DE69911632T2

DE69911632T2 - Contulakin-g, analoga davon und deren verwendung

Info

Publication number: DE69911632T2
Application number: DE69911632T
Authority: DE
Inventors: Grey A. CRAIG; David Griffin; M. Baldomero OLIVERA; Maren Watkins; R. David HILLYARD; Julita Imperial; J. Lourdes CRUZ; D. John WAGSTAFF; T. Richard LAYER; M. Robert JONES; Tyler R. McCABE
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Cognetix Inc; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Cognetix Inc; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1998-10-20
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: US6344551B1; EP1123109A1; US20040072758A1; EP1123109A4; US6369193B1; DE69911632D1; US6489298B1; HK1039570A1; EP1123109B1; US20050203003A1; JP2002527093A; JP2011024579A; WO2000023092A9; AU766294B2; CA2347713C; HK1039570B; US6696408B1; WO2000023092A1; CA2347713A1; ES2207970T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die provisorischen US-Patentanmeldungen Ser.-Nr. 60/105,015 vom 20. Oktober 1998, Ser.-Nr. 60/128,561 vom 9. April 1999 und Ser.-Nr. 60/130,661 vom 23. April 1999.
Diese Erfindung wurde mit Regierungsunterstützung unter der Subvention Nummer GM-48677 von den National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, ausgeführt. Die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika besitzt bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Contulakin-G (das natürliche, glykosylierte Peptid), ein entglykosyliertes Contulakin-G (unter der Bezeichnung Thr₁₀-Contulakin-G) und Derivate davon, einen cDNR-Klon, der einen Vorläufer dieses reifen Peptids codiert, und ein Vorläuferpeptid. Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung dieses Peptids als Therapeutikum für epileptische Anfälle, Entzündungen, Schockzustände, Thrombus, Hypotonie, Analgesie, Psychosen, Parkinsonsche Krankheit, gastrointenstinale Krankheiten, depressive Zustände, kognitive Dysfunktionen, Angstzustände, Spätdyskinesien, Drogenabhängigkeit, Panikattacken, Manie, Reizdarm, Diarrhöe, Ulcer, Magen-Darm-Tumore, Tcurett'sche Krankheit, Huntington'sche Cherea, Gefäßundichtheit, Arteriosklerose, Gefäßerweiterung und Vasodilatation sowie für neurologische, reuropharmakolgische und neurepsychopharmakolegische Krankheiten.
Die Publikationen und das andere hier verwendet Material zur Erhellung des Hintergunds der Erfindung und insbesondere der Fälle, welche zusätzliche Details unter Beachtung der Praxis liefern, sind im nachstehenden Text mit numerischen Referenzen versehen und im Anhang bibliografisch aufgelistet.
Mollusken der Gattung Conus erzeugen ein Venenum, das sie in die Lage versetzt, ihres spezifisch räuberischen Lebensstils zu frönen. Die Beute wird von dem Venenum immobilisiert, das mittels eines hochspezialisierten Venenumapparates, eines disponiblen Hohlzahns, der einerseits wie eine Harpune und anderseits wie eine Subkutankanüle funktioniert, injiziert wird.
Wenige Interaktionen zwischen Organismen sind ungewöhnlicher als die zwischen einem venomösen Tier und dessen invenomiertem Opfer. Das Venenum kann als primäre Waffe zum Erlegen von Beute oder als Abwehrmechanismus eingesetzt werden. Viele dieser Venena enthalten Moleküle, die auf Rezeptoren und Ionenkanäle neuromuskulärer Systeme gerichtet sind.
Mehrere von Conus-Venena isolierte Peptide sind charakterisiert worden. Dazu gehören die α-, μ- und ω-Conotoxine, welche auf Nikotinacetylcholinrezeptoren, Muskelnatriumkanäle bzw. neuronale Calciumkanäle gerichtet sind (Olivera et al., 1985). Conopressine, die Vasopressinanaloge sind, wurden ebenfalls identifiziert (Cruz et al., 1987). Außerdem wurden Peptide mit der Bezeichnung Conantokine von Conus geographus und Conus tulipa isoliert (Mena et al., 1990; Haack et al., 1990). Diese Peptide haben ungewöhnliche, altersabhängige physiologische Wirkungen: Sie induzieren bei Mäusen, die jünger als zwei Wochen sind, einen schlafähnlichen Zustand, und bei Mäusen, die älter als 3 Wochen sind, hyperaktives Verhalten (Haack et al., 1990). Isolierung, Struktur und Wirkung der κ-Conotoxine werden in US-Patent Nr. 5,633,347 beschrieben. Kürzlich wurden von Conus radiatus Peptide mit der Bezeichnung Contryphan isoliert, welche D-Tryptophanreste enthalten (U.S. Serien-Nr. 09/061,026), und Bromo-Tryptophan-Conopeptide wurden von Conus imperialis und Conus radiatus isoliert (U. S. Serien-Nr. 08/785,534).
In US-Patent Nr. 5,432,155 wird die Synthese mehrerer Conotoxine beschrieben, einschließlich der Synthese eines Peptids mit der Bezeichnung J-004 mit der Sequenz Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1), wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist, Xaa₂ Prolin ist und Thr₁₀ glykosyliert werden kann. In diesem Patent wird die Art der Glykosylierung nicht offenbart.
Wünschenswert ist die Identifizierung zusätzlicher Conopeptide mit Wirkungen wie die oben genannten Conopeptide sowie von Conotoxinpeptiden mit zusätzlichen Wirkungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Contulakin-G-glykosylierte Peptide, Derivate derselben, einen cDNA-Klon, der einen Vorläufer der Peptide codiert, und ein Vorläuferpeptid wie in den angehängten Ansprüchen definiert. Diese Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung der genannten Peptide als Therapeutikum für epileptische Anfälle, Entzündungen, Schockzustände, Thrombus, Hypotonie, Analgesie, Psychosen, Parkinsonsche Krankheit, gastrointenstinale Krankheiten, depressive Zustände, kognitive Dysfunktionen, Angstzustände, Spätdyskinesien, Drogenabhängigkeit, Panikattacken, Manie, Reizdarm, Diarrhöe, Ulcer, Magen-Darm-Tumore, Tourett'sche Krankheit, Huntington'sche Chorea, Gefäßundichtheit, Arteriosklerose, Gefäßerweiterung und Vasodilatation sowie für neurologische, neuropharmakologische und neuropsychopharmakologische Krankheiten.
Das Contulakin-G hat folgende Formel: Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1), wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist, Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist und Thr₁₀ so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan wie in den Ansprüchen definiert enthält. X₂ ist vorzugsweise Prolin. Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Glykan jedes N-, S- oder O-verknüpfte Mono-, Di-, Tri-, Poly- oder Oligosaccharid, das mit in der Fachwelt gut bekannten synthetischen oder enzymatischen Methoden an eine Hydroxy-, Amino- oder Thiolgruppe natürlicher oder modifizierter Aminosäuren angebunden werden kann. Die Monosaccharide, welche das Glykan bilden, können D-Allose, D-Altrose, D-Glukose, D-Mannose, D-Gulose, D-Idose, D-Galaktose, D-Talose, D-Galaktosamin, D-Glukosamin, D-N-Acetyl-Glukosamin (GlcNAc), D-N-Acetyl-Galaktosamin (GalNAc), D-Fukose oder oder D-Arabinose umfassen. Diese Saccharide können strukturell modifiziert sein, wie hier beschrieben, z. B. mit einer oder mehreren O-Sulfat-, O-Phosphat-, O-Acetyl- oder Säuregruppen, wie etwa Sialinsäure, einschließlich Kombinationen derselben. Das Glykan kann auch ähnliche Polyhydroxygruppen umfassen, wie D-Penizillamin 2,5 und halogenierte Derivate derselben oder Polypropylenglykol-Derivate. Die glykosidische Verbindung ist Beta und 1–4 oder 1–3, vorzugsweise 1–3. Die Verbindung zwischen dem Glykan und der Aminosäure kann Alpha oder Beta sein, vorzugsweise Alpha, und ist 1–. Bevorzugte Glykane werden weiter unten beschrieben, wobei das meistbevorzugte Glykan Gal(β1→3)GalNAc(α1→) ist.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel betrifft die vorliegende Erfindung ein generisches Contulakin-G mit folgender allgemeiner Formel:
wobei Xaa₁ Pyro-Glu, Glu, Gln oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₂ Ser, Thr oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₃ Glu oder γ- Carboxy-Glu ist; Xaa₄ Asn, N-Glykan-modifiziertes Asn oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa5 Ala oder Gly ist; Xaa₆ Thr, Ser, S-Glykan-modifiziertes Cys, Tyr oder eine unnatürliche hydroxyhaltige Aminosäure ist (wie 4-Hydroxymethyl-Phe, 4-Hydroxyphenyl-Gly, 2,6-Dimethyl-Tyr, 3-Nitro-Tyr und 5-Amino-Tyr); Xaa₇ Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin oder eine unnatürliche basische Aminosäure ist (wie N-1-(2-Pyrazolinyl)-Arg); Xaa₈ Ala, Gly, Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin, eine unnatürliche basische Aminosäure (wie N-1-(2-Pyrazolinyl)-Arg) oder x-Lys ist , wobei X (CH₂)_n, Phenyl , -(CH₂)_m-(CH=CH)-(CH₂)_mH oder -(CH₂)_m-(C≡C)-(CH₂)_mH ist, wobei n 1–4 und m 0–2 ist; Xaa₉ Pro oder Hydroxy-Pro ist; und Xaa₁₀ Tyr, Mono-Iodo-Tyr, Di-Iodo-Tyr, O-Sulpho-Tyr, O-Phospho-Tyr, Nitro-Tyr, Trp, D-Trp, Bromo-Trp, Bromo-D-Trp, Chloro-Trp, Chloro-D-Trp, Phe, L-neo-Trp oder eine unnatürliche aromatische Aminosäure ist (wie Nitro-Phe, 4-substituiertes-Phe, wobei der Substituent C₁-C₃-Alkyl, Carboxyl, Hyrdroxymethyl, Sulphomethyl, Halo, Phenyl, - CHO, -CN, -SO₃H und -NHAc, 2,6-Dimethyl-Tyr und 5-Amino-Tyr ist). Der C-Terminus enthält eine freie Carboxyl-Grpuppe, ist amidiert, ist acyliert, enthält ein Glykan oder enthält ein Aldehyd. Es ist bevorzugt, dass der C-Terminus ein freies Carboxyl enthält. Dieses Peptid kann des weiteren ein oder mehrere Glykane wie oben beschrieben enthalten. Die Glykane können an den Resten 2, 7, 8, 10 und 16 erscheinen. Die oben genannten und andere unnatürliche basische Aminosäuren, unnatürlichen hydroxyhaltigen Aminosäuren oder unnatürlichen aromatischen Aminosäuren sind im Building Block Index, Version 2.2 beschrieben, von und erhältlich bei RSP Amino Acid Analogues, Inc., Worcester, MA.
In einem dritten Ausführungsbeispiel betrifft die vorliegende Erfindung Analoge von Contulakin-G oder dem generischen Contulakin-G. Diese Analoge enthalten N-terminale Verkürzungen von Contulakin-G oder des generischen Contulakin-G bis einschließlich Thr₁₀. Wenn die N-terminale Verkürzung bis einschließlich Thr₁₀ reicht, wird Lys₁₁ unter Verwendung eines carboxylierten modifizierten Linkers N-glykosyliert. Dieses N-glykosylierte Lys₁₁ kann wie in 1 gezeigt dargestellt werden (Toth et al., 1999), wobei R₂, R₃ und R₄ so wie hier beschrieben sind. In diesen Verkürzungen ist bevorzugt, dass der der Verkürzung proximale Rest mit einem glykosylierten Serin substituiert ist. Zusätzliche Analoge umfassen Peptide, in denen Ser-O-Glykan, Thr-O-Glykan oder Cys-S-Glykan für einen Rest an Position 1–9 substituiert ist.
In einem vierten Ausführungsbeispiel betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendungen der hier beschriebenen Peptide als Therapeutikum für epileptische Anfälle, Entzündungen, Schockzustände, Thrombus, Hypotonie, Analgesie, Psychosen, Parkinsonsche Krankheit, gastrointenstinale Krankheiten, depressive Zustände, kognitive Dysfunktionen, Angstzustände, Spätdyskinesien, Drogenabhängigkeit, Panikattacken, Manie, Reizdarm, Diarrhöe, Ulcer, Magen-Darm-Tumore, Tourett'sche Krankheit, Huntington'sche Chorea, Gefäßundichtheit, Arteriosklerose, Gefäßerweiterung und Vasodilatation sowie für neurologische, neuropharmakologische und neuropsychopharmakologische Krankheiten. In einem Aspekt dieses Ausführungsbeispiels wird in einem Säugetier unter Verwendung eines der hier beschriebenen Peptide eine Analgesie induziert. In einem zweiten Aspekt dieses Ausführungsbeispiels werden in einem Säugetier Epilepsie oder Konvulsionen behandelt. In einem dritten Aspekt dieses Ausführungsbeispiels wird in einem Säugetier Schizophrenie behandelt. In einem vierten Aspekt dieses Ausführungsbeispiels werden in einem Säugetier Spätdyskinesie und akute dystonische Reaktionen behandelt. In einem fünften Aspekt dieses Ausführungsbeispiels wird in einem Säugetier eine Entzündung behandelt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Struktur einer N-Glykosylierung von Lys unter Verwendung eines carboxylierten modifizierten Linkers. 2 zeigt das natürliche O-Glykan in Anbindung an das Thr₁₀ des Contulakin-G.
3 zeigt Analoge des Glykans, die an einen oder mehrere Reste von Contulakin-G gebunden sein können.
4 zeigt die bevorzugten Kern-O-Glykane (van de Steen et al., 1998). O-verknüpfte Oligosaccharide vom Muzin-Typ sind durch einen GalNAc-Rest mit Ser oder Thr verbunden (oder anderen hydroxylierten Resten der vorhandenen Peptide). Die Monosaccharid-Hausteine und die an diesen ersten GalNAc-Rest geheftete Bindung definieren die "Kern-Glykane", von denen acht identifiziert wurden. Der Typ der glykosidischen Bindung (Ausrichtung und Konnektivitäten) ist für jedes Kern-Glykan definiert.
5 zeigt die Reinigung des Contulakin-G. Ein Gramm rohen, lyophilisierten Venenums von Conus geographus wurde extrahiert und wie früher beschrieben auf eine Sephadex G-25 Säule appliziert (Olivera et al., 1984). Drei aufeinanderfolgende Fraktionen mit paralytischen und Schläferwirkungen (Ve/Vo = 1,37 bis 1,41) wurden gepoolt, auf eine präparative Umkehrphasen-Vydac-C₁₈-Säule appliziert und mit einem Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Die durch einen Pfeil in der Tafel A angezeigte Komponente führte bei icv Verabreichung in Mäusen zu Laufunsicherheit und Tod.
6 zeigt ein Nano-ESI MS/MS Spektrum (m/z 1035 Vorläufer) von natürlichem Contulakin-G (286-1886 Da) (das MS/MS-Experiment ist unter Verwendung einer vorgeschlagenen Kurzschrift aufgezeichnet (Mcluckey et al., 1991), wobei der geschlossene Kreis m/z 1035 [M + 2H]²⁺ Vorläufer darstellt und die Pfeile gegen die offenen Kreise gerichtet sind, welche die vom Vorläufer generierten Fragmente darstellen). Oberhalb des Spektrums ist die Struktur der Glykoaminosäure dargestellt, wo die Pfeile 2 Stellen anzeigen, die zu bedeutenden im MS/MS-Spektrum beobachteten Fragment-Ionen führen (Craig et al., 1993).
