PT1336409E - Composições e formulações para a produção de analgesia e para a inibição da progressão de patologias dolorosas neuropáticas. - Google Patents

Description

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Descrição "Composições e formulações para a produção de analgesia e para a inibição da progressão de patologias dolorosas neuropáticas"

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito à utilização de conopéptidos omega para a preparação de medicamentos para inibir a progressão de patologias dolorosas neuropáticas. A invenção também diz respeito à utilização de conopéptidos omega para a preparação de medicamentos adequados para administração epidural a um paciente.

Antecedentes da Invenção

As terapias analgésicas são indicadas para tratar patologias que tenham em comum a percepção de dor por parte de um paciente. A forma mais vulgar de dor, somática ou dor nociceptiva, resulta de um qualquer de diversos estímulos nóxios ou dolorosos com origem na pele, nos tecidos subjacentes ou nos orgão internos. As dores nociceptivas resultam da activação das fibras nervosas Ce A aferentes nociceptivas periféricas que se projectam para a saliência dorsal da medula espinal e que estabelecem sinapses com os neurónios aferentes que conduzem a zonas específicas no cérebro.

Como exemplos de estímulos que suscitam respostas dolorosas nociceptivas refere-se os estímulos nóxios que atingem a pele (calor, fricj, lesões de tecidos, tais como lacerações da pele e dos tecidos subjacentes, e inflamações. A mitigação de dores nociceptivas pode ser 2 conseguida por meio de analgésicos de tipo não narcótico, tais como os seleccionados entre a aspirina, ibuprofeno ou indometacina, ou por meio de compostos opióides, os quais possuem uma acção inibidora directa sobre a excitação das fibras C. É possível utilizar determinados anestésicos locais ( v.g., bupivicaína) , ar.ti-histamínicos, anfetaminas e agentes antidepressivos para reforçar os efeitos dos opióides. Além disso, a patente de invenção norte-americana n° 5364842, de que somos co-proprietários, descreve a eficácia de composições de conopéptidos omega bloqueadoras dos canais de cálcio de tipo N para a produção de analgesia ou para aumentar a analgesia produzida pelos opióides. A dor neuropática é uma dor que resulta de lesões ou alterações crónicas verificadas nos circuitos somatosensoriais periféricos ou centrais designadas genericamente na presente memória descritiva pelo termo "patologias dolorosas neuropáticas". É geralmente uma patologia crónica aquela que tem uma etiologia complexa e variável. A lesão dos nervos periféricos subjacentes, que provoca dores neuropáticas é atribuível normalmente a traumas ou lesões ocorridas nos nervos periféricos, no plexo nervoso ou nos tecidos moles que estão a envolver os nervos. As dores neuropáticas também podem ser uma consequência de uma ou várias patologias subjacentes possíveis, incluindo cancros, doenças ósseas degenerativas e SIDA. A dor neuropática assume diversas formas, contendo em si componentes induzidos e não induzidos (espontâneos). 0 componente induzido da dor neuropática está normalmente associado à hipersensibilídade a estímulos sensoriais e pode integrar uma hiperalgesia (resposta exagerada a um estímulo nóxio), hiperestesia (resposta exagerada a um toque de contacto) e alodinía (percepção dolorosa originada por estímulos mecânicos ou térmicos inócuos). Os pacientes 3 também podem experimentar dores espontâneas que têm diversas manifestações.

Uma dessas manifestações, designada por "causalgia" resulta tipicamente de uma lesão nervosa e caracteriza-se por uma sensação de queimadura continua e grave e alodinia. A neuralgia é uma forma de dor neuropática que resulta de traumas ou irritações ocorridas num nervo periférico e tem sintomas consistentes com a sua etiologia focal. Em alguns casos (tal como nas neuralgias trigeminais), o paciente tem dores lancinantes, paroxismais. Pelo contrário, as neuropatias sensoriais difusas apresentam dores simétricas e distais que afectam tipicamente os pés e as mãos. As dores neuropáticas também resultam de lesões ocorridas nos circuitos somatossensoriais centrais, tais ccmo o circuito somatosensorial ascendente ao nível da medula espinal, do tronco cerebral, do tálamo ou do córtex. Tais lesões podem ter como consequência uma síndroma de dor contínua e espontânea que é sentida na periferia. Presentemente, os médicos procuram combater a dor neuropática com os mesmos fármacos que são eficazes no tratamento de dores nociceptivas; no entanto, os resultados são geralmente frustrantes. Para além dos analgésicos do tipo não narcótico, dos opióídes e dos anestésicos locais, foram feitas experiências para tratar dores neuropáticas em que se recorreu à utilização de anticonvulsionantes ! fenitoína), agentes anti-sistema simpático, antidepressivos tricíclicos e ainda a estimulação dos nervos transcutâneos. 0 documento WO 93/13128 revela que os conopéptídos omega bloqueadores dos canis do cálcio de tipo N conseguem mitigar as dores neuropáticas.

Uma complicação associada às patologias dolorosas neuropáticas é a sua natureza progressiva que resulta do agravamento dos sintomas das dores neuropáticas ao longo do tempo. A etiologia desta degeneração ainda não é 4 perfeitamente conhecida; no entanto, parece que os nervos lesionados e os nervos adjacentes a esses se tornam mais sensíveis a níveis diminutos de estimulação. A presente invenção tem por base a conclusão de que os conopéptidos omega que bloqueiam os canais de cálcio são sensíveis à tensão eléctrica, de tipo N (CCSV, em inglês VSCC) impedem a progressão das patologias dolorosas neuropáticas, em particular quando tais compostos são administrados no local da dor neuropática, de tal modo que os sintomas dolorosos não pioram com o tempo. A presente invenção também divulga uma neva via de administração dos conopéptidos omega para o combate à dor. Tendo em conta a natureza hidrofílica, a natureza da carga eléctrica dos conopéptidos omega e as propriedades de permeabilidade das meninges espinais, admitia-se anteriormente que a administração epidural dos conopéptidos omega poderia exigir a adição de um agente para reforçar a permeabilidade membranar. De acordo com uma conclusão da presente invenção, os conopéptidos omega conseguem mitigar as dores quando administrados por via epidural na ausência de qualquer agente intensificador da permeabilidade membranar, em doses que são comparáveis às doses analgésias eficazes utilizadas quando a administração se faz por via intratecal (v.g., administração directa no fluido espinal). Conforme aqui se descreve, a referida administração epidural é particularmente eficaz quando é executada por forma a que o composto administrado estabeleça um contacto prolongado com um espaço epidural e mais particularmente com as meninges espinais. 0 método aperfeiçoado tem a vantagem de a administração epidural ser tecnicamente menos exigente do que a administração intraspínal do composto e tem riscos menores para o doente. A presente invenção também descreve formulações aperfeiçoadas para conopéptidos omega que conferem 5 estabilidade às soluções que contêm os compostos. Tais formulações são particularmente úteis em métodos de tratamento prolongado (administração contínua). Estas formulações estabilizadas também são úteis para a armazenagem de soluções de conopéptidos a longo prazo.

Descrição abreviada da invenção

De acordo com um dos seus aspectos, a invenção diz respeito à utilização de um conopéptido omega antagonista dos canais de cálcio de tipo N para a preparação de um medicamento para inibir a progressão de uma patologia dolorosa neuropática caracterizada por uma dor neuropática em que o composto é administrado a um paciente no local onde evolui a lesão nervosa por via intratecal, epidural ou intravenosa. 0 conopéptido omega caracteriza-se pela sua aptidão para (a) inibir as contracções do íleo de cobaias, estimuladas electricamente, e (b) se ligar de uma forma selectiva a um local de fixação de MVIIA presente em tecidos neuronais, conforme demonstrado pela aptidão dos compostos para deslocarem o MVIIA para fora desse local.

De acordo com variantes preferidas, o conopéptido omega utilizado no medicamento ainda se caracteriza também pelas particularidades seguintes: (i.) actividades em termos de inibição das contracções do íleo das cobaias e de ligação selectiva ao local de fixação do MVIIA que estão dentro do domínio das actividades das conotoxinas omega MVIIA e TVIA; (ii) actividade de ligação selectiva ao local de MVIIA que é evidenciada pelo coeficiente de selectivídade entre a afinidade de ligação para o local de fixação de MVIIA e para o local 2 de 6 fixação do conopéptido omega, estando tal parâmetro compreendido no domínio de coeficientes de selectividade determinados para os conopéptidos omega com as designações MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX-236, SNX-239 e TVIA/SNX-185; (iii) inclusão de um agente antioxidante eficaz para evitar a oxidação da metionina; (iv) aplicação por administração períneural para inibir a progressão de uma patologia dolorosa neuropática num local de um nervo lesionado; ou (v) selecção a partir dos conopéptidos omega designados por TVIA/SNX-185, MVIIA/SNX-111, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, SNX-279 e seus derivados. A invenção pode ser realizada, através de uma formulação de conopéptido omega estável que inclui um conopéptido cmega e uma composição antioxidante de tampão de ácido carboxílico. De acordo com uma concretização preferida, o tampão ácido carboxílico é uma tampão lactato e também pode conter metionina livre.

Em concretizações preferidas, o conopéptido omega seleccionado para ser utilizado no medicamento é caracterízado por: (i) um coeficiente de selectividade entre a ligação a um local de fixação do MVIIA e a ligação a um local de fixação do conopéptido cmega 2 que está compreendido no domínio de coeficientes de selectividade determinados para os conopéptidos 7 omega designados por MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX-236, SNX239 e TVIA/SNX-185; (íi) incluir no medicamento um conopéptido omega seleccionado entre o conjunto constituído por MVIIA/SNX-111, TVI/SNX-185, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, SNX-279 e seus derivados; (iii) administração do medicamento por infusão contínua; ou (iv) inclusão de uma formulação de libertação controlada para que haja um contacto prolongado do conopéptido com a região epidural.

De acordo com outras concretizações preferidas, o medicamento para administração epidural pode conter um ou vários conopéptidos omega seleccionados entre MVIIA/SNX-111, TVIA/SNX-185, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, SNX-273, , SNX-279 e seus derivados.

Ainda de acordo com outras concretizações relacionadas, a invenção diz respeito ao conopéptido omega designado por SNX-273 que possui a sequência CKGKGAKCSRLAYDCCTGSCRSGKC. A invenção diz também respeito a um conopéptido omega designado por SNX-279 que possui a sequência CKGKGAKCSRLM(0)YDCCTGSCRSGKC, em que o símbolo M(0) indica um resíduo metionina oxidado. Estes dois conopéptidos omega possuem propriedades analgésicas e são adequados para incorporação nos medicamentos descritos supra.

Estes e outros objectivos e particularidades da invenção tornar-se-ão maís claros e compreensíveis após a leitura da presente memória descritiva que explicita minuciosamente a invenção, em conjunto com os desenhos em anexo.

