CN1854151B - 多巴胺转运蛋白拟肽抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的多巴胺转运蛋白拟肽抑制剂以及含有该抑制剂的药物组合物。本发明的该新型抑制剂对与多巴胺转运蛋白相关的神经精神性疾病(尤其是可卡因成瘾)有治疗作用，可特异性作用于多巴胺转运蛋白，竞争可卡因在多巴胺转运蛋白上的结合位点；能够透过血脑屏障，皮下注射后缓慢分布于脑内，且作用时间持久。动物实验发现本发明抑制剂可以拮抗可卡因成瘾。

Description

多巴胺转运蛋白拟肽抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及药物学领域。更具体地，本发明涉及新的多巴胺转运蛋白拟肽抑制剂以及含有该抑制剂的药物组合物。本发明的该新型抑制剂对与多巴胺转运蛋白相关的神经精神性疾病(尤其是可卡因成瘾)有治疗作用。

背景技术

多巴胺转运蛋白是良好的药物靶点，一些成功用于治疗肥胖、小儿注意力缺乏症(ADHD)、抑郁症和帕金森病的化学药物是典型的多巴胺转运蛋白抑制剂，如上市的马吲哚(mazindol)，利他林(ritalin)，安非拉酮(bupropion)和进入临床实验的brasofensine等(Dutta，A.K.，Zhang，S.，Kolhatkar，R.&Reith，M.E.Dopamine transporter as target for drug development ofcocaine dependence medications.Eur.J.Pharmacol.479，93-106，2003)。

特别值得关注的是：可卡因滥用是全球性社会和医学问题，尽管现在还无药可治，临床实验证明起效温和、作用时间长的多巴胺转运蛋白特异性抑制剂有望成为治疗药物(Gorelick，D.A.，Gardner，E.L.&Xi，Z.X.Agents indevelopment for the management of cocaine abuse.Drugs 64，1547-1573，2004)。

多巴胺转运蛋白是12次跨膜蛋白，和去甲肾上腺素转运蛋白、五羟色胺转运蛋白等在结构、功能上存在同源性，且这类蛋白至今还没有解析出晶体结构。这些都制约了多巴胺特异性抑制剂的发展。在以可卡因和GBR为模板的药物设计中得到了多巴胺转运蛋白特异性抑制剂，但数量有限(Gorelick，D.A.，Gardner，E.L.&Xi，Z.X.Agents in development for the management of cocaine abuse.Drugs 64，1547-1573，2004)。

综上所述，由于仍缺乏令人满意的多巴胺转运蛋白的抑制剂，因此本领域仍然迫切需要开发新的有效抑制多巴胺转运蛋白的抑制剂。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用作多巴胺转运蛋白特异性拟肽抑制剂的化合物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的抑制剂，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[L-脯氨酸]-[Xaa3]-[Xaa4](I)

式中，

Xaa0是L-Phe、L-Fbz、或L-Bip；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Ala、Gly、Ser、Thr；

Xaa3是无，或选自下组的氨基酸：Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；或是由上述2-5个氨基酸构成肽段；

Xaa4是无，或选自下组的氨基酸：Ala、Gly；

并且所述的抑制剂结合于多巴胺转运蛋白。

在另一优选例中，所述抑制剂具有β-转折，并且在218nm处的椭圆率大于20。较佳地，在218nm处的椭圆率大于30，更佳地，在218nm处的椭圆率大于40。

在另一优选例中，Xaa0选自L-Bip；和/或Xaa1选自Tyr、Trp、Phe；和/或Xaa2选自Thr、Ser。

在另一优选例中，Xaa3选自Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；和/或Xaa4选自无、或Gly、Ala。

在另一优选例中，Xaa0选自L-Bip、Xaa1选自Tyr、Phe；Xaa2选自Thr；Xaa3选自Phe、Tbz；且Xaa4选自无、或Gly。

在另一优选例中，该抑制剂选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2、3、5、7、8、或9所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2、3、5、7、8、或9所示氨基酸序列经过1-2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有结合于多巴胺转运蛋白的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的抑制剂。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(a)安全有效量(如0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％)本发明上述所述抑制剂或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的第四方面，提供了本发明所述的抑制剂或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备治疗多巴胺转运蛋白相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述的多巴胺转运蛋白相关疾病选自下组：帕金森病、可卡因成瘾、抑郁症、小儿多动症和肥胖症。

