PT1572725E - Péptidos de qui-conotoxina possuindo um ácido piroglutâmico n-terminal - Google Patents

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS DE QUI-CONOTOXINA POSSUINDO UM ÁCIDO PIROGLUTÂMICO N-TERMINAL" A presente invenção refere-se a novos péptidos de χ- conotoxina úteis como inibidores de transportadores de amina neuronial de neurotransmissores tais como noradrenalina, serotonina, dopamina, ácido glutâmico e glicina. A invenção também se refere a composições farmacêuticas compreendendo estes péptidos e à utilização destes péptidos na profilaxia ou tratamento de condições tais como, mas não se limitando a, dor, inflamação, incontinência, condições cardiovasculares e distúrbios do humor.

Os caracóis marinhos do género Conus (caracóis de cone) utilizam uma estratégia bioquímica sofisticada para capturar a sua presa. Como predadores de peixe, vermes ou outros moluscos, os caracóis de cone injetam a sua presa com veneno contendo um cocktail de péptidos bioativos pequenos. Estas moléculas de toxina, que são referidas como conotoxinas, interferem com a neurotransmissão visando uma variedade de recetores e canais de iões. O veneno de qualquer espécie Conus simples pode conter mais do que 100 péptidos diferentes. As conotoxinas são divididas em classes com base no seu alvo fisiológico. A classe de péptidos ω-conotoxina visa e bloqueia os canais de Ca sensíveis à tensão inibindo a libertação de neurotransmissor. As α-conotoxinas e ψ-conotoxinas visam e bloqueiam os recetores nicotínicos ACh, originando bloqueio gangliónico e neuromuscular. Os péptidos da classe de μ- conotoxina atuam no sentido de bloquear os canais de Na+ sensíveis à tensão inibindo os potenciais de ação dos 2 músculos e tecido nervoso. As δ-conotoxinas visam e retardam a inativação de canais de Na+ sensíveis à tensão, melhoramento a excitabilidade neuronial. A classe de péptidos κ-conotoxina visa e bloqueia os canais de K+ sensíveis a tensão, e estes também originam excitabilidade neuronial melhorada. As conopressinas são antagonistas do recetor de vasopressina e as conantocinas são antagonistas do recetor de NMDA. A classe de γ-conotoxina visa um canal catiónico não específico sensível à tensão. A classe de o-conotoxina antagoniza o recetor 5HT3 e a classe de χ- conotoxina inibe os transportadores de amina neuronial. A classe de péptidos χ-conotoxina foi descrita pela primaria vez na WO00/20444 (University of Queensland), embora dois membros da classe tenham sido subsequentemente referidos na WOOO/44769 (University of Utah Research Foundation). Os péptidos de χ-conotoxinas particulares identificados na WO 00/20444 foram os MrlA e MrlB do caçador de moluscos C. Marmoreus, os quais têm as seguintes sequências: χ-MrIA Asn Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 1 χ-MrIB Vai Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 2

Nestas e nas sequências seguintes o Xaa3 refere-se a 4-hidroxi-prolina (Hyp). Na natureza, este resíduo de aminoácido resulta da modificação pós-tradução do péptido codificado e não está diretamente codificado pela sequência de nucleótidos. Vários péptidos de χ-conotoxina e suas variantes, e utilizações, são divulgados na WO 2004/050688; WO 02/064740; Jones et al. (2001), Exp. Opin. Ther. Patents, 11(4): 603-623; e Harvey (2002), TRENDS in Pharmacological Sciences, 23(5): 201-203. 3

Os compostos que inibem a recaptação de neurotransmissores têm sido considerados úteis no tratamento de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação. Tais compostos também podem ser administrados com outros agentes úteis nestes tratamentos para proporcionar alivio melhorado da dor/inflamação e/ou reduzir a gravidade de efeitos secundários indesejados, tais como náusea e indisposição estomacal. Eles também têm sido considerados úteis no tratamento de distúrbios do aparelho urinário inferior, tais como incontinência urinária, instabilidade do detrusor e cistite intersticial. Um tal composto é a "imipramina" que, além da inibição da recaptação de noradrenalina, se demonstrou que afeta o bloqueio do canal de cálcio, e exibe atividade anestésica anticolinérgica, local e um número de outros efeitos. Outros compostos capazes de inibir a recaptação de noradrenalina são descritos na Patente U.S. 5,441,985. Estes compostos são referidos como tendo um efeito anticolinérgico reduzido relativamente à imipramina.

No caso dos péptidos da presente invenção, esta inibição da recaptação de neurotransmissores é conseguida inibindo seletivamente o transportador do neurotransmissor neuronial, tal como o transportador de noradrenalina, o qual atua para eliminar rapidamente a noradrenalina libertada da sinapse de volta para os neurónios.

Como descrito na WOOO/2044 o péptido χ-MrIA é constituído por uma cauda, resíduos 1-3, duas ansas, resíduos 6-9 (ansa 1) e 11-12 (ansa 2), respetivamente e têm duas ligações dissulfureto entre os resíduos de cisteína 4 e 13 e 5 e 10, respetivamente. Embora o MrlA se assemelhe a um péptido de oi-conotoxina em termos do número de resíduos de cisteína, a conectividade dissulfureto é diferente. A este respeito, os péptidos de α-conotoxina caracterizam-se por uma 4 conectividade A-C/B-D, em vez da conectividade A-D/B-C de MrlA, em que A, B, C e D representam o primeiro, segundo, terceiro e quarto resíduos de cisteína envolvidos na formação da ligação dissulfureto, respetivamente.

Determinou-se agora surpreendentemente que a substituição do resíduo de asparagina N-terminal de MrlA por um resíduo de ácido piroglutâmico ou a adição de um resíduo de piroglutamato na extremidade N-terminal de MrlA proporciona vantagens particulares em relação ao MrlA em termos de eficácia in vivo, duração de efeito, estabilidade e método de preparação.

Por conseguinte, num primeiro aspeto da presente invenção é proporcionado um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

Xaal Xaa2 Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys SEQ ID NO. 3 em que Xaal é um resíduo de pGlu ou DpGlu N-terminal; e Xaa2 é Asn ou uma supressão; ou uma tal sequência em que uma ou mais Cys está substituída pelo seu D-aminoácido correspondente e/ou Pro está substituída por 4-hidroxiprolina, e/ou Tyr está substituída por 4-metoxitirosina; ou um sal, éster ou amida do mesmo.

Num aspeto particular o péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante da presente invenção pode consistir da sequência de SEQ ID NO. 3 como acima.

Nas sequências acima pGlu representa piroglutamato e DpGlu representa D-piroglutamato. 5

Os péptidos de acordo com a presente invenção têm um número de vantagens surpreendentes e inesperadas em relação ao MrlA. Também foi determinado que os péptidos são particularmente estáveis à conservação na gama de pH de 4 a 7 e 37°C, permitindo administração a longo prazo num dispositivo, por exemplo uma bomba de infusão, mantido à temperatura ambiente até 37°C. Também existem vantagens em relação à produção e separação dos péptidos de produtos secundários de síntese indesejados, permitindo purificação direta até à homogeneidade >99%, relativamente ao MrlA utilizando um procedimento semelhante no qual a pureza é tipicamente <93%. Quando administrado i.t. num modelo neuropático de alodínia em ratazana foi determinado que um péptido de acordo com a presente invenção tem uma eficácia relativa máxima maior em relação ao MrlA, sem influenciar os efeitos secundários ou reduzir a janela terapêutica no modelo animal. Foi determinado que a duração do efeito do péptido se prolonga além das 48 horas após uma dose bolus de 30 nmol dada i.t. Os péptidos de acordo com a presente invenção são particularmente úteis no tratamento de dor neuropática e seus sintomas quando administrados por via i.t. ou epidural num tampão apropriado. Tais condições de dor neuropática incluindo cirurgia (dor pós-operatória), dor de intestino, cancro, diabética, membro fantasma, dano em tecido nervoso, inflamatória e dor associada ao tecido nervoso periférico.

Preferencialmente, o transportador de amina neuronial inibido pelo péptido de χ-conotoxina é o transportador de noradrenalina neuronial. O péptido de χ-conotoxina pode ser um péptido natural isolado de um caracol de cone, ou derivados ou versões sintéticas do mesmo. 6

Preferencialmente, o péptido de χ-conotoxina é um inibidor seletivo do transportador de noradrenalina neuronial. Os termos "seletivo" e "seletivamente" como aqui utilizados significam que a atividade do péptido como um inibidor do transportador de noradrenalina neuronial é consideravelmente maior do que qualquer atividade nos recetores oç-adrenérgicos. Preferencialmente, o péptido inibidor é 10 vezes mais seletivo para o transportador de noradrenalina neuronial, mais preferencialmente 100 vezes mais seletivo e muito preferencialmente mais do que 1000 vezes mais seletivo. O péptido também é preferencialmente seletivo em relação aos recetores oq-adrenérgicos e/ou ao transportador de recaptação de serotonina (SERT). A seletividade de um inibidor do transportador de noradrenalina neuronial pode ser medida utilizando técnicas conhecidas na matéria, por exemplo utilizando ensaios de substituição de ligando marcado apropriados. A Patente U.S. 5,441,985 indica que os inibidores de recaptação de noradrenalina que têm um efeito anticolinérgico insignificante são particularmente úteis no tratamento de distúrbios do aparelho urinário inferior. Foi determinado que os péptidos desta invenção também não têm qualquer efeito anticolinérgico detetável ou têm um efeito anticolinérgico substancialmente não detetável.

Por conseguinte, numa forma de realização preferida da invenção o péptido de χ-conotoxina tem a aptidão para inibir seletivamente o transportador de noradrenalina neuronial, e tem um efeito anticolinérgico insignificante ou não substancial. 7

Preferencialmente, os péptidos da presente invenção não têm qualquer atividade como um bloqueador do canal de sódio ou como um inibidor do transportador de dopamina. A ausência, nos péptidos da invenção e em particular nos péptidos preferidos de acordo com a invenção, destas atividades farmacológicas adicionais geralmente associadas a outros inibidores do transportador de noradrenalina torna estes péptidos ferramentas farmacológicas úteis.

Os péptidos de acordo com a presente invenção são derivados específicos de MrlA. 0 termo "derivado" como aqui utilizado em relação a um péptido de χ-conotoxina natural, tal como χ-MrIA, refere-se a um péptido que difere dos péptidos naturais por uma ou mais supressões, adições, substituições ou modificações da cadeia lateral de aminoácidos. Os derivados específicos de MrlA reivindicados têm a aptidão de inibir o transportador de noradrenalina neuronial.