Descrição abreviada dos desenhos 8

As figuras 1 e 2 representam sequências primárias de diversos conopéptidos omega naturais seleccionadcs entre MVIIA/SNX-111 (SEQ ID N°: 01), MVIIB/SNX-159 (SEQ ID N° : 02), GVIA/SNX-124 (SEQ ID N° : 03), GVIIA/SNX-178 (SEQ ID N°: 04), RVIA/SNX-182 (SEQ ID Nc : 05), SVIA/SNX-157 (SEQ ID N°: 06), TVIA/SNX-185 (SEQ ID N°: 07), SVIB/SNX-183 (SEQ ID N°: 08) e MVIIC/SNX-230 (SEQ ID N°: 29) e SNX-231 (SEQ ID N°: 21);

As figuras 3 e 4 representam sequências primárias de MVIIA/SNX-111, incluindo o seu padrão de pontes dissulfureto, e os conopéptidos omega análogos de SNX-111 seleccionados entre SNX-190 (SEQ ID N°: 09), SNX-191 (SEQ ID N°:10), SNX-193 (SEQ ID N°: 11), SNX-194 (SEQ ID N°:12), SNX-195 (SEQ ID N°: 13), SNX-196 (SEQ ID N°:14), SNX-197 (SEQ ID N0:15), SNX-198 (SEQ ID N° 16), SNX-199 (SEQ ID N°: 33), SNX-200 (SEQ ID N°: 17), SNX-201 (SEQ ID N°18), SNX-239 (SEQ ID N° : 32), SNX-240 (SEQ ID N°; 34), SNX-273 ([ala12-SNX-lll; SEQ ID N°: 35) e SNX-279 (Met(O)12 -SNX-111; SEQ ID N°:36), em que Nle designa norleucina e Met(O) designa uma substituição sulfoxi-metionina; A figura 5 representa o conopéptido omega SNX-202 análogo do SVIB/SNX-183 e os conopéptidos omega SNX-207 e SNX-236 análogos do TVIA/SNX-185; A figura 6 representa os conjuntos de conopéptidos omega seguintes: I, MVIIA, SNX-199 (SEQ ID N°:33), MVIIB e SNX-239 (SEQ ID N°: 32); II, TVIA, SNX-207 e SNX-236; III, RVIA, SVIA, GVIIA, SVIB, MVIIC e SNX-231; A figura 7 mostra um traçado da corrente de cálcio polarizada, induzida por uma operação de imposição de uma tensão eléctrica a células do neuroblastoma N 1E-115 não tratadas (curva a) e a células do neuroblastoma expostas a concentrações cada vez maiores de MVIIA (SNX-111) (curvas b-d) ; 9 A figura 8 mostra curvas de ligação competitiva, ajustadas por computador, para a ligação do conopéptido omega ao local de ligação de MVIIA (SNX-lllj nos sinaptossomas do cérebro do rato;

As figuras 9 mostram as curvas de ligação competitiva, ajustadas por computador, para a ligação do conopéptido cmega ao local de ligação MVIIC (SNX-230) nos sinaptossomas do cérebro dc rato; A figura 10 ilustra a eficácia analgésica de uma formulação de SNX-111 que combina metionina em tampão lactato; A figura 11 mostra um traçado do deslocamento da ligação de [125I]SNX-111 aos homogeneizados de pia-máter e aracnóideia do macaco por acção de [Nle12]SNX-lll; A figura 12 mostra histogramas dos limiares de alodinia mecânica em % de MPE em diversos momentos a seguir à injecção epidural de bolus de 30 μg de SNX-111; A figura 13 mostra histogramas dos limiares de alodinia mecânica em % de MPE decorridas após 24, 72, 120 ou 168 horas de infusão intrateeal contínua com solução salina ou de SNX-111 à razão de 0,1 μg/hora; e A figura 14 mostra histogramas dos limiares de alodinia mecânica em % de MPE decorridas 24, 48 ou 72 horas de infusão epidural constante com solução salina ou de quantidades variáveis de SNX-111 no espaço epidural lombar espinal dos ratos.

Descrição minuciosa da invenção 1. Definições

Salvo quando especificado de outro modo, os termos adiante utilizados possuem as definições que a seguir se indica. 10 "Dor" refere-se quer à dor somática (nociceptiva) quer à dor neuropática. "Dor somática e "dor nociceptiva" são termos que podem ser utilizados arbitrariamente para designar uma dor que resulta de um er.tre vários estímulos nóxios ou dolorosos com origem na pele, nos tecidos subjacentes ou nos orgâos internos e que activem as fibras nervosas C e A aferentes periféricas nociceptivas que se projectam até à raiz dorsal da medula espinal e que estabelecem sinapses com fibras aferentes que conduzem a zonas específicas do cérebro. "Dor neuropática" é uma dor que resulta de uma lesão ou de alterações crónicas nos circuitos periféricos ou centrais somatcssensoriais, de etiologia complexa e variável. A lesão nervosa periférica subjacente, que provoca uma dor neuropática, pode ser atribuída tipicamente a traumas ou lesões de um nervo periférico, do nervo do plexo ou dos tecidos moles que envolvem o nervo. A dor neuropática também pode ser uma consequência de uma ou várias patologias subjacentes, incluindo cancro, doenças ósseas degenerativas e SIDA. Este tipo de dor pode assumir diversas formas, conforme se disse antes; no entanto inclui tipicamente o resultado da hipersensibilidade a estímulos sensoriais que podem ser acompanhados por uma sensação persistente de dor na região afectada. Estas múltiplas causas subjacentes de dores neuropáticas são designadas colectivamente por "doenças dolorosas neuropáticas". A frase "progressão de uma doença dolorosa neuropática" diz respeito ao agravamento dos sintomas da dor neuropática ao longo do tempo. Diz-se que um regime terapêutico evita ou retarda a evolução de uma doença dolorosa neuropática se impedir ou evitar o agravamento desses sintomas. Como exemplos específicos de doenças dolorosas neuropáticas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, 11 as neuropatías centrais tais como as que podem ser provocadas por lesões da medula espinal, as neuropatías periféricas tais como a distrofia reflexa simpática (DRS, em inglês RSD), a neuropatia do herpes zoster e a neuropatía diabética, as neuropatías que são uma consequência de lesões dos nervos periféricos e também as dores neuropáticas associadas a causas desconhecidas mas que se manifestam com os sintomas clássicos de uma dor neuropática, por exemplo, os casos de hiperestesia, alodinia e hiperalgesia. C termo "administração perineural" designa a aplicação de um agente terapêutico a um nervo ou a uma zona próxima dele, em particular a um nervo danificado. 0 termo "administração epidural" designa a administração de um composto ao espaço epidural, definido como sendo a região entre a dura-máter e a membrana aracnoideia que envolvem a espinal-medula dentro do canal espinal. 0 termo "administração intratecal" designa a administração de um composto dentro do "espaço subaracnoideo" da espinal medula; o termo "espaço subaracnoideo" designa a região entre a membrana aracnoideia e a pia-máter que envolvem a espinal-medula. A administração de um medicamento " ao local de progressão de uma lesão nervosa" serve para designar todos os meios que permitam colocar o medicamento em estreita proximidade de um nervo ou de um gânglio afectados, de sínapses espinais efectadas ou de uma região afectada de um tecido. Os modos de administração abrangidos por este termo compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as administrações perineural, epidural, intratecal e intravenosa.

Os "conopéptidos omega actívos" são péptidos que (a) bloqueiam os canais do cálcio de tipo N sensíveis à tensão eléctrica, (b) obedecem a determinadas restrições 12 estruturais e (c) têm actividades específicas in vitro em termos de (i) inibição das contracções do íleo da cc-baia, estimuladas electricamente, e (ii) na ligação aos locais de ligação de MVIIA em membranas neuronaís. Tais péptidos possuem ura comprimento de 25-35 aminoácídos e estão em conformidade com outras restrições respeitantes a sequências, conforme descrito na secção IIA da presente memória descritiva. As actividades in vitro são preferencialmente as que pertencem ao domínio de actividades medidas para os conopéptídos omega conhecidos MVIIA e TVIA em ensaios adequados. II. Preparação de__ uma composição terapêutica

Nesta secção descreve-se a preparação de uma composição de um conopéptido omega utilizável para impedir a progressão de uma patologia dolorosa neuropática, em conformidade com a invenção. A Conopéptídos omega activos

Os conopéptídos omega são componentes de toxinas peptídicas ou são obtidos a partir dessas toxinas, sendo produzidos pelos caracóis marinhos do género Conusr que actuam como bloqueadores dos canais do cálcio (Gray et al., 1988) . Nas figura 1 e 2 estão representadas as sequências primárias de 8 conopéptídos omega que ocorrem naturalmente, em que SNX-231 é uma forma alternativa de MVIIC/SNX-230. Utiliza-se o sistema convencional de letras para representar os resíduos de aminoácídos, representando a letra X o resíduo 4-hidróxiprolina, também indicado abreviadamente por 4Hyp. Todos os péptidos indicados na figura são ainídados nos seus terminais C. 1. Característícas estruturais dos conopéptídos omega activos 13

Os conopéptidos cmega úteis para a preparação dos medicamentos da presente invenção obedecem a determinadas restrições físicas e químicas, conforme adiante descrito. Dito de uma forma genérica, os conopéptidos omega úteis no método de tratamento possuem um comprimento de 25-35 aminoácídos e possuem três pontes de dissulfureto em posições especificadas. Nesta secção sãc explicitados outras regras e orientações para a selecção de conopéptidos omega analgésicos; no entanto, faz-se observar que as regras e orientações adiantes apresentadas também servem para os ensaios preditivos in vitro aqui descritos.

Com base numa análise de homologia entre sequências dos péptidos cujas sequências completas estão transcritas na figura 6, é possível agrupar os conopéptidos omega activos que ocorrem naturalmente, em grupos distintos I e II, cada um deles com homologias distintas internas próprias de cada grupo, conforme se pode concluir a partir da figura 6. Há um terceiro grupo que inclui os péptidos inactivos SNX-231 e SVIA (SNX-157) e os conopéptidos omega cujas activídades de ligação ao local de MVIIA nas membranas neuronais e/ ou cuja actividade em termos de inibição da norepinefrina estão fora do conceito de compostos activos.

Os três grupos de conopéptidos omega estão dispostos na figura 6 com os seus 6 resíduos Cys alinhados, o que coloca esses resíduos nas posições 1,8, 15, 16, 20 e 28. Para se fazer este alinhamento, foram introduzidos espaços vazios nas posições indicadas nos 3 grupos. Na análise subsequente, estes espaços vazios conservam o número que lhes está atribuído na figura, ainda que se representem supressões de aminoácídos nos grupos respectivos dos conopéptidos omega activos. 14 A variação sequencial nos péptidos, apenas com base na sua estrutura primária, foi analisada adoptando as restrições a seguir enumeradas. 1. Os péptidos de ambos os grupos activos (I e II) incluem os resíduos Cys nas posições 1, 8, 15, 16, 20, e 28. 2. Os péptidos nos grupos activos possuem 3 pontes dissulfureto que ligam os resíduos Cys nas posições 1 e 16, 8 e 20, 15 e 28. Esta restrição exclui as variações de amínoácidos noutras posições, o que impede ou de alguma forma dificulta a formação das 3 pontes seleccionadas. 3. No grupo I, são aceites as variações de amínoácidos que ocorrem nos 7 resíduos não conservados, incluindo os péptidos em que o terminal carbóxilo é amidado ou tem uma forma de ácido livre. Dito de outro modo, os derivados dos compostos do primeiro grupo possuem as estruturas peptídicas com a forma seguinte: CKGKGA-

