ beschreibt das US-Patent Nr. 5.362 497 ein "super-Wasser-absorbierendes Harz", das transdermalen Formulierungen zugegeben werden kann, um die transdermale Einbringung noch einmal zu verstärken. Beispiele solcher Harze umschließen Polyacrylate, saponierte Venylacetat-Acrylsäureester-Copolymere, vernetzte Polyvenylalkohol-Maleinanhydrid- Copolymere, saponierte Polyacrylnitril-Transplantat-Polymere, Stärke-Acrylsäure- Transplantat-Polymere und dergleichen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Solche Formulierungen können auch in Verbänden für die interessierende Region eingeschlossen verwendet werden.
Für eine verzögerte Freisetzung kann die VSCC des N-Typs blockierende Verbindung in eine pharmazeutische Zusammenstellung eingebunden sein, die für langsame Freisetzung formuliert wurde, wie etwa in aus biologisch abbaubaren Polymeren gebildeten Mikrokapseln, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Zur gleichmäßigen Freisetzung von Peptiden kann das Peptid kovalent an ein wasserlösliches Polymer gebunden sein, wie ein Polylactid oder biologisch abbaubares Hydrogel, das von einem amphipatischen Block-Copolymer abstammt, wie im US- Patent Nr. 5.320.840 beschrieben. Matrix-Implantate auf Collagenbasis, wie im US-Patent Nr. 5.024 841 beschrieben, sind ebenfalls nützlich für eine verzögerte Abgabe von therapeutischen Peptiden. Ebenfalls nützlich, besonders für die subdermale langsame Freisetzung in perineurale Regionen, ist eine Zusammenstellung, die ein biologisch abbaubares Polymer enthält, das selbstheilend ist, und das ein Implantat in situ bildet, nachdem es in flüssiger Form verabreicht wurde. Eine solche Zusammenstellung ist zum Beispiel im US-Patent Nr. 5.278.202 beschrieben.
Obgleich die Dosierungen je nach den physikalischen Eigenschaften des einzelnen Patienten unterschiedlich sein werden, sollte eine Dosis so gewählt werden, dass eine Abgabe zwischen 1 und 100 ug/g Gewebe in der betroffenen Region gewährleistet ist.
Intrathekale Verabreichung. Medikamente der vorliegenden Erfindung können auch in jene Regionen des Rückenmarks verabreicht werden, in denen die polysynaptische Verstärkung des Schmerzereignisses stattfindet, wie etwa die Regionen des dorsalen Horns auf der Höhe der betroffenen Wirbel. Diese Art lokaler Verabreichung kann durch intrathekale Verabreichung erreicht werden, wie in dem Patent WO 93/13128 beschrieben.
Aktive Omega-Conopeptide können intrathekal durch langsame Infusion verabreicht werden. In dem Fachgebiet sind eine Reihe von implantierbaren oder am Körper tragbaren Pumpen bekannt, die eine Verbindung in regulierbarer Rate freisetzen können. Eine solche Pumpe, im US-Patent Nr. 4.619.652 beschrieben, ist eine am Körper tragbare Pumpe, die eingesetzt werden kann, um eine Verbindung in einer tonischen Flussrate oder in periodischen Pulsen freisetzen kann. Wenn das aktive Omega-Conopeptid MVIIA Menschen über den intrathekalen Weg in gleichmäßigem Fluss verabreicht wird, können Dosierungen erforderlich sein, die etwa im Bereich von 0,1-500 ng/kg/h liegen, um eine therapeutische Konzentration der Verbindung zu erreichen.
Epidurale Verabreichung. Verabreichung in Regionen des Rückenmarks kann auch durch epidurale Injektion in eine Region des Rückenmarks außerhalb der Arachnoid-Membran erfolgen. Es ist darüber hinaus zu bemerken, dass es bei der Verabreichung der Omega- Conopeptide über diesen Weg vorteilhaft sein kann, der Omega-Conopeptid- Zusammensetzung Mittel zuzugeben, die die Durchdringung des Conopeptids durch die meningnalen Membranen verstärkt. Solche Mittel sind im Fachgebiet bekannt und umschließen liposomale Einkapselung oder Zugabe eines Oberflächen-aktiven Stoffs oder eines Ionen bindenden Agens zu der Peptid-Zusammenstellung. Alternativ oder zusätzlich kann eine verstärkte Durchdringung der Arachnoid-Membran erreicht werden, indem eine hypertonisch dosierte Lösung verabreicht wird, die die Permeabilität der meningnalen Barrieren erhöht.
Gemäß eines weiteren Aspekts der hierin beschriebenen Erfindung kann epidurale Verabreichung von aktiven Omega-Conopeptiden auch durchgeführt werden, indem die Omega-Conopeptide epidural ohne Zusatz eines Membran-durchdringenden Agens verabreicht werden. Dieser Aspekt der Erfindung wird im Abschnitt IIIB, nachstehend, ausgeführt.
Intravenöse Verabreichung. Intravenöse Verabreichung von aktiven Omega-Conopeptiden kann angewendet werden, um therapeutische Konzentrationen einer Verbindung in perineuralen Regionen und/oder an Rückenmarkssynapsen im Einklang mit den vorstehend beschriebenen Behandlungsprinzipien zu erhalten. Um wirksame intraspinale Spiegel von Omega-Conopeptiden zu erhalten, können für Menschen Dosierungen erforderlich sein, die einer Dosierung im Bereich von 0,1-15 mg/kg bei einer Ratte entsprechen. Zusätzlich kann die Verbindung über eine kontinuierliche intravenöse Infusion mit einer Rate von 1-10 mg/kg/h verabreicht werden, um therapeutische Spiegel zu erhalten.