附图说明

图1显示了本发明拟肽的圆二色谱图。

图中1-4分别表示肽1-4。肽1-4的序列如下：

肽1：[L-苯丙氨酸]-[L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-苏氨酸]-[L-脯氨酸]-[L-赖氨酸]-[L-苏氨酸](SEQ ID NO：1)；

肽2：[L-苯丙氨酸]-[4-苄基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-苏氨酸]-[L-脯氨酸]-[L-赖氨酸]-[L-苏氨酸](SEQ ID NO：2)；

肽3：[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-苏氨酸]-[L-脯氨酸]-[L-赖氨酸]-[L-苏氨酸](SEQ ID NO：3)；

肽4：[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-苏氨酸]-[L-丙氨酸]-[L-赖氨酸]-[L-苏氨酸](SEQ ID NO：4)。

图2显示了饱和实验曲线图。图中曲线表示多巴胺转运蛋白的转运速度随底物浓度变化的情况，空心方框表示没有本发明拟肽抑制剂，实心圆点表示250nM肽5，空心三角表示600nM肽5。

其中肽5序列为：[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-苏氨酸]-[L-脯氨酸]-[O-苄基-苏氨酸]-[L-甘氨酸](SEQ ID NO：5)。

图3显示了肽5对Win35428结合的影响。图中曲线表示可卡因类似物Win35428在多巴胺转运蛋白上的结合随拟肽浓度的升高而下降。三角形表示肽5，圆形表示肽6。

图4显示了肽5在脑内的浓度时间曲线图。结果表明，皮下给药后，脑内肽5浓度随时间变化。其中，每组数据是5只小鼠数据的平均值。

图5显示了本发明的拟肽可以拮抗可卡因成瘾。

其中，在A中，动物分别皮下注射生理盐水、20mg/Kg肽5或6、10mg/Kg可卡因。结果表明，只有可卡因会诱导小鼠地点偏好性。每组数据是6只动物的平均值。

在B中显示了肽5可拮抗可卡因对地点偏好的诱导。每组数据由15只动物组成。星号表示P＜0.05。

在C中显示了肽5可拮抗可卡因诱导出的地点偏好的表达。每组数据由15只动物组成。星号表示P＜0.05。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，建立了快速灵敏的多巴胺转运蛋白活性测定方法以及对该蛋白抑制剂的体内活性评价方法，在此基础上筛选了大量化合物。结果发现多巴胺转运蛋白偏好整体结构为β-转折的多肽配基，尤其是4-苯基-L-苯丙氨酸和L-脯氨酸配对组成β-转折起始模块。含有所述起始模块的4-10个短肽可有效地结合于多巴胺转运蛋白并抑制其活性。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，“L-Fbz”指4-苄基-L-苯丙氨酸。

如本文所用，“L-Bip”指4-苯基-L-苯丙氨酸。

如本文所用，“Tbz”指O-苄基-L-苏氨酸。

多巴胺转运蛋白抑制剂

如本文所用，“本发明多肽”、“本发明拟肽”、“本发明的多巴胺转运蛋白抑制剂”可互换使用，指氨基酸序列式I所示结构的抑制剂或SEQ ID NO：10所示序列。此外，还包括具有结合或抑制多巴胺转运蛋白功能的、SEQ ID NO：10序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。

该术语还包括式I化合物的活性衍生物。在本发明中，这些活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。

表a

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

另外，本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。卤化物的盐同样适用。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

在另一优选例中，本发明抑制剂具有兼具芳香化与β-转折起始功能的结构模块：Bip-X-X-Pro。

在另一优选例中，本发明抑制剂能够竞争可卡因在多巴胺转运蛋白上的结合位点。

在另一优选例中，本发明抑制剂能够跨越血脑屏障，且在脑内缓慢分布。

在另一优选例中，本发明抑制剂能够阻断的可卡因成瘾。

制备方法

本发明的抑制剂可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25％六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4％对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10％)的氟化氢(HF)，在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80％乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛Sephadex G10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。所用氨基酸单体或修饰氨基酸单体均经过结构确证。无论是用哪种方法合成得到的拟肽，其纯度与结构都经过反相高效液相和质谱分析确证(Stewart et al.，Solid Phase PeptideSynthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.co.，Rockford，IL，1984)。

