JP6529606B2 - 自己免疫障害及び炎症障害を治療及び／又は予防するための短い合成ペプチド - Google Patents

Description

本出願は、2015年4月27日に出願された米国仮特許出願第62/152980号の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。

本開示は、短い合成ペプチドの発見、及び自己免疫疾患及び炎症障害等の炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状の治療及び/又は予防における該合成ペプチドの使用に関する。

異常な炎症は、広範なヒト疾患の主要な原因である。異常な炎症により直接引き起こされる一般的な医学的問題の非限定的な例は、アレルギー、アレルギー性結膜炎(AC)、喘息、乾癬、関節リウマチ(RA)、全身性硬化症(SSc)等を含む。そのような炎症性疾患の治療に利用可能な薬剤があるが、効力の欠如及び副作用により、治療に不十分である。

乾癬

乾癬は、皮膚炎症、ケラチノサイトの過剰増殖及び落屑形成を特徴とする慢性皮膚障害であり、米国の総人口の約3％に影響を及ぼしている。乾癬患者の約40％は中等度から重度の疾患を有し、10-30％は、骨及び関節周囲の結合組織を損傷する関節炎-乾癬性関節炎を発症する。現在、乾癬を治療可能な方法がある。このような方法は、局所治療、光線療法、及び全身適用(例えば、メトトレキセート、シクロスポリン又はレチノイド)を含む。しかし、これらの方法は、疾患を抑制及び緩和しかできないと考えられ、治癒効果を有しない。さらに、多くの治療方法は、美容的に望ましくないか、長期間の使用に適していないか、又は末端器官損傷をもたらす恐れがある大な毒性（例えば、腎毒性、高血圧、骨髄毒性及び肝毒性)を有する。

アレルギー性結膜炎(AC)

ACは、1つ以上のアレルゲンによる過敏症に起因する結膜の炎症であり、急性、間欠性、又は慢性であり得る。また、結膜のIgE媒介性炎症である。ヒスタミンがこの疾患の主要なメディエーターであるため、抗ヒスタミン剤を投与することによりヒスタミンによるアレルギー反応を拮抗することができる。しかし、局所的な抗ヒスタミン剤又は局所的なコルチコステロイドの使用は、症状を一時的に減軽しかできない。アレルギー性結膜炎の症状を緩和可能な改善された薬剤が依然として必要とする。

アレルギー性喘息

アレルギー性喘息は、気道の慢性炎症性疾患であり、肺好酸球増加症、粘液分泌過多、アレルゲン特異的IgEの血清レベルの上昇、及び気道過敏性（AHR）を特徴とする。現在の標準治療（SoC）は、喘息コントロールを達成及び維持することを目的とし、吸入コルチコステロイド(ICS)及び長時間作用性β2刺激薬(LABA)の単独使用又は併用を含む。しかし、患者の50％以上は、SoCで喘息のコントロールを達成できずにいるため、メディカルニーズが明らかに満たされていない。さらに、コルチコステロイド耐性は重度の喘息患者にとって大きな問題である。

関節リウマチ(RA)

RAは、滑膜炎症及び関節破壊を特徴とする全身性自己免疫疾患である。メトトレキセート、シクロスポリンなどの伝統的な全身療法は、RAの治療に利用可能である。さらに、ヤヌスキナーゼ(JAK)を標的とする小分子阻害剤であるトファシチニブは、樹状細胞Th1、Th17及び活性化B細胞からの多発性炎症性サイトカインの産生を抑制するのに寄与する。トファシチニブに関する最も一般的な有害事象は、感染、血液障害、肝臓障害、腎臓障害及び発癌性である。従って、RAの治療に有効性がより高く、副作用がより少ない新薬を必要とする。

全身性硬化症(SSc)

SScは、皮膚及び内臓器官の線維化を特徴とする自己免疫疾患であり、アメリカでは、希少疾患である。SScの罹患率は大人100万人あたり240症例で、年間発生率は成人100万人あたり20症例である。今まで、SScの病因が知られていない。全身性硬化症の特徴は、炎症、自己免疫、びまん性脈管障害をもたらす内皮細胞機能障害、及び進行性線維症である。進行性線維症を逆転又は中止できる療法が開発されていないため、SScは予後不良である。

従って、炎症に関連する疾患、障害、及び/又は病状を治療及び/又は予防するための医薬品及び/又は方法を改善する必要がある。

一般に、本開示は、炎症に関連する疾患、障害又は病状を治療する新規化合物及び/又は方法の開発に関する。

従って、本開示の第1の態様は、炎症に関連する疾患、障害又は病状を治療できる短い合成ペプチドを提供することを目的とする。該短い合成ペプチドは、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇(配列番号:1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、
X₁は、アラニン(A)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、又はバリン(V)であり、
X₂は、アラニン(A)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はバリン(V)であり、
X₃はフェニルアラニン(F)、チロシン(Y)又はトリプトファン(W)であり、
X₄はアルギニン(R)又はリジン(K)であり、
X₅はバリン(V)、メチオニン(M)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はグルタミン(Q)であり、
X₆はアルギニン(R)、グルタミン(Q)、リジン(K)又はプロリン(P)であり、
X₇はセリン(S)又はトレオニン(T)であり、
X₂、X₃、X₄、X₆及びX₇は互いに独立してL型アミノ酸残基である。

いくつかの好ましい実施形態によれば、X₁及びX₅の少なくとも1つはD型アミノ酸残基であり、上記合成ペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列(以下7-mer)を有する。一例では、X₁はD-アスパラギン酸(以下7-mer DD)等のD型である。別の例では、X₅はD-バリン(以下7-mer DV)等のD型である。

他の好ましい実施形態によれば、上記合成ペプチドは、配列番号:3、4、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21のいずれかであるアミノ酸配列を有する。一例では、上記合成ペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列(以下7-mer Da)を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列(以下7-mer La)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:10のアミノ酸配列(以下7-mer MK)を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:11のアミノ酸配列(以下7-mer KP)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:12のアミノ酸配列(以下7-mer WI)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:13のアミノ酸配列(以下7-mer IP)を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:14のアミノ酸配列(以下7-mer NV)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:15(以下7-mer QK)のアミノ酸配列を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:16のアミノ酸配列(以下7-mer VFT)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:17のアミノ酸配列(以下7-mer(V→L))を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:18のアミノ酸配列(以下7-mer(R2→Q))を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:19のアミノ酸配列(以下7-mer(D→V))を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:20のアミノ酸配列(以下7-mer(D→F))を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:21のアミノ酸配列(以下7-mer(D→L))を有する。

本開示の第2の態様は、炎症に関連する疾患、障害、又は病状を治療するのに適した医薬品及び/又は組成物を提供することを目的とする。該医薬品又は組成物は、有効量の上記合成ペプチド、及び薬学的に許容される担体を含む。

いくつかの好ましい実施形態によれば、X₁及びX₅の少なくとも1つはD型アミノ酸残基であり、上記合成ペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列を有する。一例では、X₁はD-アスパラギン酸(以下7-mer DD)等のD型である。別の例では、X₅はD-バリン(以下7-mer DV)等のD型である。

好ましい実施形態によれば、上記合成ペプチドは、配列番号:3、4、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21のいずれかであるアミノ酸配列を有する。一例では、上記合成ペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列(以下7-mer Da)を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列(以下7-mer La)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:10のアミノ酸配列(以下7-mer MK)を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:11のアミノ酸配列(以下7-mer KP)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:12のアミノ酸配列(以下7-mer WI)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:13のアミノ酸配列(以下7-mer IP)を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:14のアミノ酸配列(以下7-mer NV)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:15のアミノ酸配列(以下7-mer QK)を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:16のアミノ酸配列(以下7-mer VFT)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:17のアミノ酸配列(以下7-mer(V→L))を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:18のアミノ酸配列(以下7-mer(R2→Q))を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:19のアミノ酸配列(以下7-mer(D→V))を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:20のアミノ酸配列(以下7-mer(D→F))を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:21のアミノ酸配列(以下7-mer(D→L))を有する。

本発明の医薬品又は組成物によって治療可能な炎症に関連する疾患、障害又は病状は、自己免疫疾患、酒土性座瘡、消化性潰瘍、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性結膜炎、急性肺損傷、肺炎、気道過敏性、血管炎、敗血症性ショック、アトピー性皮膚炎及び湿疹からなる群から選択される。

いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬品又は組成物は、自己免疫疾患の治療に適している。該自己免疫疾患は、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植拒絶反応、移植片移植拒絶に関連する免疫障害、良性リンパ球性血管炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、原発性粘液浮腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性真性糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、交感神経性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、ウェゲナーサルコイドーシス、抗リン脂質症候群、炎症性ミオパシー、多発動脈炎、リウマチ性疾患、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、膠原病、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節周囲炎肉芽腫、結節性汎動脈炎、進行性全身性強皮症、関節炎ウリカ、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、筋萎縮、軟骨石症、甲状腺炎、アレルギー性浮腫、肉芽腫、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)のいずれかである。

いくつかの例では、上記自己免疫疾患は乾癬である。

他の例では、上記自己免疫疾患は関節リウマチである。

いくつかの実施形態によれば、上記炎症に関連する疾患、障害又は病状は喘息である。

他の実施形態によれば、上記炎症に関連する疾患、障害又は病状はアレルギー性結膜炎である。

本開示の医薬品又は組成物は、血管内送達(例えば、注射又は輸液)、経口、経腸、経直腸、経肺(例えば、吸入)、経鼻、局所(経皮、頬及び舌下を含む)、膀胱内、硝子体内、腹腔内、膣、脳内送達(例えば、脳室内及び脳内)、CNS送達(例えば、髄腔内、傍脊椎及び脊椎内)、非経口(例えば、皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内)、経粘膜投与若しくはインプラントを介した投与、又は当技術分野で公知の他の送達経路により被験体に投与され得る。

本開示の第3の態様は、炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状に罹患している被験体を治療する方法に関する。該方法は、炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状を改善又は緩和するための本開示の上記医薬品又は組成物を被験体に投与するステップを含む。

好ましい実施形態によれば、本発明の方法によって治療可能な炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状は、自己免疫疾患、酒土性座瘡、消化性潰瘍、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性結膜炎(AC)、急性肺損傷、肺炎、気道過敏性、血管炎、敗血症性ショック、アトピー性皮膚炎及び湿疹からなる群から選択される。

好ましい例によれば、本発明の方法によって治療可能な自己免疫疾患は、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植拒絶反応、移植片移植拒絶に関連する免疫障害、良性リンパ球性血管炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、原発性粘液浮腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性真性糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、交感神経性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、ウェゲナーサルコイドーシス、抗リン脂質症候群、炎症性ミオパシー、多発動脈炎、リウマチ性疾患、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、膠原病、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節周囲炎肉芽腫、結節性汎動脈炎、進行性全身性強皮症、関節炎ウリカ、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、筋萎縮、軟骨石症、甲状腺炎、アレルギー性浮腫、肉芽腫、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択される。

いくつかの例では、上記自己免疫疾患は乾癬である。

他の例では、上記自己免疫疾患は関節リウマチである。

いくつかの実施形態によれば、上記炎症に関連する疾患、障害又は病状は喘息である。

他の実施形態によれば、上記炎症に関連する疾患、障害又は病状はアレルギー性結膜炎である。

任意の実施形態によれば、上記方法は、被験体に有効量の抗炎症剤を投与するステップをさらに含む。好ましくは、上記抗炎症剤は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)である。

すべての実施形態において、上記被験体はヒトである。

以下、本発明の1つ以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

特許又は出願書類には、少なくとも1つのカラー図面が含まれる。この特許又は特許出願の刊行物のカラー図面の写しは、請求及び必要な手数料の支払いがあった場合に庁によって提供される。本説明は、添付の図面に照らして以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろう。

図１は、本開示の一実施形態に係る、IMQ誘発性乾癬様皮膚炎症に対する7-merの影響を示す写真であり、各写真は、高倍率ライトフィールドカメラで撮影された背中の皮膚の写真である。 図2は、本開示の一実施形態に係る、誘発性乾癬様表皮過形成に対する7-merの影響を示す。同図において、(A)は、BrdU標識測定により測定したケラチノサイト増殖に対する7-merの影響を示す写真であり、(B)は、IMQで処理した各マウスの4つの代表的なハイパワーフィールド（HPF）でのBrdU陽性細胞±S.Dの平均値を示す棒グラフである。 図3は、本開示の一実施形態に係る、HOCl誘発性皮膚線維症に対する7-merの影響を示す。同図において、(A)は、マッソントリクロームで染色した組織切片の写真（倍率：200x）であり、該染色がHOCl注射の6週間後のコラーゲン線維を強調表示することができ；(B)は、それぞれビヒクル、HOCl及びHOCl/7-merで処理した皮膚の総コラーゲン含量を示す棒グラフである（*P<0.05 vs. HOCl/ビヒクル処理）。 図4は、本開示の一実施形態に係る、LPS誘発性関節炎に対する本発明の合成ペプチドの影響を示す写真である。 図5は、本開示の一実施形態に係る、OVA誘発性アレルギー性結膜炎(AC)に対する7-merペプチドの影響を示す写真である。同図において、(A)は、実験用ACモデルを構築するためのプロトコルであり；（B）は組織学的染色写真であり；(C)は、7-merで処理したACマウス、又は未処理ACマウスの好酸球数を示す棒グラフである（*P<0.05 vs.OVAチャレンジ）。 図6は、本開示の一実施形態に係る、アレルギー性喘息の発症に対する7-merペプチドの影響を示す。同図において、(A)は、実験用アレルギー性喘息モデルを構築するためのプロトコルである；（B）は、それぞれヘマトキシリン、エオシン（H＆E）及びPASによって染色された組織学的染色写真である。

添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、この実施例の機能と、この実施例を構成し動作させるための一連のステップを示す。しかし、同じ又は同等の機能及び順序は、異なる実施例によって達成されてもよい。

1.定義

便宜上、本開示の文脈で使用される特定の用語がここに集められる。別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

ここで使用される用語「ペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味する。ここで使用される「合成ペプチド」は、天然に存在するタンパク質分子全体を含まないペプチドを意味する。このペプチドは、化学合成、組換え遺伝子技術、又は抗原全体の断片化などの技術を用いたヒトの介入によって産生され得る点で「合成品」である。本開示の全体を通して、ペプチド内の任意の特定のアミノ酸残基の位置は、ペプチドのN末端から番号が付けられる。アミノ酸がD型アミノ酸又はL型アミノ酸のいずれかとして指定されていない場合、アミノ酸は特定の異性体が必要でない限り、L型アミノ酸又はD型アミノ酸のいずれかであり得る。用語「D型アミノ酸」及び「L型アミノ酸」は、平面偏光の特定の回転方向ではなく、アミノ酸の絶対配置を指すために使用される。本明細書における使用は、関連技術の当業者による標準的な使用と一致する。本明細書において、アミノ酸は、例えば、産業財産関係情報及び文献についての手引書における標準ST.25に示されているような標準の1文字又は3文字のコードを用いて示される。

本明細書で論じるように、タンパク質/ペプチドのアミノ酸配列のわずかな変異は、いずれも本発明で開示され、請求されている概念に含まれる。変異されたアミノ酸配列は、少なくとも、例えば、70％、71％、72％、73％、75％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％及び99％の類似性を維持する。本発明の合成ペプチドについて、特異的に修飾することにより、その生理的活性に影響を及ぼすことなく、ペプチドの特徴を変更し得る。例えば、この研究におけるペプチドの生理的活性（即ち、炎症関連の疾患及び/又は病状を治療する能力）に影響を及ぼすことなく、特定のアミノ酸を変更及び/又は欠失させることができる。特に、保存的アミノ酸置換が考えられる。保存的置換は、側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で発生する置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に、(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸;(2)塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;及び(4)非荷電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンに分けられる。より好ましい分類は以下の通りである。即ち、セリン及びトレオニンは脂肪族ヒドロキシ基アミノ酸であり、アスパラギン及びグルタミンはアミド含有アミノ酸であり、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは脂肪族アミノ酸であり、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは芳香族アミノ酸である。例えば、イソロイシン若しくはバリンでのロイシンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、セリンでのトレオニンの置換、又は構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の同様の置換は、特に置換がフレームワーク部位のアミノ酸に及ばない場合、得られた分子の結合又は特性に大きな影響を与えないことを期待することは合理的である。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすかどうかは、ペプチド誘導体の比活性を分析することにより容易に確定することができる。タンパク質/ペプチドのフラグメント又は類似体は、当業者にとって容易に調製され得るものである。フラグメント又は類似体の好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近で生じる。一例では、本発明の合成ペプチドの1つのアミノ酸残基(例えば、バリン)は、(例えば、ロイシンに)保存的に置換される。他の例では、本発明の合成ペプチドの2つのアミノ酸残基は、他の適切なアミノ酸残基に保存的に置換され、例えば、バリン(V)及びアルギニン(R)は、アミノ酸対（メチオニン(M)及びリジン(K)、リジン(K)及びプロリン(P)、トリプトファン(W)及びイソロイシン(I)、イソロイシン(I)及びプロリン(P)、アスパラギン(N)及びバリン(V)、並びにグルタミン(G)及びリジン(K)を含むが、これらに限定されない）に置換される。