B. Medikamente zur Behandlung von Schmerz durch epidurale Verabreichung

Es ist die weitere Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass Analgesie durch epidurale Verabreichung eines Omega-Conopeptids ohne das Hinzufügen eines Membrandurchdringenden Agens zu der Zusammenstellung erreicht werden kann. Dieser Befund war unerwartet, basierend auf den hydrophilen, geladenen Eigenschaften der Omega-Conopeptide und der relativ geringen Permeabilität der meningnalen Membranen, die den epidermalen Spalt umgeben, für Verbindungen, die solche physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweisen.
Dieses unerwartete Ergebnis kann zum Teil durch Experimente erklärt werden, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, in denen festgestellt wurde, dass die meningnalen Membranen des Rückenmarks bestimmte Bindungsstellen mit relativ niedriger Affinität für Omega-Conopeptide besitzen (Beispiel 3, Fig. 11) Ohne eine bestimmte mechanische Theorie vorauszusetzen, kann eine solche Bindung eine Begründung für die in vivo beobachteten Ergebnisse liefern. Die Kurve der Konkurrenzbindung zeigt eine niedrige, nicht spezifische Bindung (annähernd 20%) und einen Hill-Koeffizienten nahe eins, vereinbar mit der Bindung an eine einzelne Stelle mit niedriger Affinität. Der berechnete IC&sub5;&sub0;-Wert beträgt 41 uM.
In Experimenten, die zur Unterstützung der Erfindung durchgeführt wurden, wird nun gezeigt, dass aktive Omega-Conopeptide, nach vorstehender Definition, in Individuen Analgesie erzeugen können, wenn diese Verbindungen epidural in Dosierungen verabreicht werden, die äquivalent oder nur leicht höher als eine wirksame intrathekale (intraspinale) Dosierung der selben Verbindung sind. Wirksame intrathekale Dosierungen, bestimmt an Ratten, die dem in Beispiel 5 beschriebenen Ratten-Allodynie-Modell perineuraler Neuropathie unterworfen waren, liegen im Bereich von 0,1-0,3 ug (SNX-239, SNX-159, SNX-273, SNX-279, SNX- 111). Die Gesamtdosis von aktivem Omega-Conopeptid, die erforderlich ist, um Analgesie zu erzeugen ist, wenn sie als intrathekale Infusion gegeben wird, etwa die gleiche (2,4 ug SNX- 111) wie bei der Bolus-Dosierung.
In exemplarischen Experimenten, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, bewirkt eine epidurale Dosis von 30 ug SNX-111 Analgesie in einer Ratte, die peripherer Neuropathie unterworfen war (Fig. 12). Diese Dosis liegt innerhalb des wirksamen Bereiches (3-30 ug) einer intrathekalen Dosis von SNX-111 in dem selben experimentellen Modell. Noch eindrucksvoller ist, dass das aktive Omega-Conopeptid SNX- 111 in vergleichbaren Dosierungen Analgesie erzeugte, wenn es durch kontinuierliche intrathekale Infusion mit 0,5 ug/h (Fig. 13) oder durch kontinuierliche epidurale Infusion mit 0,1, 0,3 oder 1,0 ug/h (Fig. 14) verabreicht wurde. Wenn die Verbindung in dieser Weise verabreicht wird, steht sie in verlängertem Kontakt mit der epiduralen Region. Aus diesen Daten kann man ersehen, dass ein solcher verlängerter Kontakt bei epiduraler Verabreichung wünschenswert ist. Andere nützliche Wege, verlängerten Kontakt zu erzeugen, etwa über Formulierungen mit verzögerter Freisetzung, sind im Fachgebiet bekannt und werden in Abschnitt IIIA2, vorstehend, offenbart.
Bei der praktischen Anwendung der Erfindung wird einem Individuum, das Schmerz verspürt, über standardisierte Verabreichungswege eine wirksame analgetische Dosis eines aktiven Omega-Conopeptids gegeben, nach der Definition dieses Ausdrucks in den Abschnitten I und II, vorstehend. Mit "innerhalb des Bereiches" ist gemeint, dass die Dosis etwa innerhalb ± einer Größenordnung der wirksamen intrathekalen Dosis liegt, und mehr bevorzugt innerhalb ± 0,5 log Einheiten der Dosis. Auf diese Weise wird in dem vorstehend beschriebenen Beispiel, in dem eine intrathekale Gesamtdosis von 1-3 ug SNX-111 Analgesie in einer Ratte erzeugt, der Bereich für epidurale Verabreichung zwischen etwa 0,1-30 ug liegen.
Es stellte sich heraus, dass SNX-111 beim Menschen Analgesie bewirkt, wenn es als kontinuierliche Infusion intrathekal mit einer Dosierung zwischen 0,3 und 300 ng/kg/h über einen Zeitraum von 24 Stunden gegeben wird. Während die genaue Dosierung von der Größe und anderen physiologischen Bedingungen des Individuums abhängig sein wird, wird eine epidurale Dosis für den Menschen innerhalb der Dosis liegen, die für eine Analgesie notwendig ist, wenn die Verbindung intrathekal gegeben wird. Basierend auf dem Vorangegangenen kann eine wirksame epidurale Dosis beim Menschen in dem Bereich von 0,3-3000 ng/kg/h erwartet werden.
Während bevorzugt ist, die epidurale Dosis mittels kontinuierlicher Infusion über mindestens 24 Stunden zu geben, wird dies und die Dosierungsparameter im Rahmen der Standard- Klinikprotokolle zur Regulierung von Schmerzmedikation vom Arzt an den Bedarf des einzelnen Patienten angepasst werden. Weitere Information, die die Dosierung betrifft, kann in Bezug auf die im Fachgebiet bekannten Standard-Tiermodelle in Einklang mit Standardpharmakokinetischen Grundsätzen erhalten werden.
Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen Allodynie-Modell peripherer Neuropathie der Ratte können andere Standard-Tiermodelle, wie etwa das Rattenschwanz-Flick-Modell oder das Ratten-Formalin-Modell, verwendet werden, um die Wirksamkeit zu bestimmen und die Dosierungen zur Behandlung von nociceptivem Schmerz bei Anwendung epuiduraler Verabreichung eines aktiven Omega-Conopeptids abzuschätzen. Im Allgemeinen sind antinociceptive Dosen niedriger als die Dosen, die notwendig sind, um Analgesie bei Patienten zu erzeugen, die unter neuropathischem Schmerz leiden.
Stabilisierte Formulierungen, wie in Abschnitt IIC, vorstehend, beschrieben, sind hilfreich bei der Herstellung der Medikamente für epidurale Verabreichung und bilden daher einen Teil der Erfindung. Während es wünschenswert sein kann, die Lösungen vor der Verabreichung zu neutralisieren, können Formulierungen, die Lactat oder mit Säure versetzte Kochsalzlösung als Trägerstoff verwenden, auch direkt über den epiduralen Weg oder die intrathekale Bolus- Injektion oder über andere Wege, für die versäuerte Trägerstoffe in geeigneter Weise verwendet werden, verabreicht werden. Neutralisation kann, falls erforderlich, durch Verdünnung in einer pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff-Pufferlösung erreicht werden, direkt bevor sie dem Individuum verabreicht wird.
Die folgenden Beispiele sollen die verschiedenen Aspekte der Erfindung illustrieren, sind aber in keiner Weise dazu gedacht, den Bereich der Erfindung zu begrenzen.