As substituições abrangem alterações de aminoácido, nas quais um aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido natural diferente ou um resíduo de aminoácido não convencional. Tais substituições podem ser classificadas de "conservadoras", em cujo caso um resíduo de aminoácido contido num polipéptido é substituído por outro aminoácido natural de caráter semelhante em relação à polaridade, funcionalidade ou tamanho da cadeia lateral, por exemplo Ser<->Thr^Pro<->Hyp<->Gly«Ala, Val^Ile^Leu, His<->Lys<->Arg, Asn<->Gln<->Asp<->Glu ou Phe«Trp~Tyr. É para ser entendido que alguns aminoácidos não convencionais também podem ser substituições adequadas para os aminoácidos naturais. Por exemplo, os resíduos de Lys podem estar substituídos por ornitina, homoarginina, nor-Lys, N-metil-

Lys, N,N-dimetil-Lys e N,N,N-trimetil-Lys. Os resíduos de Lys também podem estar substituídos por aminoácidos básicos sintéticos incluindo, mas não se limitando a, N-l-(2-pirazolinil)-Arg, 2-(4-piperinil)-Gly, 2-(4-piperinil)-Ala, 2-[3-(2S) pirrolininil]-Gly e 2-[3-(2S)pirolininil]-Ala. Os resíduos de Tyr podem estar substituídos por 4-metoxi-tirosina (MeY) , meta-Tyr, orto-Tyr, nor-Tyr, 125I-Tyr, mono-halo-Tyr, di-halo-Tyr, O-sulfo-Tyr, O-fosfo-Tyr e nitro-Tyr. Os resíduos de Tyr também podem estar substituídos pelos isómeros 3-hidroxilo ou 2-hidroxilo (meta-Tyr ou orto-Tyr, respetivamente) e pelos correspondentes derivados O-sulfo- e O-fosfo. Os resíduos de Tyr também podem estar substituídos com aminoácidos sintéticos contendo hidroxilo incluindo, mas não se limitando a 4-hidroximetil-Phe, 4-hidroxifenil-Gly, 2,6-dimetil-Tyr e 5-amino-Tyr. Os aminoácidos alifáticos podem estar substituídos por derivados sintéticos que têm cadeias laterais ramificadas ou lineares CnH2n+2 alifáticas, não naturais até e incluindo n=8. Exemplos de substituições conservadoras adequadas por aminoácidos não convencionais são dados na W002/064740. De acordo com a presente invenção, as substituições restringem-se a substituições conservadoras particulares como definidas nas reivindicações.

As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos simples, mas pode ser de múltiplos resíduos, quer agrupados ou dispersados.

As adições abrangem a adição de um ou mais resíduos de aminoácido naturais ou não convencionais. Os péptidos de acordo com a presente invenção em que Xaa2 é Asn podem ser considerados derivados de MrlA possuindo um resíduo Xaal adicional. Outras adições restringem-se à extremidade C- 9 terminal. A supressão abrange a supressão de um ou mais resíduos de aminoácido.

Como especificado acima a presente invenção inclui péptidos nos quais (adicional ou alternativamente à substituição de uma ou mais Cys pelo seu D-aminoácido correspondente) a Pro está substituída por 4-hidroxiprolina e/ou a Tyr está substituída por 4-metoxitirosina. Exemplos de outras modificações da cadeia lateral consideradas pela presente divulgação incluem modificações de grupos amino tal como por alquilação redutiva por reação com um aldeído seguida de redução com NaBH4; amidinação com metilacetimidato; acilação com anidrido acético; carbamoilação de grupos amino com cianato; trinitrobenzilação de grupos amino com ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS); acilação de grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetra-hidroftálico; e piridoxilação de lisina com piridoxal-5-fosfato seguida de redução com NaBH4; e N-acetilação. 0 grupo guanidina de resíduos de arginina pode ser modificado pela formação de produtos de condensação heterocíclicos com reagentes tais como 2,3-butanodiona, fenilglioxal e glioxal. 0 grupo carboxilo pode ser modificado por ativação de carbodiimida via formação de O-acilisoureia seguida de derivatização subsequente, por exemplo, a uma amida correspondente.

Os aminoácidos ácidos podem estar substituídos por derivados tetrazolilo de glicina e alanina, como descrito em W002/600923. 10 O resíduo de tirosina pode ser alterado, por exemplo por metoxilação na posição 4 (como proporcionado pela presente invenção). A tirosina também pode ser alterada por nitração com tetranitrometano para formar um derivado de 3-nitrotirosina. Exemplos de derivados de tirosina são dados em WO02/064740. A modificação do anel de imidazole de um resíduo de histidina pode ser conseguida por alquilação com derivados do ácido iodoacético ou N-carbetoxilação com pirocarbonato de dietilo.

Os resíduos de prolina podem ser modificados, por exemplo, por hidroxilação na posição 4 (como proporcionado pela presente invenção).

Outros derivados considerados pela presente divulgação incluem uma gama de variantes de glicosilação. Os padrões de glicosilação modificados podem resultar da expressão de moléculas recombinantes em diferentes células hospedeiras. Os resíduos de Ser, Thr e Hyp podem ser modificados para conter um O-glicano, enquanto os resíduos de Asn e Gin podem ser modificados para formar um N-glicano. De acordo com a presente invenção, o termo "glicano" refere-se a um mono-, di-, tri-, poli- ou oligossacárido ligado por N, S ou O, que pode ser ligado a qualquer grupo hidroxilo, amino ou tiol de aminoácidos naturais ou modificados por metodologias sintéticas ou enzimáticas conhecidas na técnica. Os monossacáridos que constituem o glicano podem incluir D-alose, D-altrose, D-glucose, D-manose, D-gulose, D-idose; D-galactose, D-talose, D-galactosamina, D-glucosamina, D-N-acetil-glucosamina (GlcNAc), D-N-acetil-galactosamina (GalNac), D-fucose ou D-arabinose. Estes sacáridos podem ser estruturalmente modificados, isto é, 11 com um ou mais grupos O-sulfato, O-fosfato, O-acetilo ou ácidos tal como ácido siálico, incluindo combinações dos mesmos. 0 glicano também pode incluir grupos poli-hidroxilo semelhantes, tal como D-penicilamina 2,5 e seus derivados halogenados ou derivados de polipropileno glicol. A ligação glicosidica é beta e 1-4 ou 1-3, preferencialmente 1-3. A ligação entre o glicano e o aminoácido pode ser alfa ou beta, preferencialmente alfa e é 1-.

Uma lista de alguns aminoácidos possuindo cadeias laterais modificadas e de outros aminoácidos não naturais é mostrada no Quadro 1. QUADRO 1

Aminoácido não Código Aminoácido não convencional Código convencional ácido α-aminobutírico Abu α-amino-a-metilbutirato Mgabu aminociclopropano- Cpro carboxilato ácido aminoisobutirico Aib aminonorbornil- Norb carboxilato ciclo-hexilalanina Chexa ciclopentilalanina Cpen D-alanina DAla D-arginina DArg ácido D-aspártico DAsp D-cisteína DCys D-glutamina DGln ácido D-glutâmico DGlu D-histidina DHis D-isoleucina Dlle D-leucina DLeu D-lisina DLys D-metionina DMet D-ornitina DOrn 4-hidroxiprolina Hyp ácido L-piroglutâmico pGlu L-4-metoxitirosina MeY L-N-metilalanina Nmala L-N-metilarginina Nmarg L-N-metilasparagina Nmasn ácido L-N-metilaspártico Nmasp L-N-metilglutamina Nmgln ácido L-N-metilglutâmico Nmglu L-N-metil-histidina Nmhis L-N-metilisoleucina Nmile L-N-metil-leucina Nmleu L-N-metil-lisina Nmlys L-N-metilmetionina Nmmet L-N-metilnorleucina Nmnle L-N-metilnorvalina Nmnva L-N-metilornitina Nmom L-N-metilfenilalanina Nmphe L-N-metilprolina Nmpro L-N-metilserina Nmser L-N-metiltreonina Nmthr 12

Aminoácido não convencional Código Aminoácido não convencional Código D-fenilalanina DPhe L-N-metiltriptofano Nmtrp D-prolina DPro L-N-metiltirosina Nmtyr D-serina DSer L-N-metilvalina Nmval D-treonina DThr L-N-metiletilglicina Nmetg D-triptofano DTrp L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-tirosina DTyr L-norleucina Nle D-valina DVal L-norvatina Nva D-a-metilalanina DMala a-metil-aminoisobutirato Maib D-a-metilarginina DMarg a-metil-y-aminobutirato Mgabu D-a-metilasparagina DMasn a-metilciclo-hexilalanina Mchexa D-a-metilaspartato DMasp a-metilcilcopentilalanina Mcpen D-a-metilglutamina DMgln a-metil-a-naftilalanina Manap D-a-metil-histidina DMhis α-metilpenicilamina Mpen D-a-metilisoleucina DMile N-(4-aminobutil)glicina Nglu D-a-metil-leucina DM1 eu N-(2-aminoetil)glicina Naeg D-oí-metil-lisina DM1 ys N-(3-aminopropil)glicina Nom D-a-metilmetionina DMmet N-amino-a-metilbutirato Nmaabu D-a-metilornitina DMom α-naftilalanina Anap D-a-metilfenilalanina DMphe N-benzilglicina Nphe D-a-metilprolina DMpro N-(2-carbamiletil)glicina Ngln D-a-metilserina DMser N-(carbamilmetil)glicina Nasn D-a-metiltreonina DMthr N- (2-carboxietil)glicina Nglu D-a-metiltriptofano DMtrp N-(carboximetil)glicina Nasp D-a-metiltirosina DMty N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metilvalina DMval N-ciclo-heptilglicina Nchep D-N-metilalanina DNmala N-ciclo-hexilglicina Nchex D-N-metilarginina DNmarg N-ciclodecilglicina Ncdec D-N-metilasparagina DNraasn N-cilcododecilglicina Ncdod D-N-metilaspartato DNmasp N-ciclooctilglicina Ncoct D-N-metilglutamina DNmgln N-ciclopropilglicina Ncpro D-N-metilglutamato DNmglu N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metil-histidina DNmhis N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm D-N-metilisoleucina DNmile N-(1-hidroxietil)glicina Nthr D-N-metil-leucina DNmleu N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe 13

Aminoácido não convencional Código Aminoácido não convencional Código D-N-metil-lisina DNmlys N-(3-guanidinopropil)glicina Narg N-metilciclo-hexilalanina NMchexa N-(hidroxietil)glicina Nser D-N-metilornitina DNmorn N-(imidazoliletil)glicina Nhis D-N-metilmetionina Dnmmet N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp N-metilglicina Nala N-metil-y-aminobutirato Nngabu N-metilaminoisobutirato Nmaib N-metilciclopentilalanina Nmcpen N-(1-metilpropil)glicina Nile D-N-metilfenilalanina DNmphe N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metilprolina DNmpro D-N-metiltriptofano DNmtrp D-N-metilserina DNmser D-N-metiltirosina DNmtyr D-N-metiltreonina DNmthr D-N-metilvalina DNmval N-(1-metiletil)glicina Nval ácido y-aminobutirico Gabu N-metil-naftilalanina Nmanap L-t-butilglicina Tbug N-metilpenicilamina Nmpen L-etilglicina Etg N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr L-homofenilalanina Hphe N-(tiometil)glicina Ncys L-a-metilarginina Marg penicilamina Pen L-a-metilasparagina Masn L-a-metilalanina Mala L-a-metilaspartato Masp L-a-metil-t-butilglicina Mtbug L-a-metilglutamina Mgln L-metiletilglicina Metg L-a-metilglutamato Mglu L-a-metil-homofenilalanina Mhphe L-a-metil-histidina Mhis N-(2-metiltioetil)glicina Nmet L-a-metilisoleucina Mile L-a-metil-lisina Mlys L-a-metil-leucina Mleu L-a-metilnorleucina Mnle L-a-metilmetionina Mmet L-a-metilornitina Mom L-a-metilnorvalina Mnva L-a-metilprolina Mpro L-a-metilfenilalanina Mphe L-a-metiltreonina Mthr L-a-metilserina Mser L-a-metiltirosina Mtyr L-a-metiltriptofano Mtrp L-N-metil-homofenilalanina Nmhphe L-a-metilvalina Mval N-(N-(3,3-difenilpropil) Nnbhe N-(N-(2,2-difeniletil) Nnbhm carbamilmetilglicina carbamilmetilglicina O-metil-L-serina Omser 1-carboxi-l-(2,2-difenil- Nmbc O-metil-L-homosserina Omhser etilamino)ciclopropano D-piroglutamato DpGlu 14

Aminoácido não convencional Código Aminoácido não convencional Código ácido L- (-carboxiglutâmico Glci As modificações de cadeia lateral particularmente preferidas incluem a substituição de Tyr por MeY e/ou substituição de Pro por Hyp.