本明細書で用いられる用語「治療」は、所望の薬理学的及び/又は生理的効果を意味することを意図する。効果は、疾患又はその症状の発生を完全に又は部分的に予防又は阻害する観点から防止的であってもよく、及び/又は、疾患及び/又は疾患に起因する副作用を部分的に又は完全に治癒する観点から治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」は、哺乳動物(特にヒト)の疾患の予防(例えば、防止)、治癒又は一時的に軽くする治療を含み、そして、(1)疾患の傾向にあるが、まだ診断されていない個人で生じる疾患又は病状の予防（例えば、防止）、治癒又は一時的に軽くする治療、(2)(例えば、疾患の発症を抑制することによって)疾患を阻害すること、又は(3)疾患を緩和する(例えば、疾患と関連した症状を低減する)こと、を含む。

用語「投与される」、「投与する」又は「投与」は、本願明細書において互いに置換可能に用いており、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、腹膜内、動脈内、頭蓋内又は皮下に本発明の薬剤(例えば、化合物又は組成物)を投与することを含む送達モードを指す。

本明細書で用いられる「有効量」という用語は、疾患の治療に関する所望の結果を成し遂げるために必要な期間及び用量での有効量を指す。例えば、アレルギー疾患の治療において、炎症又はアレルギー疾患の任意の症状を低減、阻害、予防、遅延又は抑制する薬剤(即ち、化合物、合成ペプチド又は治療ペプチドをエンコードしている核酸)は、有効である。薬剤の有効量は、疾患又は状態の治癒に必須ではなく、疾患又は状態の発病が遅延、妨害又は予防されるように、又は、疾患又は状態の症状を改善するように疾患又は状態を治療するだろう。有効量は、指定期間全体にわたって1、2又は3回以上で投与される適切な形態で1、2又は3以上の用量に分けてもよい。

用語「被験体」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の合成ペプチド及び/又は方法によって治療可能な人類を含む哺乳動物を意味する。用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、家畜、及び、農場動物、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ又は牛;動物園、スポーツ又はペット動物;及びマウス及びラットのようなげっ歯類を含む哺乳綱のすべてのメンバーを指す。さらに、用語「被験体」又は「患者」は、1つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。従って、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、患者はヒトである。

本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤」は、皮膚又は眼投与のために薬学的に許容される適切なビヒクル、薬剤又は化合物を意味する。

本明細書で使用される用語「炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状」は、疾患進行又は症状発現に対する免疫応答を含む病理学的疾患、障害及び/又は病状を意味する。

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。

文脈で別途明記示されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。

2.好ましい実施形態の詳細な説明

本開示は、炎症に関する疾患又は病状を発症しないように、被験体を治療及び/又は予防することができる短い合成ペプチドの発見に少なくとも部分的に基づいている。従って、本発明は、炎症に関する疾患又は病状を治療及び/又は予防するための新たに同定された合成ペプチドを含む方法及び組成物を提供する。

2.1 本発明の合成ペプチド

本開示の短い合成ペプチドは、X₁X₂X₃X₄X₅X₆ X₇(配列番号:1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、
X₁は、アラニン(A)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、又はバリン(V)であり、
X₂は、アラニン(A)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はバリン(V)であり、
X₃は、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)又はトリプトファン(W)であり、
X₄は、アルギニン(R)又はリジン(K)であり、
X₅は、バリン(V)、メチオニン(M)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はグルタミン(Q)であり、
X₆は、アルギニン(R)、グルタミン(Q)、リジン(K)又はプロリン(P)であり、
X₇は、セリン(S)又はトレオニン(T)であり、
X₂、X₃、X_4、X₆及びX₇は、互いに独立してL型アミノ酸残基である。

いくつかの実施形態によれば、X₁及びX₅の少なくとも1つはD型アミノ酸残基であり、上記合成ペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を有する。一例では、X₁はD-アスパラギン酸(以下7-mer DD)等のD型であり、別の例では、X₅はD-バリン(以下7-mer DV)等のD型である。

他の好ましい実施形態によれば、上記合成ペプチドは、配列番号:3又は4のアミノ酸配列を有する。一例では、上記合成ペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列(以下7-mer Da)を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列(以下7-mer La)を有する。

他の好ましい実施形態によれば、上記合成ペプチドは、配列番号:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21のいずれかであるアミノ酸配列を有する。一例では、上記合成ペプチドは、配列番号:10のアミノ酸配列(以下7-mer MK)を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:11のアミノ酸配列(以下7-mer KP)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:12のアミノ酸配列(以下7-mer WI)を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:13のアミノ酸配列(以下7-mer IP)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:14のアミノ酸配列(以下7-mer NV)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:15のアミノ酸配列(以下7-mer QK)を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:16のアミノ酸配列(以下7-mer VFT)を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:17のアミノ酸配列(以下7-mer(V→L))を有する。さらに別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:18のアミノ酸配列(以下7-mer(R2→Q))を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:19のアミノ酸配列(以下7-mer(D→V))を有する。別の例では、上記合成ペプチドは、配列番号:20のアミノ酸配列(以下7-mer(D→F))を有する。さらなる例では、上記合成ペプチドは、配列番号:21のアミノ酸配列(以下7-mer(D→L))を有する。

いくつかの実施形態によれば、配列番号:2のC末端に位置するセリン(S)残基を欠失させて得られた、対照ペプチド(DLYRVR、配列番号:22)と命名されるペプチドは、本研究においていかなる生物学的機能も持たない。従って、配列番号:2のC末端に位置するセリン(S)残基は、炎症に関連する疾患及び/又は病状を治療及び/又は予防するための本発明の合成ペプチドの生物活性に必要である。このアミノ酸残基は、欠失されることができず、保存的アミノ酸残基に置換されることだけができる。

本開示のいくつかの実施形態によれば、配列番号:2に少なくとも1つのD型アミノ酸残基が含まれる。このD型アミノ酸残基は、本出願の実施例1の表1に記載されるような7-merのD型類似体(即ち、7-mer DD及び7-mer DV)を生じる。これらのD型類似体において、7-mer(配列番号:2)のチロシン(Y)、アルギニン(R)及びセリン(S)がL型ではないと、得られたペプチド(即ち、7-mer DL、7-mer DY、7-mer DR、7-mer DR2、及び7-mer DS;実施例1の表1を参照)は、自己免疫疾患、及び/又は炎症性障害に関連する疾患及び/又は病状に対する生物活性が失われることが発見された。

本開示の他の実施形態によれば、7-merの各アミノ酸残基は、それぞれアラニン(A)に置換されることにより、本出願の実施例1の表1に記載されるような7-mer類似体(即ち、7-mer Da及び7-mer La)を生じる。これらの類似体において、7-mer(配列番号:2)のアスパラギン酸(D)及びロイシン(L)は、炎症及び/又は線維症に関連する疾患及び/又は病状に対する生物活性が失われることなく、アラニン(A)に置換され得る一方、7-merの他のアミノ酸残基(即ち、7-merの3位〜7位にあるアミノ酸残基)のいずれかが置換されると、7-merの生物活性が失われることが発見された。