Beispiel 1

Aktivität von Calciumkanal-Antagonisten:

Hemmung von Ionenströmen

Ionenströme durch Calciumkanäle wurden an Zellen untersucht, die an eine einzelne Patch- clamp-Elektrode angeschlossen waren. Diese Patch-clamp-Untersuchungen an der ganzen Zelle wurden mit N1E115 Neuroblastenzellen der Maus durchgeführt, obwohl eine Reihe von Zelltypen, darunter auch menschliche Neuroblasten der Zelllinie 1MR-32, ebenso zur Bestimmung der Aktivität von Calcium-Antagonisten verwendet werden können.

A. Gängige Messverfahren

Es wurden Waschlösungen entworfen, die die Untersuchung von Calciumkanälen in Abwesenheit anderer Kanäle ermöglichten. Die Lösungen wurden nach Standardprotokollen hergestellt und enthielten 80 mM N-Methyl-D-Glucamin (MVIDG) (als ein Natriumersatz), 30 mM Tetraethyl-Amoniumchlorid (TEACI) (um Kaliumströme zu blockieren), 10 mM BaCl&sub2; (als ein Ladungsträger durch die Calciumkanäle) und 10 mM HEPES mit einem pH-Wert von 7,3. Einige Lösungen enthielten außerdem 2 mM Quinidin (um Kaliumströme zu blockieren) und 3 uM Tetrodotoxin (um Natriumströme zu blockieren). Die normale Wasch- Kochsalzlösung bestand aus (mM): 140 NaCl, 10 Glucose, 3 KCl, 2 CaCl&sub2;, 1 MgCl&sub2;, 10 mM HEPES, pH 7,3. Intrazelluläre Lösungen enthielten 150 mM CsCl, 0,5 mM CaCl&sub2;, 5 mM EGTA, 5 mM MgCl&sub2;, 2 mM K&sub2;ATP bei einem pH-Wert von 7,3-7,4. Die Waschlösung und alle internen Lösungen wurden vor dem Gebrauch gefiltert.
Pipetten wurden aus Corning 7052-Glas hergestellt (Garner Glass Company, Claremont, CA 91711), mit Sylgard (Dow Corning, Midland, MI 48640) überzogen und vor dem Gebrauch Feuer-poliert. Die Blasenanzahl betrug typischerWeise 5 bis 6, die Pipetten-Widerstände typischer Weise 2-5 MOhm. Corning 8161, Kimble, und andere Glasaren wurden ebenfalls verwendet, ohne dass eine Wirkung auf die beobachteten Calciumkanäle festzustellen war.
Die Aufzeichnungen wurden bei Raumtemperatur mit einem Axopatch 1-C-Verstärker (Axon Instruments, Foster City, CA 94404) vorgenommen und mit pCLAMP-Software (Axon Instruments) analysiert. Die Daten wurden bei 1000 Hz für eine typische Rate zur Probennahme von, 1 kHz gefiltert; die Analyse wurde online mit Ausdruck über einen Hewlett- Packard LaserJet Drucker (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA 94306) durchgeführt.
Das typische Experiment wurde wie folgt durchgeführt: nach Abdichtung, gefolgt von Reihenwiderstands-Kompensation und Verhinderung kapazitiver Umladungsströme, wurde ein Spannungsstufen-Protokoll durchgeführt, worin das Zellpotential vom Grundpotential (typischerweise -100 mV) in Stufen von 10 mV auf Testpotentiale erhöht wurde, die im Bereich von -60 mV bis +20 mV lagen. Die Zelle wurde für 5 Sekunden zwischen den Pulsen auf dem Potential gehalten.

B. Messung der Einstrom-Hemmung

Ableitungen des Calciumstroms wurden an einer N1E-115 Neuroblastenzelle der Maus vorgenommen, wie in Fig. 7 gezeigt. Die Figur liest sich mit dem Zeitverlauf von links nach rechts, wobei abwärts gerichteten Ausschläge der Ableitung positiven Einstrom in die Zelle anzeigen. Die Ströme wurden durch einen Spannungsschritt von 100 mV auf -10 mV hervor gerufen. Die Zelle wurde von einer Kochsalzlösung umspült, in der Natrium durch NMDG, und 2 mM Ca&spplus;&spplus; durch 10 mM Ba&spplus;&spplus; ersetzt war. Kaliumströme wurden durch TEA in der Spüllösung und Cs&spplus; in der Pipettenlösung blockiert.
Die drei Ableitungen in Fig. 7, mit b-d gekennzeichnet, zeigen mit ansteigenden Konzentrationen des Omega-Conopeptids MVIIA von 10 nM (b), 50 nM (c) und 200 nM (d) abnehmende Calciumströme.

Beispiel 2

Bindung von Omega-Conopeptid an Omega-Conopeptid-Bindungsstellen in synaptosomalen Membranen