Estes tipos de modificações, e outras que envolvem modificações mais substantivas da cadeia lateral, podem ser importantes para estabilizar o péptido se administrado a um indivíduo ou utilizado como um reagente de diagnóstico, ou para melhorar a solubilidade ou biodisponibilidade, ou para proporcionar outras farmacologias. Por exemplo, é possível prolongar ou contrair o comprimento da cadeia lateral, ou inserir ou remover grupos funcionais para conseguir estes efeitos, por exemplo através da introdução de grupos doadores de nitróxido.

Os péptidos da presente invenção podem estar na forma de um sal, éster, amida ou pró-fármaco do mesmo. As χ-conotoxinas da presente invenção estão tipicamente amidadas na extremidade C-terminal, contudo os compostos com uma extremidade carboxilo livre ou outras modificações na extremidade C-terminal são considerados como estando no âmbito da presente invenção. Preferencialmente, os péptidos estão amidados ou têm um carboxilo livre na extremidade exterminai. Os péptidos de acordo com a invenção podem estar na forma de um sal ou pró-fármaco.

Exemplos de sais adequados incluem os sais de cloreto, acetato, lactato e glutamato. Os procedimentos convencionais para a preparação de sais adequados são bem conhecidos na técnica. 15

Os péptidos de acordo com a presente invenção também podem estar na forma de pró-fármacos. Os pró-fármacos são entendidos como incluindo todos os derivados de péptidos de acordo com a invenção que são prontamente convertidos in vivo no péptido ativo necessário. Os procedimentos convencionais para a preparação de pró-fármacos adequados de acordo com a invenção são descritos em livros de referência, tais como o "Design of Prodrugs" ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.

Os péptidos da presente invenção mantêm os residuos de Cys e o padrão de ligação dissulfureto caracteristico de péptidos de χ-conotoxina.

Os péptidos também podem ser marcados e utilizados para estabelecer ensaios de ligação para identificar novas moléculas que atuam no mesmo sitio. Por exemplo, um ligando de péptido marcado poderia ter tritio incluído ou pode ter iodo radioativo ou semelhante ligado através de uma Tyr ou outro resíduo apropriado. A inibição da ligação desses péptidos marcados aos homogenatos de tecido ou transportadores expressados por compostos ou misturas permitiria identificar novos péptidos ativos neste sítio, incluindo péptidos presentes no soro e tecido nervoso e muscular de mamíferos, incluindo tecidos humanos. 0 ensaio também permitiria identificar moléculas não peptídicas que também atuam no mesmo sítio que os péptidos de χ-conotoxina e que podem ter utilidade como formas ativas por via oral destes péptidos. Os péptidos marcados permitirão ainda realizar estudos autorradiográficos para identificar a localização da ligação do péptido nos vários tecidos. 16

Contrariamente ao que foi proposto na WO00/20444, determinou-se que os péptidos de χ-conotoxina são inibidores não competitivos em relação à noradrenalina, mas competitivos em relação a moléculas pequenas que também se ligam ao transportador de noradrenalina, tais como mazindol, cocaína e antidepressivos tricíclicos, tal como a desipramina.

Por conseguinte, os ensaios de ligação utilizando os péptidos marcados da presente invenção, preferencialmente marcados radioisotopicamente, podem ser utilizados para descobrir moléculas pequenas que poderiam atuar como inibidores não competitivos do transporte de noradrenalina através do transportador de noradrenalina. Preferencialmente, este ensaio seria realizado na presença de concentrações bloqueadoras de noradrenalina ou moléculas pequenas relacionadas que não se sobrepõem com o sítio de ligação do qui-conopéptido mas que se sobrepõem com muitos inibidores de molécula pequena do transportador de noradrenalina (por exemplo antidepressivos tricíclicos).

As χ-conotoxinas da presente invenção podem ser preparadas utilizando métodos de síntese de péptidos correntes, seguidos de formação oxidativa de ligação dissulfureto. Por exemplo, os péptidos lineares podem ser sintetizados por metodologia de fase sólida utilizando química BOC, como descrito por Schnoltzer et al (1992). Após desproteção e dissociação do suporte sólido os péptidos reduzidos são purificados utilizando cromatografia preparativa. Os péptidos reduzidos purificados são oxidado em sistemas tamponados, por exemplo como descrito nos exemplos. Os péptidos oxidados podem ser purificados utilizando cromatografia preparativa. 17

As referências que descrevem a síntese de conotoxinas incluem Sato et al, Lew et al e WO 91/07980.

As χ-conotoxinas também podem ser preparadas utilizando tecnologia de ADN recombinante. A sequência de nucleótidos que codifica a sequência peptídica desejada pode ser inserida num vetor adequado e a proteína expressada num sistema de expressão apropriado. Nalguns casos pode ser apropriada modificação química adicional do péptido expressado, por exemplo amidação C-terminal e conversão de um resíduo de glutamato N-terminal num resíduo de piroglutamato. Nalgumas circunstâncias pode ser desejável realizar a formação de ligação oxidativa do péptido expressado como um passo químico após expressão do péptido. Isto pode ser precedido de um passo redutivo para proporcionar o péptido desdobrado. Os especialistas na técnica podem determinar facilmente as condições apropriadas para a redução e oxidação do péptido.

Também pode ser possível preparar anticorpos anti-idiotípicos utilizando técnicas conhecidas na matéria. Estes anticorpos anti-idiotípicos e sua utilização como agentes terapêuticos representam um outro aspeto da presente invenção.

As moléculas de ácido nucleico podem estar na forma isolada ou podem ser integradas ou ligadas ou, de outro modo, fundidas ou associadas a outras moléculas genéticas tais como moléculas vetores e, em particular, a moléculas de vetor de expressão. Os vetores e vetores de expressão são geralmente capazes de replicaçao e, se aplicável, a expressão em uma ou ambas de uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. Preferencialmente, as células procarióticas incluem E. coli, Bacillus sp e Pseudomonas 18 sp. As células eucarióticas preferidas incluem células de levedura, fungo, mamifero e inseto.

Preferencialmente, a porção de gene da construção genética está operativamente ligada a um promotor no vetor, de tal forma que o referido promotor é capaz de coordenar a expressão da porção de gene numa célula apropriada.

Podem ser preparadas quimeras das χ-conotoxinas da presente invenção, com outras conotoxinas ou, adicionalmente, com outros péptidos ou proteínas, para incorporar a atividade noutras moléculas, nalguns casos para produzir uma molécula nova com funcionalidade extra. Por exemplo, aminoácidos que se ligam ao canal de cálcio de tipo N podem ser combinados com aminoácidos que inibem o NET para produzir um péptido com atividade no NET (utilizando resíduos da ansa 1 de χ-conopéptidos) e atividade no canal de cálcio de tipo N (utilizando a ansa 2 de CVID) , como na CCSKLMYDCCGYKLG N-/C-ciclizada. Analogamente, um péptido cíclico pode ser contrastado com resíduos qui da ansa 1 e uma ansa de aminoácidos possuindo atividade nos recetores de opiáceos, como em cCCRRQICCGYKLG. Estes péptidos quiméricos podem ser particularmente úteis já que possuem farmacologias que são aditivas ou até mesmo sinérgicas, e que se espera que sejam benéficas no tratamento de uma vasta gama de síndromes de dor que estão presentes em humanos.

Deverá ser assim entendido que os termos péptido de conotoxina ou conotoxinas não se limitam a péptidos tóxicos naturais obtidos a partir do genus Conus mas, em vez disso, indicam apenas uma fonte inicial na qual os péptidos tiveram origem. Os péptidos de conotoxina podem ser derivados de péptidos não tóxicos, não naturais, criados 19 sinteticamente. Conopéptidos é um termo alternativo intermutável com péptidos de conotoxina.

Um subconjunto destes análogos de MrlA pode atuar em recetores além de NET, permitindo efeitos sinérgicos ou adicionais. Preferencialmente, estas interações adicionais atuam em sinergia para melhorar os efeitos antinociceptivos. Mais preferencialmente, estas interações adicionais ocorrem em recetores de opióides, recetores tipo recetor de opióides, GPCRs da família MRG, os recetores de NMDA, recetores de glutamato, as neurocininas, recetores de ciclooxigenase, recetores serotonérgicos, recetores adrenérgicos, recetores de vanilóides, recetores de benzodiazepinas, antagonistas de canal de cálcio de tipo N, recetores nicotínicos neuronais, recetores muscarínico de acetilcolina capsaicina, TNF-α, Canais de Na resistentes a tetrodotoxina e sensíveis a tetrodotoxina, canal de cálcio sensível a tensão e recetores endoteliais.

Preferencialmente, os péptidos de χ-conotoxina de acordo com a invenção têm 10 a 30 aminoácidos, mais preferencialmente 11 a 20. A extremidade C-terminal pode ser prolongada por adição de um "cauda" peptídica. Nalguns casos a atividade do péptido pode ser melhorada por essas modificações.

Exemplos de péptidos de χ-conotoxina de acordo com a presente invenção incluem os seguintes:

Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 4 Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Xaa5 SEQ ID NO. 5 Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Xaa4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 6 Xaal Asn Gly Vai Cys Cys Gly Xaal4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 7 Xaal Asn Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 8 Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys -OH SEQ ID NO. 9 20

Nas sequências acima, Xaal refere-se a ácido piroglutâmico, Xaa3 refere-se a 4-hidroxiprolina, Xaa4 refere-se a 4-metoxitirosina, Xaa5 (cys) refere-se a D-cisteina e -OH indica um ácido livre C terminal.