Die 7A–7C zeigen die Dosisreaktion von CGX-1063 (Thr₁₀-Contulakin-G) auf spinal vermittelte (Extremitäten-Rückzug) und supraspinal vermittelte (Lecken der hinteren Extremitäten) nozizeptive Verhaltensweisen, hervorgerufen durch schädigende Hitze. Die Daten sind als Sekunden bis zur Reaktion (7A und 7B) oder bis zum ersten Fallen (7C) zu lesen. In 7A ist die Latenz bis zur ersten beobachtbaren Reaktion nach Aufsetzen auf eine 50°C heiße Platte dargestellt. In 7B die Latenz bis zum ersten Lecken der Hinterpfote. In 7C die Latenz bis zum ersten Hinfallen nach Aufsetzen auf das beschleunigende Rotorod (in 7A–7C, n = 3-10).
8A–8B zeigt die Wirkung von CGX-1063 auf die nozizeptive Reaktion auf anhaltenden Schmerz. In 8A sind die Daten als das Maß für die Zeit dargestellt, die die Tiere mit dem Lecken der Formalin-injizierten Hinterpfote verbrachten (n = 7-10 Tiere/Behandlungsgruppe). Das intrathekale CGX-1063 verringerte in Abhängigkeit von der Dosierung die Phase-2 nozizeptive Reaktion im Formalintest im Vergleich zu Kontrollen mit intrathekalen Salzlösungsinjektionen. 8B zeigt die Latenz bis zum ersten Fallen von einem beschleunigten Rotorod unmittelbar im Anschluss an den Formalintest.
9 zeigt die Pfotenrückzugsschwelle auf mechanische Stimulation eine Woche nach partieller Ligation des Nervus ischiadicus. Die Daten stellen die 50%-Rückzugsschwelle in Gramm dar, ermittelt mit geeichten Von-Frey-Filamenten (n = 3–9 Tiere pro Gruppe).
10A–10B zeigt einen Vergleich von CGX-1160 (Contulakin-G), CGX-1063 und NT im Schwanzspitzen-Test. Die Dosisreaktion der drei Verbindungen ist in 10A dargestellt. 10B zeigt die Wirkungsdauer bei den höchsten Dosierungen für jede Verbindung an (CGX-1160 = 100 pmol; CGX-1063 = 100 pmol; NT = 10 nmol).
11A–11B zeigt die Wirkung von CGX-1160, CGX-1063 und NT auf Phase 1 (11A) und Phase 2 (11B) des Formalintests. Alle drei Verbindungen reduzierten dosisabhängig das nozizeptive Verhalten nach i. pl. Formalin. In Phase 2 (11B) war CGX-1160 10 mal potenter als CGX-1063 und 600–700 mal potenter als NT.
12A–12C zeigt die Wirkung von CGX-1160, CGX-1063 und NT auf chronische Entzündungs-induzierte mechanische Allodynie. Die Zahlen in Klammern verweisen auf den Prozentanteil der entsprechenden Kontrollwerte. In 12A reversierte CGX-1160 auf hochwirksame und dosisabhängige Weise CFA-induzierte Allodynie. In 12B reversierte CGX-1063 CFA-induzierte Allodynie, war aber in diesem Modell etwa einhundertmal weniger wirksam als CGX-1160. In 12C reversierte NT CFA-induzierte Allodynie bei 1.000 pmol, nicht aber bei 100 pmol, also annähernd 10.000-fach weniger wirksam als CGX-1160.
13A–13B zeigt lokomotorische Beeinträchtigungen von CGX-1160, CGX-1063 und NT. 13A zeigt die Zeit bis zur Gipfelwirkung und die Dauer der Wirkung der drei Verbindungen bei den höchsten getesteten Dosierungen (etwa 100 mal die ED₅₀ in Phase 2 des Formalintests). 13B zeigt die Dosisreaktion der einzelnen Verbindungen auf die lokomotorische Beeinträchtigung.
14A–14C zeigt die Dosis-Wirkung und die Zeit bis zur Maximalwirkung (Time-to-Peak) sowie die Dauer der lokomotorischen Beeinträchtigung von CGX-1160, CGX-1063 und NT. 14A zeigt, dass CGX-1160 lang dauernde motorische Beeinträchtigung nur bei Dosen 100 mal höher als seine ED₅₀ verursachte. 14B zeigt, dass CGX-1063 lang dauernde motorische Beeinträchtigung bei Dosen 10-Mal höher als seine ED₅₀ verursachte. 14C zeigt, dass NT lang dauernde motorische Beeinträchtigung bei Dosen 100-fach größer als seine ED₅₀ verursachte.
15A–15B zeigt einen Vergleich von CGX-1160, CGX-1063 und NT zur Veränderung der Körpertemperatur. 15A zeigt die Zeit bis zur Gipfelwirkung und die Dauer jeder Verbindung, und 15B zeigt die Dosisreaktion jeder Verbindung.
16A–16C zeigt hypothermische Dosiswirkung und Dauer von CGX-1160, CGX-1063 und NT. In 16A verursachte CGX-1160 Hypothermie nur bei Dosierungen 100–500 mal höher als ED₅₀. 16B zeigt die lang dauernde hypothermische Wirkung von CGX-1063 bei Dosierungen 10-fach höher als ED₅₀ (100 pmol). In 16C hatte NT eine hypothalamische Wirkung bei Dosierungen 10–100 mal höher als seine ED₅₀.
17 zeigt Wirkungen von Thr₁₀-g Contulakin-G (CGX-1160; 100 pmol i. c. v.) auf D-Amphetamin-stimulierte lokomotorische Aktivität, gemessen an der zurückgelegten Distanz. Abkürzungen: sal-sal: i. p. Behandlung war Salzlösung, i. c. v. Behandlung war Salzlösung; amphet (3 mg/kg)-sal: i. p. Behandlung war D-Amphetaminsulfat (3 mg/kg); i. c. v. Behandlung war Salzlösung; amphet (10 mg/kg)-sal: i. p.-Behandlung war D-Amphetaminsulfat (10 mg/kg), i. c. v. Behandlung war Salzlösung; sal-ctl: i. p. Behandlung war Salzlösung, i. c. v. Behandlung war Thr₁₀-g Contulakin-G (100 pmol) ; amphet (3 mg/kg) -ctl: i. p. Behandlung war D-Amphetaminsulfat (3 mg/kg), i. c. v. Behandlung war Thr₁₀-g Contulakin-G (100 pmol). Jeder Balken zeigt das mittlere ±SEM von 3–7 Mäusen pro Gruppe. a: P <0,05 vs die Salzlösung-Salzlösung-behandelte Gruppe (sal-sal); b: P <0,05 vs die D-Amphetamin-Salzlösung-Gruppe (amphet (3 mg/kg)-sal).
18 zeigt die Wirkungen von Thr₁₀-g Contulakin-G (CGX-1160; 100 pmol i. c. v.) auf D-Amphetamin-stimulierte lokomotorische Aktivität, gemessen nach der verbrachten Gehzeit (s). Abkürzungen: sal-sal: i. p. Behandlung war Salzlösung, i. c. v. Behandlung war Salzlösung; amphet (3 mg/kg)-sal: i. p. Behandlung war D-Amphetaminsulfat (3 mg/kg), i. c. v. Behandlung war Salzlösung; amphet (10 mg/kg)-sal: i. p. Behandlung war D-Amphetaminsulfat (10 mg/kg), i. c. v. Behandlung war Salzlösung; sal-ctl: i. p. Behandlung war Salzlösung, i. c. v. Behandlung war Thr₁₀-g Contulakin-G (100 pmol); amphet (3 mg/kg)-ctl: i. p. Behandlung war D-Amphetaminsulfat (3 mg/kg), i. c. v. Behandlung war Thr₁₀-g Contulakin-G (100 pmol). Jeder Balken zeigt das mittlere ±SEM von 3–7 Mäusen pro Gruppe. a: P<0,05 vs Salzlösung-Salzlösung-behandelte Gruppe (sal-sal); b: P<0,05 vs D-Amphetamin-Salzlösungsgruppe (amphet (3 mg/kg)-sal).
19 zeigt den Schutz von CGX-1160 und CGX-1063 dosisabhängig gegen audiogene Anfälle nach i. c. v. Verabreichung in Frings-Mäusen bei Dosierungen weit unter den minimalen motorisch beeinträchtigenden Dosen. Jeder Punkt steht für den Prozentsatz an Schutz (toxisch in Gruppen von mindestens vier Mäusen).
20 zeigt die lang anhaltende Wirksamkeit von CGX-1160 in der Blockierung audiogener Anfälle nach i. c. v. Verabreichung in Frings-Mäusen. Neurotensin ist nach i. c. v. Verabreichung von bis zu 5 nmol nur zu 50% wirksam. Jeder Punkt steht für den prozentualen Schutz in einer Gruppe von vier Mäusen.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der beanspruchten Peptide als Therapeutikum für epileptische Anfälle, Entzündungen, Schockzustände, Thrombus, Hypotonie, Analgesie, Psychosen, Parkinsonsche Krankheit, gastrointenstinale Krankheiten, depressive Zustände, kognitive Dysfunktionen, Angstzustände, Spätdyskinesien, Drogenabhängigkeit, Panikattacken, Manie, Reizdarm, Diarrhöe, Ulcer, Magen-Darm-Tumore, Tourett'sche Krankheit, Huntington'sche Chorea, Gefäßundichtheit, Arteriosklerose, Gefäßerweiterung und Vasodilatation sowie für neurologische, neuropharmakologische und neuropsychopharmakologische Krankheiten.
Die vorliegende Erfindung betrifft Contulakin-G und Contulakin-G-Analoge, wie in den angehängten Ansprüchen definiert. Diese Peptide können einzelne oder mehrere posttranslationale Glykan-Modifikationen an einer oder mehreren – bis zu allen – Hydroxylstellen des Peptids enthalten. Die Glykane sind wie hier beschrieben. Das an das Contulakin-G gebundene, natürliche O-Glykan ist in 2 dargestellt. 3 zeigt Analoge des Glykans, die an einen oder mehrere Reste des Contulakin-G gebunden sein können. In dieser Figur ist R₁ ein Amino, das mit einem Glykan entweder chemisch oder enzymatisch abgeleitet werden kann; R₂ ist OH, NH₃, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat oder O-Glykan; R₃ ist H, SO₃, PO₃, Acetyl, Sialinsäure oder Monosaccharid; R₄ ist H, 50₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid; R₅ ist OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat, O-Monosaccharid oder O-Acetyl; R₆ ist H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid; R, ist H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid; R₈ ist H, SO3, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid; n ist 0–4 und m ist 1–4.
Die bevorzugten Kern-Glykane, die zur Modifizierung der hier offenbarten Contulakin-G oder Analoge verwendet werden können, sind in 4 dargestellt. Weitere Abzweigungen von diesen Kernen unter Verwendung der hier beschriebenen Monosaccharide sind ebenfalls durchführbar. Bevorzugte glykosidische Verbindungen sind spezifiziert durch die Kerne 5 und 7 der 4 bei weiterer Homologisierung des Glykans an den Positionen 3, 4 und 6 der GalNAc-Matrize unter Verwendung der hier beschriebenen Monosaccharide. Jede freie Hydroxyfunktion kann O-Sulfatiert, O-Phosphoryliert oder O-acetyliert werden.
Das glykosylierte Conopeptid (Contulakin-G oder CGX-1160) besitzt eine höhere In-vivo-Potenz als das unglykosylierte Conopeptid (Thr₁₀-Contulakin-G oder CGX-1063), obwohl ihre Invitro-Potenzen etwa dieselben sind. Die Glykosylierung kann wichtig sein für eine bessere Bindung an den Rezeptor und/oder eine verstärkte Lieferung des Conopeptids an dessen Wirkort und/oder die Hemmung des Conopeptid-Abbaus.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren die DNA-Sequenz-Codierung für Contulakin-G, wie hier detaillierter beschrieben. Die Erfindung betrifft des weiteren das Propeptid für Contulakin-G, wie hier detaillierter beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges, lineares, glykosyliertes Contulakin-G und Derivate von diesem, die als pharmazeutische Wirkstoffe verwendbar sind, des weitere Methoden zu deren Herstellung, pharmazeutische Verbindungen, die diese Verbindungen enthalten, und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff. Die neuartigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Wirkstoffe auf das Zentralnervensystem, und ihre biologischen Wirkungen setzen an einer neuen "Contulakin-G-Bindungsstelle auf dem Neurotensinrezeptor" an. Die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Analgetika, entzündungshemmende Wirkstoffe, antipsychotische Wirkstoffe zur Behandlung von Psychosen, wie Schizophrenie, und sie zeigen hochwirksame anfallbekämpfende Eigenschaften in etablierten Tiermodellen der Epilepsie.
SCHMERZ: Chronischer oder unstillbarer- Schmerz, wie er bei Zuständen wie knochendegenerativen Krankheiten und Krebs vorkommen kann, ist ein schwächender Zustand, der mit einer Vielzahl unterschiedlicher Analgetika behandelt wird, in vielen Fällen mit Opioid-Verbindungen, wie etwa Morphium.
Im allgemeinen werden die Gehirnleitungen, welche die Schmerzempfindung regeln, noch immer nicht vollständig verstanden; die sensorisch afferenten, synaptischen Verbindungen zum Rückenmark, die als "Schmerzbahnen" bezeichnet werden, sind einigermaßen detailliert dokumentiert. Im ersten Abschnitt solcher Bahnen tragen C- und A-Fasern, die von peripheren Stellen zum Rückenmark vorragen, Schmerzsignale. Polysynaptische Anschlüsse im Cornu posterius des Rückenmarks sind an der Übertragung und Modulation von Schmerzempfindungen an unterschiedliche Bereiche des Gehirns beteiligt, einschließlich des periaquäduktalen Graubereichs. Eine Analgesie bzw. die Reduzierung einer Schmerzempfindung, kann unmittelbar durch die Verringerung der Übertragung entlang solcher Schmerzbahnen bewirkt werden. Man nimmt an, dass analgetische Opiate so wirken, dass sie die Wirkungen der Endorphin- oder Enkephalin-Peptid-haltigen Neuronen imitieren, die präsynaptisch am C- oder A-Faserterminal eine synaptische Verbindung herstellen, und die, wenn sie feuern, die Abgabe von Neurotransmittern hemmen, einschließlich der Substanz P. Absteigende Bahnen vom Gehirn wirken sich ebenfalls hemmend auf die C- und A-Faser-Feuerung aus.
Bestimmte Schmerztypen haben komplexe Ätiologien. Neuropathischer Schmerz ist beispielsweise allgemein ein chronischer Zustand, der einer Verletzung oder partiellen Durchtrennung eines peripheren Nervs zuzuschreiben ist. Diese Art von Schmerzen ist durch Hyperästhesie oder erhöhte Empfindlichkeit auf externe Schmerzreize charakterisiert. Die hyperästhetische Komponente des neuropathischen Schmerzes reagiert nicht auf die selben pharmazeutischen Interventionen wie allgemeinere und akutere Schmerzformen.