Xi-C-X2-X3-X4-X5-YDCCTGSC-X6-R-X7-GKC-t em que Xi=K ou S; X2=S ou H; X3=R, L, ou A; X4=L ou T; X5=M ou S; X6=N ou uma supressão; X7=S ou supressão, e t= um grupo carbóxilo ou um grupo de terminal carbóxilo amidado. 4. No grupo II, são aceites as variações de amínoácidos que ocorrem nos 4 resíduos não conservados, incluindo os péptidos em que o terminal carbóxilo é amidado ou possui uma forma de ácido livre. Assim, sendo, os derivados dos compostos do segundo grupo compreendem as estruturas peptídicas que possuem a forma seguinte: CLSXGSSCS-Xi X2 X3-YNCCRSCN-X4-YSRKCR-t em que Xi=X ou R; X2=? ou L; X3=S ou M, X4=X ou F; e t= um grupo de terminal carbóxilo eventualmente amidado. 5. Considerando conjuntamente os dois grupos activos, são preservadas as posições de aminoácidos que sâo 15 conservadas era todas as espécies activas. Assim sendo, por exemplo, os resíduos Cys, a glicina da posição 5, a tirosina da posição 13, a serina da posição 19 e a lisina da posição 2β são todos resíduos preservados. Os análogos de OCT preferidos ou os seus sais derivados podem ser seleccionados comparando, para efeitos de conservação e substituições intersequênciais, as sequências sobre as quais se sabe que são activas. 6. Considerando os dois grupos activos conjuntamente, há posições de aminoácidos que provavelmente irão ser variáveis no conjunto das espécies activas. Por exemplo, o aminoácido na posição 2 pode ser lisina ou leucina, o aminoácido na posição 3 pode ser glicina ou serina e o aminoácido na posição 4 pode ser hidroxiprolina ou arginina. Além disse, se os dois aminoácidos ou mais de dois aminoácidos na posição variante pertencerem a uma classe de substituição comum, a substituição dentro da classe pode eventualmente ser favorável. As classes de substituição convencionais são as 6 classes que têm por base propriedades comuns das cadeias laterais e a mais elevada frequência de substituição em proteínas homólogas em termos naturais, conforme determinado, por exemplo, por meio de um protocolo convencional com a matriz de Dayhoff para a pesquisa da frequência de trocas (Dayhoff). Estas classes sâo as seguíntes-Classe I: Cys; Classe II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala e Gly, representando pequenas cadeias laterais alifáticas e cadeias laterais de grupos OH; Ciasse III: Asn, Asp, Glu e Gin, representando cadeias laterais neutras e negativamente carregadas capazes de formar ligações de hidrogénio; Classe IV: His, Arg e Lys, representando cadeias laterais polares 16 básicas; Classe V: Ile, Vai e Leu representando cadeias laterais alifáticas ramificadas,, e Met ; e Classe VI: Phe, Tvr e Trp, representando cadeias laterais aromáticas. Além disso, cada grupo pode conter análogos congéneres de aminoácidos, tais como os seleccionados entre ornitína, homoargínina, N-metíl- lisina, dimetil- lisina ou trimet.il- lisina na Classe IV e uma tirosina halogenada no Grupo VI. Além do mais, tais classes podem incluir qualquer dos estereoisómeros L e D, embora sejam preferíveis as substituições com aminoácidos L. 7. Tomando em consideração as espécies inactivas conhecidas (Grupo III), para que haja conservação da actividade nos compostos actívos não são favorecidas as substituições por trocas com aminoácidos que se encontrem presentes nas espécies inactivas, mas não nas espécies activas, em qualquer posição seleccionada dos resíduos.

As regras 6 e 7 anteriormente enumeradas para a selecção de aminoácidos constituem uma orientação para as substituições admissíveis de aminoácidos no conjunto dos conopéptidos omega activos. Uma vez realizada uma substituição ou uma modificação de um aminoácido, submete-se o péptido a pesquisas suplementares para se investigar as necessárias propriedades in vitro que são identificadas pela presente invenção como preditivas de actividade antagonista dos canais de cálcio e as necessárias actividades in vivo em modelos com animais adequados ac estudo da dor. 2. Propriedades farmacológicas e in vitro dos conopéptidos omega activos

Nesta secção descreve-se as propriedades in vitro dos conopéptidos omega activos. Gs conopéptidos omega activos 17 (i) bloqueiam os canais de cálcio de tipo N sensíveis à tensão eléctrica, (ii) são selectivos, ligando-se de forma especifica ao local de ligação do conopéptido omega designado por MVIIA (local i) em membranas neuronais e (iii) inibem a libertação de neurotransmissores no ensaio de contracção do íleo da cobaia, conforme adiante se descreve. a Actividade antagonista dos canais de cálcio

Os conopéptidos omega activos inibem a transmissão de iões cálcio através dos canais do cálcio do tipo N sensíveis à tensão eléctrica (CCSV, em inglês VSCC). É possível medir o bloqueio dos CCSV de tipo N num sistema celular isolado, tal como a linhagem de células do neuroblastoma do murganho da estirpe N1E115 ou na linhagem de células do neuroblastoma humano IMR32, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5364842. As correntes do cálcio do tipo N são bloqueadas pelo conopéptido omega designado por MVIIA, mas não pelas di-hidropiridinas. Mede-se convenientemente as correntes membranares com a configuração celular intacta, por observação ao microscópio com iluminação de campo escuro, em conformidade com o procedimento minuciosamente descrito no exemplo 1. A figura 7 ilustra um traçado da corrente interna de cálcio suscitada por uma operação de variação de tensão eléctrica de -80 mV para -20 mV, em que se utilizou bário (Ba) para substituir o cálcio (Ca) como veículo portador da carga eléctrica através dos canais do cálcio (McCleskey, E. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (8_4:4327—31 (1987)). A curva a corresponde a um traçado de contraprova na presença de nifedipína que é um bloqueador dos canais de cálcio de tipo L que não tem nenhum efeito sobre as características da corrente do canal. As curvas b.......d 18 traduzem o bloqueio do canal por adição de concentrações cada vez maiores do conopéptido ortiega designado por MVIIA. Os conopéptidos utilizados ncs medicamentos da presente invenção também bloqueiam esta corrente. b. Ligação específica, de elevada afinidade, _aos receptores de conopéptidos ornega

Uma das características dos conopéptidos omega activos é a sua aptidão para se ligarem a uma população específica de locais de ligação existentes fundamentalmente em tecidos neuronais. Os compostos di-hidropiridinas e outros bloqueadores dos canais de tipo L não deslocam a ligação da conotoxina omega para fora desses locais. Esta afinidade de ligação pode ser caracterizada, quer pela constante de ligação do composto para o local de alta afinidade ao MVIIA (SNX-111), também designado por "local 1" na presente memória descritiva, e/ ou pela constante de ligação do composto para o local de ligação de elevada afinidade de SVIB (SNX-18 3) ou de MVIIC (SNX-230), também aqui designados por "local 2". As características destes 2 locais distintos de ligação são resumidas adiante. Também é útil caracterízar os conopéptidos omega em função da razão entre as suas constantes de ligação medidas em termos de ligação aos dois locais de ligação. em que A ligação ao local de ligação de MVIIA em tecidos neuronais pode ser demonstrada em diversos tipos de células e em fracções celulares sinaptossómicas. Uma fracção sinaptossómica preferida é uma preparação membranar sinaptossómica do cérebro de mamífero, tal como a preparação sinaptossómica de cérebro de rato aqui descrita no exemplo 2 subsequente. A constante de ligação de um composto para o local de ligação de MVIIA é medida tipicamente num ensaio de deslocamento competitivo, 19 o composto experimentado vai competir com o MVIIA (SNX-111), marcado com radioisótopcs, pela ligação à preparação sinaptossómica.

Utilizando uma análise convencional pela metodologia de Scatchard, numa experiência de ligação com saturação em equilíbrio, calculou-se uma constante de ligação Ka aproximadamente igual a 10 pM para a ligação do conopéptido omega designado por MVIIA às membranas sinaptossómicas do rato. De forma semelhante, foram determinadas as constantes Ka para a ligação das substâncias SVIB (SNX-183) e MVIIC (SNX-230), marcadas com radioisótopos, aos locais de ligação em membranas sinaptossómicas.

Para se determinar a constante de ligação de um composto experimental bloqueador de CCSV de tipo N para o local de ligação, juntou-se o composto experimental, em concentrações cada vez maiores, a uma preparação membranar, tal como uma preparação sinaptossómica, na presença de uma concentração padrão de conopéptido omega designado por MVIIA (SNX-111), marcado com radioisótopos. A seguir filtrou-se rapidamente o material sinaptossómico, lavou-se a testou-se para se pesquisar o radioisótopo marcador ligado. Efectuou-se a análise de curvas de ligação com deslocamento competitivo, tais como as ilustradas na figura 8, em termos de deslocamento da ligação de MVIIA, para se determinar em primeiro lugar o valor de CI5o do composto para o local de ligação de MVIIA, isto é, a concentração que determina um deslocamento de 50% do péptido MVIIA marcado. Determinou-se uma constante Kl em conformidade ccm métodos convencionais a partir do valor Ka do MVIIA e determinou-se também o valor CI50 do composto, conforme minucíosamente explicado nc exemplo 2. A partir desta informação também é possível calcular um valor de potência relativa, conforme descrito. Tal como sucede com o valor Kj., este valor permite fazer comparações entre experiências 20 efectuadas em condições ligeiramente diferentes ou em momentos diferentes. Enquanto o valor CI50 especifico para um composto particular pode variar de preparação para preparação, a ordem de grandeza das afinidades de ligação entre os compostos deve permanecer essencialmente inalterada entre experiências. Ao testar-se um composto para se determinar se irá ser útil para efeitos de incorporação no medicamento da presente invenção, compara-se a potência do composto experimentado com compostos convencionais (tais como MVIIA e GVIA) contidos numa dada preparação, para assim se determinar se o composto experimentado desloca a ligação de MVIIA no intervalo de potências consideradas úteis nos métodos da invenção, conforme adiante se descreve.

No quadro 1 estão agrupados os valores CI50 calculados para diversos conopéptidos omega para a ligação do MVIIA (SNX-111) a um local de ligação do MVIIA ("Local 1") numa preparação sinaptossómica de rato. Os compostos estão dispostos pela ordem crescente dos valores de CI50, estando os valores mais baixos associados às afinidades mais elevadas para o local de ligação. 21 Quadro 1

Competição de Ligação entre 125I-MVIIA (SNX-111) e Conopéptidos Omega Ciso (oM) SNX-207 0,007 SN X-194 0,008 SNX-195 0,009 MVIIA (SNX-111) 0,010 SNX-190 0,021 SNX-236 0,030 SNX-200 0,039 SNX-201 0,046 SNX-202 0,046 SNX-193 0,070 SNX-194 0,090 SNX-239 0,090 MVIIC (SNX-230) 0,32 MVIIB (SNX-159) 0,101 GVIA (SNX-124) 0,134 SNX-198 0,160 SNX-191 0,165 TVIA (SNX-185) 0,228 SNX-196 0,426 RVIA (SNX-182) 0,893 SVB (SNX-183) 1,5 GVIIA (SNX-178) 3,70 SNX-197 11,3 SVIA (SNX-157) 1460,0 | 22

De igual modo, é possível calcular os valores de CI5o e Ki para a ligação de um composto ao local de ligação designado por "local 2" (SVIB/SNX-183 ou MVIIC/SNX-230), tal como se disse anteriormente, determinando o valor de Kd de ligação de SVIB (SMX-183) ou MVIIC (SNX-230), marcados com radioisótopos, a uma preparação sinaptossómica e utilizando depois o deslocamento competitivo do composto marcado, por acção do composto experimentado, para se determinar o valor de CI50 e o valor de Κχ ou os valores de potência relativa do composto experimentado. A figura 9 traduz as curvas de ligação competitiva, ajustadas por computador, para diversos conopéptidos omega cuja ligação aos locais de ligação de SVIB (SNX-183) e/ ou MVIIC (SNX-230) foi examinada. A partir destas curvas fez-se a determinação dos valores de CI50.