Salvo indicação em contrário, o C-terminal do péptido está preferencialmente amidado.

Outros exemplos de péptidos de χ-conotoxina de acordo com a presente invenção incluem os seguintes:

Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys -OH SEQ ID NO. 10

Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 11

Nas sequências acima, Xaal refere-se a ácido D-piroglutâmico, Xaa3 refere-se a 4-hidroxiprolina e -OH indica um ácido livre C terminal.

Os péptidos de χ-conotoxina de acordo com a presente invenção são ativos na inibição do transportador de noradrenalina neuronial. Por conseguinte, a invenção refere-se à utilização dos péptidos de χ-conotoxina como inibidores do transportador de noradrenalina neuronial, e ao tratamento ou profilaxia de doenças ou condições em relação às quais a inibição do transportador de noradrenalina neuronial está associada a tratamento eficaz. Tal atividade em agentes farmacológicos está associada a atividade na profilaxia ou tratamento de doenças ou condições dos sistemas urinário ou cardiovascular, ou distúrbios do humor, ou no tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação.

Exemplos da formulação e utilização de inibidores da ser recaptação de noradrenalina em terapia podem 21 encontrados em Ardid, D et al., (1992) Fund. Clinicai Pharmacology 6(2): 75-8; Yaksh, T.L. (1985) Pharmacology Biochemistry and Behaviour 22:845-858; Yaksh, T.L. & Takano, Y. (1992) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 261(2): 764-772; Yaksh, T.L. & Howe, J.R. (1982) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 220(2): 311-321; Howe, J.R. et al., (1983) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 224(3): 552-558; Solomon et al., (1989) J. Pharmacology & Experimental Therapeutics 251(1): 28-38; Fleetwood-Walker, S.M. et al., (1985) Brain Research 334:243-254; Takagi, H & Harima, A. (1996) European Neuropsychopharmacology 6, 43-47; Eisenach, J.C. et al (1998) Anesth Analg 87, 591-6; Dubner, R. & Hargreaves, KM (1989) Clin J Pain, 5 pSl-6; Max, MB (1992) N Engl J Med 326, pl287-8; Atkinson, JH et al (1998) Pain 76, p287-96; Mico, J.A. et al., (1997) European Neuropsychopharmacology 7, S 162.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona a utilização de um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

Xaal Xaa2 Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys SEQ ID NO: 3 em que Xaal é um residuo de piroglutamato (pGlu) ou D-piroglutamato (dpGlu) N-terminal; e Xaa2 é Asn ou uma supressão; ou uma tal sequência em que uma ou mais Cys está substituída pelo seu D-aminoácido correspondente e/ou Pro está substituída por 4-hidroxiprolina, e/ou Tyr está substituída por 4-metoxitirosina; ou um sal, éster, amida ou pró-fármaco do mesmo no fabrico de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de condições ou doenças urinárias ou cardiovasculares, ou distúrbios do humor, ou para o 22 tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação. 0 medicamento pode ser formulado para administração substancialmente simultânea ou sequencialmente com outros agentes úteis no tratamento das condições, doenças ou distúrbios. Assim, o péptido de χ-conotoxina da invenção pode ser utilizado num método para o tratamento ou profilaxia de condições ou doenças urinárias ou cardiovasculares ou distúrbios do humor ou para o tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação, o qual inclui o passo de administrar a um mamifero uma quantidade eficaz de um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante possuindo a aptidão para inibir o transportador de noradrenalina neuronial, em que o referido péptido de χ-conotoxina é como definido nas reivindicações aqui .

Ao realizar um tal método, a administração do χ-péptido pode ser realizada em conjunto com outras terapias úteis no tratamento da condição, doença ou distúrbio. Por conseguinte, o péptido pode ser administrado de modo substancialmente simultâneo ou sequencialmente com outros agentes úteis no tratamento das condições, doenças ou distúrbios. Quando a coadministração é simultânea, o péptido pode ser formulado numa composição com um ou mais dos outros agentes. A coadministração de outros agentes pode ser realizada através de vias iguais ou diferentes da via de administração do χ-péptido. Quando o método é para o tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática ou enxaqueca, o péptido pode ser administrado de modo substancialmente simultâneo ou sequencialmente com um agente analgésico selecionado do grupo consistindo de analgésicos opióides, antagonistas tipo recetor de opióides, antagonistas do GPCR da familia MRG, antagonistas 23 de NMDA, antagonistas de substância P, inibidores de COX 1 e COX 2, antidepressivos triciclicos (TAC), inibidores seletivos da recaptação de serotonina (SSRI), antagonistas do recetor de capsaicina, agentes anestésicos, benzodiazepinas, relaxantes musculares esgueléticos, agentes terapêuticos para a enxaqueca, anticonvulsivantes, anti-hipertensivos, antiarritmicos, anti-histaminicos, esteroides, cafeina, antagonistas do canal de cálcio de tipo N, agonistas parciais e antagonistas do recetor nicotinico, antagonistas e agonistas do recetor de vanilóides, antagonistas e anticorpos para TNF-a, inibidores de canais de Na sensiveis a tetrodotoxina, inibidores do canal tipo P, antagonistas endoteliais e toxina botulinica. 0 péptido também pode ser administrado simultaneamente com dois ou mais de outros agentes, por exemplo misturas de SSRIs e inibidores da recaptação de noradrenalina.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico tipo recetor de opióides, ele é preferencialmente selecionado de naltrexona e nalmefene; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico opióide, ele é preferencialmente selecionado de propoxifeno, meperidina, hidromorfona, hidrocodona, morfina, codeina e tramodol; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico antagonista de NMDA, ele é preferencialmente selecionado de derivados de 2-piperidino-alcanol, dextrometorfano, eliprodil e ifenprodil; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico antagonista de P, ele é preferencialmente selecionado de derivados de 2-fenil-piperidin-3-ilo ou 2-difenilmetil-l-azabiciclo[2.2.2]-octano-3-amina como descritos no Pedido de Patente U.S. n° 2001/00336943 AI (Coe et al.); seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico de inibição de COX 2, ele é preferencialmente selecionado de rofecoxib e celecoxib; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico anestésico, ele é preferencialmente selecionado de óxido nitroso, halotano, lidocaina, etidocaina, ropivacaína, cloroprocaina, sarapin e bupivacaína; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico de benzodiazepina, ele é preferencialmente selecionado de diazepam, clordiazepóxido, alprazolam, lorazepam, midazolam, L-365260; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico relaxante muscular esquelético, ele é preferencialmente selecionado de flexeril, carisoprodol, robaxisal, norgesic e dantrium; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente terapêutico para a enxaqueca, ele é preferencialmente selecionado de elitriptano, sumatriptano, rizatriptano, zolmitriptano e 25 naratriptano; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico anticonvulsivante, ele é preferencialmente selecionado de gabapentina, pregabalina, carbamazepina, e topiramato e ácido valpróico; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico inibidor de COX 1, ele é preferencialmente selecionado de ácido salicilico, acetominofeno, diclofenac, piroxican indometacina; ibuprofeno e naproxeno; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico antidepressivo triciclico, ele é preferencialmente selecionado de amitriptilina, desipramina, perfenazina, protriptilina e tranilcipromina; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um agente analgésico SSRI, ele é preferencialmente selecionado de tramadol e milnaciprano; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é uma mistura de SSRI e Inibidores da recaptação de noradrenalina, o último é preferencialmente selecionado de reboxetina e atomoxetina; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos. 0 agente analgésico também pode ser selecionado de adenosina, baclofeno, clonidina, mexilitena, difenil-hidramina, hidroxisina, cafeina, prednisona; metilprednisona, decadron, paroxetina, sertralina, 26 fluoxetina, Ziconotide® e levodopa; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um antagonista ou anticorpo para o TNF-α, o agente é preferencialmente selecionado de etanorcept, infliximab e talidomida; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um antagonista endotelial, o agente é preferencialmente selecionado de bosentan e tesosentan; seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é um antagonista vanilóide, o agente analgésico é preferencialmente selecionado de ananamida, capsazepina, derivados de ácido tiocarbâmico (como descrito em WO02/16317 Al) e derivados de tioureia (como descrito em WO02/16318 Al); seus sais farmaceuticamente ativos e seus isómeros óticos.

Quando o agente analgésico é selecionado de agonista parcial do recetor de nicotina, ele é preferencialmente selecionado de derivados de 1,2,3,4,5,6-hexa-hidro-l,5-metano-pirido[1,2-a][1,5]diazocin-8-ona, derivados de diazatetraciclo[9,3,1,0.sup.2,10,0.sup.4,8]pentadeca-2(10) , 3, 8-trieno, derivados de 10-aza- triciclo[6,3,l,0.sup.2,7]dodeca-2(7),3,5-trieno, derivados de triazatetraciclo[9,3,1,0.sup.2,10,0.sup.4,8]pentadeca-2 (10),3,5,8-tetraeno, derivados de 5,8,14- triazatetraciclo[10,3,1,0.sup.2,11,0.sup.4,9]hexadeca-2(11) , 3,5,7,9-pentaeno, derivados de diazatetraciclo[9,3,1,0.sup.2,10,0.sup.4,8]pentadeca-2(10) , 3, 6, 8-tetraeno, derivados de 10- 5,7,14- azatriciclo[6,3,1,0.sup.2,7]dodeca-2(7),3,5-trieno, derivados de 27 triazatetraciclo[10,3,1,0.sup.2,10,0.sup.4,8]hexadeca-2 (10),3,5,8-tetraeno, derivados de 5,8,15- triazatetraciclo[11,3,1,0.sup.2,11,0.sup.4,9]heptadeca-2(11),3,5,7,9-pentaeno, derivados de 5,14- diazatetraciclo[10,3,1,0.sup.2,10,0.sup.4,8]hexadeca-2 (10),3,5,8-tetraeno, derivados de 11- azatriciclo[7,3,l,0.sup.2,7]trideca-2(7) ,3,5-trieno, os quais são todos descritos no Pedido de Patente U.S. n° 2001/00336943 Al e seus sais farmaceuticamente aceitáveis e seus isómeros óticos.