Opioid-Zusammensetzungen wie Morphium sind zwar wirksam in der Produktion von Analgetika für viele Schmerztypen, aber nicht immer, und sie können in Patienten eine Gewöhnung bewirken. Hat sich bei einem Patienten eine Toleranz gegen Opioid-Narkotika entwickelt, sind höhere Dosierungen erforderlich, um eine zufriedenstellende analgetische Wirkung zu erzielen. Diese Zusammensetzungen können Nebenwirkungen – wie etwa eine Atemdepression – hervorbringen, die lebensbedrohlich sein können. Zusätzlich erzeugen Opioide häufig physische Abhängigkeiten in Patienten. Die Abhängigkeit scheint mit der Dosis des genommenen Opioids und dem Zeitraum der Einnahme durch den Patienten zusammen zu hängen. Aus diesem Grund werden Alternativtherapien für die Behandlung chronischer Schmerzen intensiv gesucht. Zusätzlich haben Verbindungen, die entweder als Ersatz für oder als Zusatz zu Opioid-Behandlungen dienen, um die Dosis der benötigten analgetischen Verbindung zu reduzieren, in der Schmerzbehandlung ihren Nutzen, insbesondere wenn es um die Behandlung chronischer, unstillbarer Schmerzen geht.
Da sich gezeigt hat, dass Contulakin-G an einer Stelle auf bestimmten Neurotensinrezeptoren wirkt, und da von Neurotensin analgetische Wirkung nachgewiesen wurde (Clineschmidt et al. 1979), sind Contulakin-G-artige Conopeptide nützlich in der Behandlung von Schmerzen und damit verbundener Krankheiten.
SCHIZOPHRENIE: Schizophrenie ist eine neurogenetische Erkrankung, die derzeit in erster Linie mit neuroleptischen Verbindungen behandelt wird, wie etwa Phenothiazinen und Butyrophenonen, welche die Dopaminrezeptoren blockieren. Da nachgewiesen wurde, dass Contulakin-G an einer Stelle auf bestimmte Neurotensinrezeptoren wirkt und Neurotensinwirkungen an der Ätiologie der Schizophrenie beteiligt sind (Nemeroff et al. 1992), sind Contulakin-G-artige Conopeptide nützlich für die Behandlung der Schizophrenie und verwandter Störungen.
Die In-vitro-Selektionskriterien für Conopeptide, die für die Behandlung der Schizophrenie geeignet sind, umfassen: a) Aktivierung von Contulakin-G-Stellen; b) reversible Bindung hoher Affinität an eine Contulakin-G-Bindungsstelle, die im limbischen Bereich des Gehirns lokalisiert ist, und c) Hemmung der Dopaminausschüttung aus Gehirnregionen, insbesondere aus den limbischen Gehirnregionen.
Verbindungen, die ausreichend hohe Aktivitäten in den oben erwähnten In-vitro-Screening-Assays zeigen, werden dann in einem Tiermodell getestet, das zum Screening antipsychotischer Verbindungen verwendet wird.
SPÄTDYSKINESIE UND ANDERE AKUTE DYSTONISCHE REAKTIONEN.
Spätdyskinesien und akute dystonische Reaktionen sind Bewegungsstörungen, die im allgemeinen als Nebenwirkungen einer anti-psychotischen Therapie mit Dopaminantagonisten, wie Haloperidol, auftreten. Diese Störungen sind gekennzeichnet durch die Supersensititvität von Dopaminrezeptoren in bestimmten Bereichen des Gehirns, die mit der Bewegungskontrolle in Verbindung stehen, insbesondere den Basalganglien. Zur Zeit wird mit einer intermittierenden antipsychotischen Therapie versucht, den Ausbruch der Krankheit zu verhindern, und die Behandlung solcher Krankheiten erfolgt durch die Absetzung der Therapie.
Die Kriterien für die Auswahl von Omega-Conopeptiden für die Behandlung der Spätdyskinesie umfassen: a) Aktivierung von Contulakin-G-Stellen; b) reversible Bindung hoher Affinität an die Contulakin-G-Stelle; c) Hemmung der Dopaminausschüttung aus Striatum-Gehirnregionen und anderen Regionen der Basalganglien, und d) ein Verhältnis der Hemmung der Dopaminausschüttung in den Basalganglien zur Hemmung der Dopaminausschüttung in den limbischen Regionen.
Verbindungen, die ausreichend hohe Aktivitäten in In-vitro-Screening-Assays zeigen, werden dann im oben beschriebenen Ratten-Striatum-Drehmodell getestet. Verbindungen, die sich für die Methode zur Behandlung solcher Bewegungsstörungen eignen, korrigieren das Drehverhalten, wenn sie in das Striatum auf der zur Läsion kontralateralen Seite des Gehirns injiziert werden.
ENTZÜNDUNG: Eine neurogenetische Komponente der Entzündung wurde beschrieben, insofern als die Blockierung des sympathischen Nervensystems, und insbesondere die Blockierung der Beta-Adrenorezeptoren, nützlich in der Reduzierung entzündlicher Gelenksschäden ist. Von Verbindungen, die sich für die Behandlung von Entzündungen eignen, sollte man die folgenden In-Vitro-Eigenschaften erwarten: a) Aktivierung neuartiger Contulakin-G-Stellen; b) Bindung hoher Affinität an die Contulakin-G-Bindungsstellen, und c) Hemmung der Norepinephrinausschüttung aus dem Nervengewebe. Verbindungen, die ausreichend hohe Aktivitäten in solchen In-vitro-Screening-Assays zeigen, werden in einem Tiermodell rheumatoider Arthritis getestet.
EPILEPSIE: Epilepsie ist ein allgemeiner Ausdruck zur Beschreibung von Krankheiten des Zentralnervensystems, die von wiederholten Anfällen gekennzeichnet sind. Solche Anfälle können das sensorische, das autonome oder das motorische Nervensystem betreffen und werden elektrophysiologisch durch die Anwesenheit abnormaler elektrischer Entladungen im Gehirn erkannt. Die Pathophysiologie solcher abnormaler Entladungsaktivität wird nicht gut verstanden, es liegen jedoch Anhaltspunkte vor, dass ein Verlust von inhibitorischem neuronalem Input, etwa GABA-Input, zumindest bei einigen epileptischen Anfällen eine Rolle spielt.
Die Fähigkeit bestimmter Benzodiazepine (z. B. Diazepam) zur Unterdrückung oder Hemmung epileptischer Episoden wird verschiedentlich als Nachweis für eine GABA-ergische Pathophysiologie der Anfallaktivität verstanden, da diese Medikamente bekanntermaßen über eine Wirkung auf den GABA-Rezeptor-assoziierten Chlorid-Innenkanal eine GABA-ergische neurale Hemmung ermöglichen. Die biochemischen Wirkungen anderer anti-epileptischer Verbindungen umfassen die Stabilisierung erregbarer Membranen durch Hemmung der spannungsempfindlichen Natrium- oder Kaliumkanäle (Phenytoin) und die allgemeine Unterdrückung der neuronalen Funktion, gekennzeichnet durch die Ermöglichung von GABA-ergischer Übertragung, Hemmung der Wirkungen der exzitatorischen (glutaminergischen) Neurotransmission und Unterdrückung der Neurotransmitterausschüttung (Phenobarbital).
von Verbindungen, die sich für die Behandlung der Epilepsie eignen, sollte man die folgenden In-Vitro-Eigenschaften erwarten: a) Aktivierung neuartiger Contulakin-G-Stellen; b) Bindung hoher Affinität an die Contulakin-G-Conopeptidbindungsstellen, und c) Hemmung der exzitatorischen Neurotransmitterausschüttung aus dem Nervengewebe. Verbindungen, die ausreichend hohe Aktivitäten in solchen In-vitro-Screening-Assays zeigen, werden in einem etablierten Tiermodell der Epilepsie getestet.
Neben den oben aufgeführten spezifischen Erkrankungen, sind diese Verbindungen auch anwendbar im Zusammenhang mit Krankheiten in Verbindung mit dem Neurotensinrezeptor und für die Neurotensin-artige Verbindungen oder andere Verbindungen sich als wirksam erwiesen haben, da sich herausgestellt hat, dass die Peptide, Derivate und Analoge der vorliegenden Erfindung den Neurotensinrezeptor binden. Zu diesen Wirkungen gehören: Methamphetamin-Antagonisten, antipsychotische Wirkstoffe, zerebrale Medikamente, Analgetika, Anti-Endotoxin-Schockwirkung, Protease-hemmende Wirkung {eine Anti-Thrombin-Wirkung, eine Anti-Plasmin-Wirkung), eine hypotensive Wirkung, eine Anti-DIC-Wirkung, eine anti-allergische Wirkung, eine wundheilende Wirkung, Zerebralödem, Lungenödem, ein Luftröhrenödem, ein Thrombus, eine Arteriosklerose, eine Verbrennung und eine Hypertension, allergische Erkrankungen (wie etwa ein Bronchialasthma und eine Pollinose); Blutungsreduzierung nach schweren Traumata, wie etwa ein verletzter Gewebeabschnitt während einer Operation; eine lazerierte Wunde eines Hirn- oder anderen Gewebes, verursacht von einem Verkehrsunfall und ähnlichem, und zur Milderung und Heilung von Schwellungen, Schmerzen und Entzündungen, die von Traumata verursacht wurden; Unterdrückung innerer Blutungen infolge eines dumpfen Traumas; Ödeme und Entzündungen, die von der inneren Blutung begleitet werden; Unterdrückung und Verbesserung zerebraler Ödeme durch Unterdrückung des Ausdringens von Blutkomponenten in eine Gewebematrix, wie es in zerebralen, ischämischen Erkrankungen vorgefunden wird, zu denen zerebrale Infraktionen (z. B. ein zerebraler Thrombus und ein zerebraler Embolismus), intrakraniale Blutungen (z. B. eine Zerebralblutung und eine Subarachnoidalblutung), ein vorübergehender zerebral-ischämischer Anfall, akute zerebrale Blutgefäßerkrankungen in einer hypertensiven Encephalopathie gehören; Unterdrückung und Verbesserung von Verbrennungen, Frostbeulen, andere Hautentzündungen und Schwellungen; eine Entzündung der oberen Luftröhre, Asthma, eine Nasenschleimhautanschwellung, ein Lungenödem und entzündliche Erkrankungen, die von endogenen und exogenen Faktoren verursacht wurden, die unmittelbar Gefäßendothelia und Schleimhäute schädigen, wie etwa umweltchemische Substanzen, Krebs-Chemotherapeutika, ein Endotoxin und ein Entzündungsmediator.
Die Conopeptide der vorliegenden Erfindung werden durch Isolierung von Conus venom identifiziert. Alternativ dazu werden die Conopeptide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken mittels Screenings von cDNA-Bibliotheken unterschiedlicher Conus-Spezies unter Heranziehung konventioneller Techniken mit degenerierten Proben identifiziert. Klone, die zu diesen Proben hybridisieren, werden analysiert, um jene zu identifizieren, die Minimalgrößenerfordernisse erfüllen, d. h. Klone mit annähernd 300 Nukleotiden (für ein Propeptid), wie unter Verwendung von PCR-Primern festgestellt wurde, welche die cDNA-Klonierungsstellen für die spezifische untersuchte cDNA-Bibliothek flankieren. Diese minimalgroßen Klone werden dann sequenziert. Die Sequenzen werden dann auf die Anwesenheit eines Peptids mit den oben für Conopeptide festgestellten Merkmalen untersucht. Die biologische Wirksamkeit der mit diesem Verfahren identifizierten Peptide wird so wie hier beschrieben, wie im US-Patent Nr. 5,635,347 oder auf fachübliche Weise geprüft.
Diese Peptide sind ausreichend klein, um chemisch synthetisiert zu werden. Allgemeine chemische Synthesen zur Zubereitung der voranstehenden Conopeptide werden weiter unten beschrieben, zusammen mit der spezifischen chemischen Synthese von Conopeptiden und Indikationen biologischer Wirkungen dieser synthetischen Produkte. Verschiedene dieser Conopeptide können auch mittels Isolierung und Reinigung von spezifischen Conus-Spezies gewonnen werden, wofür die in den U.S. Patent-Nr. 4,447,356 (Olivera et al., 1984); 5,514,774 (Olivera et al. 1996) und 5,591,821 (Olivera et al., 1997) beschriebenen Techniken zur Anwendung kommen.
Obwohl die Conopeptide der vorliegenden Erfindung durch Reinigung von Kegelschnecken gewonnen werden können, werden die gewünschten im wesentlichen reinen Conopeptide am besten in kommerziell verwertbaren Mengen durch chemische Synthese mittels einer Festphasenstrategie gewonnen, zumal die Mengen an Conopeptiden, die von einzelnen Schnecken zu gewinnen sind, sehr klein sind. Beispielsweise kann der Ertrag einer einzigen Kegelschnecke etwa 10 Mikrogramm oder weniger Conopeptid ausmachen. Mit "im wesentlichen rein" ist gemeint, dass das Peptid in praktischer Abwesenheit anderer biologischer Moleküle des selben Typs vorhanden ist; es ist vorzugsweise vorhanden in einer Menge von mindestens etwa 85% Reinheit und insbesondere mindestens etwa 95% Reinheit. Die chemische Synthese biologisch wirksamer Conopeptide ist natürlich von der korrekten Bestimmung der Aminosäuresequenz abhängig. So können die Conopeptide der vorliegenden Erfindung isoliert, synthetisiert und/oder im wesentlichen rein sein.
Die Conopeptide können auch durch rekombinante DNA-Verfahren produziert werden, die in der Fachwelt gut bekannt sind. Solche Verfahren werden beschrieben von Sambrook et al. (1989). Die auf diese Weise produzierten Peptide werden isoliert, bei Bedarf reduziert und oxidiert, um die korrekten Disulfidbindungen zu bilden, wenn im abschließenden Molekül vorhanden.
Die Peptide werden auf geeignete Weise synthetisiert, wie etwa durch ausschließliche Festphasenverfahren, durch partielle Festphasenverfahren, durch Fragmentkondensation oder durch klassische Lösungskopplungen.
In der konventionellen Lösungsphasen-Peptidsynthese kann die Peptidkette durch eine Reihe von Kopplungsreaktionen zubereitet werden, in denen konstituierende Aminosäuren der wachsenden Peptidkette in der gewünschten Reihenfolge zugefügt werden. Der Einsatz unterschiedlicher Kopplungsreagenzien, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid oder Diisopropyl-Carbonyldimidazol, verschiedener aktiver Ester, z. B. die Ester von N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxy-Succinimid, und der unterschiedlichen Spaltungsreagenzien zur Ausführung der Reaktion in Lösung mit anschließender Isolierung und Reinigung von Zwischenprodukten ist in der klassischen Peptidmethodologie gut bekannt. Die klassische Lösungssynthese wird detailliert beschrieben in der Abhandlung "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden," (1974). Die Techniken der ausschließlichen Festphasensynthese werden in dem Lehrbuch "Solid-Phase Peptide Synthesis," (Stewart and Young, 1969) ausgeführt und exemplifiziert in der Offenbarung von US-Patent Nr. 4,105,603 (Vale et al., 1978). Das Fragmentkondensierungsverfahren der Synthese wird exemplifiziert in US-Patent Nr. 3,972,859 (1976). Andere verfügbare Synthesen werden in den US-Patenten Nr. 3,842,067 (1974) und 3,862,925 (1975) exemplifiziert. Die Synthese von Peptiden, die γ-Carboxyglutaminsäurereste enthalten, wird exemplifiziert von Rivier et al. (1987), Nishiuchi et al. (1993) und Zhou et al. (1996). Die Synthesen von Conopeptiden wurden in US-Patent Nr. 4,447,356 (Olivera et al., 1984), 5,514,774 (Olivera et al., 1996) und 5,591,821 (Olivera et al., 1997) beschrieben.