Os quadros 2 e 3 enumeram as potências relativas para a ligação de diversos conopéptidos omega aos locais de ligação designados por local 1 e local 2. Estes dados ilustram o modo como quer os valores Κχ (quadro 2), quer os valores CI50 (quadro 3) podem ser utilizados para o cálculo dos coeficientes de selectividade para ligação aos locais de ligação.

De um modo geral, os conopéptidos omega úteis para a preparação de medicamentos da presente invenção irão ter afinidades de ligação para o local de MVIIA, ou um coeficiente de selectividade para o local de MVIIA, tomando como referência a ligação ao local 2, no domínio das afinidades determinadas para os conopéptidos omega designados por MVIIA e TVIA. Maís geralmente, o domínio de coeficientes de selectividade irá ser definido pelos conopéptidos omega seleccionados entre MVIIA/SNX-111, SNX-199, SNX-236, SNX-239 e TVIA/SNX-185. 23

Quadro 2

Selectividade dos Conopéptidos para o Local 1 e para o

Local 2

Composto K5 (nM) para competição com: Selectividade6 para: 11 [12íí]-SíNX-230 Local 1 Local 2 SNX-lll 0,002 150 75000 1 SNX-183 0,43 6 14 : 1 SNX-230 0,20 0,03 1 : 7 a Os valores Ki foram obtidos a partir da análise de ligação competitiva feita conforme descrito na figura 8 b A selectividade é expressa peio coeficiente que resulta da divisão do valor K*, determinado para a competição com a ligação de [125I]-SNX-230 de elevada afinidade, pelo valor Ki para a competição com a ligação [125I]~SNX-111.

Quadro 3

Selectividade dos Conopéptidos para o Local 1 e para o

Local 2

Composto CI50 (nM) para competição com: Selectividade3 para: [ÍI5I]-SNX-111 [,wI]-SNX-230 Local 1 Local 2 SNX-199 0,09 5000 56000 1 SNX-236 0,03 1500 50000 1 SNX-239 0,09 10000 111000 : 1 a A selectividade é expressa pelo coeficiente que resulta da divisão do valor CI:o, determinado para a competição com a ligação de [125l]-SNX-230 de elevada afinidade, pelo valor de CI50( para a competição com a ligação de [i25I]-SNX-líl. c. Inibição selectiva da libertação de neurotransmissores

Os conopéptidos omega activos também inibem a libertação de neurotransmissores em diversas regiões do sistema nervoso. Os neurotransmissores que é possível medir 24 em conformidade com diversos aspectos da presente invenção, são seleccionados, sem que isso constitua qualquer limitação, entre dopamina, norepinefrina, acetilcolina, AGAB (em inglês GABA), glutamato e diversos neurotransmissores peptidicos, tais como péptido associado ao gene da calcitonína.

As experiências feitas com tecidos isolados correspondem a métodos farmacológicos tradicionais para medir efeitos sobre a libertação de neurotransmissores. Um desses métodos consiste em utilizar uma preparação de íleo de cobaia, em que a inibição das contracções estimuladas electricamente está correlacionada com a inibição da libertação da acetilcolina. 0 exemplo 4 descreve a preparação e a experiência minuciosamente. 0 quadro 4 agrupa os valores CI50 para diversos conopéptidos omega sobre a contracção do íleo da cobaia em resposta a um estímulo eléctrico. Os conopéptidos omega activos designados por SNX-111 e SNX-185 são os mais potentes em termos de inibição dessas contracções, ao passo que os compostos inactivos SNX-183 e SNX-157 são muito menos potentes.

Quadro 4

Efeitos dos conopéptidos sobre a contracção do ileo da cobaia estimulada electricamente

Composto CI50 (nM) SNX-111 13 SNX-185 29 SNX-183 91 SNX-157 > 100 25

Dito de forma abreviada, os conopéptidos omega que bloqueiam o CCSV de tipo N e que são úteis para a preparação dos medicamentos da presente invenção revelam determinadas propriedades in vitro e farmacológicas graças ao facto de inibirem a contracção do ileo da cobaia estimulada electricamente e também por se ligarem de forma selectiva aos locais de ligação de MVIIA no tecido neuronal, conforme confirmado para os conopéptidos omega seleccionados entre MVIIA/SNX-111, TVIA/SNX-185, SNX-236, SNX-159, SNX-239, SNX-199, 3NX-273 e SNX-279.

Depois de seleccionados para utilização no medicamento em conformidade com os critérios anteriores confirmados in vitro, é possível testar um conopéptido omega activo em qualquer um dos diversos modelos de neuropatia com animais experimentais para se determinar os domínios de dosagem para os seres humanos. B. Preparação de conopéptidos omega

Os conopéptidos omega podem ser produzidos por métodos de síntese convencionais ou podem ser isolados a partir de fontes naturais. Os péptidos sintéticos e aqueles que ocorrem naturalmente, que possuam a mesma sequência, têm comportamentos praticamente idênticos quando utilizados nos medicamentos aqui descritos. Todos os conopéptidos omega indicados têm três pontes dissulfureto que estão a ligar os resíduos de cisteína le4, 2e5e3e6, conforme indicado para o péptido MVIIA na figura 3. As figuras 3-5 correspondem a análogos ou derivados dos conopéptidos omega naturais MVIIA, TVIÃ e SVIB que foram sintetizados e experimentados em conformidade com a invenção. Nas figuras utilizou-se o código convencional de uma só letra para designar os aminoácídos; além disso, foram utilizadas também as seguintes abreviaturas: X-hidróxiproi i.na; 26

Nle=norleucina; Met(0)=sulfóximetionina; o grupo NH2 no terminal C indica que o péptido é amidado no terminal C; o grupo G-GH indica a existência de uma terminação num resíduo glicina não modificado. Há muitos conopéptidos omega que podem ser adquiridos nos circuitos comerciais (v.g., as substâncias MVIIA, GVIA e MVIIC podem ser adquiridas a "Bachem", Torrance, CA; a substância SVIB pode ser adquirida a "Península Laboratories, Belmont, CA) : Os conopéptidos omega também podem ser sintetizados por métodos convencionais em fase sólida, tal como já descrito (Olivera, B. et ai., Biochemistry 2_3:5087-5090 (1984); e também nas patentes de invenção norte-americanas N°s 5051403 e 5364842). As 3 pontes dissulfureto existentes nos péptidos podem ser produzidas por oxidação ao ar na presença de ditiotreitol (DTT) ou facultativamente na presença de outros compostos que contenham o grupo tiol (v.g., cisteína e glutationa) e ainda podem ser purificados em conformidade com procedimentos já descritos noutras obras (WQ 93/13128). C. Formulações com conopéptidos omega

As soluções de SNX-111 em que a concentração do péptido é inferior a cerca de 0,1 mg/ml oxidam rapidamente quando dissolvidas em água em solução alcalina ou em qualquer um dos inúmeros tampões utilizados na especialidade da química dos péptidos. Tal oxidação resulta de uma diminuição ou da perda de activídade biológica. De acordo com um dos aspectos da presente invenção, concluiu-se que os conopéptidos omega podem, ser bastante bem estabilizados em solução se se impedir a oxidação dos resíduos de metionina existentes na estrutura do péptido. Em particular, o péptido SNX-111, que contém um resíduo metionina na posição 12, é aproximadamente 10 vezes menos 27 potente em termos de inibição dos locais de ligação do cor.opéptido omega designado por MVIIA, quando o seu resíduo metíonina se encontra presente na forma de sulfóxido.

Em experiências realizadas para fundamentar a presente invenção, conclui-se que é possível evitar a oxidação do péptido SNX-111 adicionando o tampão de ácido carboxílico (lactato) à solução de péptido. As soluções de SNX-111 com concentrações compreendidas entre 0,01-0,1 mg/ml são estáveis a 45°C durante várias semanas quando estabilizadas com lactato (150 mM, pH 4-4,5). Além disso, os tampões que contenham metionina na concentração de 50 pg/ml também são eficazes para estabilizar o péptido SNX-111. No presente caso, para tamponar a solução é possível utilizar o tampão lactato 150 mM ou solução salina acidificada a pH 4-4,5.

Tais formulações de conopéptidos omega estáveis são úteis para armazenagem ou para utilização em métodos em que seja necessária uma infusão lenta do composto. A solução pode ser administrada directamente ou neutralizada antes da administração, de acordo com a via particular de administração em que a formulação venha a ser utilizada. Por exemplo, foi já administrada uma quantidade aproximada de 10 μΐ de SNX-111 em tampão lactato (150 mM, pH 4-4,5) directamente na espinal-medula de ratos (via intratecal) sem que tivessem sido observados efeitos secundários dignos de nota. A figura 10 mostra os resultados de experiências que demonstram que o composto SNX-111 administrado sob a forma de uma formulação conjuntamente com metíonina e lactato é tão eficaz como o composto SNX-1 administrado por si só, em termos de redução das dores neuropáticas. Há outras formulações que podem conter os meios necessários para aumentar a capacidade do conopéptido para atravessar os tecidos das meninges que possam estar a envolver o nervo lesionado, ou visado. Os meios para reforçar o transporte do composto são conhecidos na 28 especialidade e podem consistir na encapsulação do conopéptido em membranas lipossómicas, na adição de um agente tensioactivo à composição, na adição de um agente de emparelhamento de iões e outros análogos. 0 transporte transmeníngeo também pode ser facilitado administrando ao paciente uma solução dosifiçadora hipertónica eficaz para destruir as barreiras meníngeas, em conformidade com métodos conhecidos na especialidade. Em alternativa, o transporte transmeníngeo ou transcutâneo pode ser facilitado ainda mais modificando a sequência primária do conopéptido omega, por exemplo, substituindo cadeias laterais de aminoácidos neutros ou radicais hidrofóbicos por resíduos catiónícos. III. Métodos de tratamento A Medicamentos para inibir a evolução de patologias dolorosas neuropáticas A presente invenção assenta no facto de se ter concluído que é possível retardar a evolução de patologias dolorosas neuropáticas num paciente que manifeste os sintomas que se manifestam na fase precoce da dor neuropátíca administrando a esse paciente um conopéptido omega bloqueador do CCSV, de tipo N, activo que possua as características físicas e farmacológicas descritas antes, em particular se essa administração se localizar no local neuropático.

Esta secção descreve os diversos modos de administração que é possível utilizar para impedir a progressão ou a evolução de patologias dolorosas neuropáticas. Nesta secção descreve-se também um modelo exemplificativo de uma patologia dolorosa neuropátíca, caracterizado por alodinía (sensibilidade a um estímulo 29 fraco) em que se utiliza um medicamento à base de um conopéptido omega para impedir a progressão da patologia. 1. Inibição da progressão da dor neuropática 0 modelo de alodinia do rato descrito no exemplo 5 é um modelo exemplificativo de uma patologia dolorosa neuropática. Este modelo constitui um exemplo do modo como os medicamentos da presente invenção podem ser utilizados para inibir a progressão da dor neuropática. Além disso, o modelo foi já utilizado para avaliar intervenções e terapêuticas eficazes para a inibição da progressão da dor neuropática.

Num modelo, depois da ligação experimental de um nervo, os sintomas de dor neuropática aumentam entre o Io e o 7o dias a seguir à lesão nervosa, estabilizando a dor depois num determinado patamar de resposta. Avalia-se a aptidão de um conopéptido omega, seleccionado em conformidade com os princípios explicitados na secção II anterior, para inibir ou para impedir a progressão da neuropatia durante o período que medeia o 1 ° e o 7o dia, administrando o composto ao animal do modelo imediatamente antes, durante ou após a lesão do nervo. Faz-se a medição das respostas do limiar de dor utilizando um paradigma convencional que decorre entre o Io e o 7o dia ou durante um período mais longo, a seguir à lesão da ligação. A referida administração do conopéptido omega é feita em conformidade com qualquer dos métodos descritos na subsecção 2, infra.