本開示のさらなる実施形態によれば、7-merのアミノ酸残基の少なくとも2つは、それぞれ他のアミノ酸残基に置換されることにより、本出願の実施例1の表1に記載されるような7-mer類似体(即ち、7-mer MK、7-mer KP、7-mer WI、7-mer IP、7-mer NV、7-mer QK、7-mer VFT、7-mer(V→L)、7-mer(R2→Q)、7-mer(D→V)、7-mer(D→F)及び7-mer(D→L))を生じる。部位特異的置換により生成される7-mer類似体のそれぞれは、7-merペプチドの一定の生物活性を有する。そのうち、7-mer VFT、7-mer(V→L)、7-mer(D→V)、7-mer(D→F)及び7-mer(D→L)のそれぞれは、7-mer(配列番号:2)に類似した比較的同じ生物活性を示すことが発見された。

本発明の合成ペプチドは、当該技術分野における任意の標準ペプチド合成プロトコルに従って合成することができる。一実施形態において、本発明の合成ペプチドは、製造者のプロトコルに従って固相ペプチド合成機(ABI433A ペプチドsynthesizer, Applied Biosystems Inc., Life Technologies Corp., Foster City, CA, USA)を用いて合成された。

或いは、本発明の合成ペプチドは、組換え技術を用いて調製することができる。例えば、発現ベクターにおいて、本発明のペプチドをコードする核酸をクローニングすることができ、ここで、核酸が宿主細胞で本発明のペプチドを発現させるのに適した調節配列に作動可能に結合される。次いで、上記ベクターを適切な宿主細胞に導入して、ペプチドを発現させることができる。発現された組換えポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿法及び分取カラムクロマトグラフィー等の方法により宿主細胞から精製することができる。このようにして調製されたペプチドは、以下の実施例に記載の方法に従ってその活性を試験することができる。

前記核酸又はポリヌクレオチドは、当該分野で公知のポリマー、生分解性微粒子若しくはマイクロカプセル送達装置の使用によって送達され得る。宿主中での核酸の取り込みを達成するための別の方法は、標準的な方法によって調製されたリポソームを使用することである。ポリヌクレオチドは、単独で、又は組織特異的抗体と一緒にこれらの送達ビヒクルに導入することができる。或いは、静電気力若しくは共有結合力によってポリ-L-リジンに結合したプラスミド又は他のベクターから構成される分子複合体を調製することができる。或いは、組織特異的標的化は、当技術分野で公知の組織特異的転写調節エレメントの使用によって達成することができる。筋肉内、皮内、又は皮下部位への「裸のDNA」（即ち、送達ビヒクルなし）の送達は、インビボ発現を達成するための別の手段である。

本発明の合成ペプチドは、そのN末端又はC末端が修飾されてもよい。N末端修飾の例として、N-グリコシル化、N-アルキル化及びN-アセチル化アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。末端修飾はペグ化を含むことができる。C末端修飾の例は、C末端アミド化アミノ酸である。或いは、1つ以上のペプチド結合は非ペプチジル結合で置換されてもよく、個々のアミノ酸部分は選択された側鎖又は末端残基と反応可能な薬剤で処理することにより修飾されてもよい。

様々な官能基を化学修飾が実施されやすい合成ペプチドの様々な部位に導入してもよい。官能基をペプチドの末端に導入してもよい。いくつかの実施形態において、官能基は、ペプチドの1つ以上の特性に関する活性を改善する。例えば、合成ペプチドの安定性、有効性、又は選択性の改善;合成ペプチドの細胞膜及び/又は組織バリアへの透過性の改善;組織の局在化の改善;毒性又はクリアランスの低減;及び細胞ポンプによる排除に対する耐性の改善等がある。適切な官能基の非限定的な例は、該官能基に結合したペプチドを細胞に輸送することを促進するものである。例えば、ペプチドの親水性を減少させ、親油性を増加させることによって、これらの官能基は、任意に好ましくは、インビボで切断される。例えば、細胞内で加水分解又は酵素的に切断され得る。ヒドロキシ保護基には、エステル、カーボネート及びカルバメート保護基が含まれる。アミン保護基には、アルコキシ及びアリールオキシカルボニル基が含まれる。カルボン酸保護基には、脂肪族、ベンジル及びアリールエステルが含まれる。任意のいくつかの実施形態において、本発明の合成ペプチドのアスパラギン酸(D)の側鎖にあるカルボン酸基は、メチル、エチル、ベンジル又は置換ベンジルエステルによって保護されることが好ましい。

保存的及び非保存的置換の両方により、「ペプチド模倣有機部分」で本発明の合成ペプチドのアミノ酸残基を任意に置換することができる。該ペプチド模倣有機部分は、任意に好ましくは、立体的、置換されたアミノ酸に類似した電子的又は立体配置特性を有し、このようなペプチド模倣体は、必須位置のアミノ酸を置換するために使用され、保存的置換と考えられる。ペプチド模倣体は、任意に、酵素によるペプチドの分解、又は他の分解プロセスを阻害するために使用され得る。ペプチド模倣体は、任意に好ましくは、有機合成技術によって製造することができる。適切なペプチド模倣物の非限定的な例には、アミド結合の同配体、3-アミノ-2-プロペニドン-6-カルボン酸、ヒドロキシル-1、2、3、4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボキシレート、1、2、3、4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボキシレート、及びヒスチジンイソキノロンカルボン酸が含まれる。

合成ペプチドの任意の部分は、官能基の導入などによって任意に化学的に修飾することができる。この修飾は、本発明のペプチドの合成中に任意に実施することができる。修飾の非限定的な例示的なタイプには、カルボキシメチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化又は脂肪酸アシル化が含まれる。エーテル結合は、セリン又はトレオニンヒドロキシルを糖のヒドロキシル基に結合させるために任意に使用することができる。アミド結合は、グルタメート又はアスパラギン酸カルボキシ基を糖のアミノ基に結合させるために任意に使用することができる。アセタール及びケタール結合は、アミノ酸と炭素水和物との間に任意に形成することもできる。

2.2炎症に関連する疾患及び/又は病状を治療及び/又は予防するための組成物

本発明の合成ペプチドは、炎症に関連する疾患及び/又は病状に罹患している被験体の治療、又は被験体の炎症に関連する疾患及び/又は病状の発症を防止するのに適している。

従って、本開示のさらなる態様は、炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状を治療するための、本発明の合成ペプチドを含む医薬品を提供する。上記炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状には、自己免疫疾患、酒土性座瘡、消化性潰瘍、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性結膜炎、急性肺損傷、肺炎、気道過敏性、血管炎、敗血症性ショック、アトピー性皮膚炎及び湿疹が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明の合成ペプチドを含む医薬品は、自己免疫疾患を治療するためのものである。本発明の合成ペプチドを含む医薬品によって治療可能な自己免疫疾患の非限定的な例は、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植拒絶反応、移植片移植拒絶に関連する免疫障害、良性リンパ球性血管炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、原発性粘液浮腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性真性糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、交感神経性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、ウェゲナーサルコイドーシス、抗リン脂質症候群、炎症性ミオパシー、多発動脈炎、リウマチ性疾患、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、膠原病、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節周囲炎肉芽腫、結節性汎動脈炎、進行性全身性強皮症、関節炎ウリカ、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、筋萎縮、軟骨石症、甲状腺炎、アレルギー性浮腫、肉芽腫、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む。

一例では、上記自己免疫疾患は乾癬である。別の例では、上記自己免疫疾患は関節リウマチである。

別の実施形態において、本発明の合成ペプチドを含む医薬品によって治療可能な、炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状は、アレルギー疾患である。本発明の合成ペプチドを含む医薬品によって治療可能なアレルギー疾患の非限定的な例は、喘息、アレルギー、及びアレルギー性結膜炎である。

一例では、上記アレルギー疾患は喘息である。別の例では、上記アレルギー疾患は、アレルギー性結膜炎である。

上記医薬品は、適切な量の本発明の合成ペプチドを、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と共に組成物に混合することによって製造される。特定の実施形態では、合成ペプチドは、上記のペプチドから選択され、7-mer、7-mer DD、7-mer DV、7-mer Da、7-mer La、7-mer MK、7-mer KP、7-mer WI、7-mer IP、7-mer NV、7-mer V→L、7-mer QK、7-mer LQ、7-mer VFT、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