Gemeinsam ist solchen chemischen Synthesen der Schutz der labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäureanteile mit geeigneten Schutzgruppen, die eine chemische Reaktion an dieser Stelle verhindern, bis die Gruppe schließlich entfernt wird. Ebenfalls allgemein ist der Schutz einer α-Aminogruppe auf einer Aminosäure oder einem Fragment, während diese Einheit an der Carboxyl-Gruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe, um die nachfolgende Reaktion an dieser Stelle zuzulassen. Es ist demnach allgemein, dass – als Schritt in einer solchen Synthese – eine Zwischenverbindung produziert wird, die jeden der Aminosäurereste in ihrer gewünschten Sequenz in der Peptidkette enthält, mit geeigneten Seitenketten-Schutzgruppen, die mit unterschiedlichen Resten verbunden sind, welche labile Seitenketten haben.
Was die Selektion einer Seitenketten-Aminoschutzgruppe betrifft, wird im allgemeinen eine gewählt, die während der Schutzaufhebung der α-Aminogruppen während der Synthese nicht entfernt wird. Für einige Aminosäuren, z. B. His, ist allerdings ein Schutz nicht allgemein nötig. Bei der Auswahl einer bestimmten Seitenketten-Schutzgruppe zur Verwendung in der Synthese des Peptids, kommen folgende allgemeine Regeln zur Anwendung: (a) die Schutzgruppe bewahrt vorzugsweise ihre Schutzeigenschaften und wird unter Kopplungsbedingungen nicht abgetrennt, (b) die Schutzgruppe sollte unter den Reaktionsbedingungen, die zur Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe bei jedem Schritt der Synthese gewählt wurden, stabil sein, und (c) die Seitenketten-Schutzgruppe muss nach Abschluss der Synthese, welche die gewünschte Aminosäurensequenz enthält, unter Reaktionsbedingungen, die die Peptidkette nicht unerwünscht ändern, entfernbar sein.
Es müsste möglich sein, viele oder sogar alle dieser Peptide unter Anwendung einer rekombinanten DNA-Technologie herzustellen. Wenn die Peptide allerdings nicht auf diese Art hergestellt werden, werden sie vorzugsweise unter Anwendung der Merrifield Festphasensynthese zubereitet, obwohl auch andere, gleichwertige chemische Synthesen, die in der Fachwelt bekannt sind, verwendet werden können, wie oben erwähnt. Die Festphasensynthese beginnt beim C-Terminus des Peptids durch Kopplung einer geschützten α-Aminosäure an ein geeignetes Harz. Ein solches Startmaterial kann zubereitet werden, indem eine α-Amino-geschützte Aminosäure mittels Ester-Verbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz gebunden wird, oder mit einer Amidbindung an ein Benzhydrylamin-(BHA)-Harz oder ein Para-Methylbenzhydrylamin-(MBHA)-Harz. Die Zubereitung des Hydroxymethylharzes wird beschrieben von Bodansky et al. (1966). Chlormethylierte Harze sind käuflich erhältlich bei Bio Rad Laboratories (Richmond, CA) und bei Lab. Systems, Inc. Die Herstellung eines solchen Harzes wird beschrieben von Stewart und Young (1969). BHA und MBHA-Harz-Träger sind käuflich erhältlich und werden allgemein benützt, wenn das gewünschte Polypeptid, welches synthetisiert wird, ein unsubstituiertes Amid am C-Terminus aufweist. Feste Harzträger können deshalb alle in der Fachwelt bekannten sein, wie etwa einer der Formeln -O-CH₂ Harzträger, -NH BHA Harzträger, oder -NH-MBHA Harzträger. Wenn das unsubstituierte Amid gewünscht ist, wird die Verwendung eines BHA- oder MBHA-Harzes bevorzugt, weil die Abspaltung direkt das Amid ergibt. Für den Fall, dass das N-Methyl-Amid gewünscht ist, kann es von einem N-Methyl-BHA-Harz generiert werden. Sollten andere substitutierte Amide erwünscht sein, können die Erkenntnisse von US-Patent Nr. 4,569,967 (Kornreich et al., 1986) verwendet werden, oder sollten noch andere Gruppen als die freie Säure am C-Terminus gewünscht werden, kann es vorzuziehen sein, das Peptid unter Anwendung klassischer Methoden zu synthetisieren, wie in dem Text von Houben-Weyl ausgeführt (1974).
Die C-terminale Aminosäure, geschützt von Boc oder Fmoc und von einer Seitenketten-Schutzgruppe, kann – wenn dies angebracht ist – zuerst an ein chlormethyliertes Harz gemäß dem Verfahren in Horiki et al. (1978) gekoppelt werden, wofür KF in DMF bei etwa 60°C für 24 Stunden mit Rühren verwendet wird, wenn ein Peptid mit freier Säure am C-Terminus zu synthetisieren ist. Anschließend an die Kopplung der BOCgeschützten Aminosäure an den Harzträger wird die α-Amino-Schutzgruppe entfernt, etwa durch Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid oder TFA allein. Die Schutzaufhebung wird durchgeführt bei einer Temperatur zwischen etwa 0°C und Raumtemperatur. Andere Standard-Spaltungsreagenzien, wie HCl in Dioxan, und Bedingungen für die Entfernung spezifischer α-Amino-Schutzgruppen können verwendet werden wie in Schroder und Lubke (1965) beschrieben.
Nach Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe werden die restlichen α-Amino- und Seitenketten-geschützten Aminosäuren
schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt, um die oben definierte Zwischenverbindung zu erhalten, oder als Alternative zum Hinzufügen jeder Aminosäure einzeln in der Synthese können einige davon vor der Zugabe zum Festphasenreaktor aneinander gekoppelt werden. Die Auswahl eines geeigneten Kopplungsreagens ist in der Fachwelt bekannt. Besonders geeignet als Kopplungsreagens ist N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, DIC, HBTU, HATU, TBTU in Anwesenheit von HoBt oder HoAt).
Die in der Festphasensynthese der Peptide benützten Aktivierungsreagenzien sind in der Peptid-Fachwelt gut
bekannt. Beispiele geeigneter Aktivierungsreagenzien sind Carbodiimide, wie N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid. Andere aktivierende Reagenzien und deren Verwendung in der Peptid-Kopplung werden beschrieben von Schroder und Lubke (1965) sowie Kapoor (1970).
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäurensequenz wird in den Festphasenreaktor in etwa zweifacher oder größerer Übermenge eingebracht, und die Kopplung kann in einem Medium von Dimethylformamid (DMF) : CH₂Cl₂ (1 : 1) oder in DMF oder CH₂Cl₂ allein durchgeführt werden. In Fällen, in denen es zu Zwischenkopplungen kommt, wird das Kopplungsverfahren vor der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe vor der Kopplung der nächsten Aminosäure wiederholt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jeder Phase der Synthese, sofern diese manuell vorgenommen wird, wird vorzugsweise durch die Ninhydrin-Reaktion überwacht, wie von Kaiser et al. (1970) beschrieben. Kopplungsreaktionen können automatisch durchgeführt werden, wie etwa auf einem automatischen Synthesizer des Typs Beckman 990, wofür ein Programm wie das in Rivier et al. (1978) beschriebene zur Anwendung kommt.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz fertiggestellt wurde, kann das Zwischen-Peptid vom Harzträger durch Behandlung mit einem Reagens entfernt werden, wie etwa mit einem flüssigen Fluorwasserstoff oder TFA (wenn Fmoc-Chemie verwendet wird), das nicht nur das Peptid vom Harz trennt, sondern auch alle restlichen Seitenketten-Schutzgruppen abspaltet, und auch die α-Amino-Schutzgruppe am N-Terminus, wenn sie nicht früher entfernt wurde, um das Peptid in Form der freien Säure zu gewinnen. Wenn Met in der Sequenz vorhanden ist, wird die Boc-Schutzgruppe vorzugsweise zuerst unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA)/Ethandithiol entfernt, bevor das Peptid mit HF vom Harz gespalten wird, um eine potentielle S-Alkylierung zu eliminieren. Wenn zum Abspalten Fluorwasserstoff oder TFA verwendet wird, werden ein oder mehrere Sammler wie Anisol, Cresol, Dimethylsulfid und Methylethylsulfid in das Reaktionsgefäß eingebracht.
Vorzugsweise ist die Cyclisierung des linearen Peptids betroffen, wenn es um das Schaffen von Bindungen zwischen Cys-Resten geht, im Unterschied zu der Cyclisierung des Peptids, während es ein Teil des Peptido-Harzes ist. Um eine solche Disulfid-Cyclisierungsverbindung zu bewirken, kann das voll geschützte Peptid von einem hydroxymethylierten Harz oder einem chlormethylierten Harzträger durch Ammonolyse, die in der Fachwelt gut bekannt ist, abgespaltet werden, um das voll geschützte Amid-Zwischenprodukt zu ergeben, das anschließend auf geeignete Weise cyclisiert und schutzbefreit wird. Die Schutzaufhebung und die Abspaltung des Peptids von den genannten Harzen oder einem Benzhydrylamin-(BHA)-Harz oder einem Methylbenzhydrylamin (MBHA) kann aber auch bei 0°C mit Fluorwasserstoffsäure (HF) oder TFA stattfinden, gefolgt von Oxidation wie oben beschrieben. Eine geeignete Methode für die Cyclisierung ist das von Cartier et al. (1996) beschriebene Verfahren.
Muteine, Analoge oder aktive Fragmente. des vorangehenden Contulakin-G oder Thr₁₀-g Contulakin-G werden hier ebenfalls erörtert. Vgl. z. B. Hammerland et al. (1992). Derivative Muteine, Analoge oder aktive Fragmente der Conotoxinpeptide können gemäß bekannten Techniken synthetisiert werden, einschließlich konservativer Aminosäuresubstitutionen, wie in US-Patent Nr. 5,545,723 (vgl. insbesondere Sp. 2, Zeile 50 bis Sp. 3, Zeile 8); 5,534,615 (vgl. insbesondere Sp. 19, Zeile 45 bis Sp. 22, Zeile 33); und 5,364,769 (vgl. insbesondere Sp. 4, Zeile 55 bis Sp. 7, Zeile 26) dargestellt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff enthalten, können gemäß herkömmlicher pharmazeutischer Herstellungsverfahren zubereitet werden. Vgl. beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). Typischer Weise wird eine antagonistische Menge des Wirkstoffes mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff gemischt. Der Trägerstoff kann eine Vielzahl unterschiedlicher Formen annehmen, je nach der für die Verabreichung gewünschten Form des Präparats, z. B. intravenös, oral oder parenteral.
For die orale Verabreichung können die Verbindungen zu festen oder flüssigen Präparaten formuliert werden, wie etwa Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen, Schmelzen, Pudern, Suspensionen oder Emulsionen. Bei der Zubereitung der Zusammensetzungen in oraler Dosierung kann jedes der üblichen pharmazeutischen Medien verwendet werden, wie beispielsweise Wasser, Glykole, Öle, Alkohole, Geschmackstoffe, Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Suspendiermittel und ähnliche im Fall von oralen flüssigen Präparaten (wie beispielsweise Suspensionen, Elixiere und Lösungen); oder Trägerstoffe wie Stärken, Zucker, Streckmittel, Granuliermittel, Schmiermittel, Bindemittel, Desintegrationsmittel und ähnliche im Fall von oralen festen Präparaten (wie beispielsweise Pulver, Kapseln und Tabletten). Aufgrund ihrer einfachen Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhaftesten Formen oraler Einheitsdosierungen dar, in welchem Fall naturgemäß feste pharmazeutische Trägerstoffe zur Anwendung kommen. Auf Wunsch können Tabletten per Standardverfahren mit Zucker oder enterisch beschichtet werden.
Für die parenterale Verabreichung kann die Verbindung in einem pharmazeutischen Trägerstoff gelöst sein und als Lösung oder als Suspension verabreicht werden. Beispiele geeigneter Träger sind Wasser, Salzlösung, Dextroselösungen, Fructoselösungen, Ethanol oder Öle tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs. Der Trägerstoff kann auch andere Ingredienzien enthalten, z. B. Konservierungsmittel, Suspendierungsmittel, Lösemittel, Pufferstoffe und ähnliche. Wenn die Verbindungen intrathekal verabreicht werden, können sie auch in cerebrospinaler Flüssigkeit gelöst sein.
Die Verabreichung des Wirkstoffes gemäß dieser Erfindung kann mit jedem geeigneten Zuführungsmittel vorgenommen werden, einschließlich der folgenden:

(a) Pumpe (vgl. z. B. Annals of Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer, 41: 1270 (1993); Cancer Research, 44: 1698 (1984));
(b), Mikroverkapselung (vgl. z. B. US-Patent Nr. 4,352,883; 4,353,888 und 5,084,350);
(c) Polymerimplantate mit kontinuierlicher Freisetzung (vgl. z. B. US-Patent Nr. 4,883,666);
(d) Makroverkapselung (vgl. z. B. US-Pat. Nr. 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 und 4,968,733 und die veröffentlichten PCT Patentanmeldungen WO92/19195, WO 95/05452);
(e) nackte oder unverkapselte Zellverpflanzungen in das ZNS (vgl. z. B. US-Pat. Nr. 5,082,670 und 5,618,531);
(f) Injektion, entweder subkutan, intravenös, intraarteriell, intramuskulär oder an anderen geeigneten Stellen; oder
(g) orale Verabreichung als Kapsel, Flüssigkeit, Tablette, Pille oder als Formel mit verzögerter Freisetzung.

In einem Ausführungsbeispiel dieser Erfindung wird ein Wirkstoff unmittelbar in das ZNS eingeführt, vorzugsweise in die Gehirnventrikel, das Gehirnparenchym, den intrathekalen Raum oder an einen anderen geeigneten ZNS-Ort, meistbevorzugt jedoch intrathekal.
Anderseits können auch Zieltherapien angewendet werden, um den Wirkstoff spezifischer zu bestimmten Zelltypen zu bringen, wofür bestimmte Zielsysteme eingesetzt werden, wie Antikörper oder zellspezifische Liganden. Die Zielverabreichung ("Targeting") kann aus unterschiedlichen Gründen wünschenswert sein, z. B. wenn der Wirkstoff unakzeptabel toxisch ist, wenn er auf anderem Wege eine zu hohe Dosis erfordern würde oder wenn er auf andere Weise nicht in der Lage wäre, in die Zielzellen zu gelangen.
Die Wirkstoffe, bei denen es sich um Peptide handelt, können ebenfalls in einem Zell-basierten Zuführungssystem verabreicht werden, in dem eine DNA-Sequenz, die einen Wirkstoff codiert, in Zellen eingeführt wird, die für die Implantierung in den Körper des Patienten konstruiert sind, insbesondere in den Rückenmarksbereich. Geeignete Zuführungssysteme sind beschrieben in US-Patent Nr. 5,550,050 und in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen Nr. WO92/19195, WO 94/25503, WO 95/01203, WO 95/05452, WO 96/02286, WO 96/02646, WO96/40871, WO 96/40959 und WO 97/12635. Geeignete DNA-Sequenzen können für jeden Wirkstoff auf Basis der entwickelten Sequenzen und des bekannten genetischen Codes synthetisch hergestellt werden.