Neste modelo exemplificativo, observa-se a inibição da progressão da patologia dolorosa neuropática quando há uma subida do limiar ao estímulo de dor durante c período que medeia entre o 1° e o 7o dia, ou quando há um prolongamento 30 do período de duração do patamar, comparativamente com os animais de contraprova neuropáticos.

As dosagens eficazes e as formulações determinadas r.este modelo podem ser extrapoladas para dosagens equivalentes para animais maiores e para seres humanos, em conformidade com métodos perfeitamente conhecidos na especialidade. 2. Modos de administração dos conopéptidos omega activos para inibir a progressão de patologias dolorosas neuropáticas

Esta secção descreve diversos modos de administração que é possível utilizar para administrar os conopéptidos omega activos ao local de progressão da dor neuropática, com a finalidade de se impedir tal progressão, em conformidade com a presente invenção.

Administração perineural. Os medicamentos que contêm os conopéptidos omega que bloqueiam o CCSV, de tipo N, podem ser administrados por via perineural para se impedir a progressão de patologias dolorosas neuropáticas. No presente caso, os compostos são administrados quer directamente ao nervo afectado, quer às regiões da pele afectadas caracterizadas pela proliferação do surto neurítico que aparece a seguir à lesão nervosa. Para a administração às regiões da pele afectadas, é possível aplicar o composto topicamente, quer por via directa, quer recorrendo à utilização de um aplicador transdérmico.

Esta alternativa, é possível injectar o medicamento, por via subdérmica na região do nervo. De acordo com outra forma de administração perineural, aplica-se um emplastro em torno do nervo lesionado, em que o referido emplastre é feito de uma matriz biodegradável que contém o composto terapêutico bioqueador dos canais de cálcio do tipo N. Em 31 alternativa ou complementarmente, o composto terapêutico pode ser colocado numa vizinhança muito próxima do nervo lesionado, conjugando o composto com uma tala para nervos ou revestindo com o composto uma tala para nervos concebida para reparar nervos lesionados. Como exemplos desse tipo de talas para nervos refere-se os que vêm descritos nas patentes de invenção norte-americanas Ncs. 4534349 e 4920962. A administração permeural também pode ser feita incorporando os conopéptidos omega activos em materiais de sutura, tais como o material de sutura à base de colagéneo descrito na patente de invenção norte americana n° 5308889. Este material é utilizado depois para suturar os tecidos lesionados, tal como acontece nos casos de traumas ou de intervenções cirúrgicas. 0 composto também pode ser aplicado nos locais perineurais por administração transdérmica. De um modo geral, a administração transdérmica implica a utilização de um "emplastro" transdérmico que permite fazer uma administração lenta do composto a uma determinada região da pele. No caso da administração transdérmica dos conopéptidos omega, a referida administração transdérmica pode ser feita preferencialmente utilizando métodos iontofcréticos, conforme descrito na patente de invenção norte americana n° 5032109 (sistema electrolitico de administração transdérmica) e também na patente de invenção norte americana n° 5314502. Eventualmente pode ser desejável incorporar substâncias que aumentem a permeabilidade, tais como substâncias solúveis nas gorduras {v.g., ácidos carboxílicos alifáticos e álcoois alifãticos) ou substâncias solúveis em água (v.g., alcano-polióis tais como os seleccíonados entre etileno-glicol, 1,3-prcpancdiol, glicerol, propileno-glicol e análogos;. Em alternativa, a patente de invenção norte americana nc 5362497 descreve uma "resina superabsorvente de água" que 32 pode ser acrescentada às formulações transdérmicas para se aumentar ainda mais a capacidade de administração transdérmica. Como exemplos de tais resinas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os poliacrilatos, os copolímeros saponifiçados de ésteres de ácido acrílico- acetato de vinilo, copolímeros reticulados de álcool polivinílico- anidrido maleico, polímeros com enxertos de poliacrilonitrilo saponifiçado, os polímeros de amido com enxertos de ácidos acrílicos e análogos. Tais formulações também podem ser utilizadas em pensos absorventes aplicados na região relevante.

Para que tenha lugar uma administração retardada, o composto bloqueador do CCSV de tipo N pode ser incorporado numa composição farmacêutica formulada para libertação lenta, por exemplo, em microcápsulas produzidas a partir de polímeros biocompatíveis conhecidos na especialidade. Para que haja uma libertação contínua dos péptidos, estes podem ser conjugados de forma covalente com um polímero solúvel em água, por exemplo, um polílactídeo ou um hidrogel biodegradável obtido a partir de copolímeros de blocos anfipáticos, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5320840. Os implantes de matrizes à base de colagéneo, tais como os descritos na patente de invenção norte- americana n° 5024841, também são úteis para se fazer uma administração retardada e prolongada dos péptidos terapêuticos. Também é útil, em particular para uma administração subdérmica de libertação prolongada em regiões perineurais, uma composição que contenha um polímero biodegradável que sofra por si próprio um processo de cura e que forme um implante in situ, depois de ter sido administrado no estado líquido. Como exemplo de uma composição desse tipo refere-se a que vem descrita na patente de invenção norte-americana n° 5278202. 33

Embora as dosagens possam variar de acordo com as características físicas de cada paciente, seleccionar-se-à preferencialmente uma dose que permita administrar o produto à razão de 1 a 100 μg/g de tecido na região afectada.

Administração íntratecal. Os medicamentos da presente invenção também podem ser administrados aquelas regiões da espinal-medula, por exemplo, a regiões dorsais salientes em níveis vertebrais afectados onde é estabelecida a ligação polissináptica da sensação de dor. Este tipo de aplicação local pode ser efectuado por administração íntratecal, conforme descrito no documento WO 93/13128.

Os conopéptidos omega activos também podem ser administrados por via Íntratecal mediante infusão lenta. São já conhecidas na especialidade diversas bombas implantáveis ou que podem ser montadas no corpo, úteis para a administração de um composto a um ritmo regulado. Uma dessas bombas, descrita na patente de invenção norte-americana n° 4 619652, é uma bomba que pode ser montada no corpo e que serve para administrar um composto em regime tónico contínuo ou com impulsos periódicos. No caso do conopéptido omega actívo MVIIA ser administrado aos seres humanos por via íntratecal com um caudal contínuo, poderão ser necessárias eventualmente doses compreendidas no intervalo entre 0,1-500 ng/kg/hora para se conseguir obter uma concentração terapêutica do composto.

Administração epidural. A administração às regiões da espinal medula também pode ser feita por injecção epidural aplicada a uma região da espinal medula exterior à membrana aracnoideia. Faz-se observar também que para a administração de conopéptidos omega por esta via pode eventualmente ser vantajoso acrescentar à composição de conopéptidos meios que permitam aumentar a permeabilidade dos conopéptidos através das meninges. Taís meios são 34 conhecidos na especialidade e compreendem a encapsulação lipossómica da composição ou a adição de um agente tensioactivo ou de um agente para o emparelhamento de iões, à composição peptídica. Em alternativa ou complementarmente é possível conseguir obter uma maior permeabilidade da membrana aracnoideia administrando uma solução dosíficadora hipertónica eficaz para aumentar a permeabilidade das barreiras meníngeas.

De acordo com outro dos aspectos da invenção aqui descritos, também é possível efectuar a administração epidural dos conopéptídos omega activos fazendo-se a administração dos conopéptídos omega por via epidural sem a adição de nenhum agente que aumente a permeabilidade membranar. Este aspecto da invenção é discutido adiante na secção IIIB.

Administração intravenosa. É possível recorrer à administração intravenosa dos conopéptídos omega activos para se conseguir obter concentrações terapêuticas do composto em regiões perineurais e/ ou em sinapses espinais, em conformidade com os princípios de tratamento descritos supra. Com o intuito de se conseguir obter concentrações eficazes intra-espinais de conopéptídos omega, eventualmente poderão ser necessárias doses humanas equivalentes a doses compreendidas entre 0,1-15 mg/kg no rato. Além disso, o composto pode ser administrado por infusão intravenosa contínua a um ritmo de 1-10 mg/kg/hora para se conseguir obter níveis terapêuticos. B, Medicamentos para tratar dores por administração epidural

Constitui ainda uma conclusão da presente invenção o facto de se ter confirmado que é possível produzir uma analgesia por administração epidural de um conopéptido 35 omega sem se adicionar à composição nenhum agente para aumentar a permeabilidade das membranas. Esta conclusão foi inesperada, com base nas propriedades hídrofílicas e de cargas eléctricas dos conopéptidos omega e também na permeabilidade relativamente fraca das membranas meníngeas, que estão a envolver o espaço epidérmico, aos compostos que possuem tais propriedades físico-químicas.

Este resultado inesperado pode ser explicado parcialmente pelos resultados de experiências efectuadas para fundamentar a presente invenção, a partir dcs quais ficou determinado que as membranas meníngeas espinais possuem locais específicos de ligação com uma afinidade relativamente baixa, para os conopéptidos omega (exemplo 3, figura 11). Sem pretendermos subscrever nenhuma teoria mecanicista particular, tal inibição pode proporcionar os fundamentos para os resultados observados in vivo. As curvas de ligação competitiva revelam uma fraca ligação não específica (aproxímadamente 20%) e um coeficiente de Hill próximo da unidade, o que é consistente com a ligação a um único local de fraca afinidade. O valor de CI5o calculado é igual a 41 μΜ.

Em experiências realizadas para fundamentar a invenção, sabe-se agora que os conopéptidos omega, tal como definidos antes, podem produzir analgesia em pacientes quando estes compostos são administradas por via epidural em doses equivalentes ou ligeiramente superiores às de uma dose eficaz intratecal (íntra-espínal) do mesmo composto. As doses eficazes intratecais determinadas em ratos sujeitos a experimentação em modelos de alodinía do rato, para o estudo da neuropatia periférica, descritos no exemplo 5, variam entre 0,1-0,3 μg (SNX-239, SNX-159, SNX-273, SNX-279, SNX-111). Quando administrada por infusão intratecal contínua, a dose total do conopéptído omega activo necessária para produzir analgesia é sensivelmente 36 igual (2,4 μg SNX-111) à da dose conseguida por meio de bolus,

Em experiências exemplificativas efectuadas para fundamentar a presente invenção, verificou-se que uma dose epidural de 30 μμ de SNX-111 é eficaz para produzir analgesia num rato que padeça de neuropatia periférica (figura 12). Esta dose está compreendida no intervalo eficaz (3-30 μρ) de doses intratecais de SNX-111 no mesmc modelo experimental. Mais rigorosamente, o conopéptido omega activo SNX-111 produziu analgesia em doses comparáveis quando administrado por difusão intratecal constante à razão de 0,5 μρ/Ιιο^ (figura 13) ou por infusão epidural constante às razões de 0,1, 0,3 ou 1,0 μg/hora (figura 14). Quando o composto é administrado desta maneira, há um contacto prolongado com a região epidural. A partir destes dados é possível concluir que tal contacto prolongado é desejável na administração epidural. Há outras maneiras úteis de se conseguir um contacto prolongado, por exemplo recorrendo a formulações de libertação prolongada, as quais são conhecidas na especialidade e se encontram descritas na secção IIIA2 acima.