上記医薬品又は組成物中に存在するペプチドの量は、使用されるペプチドに依存する。ペプチドは、典型的には組成物中に約0.001重量％〜約10重量％で存在する。例えば、0.001重量％、0.005重量％、0.01重量％、0.02重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.07重量％、0.08重量％、0.09重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％、1.3重量％、1.4重量％、1.5重量％、1.6重量％、1.7重量％、1.8重量％、1.9重量％、2.0重量％、2.1重量％、2.2.重量％、2.3重量％、2.4重量％、2.5重量％、2.6重量％、2.7重量％、2.8重量％、2.9重量％、3.9重量％、3.1重量％、3.2重量％、3.3重量％、3.4重量％、3.5重量％、3.6重量％、3.7重量％、3.8重量％、3.9重量％、4.0重量％、4.1重量％、4.2重量％、4.3重量％、4.4重量％、4.5重量％、4.6重量％、4.7重量％、4.8重量％、4.9重量％、5.0重量％、5.1重量％、5.2重量％、5.3重量％、5.4重量％、5.5重量％、5.6重量％、5.7重量％、5.8重量％、5.9重量％、6.0重量％、6.1重量％、6.2重量％、6.3重量％、6.4重量％、6.5重量％、6.6重量％、6.7重量％、6.8重量％、6.9重量％、7.0重量％、7.1重量％、7.2重量％、7.3重量％、7.4重量％、7.5重量％、7.6重量％、7.7重量％、7.8重量％、7.9重量％、8.0重量％、8.1重量％、8.2重量％、8.3重量％、8.4重量％、8.5重量％、8.6重量％、8.7重量％、8.8重量％、8.9重量％、9.0重量％、9.1重量％、9.2重量％、9.3重量％、9.4重量％、9.5重量％、9.6重量％、9.7重量％、9.8重量％、9.9重量％、及び10.0％である。特に約0.01％〜約5重量％で存在する。例えば重量％、0.01重量％、0.02重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.07重量％、0.08重量％、0.09重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％、1.3重量％、1.4重量％、1.5重量％、1.6重量％、1.7重量％、1.8重量％、1.9重量％、2.0重量％、2.1重量％、2.2.重量％、2.3重量％、2.4重量％、2.5重量％、2.6重量％、2.7重量％、2.8重量％、2.9重量％、3.9重量％、3.1重量％、3.2重量％、3.3重量％、3.4重量％、3.5重量％、3.6重量％、3.7重量％、3.8重量％、3.9重量％、4.0重量％、4.1重量％、4.2重量％、4.3重量％、4.4重量％、4.5重量％、4.6重量％、4.7重量％、4.8重量％、4.9重量％、及び5.0重量％である。

合成ペプチドと併用する薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤は、関連技術分野において周知であり、非毒性不活性固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化剤又は製剤補助剤を含むが、これらに限られない。典型的な薬学的に許容される担体は、水又は生理食塩水である。薬学的に許容される担体の例には、糖類（例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロース）、デンプン（例えば、コーンスターチ）、セルロース及びその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース）、トラガカント粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、賦形剤（例えば、ココアバター及び座剤用ワックス）、油類（例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油）、グリコール類（例えば、プロピレングリコール）、エステル類（例えば、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル）、寒天、緩衝剤（例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム）、アルギン酸、及び他の薬剤、例えば無毒の潤滑剤(例えば、ラウリル硫酸塩及びステアリン酸マグネシウム)、着色剤、離型剤、香味剤、防腐剤及び酸化防止剤を含むが、これらに限られない。

本発明の医薬品又は組成物の適切な投与経路は、血管内送達(例えば、注射又は輸液)、経口、経腸、経直腸、経肺(例えば、吸入)、経鼻、局所(経皮、頬及び舌下を含む)、膀胱内、硝子体内、腹腔内、膣、脳内送達(例えば、脳室内及び脳内)、CNS送達(例えば、髄腔内、傍脊椎及び脊椎内)、非経口(例えば、皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内)、経粘膜投与若しくはインプラントを介した投与、又は当技術分野で公知の他の送達経路である。

経口投与に適した医薬組成物は、別個の投与単位、例えば、丸薬、錠剤、トローチ剤、硬質若しくは軟質カプセル;分散性粉末若しくは顆粒;溶液若しくは懸濁液、例えば、水性若しくは油性懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル;又は経腸製剤に製剤化することができる。上記組成物は、密封バイアル若しくはアンプルのような単回投与又は複数回投与の容器で提供することができ、使用前に滅菌液体担体（例えば、水又は生理食塩水）の添加を必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。

非経口投与に適した医薬組成物は、本合成ペプチドを、水、リンゲル液、生理食塩水、1,3-ブタンジオール、アルコールなどの滅菌溶媒と混合又は分散させることによって、水性又は非水性滅菌注射剤に調製され得る。或いは、固定油、脂肪酸又は合成モノ若しくはジグリセリドを溶媒として使用することができる。上記組成物は、フィルターでろ過することにより滅菌されることができる。

局所又は経皮投与のために、医薬組成物は、一般に、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、パッチ又はスプレーに調製される。眼科用製剤、点耳剤及び点眼剤も、本発明の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、眼に局所的に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約1μg/kg〜約50mg/kg（例えば、0.1〜20mg/kg）の本発明の合成ペプチドを患者に投与する。典型的な1日又は1週間の投与量は、約1μg/ kg〜約20mg / kg、又はそれ以上であり得る。局所投与の上記目的のいずれかに利用される用量(mg/kg)は、一般に、体重1kgあたり約0.01〜100 mgであり、1日に1回〜数回、例えば4回、6回、8回又はそれ以上投与される。

肺投与に適した医薬組成物は、定量噴霧式エアゾール、噴霧器又は吸入器によって生成できる粉塵又はミストに調製され得る。

本発明によって提供される医薬組成物は、キットの形態であることが好ましい。本発明において、「キット」は、本発明により提供される合成ペプチド及び/又はパッケージングされた組成物を形成する追加の治療化合物を含有することで、その輸送、保存、及び、同時又は連続投与が可能である製品として理解される。したがって、本発明のキットは、本発明の合成ペプチドをそれぞれ含む1つ以上の密封アンプルを含むことができ、それにより単回投与又は複数回投与で調製され得る。このキットは、必要に応じて、合成ペプチドを可溶化するのに適したビヒクル、例えば、水性媒体（例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム）、水溶性媒体（例えば、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピルエチレングリコール）、及び水不溶性ビヒクルをさらに含み得る。キットに存在し得る別の成分は、本発明の組成物を所定限界内に維持することを可能にするパッケージである。そのようなパッケージを製造するのに適した材料には、ガラス、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、サッシェなどが含まれる。

本発明のキットは、キットに存在する異なる製剤の同時、連続的な又は別々の投与のための説明書をさらに含むことができる。したがって、本発明のキットは、異なる成分の同時、連続的又は別々の投与のための説明書をさらに含むことができる。上記説明書は、被印刷物の形態であってもよく、又は被験者が読むことができるように該説明書を格納可能な電子的支持体の形態、例えば、電子記憶媒体(磁気ディスク、テープ等)、光学媒体（CD-ROM, DVD)等であってもよい。該媒体は、上記説明書を提供するインターネットウェブページを追加的又は代替的に含むことができる。

2.3 炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状を治療及び/又は予防する方法

上記のように、本発明に記載の知見は、炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状の予防及び/又は治療に有用である。

従って、本発明は、炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状を治療及び/又は予防する方法に関する。該方法は、そのような治療及び/又は予防を必要とする被験体に上記医薬品又は組成物を投与するステップを含む。上記医薬品又は組成物は、X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇(配列番号:1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成される合成ペプチド及び薬学的に許容される担体を含み、
X₁は、アラニン(A)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、又はバリン(V)であり、
X₂は、アラニン(A)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はバリン(V)であり、
X₃は、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)又はトリプトファン(W)であり、
X₄は、アルギニン(R)又はリジン(K)であり、
X₅は、バリン(V)、メチオニン(M)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はグルタミン(Q)であり、
X₆は、アルギニン(R)、グルタミン(Q)、リジン(K)又はプロリン(P)であり、
X₇は、セリン(S)又はトレオニン(T)であり、
X₂、X₃、X_4、X₆及びX₇は互いに独立して、L型アミノ酸残基である。医薬品及び/又は組成物は、被験体に投与されると、炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状に関する症状を改善又は緩和することができる。