Exemplos de condições associadas a dor aguda, crónica e/ou neuropática e dor inflamatória incluem dano no tecido mole e periférico, tais como traumatismo agudo, osteoartrite, artrite reumatoide, dor musculoesquelética, particularmente após traumatismo, dor espinal, dor de dentes, sindromes de dor miofascial, dor de cabeça, dor de perineotomia e queimaduras; dor profunda e visceral, tais como dor no coração, dor muscular, dor nos olhos, dor orofacial, por exemplo, odontalgia, dor abdominal, dor ginecológica, por exemplo, dismenorreia e dor do parto; dor associada a dano do nervo e raiz, tal como dor associada a distúrbios do tecido nervoso periférico, por exemplo, compressão de nervo e dilacerações do plexo braquial, amputação, neuropatias periféricas, nevralgia, tique doloroso, dor facial atípica, dano da raiz do nervo, dor e/ou compressão de nervo crónica, e aracnoidite; dor associada a carcinoma, frequentemente referida como dor do cancro; dor associada a SIDA, dor do sistema nervoso central, tal como dor devida a dano na medula espinal ou tronco cerebral; dor lombossagrada; ciática; dor de cabeça, incluindo enxaqueca, cefaleia tensional aguda ou crónica, cefaleia em salvas, dor temporomandibular e dor do seio maxilar; espondilite 28 anquilosante, gota; dor pós-operatória; dores fantasmas; neuropatia diabética; herpes zóster; e dor da cicatriz.

Exemplos da formulação e utilização de péptidos de conotoxina no tratamento de dor podem ser encontrados em WO9107980; US 5,587,454 e WO9701351. Estes documentos referem-se a omega conotoxinas. Ver também Bowersox SS, Gadbois T, Singh T, Pettus M, Wang YX & Luther RR (1996) J Pharmacol Exp Ther, 279(3) páginas 1243-9, o gual se refere a péptidos de conotoxina gue são blogueadores seletivos do canal de cálcio sensível a tensão de tipo N e sua utilização no tratamento de dor aguda, persistente e neuropática em ratazanas.

Exemplos de doenças ou condições do sistema urinário incluem incontinência urinária e fecal. Exemplos de doenças ou condições cardiovasculares incluem arritmias de várias origens e insuficiência cardíaca coronária. Exemplos de distúrbios do humor incluem depressão, ansiedade, apetências, um distúrbio viciante e síndrome de abstinência, um distúrbio da adaptação, distúrbios de aprendizagem e mental relacionados com a idade, anorexia nervosa, apatia, distúrbios de défice de atenção devido a condições médicas gerais, distúrbio de hiperatividade com défice de atenção, distúrbio bipolar, bulimia nervosa, síndrome de fadiga crónica, stress crónico ou agudo, distúrbio do comportamento, distúrbio ciclotímico, depressão, distúrbio distímico, fibromialgia e outros distúrbios somatoformes, distúrbio da ansiedade generalizada, incontinência, distúrbios de inalação, distúrbios de intoxicação, loucura, obesidade, distúrbios obsessivo-compulsivo e distúrbios de espetro relacionado, distúrbio desafiador opositivo, distúrbio de pânico, neuropatia periférica, distúrbio pós-stress traumático, 29 distúrbio disfórico pré-menstrual, distúrbios psicóticos, distúrbio afetivo sazonal, distúrbios do sono, fobia social, distúrbios específicos do desenvolvimento, sindrome "poop out" de inibição seletiva da recaptação de serotonina (SARI) e distúrbios de tiques.

Exemplos da utilização de inibidores seletivos da recaptação de noreprinefrina no tratamento de doenças ou condições do sistema urinário incluem Springer, JP., Kropp, BP & Thor KB (1994) J Urol 152(2), p515-9 (refere-se ao aparelho urinário inferior); Penttila, O. et al (1975) Ann Clin Res (7), 32-6 (refere-se a tratamento de colite ulcerosa) e Dinan, TG et al (1990) J Psychosom Res 34, p575-80 (refere-se ao tratamento de sindrome do intestino irritável).

Preferencialmente o mamífero está necessitado desse tratamento, embora o péptido possa ser administrado de uma maneira profilática. A invenção também proporciona uma composição compreendendo um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

Xaal Xaa2 Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys SEQ ID NO. 3 em que Xaal é um resíduo de pGlu ou DpGlu N-terminal; e

Xaa2 é Asn ou uma supressão; ou uma tal sequência em que uma ou mais Cys está substituída pelo seu D-aminoácido correspondente e/ou Pro está substituída por 4-hidroxiprolina e/ou Tyr está substituída por 4-metoxitirosina; ou um sal, éster, amida ou pró-fármaco do mesmo, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. 30

Preferencialmente, a composição está na forma de uma composição farmacêutica. A composição também pode ter outros agentes ativos úteis no tratamento da condição, doença ou distúrbio presentes na composição farmacêutica.

Como discutido acima, também é proporcionada a utilização de um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante, em que o referido péptido de χ-conotoxina compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

Xaal Xaa2 Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys SEQ ID NO. 3 em que Xaal é um residuo de pGlu ou DpGlu N-terminal; e Xaa2 é Asn ou uma supressão; ou uma tal sequência em que uma ou mais Cys está substituída pelo seu D-aminoácido correspondente e/ou Pro está substituída por 4-hidroxiprolina, e/ou Tyr está substituída por 4-metoxitirosina; ou um sal, éster, amida, ou pró-fármaco do mesmo, no fabrico de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de condições ou doenças urinárias ou cardiovasculares, ou distúrbios do humor, ou para o tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação.

Como mencionado acima, os péptidos de χ-conotoxina isolados, sintéticos ou recombinantes MrlA específicos da invenção têm a aptidão de inibir o transportador da noradrenalina neuronial.

Também é proporcionado um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos: 31

Xaal Xaa2 Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys SEQ ID NO: 3 em que Xaal é um resíduo de piroglutamato (pGlu) ou D-piroglutamato (dpGlu) N-terminal; e Xaa2 é Asn ou uma supressão; ou uma tal sequência em que uma ou mais Cys está substituída pelo seu D-aminoácido correspondente e/ou Pro está substituída por 4-hidroxiprolina, e/ou Tyr está substituída por 4-metoxitirosina; ou um sal, éster, amida ou pró-fármaco do mesmo para ser utilizado como um medicamento ou para ser utilizado no tratamento ou prevenção de doenças ou condições do sistemas urinário ou cardiovascular, ou distúrbios do humor, ou no tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação ou para ser utilizado no tratamento de dor neuropática associada a cirurgia (dor pós-operatória) , dor de intestino, cancro, diabética, membro fantasma, dano em tecido nervoso, inflamatória e dor associada ao tecido nervoso periférico.

Refira-se também que o transportador de noradrenalina é expressado não só pelas células nervosas, mas também por outros tecidos incluindo a placenta, as células endoteliais pulmonares e o útero. Os péptidos de acordo com a presente invenção também podem ser eficazes na inibição destes transportadores de noradrenalina, e podem ser úteis no tratamento de condições nas quais estes transportadores são implicados.

Como será imediatamente entendido pelos especialistas na técnica, a via de administração e a natureza do veículo farmaceuticamente aceitável dependerá da natureza da condição e do mamífero a ser tratado. Julga-se que a escolha de um veículo ou sistema de administração particular, e a via de administração poderiam ser 32 prontamente determinados por um especialista na técnica. Na preparação de qualquer formulação contendo os péptidos ativos deverá ter-se cuidado para garantir que a atividade do péptido não é destruída no processo e que o péptido é capaz de atingir o seu sitio de ação sem ser destruído. Nalgumas circunstâncias pode ser necessário proteger o péptido por meios conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, por microencapsulação. Analogamente, a via de administração escolhida deve ser de forma a que o péptido atinja o seu sitio de ação.

Por exemplo a via de administração preferida para o tratamento de doenças urinárias é oral, tópica, intranasal, intrarretal, intramucosal e intravenosa. A mesma pode ser utilizada para o tratamento de dor e distúrbios do humor, além da administração intratecal. Um método e formulações para serem utilizados com péptidos de conotoxina na administração intratecal é descrita em WO 9701351.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções ou dispersões injetáveis estéreis, e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis. Elas devem ser estáveis nas condições de fabrico e conservação e podem ser conservadas contra a oxidação e a ação contaminadora de microrganismos tais como bactérias ou fungos.

Os especialistas na técnica podem determinar prontamente as formulações apropriadas para os péptidos ou péptidos modificados da presente invenção utilizando abordagens convencionais. A identificação de gamas de pH preferidas e excipientes adequados, por exemplo antioxidantes, é rotina na técnica (ver, por exemplo, Cleland et al, 1993) . Os sistemas tampão são rotineiramente utilizados para 33 proporcionar valores pH numa gama desejada e incluem os tampões de ácido carboxilico por exemplo acetato, citrato, lactato e succinato. Encontra-se disponível uma variedade de antioxidantes para tais formulações incluindo compostos fenólicos tais como BHT ou vitamina E, agentes de redução tais como metionina ou sulfito, e queladores de metal tais como EDTA.

As abordagens convencionais para a formulação de péptidos farmaceuticamente ativos são descritas nos seguintes artigos: Ryan, J et al. , (1986) Clin Pharmacol Ther (39), 40-2. (um ensaio clínico que detalha a administração oral do péptido nifalatida); Krames E.S. et al. (1986) Pain 24, 205-9 (descreve a administração intratecal de um péptido); WO9614079A1 (a qual descreve a administração oral e retal de formulações do péptido ciclosporina); W09640064A1 (a qual descreve formulações para a estabilidade de péptidos); W09805309A1 (descreve formulações de péptidos - uma composição farmacêutica de ciclosporina para utilização intervalada) e WO9802148A2 (a qual descreve formulações retais e orais de péptidos para libertação prolongada). O solvente ou meio de dispersão para a solução ou dispersão injetável pode conter qualquer um dos solventes ou sistemas veículo convencionais para péptidos ativos, e pode conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos, e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pela utilização de tensioativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser conseguida quando necessário através da inclusão de 34 vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes para ajustar a osmolalidade, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Preferencialmente, a formulação para injeção será isotónica com o sangue. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida pela utilização nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. As formas farmacêuticas adequadas para utilização injetável podem ser administradas por qualquer via apropriada incluindo injeção ou infusão intravenosa, intramuscular, intracerebral, intratecal, epidural.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando os compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes tais como aqueles enumerados acima, consoante necessário, seguida de esterilização por filtração. No geral, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo ou secagem por congelação de uma solução, previamente esterilizada por filtração, do ingrediente ativo e quaisquer ingredientes adicionais desejados.

Quando os ingredientes ativos estão adequadamente protegidos eles podem ser administrados por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável, ou eles podem ser fechados numa cápsula de gelatina dura ou mole, ou eles podem ser 35 prensados em comprimidos, ou eles podem ser incorporados diretamente com a comida do regime alimentar. Para administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e semelhantes. Tais composições e preparações contêm preferencialmente pelo menos 1% em peso de composto ativo. A percentagem das composições e preparações pode ser, evidentemente, modificada e pode estar convenientemente entre cerca de 5 até cerca de 80% de peso da unidade. A quantidade de composto ativo nessas composições terapeuticamente úteis é de tal forma que será obtida uma dosagem adequada.