活性测试

本发明的多巴胺转运蛋白测活系统的构建，首先涉及到多巴胺转运蛋白在细胞膜上稳定表达的问题。多巴胺转运蛋白的核苷酸全长序列可以用PCR扩增法或人工合成的方法获得。多巴胺转运蛋白核苷酸序列可插入到重组表达载体如pCDNA3中。宿主细胞是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，代表性例子有中华仓鼠卵巢瘤(CHO)细胞。重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，如电击。电击后的细胞可以用常规方法培养，如使用含G418的1640培养液筛选转化子。待细胞长满孔底后，其中一块板用于同位素流量测定，用PBS洗涤一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ul HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，pH8.0)，25℃-37℃温育10分钟，每孔加入10ul HBS反应液(含10uCi/ml³H-DA，1mM维生素C，1mM pargyline)。25℃-37℃温育20分钟，用冰浴的PBS溶液洗涤三遍，用100ul 2M NaOH或1％SDS溶液裂解30分钟，吸取各孔的裂解液加入到1.6ml的闪烁液(PPO 3.6g，POPOP 0.36g，二甲苯600ml，Triton X-100 300ml)中，放入液闪计数仪中检测同位素的含量，以此来衡量多巴胺转运蛋白的活性。最后选取转运活力最高的细胞克隆保种用于测定拟肽对多巴胺转运蛋白的抑制活性，拟肽溶解在90ul HBS中，25℃-37℃温育10分钟，然后加入10ulHBS反应液，其它同上。同时以不表达多巴胺转运蛋白的CHO细胞测定同位素的非特异性吸附，非特异性吸附值为多巴胺转运蛋白摄入值的2％以下。

药物组合物

另一方面，本发明还提供了一种组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

本发明的含本发明多肽的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经口服、皮下、皮内、静脉注射等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

在本发明的一个优选例中，[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-苏氨酸]-[L-脯氨酸]-[O-苄基-L-苏氨酸]-[L-甘氨酸](肽5)，依赖于4-苯基-L-苯丙氨酸和L-脯氨酸形成β-转折结构，特异性抑制多巴胺转运蛋白，IC₅₀值为330nM。该拟肽为可逆竞争性抑制剂，可以竞争可卡因在多巴胺转运蛋白上的结合位点，皮下给药后能缓慢分布到大脑且持续时间超过3小时，能够显著性拮抗小鼠的可卡因觅药行为。该拟肽是一种全新结构的特异性多巴胺转运蛋白抑制剂，具有良好的体内活性，是多巴胺转运蛋白相关疾病的合适药物前体。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明多巴胺转运蛋白拟肽抑制剂的结构简单；

(b)在体外、体内实验中可有效而特异地抑制多巴胺转运蛋白。

(c)本发明抑制剂是竞争性可逆抑制剂，且和可卡因竞争结合位点。

(d)给药后可进入大脑，且脑内药时曲线平缓。

(e)给药后不能使小鼠成瘾，但可拮抗可卡因成瘾。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

通用方法

(a)条件性地点偏好实验

条件性地点偏好实验被广泛应用于在实验动物模型上评价药物成瘾性。实验方法如下：

体重在20-25g的雄性Balb/c小鼠，自由饮食，饲养温度为20±2℃，早7:00至晚7:00光照，其余时间黑暗。测定装置由两个相同的塑料盒子组成，每个盒子的长、宽、高分别为25cm，15cm和12.5cm。一个盒子的底板黄色光滑，另一个盒子的底板铺有灰色柔软草纸。两个盒子由一个长、宽、高分别为13cm，4cm和1.5cm的平台连接，平台上方有可移动塑料板将两者分隔开来。在条件性刺激前、后时期，平台上方没有阻隔，让动物在两个盒子自由活动，同时观测在各盒子的活动时间。而在条件性刺激中，动物被限制在一个盒子里活动。在条件性刺激前，动物在20分钟的自由活动中，在铺有草纸的盒子里活动时间超过10分钟。在条件性刺激时期，可卡因、肽5或肽6分别和生理盐水配对，一组动物随即给药或生理盐水。给生理盐水动物在铺有草纸的盒子活动30分钟，而相应给药的动物在黄色光滑底板盒子活动30分钟。刺激后动物被放回饲养笼中，8小时后，每组动物给过生理盐水的给药，反之亦然。给生理盐水动物在铺有草纸的盒子活动30分钟，给药物动物在黄色光滑底板盒子活动30分钟。这组条件性刺激每天依次，重复4天。第5天进行条件性刺激后测试，所有动物都给生理盐水，放置于白色平台上，记录20分钟内在两个盒子各自的活动时间。计算在条件性刺激前后，动物在黄色光滑底板盒子中活动时间的差异，差值越大，成瘾性越强(Vorel，S.R.et al.Dopamine D3 receptor antagonism inhibits cocaine-seeking andcocaine-enhanced brain reward in rats.J.Neurosci.22，9595-9603，2002)。