Der Wirkstoff wird vorzugsweise in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die tatsächlich verabreichte Menge sowie Rate und Zeitverlauf der Verabreichung sind von der Art und Schwere der behandelten Erkrankung abhängig. Die Verschreibung der Behandlung, z. B. die Entscheidungen über Dosierung, Zeitplan usw., liegen in der Verantwortung des praktischen Arztes oder Facharztes, wobei in der Regel die zu behandelnde Erkrankung, der Zustand der Patientin oder des Patienten, die Zuführungsstelle, das Verabreichungsverfahren und andere den praktischen Ärzten bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Beispiele für Techniken und Protokolle finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences. In der Regel zeigen die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung ihre Wirkungen in einem Dosierungsbereich von etwa 0,001 μg/kg bis etwa 500 μg/kg, vorzugsweise von etwa 0,01 μg/kg bis etwa 100 μg/kg des Wirkstoffes, insbesondere von etwa 0,10 μg/kg bis etwa 50 μg/kg und meistbevorzugt von etwa 1 μg/kg bis etwa 10 μg/kg. Eine angemessene Dosis kann in mehreren Teildosierungen pro Tag verabreicht werden. In der Regel kann eine Dosis oder Teildosis von etwa 0,1 μg bis etwa 500 μg des Wirkstoffes pro Einheitsdosisform enthalten. Eine eher bevorzugte Dosierung enthält von etwa 0,5 μg bis etwa 100 μg des Wirkstoffes pro Einheitsdosisform. Die Dosierungen beginnen im allgemeinen bei niedrigeren Werten und werden gesteigert, bis die gewünschten Wirkungen erzielt werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird weiter beschrieben in den folgenden Beispielen, die nur illustrativen Charakter haben und nicht geeignet sind, die Erfindung auf irgendeine Weise einzuschränken. Es kommen in der Fachwelt gut bekannte Standardtechniken oder die unten im einzelnen beschriebenen Techniken zur Anwendung. Die verwendeten Abkürzungen: Bop, Benzotriazoyloxy-tris(Dimethylamin)-Phosphoniumhexafluorphosphat; Boc, Tert-Butyloxycarbonyl; Fmoc, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; Gal, Galaktose; GalNAc, N-Acetylgalaktosamin; hNTR1, Humanneurotensin-Typ 1-Rezeptor; Hex, Hexose; HexNAc, N-Acetyl-Hexosamin; icv, intracerebroventrikular; LSI, Liquid Secondary Ionization (Flüssigkeits-Sekundärionisierung); MALD, "Matrix Assisted Laser Desorption" (Matrixunterstützte Laser-Desorption); MS, Massenspektrometrie; mNTR3, Maus-Neurotensin-Typ-3-Rezeptor; Nano-ESI, Nano-Elektrospray; NMP, N-Methylpyrrolidon; NMR, kernmagnetische Resonanz; ppm, Teile pro Million; rNTR1, Ratten-Neurotensin-Typ 1-Rezeptor; rNTR2, Ratten-Neurotensin-Typ 2-Rezeptor; RP-HPLC, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen. Aminosäuren sind mit den standardisierten Drei- oder Einbuchstaben-Abkürzungen bezeichnet.
BEISPIEL 1
Experimentelle Verfahren zur Erstanalyse von Contulakin-G

1. Rohes Venenum. Conus-geographus-Proben wurden von der Marinduque-Insel in den Philippinen bezogen. Das rohe Venenum wurde durch Dissektion des Ausführungsgangs der Venenum-Glandula gewonnen, anschließend gefriergetrocknet und bei –70°C gelagert.
2. Peptid-Reinigung. Gefriergetrocknetes C.-geographus-Venenum (1 g) wurde mit 1,1% Essigsäure extrahiert und auf einer Sephadex G-25 Säule chromatografiert, die mit 1,1% Essigsäure eluiert war, wie beschrieben (Olivera et al., 1984). Ein Peptid, das Mäuse träge und reaktionsarm macht, wurde mit einer Reihe von RP-HPLC-Reinigungen auf präparativen und halb-präparativen und analytischen Umkehrphasen-C₁₈-Säulen gereinigt. Ein Gradient von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure wurde verwendet, um das Peptid von den Säulen zu eluieren. Die Hauptprobe wurde vor der weiteren Charakterisierung erneut gereinigt. Kurz beschrieben, wurde ein Gramm rohes, lyophilisiertes Venenum von Conus geographus extrahiert und auf eine Sephadex G-25 Säule aufgebracht, wie früher beschrieben (Olivera et al., 1984). Drei aufeinanderfolgende Fraktionen, die paralytische und Schläfer-Aktivitäten enthielten (Ve/Vo = 1,37 bis 1,41) wurden gepoolt, auf eine präparative Umkehrphasen-Vydac-C₁₈-Säule aufgebracht und mit einem Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert (1). Die durch einen Pfeil in 1 angezeigte Komponente führte bei Verabreichung icv in Mäusen zu schwankendem Gang und Tod. Sie wurde auf eine halbpräparative C₁₈-Säule aufgebracht und mit 12–42% Acetonitril-Gradient in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Die Komponente, die Mäuse bei Verabreichung icv reaktionsarm machte, wurde mit einer isokraten Elution bei 20,4% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure weiter gereinigt. Eine Maus, der ein Aliquot der Komponente icv injiziert wurde, hatte in 5 Minuten Schwierigkeiten, sich aufrecht zu halten und wurde in 12 Minuten sehr träge. In etwa 25–30 Minuten lag die Maus ausgestreckt auf dem Bauch.
3. Bioaktivität. In der Regel hatten Mäuse, denen das partiell gereinigte, natürliche Peptid icv injiziert wurde, anfangs Schwierigkeiten, sich nach 5 Minuten aufrecht zu halten, wurden nach 12 Minuten träge und lagen nach 30 Minuten auf dem Bauch. Diese Zeichen wurden als Assay zur Identifizierung des biologisch aktiven Peptids während der Reinigung verwendet.
4. Enzymhydrolyse. Annähernd 180 pmol des Peptids (6 μL) wurden mit 7 mU β-Galaktosidase (Rinder-Testes) (2 μL) in 50 μL von 50 mM Citrat/Phosphat-Puffer (pH 4,5) 53 Stunden lang bei 32°C inkubiert. Etwa 60 pmol des Peptids (2 μL) wurde mit 2 mU O-Glykosidase (Diplococcus pneumoniae) (2 μL) in 50 μL von 20 mM Kakodylsäure (pH 6,0) 19 Stunden lang bei 32°C inkubiert.
5. Chemische Sequenz- und Aminosäurenanalyse. Die automatisierte chemische Sequenzanalyse wurde auf einem 477A Protein Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Die Aminosäurenanalyse wurde mit Vorsäulenderivatisierung ausgeführt. Annähernd 500 pmol des Contulakin-G wurde unter Vakuum mit konzentriertem HCl versiegelt, bei 110°C 24 Stunden lang hydrolysiert, lyophilisiert und dann mit o-Phthalaldehyd derivatisiert. Die derivatisierten Aminosäuren wurden dann mit RP-HPLC analysiert.
6. Massenspektrometrie. Die Massenspektra der matrixunterstützten Laser-Desorption (MALD= (Hillenkamp et al., 1993) wurden mit einem Flugzeit-Massenspektrometer 'Bruker REFLEX' (Bruker Daltonics, Billerica, MA) gemessen (Cotter, 1989), das mit einem gitterlosen Reflektron, einem N2-Laser und einem 100-MHz-Digitalisierer ausgerüstet war. Eine Beschleunigungsspannung von +31 kV und eine Reflektorspannung zwischen 1,16 und 30 kV wurden für die Messungen nach dem Quellenzerfall (Spengler et al., 1992) verwendet. Die Probe (in 0,1% wässriger Trifluoressigsäure) wurde mit einer α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure appliziert. Die Massenspektra der Flüssigkeits-Sekundärionisierung (LSI) (Barber et al., 1982) wurden mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer Jeol HX110 (Jeol, Tokio, Japan) gemessen, das mit 10 kV Beschleunigungsspannung und einer Auflösung von 1000 oder 3000 betrieben wurde. Die Probe (in 0,1% wässriger Trifluoressigsäure und 25% Acetonitril) wurde in einer Thieglycerol- und Dithiothreitolmatrix gemischt. Die Nano-Elektrospray-(Nano-ESI)-Massenspektra wurden mit einem Esquire Innenfallen-Massenspektrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) gemessen. Die RP-HPLC-gereinigte Probe, gesammelt in 0.1% wässriger Trifluoressigsäure und Acetonitril, wurde in Methanol 1% Essigsäure verdünnt, auf eine Nanospray-Kapillare übertragen und analysiert. Die Massengenauigkeit war in der Regel besser als 1000 ppm beim Flugzeit-Instrument, 200 ppm beim Innenfallen-Instrument und 20–100 ppm beim doppelt fokussierenden Massenspektrometer, je nach der Einstellung des Auflösungsvermögens des verwendeten Magnetsektorinstruments.
7. Synthese des Contulakin-G. Die Festphasen-Glykopeptid-Synthese wurde manuell unter Verwendung von Fmoc-Chemie durchgeführt, mit t-Butylether-Seitenkettenschutz für Tyrosin und Serin, N-t-Boc-Seitenkettenschutz für Lysin und t-Butylester-Seitenkettenschutz für Glutaminsäure (geschützte Aminosäuren wurden bezogen bei Bachem, Torrance, CA). Beginnend mit einem Wang-Harz, wurden die Aminosäuren mit Bop/Diisopropylethylamin/N-Methylpyrrolidon/Dichlormethan (Stewart et al., 1984; LeNguyen et al., 1986) gekoppelt, und die N-Schutzaufhebungen wurden mit N-Methylpyrrolidon/Piperidin (Stewart et al., 1984; LeNguyen et al., 1986) durchgeführt. Das Wang-Harz wurde am Salk Institute mit einer Substitution von 0,2 nmol/g zubereitet. Nach der Kopplung der ersten sechs Aminosäuren wurde das Harz mit peracetyliertem Fmoc-Oβ-D-Galp-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→O)-Threonin gekoppelt, wie an einem anderen Ort beschrieben synthetisiert (Luning et al., 1989), gefolgt von Einfachkopplung der restlichen neun Aminosäuren in der Sequenz. Es wurde darauf geachtet, Essigsäure- und Acetatverunreinigungen von den glykosylierten Aminosäuren zu entfernen; dies umschloss auch die chromatographische Reinigung auf Kieselgel unter Verwendung von Dichlormethan-Ethylacetat 4 : 1 als Eluationsmittel, die Konzentrierung und schließlich die Lyophilisierung des Produkts von Benzen. Nicht-glykosyliertes Peptid wurde ähnlich synthetisiert, wofür Fmoc-Threonin zur Anwendung kam (Bachem, Torrance, CA). Das Harz wurde Abspaltungsbedingungen ausgesetzt (95% Trifluoressigsäure/5% Anisol (Stewart et al., 1984)), und im Fall des Glykopeptids wurde das resultierende peracetylierte Glykopeptid mit RP-HPLC isoliert, wobei die Hauptkomponente m/z 2322,3 (MALD-Analyse) dem gewünschten Produkt entsprach (2322,0 Da). Nach der Lyophilisierung wurde das peracetylierte Glykopeptid mit 20 μL Natriummethoxid (Sigma, St Louis, MO) (50 mM) in trockenem Methanol eine Minute lang behandelt (um O-Acetylgruppen auf dem Zucker zu entfernen (Norberg et, al., 1994)) und bei –20°C lyophilisiert. Die de-acetylierte Probe wurde auf ein Waters Prep LC/System 500 A, ausgerüstet mit Gradient-Controller, Waters Model 450 Variable Wavelength Detector (Wellenlängenmesser) und Waters 1000 PrepPack Patronenkammer-Säule (65,5 × 320 mm), gepackt mit Vydac C₁₈ 15–20 μm Partikeln geladen. Strömungsbedingungen: Wellenlänge 230 nm, AUFS 2,0, Durchfluss 100 mL/min., Gradient 20–60% B/60 min; (wobei der A-Puffer 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und der B-Puffer 0,1% Trifluoressigsäure in 60% wässrigem Acetonitril war). Die Fraktionen (200 mL) wurden manuell gesammelt. Die Hauptkomponente, m/z 2069,9 (LSI-Analyse), entsprach dem gewünschten Produkt (2069,98 Da). Nach einer präparativen RP-HPLC-Reinigung war ausreichend gereinigtes Contulakin-G für die analytische Charakterisierung und für biologische Untersuchungen gewonnen. Eine umfassendere Charakterisierung des synthetischen Contulakin-G einschließlich ¹H NMR Daten wird an anderer Stelle vorgelegt.
8. Co-Eluierung. Das natürliche und das synthetische Contulakin-G wurden getrennt analysiert und mit RP-HPLC coeluiert, wofür eine 2,1 × 150 mm Vydac C₁₈ Säule und ein Gradient von 0,%5/Min von 0% B bis 40% B verwendet wurde (wobei der A-Puffer 0,55% Trifluoressigsäure in Wasser und der B-Puffer 0,05% Trifluoressigsäure in 90% wässrigem Acetonitril war).
9. Bindungsstudien. Das nicht-glykosylierte Thr₁₀-Contulakin-G und das synthetische Contulakin-G wurden mit dem Human-Neurotensin Typ: 1 Rezeptor (hNTRI) geprüft, wobei für alle Pipettierungsschritte in den Radioligand-Bindungs-Assays (beschrieben von Cusack et al., 1993) eine Biomek 1000 Roboter-Arbeitsstation verwendet wurde. Konkurrenz-Bindungs-Assays mit [³H] Neurotensin_1-13 (1 nM) und variierenden Konzentrationen von nicht-etikettiertem Neurotensin_1-13, nichtglykosyliertem Thr₁₀-Contulakin-G oder synthetischem Contulakin-G wurden mit Membranpräparaten von der Zelllinie HEK-293 durchgeführt. Die nichtspezifische Bindung wurde mit 1 μM nicht-etikettiertem Neurotensin_1-13 in Probenröhren mit einem Gesamtvolumen von 1 mL ermittelt. Die Inkubation dauerte 30 Minuten bei 20°C. Der Assay wurde routinemäßig durch Zugabe von kaltem 0,9% NaCl (5 × 1,5 mL) beendet, gefolgt von rascher Filtrierung durch einen GF/B-Filterstreifen, der mit 0,2% Polyethylenimin vorbehandelt worden war. Details der Bindungs-Assays wurden früher bereits beschrieben (Cusack et al., 1991). Die Daten wurden mit Hilfe des LIGAND-Programms analysiert (Munson et al., 1980).

Das nicht-glykosylierte Thr₁₀-Contulakin-G und das synthetische Contulakin-G wurden mit den Ratten-Neurotensin-Typ-1- und Typ-2-Rezeptoren (rNTR1 und rNTR2) und mit dem Maus-Neurotensin-Typ-3-Rezeptor (mNTR3) getrennt geprüft. [¹²⁵I-Tyr³]-Neurotensin_1-13 wurde wie früher beschrieben zubereitet und gereinigt (Saadoul et al., 1984). Stabile transfizierte CHO-Zellen, die entweder den rNTR1 (Tanaka et al., 1990) oder den rNTR2 (geklont im Labor von J. Mazella durch Screening einer Rattenhirn-cDNA-Bibliothek (Stratagen)) exprimierten, wurden in DMEM mit 10% Fötalkalbsserum und 0,25 mg/mL G418 (Sigma, Frankreich) gezüchtet. Zellmembranhomogenate wurden wie anfangs beschrieben präpariert (Chabry et al., 1994). Die Proteinkonzentration wurde im Bio-Rad-Verfahren mit Ovalbumin als Standard ermittelt.