Na prática da presente invenção, administra-se a um paciente com dores, por meio de procedimentos convencionais de administração epidural, uma dose analgésica eficaz de um conopéptido activo, no contexto dos termos definidos nas secções I e II acima. O termo "compreendido no intervalo" significa que a dose deve corresponder à dose intratecal eficaz com uma variação possível de cerca de ± uma ordem de grandeza e mais preferencialmente deve ser igual ao valor daquela dose ±0,5 unidades logarímicas dessa dose. Posto isto, no exemplo descrito supra, se uma dose total de 1-3 μα de SNX-111 for eficaz por via intratecal para produzir 37 analgesia num rato, então o intervalo de dosagem para a administração epidural irá estar entre 0,1-30 μς.

Ccnclui-se que a substância SNX-111, nos seres humanos, gera analgesia quando administrada como infusão contínua por via intratecal numa dose compreendida entre 0,3 e 300 ng/kg/hora ao longo de um período de 24 horas. Embora a dose exacta dependa da massa corporal e de outros atributos fisiológicos do doente, uma dose epidural para um ser humano irá estar compreendida no intervalo de doses necessárias para que haja analgesia quando o composto é administrado por via intratecal. Com base nas conclusões anteriores, antevê-se que uma dose epidural eficaz nos seres humanos possa estar compreendida no intervalo entre 0,3 e 3000 ng/kg/hora.

Embora seja preferível que a dose epidural seja administrada por infusão contínua pelo menos durante 24 horas, o médico assistente fará o ajuste deste e de outros parâmetros de dosagem, em conformidade com as necessidades de cada paciente particular, no âmbito dos protocolos clínicos convencionais para a regulação da medicação para as dores. É possível determinar outra informação respeitante às dosagens tomando como referência os modelos animais, conhecidos na especialidade, em conformidade com princípios farmacocinéticos consagrados.

Para além do modelo de alodinia do rato para o estudo da neuropatia periférica, descrito supra, é possível utilizar outros modelos animais padrão, tais como o modelo do golpe súbito na cauda do rato ou o modelo de formalina aplicada ao rato, para se determinar a eficácia e avaliar as doses para o tratamento das dores ncciceptivas utilizando a administração epidural de um conopéptido omega activo. De um modo geral, as doses antinociceptivas são menores do que as doses necessárias para que seja produzida analgesia em pacientes que padeçam de dores neuropáticas. 38

As formulações estabilizadas, conforme descrito na secção IIC anterior, são úteis para a preparação de medicamentos para administração epidural e por tal motivo fazem parte da invenção. Embora possa ser desejável neutralizar as soluções antes da sua administração, as formulações em que se utiliza lactato ou uma solução salina acidificada como excipiente também podem ser administradas directamente por injecção por meio de bolus por via epidural ou intratecal ou por qualquer outra via em que a utilização de excipientes acidificados é adequada. A neutralização, se for necessária, pode ser feita por diluição r.um excipiente tampão neutralizante farmaceuticamente eficaz, imediatamente antes da administração ao paciente.

Os exemplos a seguir descritos têm por finalidade ilustrar as diversas características do método da invenção, mas não se pretende com eles limitar, de forma alguma, o âmbito da invenção.

Exemplo 1

Actividade antagonista dos canais do cálcio: Inibição das correntes iónicas

Examinou-se as correntes iónicas através dos canais do cálcio em células que são polarizadas com um único eléctrodo de polarização de campo escuro. Estes estudos com células completas em campo escuro foram efectuadas em células N1E115 de neuroblastoma do murganho, embora também, possam ser utilizados diversos outros tipos de células, incluindo a linhagem, de células TMR-32 do neuroblastoma humano, para a determinação da actividade antagonista do cálcio. 39 A Métodos de medição da corrente

Foram preparadas soluções para os banhos para possibilitar a medição dos canais do cálcio na ausência de outros canais. As soluções foram preparadas em conformidade com protocolos convencionais e continham N-metil-D- glucamína (NMDG) 80 mM (como substituinte do sódio), cloreto de tetra-etilamónio 30 mM (TEACI) (para bloquear as correntes do potássio), BaCl2 10 mM (como portador de carga eléctrica, através dos canais do cálcio) e tampão HEPES 10 mM a pH 7,3. Algumas soluções também continham quinidina 2 mM (para bloquear as correntes do potássio) e tetrodotoxina 3 μΜ (para bloquear as correntes do sódio). A solução do banho normal continha (em mM): 140 de NaCl, 10 de glucose,

3 de KC1, 2 de CaCl2, 1 de MgCl2, e 10 mM de HEPES a pH 7.3. As soluções intracelulares continham CsCl 150 mM, CaCl2 0,5 mM, EGTA 5 mM, MgCl2 5 mM e K2ATP 2 mM a pH 7,3- 7.4. O banho salino e todas as soluções internas foram objecto de filtração antes da sua utilização.

As pipetas eram feitas de vidro "Corning 7052" (Garner Glass Ccmpany, Claremont, CA 91711), recoberto com "Sylgard" (Dow Corning, Midland, MI 48640) e com acabamento de polimento ao fogo antes da sua utilização. O número de bolhas foi tipicamente de 5 cu 6, sendo as resistências das pipetas tipicamente da ordem de 2-5 Mohms. Utilizou-se também o vidro "Corning 8191, Kimble", e outros tipos de vidros sem nenhum efeito digno de nota sobre as correntes de cálcio observadas.

Os registos foram feitos à temperatura ambiente com um amplificador "Axopatch 1-C" (Axon Instruments, Foster City, CA 94404) e as análises foram efectuadas com recurso à aplicação informática "pCLAMP" (Axon Instruments). Os dados foram filtrados a 1000 Hz para um ritmo típico de amostragem de 0,1 kHz; a análise foi feita no monitor e com 40 impressão produzida por uma impressora de Laser da Hewlett-Packard (Hewlett-Packard, Paio Alto, CA 94306). A experiência típica foi realizada do modo seguinte: após a formação de estanquecidade a que se seguiu a compensação por meio de resistências em série e o cancelamento do efeito capacitivo transitório, executou-se um protocolo de polarização em que c potencial das células foi variando gradualmente a partir do potencial de referência (tipicamente -100 mV) para se testar os potenciais que foram variando entre -60mV e +20 mV por incrementos de 10 mV. Manteve-se as células no potencial de referência durante 5 segundos entre impulsos. B. Medição da inibição da corrente

Foram efectuados traçados da corrente do cálcio a partir de células do neuroblastoma de murganho N1E-115 ilustrado na figura 7. A figura deve ser lida da esquerda para a direita em função do tempo, indicando as deflexões da curva voltadas para baixo a existência de uma corrente positiva a entrar na célula. As correntes foram originadas por uma variação gradual da tensão eléctrica desde 100 mV até -10 mV. Emergiu-se as células em solução salina em que o sódio havia sido substituído por NMDG e em que havia Ba++ 10 mM em vez de Ca++ 2 mM. As correntes de potássio foram bloqueadas por TEA do banho e pelo Cs+ na solução da pipeta.

Os três traçados representados na figura 7, identificados pelas letras b-d, revelam uma diminuição das correntes do cálcio, com o aumento das concentrações do conopéptido omega designado por MVIIA, tendo sido experimentadas as concentrações de 10 nM (b) , 50 nM (c) e 200 nM (d). 41

Exemplo 2

Ligação do conopéptido omega aos locais de ligação do conopéptido omeqa em membranas sinaptossómicas A Preparação _ de membranas sinaptossómicas e de sinaptossomas de cérebros de mamíferos.

Foram preparados sinaptossomas a partir do cérebro intacto de rato ou a partir da regiâc do hipocampo do rato. Depois dos ratos terem sido sacrificados, removeu-se-lhes os prosencéfaios que foram seguidamente transferidos para 10 mL de uma solução de sacarose 0,32 M arrefecida com gelo, que continha os seguintes inibidores de proteases IP): EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, pepestatina a 1 μΜ e leupeptina a 2 μΜ. Fez-se a homogeneização dos cérebros utilizando um homogeneizador de vidro recoberto com "Teflon", accionado por um motor (aproximadamente 8 operações a 400 rpm) . Juntou-se os homogeneizados de 4 cérebros e fez-se a sua centrifugação a 900 x g durante 10 minutos a 4°C. A seguir fez-se a centrifugação dos sobrenadantes a 8500 x g durante 15 minutos. Com as massas resultantes preparou-se nova suspensão em 10 ml de cada uma das soluções de sacarose 0,32 M, arrefecidas com gelo, contendo também os IP, sob agitação vigorosa em vórtice. Centrifugou-se depois a suspensão a 8500 x g durante 15 minutos. Com a massa obtida preparou-se nova suspensão em 20 mL de solução de sacarose 0,32 M, arrefecida em gelo, mais IP. Aplicou-se a suspensão (5 ml/tubo) sobre um gradiente de densidade de sacarose para 4 concentrações (7 ml cada: sacarose 1,2 M, sacarose 1,0M, sacarose 0,8 M e sacarose 0,6 M; todas as soluções de sacarose continham IP) . Fez-se a centrifugação dos tubos com as diversas concentrações numa centrifugadora com um rotor oscilante de baldes a trabalhar a 160000 x g durante 42 60 minutos a 4°C. Recolheu-se a camada de sacarose 1,0 M mais o produto de interface entre as camadas de sacarose 1,0 M e 1,2 M e diluiu-se tudo com água desionizada, arrefecida em gelo, contendo IP, para se obter uma concentração final de sacarose igual a 0,32 M. Efectuou-se a centrifugação da suspensão resultante a 20000 x g durante 15 minutos. Com a massa obtida preparou-se nova suspensão em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato contendo IP, arrefecido com gelo. Os sinaptossomas de cérebro de rato resultantes foram depois distribuídos por aliquotas e guardados num sistema de confinamento em azoto líquido.

Antes da sua utilização nos ensaios de ligação, os sinaptossomas foram descongelados e diluídos com três volumes de água desionizada, arrefecida com gelo, contendo os IP, Homogeneizou-se esta suspensão utilizando um aparelho de modelo "PT 10-35 Polytron" (regulado para a posição 6), tendo sido executados 10 operações de 10 segundos cada uma. Centrifugou-se o homogeneizado a 40000 x g durante 20 minutos a 4°C. Com a massa resultante preparou-se nova suspensão em cerca de 5 ml de solução salina tamponada com fosfato, arrefecida em gelo, contendo também os IP. A preparação resultante da membrana sinaptossómica de cérebro foi distribuída por aliquotas e guardada a -80°C para posterior utilização. Determinou-se a concentração das proteínas na preparação membranar, utilizando o reagente de Bradford (BioRad), tendo sido utilizado como padrão albumina de soro de bovino. B. Ensaio de ligação com deslocamento competitivo 1. Deslocamento competitivo de MVIIA de OCT. Com as membranas sínaptossómicas de cérebro de rato, preparadas conforme descrito na parte A, preparou-se uma suspensão em tampão de ligação constituído por HEPES 20 mM a pH 7,0, 43

NaCl 75 mM, EGTA 0,1 mM, EDTA 0,1 mM, leupeptina 2 μΜ, aprotinina na concentração de 0,035 μg/ml e 0,1% de albumina do soro de bovino (ASB). Distribuiu-se por aiiquotas as substâncias [l23I]-MVIIA (SNX-111) OCT (25— 30000 c.p.m., aproximadamente 1500-2000 Ci/mmol) e o composto de teste, dentro dos tubos de polipropileno, na ausência ou na presença de 1 nM de MVIIA (SNX-111) OCT para se determinar a ligação não especifica. Diluiu-se a suspensão membranar e distribuiu-se por aiiquotas pela última vez dentro de tubos de ensaio, de tal modo que em cada tubo de ensaio passou a haver 10 μg de proteínas membranares num volume total de 0,5 ml. Após um período de incubação de 1 hora à temperatura ambiente colocou-se os tubos em banho de gelo e a seguir efectuou-se a filtração, através de filtros "GF/C (Whatman), que haviam sido previamente embebidos em solução de polietilenoimina a 0,6% e previamente lavados com tampão de lavagem (HEPES 20 mM a pH 7,0 e NaCl 125 mM contendo 0,1% de ASB), utilizando um sistema de filtração "Míllipore". Imediatamente antes da filtração introduziu-se em cada tubo de ensaio 3 ml de tampão de lavagem arrefecido com gelo. As membranas filtradas foram lavadas com dois volumes de 3 ml de tampão de lavagem arrefecido com gelo, efectuou-se a secagem e mediu-se a radioactividade ligada ao filtro utilizando para tal um contador de raios γ de modelo "Beckman" (tem uma eficiência de contagem igual a 75%).