(b)活性测试

用常规的PCR扩增法获得多巴胺转运蛋白的核苷酸全长序列，将多巴胺转运蛋白核苷酸序列可插入到重组表达载体pCDNA3中。宿主细胞是中华仓鼠卵巢瘤(CHO)细胞。重组DNA转化宿主细胞可用电击法进行。电击后的细胞使用含G418的1640培养液筛选转化子。待细胞长满孔底后，其中一块板用于同位素流量测定，用PBS洗涤一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ul HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，pH8.0)，25℃-37℃温育10分钟，每孔加入10ul HBS反应液(含10uCi/ml³H-DA，1mM维生素C，1mM pargyline)。25℃-37℃温育20分钟，用冰浴的PBS溶液洗涤三遍，用100ul 2M NaOH或1％SDS溶液裂解30分钟，吸取各孔的裂解液加入到1.6ml的闪烁液(PPO 3.6g，POPOP 0.36g，二甲苯600ml，Triton X-100300ml)中，放入液闪计数仪中检测同位素的含量，以此来衡量多巴胺转运蛋白的活性。最后选取转运活力最高的细胞克隆保种用于测定拟肽对多巴胺转运蛋白的抑制活性。

各拟肽溶解在90ul HBS中，25℃-37℃温育10分钟，然后加入10ul HBS反应液，其它同上。同时以不表达多巴胺转运蛋白的CHO细胞测定同位素的非特异性吸附，非特异性吸附值为多巴胺转运蛋白摄入值的2％以下。

实施例1β-转折肽的设计

设计表1所示的多种短肽(肽1-9分别具有SEQ ID NO：1-9所示序列)，用常规方法合成。然后用远紫外圆二色谱来测定拟肽的二级结构。方法如下：

拟肽溶解于含10％三氟乙醇的20mmol磷酸钾、40mmol氯化钠、pH 7溶液中，肽浓度为0.4mg/ml。圆二色谱仪的型号是Jasco J-715，测试在20℃下进行，使用标准参数：波长为190-250nm；灵敏度为20mdeg；数据采集间距为0.1nm；扫描速度为10nm/s；累积值为1；响应时间为0.25秒；带宽为1nm；光程为0.1cm。拟肽中β-转折含量与218nm处的椭圆率正相关。

结果如图1所示：

肽1在月205nm处有一波谷，表示存在极少量的类I型β-转折结构；

肽2和肽3在218nm处有强的倒峰，说明这两种拟肽存在很强的类I’型β-转折结构；

肽4由于L-脯氨酸被置换成L-丙氨酸而称为无规卷曲结构。

若肽3中的4-苯基-L-苯丙氨酸被置换成1-萘L-丙氨酸、或2-萘L-丙氨酸、或4-苯甲酰基L-苯丙氨酸时，不能形成β-转折结构。

这些实验数据说明4-苯基-L-苯丙氨酸和L-脯氨酸联合使用可起始多肽β-转折结构的形成。

实施例2拟肽的结构功能关系

表1中，肽1-4清楚地显示β-转折与拟肽的活性直接相关。肽5是以肽3为基础设计的，有着相似的二级结构，但活性提高了50倍以上。这和局部结构的改进而增加了拟肽和多巴胺转运蛋白的结合力有关，如去掉了碱性的L-赖氨酸残基，C端L-苏氨酸羟基的苄基化修饰，这些改变增强了分子的疏水性。肽5中C端L-甘氨酸不是活性结构必需的，而是为便于固相合成而设计的。肽7-9说明肽5中的O-苄基L-苏氨酸可以被L-苯丙氨酸替换、L-酪氨酸可以被或L-苯丙氨酸替换、L-苏氨酸可以被L-丝氨酸替换。这些替换基本上保持了活性。

表1中，肽3具有非常特异的多巴胺转运蛋白抑制活性，对同一家族的其它蛋白没有作用。肽5在提高活性的同时也保持了相当好的选择性，对其它蛋白的抑制活性比多巴胺转运蛋白低300倍以上。对于肽5结构上的改动会降低选择性。