10. Bindungsexperimente auf Zellmembranen. Die Membranen (25 μg für NTR2 und 10 μg für NTR1) wurden mit 0,4 nM [¹²⁵I-Tyr³] Neurotensin_1-13 (2000 Ci/mmol) und zunehmenden Konzentrationen von Neurotensin_1-13, nicht-glykosyliertem Thr₁₀-Contulakin-G oder synthetischem Contulakin-G 20 Min. bei 25°C in 250 μl von 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin und 0,8 mM 1–10-Phenanthrolin, inkubiert. Die Bindungsexperimente wurden beendet durch die Zugabe von 2 mL eiskaltem Puffer, gefolgt von der Filtrierung durch Cellulose-Acetatfilter (Sartorius) und zweimaligem Waschen. Die auf den Filtern zurückbleibende Radioaktivität wurde mit einem γ-Zähler gezählt.
11. Bindungsexperimente auf solubilisierten Extrakten. CHAPS-solubilisierte Extrakte (100 μg) wurden mit 0,2 nM [¹²⁵I-Tyr³] Neurotensin_1-13 eine Stunde lang bei at 0°C in 250 μL Tris-Glycerolpuffer, enthaltend 0,1% CHAPS, inkubiert. Gebundene Liganden wurden von freien Liganden durch Filtrierung auf mit 0,3% Polyethylenimin vorbehandelten GF/B-Filtern getrennt. Die Filter wurden rasch zweimal mit 3 mL eiskaltem Puffer gewaschen und auf Radioaktivität gezählt.
Für Bindungsexperimente auf mNTR3 wurden die Membranhomogenate vom Maushirn in 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 10% (w/v) Glycerol, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 μM Pepstatin, 1 mM Iodacetamid und 5 mM EDTA (Tris-Glycerolpuffer) re-suspendiert. Die Solubilisierung wurde durchgeführt durch die Inkubation von Homogenaten bei einer Konzentration von 10 mg/mL im Tris-Glycerolpuffer mit 0,625% CHAPS, enthaltend 0,125% CHS (Mazella et al., 1988). Solubilisierte Extrakte wurden durch Zentrifugierung bei 100.000 × g während 30 Min. bei 4°C gewonnen und entweder sofort verwendet oder bei –20°C gespeichert.
12. Phosphoinositid-Bestimmung. Zellen, die den rNTR1 oder den NTR2 exprimieren, wurden in 12-Schalen-Platten 15–18 Stunden lang in Anwesenheit von 1 μCi Myo-[³H]inositol (ICN) in einem Serum-freien HAM's-F-1O-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden mit Earle-Puffer, pH 7,5, (25 mM Hepes, 25 mM Tris, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0, 8 mM MgCl₂, 5 mM Glucose), der 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, gewaschen und 15 Min. lang bei 37°C in 900 μl von 30 mM LiCl in Earle-Puffer inkubiert. Neurotensin_1-13 wurde dann mit den angezeigten Konzentrationen 15 Min. lang hinzugefügt. Die Reaktion wurde mit 750 μL eiskaltem 10 mM HCOOH, pH 5,5, angehalten. Nach 30 Min. bei 4°C wurde der Überstand abgeschöpft und mit 2,5 mL von 5 mM NH₄OH neutralisiert. Die gesamten [³H]Phosphoinositide (PIs) wurden vom freien [³H]inositol auf Dowex AG-X8 Chromatographie (Bio-Rad) (van Renterghem et al., 1988) durch die aufeinanderfolgende Eluierung mit 5 mL Wasser und 4 mL von 40 mM und 1 M Ammoniumformat, pH 5,5, getrennt. Die in der 1-M-Fraktion enthaltene Radioaktivität wurde nach Zugabe von 5 mL Ecolum (ICN) gezählt.
13. Identifizierung eines cDNA-Klons, der Contulakin-G codiert. Contulakin-G-codierende Klone wurden aus einer größenfraktionierten cDNA-Bibliothek selektiert, die unter Verwendung von mRNA konstruiert wurde, die aus einem Conusgeographus-Venenum-Gang wie früher beschrieben (Colledge et al., 1992) gewonnen wurde. Die Bibliothek wurde mit einer spezifischen Sonde gescreened, welche den Aminosäuren #10–15 des Peptids entspricht (5'- ATR ATN GGY TTY TTN GT-3'; SEQ ID NO: 3). Das Oligonukleotid wurde endmarkiert, hybridisiert, und ein Sekundär-Screening durch Polymerase-Kettenreaktion wurde an 10 Klonen durchgeführt, die zu dieser Sonde hybridisierten, wie früher beschrieben (Jimenez et al., 1996). Die im Sekundär-Screening identifizierten Klone wurden für die DNA-Sequenzierung präpariert, wie früher beschrieben (Monje et. al., 1993). Die Nukleinsäure-Sequenz wurde gemäß dem Standardprotokoll für das Sequenase Version 2.0 DNA Sequenzierungs-Kit bestimmt, wie früher beschrieben (Jimenez et al., 1996).
BEISPIEL 2
Reinigung des Contulakin-G
Eine Fraktion des Conus-geographus-Venenums wurde entdeckt, die Mäuse zunehmend träge machte. Wenn sitzende Mäuse mit einem Stäbchen angestoßen werden, springen sie normalerweise sofort auf und laufen eine beträchtliche Distanz. Nach i. c. v.-Injektion der Fraktion von Conus geographus, wie in 5 angezeigt, mussten die Mäuse wesentlich kräftiger angestoßen werden, ehe sie sich überhaupt erhoben, und nach dem Aufstehen gingen sie einen oder zwei Schritte und setzten sich gleich wieder hin. Dieses "träge Verhalten" wurde durch mehrere Reinigungsschritte hindurch beobachtet, und das offensichtlich homogene Peptid wurde weiter analysiert. Dieses Peptid wurde als Contulakin-G bezeichnet (das Filipino-Wort tulakin' bedeutet "muss geschoben oder gestoßen werden," vom Wurzelwort "tulak" = schieben). Das "G" weist darauf hin, dass das Peptid vom Conus geographus stammt.
BEISPIEL 3
Biochemische Charakterisierung des gereinigten Contulakin-G
Die versuchte Aminosäuresequenz-Analyse des gereinigten Peptids ergab, dass das Peptid am N-Terminus blockiert war. Da die meisten N-terminal blockierten Conus-Peptide einen Pyroglutamatrest an der Position 1 haben, wurde das Peptid mit Pyroglutamat-Aminopeptidase behandelt. Dies hatte eine Verschiebung der Retentionszeit zur Folge, was die Entfernung eines Pyroglutamatrests nahe legte. Nach der Enzymbehandlung wurde mittels Standard-Edman-Methoden die Sequenz Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Xaa-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 4) gewonnen, was die Entfernung des Pyroglutamatrests bestätigte, wobei Xaa anzeigt, dass im 9. Zyklus (an Position 10) keine Aminosäure zugeteilt wurde, obwohl ein sehr schwaches Signal für Threonin erhalten wurde. Die Aminosäureanalysen waren konsistent zur Anwesenheit eines Threoninrests im Peptid.
Um die Art des Aminosäurerests in Position 10 zu bestätigen, wurde ein cDNA-Klon isoliert, welcher das Peptid codierte. Die Nukleotidsequenz und vom Klon aufgezeigte, mutmaßliche Aminosäuresequenz sind in Tabelle 1 und in SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Die Aminosäuresequenz des Contulakin-G, welche durch direkte Edman-Sequenzierung gewonnen wurde, wird codiert gegen das C-terminale Ende des einzigen signifikanten offenen Leserahmens im Klon (an den Resten 51–66) vorgefunden; die prognostizierte Aminosäuresequenz ergibt, dass Position 10 des reifen Peptids (Rest 60 des Vorläufers) von einem Codon für Threonin codiert ist. So ergibt die Edman-Sequenzierung gemeinsam mit den Klonierungsergebnissen, dass ein modifizierter Threoninrest an Position 10 vorhanden war.
TABELLE 1 DNA- (SEQ ID NO: 5) und Peptid- (SEQ ID NO: 6) Sequenzen des Contulakin-G
Massenspektrometrische Analysen (MALD, LSI und nano-ESI) der gereinigten Contulakin-G-Fraktion ergaben unterschiedliche intakte Spezies, so wie in Tabelle 2 zusammengefasst. Mit unterschiedlichen Ionisierungstechniken wurden Variationen in der Intensität der unterschiedlichen Spezies beobachtet, die Unterschieden in der Vorspannung (Craig et al., 1994) bei den einzelnen Ionisierungstechniken zugeschrieben wurden. In der folgenden Analyse haben wir uns auf das wichtigste mit allen probierten Ionisierungstechniken beobachtete Glykoform mit intakter Masse M₁ = 2069 konzentriert. Der Unterschied zwischen der beobachteten Masse (2069 Da) und der für die Sequenz berechneten Masse unter der Annahme von Thr an Rest 10 (1703,83 Da) war 365 Da. Da eine mögliche Modifikation von Threonin die O-Glykosylierung ist, haben wir auf der Grundlage dieser Massendifferenz vorgeschlagen, dass der unidentifizierte Rest Hexose-N-Acetyl-Hexosamin-Threonin (Hex-HexNAc-Thr) war, was eine Addition von 365,13 Da ergäbe. Die beobachteten Massen (Tabelle 2) sind konsistent mit der berechneten monoisotopen Masse des [M₁ + H]⁺ oder [M₁ + 2H]²⁺ des vorgeschlagenen Disaccharid-verknüpften Peptids (2069,98 bzw. 1035,5 Da). Intensive Fragment-Ionen wurden in dem Nano-ESI MS/MS Massenspektrum des doppelt geladenen, intakten [M₁ + 2H]²⁺ Molekül-Ions von Contulakin-G beobachtet (6), entsprechend dem Verlust des kompletten Hex-HexNAc-Glykans (als ρ(χ₈)₁₀ (Craig et al., 1993) bezeichnet) oder dem Verlust des terminalen Hexose-Rests (ρ(χ₈)₁₀).
TABELLE 2 Spezies, die mit MALD, LSI und Nano-ESI-Analyse des gereinigten Contulakin-G beobachtet wurden
BEISPIEL 4
Nachweis, dass Thr₁₀ O-Glykosyliert ist
Natürliches Contulakin-G wurde mit von Rindertestes isolierter β-Galaktosidase behandelt. Dieses Enzym hydrolysiert vorzugsweise terminale β 1→3 Galaktopyranosyl-Reste aus dem nicht-reduzierenden Ende von Glyko-Paarlingen. Nach der β-Galaktosidase-Behandlung der natürlichen Probe wurde auf RP-HPLC eine neue Komponente beobachtet. Diese Komponente wurde gesammelt und mit MALD-MS analysiert, wobei eine Spezies bei m/z 1907 beobachtet wurde. Die Unterschiede in der Masse und Spezifität des Enzyms sind konsistent mit einem terminalen Galaktoserest, der abgegeben wird. Auf Basis der Ergebnisse der β-Galaktosidase-Hydrolyse argumentierten wir, dass der Glykan-Anteil auf eine O-Glykosidase-Behandlung ausrechen könnte, die das an das Serin oder Threonin als Kerneinheit von Glykopeptiden gebundene Disaccharid Gal(β 1→3)GalNAc(α1→) befreit. Die O-Glykosidase-Behandlung des natürlichen Contulakin-G ergab in der Tat eine neue Spezies, nachdem die Enzymhydrolysemischung auf RP-HPLC analysiert wurde. Die neue Komponente wurde gesammelt und mit MALD-M5 analysiert, wobei eine m/z 1704 Spezies beobachtet wurde, die konsistent mit dem Verlust von Hex-HexNAc war (d. h. die Masse war konsistent mit jener, die für das Peptid mit einem unmodifizierten Threoninrest an Position 10 prognostiziert wurde). Die Enzymhydrolyse-Ergebnisse sind konsistent mit der Anwesenheit eines Gal(β 1→3)GalNAc(α1→) Glykans. Auf Basis der O-Glykosidase- und der β-Galaktosidase-Hydrolyse-Ergebnisse ist die Struktur des häufigsten Glykopeptids:
BEISPIEL 5
Synthese des nicht-glykosylierten und glykosylierten Contulakin-G
Das nicht-glykosylierte 16-Aminosäure-Peptid wurde chemisch synthetisiert. Das synthetische Material wies auf RP-HPLC die selbe Retentionszeit wie das enzymatisch entglykosylierte Contulakin-G auf. Das glykosylierte 16-Aminosäure Contulakin-G mit an Thr₁₀ gebundenem Gal(β 1→3)GalNAc(α1→) wurde ebenfalls synthetisiert. Dieses synthetische glykosylierte Contulakin-G co-eluierte mit dem natürlichen Contulakin-G auf RP-HPLC. Die für das natürliche ebenso wie für das synthetische Contulakin-G beobachteten Fragmentierungsspektren für den Zerfall nach der Quelle zeigten sehr ähnliche Fragmentierungsmuster.
BEISPIEL 6
Die biologische Potenz von synthetisch glykosyliertem und nicht-glykosyliertem Contulakin-G
Der Verlust an motorischer Kontrolle, für den das natürliche Contulakin-G ursprünglich isoliert wurde, zusammen mit Darmkontraktion, Abwesenheit von Putz-/Pflegehandlungen und herabgesetzter Empfindlichkeit auf Schwanzdruck waren Anzeichen, die nach einer Verabreichung icv von Neurotensin_1-13, nicht-glykosyliertem Thr₁₀-Contulakin-G oder synthetischem Contulakin-G beobachtet wurden. Um diese Beobachtungen detaillierter zu untersuchen, wurde ein Dosisreaktionsvergleich gemäß Tabelle 3 durchgeführt. Während das nicht-glykosylierte Thr₁₀-Contulakin-G-Rnalog bei Dosen von 1 nmol und höher wirksam war, war es bei 300 pmol-Dosen unwirksam. Zum Unterschied dazu, zeigte sich, dass Contulakin- G den Verlust motorischer Kontrolle bei Dosierungen von 30 pmol oder etwa 5 pmol/g auslöste.
TABELLE 3 Wirkung einer icv Verabreichung von Neurotensin_1-13 Thr₁₀-Contulakin-G und Contulakin-G an 14–18 Tage alte Mäuse
Die sechs C-terminalen Aminosäuren des Contulakin-G zeigen eine signifikante Ähnlichkeit mit den Sequenzen von Neurotensin_1-13, Neuromedin, Xenin und dem C-Terminus von Xenopsin (vgl. Tabelle 4). Aufgrund der ähnlichen beobachteten Anzeichen, wenn entweder Contulakin-G oder Neurotensin_1-13 icv verabreicht wurden, und der signifikanten Homologie zwischen Contulakin-G und Neurotensin_1-13 prüften wir die Affinität von Contulakin-G für eine Reihe der geklonten Neurotensin-Rezeptoren. Wie in Tabelle 5 dargestellt, zeigte sich, dass das nicht-glykosylierte Thr₁₀-Contulakin-G-Analog den Human-Neurotensin-Typ-I-Rezeptor (hNTR1) mit 10-fach geringerer Affinität band als Neurotensin_1-13, und noch geringeren Affinitäten für die anderen NT's. Das Contulakin-G zeigte eine signifikant geringere Affinität als das nichtglykosylierte Thr₁₀-Contulakin-G-Analog für alle getesteten NT's.