Efectuou-se o cálculo dos valores de CI50 a partir das curvas ajustadas à linha de deslocamento competitivo, geradas por uma função logística de 4 parâmetros. Estes valores representam a concentração do composto testado, necessárias para inibir em 50% a ligação específica total de [125I]-MVIIA (SNX-111) OCT às membranas sinaptossómicas do cérebro de rato, definindo-se a ligação específica como 44 sendo a diferença entre a ligação de [125I]-MVIIA (SNX-lll) OCT na ausência e na presença de excesso (1 nM) de MVIIA OCT não marcado. A ligação não especifica é a ligação do composto marcado com radioisótopos que é medida na presença de excesso de MVIIft OCT não marcado. Tais valores servem de aproximação às afinidades relativas de um conjunto de compostos para um local de ligação específico. 2. Deslocamento competitivo de SVIB de OCT. Realizou-se a preparação de membranas sínaptossómicas de cérebro de rato conforme descrito acima. Marcou-se com radioisótopos a substância SVIB de OCT, por iodação com 125I, mediante a reacção do iodogénío. A ligação da substância SVIB por deslocamento, marcada com radioisótopos às membranas sínaptossómicas do cérebro de rato foi efectuada conforme descrito no exemplo 4B. Os valores CI50 e os valores de potência relativa foram calculados conforme adiante se descreve. Os quadros 2 e 3 indicam os valores de potências relativas dos omega conopéptidos examinados, e a razão das potências relativas dos compostos para o local de MVIIA de OCT e para o local de ligação de SVIB.

Calculou-se a constante de ligação (Ki) para cada substância testada, recorrendo a uma análise de regressão não linear dos mínimos quadrados (Bennett, G. J. e Xie, Y-K, Pain 33/.87-107 (1988)) com os dados de ligação competitiva para duas experiências efectuadas em duplicado em ocasiões separadas. A relação entre os valores PR e CI50 (a concentração à qual ocorre a deslocação de 50% do composto marcado por acção do composto experimentado é expressa pela equação de Chen-Prusoff:

Ki=CIso/(l+[L]/Kd) , 45 era que a grandeza CI50 é a concentração da substância experimentada que é necessária para reduzir em 50% a ligação especifica do ligando marcado; [L] é a concentração da substância [125I]-MVIIA (SNX-111) OCT utilizada na experiência; KG é a constante de ligação determinada para a ligação de [125I]-MVIIA (SNX-111) OCT às membranas sinaptossómicas do cérebro de rato em experiências de ligação na saturação. 0 quadro 3 agrupa os valores CI50 calculados para diversos conopéptidos omega para o local das membranas sinaptossómicas do cérebro de rato onde tem lugar a ligação de MVIIA. A potência relativa para o deslocamento da ligação é calculada em termos da razão entre os valores de ΟΙ50 para o composto experimentado e os valores CI50 para um composto de referência. O composto de referência é geralmente o equivalente não marcado do ligante marcado. 0 cálculo da potência relativa é feito de acordo com a expressão seguinte: flog (potência relativa) ]=log (CI3o<ref)-log (CI50(testei)

Exemplo 3

Ligação às membranas meníngeas

As membranas meníngeas foram obtidas a partir de medulas espinais (T3 a L5) de primatas Macaque nemestrina. Efectuou-se-lhes a remcção das medulas espinais, tende sido feitas incisões simultaneamente, através das 3 camadas meníngeas ao longo das superfícies ventrais. Recolheu-se cuidadosamente e conjuntamente as membranas dura-máter, aracnoideia e pia-máter a partir de cada espinal medula, tendo sido conservadas as suas relações anatómicas normais.

Cortou-se em fatias delgadas as membranas espinais pia-máter e aracnoideia congeladas e com essas fatias preparou-se uma suspensão em 5 ml de água desionizada que 46 continha ínibidores das proteases (EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, pepestatina 1 μΜ e leupeptina 2 μΜ) , fez-se a homogeneização com um aparelho "Polytron" (PT-10-35, velocidade regulada para a posição 6) durante 10 segundos e fez-se a centrifugação a 40000 x g durante 20 minutos. Com a massa membranar preparou-se nova suspensão em 5 ml de tampão fosfato 0,05 M a pH 7,4 que continha os ínibidores de protease e guardou-se tudo em azoto líquido até posterior utilização. Determinou-se a concentração das proteínas na preparação membranar utilizando o reagente de Bradford (Biorad) em que a albumina de soro de bovino (ASB) serviu de padrão. Marcou-se radioactivamente a substância MVIIA OCT utilizando o radioisótopo 125I, por reacçâo com "IodogenMR", essencialmente em conformidade com o método de Ahmad, S. N. e Miljanich, G. P., Brain Research 453:247-256 (1988) . Os ensaios de ligação foram feitos à temperatura ambiente em tubos de polipropileno com as dimensões de 12x75 mm. O tampão de ligação continha HEPES 20 mM a pH 7,2, NaCl 75 mM, EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, leupeptina 2,0 μΜ, 0,5 U de aprototinina e 0,1% de ASB. A mistura de ligação continha 5 μg de membranas meníngeas em 0,2 ml de tampão de ligação, x'5I-SNX em 0,1 ml de tampão de ligação e ainda mais 0,2 ml de tampão de ligação para se fazer um volume final igual a 0,5 ml por tubo. As curvas de ligação pela competição de 125I-SNX-111 foram geradas adicionando diversas concentrações de SNX-194 ([Nle12]SNX-lll) aos tubos de ensaio. Determinou-se a ligação não específica na presença de 500 μΜ de SNX-194. Extinguiu-se a reacção transferindo os tubos de ensaio para um banho maria arrefecido com gelo e diluindo cada amostra com 3 ml de tampão de lavagem fortemente arrefecido (HEPES 20 mM a pH 7,2 NaCl 125 mM e 0,1% de ASB). Separou-se a radioactividade ligada às membranas utilizando um sistema de filtração com um colector de várias entradas "Míllípore" 47 equipado com filtros de fibra de vidro que haviam sido pre\riamente mergulhados em polietilenoimina a 0,6%. Efectuou-se a lavagem dos filtros duas vezes (3 ml) com tampão de lavagem arrefecido com gelo e fez-se a contagem da radioactividade num contador de raios γ "Bechman" (modelo G-500) com uma eficiência de contagem igual a 75%. Fez-se o ajustamento dos dados a uma função logística de 4 oarâmetros:

Efeito=Ec+ (Ei-Eo) . 1/[1+ (K/L) h] em que E0 é o efeito para a dose nula, (Ei é o efeito para uma dose infinita, K=CI5o, L é a concentração do ligando competidor e h é o declive. Os valores dos parâmetros foram calculados utilizando um algoritmo não linear para ajustamento da curva aos mínimos quadrados, a correr num computador (Hewlett-Packard 9000) .

Exemplo 4

Inibição das contracções do íleo da cobaia estimuladas electricamente

Nesta experiência foram utilizadas cabaias com 300-400 g que foram decapitadas e às quais se removeu depois o íleo. Aplicou-se imediatamente uma secção de íleo retirada a cerca de 6 cm do cego, em tampão de Krebb modificado que se manteve a 37°C em banho maria e arejou-se com uma mistura constituída por 95% de 02 e 5% de C02. A solução tampão continha: KC1 4,6 mM, KH2PQ4 lf2 mM, MgS04 1,2 mM, glucose 10,0 mM, NaCl 118,2 mM, NaHCCh 24,8 mM e CaCl2 mM.

Efectuou-se o corte de pequenos segmentos de íleo que foram repuxados sobre uma pipeta de vidro e depois de abertas incisões removeu-se-lhes o músculo longitudinal. 48

Fixou-se cada segmento a um eléctrodo por uma das extremidades e a um transdutor de força pela outra extremidade. Mergulhou-se a preparação num banho de orgãos mantido a 37°C e arejou-se com uma mistura de O2 e CO2. Regulou-se para 1 g a força que impõe a tensão em repouso e estimulou-se os tecidos com uma tensão eléctrica de 30-50 V com uma duração de 4,5 ms por cada estimulação.

Fez-se o registo das respostas da linha de base (contracções) durante 10-15 minutos e acrescentou-se aiiquotas de 100 ml de fármaco ao banho de orgãos até ocorrer a inibição. A seguir aos testes efectuou-se a lavagem dos tecidos até se obter novamente a magnitude original da resposta.

Exemplo 5

Modelo de alodinia do rato da neuropatia periférica O modelo animal aqui descrito assemelha-se à patologia humana designada por causalgia ou distrofia reflexa do simpático (DRS) secundária relativamente à lesão de um nervo periférico. Esta patologia caracteriza-se por hiperestesia (maior sensibilidade a um estímulo natural), hiperalgesia (sensibilidade anormal à dor), alodinia (fragilidade generalizada, caracterizada por uma hipersensibilidade a estímulos tácteis) e dores espontâneas semelhantes a queimaduras. Estes sintomas de um modo geral, aumentam ou progridem com o tempo. 0 modelo experimental adiante descrito foi concebido para provocar de forma reprodutível lesões nos nervos periféricos (nervos espinais L5 e L6) dos ratos. Neste modelo, os ratos desenvolvem um estado de hiperestesia que pode ser medido. No presente caso mediu-se a alodinia por estimulação das patas traseiras de ratos neuropáticos, 49 utilizando fios metálicos de dureza e espessura calibrados. Os compostos analgésicos inverteram a sensibilidade acentuada que esses animais manifestam perante o estimulo. Os dados obtidos com um modelo destes tipo são geralmente expressos em percentagem do efeito máximo, em que o valor do efeito máximo indica uma inversão completa da alodinia induzida por via cirúrgica, ou então a insensibilidade relativa a um estímulo máximo fornecido por um "fio metálico" ou "arame" de 15 g.

Para a administração intratecal dos compostos, foram utilizados ratos (machos) da estirpe Sprague-Dawley (250-350 g) , que foram preparados com catéteres intratecals lumbares crónicos inseridos sob anestesia com halotano (Yaksh, T. L. e Rudy, T. A, Physiol. Behav. 17:1031-1036 (1976)).

Cirurgia neurcpatogénica. Efectuou-se a anestesia de animais com pentobarbital sódico com os animais deitados em pronação, e tendo os músculos paraspinais esquerdos sido separados dos processos espinosos aos níveis L4-S2, conforme descrito por Kim e Chung (Kim, S. H. e Chung, J. M., Pain 50:355-363 (1992)). As raízes dos nervos L5 e L6 esquerdos foram expostas e ligadas perfeitamente com fio de seda para sutura cirúrgica de calibre 6-0.