A. Präparation von Synaptosomen und synaptosomalen Membranen aus Säugetierhirn

Synaptosomen wurden aus dem gesamten Gehirn oder der Hippocampusregion des Gehirns von Ratten präpariert. Die Raffen wurden getötet, und die Vorderhirne wurden entnommen und in 10 ml eisgekühlte 0,32 M Sucroselösung überführt, die die folgenden Protease-Hemmer (PI) enthielt: 1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 1 uM Pepstatin; 2 uM Leupeptin. Die Gehirne wurden unter Verwendung eines Motor-getriebenen Teflonglas-Homogenisators (ca. 8 Durchgänge bei 400 rpm) homogenisiert. Die Homogenate von je vier Gehirnen wurden zusammengegeben und bei 900 · g für, 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstände wurden bei 8.500 · g für 15 Minuten zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets wurden je in 10 ml eisgekühlter 0,32 M Sucroselösung plus PI im Vortex-Mixer resuspendiert. Die Suspension wurde dann bei 8 500 · g für 15 Minuten zentrifugiert. Die Pellets wurden in 20 ml eisgekühlter 0,32 M Sucroselösung plus PI resuspendiert. Die Suspension (5 ml/Röhrchen) wurde über einen 4-Stufen Sucrose-Dichtegradienten geschichtet (je 7 ml 1,2 M Sucrose, 1,0 M Sucrose, 0,8 M Sucrose, 0,6 M Sucrose; alle Sucrose-Lösungen enthielten PI). Die Gradienten-Röhrchen wurden in einem schwingenden Becher-Rotor bei 160.000 · g für 60 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die 1,0 M Sucrose-Schicht und die Zwischenschicht zwischen den 1,0 und 1,2 M Sucrose-Schichten wurden entnommen und mit eisgekühltem, deionisiertem Wasser plus PI verdünnt, um schließlich eine 0,32 M Sucrose-Konzentration zu erhalten. Die erhaltene Suspension wurde bei 20.000 · g für 15 Minuten zentrifugiert. Die Pellets wurden dann in 5 ml eisgekühlter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung plus PI resuspendiert. Die erhaltenen Rattenhirn-Synaptosomen wurden dann in Aliquots aufgeteilt und in einem Lagerungssystem aus flüssigem Stickstoff gelagert.
Vor der Verwendung in Bindungsuntersuchungen wurden die Synaptosomen aufgetaut und mit 3 Volumeneinheiten aus eisgekühltem deionisiertem Wasser plus PI verdünnt. Die Suspension wurde mit Hilfe eines PT 10-35 Polytrons (Stufe 6) mit 2 10-Sekunden-Pulsen homogenisiert. Das Homogenat wurde mit 40.000 · g für 20 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets wurden in etwa 5 ml eisgekühlter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung plus PI resuspensiert. Die erhaltene synaptosomale Gehirn-Membranpräparation wurde in Aliquots aufgeteilt und bei -80ºC bis zum Gebrauch gelagert. Die Proteinkonzentration der Membranpräparation wurde mit Hilfe von Bradford-Reagenz (BioRad) mit Rinderserum- Albumin als Standard bestimmt.

B. Untersuchung zur kompetitiven Verdrängungsbindung

1. Kompetitive Verdrängung von OCT MVIIA. Synaptosomale Membranen aus Rattenhirn, präpariert wie in Abschnitt A beschrieben, wurden in einem Bindungspuffer suspendiert, der aus 20 mM HEPES, pH-Wert 7,0, 75 mM NaCl, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 2uM Leupeptin, ,035 ug/ml Aprotinin und 0,1% Rinderserum-Albumin (BSA) zusammengesetzt war. [¹²&sup5;I]-MVIIA (SNX-111 OCT (25-30.000 cpm, etwa 1500-2000 Ci/mmol) und die Testverbindung wurden in Polypropylen-Röhrchen in Aliquots aufgeteilt, entweder ohne oder mit 1 nM MVIIA (SNX-111) OCT, um nicht-spezifische Bindung zu erfassen. Die Membran- Suspension wurde verdünnt und schließlich in Aliquots in die Teströhrchen aufgeteilt, so dass jedes Teströhrchen 10 ug Membranprotein enthielt und das Gesamtvolumen 0,5 ml betrug. Nach Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen in ein Eisbad gestellt, dann unter Verwendung eines Milipore-Filtriersystems durch GF/C-Filter (Whatman) gefiltert, die zuvor mit 0,6% Polyethylenimin getränkt und mit Waschpufferlösung (20 mM HEPES, pH-Wert 7,0, 125 mM NaCl, 0,1% BSA) gewaschen worden waren. Direkt vor der Filtration erhielt jedes Teströhrchen 3 ml eisgekühlte Waschpufferlösung. Die filtrierten Membranen wurden mit zwei 3 ml-Volumeneinheiten eisgekühlter Waschpufferlösung gewaschen, getrocknet, und die Filter-gebundene Radioaktivität wurde in einem Beckman- Gammazähler (75% Zähleffizienz) gemessen.
Die IC&sub5;&sub0;-Werte wurden per Computer aus den Bindungskurven für die kompetitive Verdrängung erstellt, erzeugt durch eine logistische 4-Parameter-Funktion. Diese Werte geben die Konzentration der Testverbindung an, die notwendig ist, die gesamte spezifische Bindung von [¹²&sup5;I]-MVIIA (SNX-111) OCT an synaptosomale Membranen aus dem Rattenhirn zu 50 % zu hemmen, wobei spezifische Bindung als die Differenz zwischen der Bindung von [¹²&sup5;I]- MVIIA (SNX-111) OCT ahne und seiner Bindung mit Anwesenheit eines Überschusses (1 nM) an nicht markiertem MVIIA OCT definiert ist. Nicht-spezifische Bindung ist jene Bindung einer radiomarkierten Verbindung, die in Anwesenheit eines Überschusses von nicht markiertem MVIIA OCT gemessen wird. Solche Werte dienen als Näherungen für die relativen Affinitäten einer Reihe von Verbindungen für eine bestimmte Bindungsstelle.
2. Kompetitive Verdrängung von OCT SVIB. Synaptosomale Membranen des Rattenhirns wurden wie vorstehend beschrieben präpariert. OCT SVIB wurde durch Jodierung mit ¹²&sup5;I- Jodid durch die Jodierungsreaktion radiomarkiert. Die Verdrängungsbindung von radiomarkiertem SVIB an synaptosomalen Membranen des Rattenhirns wurden wie in Beispiel 4B durchgeführt. IC&sub5;&sub0;-Werte und relative Potenzwerte wurden wie nachstehend beschrieben errechnet. Die Tabellen 2 und 3 stellen die relativen Potenzwerte für die untersuchten Omega- Conopeptide und das Verhältnis der relativen Potenzen der Verbindungen für die OCT MVIIA-Stelle und die SVIB-Bindungsstelle dar.
Die Bindungskonstante (Ki) für jede Testsubstanz wurde mit Hilfe der nicht linearen Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate (Bennett, G. J. und Xie, Y.- K., Pain 33: 87-107 (1988)) aus den Daten von kompetitiver Bindung aus zwei Untersuchungen, die doppelt in getrennten Ansätzen durchgeführt wurden, ermittelt. Der Zusammenhang von Ki-Wert und IC&sub5;&sub0;-Wert (Konzentration, bei der 50% der markierten Verbindung durch die Testverbindung verdrängt wird) wird durch die Cheng-Prusoff- Gleichung ausgedrückt:
Ki = IC&sub5;&sub0;/(1 + [L]/Kd)
wobei IC&sub5;&sub0; diejenige Konzentration der Testsubstanz ist, die notwendig ist, um die spezifische Bindung des markierten Liganden um 50% herabzusetzen; [L] ist die Konzentration von [¹²&sup5;I]- MVIIA (SNX-111) OCT, die im Experiment verwendet wurde; und Kd ist die Bindungskonstante, die für die Bindung von [¹²&sup5;I]-MVIIA(SNX-111)OCT an synaptosomale Membranen des Rattenhirns in Experimenten zur Sättigungsbindung ermittelt wurde. Tabelle 3 fasst die ermittelten IC&sub5;&sub0;-Werte für verschiedene Omega-Conopeptide für die MVIIA- Bindungsstelle aus synaptosomalen Membranen des Rattenhirns zusammen. Die relative Potenz für die Verdrängung der Bindung wird aus dem Verhältnis des IC&sub5;&sub0;-Wettes der Testverbindung zu dem IC&sub5;&sub0;-Wert der Referenzverbindung errechnet. Die Referenzverbindung ist im Allgemeinen das unmarkierte Äquivalent des markierten Liganden. Die Berechnung der relativen Potenz wird wie folgt durchgeführt:
[log(relative Potenz)] = log(IC&sub5;&sub0;(Ref)) - log(IC&sub5;&sub0;(Test))