Os comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e semelhantes também pode conter os componentes como listados a seguir: um aglutinante tal como goma, goma-arábica, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcico; um desintegrante tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e pode ser adicionado um edulcorante tal como sacarose, lactose ou sacarina ou um aromatizante tal como hortelã-pimenta, óleo de gaultéria ou aromatizante de cereja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além de materiais do tipo acima, um veículo líquido. Podem estar presentes vários outros materiais como revestimentos ou para modificar de outro modo a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, os comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter o composto ativo, sacarose como um edulcorante, metil e propilparabenos como conservantes, um corante e aromatizante tal como aroma de cereja ou laranja. 36

Evidentemente, qualquer material utilizado na preparação de qualquer forma unitária de dosaqem deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades utilizadas. Além disso, o(s) composto(s) ativo(s) pode(m) ser incorporado(s) em preparações e formulações de libertação prolonqada. A presente invenção também se alarqa a quaisquer outras formas adequadas para administração, por exemplo aplicação tópica tais como cremes, loções, adesivos transdérmicos, formulações para pulverização e qeles, ou composições adequadas para inalação ou administração intranasal, por exemplo soluções ou pós secos.

As formas de dosaqem parentéricas são preferidas, incluindo aquelas adequadas para administração intravenosa, subcutânea, intratecal, intracerebral ou epidural. A composição também pode ser formulada para administração via implantes de libertação lenta, incluindo bombas implantáveis, tais como bombas osmóticas.

Os veiculos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, é considerada a sua utilização nas composições terapêuticas. Nas composições também podem ser incorporados ingredientes ativos adicionais. 37 É especialmente vantajoso formular as composições parentéricas na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados; contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as novas formas unitárias de dosagem da invenção são ditadas e diretamente dependentes das (a) características únicas do material ativo e do efeito terapêutico particular a ser conseguido, e (b) limitações inerentes na técnica de formulação de um tal material ativo para o tratamento de doenças em indivíduos vivos possuindo um estado patológico em que a saúde corporal está debilitada como aqui divulgado em pormenor. 0 ingrediente ativo principal é formulado para administração conveniente e eficaz em quantidades eficazes com um veículo farmaceuticamente aceitável adequado na forma unitária de dosagem. A forma de dosagem unitária pode, por exemplo, conter o composto ativo principal em quantidades que vão desde 0,25 yg até cerca de 2000 mg. Exprimido em proporções, o composto ativo está geralmente presente desde cerca de 0,25 yg até cerca de 200 mg/mL de veículo. No caso de composições contendo ingredientes ativos adicionais, as dosagens são determinadas por referência à dose e modo de administração habituais dos referidos ingredientes. A invenção será agora descrita relativamente aos desenhos e exemplos apensos, contendo é para ser entendido que a 38 particularidade da descrição seguinte não é para substituir a generalidade da descrição precedente da invenção.

Reportando às figuras:

Figura 1: Alivio de alodinia tátil na pata ipsilateral na ratazana CCI utilizando (a) SEQ ID NO. 4 (0,2-30 nM) ao longo de 6 h; (b) Morfina (3,5-50 nM) ao longo de 6 h; e (c) SEQ ID NO. 4 (1-30 nM) ao longo de 72 h.

Figura 2: Morfina i.t. vs 2174 i.t. para o alivio de alodinia tátil na pata ipsilateral na ratazana CCI.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Síntese e purificação de MrlA (SEQ ID NO. 1), SEQ ID NO. 4 e derivados de MrlA relacionados (a) Síntese (i) O péptido de acordo com a SEQ ID NO. 4 foi construído utilizando métodos químicos de F-moc com base no método de Scholzer et al. (Scholzer et al. Int. J. Prot. Pept. Res., 40, 180, (1992)) sobre resina de amida de Rink obtida de

Polymer Laboratories. Foi utilizada proteção da cadeia lateral Trt/f-Bu convencional ao longo da construção da cadeia. A eficiência de acoplamento foi seguida utilizando o teste de ninidrina (Sarin et al., Anal. Biochem. 117, 145-157 (1981) . (ii) Outros péptidos foram construídos utilizando química Boc e grupos de proteção da cadeia lateral convencionais sobre uma resina MBHA utilizando (Schnolzer et al, 1992). 39

Quando é utilizado este método, a dissociação é realizada utilizando HF: armadilhas (9:1) durante lh a 0 a -10°C. (b) Oxidação e purificação (i) A oxidação do péptido reduzido puro construído de acordo com (a) (i) foi realizada utilizando um sistema tampão otimizado (30% em peso de DMSO/NH4HCO3 0,1M, pH 6, 12 h) e o produto oxidado desejado possuindo a conectividade de ligação dissulfureto correspondente à do MrlA foi purificado utilizando o passo de RP-HPLC (coluna C-8 com um gradiente desde 10%B até 33%B ao longo de 40 min) para proporcionar o péptido com uma pureza maior do que 99%. (ii) A purificação foi conseguida utilizando um passo de RP-HPLC tanto na fase de péptido reduzido como na de péptido oxidado. Isto por oposição ao MrlA que requer um passo de purificação adicional utilizando um programa de cromatografia otimizado para remover uma impureza de degradação de Asp que eluiu na proximidade (MM 1408,8, Asp, B-Asp). (iii) Os outros péptidos foram oxidados e purificados seguindo procedimentos substancialmente iguais ao descrito acima. Nalgumas sínteses o sistema tampão utilizado foi 30% isopropanol/NH4HC03 0, 1M pH 8,0 ou uma mistura de isopropanol/DMS0/NH4HC03 0,1M, pH8 8. 40

Exemplo 2 Estabilidade dos péptidos relativamente a MrlA Métodos

Os péptidos foram dissolvidos a lmg/mL em tampão de acetato de sódio 5mM/soro fisiológico a 0,9%. As amostras foram conservadas a 37 °C e as amostras tomadas em intervalos ao longo de um periodo de 31 dias. Para estudos de comparação, uma amostra recente de ambos os péptidos foi preparada a partir de pó seco liofilizado conservado a -20°C à mesma concentração em água, imediatamente antes da avaliação. As amostras foram avaliadas por RP-HPLC/MS utilizando o programa de cromatografia otimizado descrito acima e ao longo de uma gama de massa de 300-1800amu.

Resultados (a) estabilidade utilizando diferentes tampões A estabilidade do péptido de SEQ ID NO. 4 foi medida numa gama de condições tampão a 37°C. Os resultados, mostrados no Quadro 2, indicam que este péptido é estável sob uma gama de condições por períodos de tempo prolongados. QUADRO 2

Tempo Acetato pH 4,5 Acetato pH 5, 0 Acetato pH 5,5 Lactato pH 4,5 Lactato pH 5, 0 Lactato pH 5, 5 6 dias 100 100 100 100 100 100 18 dias 100 100 100 100 100 100 31 dias 99,46 98, 52 100 99, 58 100 99, 51 Gráfico 1: Estabilidade da SEQ ID tempo e em vários tampões Tampão de Acetato = acetato de Na fisiológico a 0,9% Tampão de Lactato = lactato de Na fisiológico a 0,9% NO. 4 a 37°C após vários períodos de 5mM/ácido acético com soro 5mM/ácido láctico com soro 41 (b) comparação de MrlA e SEQ ID NO. 4 A estabilidade do péptido de SEQ ID NO. 4 também foi comparada diretamente com a estabilidade de MrlA a 37 °C. Os resultados mostrados no Quadro 3 destacam a estabilidade muito melhorada do péptido de SEQ ID NO. 4. Após 31 dias mais de 99% do produto parental continua presente para o péptido de SEQ ID NO. 4. Após o mesmo tempo a 37°C, o MrlA é significativamente menos estável em relação à sua estabilidade global. Adicionalmente, o MrlA é guase completamente convertido nos produtos de degradação (Asn em Asp e B-Asp, JBC, Vol 286(33), pp 22549-22556, 1991 Tiler-Cross, R e Schirch, V.) após 31 dias.

Quadro 3: Estabilidade de MrlA e SEQ ID NO. 4 a 37°C ao longo do tempo em acetato de Na 5mM/ácido acético com soro fisiológico a 0,9% pH5,5 % pureza Amostra 6 dias 31 dias SEQ ID NO. 4 (recente) 100,00 100,00 SEQ ID NO. 4 100,00 100,00 MrlA (recente) 99, 77 99, 77 MrlA 94,04* 93,30t *contém uma mistura de MrlA e AspIMrlA; tcontém predominantemente AspIMrlA.

Exemplo 3 A atividade de ligação ao transportador de noradrenalina (NET) humano e a captação de noradrenalina (NA) foram medidos para vários péptidos de acordo com a invenção, bem como para o MrlA e outros péptidos que não estão de acordo com a invenção. (i) 42

Ensaio de ligação de radioligando ao hNET A aptidão das χ-conotoxinas para atuar como inibidores do transportador de noradrenalina humano (hNET) pode ser medida pela sua inibição competitiva de 3H-nisoxetina de membranas preparadas a partir de células de mamifero COS-7 que expressam hNET. Observa-se resultados semelhantes com outras 3H-moléculas pequenas, tais como o mazindol. Células COS-7 (ATCC) cultivadas em placas de 150 mm contendo DMEM e 10% de soro foram transfetadas de modo transitório com ADN de plasmídeo que codifica o NET mamífero (humano ) (Percy et al 1999 , Br J Pharmacol 128: 774-780) utilizando o reagente metafecteno (Biontex). As células foram colhidas 48h após transfeção, as células foram raspadas, lavadas, homogeneizadas e centrifugadas utilizando tampão TEM. Para cada membrana de disco de 150mm foi ressuspenso em 500yL de TEM com 10% de glicerol. Foram realizadas estimativas da proteína por BCA dando ~ 6yg/yL. No ensaio foram utilizados lyL de membrana + 49yL de tampão de ensaio por poço (tampão de ensaio é TrisHCl 20mM pH 7,4, NaCl 75mM, EDTA 0,lmM, EGTA 0,lmM, 0,1% de BSA) . O volume total de ensaio foi de 150yL e cada ponto de dados realizado em triplicado. Foram adicionados péptidos a várias concentrações (10“4 a 10_11M) ou ligando de controlo (nisoxetina) à placa de ensaio, seguido de 3H-nisoxetina 4,3nM (Perkin Elmer cat # NET1084). Finalmente foi adicionada a membrana e o ensaio foi incubado durante 1 h à TA, após o que a reação foi filtrada sobre tapetes de filtração GF B (Perkin Elmer cat #: 1450-521) pré-tratados com PEI a 0,6% utilizando um coletor de células Tomtec e lavados 3 vezes utilizando tampão de lavagem (HEPES 20mM pH 7,4, NaCl 125mM Θ 4°C). Os tapetes de filtração foram então 43 secos, colocados num saco de filtro, adicionados 9 mL de cintilante betaplate (Perkin Elmer cat # 1205-440) e tapetes de filtração contados num instrumento Wallac MicroBeta. Cada ponto de dados foi realizado em triplicado e os resultados resumidos no Quadro 4 são de ná 3 experiências.