特定の実施形態において、上記合成ペプチドは、上記ペプチドから選択され、7-mer、7-mer DD、7-mer DV、7-mer Da、7-mer La、7-mer MK、7-mer KP、7-mer WI、7-mer IP、7-mer NV、7-mer QK、7-mer VFT、7-mer(V→L)、7-mer(R2→Q)、7-mer(D→V)、7-mer(D→F)、7-mer(D→L)、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。

上記炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状は、自己免疫疾患、酒土性座瘡、消化性潰瘍、胃炎、痛風、痛風性関節炎、関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、潰瘍、慢性気管支炎、喘息、アレルギー、アレルギー性結膜炎、急性肺損傷、肺炎、気道過敏性、血管炎、敗血症性ショック、アトピー性皮膚炎及び湿疹を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明の方法によって治療可能な炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状は、自己免疫疾患である。本発明の方法によって治療可能な自己免疫疾患の非限定的な例は、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植拒絶反応、移植片移植拒絶に関連する免疫障害、良性リンパ球性血管炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、原発性粘液浮腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性真性糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、交感神経性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、ウェゲナーサルコイドーシス、抗リン脂質症候群、炎症性ミオパシー、多発動脈炎、リウマチ性疾患、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、膠原病、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節周囲炎肉芽腫、結節性汎動脈炎、進行性全身性強皮症、関節炎ウリカ、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、筋萎縮、軟骨石症、甲状腺炎、アレルギー性浮腫、肉芽腫、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。

一例では、上記自己免疫疾患は乾癬である。別の例では、上記自己免疫疾患は関節リウマチである。

他の実施形態において、本発明の方法によって治療可能な炎症に関連する疾患、障害及び/又は病状は、アレルギー疾患である。本発明の方法によって治療可能なアレルギー疾患の非限定的な例は、喘息、アレルギー、及びアレルギー性結膜炎である。

一例では、上記アレルギー疾患は喘息である。別の例では、上記アレルギー疾患はアレルギー性結膜炎である。

必要に応じて、該方法は、被験体に炎症生に関連する疾患、障害及び/又は病状を治療する有効量の抗炎症剤を投与することをさらに含み得る。

本開示の実施形態によれば、上記抗炎症剤は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、免疫抑制剤、又は腫瘍壊死因子(TNF)であり得る。

上記コルチコステロイドの非限定的な例は、プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、及びメチルプレドニゾロンを含むが、これらに限定されない。

上記NSAIDは、ナプロキセン、イブプロフェン、ケトロラク、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロフェン、ジクロフェナク、トルメチン、トルフェナミン酸、メフェナム酸、スリンダク、インドメタシン、サリチル酸、アセチルサリチル酸、ジフルニサル、ロキソプロフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、クリダナク、フェンクラク、メクロフェナメート、ベノキサプロフェン、カルプロフェン、イソフェザラク、アセクロフェナク、フェンブフェン、エトドラク酸、フレクロジン酸、アンフェナク、メフェナム酸、ブロムフェナク、ジクロフェナク、アセクロフェナク、オルパノキシン、ゾメピラク、フルフェナミン酸、ニフルム酸、プラノプロフェン、ザルトプロフェン、及びスプロフェンからなる群から選択され得る。好ましいNSAIDは、ジクロフェナク、ナプロキセン又はイブプロフェンであり、いずれも最も強力で、且つNSAIDの処方薬である。

上記免疫抑制剤は、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤(例えば、アルキル化剤又は代謝拮抗物質)、抗体、イムノフィリン(例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス)に作用する薬物、インターフェロン、TNF結合タンパク質、ミコフェノール酸モフェチル等であり得る。アルキル化剤の非限定的な例は、シクロホスファミド、ニトロソウレア、及び白金化合物を含むが、これらに限定されない。代謝拮抗物質の非限定的な例は、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、及びフルオロウラシルを含むが、これらに限定されない。

全ての実施形態において、治療に適した被験体はヒトである。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例

材料及び方法

材料

ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ウシ胎仔血清(FBS)、0.25％トリプシン、抗生物質-抗真菌溶液は、Invitrogen(Carlsbad、CA)から購入した。3-(4、5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)は、Merck(カタログ番号1.11714.0001)から入手した。メチルスルホキシド(DMSO)、次亜塩素酸、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)、ヘキスト33258染料、NaClO溶液及び過ヨウ素酸シッフ(PAS)試薬は、すべてSigma-Aldrich(St. Louis、MO)から入手した。抗BrdUは、GeneTex(Taipei、Taiwan)から入手した。IMQクリーム(ALDARA CREAM 5％)は、DKSH(Taipei、Taiwan) から購入した。

全てのペプチドは、GenScript(Piscataway, NJ, USA)により合成されたものである。各ペプチドについて、NH₂末端でのアセチル化及びCOOH末端でのアミド化によって修飾されることで、その安定性を改善し、続いて質量分析法（>95％純度）を採用して特徴付けた。

細胞培養及び処理

ネズミマクロファージ細胞株RAW264.7(ATCC、Rockville、MD)を、10％FBS及び抗生物質-抗真菌溶液を添加したDMEMで、37℃及び5％CO₂で培養した。

実験動物

すべての動物は、Mackay Memorial Hospital Review Board(Taiwan, R.O.C. )に承認された手順に従って、動物施設で飼育されていた。すべての動物実験手順は、眼科及び視覚研究における動物の使用に関するARVO宣言に従って行われた。

MTT分析

RAW264.7細胞を48ウェル培養プレート(2×10⁴細胞/ウェル)に接種して24時間培養した後、刺激前に、無血清DMEMでさらに24時間培養した。処理は、細胞を、25μMペプチドを含有する0.5mLの新鮮な無血清DMEM培地に24時間曝露した。細胞生存率を測定するために、50μlのMTTストック溶液(5mgのMTTが1mlの無菌PBSに溶解された)を各ウェルに添加した。さらに、50μLのMTTストック溶液を陰性対照として500μlの培地に添加した。このプレートを37℃で4時間インキュベートした。各サンプルからアリコート(450μl)を採取し、新しい48ウェル培養プレートのウェルに入れた後、100μLのDMSOを添加し、ピペットを用いて完全に混合し、37℃で20分間反応させ、570nmで吸光度を読み取った。

乾癬様皮膚炎症のマウスモデル

すべての実験手順は、Mackay Memorial Hospital Animal Care・and Uses Committeeにより承認され、全国動物福祉規則に従って行われた。乾癬様皮膚炎症は、van der Fitsらによって開示された手順(J Immunol.(2009)、182、5836-5845)に従って、マウス皮膚をイミキモド(IMQ)で処理することにより作製された。従って、各BALB/cマウス(8週齢)は、剃毛した背中及び右の耳に62.5mgの市販のIMQクリーム(5％)を6日間連続して毎日局所投与した。対照マウス(正常群)は、対照クリームを投与した。処理において、濃度100μMとなるように、7-mer類似体をIMQクリームと混合した。

5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)標識測定によりケラチノサイト増殖を測定した。BrdU(Sigma-Aldrich)をDMSOに加えてストック溶液（80mM）を調製した。10μlのBrdUを90μlのPBSと混合したものを各マウスに腹腔内注射し、24時間後、マウスを安楽死させた。背中の皮膚を4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンで包埋して免疫組織化学を行った。

関節リウマチのラットモデル

個の研究において、Pan RYらに開示された手順(J Virol.(1999)73、3410-3417)に従って、ラット関節にリポ多糖(LPS)を直接注射することにより急性関節炎を誘導した。簡単に言えば、成体(約10週齢)雄性Sprague-Dawleyラット(初期体重＝312±11g)をキシラジン（10mg/kg）の腹腔内注射により麻酔した後、実験群にランダムに割り当てた。その後、ラットの右膝に、LPS(2μg及び10μg)又はLPS+7-merを含む25μlの5％ヒアルロン酸（HA）を単回関節内注射した。7-mer(10 mMストック)を最終濃度1mMとなるように25μlの5％HAに溶解した。2日目に、LPS+7-mer群又はLPS+ 7-mer類似体群に7-merを単回関節内注射した。3日目に、膝関節を切開し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液に固定し、次いでShandon TBD-2脱灰液(Thermo Scientific、Logan、UT)で脱灰した。次いで、関節を矢状に切開し、パラフィンブロックに包埋した。切片（厚さ5μm）を縦方向に切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（H＆E）で染色した。