Beispiel 3

Bindung an meningnale Membranen

Meningnale Membranen wurden aus dem Rückenmark (T3 bis L5) von Affen der Art Macaque nemestrina gewonnen. Das Rückenmark wurde entnommen und Schnitte wurden simultan durch alle drei Meningnen auf der ventralen Oberfläche geführt. Gemeinsam wurden die Dura, arachnoidea und die Pia mater vorsichtig von jedem einzelnen Rückenmark entfernt, so dass ihre normale anatomische Lage zueinander erhalten blieb.
Gefrorene Pia-Arachnoid-Membranen des Rückenmarks wurden zerkleinert, in 5 ml deionisiertem Wasser, das Protease-Hemmer (1 mM EDTA, 1 EGTA, 1 uM Pepstatin, 2 uM Leupeptin) enthielt, suspendiert, mit einem Polytron-Homogenisator (PT-10-35, Stufe 6) für 10 Sekunden homogenisiert und bei 40.000 · g für 20 min zentrifugiert. Das Membran-Pellet wurde in 5 ml 0,005 M Phosphat-Pufferlösung, pH 7,4, die Protease-Hemmer enthielt, resuspendiert und bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff gespeichert. Der Proteingehalt der Membranpräparation wurde mit Hilfe von Bradford-Reagenz (Bio-Rad) mit Rinderserum- Albumin (BSA) als ein Standard bestimmt. MVIIA OCT wurde mit ¹²&sup5;I-Jodid über die Reaktion mit IodogenTM radiomarkiert, im Wesentlichen dem Verfahren von Ahmad und Miljanich (Ahmad, S. N. und Miljanich, G. P., Brain Research 453: 247-256 (1988) folgend. Die Bindungsuntersuchungen wurden bei Raumtemperatur in 12 · 75 mm-Polypropylen- Röhrchen durchgeführt. Die Bindungs-Pufferlösung enthielt 20 mM HEPES, pH 7,2, 75 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EDTA, 2,0 uM Leupeptin, 0,5 U Aprototinin und 0,1% Rinderserum-Albumin (BSA). Das Bindungsgemisch enthielt 5 ug meningnale Membranen in 0,2 ml, ¹²&sup5;I-SNX-111 in 0,1 ml und 0,2 ml Bindungs-Pufferlösung, was ein Endvolumen von 0,5 ml pro Röhrchen ergab. Die ¹²&sup5;I-SNX-111-Kompetitions-Bindungskurven wurden erzeugt, indem verschiedene Konzentrationen von SNX-194 (Nle¹² SNX-111) in die Teströhrchen zugegeben wurden. Nicht-spezifische Bindung wurde bei Anwesenheit von 500 uM SNX-194 bestimmt. Die Reaktion wurde durch Übertragen der Teströhrchen in ein eisgekühltes Wasserbad und Verdünnen jeder Probe mit 3 ml gekühlter Wasch-Pufferlösung (20 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, 0,1% BSA) gestoppt. Membran-gebundene Radioaktivität wurde auf einem Milipore-Mehrfach-Filtersystem unter Verwendung von Glasfaserfiltern, die zuvor mit 0,6% Polyethylenimin getränkt worden waren, abgetrennt. Die Filter wurden zweimal (3 ml) mit eisgekühlter Wasch-Pufferlösung gewaschen und in einem Beckman- Gammazähler (Model G-500) bei 75% Zähleffizienz ausgezählt. Die Daten wurden in ein logistische Vier-Parameter-Funktion eingestetzt:
Effekt = E&sub0; + (Ei - Eo)·1/1 + (K/L)h
wobei gilt: E0 = Effekt bei Dosis 0, Ei = Effekt bei der Anfangsdosis, K = IC&sub5;&sub0;-Wert, L = Konzentration des konkurrierenden Liganden und h = Gefälle. Die Werte der Parameter wurden per Computer (Hewlett-Packard) unter Verwendung eines nicht linearen Algorithmus nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate zur Kurvenberechnung ermittelt.

Beispiel 4

Hemmung der elektrisch stimulierten Kontraktion des Meerschweinchen-Ileums

Meerschweinchen (300-400 g) wurden enthauptet, und das Ileum wurde entnommen. Ein Abschnitt des Ileums, etwa 6 cm vom Caecum, wurde sofort in Krebbs modifizierte Pufferlösung übertragen, das in einem Wasserbad auf 37ºC gehalten und mit einem Gemisch aus 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; belüftet wurde. Die Pufferlösung enthält: KCl, 4,6 mM; KH&sub2;PO&sub4;, 1,2 mM; MgSO&sub4;, 1,2 mM; Glucose, 10,0 mM, NaCl, 118,2 mM, NaHCO&sub3;, 24,8 mM; CaCl&sub2;, 2,5 mM.
Es wurden kleine Stücke des Ileums abgeschnitten und über eine Glaspipette gezogen, eingeschnitten, und der Längsmuskel wurde entfernt. Jedes Stück wurde an einem Ende an eine Elektrode und am anderen Ende an einen Kraftaufnehmer angeschlossen. Die Präparation wurde in ein Organ-Bad gelegt, auf 37ºC gehalten und mit O&sub2; : CO&sub2; belüftet. Die Ruhespannung wurde auf 1 gm gesetzt, und das Gewebe wurde mit 30-40 mV bei einer Dauer von 4,5 msec pro Reiz stimuliert.
Basis-Antworten (Kontraktionen)wurden über 10-15 min aufgezeichnet, und Aliquots (100 ml) des Wirkstoffs wurden dem Bad zugegeben, bis Hemmung eintrat. Nach dem Test wurden die Gewebe gewaschen, bis die ursprüngliche Größenordnung der Antwort wieder erreicht wurde.