(ii) Ensaio de captação de NA A aptidão das χ-conotoxinas para atuar como inibidores do transportador de noradrenalina humano (hNET) pode ser medida pela sua inibição não competitiva da função do transportador de noradrenalina para transportar 3H- noradrenalina para o interior de células de mamifero COS7 que expressam o hNET. Células COS-7 (ATCC) cultivas em placas de 24 poços contendo DMEM e 10% de soro foram transfetadas de modo transitório com ADN de plasmideo que codifica o NET de mamifero (humano) utilizando o reagente metafecteno (Biontex). Os ensaios de captação foram realizados à TA, 48h após transfeção em tampão de transporte contendo NaCl 125mM, KC1 4,8mM, MgS04 l,2mM, KH2P04 l,2mM, CaCl2 l,3mM, HEPES 25mM pH7,4, glucose 5,55mM, ácido ascórbico l,02mM, U-0521 ΙΟμΜ e pargilina ΙΟΟμΜ. O volume total de ensaio foi de 250pL. As células foram lavadas 3 vezes com PBS quente, seguido da adição de tampão de ensaio ao qual foi adicionado o controlo ou ligando de competição a várias concentrações (10‘4 a 10_11M) . O ensaio foi incubado durante 20 min, após o que foi adicionada 3H-noradrenalina lOOnM e deixada incubar durante 10 min. O ensaio foi parado por remoção e lavagem com PBS frio. As células foram submetidas a lise com 500pL de SDS a 0,1%, NaCl 0,1N. Foram retiradas aliquotas de 100pL e adicionadas à placa de 96 poços 44 flexível (para o contador) as quais foi adicionado cintilante supermix (100yL), bem misturadas e contadas durante 3 min por poço. Cada ponto de dados foi realizado em triplicado e os resultados, resumidos no Quadro 4, são e n> 3 experiências.

Os resultados são mostrados abaixo no Quadro 4. No quadro "h", "c" e "u" referem-se a D-histidina, D-cisteína e D-piroglutamato respetivamente, 0 refere-se a 4-hidroxilprolina, MeY refere-se a 4-metoxitirosina e U refere-se a piroglutamato, e -OH indica que existe um ácido livre C-terminal. QUADRO 4 χ-Péptido Sequência Log IC50 médio para a substituição de 3H-nisoxetina de hNET Log IC50 médio para a inibição de 3H-NA através de hNET SEQ ID NO . 1 N G V C c G Y K L C H 0 C -5,74 -6,30 SEQ ID NO . 4 U G V c c G Y K L C H 0 -5,57 -6,48 SEQ ID NO. 12 (comparativa) U G V c c G Y K L C h 0 C -4,22 -4,15 SEQ ID NO . 5 U G V c c G Y K L C H 0 C -5,38 -6,24 SEQ ID NO . 6 U G V c c G MeY K L C H 0 c -5, 94 -6, 67 SEQ ID NO . 7 u N G V c c G MeY K L C H 0 c -5, 64 -6,58 SEQ ID NO . 8 u N G V c c G Y K L C H 0 c -5,33 -6,12 SEQ ID NO . 9 U G V c c 0 Y K L C H 0 c -OH -5, 08 - SEQ ID NO . 10 U G V c c G Y K L C H 0 c -OH -5,16 - SEQ ID NO . 11 u G V c c G Y K L C H 0 c -5,56 - - indica não testado 45 46

Exemplo 4 - Comparação dos efeitos antinociceptivos da SEQ ID NO. 4, MrlA e morfina num modelo de dor neuropática em ratazana Métodos

Animais

Ratazanas Sprague-Dawley masculinas adultas foram adquiridas de Animal Resources Centre (ARC), Perth, Austrália, e do Herston Medicai Research Centre, The University of Queensland. As ratazanas foram alojadas num ambiente de temperatura controlada (21 ± 2° C) com um ciclo luz/escuro de 12h/12h. A comida e a água estavam disponiveis ad libitum. A aprovação ética para este estudo foi obtida de Animal Experimentation Ethics Committee da The University of Queensland.

Reagentes e materiais 0 isoflurano (Forthane®) foi obtido de Abbott Australasia Pty Ltd (Sydney, Austrália). Os frascos de benzilpenicilina de sódio (600 mg) foram adquiridos de CSL Ltd (Melbourne, Austrália). As ampolas de soro fisiológico normal foram obtidas de Delta West Pty Ltd (Perth, Austrália) e o soro fisiológico heparinizado (50 IU/5 mL) foi adquirido de Astra Pharmaceuticals Pty Ltd (Sydney, Austrália). O tubo de polietileno de lúmen simples (I.D. 0,2 mm, O.D. 0,6 mm) foi adquirido de Auburn Plastics and Engineering Pty Ltd (Sydney, Austrália). As suturas de seda siliconizada estéril (Dysilk™) foram obtidas de Dynek Pty Ltd (Adelaide, Austrália do sul) e os grampos de Michel foram adquiridos de Medicai and Surgical Requisites Pty Ltd (Brisbane, Austrália). 47

Lesão por Constrição Crónica (CCI) do Nervo ciático

As ratazanas foram anestesiadas com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg) administradas por injeção intraperitoneal e foi produzida uma lesão por constrição crónica (CCI) do nervo ciático de acordo com o método de Bennett e Xie (1988). Resumidamente, o nervo ciático comum esquerdo foi exposto ao nivel da coxa média por dissecção romba através do bíceps femoral. Proximal à trifurcação, * 10 mm do nervo foi libertado de tecido aderente e foram aplicadas quatro ligaduras soltas (seda 3.0) em torno do nervo ciático (afastadas de ~ 1 mm) . A incisão foi fechada em camadas. Após cirurgia, as ratazanas receberam benzilpenicilina (60 mg s.c.) para prevenir infeção e foram mantidas quentes durante a recuperação cirúrgica. As ratazanas foram alojadas isoladamente durante 14 dias antes da administração do opióide ou veículo. As ratazanas foram inspecionadas diariamente desde o tempo de cirurgia CCI em relação à postura da pata traseira afetada, comportamento de exploração, peso corporal e ingestão de água, e quaisquer sinais de autotomia. Foram observados sinais precoces de autotomia numa ratazana (roer das pontas das garras e de algum tecido circundante na pata traseira ipsilateral) e este animal foi imediatamente sacrificado.

Inserção de Cateter Intratecal

Dez a onze dias após cirurgia CCI ou em controlos não tratados, as ratazanas foram profundamente anestesiadas com uma mistura de cetamina (80 mg kg-1) e xilazina (8 mg/kg) administrada como uma única injeção intraperitoneal (i.p.). Antes da cirurgia, as regiões do dorso e pescoço da ratazana foram rapadas e a pele limpa com uma gaze cirúrgica com betadine. A ratazana foi então colocada numa 48 posição em decúbito abdominal e a vértebra lombar L6 foi localizada por palpação das tuberosidades sacrais do ileo os (Hebel & Stromberg 1976). Foi feita uma incisão de 6 cm na linha média do dorso, 3 cm caudal e 3 cm cefálica em relação a L6. Formou-se uma bolsa subcutânea (para o cateter intratecal) por dissecção romba com tesouras em ambos os lados da incisão. A fáscia que cobre os músculos superficiais do dorso foi cortada numa incisão de 5 mm em forma de V que abrangia a L5. Foram feitas incisões caudais de 5 mm adicionais paralelas a L6. A fáscia foi então retraída e os músculos lombares que circundam a base de L5 e L6 foram removidos, assim como o foi o m. interspinalis entre os processos espinhosos de L5-L6.

Após remoção dos processos espinhosos de L6 com fórceps, o tecido mole por baixo do arco ilíaco de L5 foi removido, expondo a dura-máter. A membrana durai foi furada com um agulha 23G, libertando CSF transparente. Um cateter de polietileno (O.D. 0,6 mm, I.D. 0,2 mm; 20 cm de comprimento) pré-cheio com soro fisiológico foi cuidadosamente avançado um comprimento de 1 cm dentro do espaço intratecal e foi administrado um pequeno volume de soro fisiológico (20 yL) através do cateter. Se fosse observada fuga de soro fisiológico em torno do cateter, a ratazana era excluída de mais experiências. Depois de uma finalização bem sucedida do 'teste de fuga', o cateter intratecal (i.t.) foi fixado com cimento dentário ao músculo circundante - 2 cm da L5, exteriorizado através de um túnel subcutâneo (s.c.) até uma pequena incisão na base do pescoço e suturado em posição. Após sutura dos músculos lombares e pele, as ratazanas receberam benzilpenicilina (50000 IU i.p.) e enrofloxacina (5 mg»kg_1 s.c.) para prevenir infeção e foram mantidas quentes durante a recuperação da anestesia. Após conclusão da cirurgia, as 49 ratazanas foram alojadas separadamente durante um período de recuperação de 3-4 dias antes da administração i.t. de fármaco. No dia a seguir à cirurgia, o anestésico local, lignocaína (2%, 20 pL) foi administrado através do cateter i.t.. Se não fosse observada paralisia total de ambas as patas traseiras, as ratazanas eram excluídas de mais experiências. Fármacos Administrados A SEQ ID NO. 4 foi preparada em tampão de acetato de sódio 5 mM a pH 5,5 e administrada a ratazanas num dose bolus única de 0,2-30 nmoles. As soluções-mães dos péptidos foram quantificadas relativamente a uma solução-mãe analisada de aminoácido por HPLC de fase inversa com deteção u.v. na Xenome Ltd. O morfina HC1 em pó foi adquirido de Royal Brisbane Hospital Central Pharmacy (Herston, Queensland) e dissolvido em soro fisiológico normal para preparar uma concentração mãe de 10 pg/10 pL (morfina base). Cada ratazana recebeu 3,5-50 nmol (10-15 pL) de morfina. Todas as diluições foram feitas com soro fisiológico normal. Todas as injeções i.t. foram seguidas de um fluxo de soro fisiológico (20 pL) para garantir administração completa do péptido no espaço intratecal.

Conservação das Soluções-mães

Alíquotas (10 pL) das soluções-mães foram conservadas a -20°C antes da utilização em experiências animais. Imediatamente antes da experiência, as alíquotas do composto relevante foram descongeladas à temperatura ambiente e em seguida diluídas até à concentração necessária com soro fisiológico estéril para alcançar a concentração final desejada para i.t. subsequente. As 50 porções não utilizadas foram rejeitadas para o esgoto para garantir que os compostos sofriam apenas um ciclo de congelação-descongelação.

Administração Intratecal de Fármaco

No dia 14 após cirurgia CCI, grupos individuais de ratazanas CCI, naives ao fármaco receberam uma injeção bolus i.t. de SEQ ID NO. 4, morfina ou soro fisiológico num volume de 10-15 pL. A antinociceção foi avaliada utilizando filamentos de von Frey até as respostas regressarem aos valores de base.