Deixou-se os animais recuperarem da cirurgia neuropatogénica e depois mediu-se as respostas nociceptivas diariamente até os animais apresentarem sinais consistentes de alodinia mecânica (aproximadamente) 7-10 dias). Para a administração epidural dos fármacos implantou-se depois nos animais catéteres epidurais espinais (lumbares) de aplicação permanente, de acordo com o procedimento de Durant e Yaksh (Durant, P. A C. E Yaksh, 1. L. Anesthesiology 64 :43-53(1986)), com modificações pouco significativas. Administrou-se a substância SNX-111 ou apenas veículo (solução salina), quer por injecção de bolus 50 um dia após a colocação do catéter ou por infusão continua a um ritmo constante com início no momento da implantação do catéter. Para a injecção por holus, administrou-se a substância SNX-111 segundo um volume de 30 μΐ a que se seguiu a administração de 10 μΐ de solução salina para limpeza do tubo. Para a infusão epidural contínua ligou-se os catéteres às minibombas osmóticas de instalação permanente e fez-se a administração das soluções que se pretendia testar à razão de 0,5-1,0 μΙ/hora. Mediu-se os limiares de alodinia mecânica imediatamente antes e a intervalos determinados, durante ou após a administração de SNX-111.

Para a administração intratecal dos fármacos intrcduziu-se os catéteres no espaço subaracnoideu lumbar e por eles fez-se passar tubos de polietileno (PE-10) carregados com solução salina, conforme descrito por Yaksh e Rudy (Yaksh, T. L. e Rudy, T.A, Physiol. Behav. Γ7: 1031-1036 (1976)). Fixou-se o catéter com suturas permanentes ao tecido muscular adjacente onde emergiu a partir da cisterna magna. Para a injecção de bolus, dissolveu-se o composto que se pretendia testar em solução salina e administrou-se um volume de 10 μΐ, através do catéter intratecal, seguindo-se a administração de 10 μΐ de solução salina para limpeza do tubo do catéter. A infusão contínua foi realizada conforme descrito antes.

Concedeu-se aos animais pelo menos 3 dias para recuperarem da cateterização antes de se fazer a avaliação dos limiares de alodinia mecânica. Confirmou-se que a alodinia começava tipicamente ao fim de 1-2 dias após a intervenção cirúrgica e prosseguia durante 45 dias. Os animais que manifestaram deficiências motrizes foram excluídos do estudo subsequente. Para se avaliar o limiar de um estímulo não deletério, necessário para provocar a retirada da pata traseira esquerda (alodinia), fez-se uma 51 aplicação sistemática de filamentos de Von Frey (Stoelting, Wood Dale, IL) de rigidez variável (variando entre 0,4-15 g) na região plantar, tratada cirurgicamente, das paras traseiras. Manteve-se o fio metálico pressionado contra a superfície com uma força suficiente para que tivesse lugar um ligeiro encurvamento, e assim se manteve durante 6-8 segundos. No caso de não haver resposta, testou-se o fio metálico de dureza e espessura ímedíatamente a seguir. O aparecimento de uma resposta de retirada vigorosa foi motivo para se testar a intensidade de estímulo imediatamente mais baixo na escala. Repetiu-se este paradigma de acordo com um método estatístico (Dixon, W. J., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20:441-462 (1976)) para se definir o limiar de resposta a 50%. A existência de alodinia ficou demonstrada por um limiar de resposta inferior a 3 g (relativamente à intensidade do estimulo com o fio metálico) manifestado por todos os animais tratados cirurgicamente. O limite superior do estímulo mecânico para a determinação do limiar foi regulado para 15 g. Valores em percentagem dos EPM próximos de 100% indicam a existência de limiares mecânicos normais (isto é, iguais ou próximos de 15 g) ; valores próximos de 0 indicam a existência de alodinia. Depois de completados os testes, os animais foram mortos e as suas colunas vertebrais foram dissecadas para se confirmar a posição dos catéteres e para se examinar o estado das pontas dos catéteres. A seguir fez-se a remoção dos catéteres e a sua limpeza com solução salina para se detectar fugas e para se confirmar a potência. Os animais em que os catéteres estavam obstruídos ou não estavam adequadamente colocados no espaço epidural foram excluídos do estudo.

Os dados obtidos com este modelo sâo expressos era termos de efeito percentual máximo (EPM%), determinado de 52 acordo com a equação subsequente, em que o efeito máximo indica a existência duma inversão completa da alodinia ou a existência de insensibilidade ao estimulo (o termo máximo significa a utilização de um fio metálico com o valor critico de 15 g) . Uma linha de referência igual a zero indica a existência de uma sensibilidade média inferior à que corresponde a um fio metálico de 3 g. EPM % = Limiar novo (g) - limiar de referência (g) x 100 15 g - Limiar de referência (g)

De acordo com esta análise, quanto mais elevado for o valor do EPM(%), tanto melhor será o efeito antinociceptivo. Os conopéptidos activos, incluindo os conopéptidos SNX-273 e SNX-279, bloqueiam a alodinia mecânica significativamente em comparação com a contraprova de solução salina. A ordem aparente de potência para a supressão da alodinia é SNX-lll=SNX-273>SNX-279. Isto é consistente com as afinidades relativas dos compostos para o local de ligação de SNX-111 (valores CI50: SNX-111 a 8 pM, SNX-273 a 8 pM e SNX-279 a 40 pM).

Examinou-se também os animais à procura de disfunções motoras gerais, conforme comprovado pela inaptidão para se deslocarem simetricamente, e também à procura de outros sinais evidentes de actividade invulgar. Não foram observados nenhuns efeitos sobre a actividade motora nos animais tratados com solução salina; observou-se um tremor, dependente da dose, característico da administração da substância SNX-111 nos animais aos quais se administrou essa substância SNX-111. A Inibição da progressão das dores neuropáticas 53

Administrou-se aos animais a substância SNX-111 para se avaliar a capacidade para impedir o desenvolvimento de neuropatia, conforme demonstrado pela redução do desenvolvimento da alodinia mecânica e da térmica. Implantou-se nos animais catéteres permanentes, intravenosos (veia jugular direita) ou intratecais espinais, fixados a minibombas osmóticas implantadas subcutaneamente (Alza Corp. Paio Alto, CA) para se impor uma infusão contínua com caudal constante de composto ou de veicule (solução salina fisiológica acidificada a pH 4-4,5). Para efeitos de estudos crónicos, deixou-se os animais recuperarem durante 24 horas antes de serem submetidos ao procedimento cirúrgico descrito supra para se produzir uma lesão nervosa periférica. A infusão de fármaco ou de veículo começou no dia anterior ao da intervenção cirúrgica. As doses de SNX-111 testadas nos estudos iniciais foram 100 \iq/kq/hora i.v. (14 dias) e de 100 ng/kg/hora i.t. (14 dias).

Avaliou-se a alodinia mecânica diariamente durante cerca de quarenta (40) dias, começando no dia anterior ao da intervenção cirúrgica e utilizando como estímulos os fios metálicos de Van Frey, conforme descrito antes. Efectuou-se a comparação dos limiares médios dos estímulos, ao longo do tempo, para animais tratados com o fármaco e para animais de contraprova (tratados apenas com veículo),

Além disso, num conjunto separado de animais tratados, foram aplicados estímulos térmicos como forma de estímulos agudos ou persistentes. Os estímulos agudos são administrados aplicando acetona na superfície plantar da pata afectada e efectuando a contagem das retiradas repentinas das paras em resposta à aplicação. Mediu-se a resposta aos estimules persistentes colocando os ratos sobre uma chapa de latão mantida a uma temperatura neutra (3 0 ° C) ou a uma temperatura fria (5°C). Decorridos 5 54 minutos de adaptação, faz-se a medição do período cumulativo durante o qual cada rato mantém a sua pata fora da placa, durante um período de observação de 5 minutos. Depois faz-se a análise dos dados conforme descrito antes.

Exemplo 6

Formulações com tampão de lactato-metionina

Testou-se a eficácia analgésica da substância SNX-111 administrada por via espinal, utilizando uma formulação de tampão lactato-metionina, em conformidade com o paradigma minuciosamente explicitado no exemplo 5. Dissolveu-se SNX-111 (10 μρ/ιηΐ) e L-metionina (50μς/πι1) num veículo constituído por lactato de sódio (150 mM) ajustado para o valor de pH 4-4,5 com ácido láctico 250 mM. Utilizou-se esta formulação para fornecer 0,1 pg de SNX-111 por via intratecal, conforme descrito no exemplo 5, decorridos 30, 60, 120 e 240 minutos após o tratamento com o composto que se pretendia testar ou com a substância de contraprova. A figura 10 mostra os efeitos de alodinia mecânica que resultam de uma única injecção intratecal por bolus com aplicação de 10 μς/τηΐ (círculos) , ou tampão lactato (150 mM) contendo 50 μς/πιΐ de metionína (quadrados a cheio) ou sem SNX-111 (triângulos a cheio) . Nem a solução salina por si só nem o tampão de contraprova constituído por lactato de metionína por si só foram eficazes para suprimir a alodinia, ao passo que a formulação de SNX-111 foi eficaz para esse efeito. Além do mais, verificou-se que os valores de EPM(%) para os animais de contraprova tratados com soluto salino não foram significativamente diferentes dos correspondentes valores observados com os animais aos quais foi administrado apenas o tampão de metionina-lactato. 55

Embora a invenção tenha sido descrita tomando como referência concretizações particulares, é evidente para os especialistas na matéria que é possível introduzir diversas alterações e modificações sem que haja afastamento do espírito da invenção.

Lisboa, 20 de Junho de 2007

Claims (3)

1 Reivindicações 1. Utilização de um conopéptido omega bloqueador dos canais de cálcio de tipo N, sensíveis à tensão eléctrica, caracterizado pela sua aptidão para (a) inibir a contrscção do íleo da cobaia estimulada electricamente e (b) se ligar selectivamente aos locais de ligação do conopéptido omega designado por MYIIA existente no tecido neuronal, conforme comprovado pela aptidão do conopéptido omega para deslocar o MYIIA para fora desse local, para a preparação de um medicamento para inibir a progressão de uma patologia dolorosa neuropática, em que o conopéptido omega é administrado por via intratecal a um paciente no local de progressão de uma lesão nervosa.

2. Utilização de um conopéptido omega bloqueador dos canais de cálcio de tipo N, sensíveis à tensão eléctrica, caracterizado pela sua aptidão para (a) inibir a contracção do íleo da cobaia estimulada electricamente e (b) se ligar selectivamente aos locais de ligação do conopéptido omega designado por MVIIA existente no tecido neuronal, conforme comprovado pela aptidão do conopéptido omega para deslocar o MVIIA para fora desse local, para a preparação de um medicamento para inibir a progressão de uma patologia dolorosa neuropática, em que o conopéptido omega é administrado por via epidural a um paciente no local de progressão de uma lesão nervosa.

3. Utilização de um conopéptido omega bloqueador dos canais de cálcio de tipo N, sensíveis à tensão eléctrica, caracterizado pela sua aptidão para (a) inibir a contracção 2 do íleo da cobaía estimulada electricamente e (b) se ligar selectivamente aos locais de ligação do conopéptido omega designado por MVIIA existente no tecido neuronal, conforme comprovado pela aptidão do conopéptido omega para deslocar o MVIIA para fora desse local, para a preparação de um medicamento para inibir a progressão de uma patologia dolorosa neuropática, em que o conopéptido omega é administrado por via intravenosa a um paciente. Lisboa, 20 de Junho de 2007