肽6在以后的实验中作为阴性对照药。

表1拟肽的结构功能关系

[φ]218obs为拟肽在218nm处的椭圆率，与其β-转折的含量正相关；

IC50(μM)为达到最大抑制效应一半时所需的药物浓度；

Nd表示没有测定；

DAT为大鼠多巴胺转运蛋白，NET为大鼠去甲肾上腺素转运蛋白，SERT为大鼠五羟色胺转运蛋白，GAT1为γ-氨基丁酸转运蛋白，这些属于同一蛋白家族，结构同源性极高；

Phe为L-苯丙氨酸，Tyr为L-酪氨酸，Thr为L-苏氨酸，Pro为L-脯氨酸，Lys为L-赖氨酸，Fbz为4-苄基-L-苯丙氨酸，Bip为4-苯基-L-苯丙氨酸，Ala为L-丙氨酸，Tbz为O-苄基-L-苏氨酸，Ser为L-丝氨酸。

实施例3拟肽对多巴胺转运蛋白的抑制动力学

拟肽的动力学分析是在稳定表达大鼠多巴胺转运蛋白的CHO细胞上进行。1μM肽5可以抑制80％的多巴胺转运蛋白活性，且经过两次洗涤后，这种抑制作用可以彻底被逆转。故肽5是一种可逆性的完全抑制剂。

还用饱和分析实验来确定肽5作用于多巴胺转运蛋白的特性(图2)。没有抑制剂时，多巴胺转运蛋白对多巴胺转运的Km值为1.38±0.27μM，最大转运速度Vmax为1.27±0.13pmol/min.106cells；在有250nM肽5时，Km值为2.41±0.35μM，Vmax为1.29±0.11pmol/min.106cells；在有600nM肽5时，Km值为3.59±0.20μM，Vmax为1.25±0.08pmol/min.106cells。可以看到肽5只改变Km值而不改变Vmax，是竞争性抑制剂。故肽5是竞争性可逆抑制剂。

还用以上检测系统分析了肽5和可卡因的类似物Win35，428的相互作用，发现肽5可以抑制可卡因类似物在多巴胺转运蛋白上的结合，IC50值为494nM(图3)。这些结果说明肽5直接结合多巴胺转运蛋白，并且和多巴胺、可卡因竞争结合位点。

实施例4拟肽的脑内分布

为了考察高压液相方法的灵敏度是否能够达到分析体内肽5的要求，首先验证了在常规条件下，280nm检测可以定量检测1μg肽5。然后，从脑组织中检测肽5的回收率为90％。Balb/c小鼠近尾端皮下注射肽5溶液(10mg/Kg)后0，0.25，1，2，3，4小时，取脑组织在0.5ml 50％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)中匀浆后离心取上清，上清冻干后，在用0.1ml 50％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)抽提，离心后上清可用于高压液相测量。每个时间点为5只小鼠，从图4中可以看出：在皮下给药后1小时，小鼠脑内肽5浓度达到峰值，4小时后降低到基线值。同时检测血药浓度，可以估算出约28％的肽5进入大脑。

实施例5拟肽对可卡因成瘾的阻断作用

本实施例用小鼠条件性地点偏好模型同时评价肽5和可卡因的成瘾性。如图5A所示，10mg/Kg可卡因可以诱导出明显的地点偏好，而20mg/Kg肽5不能诱导出地点偏好。这说明在该模型上肽5无成瘾性能。在对小鼠做可卡因条件性刺激前2小时，皮下注射肽5(10mg/Kg)。照样测定条件性刺激后小鼠的地点偏好性。

结果显示可卡因诱导的地点偏好明显减弱(图5B)，这说明肽5可以阻断可卡因对小鼠地点偏好的诱导作用。在另一组实验中，小鼠经过可卡因诱导，其地点偏好在200秒以上，连续两天皮下注射肽5，10mg/Kg，每天一次。再次测定地点偏好性，发现肽5可以明显阻断可卡因诱导的地点偏好性的表达(图5C)。

实施例6

注射剂的制备

利用常规技术，混合以下组分，制得注射剂，其配方如下：

多巴胺转运蛋白抑制肽    100mg

1.2-丙二醇              2.5ml

注射用水                加至100ml

讨论

拟肽(peptidomimetics)一般是指，以生物大分子的天然多肽配基、相互作用蛋白质表面活性位点、或是从多肽库筛选所得相互作用氨基酸序列为骨架，通过高级构象的约束和局部结构的修饰，所得到的高活性、高选择性、具有细胞内或体内活性小分子多肽类似物。拟肽可为基础研究提供有力工具，也可直接发展成药物、或作为前体发展成小分子化学药物。在拟肽设计中，环化和芳香化修饰经常联合使用，前者是广泛使用的多肽高级结构限制的方法，后者可增强分子间作用的疏水相互作用力以增强拟肽和大分子的结合(Kieber-Emmons，T.，Murali，R.&Greene，M.I.Therapeutic peptides and peptidomimetics.Curr.Opin.Biotechnol.8，435-441(1997))。