アレルギー性結膜炎のマウスモデル

それぞれ0日目及び7日目に、1μgの卵白アルブミン(OVA)及び200μlの1.5％水酸化アルミニウム(ALUM)を腹腔内注射することにより、BALB/cマウス(4〜5週齢、雌性)を感作させた。それぞれ15日目及び18日目に250μgのOVAで結膜嚢を局所的に2回チャレンジした。対照マウスには感作段階でOVA及びALUMを、チャレンジ段階でOVAの代わりにPBSを与えた。処理において、7-merを濃度100μMとなるように1％CMC点眼剤と混合した。OVAチャレンジ(15日目)後、マウスを2つの実験群(n=6/群)にランダムに割り当て、眼を20μlの7-mer又はビヒクル点眼剤で1日2回、4日間（18日目まで）処理した。OVAでの最終チャレンジの24時間後（19日目）、マウスを安楽死させ、それらの眼を採取し、4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。好酸球浸潤を評価するために、瞼を含む切片（5μm）を脱パラフィンし、その後、酸ジェミッサで染色して好酸球を検出した。

アレルギー性喘息のマウスモデル

それぞれ0日目及び7日目に、1μgの卵白アルブミン(OVA)及び200μlの1.5％水酸化アルミニウムを腹腔内注射することにより、BALB/cマウス(4〜5週齢、雌性)を感作させた。その後、21日目、22日目及び23日目に、250μgのOVAの鼻腔内注射により3回チャレンジした。対照マウスには、感作段階でOVA 及びALUMを、チャレンジ段階でOVAの代わりにPBSを与えた。処理において、7-mer類似体を濃度100μMとなるように1％CMC点眼剤と混合した。20日目及びOVAチャレンジ後(21日目)に、マウスを2つの実験群(n=6/群)にランダムに割り当て、鼻に20μlの7-mer又はビヒクル滴を1日2回、4日間（23日目まで）注射した。OVAでの最終チャレンジの24時間後（24日目）、マウスを安楽死させ、それらの眼を採取し、4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。

全身性硬化症(SSc) のマウスモデル

BALB/cマウスにプロオキシダーゼ剤(例えば、次亜塩素酸、HOCl)を6週間毎日皮下注射することにより、SScのマウスモデルを成功に構築した(Servettaz A et al.、J Immuno. 2009；182: 5855)。

166μlのNaClO溶液(2.6％が活性塩素とされる)を11.1mlのKH₂PO₄溶液(100mM；pH 7.2)に添加し、HOClを調製した。HOClの濃度は、分光光度法により292nm（モル吸光係数：350M^-1cm^-1)で測定した。雌BALB/cマウス(6週齢)を実験群及び対照群(n＝6/群)にランダムに割り当てた。HOCl溶液と7-merビヒクル又は7-mer(最終濃度0.2mM)との混合液100μlを27ゲージの針を用いてマウスの剃毛した背部に6週間毎日皮下注射した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を皮下注射したマウスを正常対照として用いた。マウスを安楽死させ、それらの眼を採取し、4％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。製造業者に説明された手順に従って、マッソントリクローム染色法(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)により脱パラフィンした皮膚切片を染色した。

総コラーゲンの測定

約20％の皮膚ホモジネートを用いて可溶性コラーゲンのレベルを測定した。製造業者のプロトコールに従って、Sircol^TM可溶性コラーゲン分析(Biocolor Ltd.、Newtownabbey)によりコラーゲンレベルを定量した。簡単に言えば、100μlの回収した上清を1mlのSircol染料と30分間混合し、その後、室温で10,000rpmの速度で10分間遠心分離してコラーゲン-色素複合体を沈殿させた。上層液を除去し、沈殿物を1mLのSircolアルカリ試薬に溶解し、ボルテックスした。相対吸光度を540nmで測定した。

統計

結果は、平均±標準誤差（SEM）として表された。統計的比較に一元配置分散分析（1-way ANOVA）を使用した。P<0.05を有意とみなした。

実施例1 本発明の合成ペプチドの機能的残基の同定

この実施例において、「材料及び方法」に記載された手順に従って7-merペプチド(配列番号:2)を合成した。「アラニンスキャニング」、「D-アミノ酸置換」又は部位特異的置換により7-merの類似体を生成した。ここで、示された各残基は、アラニン、そのD型対応物、又は特定のアミノ酸残基で置換された。

全部で25種類のペプチドが合成された。具体的には、そのうち、7種類の類似体は、「アラニンスキャニング」により生成され、7-mer Da、7-mer La、7-mer Ya、7-mer Ra、7-mer Va、7-mer R2a、及び7-mer Saと名付けられ;7種類の類似体は、「D-アミノ酸置換」により生成され、7-mer DD、7-mer DL、7-mer DY、7-mer DR、7-mer DV、7-mer DR2、及び7-mer DSと名付けられ;他の12種類の類似体は、部位特異的置換により生成され、7-mer MK、7-mer KP、7-mer WI、7-mer IP、7-mer NV、7-mer QK、7-mer VFT、7-mer(V→L)、7-mer(R2→Q)、7-mer(D→V)、7-mer(D→F)、及び7-mer(D→L)と名付けられた。さらに、7-merのセリン残基を欠失させた6-mer対照ペプチドも合成さらた。この実施例の合成ペプチド(即ち、7-mer及びその類似体)の配列をそれぞれ以下の表1に示した。

表１: 本発明の合成ペプチド
任意の配列における太字は、特定のアミノ酸がD型であることを示す。

Raw284.7マクロファージの生存率に対するこれらの合成ペプチドの影響をMTT分析により測定した。結果を表2に示した。

表2に示すように、7-merは、Raw284.7細胞(55.7±4.24 vs. 100±0.60、対照未処理細胞)の生存率を低下させた。7-merの1位、2位にある残基に対するアラニン置換により得られた7-mer類似体(即ち、7-mer Da及び7-mer La)は、7-merペプチドの阻害活性を維持し得る。その一方で、7-merの3、4、5、6、及び7位にある残基に対するアラニン置換により得られた7-mer類似体が阻害活性の喪失を引き起こすことにより、特定の残基の側鎖が7-merの生物活性に対して不可欠であることを示唆している。この結果は、1位に対する置換(アラニンでアスパラギン酸を置換)及び2位に対する置換(アラニンでロイシンを置換)は、ともに、7-merペプチドの生物活性に比較的小さな影響を及ぼすことを示し、1位及び2位の活性及び主鎖の置換可能性は、7-mer修飾に部位を提供することを示唆している。

表2. Raw264.7マクロファージ細胞の生存率に対するアラニンを含む7-merペプチドの影響
本発明の合成ペプチドの濃度は20μMである。
データは、2回繰り返した2回の実験の平均±S.E.として表される。
*p<0.05 vs. 未処理細胞

天然L型アミノ酸は、ペプチダーゼにより切断されやすい代謝的に不安定なアミノ酸である。従って、天然L型アミノ酸をそれらのD型対応物で置換することにより7マー類似体を生成した。2、3、4、6及び7位にある残基に対するD型アミノ酸置換は、阻害活性の喪失を引き起こすことが分かった(表3)。7-merの1位にある残基に対するD-アミノ酸置換(D-アスパラギン酸でL-アスパラギン酸を置換)及び5位にある残基に対するD-アミノ酸置換(D-バリンでL-バリンを置換)により得られた7-mer類似体のみが、依然として7-merの阻害活性を有していた。

表3. Raw264.7マクロファージ細胞の生存率に対する7-merD型類似体の影響
本発明の合成ペプチドの濃度は20μMである。
データは、2回繰り返した2回の実験の平均±S.E.として表される。
*p<0.05 vs. 未処理細胞

7-merの主鎖の置換可能性をさらに調べるために、7-merに部位特異的アミノ酸置換を行い、その結果を表4に示す。その結果は、部位特異的置換により生成された各7-mer類似体（7-mer QK、7-mer MK、7-mer KP、7-mer WI、7-mer IP、7-mer NV、7-mer VFT、7-mer(V→L)、7-mer(R2→Q)、7-mer(D→V)、7-mer(D→F)、及び7-mer(D→L)を含む）は、7-mer生物活性を部分的にしか維持し得ないことを示した。