Sowohl Contulakin-G wie das nicht-glykosylierte Thr₁₀-Contulakin-G-Analog wirkten als Agonisten, wenn sie auf CHO-Zelllen getestet wurden, die den rNTR1 exprimierten. Keine Reaktion wurde mit CHO-Zellen beobachtet, die den rNTR2 exprimieren. Das nicht-glykosylierte Thr₁₀-Contulakin-G-Analog ergab geringfügig niedrigere Potenz (0,6 nM) aber mit ähnlicher Wirksamkeit im Vergleich zu Neurotensin_1-13. Die Potenz des synthetischen glykosylierten Contulakin-G war signifikant geringer (20–30 nM), und die agonistische Wirksamkeit war annähernd halb so groß wie die für Neurotensin_1-13 beobachtete.
TABELLE 4 Sequenzvergleich von Contulakin-G und Mitgliedern der Neurotensin-Familie der Peptide
Referenzen (1) Carraway et al., 1973; (2) Minamino et al., 1984; (3) Araki et al., 1973; (4) Feurle et al., 1992.
TABELLE 5 Vergleich der Bindungsaffinität von Neurotensin_1-13, Thr₁₀-Contulakin-G und Contulakin-G für den geklonten Human- und Ratten-Neurotensin-Typ-1-Rezeptor (NTR1), den Ratten-Neurotensin-Typ-2-Rezeptor (rNTR2) und den solubilisierten Maus-Neurotensin-Typ-3-Rezeptor (mNTR3)
BEISPIEL 7
Biologische Wirksamkeit der Contulakin-G-Analoge
Die biologische Wirkung verschiedener Peptid-Analoge des Contulakin-G wurde auf ähnliche Weise durch Icv-Injektion in Mäusen getestet wie oben beschrieben. Diese Peptide wurden wie hier beschrieben synthetisiert und enthalten folgende Analoge:
Ser₁₀-Contulakin-G, welches die natürliche Glykosylierung auf Ser₁₀ (Analog A) enthält; und
Δ1-9-Ser₁₀-Contulakin-G, welches die natürliche Glykosylierung auf Ser₁₀ (Analog B) enthält.
Es stellte sich heraus, dass das Analog A etwas aktiver war als das natürliche Contulakin-G. Es zeigte sich auch, dass das Analog B die selbe Wirksamkeit d. h. Wirkungseintritts- und Erholungszeiten hatte als das Analog A, wenn es in zwei Wochen alten Mäusen in einer Dosis von 100 pmol getestet wurde. In diesem Test waren die Mäuse noch immer nicht in der Lage, sich nach 75 Minuten aufzurichten. Bei Tests in drei Wochen alten Mäusen mit Dosierungen von 1 nmole und 300 pmole wurde zwischen den Analogen die selbe Wirkung festgestellt und erwiesen sich diese Mäuse während 100 Minuten als schläfrig. Diese Experimente zeigen, dass glykosylierte Contulakin-G-Analoge, in denen N-terminale Aminosäurereste entfernt wurden, ihre Wirkung behalten. Ähnliche Ergebnisse werden bei anderen Analogen erzielt, beispielsweise bei Δ1-5-Ser₆-Contulakin-G, welches die natürliche Glykosylierung auf Ser₆ mit oder ohne die natürliche Glykosylierung auf Thr₁₀ enthält. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Platzierung eines glykosylierten Serinrests proximal zu der Stelle der Kürzung aktive Analoge ergibt.
Das oben charakterisierte Conus-Peptid Contulakin-G besitzt ein neuartiges biochemisches Merkmal- ein post-translational O-Glykosyliertes Threonin, das zuvor in Conus-Peptiden nicht gefunden wurde. Unter Einsatz von Massenspektrometrie und spezifischer enzymatischer Hydrolysen wurde entdeckt, dass Thr₁₀ mit dem Disaccharid Gal (β 1→3)GalNAc(α1→) modifiziert war. Die entsprechenden glykosylierten und nichtglykosylierten Formen des Contulakin-G wurden synthetisiert, was die molekulare Struktur dieser wichtigen glykosylierten Form des natürlichen Moleküls auf Basis von RP-HPLC-Co-Eluierungs- und MS-Fragmentierungs-Kriterien bestätigte. Die Massen der anderen weniger bedeutenden, mit Massenspektrometrie beobachteten Molekül-Spezies sind konsistent mit Glykan-strukturalen Variationen an peripheren Stellen auf der charakterisierten Oligosaccharid-Kerneinheit (Baenziger, 1994).
Eine Analyse eines das Contulakin-G codierenden cDNA-Klons ergibt, dass die Präpropeptid-Organisation des Contulakin-G-Vorläufers ähnlich dem anderer Conus-Peptidvorläufer ist (Olivera et al., 1997). Es findet sich eine typische Signalsequenz, und unmittelbar N-terminal zu der Contulakin-G-Sequenz befinden sich zwei basische Aminosäuren, die vermutlich eine proteolytische Abspaltung signalisieren, um den N-Terminus des reifen Peptids zu generieren (der Glutaminrest würde entweder spontan oder aufgrund der Wirkung der Glutaminylcyklase (Fischer et al., 1987) zu Pyroglutamat zyklieren). Obwohl der Contulakin-G-Vorläufer-in den meisten Belangen die selbe Organisation wie alle anderen Conus-Venenum-Peptidvorläufer aufweist und eine gleichartige Verarbeitung zu prognostizieren wäre, sind die vom Klon prognostizierten zehn C-terminalen Aminosäuren in vom Venenum gereinigtem Contulakin-G nicht vorhanden. Eine Möglichkeit besteht darin, dass der Klon eine unterschiedliche Variante darstellt, beispielsweise eine, die anders gespleißt war. Es könnte aber auch weitere proteolytische Verarbeitung am C-Terminus erforderlich sein, um reifes Contulakin-G zu generieren.
In den letzten 20 Jahren wurde eine zunehmende Zahl von biologisch bedeutenden Glykopeptiden und Glykoproteinen identifiziert. Das zuerst von Pisano et al. (Yoshida et al., 1976) identifizierte Vespulakinin 1 ist unserer Kenntnis nach das einzige andere O-glykosylierte Peptid-Toxin, das von einem anderen als dem Conus-Venenum isoliert wurde. Vespulakinin 1 wurde aus den Venenumtaschen der Gelben Jacket-Wespe ("Eastern Jacket"; Vespula maculifrons) extrahiert. Das Peptid (TAT*T*RRRGRPPGFSPFR-OH (SEQ ID NO: 12), bei dem der Asteriskus einen O-verknüpften, glykosylierten Threoninrest anzeigt) enthält zwei sequenzielle Stellen O-verknüpfter Glykosylierung. Der C-Terminus des Vespulakinin ist identisch mit der Sequenz des Bradykinin (RPPGFSPFR-OH (SEQ ID NO: 13)), und das Peptid rief eine Anzahl Zeichen ab, die auch von Bradykinin abgerufen wurden. Vespulakinin ist deshalb ein weiteres Beispiel eines O-verknüpften, glykosylierten Peptid-Toxins, in dem der C-Terminus auf einen Säugetier-Neurotransmitter-Rezeptor abzuzielen scheint. Folglich enthalten sowohl Contulakin-G wie auch Vespulakinin I glykosylierte, N-terminale Erweiterungen zu Sequenzen mit sehr hoher Homologie zu Säugetier-Neuropeptiden. κA-conotoxin SIVA, ein K⁺-Kanalhemmer, ist ungewöhnlich unter den Disulfid-reichen Conus-Peptiden als Besitzer eines langen N-terminalen Schwanzes, der einen O-Glykosylierten Rest besitzt (Craig et al., 1998).
Für die meisten Conus-Peptide scheint eine spezifische Konformation entweder durch mehrere Disulfid-Verknüpfungen oder durch die entsprechende Beabstandung der γ-Carboxyglutamatreste stabilisiert zu sein, um die Bildung von α-Wendeln zu fördern (Olivera et al., 1990). Conus-Peptide ohne mehrere Disulfide umfassen eine höchst eklektische Gruppe von Familien, einschließlich der Conopressine, Conantokine, Contryphane und jetzt des Contulakin-G. Die Conopressine sind wahrscheinlich endogene Molluskel-Peptide, deutlich homolog zu der Vasopressin/Oxytocin-Familie der Peptide; diese sind in Molluskelgeweben weiter verbreitet als in Conus-Venenum-Gängen. Allerdings können die anderen Nicht-Disulfid-reichen Peptide (Conantokine, Contryphane und Contulakin-G) spezialiserte Venenum-Peptide sein, die ungewöhnliche posttranslationale Modifikationen zeigen. Zusätzlich zu dem O-glykosylierten Threonin-Anteil des hier beschriebenen Contulakin-G wurden γ-Carboxylierung von Glutamatresten und die post-translationale Epimerisierung und Bromierung von Tryptophan-Resten in Conantokinen und Contryphanen entdeckt.
Es gibt mehrere Hinweise darauf, dass Contulakin-G das erste Mitglied der Neurotensin-Familie von Peptiden ist, das von einer Invertebraten-Quelle isoliert wird. Zunächst zeigt der C-terminale Bereich des Contulakin-G ein auffälliges Ausmaß an Ähnlichkeit zu anderen Mitgliedern der Neurotensin-Familie (alle von Vertebraten), wie in Tabelle 4 dargestellt. Des weiteren wurde oben gezeigt, dass Contulakin-G um die Bindung an drei bekannte Neurotensin-Rezeptor-Subtypen konkurriert; auch Nachweise, dass Contulakin-G als Rgonist auf einem geklonten Neurotensin-Rezeptor wirkt, wurden oben präsentiert. Am überzeugendsten ist aber die Tatsache, dass Contulakin-G, wenn es in Mause injiziert wird, die selben Verhaltenszeichen auslöst wie mit der Verabreichung von Neurotensin. Damit sind strukturelle Daten, Bindungsdaten und In-vivo-Verhaltenssymptomatologien sämtlich konsistent mit der Zuweisung von Contulakin-G zu der Neurotensin-Familie der Peptide.
Ohne Zweifel sind sowohl Contulakin-G wie das nichtglykosylierte Thr₁₀-Contulakin-GrNTR1-Agonisten bei physiologisch relevanten Konzentrationen (20–30 bzw. 0,6 nM). Die beobachteten agonistischen Wirkungen von Contulakin-G und dem nicht-glykosylierten Analog sowie die Abwesenheit aller agonistischer Effekte dieser Liganden auf CHO-Zellen, die rNTR2 exprimieren, korrelieren unter Anwendung des IP-Akkumulierungs-Assays nicht mit den In-vitro-Bindungsdaten; beide Peptide sind Agonisten mit Konzentration, die wesentlich niedriger sind als ihre IC₅-Bindungsaffinität (524 bzw. 79 nM). Angesichts seiner offensichtlich niedrigeren Bindungsaffinität ist deshalb die erhöhte Potenz von glykosyliertem Contulakin-G im Vergleich zu dem nichtglykosylierten Analog nach Icv-Verabreichung höchst unerwartet.
Die Rolle des Glykans ist deshalb etwas paradox. In vitro erhöht das Glykan weder die Bindungsaffinität, noch die agonistische Potenz noch die agonistische Wirksamkeit. Im Gegensatz dazu erhöht das Glykan in vivo signifikant die Potenz des Peptids. Eine einfache Erklärung dafür ist, dass die erhöhte Potenz des Contulakin-G im Vergleich zu dem nichtglykosylierten Analog auf erhöhte Stabilität zurückzuführen ist. Ein Alternativmechanismus für die erhöhte Potenz ist der vom Glykan erleichterte Transport zur Wirkstelle. Außerdem kann das glykosylierte Peptid mit hoher Affinität auf einen bisher undefinierten Neurotensin-Rezeptor-Subtyp (Tyler et al., 1998) wirken oder ein selektiver Ligand hoher Affinität für einen bestimmten Zustand eines Neurotensin-Rezeptor-Subtyps sein. Eine weitere Möglichkeit liegt darin, dass die relevanten fokussierten Neurotensin-Rezeptoren eng mit Kohlenhydrat-Bindungsstellen co-lokalisiert sein können und dass das Glykan als "Adressenetikett" dienen kann – ein Mechanismus, wie er für bestimmte Opiat-Peptide postuliert wird. Vorläufige Daten, welche die Hypothese der erhöhten Stabilität unterstützen, wurden gewonnen – der proteolytische Abbau des Contulakin-G wird durch die Anwesenheit der Glykan-Komponente gehemmt. Die erhöhte Stabilität kann gut zu einer verstärkten Versorgung mit dem Glykopeptid am Rezeptor führen. Allerdings verlangt die verstärkte, von der O-Glykosylierung vermittelte In-vivo-Potenz des Contulakin-G eindeutig eine ausgeglichenere Evaluierung der oben skizzierten Möglichkeiten.
BEISPIEL 8
Materialien und Methoden zur Bewertung der analgetischen Wirkung des Thr₁₀-Contulakin-G

1. Akuter Schmerz (heiße Platte). Thr₁₀-Contulakin-G (CGX-1063) oder ein Bindemittel wurde intracerebroventrikular (icv) in einem Volumen von 5 μl verabreicht. Fünfzehn Minuten nach der Injektion wurden die Tiere auf eine 55°C heiße Platte gesetzt. Die Latenz bis zur ersten Reaktion (zurückzucken), eine spinal vermittelte Verhaltensreaktion, und das erste Hinterbeinlecken, eine zentral organisierte motorische Reaktion auf akute Schmerzen, wurden protokolliert. Die Mäuse wurden nach 60 Sekunden von der heißen Platte entfernt, wenn keine Reaktion beobachtet wurde. Unmittelbar bevor sie auf die heiße Platte gesetzt wurden, wurden die motorischen Funktionen durch Feststellung der Latenz bis zum ersten Fallen von einem beschleunigenden Rotorod getestet.
2. Dauerschmerz (Formalin-Test). Intrathekale (it) Medikamentinjektionen wie von Hyldon und Wilcox (1980) beschrieben, wurden durchgeführt. CGX-1063 (10 oder 100 pmol) oder ein Trägerstoff wurden in einem Volumen von 5 μl verabreicht. Fünfzehn Minuten nach der i. t. Injektion wurde die rechte Hinterpfote mit 20 μl 5%-Formalin injiziert. Die Tiere wurden in durchsichtige Plexiglaszylinder mit Spiegelrückseiten zur leichteren Beobachtung untergebracht. Die Tiere wurden 2 Minuten lang pro 5-Minutenperiode genau beobachtet, und die Zeit, die das Tier mit dem Ablecken der injizierten Pfote verbrachte, wurde auf diese Weise insgesamt 45–50 Minuten lang protokolliert. Die Ergebnisse sind als Leckzeit in Sekunden pro fünf Minuten notiert. Mit dem Ende des Experiments wurden alle Tiere auf ein sich beschleunigendes Rotorod gesetzt und die Latenz bis zum ersten Fallen protokolliert.