50％以上药物的作用靶点为膜蛋白，包括：受体、离子通道和转运蛋白。这类蛋白一般缺乏晶体结构解析，且存在多种亚型。基于配基的分子设计是获得受体特异性激动剂、抑制剂的主流方法。转运蛋白的底物通常为结构简单的小分子化合物，且底物和转运蛋白相互作用的特异性和强度比较低。本发明人从头设计了多巴胺转运蛋白的拟肽配基，成功地解决了没有多肽配基作为药物设计模板的问题，这种方法也可应用于其它的转运蛋白激动剂或抑制剂的设计。本发明中发现的兼具芳香化与β-转折(β-turn)起始功能的结构模块Bip-X-X-Pro，可能也可用于其它的拟肽设计。

另外，本发明还证明了经过合适修饰的拟肽可以跨越血脑屏障作用于中枢神经系统，在条件性地点偏好实验中，拟肽可以拮抗可卡因。其原因可能是：已有实验表明可卡因成瘾的关键原因是其迅速强烈的脑内作用，而起效慢作用持久的药物通常不成瘾；拟肽具有后者特征而不成瘾，且可以竞争可卡因作用位点，部分取代可卡因的功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海南方模式生物科技发展有限公司

上海生物泰生命科学研究有限公司

<120>多巴胺转运蛋白拟肽抑制剂及其应用

<130>052697

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人工合成的短肽

<400>1

Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

1               5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa＝Fbz

<400>2

Phe Xaa Tyr Thr Pro Lys Thr

1               5

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Bip

<400>3

Xaa Tyr Thr Pro Lys Thr

1               5

<210>4

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Bip

<400>4

Xaa Tyr Thr Ala Lys Thr

1               5

<210>5

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Bip

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa＝Tbz

<400>5

Xaa Tyr Thr Pro Xaa Gly

1               5

<210>6

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Bip

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa＝Tbz

<400>6

Xaa Tyr Thr Ala Xaa Gly

1               5

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Bip

<400>7

Xaa Tyr Thr Pro Phe

1               5

<210>8

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Bip

<400>8

Xaa Phe Thr Pro Phe

1               5

<210>9

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝Bip

<400>9

Xaa Tyr Ser Pro Phe

1               5

<210>10

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝L-Phe、L-Fbz、或L-Bip

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>Xaa1＝Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、或Val

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>Xaa＝Ala、Gly、Ser、或Thr

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Xaa＝无，或选自下组的氨基酸：Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、T

yr、Val；或是由上述2-5个氨基酸构成肽段；

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa是无，或选自下组的氨基酸：Ala、Gly

<400>10

Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa

1               5

Claims (11)

1.一种下式I表示的抑制剂，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[L-脯氨酸]-[Xaa3]-[Xaa4]    (I)

式中，

Xaa0是L-Fbz、或L-Bip；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Phe、Tyr；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Ser、Thr；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Tbz、Phe；或是Lys-Thr肽段；

Xaa4是无，或氨基酸Gly；

并且所述的抑制剂结合于多巴胺转运蛋白。

2.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂具有β-转折，并且在218nm处的椭圆率大于20。

3.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，Xaa0选自L-Bip；和/或Xaa1选自Tyr、Trp；和/或Xaa2选自Thr。

4.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，Xaa3选自Tbz、Phe；和/或Xaa4选自Gly。

5.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，Xaa0选自L-Bip、Xaa1选自Tyr、Phe；Xaa2选自Thr；Xaa3选自Phe、Tbz；且Xaa4选自无、或Gly。

6.如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，该抑制剂选自下组：

氨基酸序列如SEQ ID NO：3、5、7、8、或9所示的多肽。

7.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的抑制剂。

8.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(a)安全有效量的权利要求1所述抑制剂或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

9.权利要求1所述的抑制剂或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备治疗多巴胺转运蛋白相关疾病的药物。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的多巴胺转运蛋白相关疾病选自下组：帕金森病、可卡因成瘾、抑郁症、小儿多动症和肥胖症。

11.一种抑制剂，其特征在于，该抑制剂是氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽。

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