Beispiel 5

Allodynie-Modell peripherer Neuropathie der Ratte

Das Tiermodell der Neuropathie, das hierin beschrieben wird, spiegelt den beim Menschen Causalgie oder Reflex-sympathische Dystrophie (RSD) genannten Zustand wider, der sekundär auf Verletzung eines peripheren Nervs eintritt. Dieser Zustand ist durch Hyperesthesie (verstärkte Sensitivität auf einen natürlichen Reiz), Hyperalgesie (abnorme Sensitivität auf Schmerz), Allodynie (ausgedehnte Empfindlichkeit, gekennzeichnet durch Überempfindlichkeit auf taktile Reize) und durch spontanen, brennenden Schmerz gekennzeichnet. Im Allgemeinen verschlimmern sich diese Symptome mit der Zeit oder breiten sich aus.
Das nachfolgend beschriebene experimentelle Modell dient dazu, periphere Nerven (Rückenmarksnerven L5 und L6) von Ratten reproduzierbar verletzen zu können. Ratten entwickeln einen hyperesthetischen Zustand, der gemessen werden kann. Hier wurde die Allodynie durch Stimulation der neuropathischen Hintergliedmaßen der Ratte mit Hilfe von Drahthärchen gemessen, die verschiedene Steifheitsgrade hatten. Analgetische Verbindungen kehren die erhöhte Empfindlichkeit, die solche Tiere auf den Reiz zeigen, um. Daten aus einem solchen Modell werden allgemein als Prozent des maximalen Effekts ausgedrückt, wobei der maximale Effekt eine vollständige Umkehr der operativ erzeugten Allodynie zeigt, oder als relative Intensität auf einen maximalen Reiz, die von einem 15-Gramm "Härchen" oder "Draht" erzeugt wird.
Zur intrathekalen Verabreichung von Verbindungen wurden männliche Sprague-Dawley Ratten (250-350 g) mit chronischen Lumbar-intrathekalen Kathetern versehen, die unter halothaner Anesthesie eingesetzt wurden (Yaksh, T. L. und Rudy, T. A., Physiol. Behav. 17: 1031-1036 (1976)).
Neuropathogene Operation: Die Tiere wurden mit Pentobarbital-Natrium betäubt, in die Bauchlage gebracht, und die linken paraspinalen Muskeln wurden von den Wirbelfortsätzen in der Höhe von L&sub4;-S&sub2; entfernt, wie von Kim und Chung (Kim, S. H. und Chung, J. M., Pain 50: 355-363 (1992)) beschrieben. Die linken Nervenwurzeln L5 und L6 wurden frei gelegt und fest mit 6-0 medizinischer Nahtseide umwickelt.
Man ließ sich die Tiere von der neuropathischen Operation erholen, und die nociceptiven Reaktionen wurden täglich gemessen, bis die Tiere beständige Anzeichen mechanischer Allodynie zeigten (etwa 7-10 Tage). Zur epiduralen Verabreichung der Wirkstoffe wurde den Tieren innerspinale (lumbale) epidurale Katheter nach dem Verfahren von Durant und Yaksh (Durant, P. A. C. und Yaksh, T. L., Anesthesiology 64: 43-53 (1986)) mit kleineren Veränderungen implantiert. SNX-111 oder Trägerstoff (Kochsalzlösung) wurde entweder durch Bolus-Injektion einen Tag nach der Platzierung der Katheter verabreicht oder durch kontinuierliche Infusion mit konstanter Rate, beginnend nach der Implantation der Katheter. Bei der Bolus-Injektion wurde SNX-111 in einem Volumen von 30 ul verabreicht, gefolgt von 10 ul Kochsalzlösung zum Nachspülen. Für die kontinuierliche epidurale Infusion wurden die Katheter mit innenliegenden osmotischen Minipumpen verbunden, und die Testlösungen wurden mit einer Rate von 0,5-1,0 ul/h zugeführt. Die Reizschwellen der mechanischen Allodynie wurden direkt vorher und in festen Intervallen während oder nach der Verabreichung von SNX-111 gemessen.
Zur intrathekalen Verabreichung der Wirkstoffe wurde ein mit Kochsalzlösung gefüllter Polyethylen-Katheter (PE-10) in den lumbalen subarachnoiden Spalt eingebracht, wie von Yaksh und Rudy (Yaksh, T. L. und Rudy, T. A., Physiol. Behav. 17: 1031-1036 (1976)) beschrieben. Der Katheter wurde mit Stay-Nähten im umgebenden Muskelgewebe verankert, aus dem er aus der Cisterna magna hervorragte. Zur Bolus-Injektion wurde die Testverbindung in Kochsalzlösung gelöst und mit einem Volumen von 10 ul durch den intrathekalen Katheter verabreicht, gefolgt von 10 ul Kochsalzlösung, um den Katheter zu spülen. Die kontinuierliche Infusion wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Den Tieren wurden mindestens drei Tage gegeben, sich von der Kathetisierung zu erholen, bevor die Reizschwellen der mechanischen Allodynie festgestellt wurden. Es wurde beobachtet, dass die Allodynie typischerweise 1-2 Tage nach der Operation begann und bis zu 45 Tage anhielt. Tiere, die motorische Defizite aufwiesen, wurden von weiteren Studien ausgeschlossen.
Um die Reizschwelle für einen nicht noxischen Reiz festzustellen, der erforderlich ist, das Zurückziehen der linken Hinterpfote (Allodynie) auszulösen, wurden Von Frey-Filamente (Stoelting, Wood Dale, IL) mit abgestufter Steifheit (zwischen 0,4-15 Gramm) systematisch auf die operativ behandelte Fußsohle der Hinterpfote aufgebracht. Das Haar wurde mit einer so großen Spannung gegen die Oberfläche gehalten, dass eine leichte Biegung entstand und für 6- 8 Sekunden so gehalten. Falls es keine Reaktion gab, wurde das nächst steifere Haar getestet. Das Hervorrufen einer kurzen Rückziehreaktion führte zum Testen der nächst niedrigeren Reizintensität. Diese Vorgehensweise wurde nach einem statistischen Verfahren (Dixon, W. J., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20: 441-462 (1976)) wiederholt, um die 50% -Reaktions- Reizschwelle zu ermitteln. Allodynie wurde durch eine Reizschwelle von weniger als 3 Gramm (bezogen auf die Intensität des Haar-Reizes) belegt, die von allen operativ behandelten Tieren gezeigt wurde.
Die Obergrenze der mechanischen Reizung zur Ermittlung der Reizschwelle wurde bei 15 Gramm festgelegt. % MPE-Werte nahe 100 zeigen eine normale mechanische Reizschwelle an (z. B. bei genau oder annähernd 15 Gramm); Werte nahe 0 kennzeichnen Allodynie. Nach Beendigung der Tests wurden die Tiere getötet, und die Wirbelsäulen wurden entnommen, um die Position der Katheter zu überprüfen und den Zustand der Katheterspitzen zu untersuchen. Dann wurden die Katheter entfernt und mit Kochsalzlösung gespült, um Lecks aufzuspüren und die Funktionsfähigkeit zu überprüfen. Tiere wurden von der Studie ausgeschlossen, wenn die Katheter verstopft oder nicht richtig im epiduralen Spalt positioniert waren.
Die aus diesem Modell erhaltenen Daten werden als Prozent des maximalen Effekts ausgedrückt, entsprechend der nachstehenden Gleichung, bei der der maximale Effekt eine vollständige Umkehr der Allodynie oder Unempfindlichkeit auf den Reiz bedeutet (Maximum entspricht 15 Gramm-Haar-Auslenkung). Eine Basislinie bei 0 zeigt eine Hauptsensitivität bei weniger als 3 Gramm an.
Dieser Analyse folgend gilt: je höher % MPE, desto besser ist die antinociceptive Wirkung. Aktive Conopeptide, einschließlich SNX-273 und SNX-279, blockieren mechanische Allodynie signifikant im Vergleich zu Kontrollen mit Kochsalzlösung. Die offensichtliche Reihenfolge der Potenz zur Unterdrückung der Allodynie ist SNX-111 = SNX-273 > SNX-279. Dies stimmt mit den relativen Affinitäten der Verbindungen für die SNX-111-Bindungsstelle überein (IC&sub5;&sub0;- Werte: SNX-111, 8 pM; SNX-273, 8 pM; SNX-279, 40 pM).
Die Tiere wurden auch auf das Auftreten allgemeiner motorischer Dysfunktionen überwacht, die etwa durch Unvermögen zur symmetrischen Fortbewegung oder durch alle anderen offensichtlichen Anzeichen für ungewöhnliche Aktivität sichtbar werden. Bei den mit Kochsalzlösung behandelten Tieren wurden keine Auswirkungen auf die motorische Aktivität beobachtet; ein von der Dosis abhängiges, für die Verabreichung von SNX-111 charakteristisches Zittern wurde bei den Tieren beobachtet, denen SNX-111 gegeben wurde.