Avaliação da antinociceção: ratazanas CCI utilizando filamentos de von Frey A alodinia tátil, a caracteristica distintiva de dor neuropática, foi quantificada utilizando filamentos de von Frey que foram utilizados para aplicar um estimulo mecânico não nocivo (ligeira pressão) na pata traseira. As ratazanas foram transferidas para gaiolas de ensaio de rede metálica (20 cm x 20 cm x 20 cm) e deixadas aclimatar durante 10 min. Os filamentos de von Frey foram utilizados para determinar o limiar mecânico mais baixo necessário para um reflexo rápido de afastamento da pata. Resumidamente, começando com o filamento de von Frey que produziu a força mais baixa, o filamento foi aplicado na superfície plantar da pata traseira até o filamento dobrar ligeiramente. A ausência de uma resposta após 5 s levou à utilização do filamento seguinte de peso crescente. Os filamentos utilizados produziam um peso de varejamento de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20 g e estes foram regularmente calibrados. Foi dada uma classificação de 20 g aos animais que não responderam a qualquer um dos filamentos de von 51

Frey. Os limiares de afastamento da pata (g) foram convertidos em área sob a curva (AUC). A resposta máxima no lado ipsilateral foi 45 AUC.

Verificação da colocação correta do cateter i.t.

No final de cada experiência foi injetado o corante verde de malaquite (30 yL) via o cateter i.t., enquanto as ratazanas eram ligeiramente anestesiadas com O2:CO2 (50%:50%). Trinta segundos mais tarde, as ratazanas foram decapitadas e a coluna espinal foi exposta cirurgicamente. Os dados das ratazanas onde havia evidência de fuga subcutânea de corante no sitio onde o cateter entrava nos músculos dorsais acima da L6 ou insucesso em o corante se distribuir pelo menos 3-4 cm ao longo da medula espinal, foram excluídos da análise.

Análise de Dados

As áreas sob as curvas do grau de antinociceção versus tempo (valores AUC) para cada um dos péptidos foram calculadas desde o tempo = 0 até 3 h. Foram construídas curvas dose-resposta para cada um dos péptidos representando graficamente os valores de AUC versus a dose de péptido i.t. (exprimida em nmol por ratazana).

Resultados

Tanto a SEQ ID NO. 4 (Figura IA, C) como a morfina (Figura 1B) produziram efeitos antinociceptivos num modelo de dor neuropática em ratazana quando injetadas como uma dose bolus única pela via intratecal (i.t.). Estes efeitos foram dependentes da dose (Figura 2) . Embora ambos os compostos tenham produzido efeitos secundários analogamente suaves, a 52 SEQ ID NO. 4 produziu efeitos antinociceptivos que foram maiores tanto em extensão como em duração utilizando doses menores de composto (Figura 1) . Surpreendentemente, a SEQ ID NO. 4 próximo da dose de eficácia máxima produziu efeitos antinociceptivos que duraram durante 2 dias. Em contraste, a morfina a uma dose i.t. de eficácia máxima produziu efeitos que duraram apenas 3 h. Dado que a SEQ ID NO. 4 produz efeitos antinociceptivos moderados a 1 nmole e efeitos secundários relativamente suaves a 30 nmole que não eram limitantes da dose, a SEQ ID NO. 4 tem uma janela terapêutica de pelo menos 30 vezes. Os efeitos antinociceptivos das morfina e SEQ ID NO. 4 foram seletivos para a pata ipsilateral em relação à contralateral.

Ao longo desta especificação e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra "compreendem", e variantes tais como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro ou passo ou grupo de números inteiros ou passos especificados mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou passo ou grupo de números inteiros ou passos.

Os especialistas na técnica aperceber-se-ão que a invenção aqui descrita é suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> XENOME LTD

<120> NOVOS PÉPTIDOS DE QUI-CONOTOXINA (-1) <130> 12373570/JGC 53 <150> US 60/430306 <151> 2002-12-02 <16 0 > 12 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Conus marmoreus <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (12)..(12) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> DISSULFURETO <222> (4)..(13) <223> <22 0> <221> DISSULFURETO <222> (5)..(10) <223> <400> 1

Asn Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 15 10

<210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Conus marmoreus 54 <22 0> <221> CARACTERISTICA MISTA <222> (12) . . (12) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (4)..(13) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) . . (10) <4 0 0> 2

Vai Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 1 5 10

<210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERISTICA MISTA <222> (D ..(D <223> X é um residuo de pGLU ou DpGlu <22 0> <221> CARACTERISTICA MISTA 55 <222> (2)..(2) <223> X é Asn ou uma supressão <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) .. (14) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (6) . . (11) <4 0 0> 3

Xaa Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (1) .. (1) <223> X é ácido piroglutâmico <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (12) . . (12) <223> X é 4-hidroxiprolina 56 <22 0> <221> MOD RES <222> (13)..(13) <223> AMIDAÇÃO <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (4)..(13) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) . . (10) <4 0 0> 4

Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 15 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (1) ..(1) <223> X é ácido piroglutâmico <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (12) . . (12) 57 <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (13) .·(13) <223> X é D-cisteína <22 0> <221> MO D RES <222> (13) .·(13) <223> AMIDAÇÃO <22 0> <221> DISSULFURETO <222> (5) . . (10) <223> <4 0 0> 5

Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Xaa 15 10

<210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (11).. (1) <223> X é ácido piroglutâmico <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA 58 <222> (7) . . (7) <223> X é 4-metoxítirosina <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (12) .. (12) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (4)..(13) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) . . (10) <22 0> <221> MOD RES <222> (13)..(13) <223> AMIDAÇÃO <4 0 0> 6

Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Xaa Lys Leu Cys His Xaa Cys 15 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético 59 <22 0> <221> CARACTERISTICA MISTA <222> (1) ..(1) <223> X é ácido piroglutâmico <22 0> <221> CARACTERISTICA MISTA <222> (8) . . (8) <223> X é 4-metoxitirosina <22 0> <221> CARACTERISTICA MISTA <222> (13)..(13) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> MOD RES <222> (13)..(13) <223> AMIDAÇÃO <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) . . (14) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (6) . . (11) <4 0 0> 7

Xaa Asn Gly Vai Cys Cys Gly Xaa Lys Leu Cys His Xaa Cys 15 10 60 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (1) ..(1) <223> X é ácido piroglutâmico <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (13)..(13) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> MOD RES <222> (13)..(13) <223> AMIDAÇÃO <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) . . (14) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (6) .. (11) <4 0 0> 61

Xaa Asn Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (1) ..(1) <223> X é ácido piroglutâmico <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (12) . . (12) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (9)..(13) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) . . (10) <4 0 0> 9

Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 15 10 62 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (1) ..(1) <223> X é ácido D-piroglutâmico <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (12) . . (12) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (4)..(13) <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (5) . . (10) <4 0 0> 10

Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 13 63

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1) .. (1) <223> X é ácido D-piroglutâmico <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (12)..(12) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> MOD RES <222> (13)..(13)

<223> AMIDAÇÃO <22 0> <221> DISSULFURETO <222> (4)..(13) <223> <22 0> <221> DISSULFURETO <222> (5) . . (10) <223> <4 0 0> 11

Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa Cys 15 10 64 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (1) .. (1) <223> X é piroglutamato <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (11).. (11) <223> X é D-histidina <22 0> <221> CARACTERÍSTICA MISTA <222> (12) . . (12) <223> X é 4-hidroxiprolina <22 0> <221> MOD_RES <222> (D ..(D <223> AMIDAÇÃO <22 0> <221> DISSULFURETO <222> <223> (4)..(13) <22 0> 65 <221> DISSULFURETO <222> (5)..(10) <223> <4 0 0> 12

Xaa Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys Xaa Xaa Cys 15 10

Lisboa, 18 de Maio de 2012

Claims (13)

1. 1 REIVINDICAÇÕES Péptido de χ-conotoxina recombinante compreendendo aminoácidos: isolado, sintético ou a seguinte sequência de Xaal Xaa2 Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Pro Cys SEQ ID NO: 3 em que Xaal é um resíduo de piroglutamato (pGlu) ou D-piroglutamato (dpGlu) N-terminal; e Xaa2 é Asn ou uma supressão; ou uma tal sequência em que uma ou mais Cys está substituída pelo seu D-aminoácido correspondente e/ou Pro está substituída por 4-hidroxiprolina, e/ou Tyr está substituída por 4-metoxitirosina; ou um sal, éster ou amida do mesmo.

2. Péptido consistindo da sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 1 ou uma tal sequência em que uma ou mais Cys está substituída pelo seu D-aminoácido correspondente ou um sal, éster ou amida do mesmo.

3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a Pro foi substituída por 4-hidroxiprolina. Péptido de acordo com a reivindicação 1 possuindo a seguinte sequência de aminoácidos SEQ ID NO.

4 SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 6 SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 9 Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Xaa5 Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Xaa4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys Xaal Asn Gly Vai Cys Cys Gly Xaa4 Lys Leu Cys His Xaa3 Cys Xaal Asn Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys -OH 4. 2 em que Xaal refere-se a ácido piroglutâmico, Xaa3 refere-se a 4-hidroxiprolina, Xaa4 refere-se a 4-metoxitirosina, Xaa5 refere-se a D-cisteína e -OH indica um ácido livre C terminal.

5. Péptido de acordo com a reivindicação 1 possuindo a seguinte sequência de aminoácidos Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys -OH SEQ ID NO. 10 Xaal Gly Vai Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His Xaa3 Cys SEQ ID NO. 11 em que Xaal refere-se a ácido D-piroglutâmico, Xaa3 refere-se a 4-hidroxiprolina e -OH indica um ácido livre C terminal.

6. Composição compreendendo um péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em conjunto com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

7. Composição da reivindicação 6 compreendendo ainda um ou mais de outros agentes ativos.

8. Péptido de χ-conotoxina de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para ser utilizado como um medicamento.

9. Péptido de χ-conotoxina de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para ser utilizado no tratamento ou prevenção de doenças ou condições do sistemas urinário ou cardiovascular, ou distúrbios do humor, ou no tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação. 3

10. Péptido de χ-conotoxina de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para ser utilizado no tratamento de dor neuropática associada a cirurgia (dor pós-operatória), dor de intestino, cancro, diabética, membro fantasma, dano em tecido nervoso, inflamatória e dor associada ao tecido nervoso periférico.

11. Utilização do péptido de χ-conotoxina isolado, sintético ou recombinante de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 no fabrico de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de condições ou doenças urinárias ou cardiovasculares, ou distúrbios do humor, ou para o tratamento ou controlo de dor aguda, crónica e/ou neuropática, enxaqueca ou inflamação.

12. Utilização de acordo com a reivindicação 11 em que a referida dor neuropática está associada a cirurgia (dor pós-operatória), dor de intestino, cancro, diabética, membro fantasma, dano em tecido nervoso, inflamatória e dor associada ao tecido nervoso periférico.

13. Utilização da reivindicação 11 ou 12 em que o referido medicamento é formulado para administração de modo substancialmente simultâneo ou sequencialmente com outros agentes úteis no tratamento das condições, doenças ou distúrbios. Lisboa, 18 de Maio de 2012