表4. Raw264.7マクロファージ細胞の生存率に対する7-mer類似体の影響
本発明の合成ペプチドの濃度は20μMである。
データは、2回繰り返した2回の実験の平均±S.E.として表される。
*p<0.05 vs. 未処理細胞

まとめると、この実施例の結果は、7-merの1位及び2位にあるアミノ酸残基が阻害活性に関して重要ではないこと、及び、7-merの1位及び5位にあるアミノ酸残基がL型又はD型のいずれかであり得るが、残りのアミノ酸残基(即ち、7-merの2、3、4、6及び7位にある残基)がそれらの天然型（即ち、L型）でなければならないことを示した。

実施例2 本発明の合成ペプチドがIMQ誘発性乾癬様皮膚炎症を改善する。

この実施例において、IMQ誘発性乾癬様皮膚炎症に対する実施例1の本発明の合成ペプチドの有効性を調査した。この目的のために、動物(8週齢のマウス)の剃毛した背中にIMQクリームを6日間連続して毎日局所投与することにより、乾癬様皮膚炎症及び落屑を誘導した（図1;左パネル）。IMQ及び7-merペプチド(100μM)の両方を含有する局所用クリームを適用した場合、皮膚炎症及び落屑のレベルは顕著に低下した（図1;中央パネル）。さらに、参照化合物クロベタゾール(0.02％；極めて強力な合成グルココルチコイド)による局所処理も落屑形成を改善した（図1;右パネル）。しかし、7-merの効果と異なり、クロベタゾールは試験動物の背中全体の皮膚萎縮を引き起こした。

乾癬は、異常なケラチノサイト増殖に起因する疾患である。「材料及び方法」に記載された手順に従って、ケラチノサイト増殖に対する本発明の合成ペプチドの影響を調査した。結果を図2に示した。

図２(パネルA)の写真は、IMQ処理後に大量のBrdUが組織に取り込まれたことを示す。この現象は、高レベルの細胞増殖の指標である。その一方で、7-merで局所的又は腹腔内注射により処理された皮膚は、BrdU陽性ケラチノサイトの数が顕著に減少した（図2、パネルB）。

まとめると、本研究の結果は、7-merペプチドが乾癬様皮膚炎症を改善できることを確認する。

実施例3 本発明の合成ペプチドがHOCl誘発性皮膚線維症を改善する。

全身性硬化症(SSc)は、皮膚及び内臓の線維症、微小血管損傷、自己免疫を特徴とする結合組織障害である。HOCl誘発性マウスSScは、ヒト疾患の主な特徴、特に皮膚線維芽細胞の活性化及び過剰増殖速度を模倣するネズミモデルである。この実施例において、「材料及び方法」に記載された手順に従って、HOCl誘発性マウスSScネズミモデルを用いて皮膚線維症に対する本発明の合成ペプチドの効果を調査した。結果を図3に示した。

図３(パネルA)の写真に示すように、SScマウス(即ち、HOCl/ビヒクルを注射されたマウス)は、PBS処理マウスと比較して、真皮においてコラーゲンマトリックスが異常に高密度であり、コラーゲン繊維がより緊密であった。さらに、7-merで処理したSScマウスは、未処理の正常対照マウスの皮膚コラーゲと同様のレベルであり、未処理SSCマウス(即ち、HOCl/ビヒクル処理マウス)と比較して、皮膚コラーゲのレベルが顕著に減少したことを示した。

これらの結果は、正常皮膚又はHOClに直接暴露された皮膚の1ミリグラムあたりの酸及びペプシン可溶性コラーゲン含有量の測定によって裏付けられた。SSCマウスの皮膚に高レベルのコラーゲン(コラーゲン（μg）/皮膚（mg）)があり、7-merペプチドにより処理した後、コラーゲンのレベルが顕著に低下した(図3、パネルB；HOCl処理SSCマウス：169.9±7.75、7-mer処理SScマウス：99.0±5.43)。

実施例4 本発明の合成ペプチドがリポ多糖(LPS)誘発性関節炎を予防する。

関節リウマチ(RA)は、関節軟骨の破壊、ひいては、関節機能の破壊をもたらす滑膜の炎症を特徴とする慢性炎症性疾患である。この目的のために、Sprague-Dawleyラットの膝にLPS(2又は10μg)を含む2％ヒアルロン酸(ビヒクル)25μlを注射することにより関節炎膝を作製した。また、実験群の動物にLPS及び7-mer(1mM)を注射した。注射の3日後、滑膜組織を外科的に摘出し、固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色して組織学的分析を行った。結果を図4に示す。

図４の写真に示すように、対照動物(即ち、2％HAビヒクル注射)に白血球浸潤が発生せず、炎症がないことを示した。その一方で、LPS注射の3日後に撮影した写真は、滑膜に滑膜細胞の増殖、蓄積、及び白血球浸潤が発生したことを示し、この現象が膝炎症の明確な指標である。本発明の7-merペプチドをLPSと共に投与した場合、この炎症は顕著に減軽された。

まとめると、この実施例における知見は、本発明の合成ペプチドが関節炎動物に炎症が発生することを防止できることを示唆している。

実施例5 本発明の合成ペプチドがアレルギー性結膜炎(AC)の発症を予防する。

アレルギー性結膜炎(AC)は、結膜好酸球浸潤を特徴とする。この実施例において、「材料及び方法」に記載された手順に従って、ネズミACモデルにおける卵白アルブミン(OVA)アレルゲンに対する免疫応答をモニターすることにより、本発明の合成ペプチドの抗アレルギー効果を調査した。結果を図５のパネルAに示した。

組織学的分析により、OVAによる全身プライミング及び局所ブースティングの後に、OVAチャレンジマウスの結膜に好酸球の浸潤が顕著に発生したことを明らかにした(図5、パネルB)。しかし、7-merで処理したマウスにおいて、結膜における好酸球の浸潤は、顕著に減少した(図5、パネルC)。この結果は、7-merがOVA誘発性アレルギーモデルにおける好酸球浸潤を抑制できることを示唆している。

実施例6 本発明の合成ペプチドがアレルギー性喘息の発症を予防する。

この実施例において、よく特徴付けられたアレルギー性気道疾患のネズミモデルにより、卵白アルブミンを抗原として用いてアレルギー性喘息に対する本発明の合成ペプチドの効果を調査した。「材料及び方法」に記載された手順に従って実験用ネズミ喘息モデルを構築した。結果を図６のパネルAに示した。

H＆E染色による組織病理学的研究は、OVAチャレンジマウスの気管支周囲及び血管周囲の隙間に白血球浸潤が発生したこと実証した(図6、パネルB、H&E染色)。浸潤した炎症細胞は主にマクロファージ及び好酸球であった。しかし、7-mer処理マウスは、OVAチャレンジマウスと比較して、炎症性細胞の浸潤が顕著に減少した。さらに、杯細胞の過形成による粘液の過剰産生は、気道閉塞及び気道リモデリングの特徴である。7-mer処理マウスは、OVAチャレンジマウスと比較して、粘液分泌が顕著に減少した(図6、パネルB、PAS染色)。

この結果は、7-merがOVA誘発性アレルギー性肺炎の発症を抑制できることを示唆している。

実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は1又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。

Claims (2)

1. 合成ペプチドを含む炎症に関連する疾患、障害又は病状を治療するための医薬組成物であって、
   前記合成ペプチドは、X₁X₂X₃X₄X₅X₆ X₇(配列番号:1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、
   X₁は、アラニン(A)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、又はバリン(V)であり、
   X₂は、アラニン(A)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はバリン(V)であり、
   X₃は、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、又はトリプトファン(W)であり、
   X₄は、アルギニン(R)又はリジン(K)であり、
   X₅は、バリン(V)、メチオニン(M)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、又はグルタミン(Q)であり、
   X₆は、アルギニン(R)、グルタミン(Q)、リジン(K)、又はプロリン(P)であり、
   X₇は、セリン(S)又はトレオニン(T)であり、
   X₂、X₃、X₄、X₆及びX₇は、互いに独立してL型アミノ酸残基であり、
   前記合成ペプチドは、配列番号:2,3,4,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20又は21のいずれかであるアミノ酸配列を有し、
   前記炎症に関連する疾患、障害又は病状は乾癬、関節リウマチ、喘息又はアレルギー性結膜炎である医薬組成物。
2. X₁及びX₅の1つはD型アミノ酸残基である請求項1に記載の医薬組成物。