A. Hemmung der Progression von neuropathischem Schmerz.

SNX-111 wird den Tieren verabreicht, um die Verhinderung der Entwicklung von neuropathischem Schmerz zu untersuchen, die durch die Reduktion der Entwicklung mechanischer und thermischer Allodynie beobachtet wurde. Den Tieren werden innenliegende, intravenöse (rechte Jugularvene) oder spinale, intrathekale Katheter implantiert, die mit subkutan implantierten osmotischen Minipumpen (Alza Corp., Palo Alto, CA) verbunden sind, um kontinuierliche Infusion mit konstanter Rate von Verbindung oder Trägerstoff (mit Säure versetzte physiologische Kochsalzlösung, pH-Wert 4-4,5) zu gewährleisten. Für die Untersuchungen zum chronischen Krankheitsverlauf wir den Tieren eine Erholungszeit von 24 Stunden zugestanden, bevor sie der vorstehend beschriebenen operativen Prozedur zum Hervorrufen einer Nervenverletzung unterworfen werden. Mit der Infusion von Wirkstoff oder Trägerstoff wird einen Tag vor der Operation begonnen. Die untersuchte SNX-111-Dosierung beträgt in anfänglichen Studien 100 ug/kg/h i.v. (14 Tage) und 100 ng/kg/h i.t. (14 Tage).
Mechanische Allodynie wird jeden Tag über etwa vierzig (40) Tage untersucht, beginnend am Tag vor der Operation unter Verwendung von van Frey-Draht-Reizen, wie vorstehend beschrieben. Die Haupt-Reizschwellen werden über die Zeit zwischen den mit Wirkstoff behandelten und den Kontroll-(mit Trägerstoff behandelten) Tieren verglichen.
Zusätzlich oder in einem getrennten Ansatz behandelter Tiere werden thermische Reize als akute oder andauernde Reize gegeben. Akute Reize werden durch das Auftragen von Aceton auf die Sohlenoberfläche des betroffenen Fußes und das Zählen der kurzen Rückziehbewegungen des Fußes als Reaktion auf den Reiz verabreicht. Die Reaktion auf andauernde Reize wird gemessen, indem man die Ratte auf eine Messingplatte mit eine neutralen (30ºC) oder kalten 5ºC) Temperatur bringt. Nach einer Anpassungszeit von 5 Minuten wird während einer Beobachtungszeit von 5 Minuten die kumulative Dauer gemessen, in der die Ratte ihren Fuß von der Platte fernhält. Die Daten werden wie vorstehend beschrieben analysiert.

Beispiel 6

Formulierungen mit Methionin-Lactat-Pufferlösung

Untersucht wurde die analgetische Wirksamkeit von spinal verabreichtem SNX-111 mit der Verwendung einer Formulierung mit Methionin-Lactat-Pufferlösung nach der Vorgehensweise, die in Beispiel 5 beschrieben ist. SNX-111 (10 ug/ml) und L-Methionin (50 ug/ml) wurden in einer Trägerlösung gelöst, die aus Natriumlactat (150 mM), mit 250 mM Milchsäure auf einen pH-Wert von 4-4,5 eingestellt, bestand. Diese Formulierung wurde verwendet, um 0,1 ug SNX-111 intrathekal, wie in Beispiel 5 beschrieben, nach 30, 60, 120 und 240 Minuten nach der Behandlung mit Test- oder Kontrollverbindungen zu verabreichen. Fig. 10 zeigt die Wirkungen auf mechanische Allodynie einer einzelnen intrathekalen Bolus-Injektion von 10 ul Kochsalzlösung (offenen Kreise) oder Lactat-Pufferlösung (150 mM) die 50 ug/ml Methionin mit (dunkle Quadrate) oder ohne (dunkle Dreiecke) 10 ug/ml SNX-111 enthielt. Weder die Kochsalzlösung allein, noch die Methionin-Lactat-Kontrollpufferlösung allein bewirkten eine Unterdrückung der Allodynie, Formulierungen mit SNX-111 hingegen waren in diesem Bezug wirksam. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die % MPE Werte bei den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen sich nicht signifikant von denen jener Tiere unterschieden, die nur Methionin-Lactat-Pufferlösung erhalten hatten.
Obwohl die Erfindung mit Bezugnahme auf die einzelnen Ausführungsformen beschrieben wurde, wird es offensichtlich für Fachleute, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Verwendung eines spannungsempfindlichen, Calciumkanal-blockierenden Omega-Conopeptids vorn N-Typ, gekennzeichnet durch die Fähigkeit,

(a) die elektrisch stimulierte Kontraktion des Meerschweinchenileums zu hemmen, und

(b) selektiv an im neuronalen Gewebe vorhandene Omega-Conopeptid- MVIIA-Bindungsstellen zu binden, was durch die Fähigkeit des Omega-Conopeptids bewiesen wird, MVIIA an dieser Stelle zu ersetzen,

für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Fortschreitens der neuropathischen Schmerzerkrankung, wenn das Omega-Conopeptid einem Individuum an der Stelle verabreicht wird, an der die Nervenverletzung fortschreitet.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aktivitäten des Omega- Conopeptids, die Kontraktion des Meerschweinchenileums zu hemmen und an die MVIIA-Bindungsstelle zu binden, innerhalb der Bereiche solcher Aktivitäten der Omega-Conotoxine MVIIA und TVIA liegen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Conopeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TVIA/SNX-185, MVIIA/SNX- 111, SNX-236, SNIX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, SNX-279, und Derivaten davon.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medikament weiterhin ein Antioxidans einschließt, das die Methioninoxidation wirksam verhindert.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aktivität, selektiv an die Omega-Conopeptid-MVIIA-Bindungsstelle zu binden ferner durch das Selektivitätsverhältnis der Bindungsaffinität für die MVIIA-Bindungsstelle zur Bindungsaffinität für eine "Stelle-2"-Omega-Conopeptid-Bindungsstelle bewiesen wird, das innerhalb des Bereichs der Selektivitätsverhältnisse liegt, die für die Omega-Conopeptide MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX-236, SNX- 239 und TVIA/SNX-185 bestimmt wurden.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament zur Hemmung des Zunehmens neuropathischer Schmerzen an einer verletzten Nervenstelle verwendet wird und perineural an der Stelle der Nervenverletzung verabreicht wird.

7. Stabile Omega-Conopeptid-Formulierung, die ein Omega-Conopeptid und eine Antioxidans-Zusammensetzung umfasst, die die Methioninoxidation wirksam verhindert.

8. Formulierung nach Anspruch 7, worin die Antioxidans-Zusammensetzung einen Carbonsäurepuffer einschließt.

9. Formulierung nach Anspruch 8, worin der Carbonsäurepuffer ein Lactatpuffer ist.

10. Formulierung nach Anspruch 7, worin das Antioxidans Methionin ist.

11. Formulierung nach Anspruch 7, worin die Antioxidans-Zusammensetzung Lactat und Methionin einschließt.

12. Omega-Conopeptid SNX-273 mit der Sequenz: CKGKGAKCSRLAYDCCTGSCRSGKC.

13. Omega-Conopeptid SNX-279 mit der Sequenz: CKGKGAKCSRLM(())YDCCTGSCRSGKC, worin M(O) einen oxidierten Methioninrest anzeigt.

14. Verwendung eines spannungsempfindlichen, Calciumkanal- blockierenden Omega-Conopeptids vom N-Typ zur Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung von Analgesie in einem Individuum durch epidurale Verabreichung an das Individuum, umfassend ein Omega-Conopeptid, das

(a) die elektrisch stimulierte Kontraktion des Meerschweinchenileums wirksam hemmt, und

(b) selektiv an die Omega-Conopeptid-MVIIA-Bindungsstellen bindet, die im neuronalen Gewebe vorhanden sind, wobei die Aktivitäten des Omega-Conopeptids bei der Hemmung des Meerschweinchenileums und der Bindung an die MVIIA-Bindungsstelle innerhalb der Bereiche solcher Aktivitäten der Omega-Conotoxine MVIIA und TVIA liegen, und wobei die epidurale Verabreichung über einen spinalen epiduralen Weg über einen Zeitraum erfolgt, dass das Conopeptid in verlängertem Kontakt mit der epiduralen Region ist, bei einer Dosis, die im Bereich der wirksamen intrathekalen analgetischen Dosis ist, die über einen equivalenten Zeitraum verabreicht wird.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die epidurale Verabreichung über eine kontinuierliche Infusion erfolgt.

16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei der verlängerte Kontakt durch Verabreichen des Conopeptids in einer Formulierung zur anhaltenden Freisetzung bewirkt wird.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Conopeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: MVIIA/SNX-111, TVIA/SNX- 185, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, SNX-279 und Derivate davon.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Aktivität, selektiv an die Omega-Conopeptid-MVIIA-Bindungsstellen zu binden, ferner durch das Selektivitä tsverhältnis der Bindung an die MVII-Bindungsstelle zur Bindung an eine "Stelle 2"-Omega-Conopeptid-Bindungsstelle bewiesen wird, das innerhalb des Bereichs der Selektivitätsverhältnisse liegt, die für die Omega-Conopeptide MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX-236, SNX-239 und TVIA/SNX-185 bestimmt wurden.