2. Neuropathischer Schmerz. Das Modell der partiellen Hüftnervligatur wurde verwendet, um die Wirksamkeit von CGX-1063 bei neuropathischen Schmerzen zu bewerten. Die Nervenverletzung wurde nach den Methoden von Malmberg und Basbaum (1998) herbeigeführt. Die Tiere wurden mit einer Ketamin/Xylazin-Lösung anästhetisiert, der Hüftnerv wurde exponiert und mit einer 8-0 Seidennaht um 1/3 bis 1/2 des Nervs fest ligiert. Bei scheinoperierten Mäusen wurde der Nerv exponiert, aber nicht ligiert. Die Tiere konnten sich mindestens 1 Woche lang erholen, bevor der Test ausgeführt wurde. Am Tag des Tests wurden die Tiere in Plexiglaszylinder auf ein Drahtgittergestell gesetzt und durften sich mindestens 60 Minuten eingewöhnen. Die mechanische Allodynie wurde mit geeichten Von-Frey-Filamenten gemessen, wofür die Auf-Ab-Methode wie von Chaplan et al. (1994) beschrieben zur Anwendung kam, und die 50% Rückzugsschwelle wurde berechnet. Tieren, die auf keinen der Fäden in der Serie reagierten, wurde ein Maximalwert von 3,6 Gramm zugeordnet, bei dem es sich um den Faden handelt, der typischer Weise das Hinterglied ohne Abbiegen anhob und ungefähr 1/10 des Tiergewichts entspricht.

BEISPIEL 9
Analgetische Wirkung von Thr₁₀-Contulakin-G
CGX-1063 (10 fmol-10 nmol, icv) erhöhte dosisabhängig die Latenz bis zum ersten Hinterpfotenlecken und zur ersten von der heißen Platte ausgelösten Reaktion (7A–7B). Interessant ist der Unterschied in der Potenz von CGX-1063 bei der Erhöhung der Latenz bis zum ersten Hinterpfotenlecken im Vergleich zu der Latenz zur ersten Reaktion. CGX-1063 erhöhte ebenfalls dosisabhängig die Latenz bis zum ersten Fallen auf dem Rotorod (7C). Allerdings schien diese augenscheinliche motorische Beeinträchtigung nicht das Ergebnis des Verlusts der motorischen Funktion zu sein, da die Tiere zu normalen lokomotorischen Aktivitäten fähig waren, wenn sie stimuliert wurden. So stellte sich die Wirkung des CGX-1063 auf der heißen Platte unzweideutig als analgetischer Effekt dar.
CGX-1063 (10 oder 100 pmol, it) verringerte dosisabhängig und signifikant die zweite Phase des Formalin-Tests (8A). Interessanter Weise war die niedrigere Dosierung (10 pmol) wirksamer für die Verringerung der Erstphasen-Reaktionszeit als die höhere Dosierung. Dies wird in zukünftigen Experimenten noch detaillierter untersucht. Nach i. t. Verabreichung zeigten CGX-1063-behandelte Tiere keine motorischen Beeinträchtigungen im Vergleich mit Trägerstoffbehandelten Tieren (8B), was darauf hinweist, dass die Wirkung von icv CGX-1063 (wie oben im Heißplattentest beobachtet) auf die motorische Beeinträchtigung in höheren Gehirnregionen und nicht spinal vermittelt wird, und dass die analgetischen Wirkungen des CGX-1063 durch Verwendung dieser Verabreichungsroute (it) von der motorischen Toxizität getrennt werden können. Die Abwärtsverschiebung der Rotorod-Werte im Vergleich zu jenen von Tieren, die in dem Heißplattentest verwendet wurden, widerspiegelt eine Gesamtbeeinträchtigung dieser Tiere infolge Formalininduzierter Allodynie und Entzündung der Hinterpfote.
Eine Woche nach der partiellen Ligatur des Hüftnervs zeigten die Tiere eine markante Senkung der Pfotenrückzugsschwelle auf der operierten Seite (ipsilateral) in Relation zur nicht-operierten Seite (contralateral), ein Hinweis auf eine Erhöhung der Empfindlichkeit auf mechanische Stimuli (9). Die intrathekale Verabreichung von CGX-1063 (100 pmol) erhöhte dramatisch die Rückzugsschwelle auf der ligierten Seite (eine annähernd sechsfache Steigerung). Interessanter Weise war die mechanische Schwelle auf der contralateralen Seite nicht signifikant verändert. In scheinoperierten Tieren zeigte sich kein Unterschied in der Rückzugsschwelle zwischen operierten und nichtoperierten Seiten. Nach intrathekalem CGX-1063 war die Rückzugsschwelle in beiden Hinterpfoten dieser Tiere gleichmäßig erhöht.
Die vorliegenden Daten zeigen, dass CGX-1063 hochwirksame analgetische Eigenschaften bei drei allgemein verwendeten Schmerzmodellen besitzt: akut, anhaltend/entzündlich und neuropathisch. Das zentral (icv) verabreichte CGX-1063 reduzierte dosisabhängig die Reaktionslatenz im Heißplattenmodell für akuten Schmerz und war im Bereich von niedrigen Picomol bis zu hohen Femtomol wirksam. Wie die vorläufigen Daten zeigen, ist die analgetische Wirkung des CGX-1063 in diesem Modell nicht durch einen Opioid-Mechanismus vermittelt. CGX-1063 war auch wirksam in der Reduzierung der nozizeptiven Aktivität im Formalinmodell von anhaltenden/Entzündungsschmerzen. CGX-1063 reduzierte dosisabhängig die zweite (entzündliche) Phase- des Formalin-Tests, und bei der niedrigeren Dosierung wurde die Phase-Eins-Aktivität reduziert. Schließlich zeigte CGX-1063 eine tiefgehende analgetische Wirkung in einem Modell neuropathischer Schmerzen. Die mechanischen Rückzugschwellen in diesem Modell wurden im Vergleich zu Vor-Behandlungswerten nahezu sechsfach gesteigert, während die Empfindlichkeit in der unverletzten Pfote unverändert blieb, was möglicherweise darauf hinweist, dass CGX-1063 neuropathische Allodynie reduziert, während die normale Reizübertragung nicht beeinträchtigt wird.
BEISPIEL 10
Materialien und Methoden zur Bewertung der analgetischen Wirkung von Contulakin-G

1. Akuter Schmerz (Schwanzzucken). Das Medikament (Contulakin-G (CGX-1160) oder Thr₁₀-Contulakin-G (CGX-1063)) oder Salzlösung wurden intrathekal (i. t.) nach dem Verfahren von Hylden und Wilcox in einem konstanten Volumen von 5 μl verabreicht (Hylden und Wilcox, 1980). Mäuse wurden vorsichtig in ein Handtuch gewickelt, so dass der Schwanz exponiert war. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der i. t. Injektion wurde der Schwanz in ein Wasserbad mit 54°C getaucht, und die Zeit bis zu heftigem Schwanzrückzug wurde protokolliert. Fand bis 8 Sekunden kein Rückzug statt, wurde der Schwanz heraus genommen, um eine Gewebsschädigung zu verhindern.
2. Anhaltender Schmerz (Formalin-Test). CGX-1160, CGX-1063 (1, 10 oder 100 pmol), Neurotensin (NT) (1, 10, 100 oder 10000 pmol) oder ein Trägerstoff wurden i. t. in einem Volumen von 5 μl verabreicht. Fünfzehn Minuten nach der i. t Injektion wurde die rechte Hinterpfote mit 20 μl 5%-Formalin injiziert. Die Tiere wurden in durchsichtigen Plexiglaszylindern untergebracht, die zur besseren Beobachtung mit Spiegeln versehen waren. Die Tiere wurden 2 Minuten lang pro 5-Minutenperiode genau beobachtet, und die Zeit, die das Tier mit dem Ablecken der injizierten Pfote verbrachte, wurde auf diese Weise insgesamt 45–50 Minuten lang protokolliert. Die Ergebnisse sind als Leckzeit in Sekunden pro fünf Minuten notiert. Mit dem Ende des Experiments wurden alle Tiere auf ein sich beschleunigendes Rotorod gesetzt und die Latenz bis zum Fallen protokolliert.
3. Chronische entzündliche Allodynie (CFA-Modell). Die Mäuse erhielten intraplantare (i. pl.) Injektionen von 20 μl CFA in die rechte Hinterpfote und kehrten in ihren Heimkäfig zurück. Drei Tage später wurden die Mäuse in Plexiglaszylinder auf ein Drahtgittergestell gesetzt und durften sich mindestens 60 Minuten eingewöhnen. Die mechanische Allodynie wurde mit geeichten Von-Frey-Filamenten gemessen, wofür die früher beschriebene Auf-Ab-Methode (Chaplan et al., 1994) zur Anwendung kam, und die 50% Rückzugsschwelle wurde berechnet. Tieren, die auf keinen der Fäden in der Serie reagierten, wurde ein Maximalwert von 3,6 Gramm zugeordnet, bei dem es sich um den Faden handelt, der typischer Weise das Hinterglied ohne Abbiegen anhob und ungefähr 1/10 des Tiergewichts entspricht.
4. Toxizitäts-Tests. Zur exakten Bewertung der motorischen Beeinträchtigungswirkungen von CGX-1160, CGX-1063 und NT wurden 50 Mäuse in Gruppen eingeteilt, die i. t. CGX-1160 oder CGX-1063 (1, 10, 100, 500 und 1000 pmol), NT (0, 1, 1, 10 und 100 nmol) oder Salzlösung erhielten (n = 5 pro Gruppe, ausgenommen die höchste Dosierung jeder Verbindung, wo n = 3). Beginnend 15 Minuten nach der Injektion, wurden die Tiere auf ein beschleunigendes Rotorod gesetzt und die Latenz bis zum ersten Fallen protokolliert. Die Tiere wurden erneut getestet nach 30, 60, 120, 240 und 300 Minuten (oder bis die Latenz zum Fallen auf Kontrollwerte zurück gekehrt war).

Zu den gleichen Zeitpunkten wurde in diesen Tieren auch die Rektaltemperatur protokolliert.
BEISPIEL 11
Analgetische Wirkung des Contulakin-G
CGX-1160 erhöhte dosis-abhängig die Schwanz-Zuckungslatenz (10A) mit einem Zeit-bis-Maximalwert-Effekt (Time-to-peak) von <30 Minuten (die früheste Testzeit, 10B). Außerdem hielt die Zunahme der Latenz lange an, bei erhöhten Rückzugszeiten 5 Stunden nach der Injektion, die 24 Stunden nach der Injektion zum Ausgangswert zurück kehrten (10B). CGX-1063 zeigte auch eine dosis-abhängige, wenngleich variablere Zunahme der Rückzugslatenz und in diesem Modell nur bescheidene Antischmerzempfindungswirkung im Vergleich zu CGX-1160 (10A–10B). Im Vergleich dazu hat NT die Rückzugslatenz im Schwanzspitzen-Test nicht signifikant erhöht (10A–10B).
Alle getesteten Zusammensetzungen zeigten dosis-abhängig anti-nozizeptive Eigenschaften in beiden Phasen des Formalin-Tests, nur mit unterschiedlicher Wirksamkeit. CGX-1160 war die potenteste der drei Verbindungen. In Phase 1 des Formalin-Tests (11A) hatte CGX-1160 eine ED₅₀ von annähernd 30 – 40 pmol, während NT eine ED₅₀ von 1 nmol aufweist. CGX-1063 hat in Phase 1 die 50% Antinozizeptions-Schwelle nicht erreicht, aber die unregelmäßige Dosisreaktion in diesem Test rechtfertigt die Wiederholung der 100-pmol-Dosis in diesem Assay. In Phase 2 des Formalin-Tests reduzierten alle drei Zusammensetzungen dosisabhängig die Pfotenleckzeit (in den Figuren als prozentuale Zunahme der Antinozizeption; 11B). Erneut war CGX-1160 wirksamer als die anderen Verbindungen, bei einer geschätzten ED₅₀ von 1 pmol. Niedrigere Dosierungen dieser Verbindung werden in Zukunft bewertet, um die Dosisreaktionskurve fertig zu stellen, die zur Berechnung einer präziseren ED₅₀ erforderlich ist CGX-1063 war auch wirksam in der Reduzierung des Nozizeptionsverhaltens in Phase 2, bei einer geschätzten ED₅₀ von 10–20 pmol. NT war dramatisch weniger wirksam als beide Contulakine, bei einer geschätzten ED₅₀ von 600–700 pmol (11B).
CGX-1160 zeigte eine extrem potente und dosisabhängige Umkehrung der CFA-induzierten mechanischen Allodynie (12A). Einhundert (100) fmol CGX-1160, i. t. gegeben, kehrten die CFA-induzierte, mechanische Allodynie völlig um. Interessanter Weise war bei dieser Dosierung die contralaterale Empfindlichkeit auf mechanischen Druck unverändert, was eine potenzielle unilaterale Änderung der NT-Rezeptoren bei chronischer Entzündung anzeigt. Bei höheren Dosierungen von CGX-1160 war die mechanische Rückzugsschwelle in der CFA-injizierten und der contralateralen uninjizierten Pfote dramatisch erhöht. In 12A und 12B zeigen die Zahlen über den Balken die Prozent Steigerung der mechanischen Schwelle im Verhältnis zum vormedikamentösen Wert an. wie dargestellt, hatte CGX-1160 bei allen getesteten Dosierungen eine wesentlich größere antiallodynische Wirkung auf die CFA-injizierte Seite in Relation zur nicht injizierten Seite. CGX-1063 war weniger wirksam als CGX-1160, kehrte aber auch die CFA-induzierte Allodynie völlig um (12B). Die minimal wirksame Dosis war 10 pmol, allerdings war bei dieser Dosis – zum Unterschied von CGX-1160 – die contralaterale Seite im Vergleich zu den vormedikamentösen Ausgangsmessungen ebenfalls erhöht. Im Einklang mit den anderen in dieser Studie untersuchten Modellen zeigte NT Wirksamkeit im CFA-Modell bei 1 nmol, nicht aber bei 100 pmol (12C). Andere Dosierungen von CGX-1160 und NT werden in Zukunft untersucht, um die exakten ED₅₀ für diese Verbindungen zu bestimmen.
CGX-1160, –1063 und NT zeigten sämtlich dosisabhängige Wirkungen auf lokomotorische Beeinträchtigung und Körpertemperatur. Für alle drei Zusammensetzungen lag die maximale Beeinträchtigung bei 15 Minuten nach der i. t. Injektion (lokomotorische Beeinträchtigung, 13A) oder bei 30 Minuten (hypothermische Wirkungen, 14A). CGX-1063 hatte bei der niedrigsten gestesteten Dosis keine motorische Toxizität (1 pmol, 13B), bei höheren Dosen zeigten die Tiere jedoch eine signifikante motorische Toxizität (geschätzte TD₅₀ von 10 pmol, 13B und 15A). Bei 10 pmol dauerte diese Toxizität 30 Minuten, löste sich aber nach 60 Minuten auf. Wenn 100 pmol oder 1 nmol verabreicht wurden, waren die Tiere 2–3 Stunden motorisch beeinträchtigt ( 14A). CGX-1160 war äquipotent mit CGX-1063 hinsichtlich der Auslösung motorischer Beeinträchtigung (geschätzte TD₅₀ von 10 –20 pmol, 13B). Ähnlich wie CGX-1063, zeigte CGX-1160 bei höheren Dosierungen (100–500 × seine ED₅₀) motorische Beeinträchtigung, die sich nach 5 Stunden legte (13A und 14B). Die geschätzte TD₅₀ für NT-induzierte motorische Beeinträchtigung war 3 nmol (13B). Ähnlich wie bei den Contulakinen dauerte die NT-induzierte motorische Beeinträchtigung bei hohen Dosierungen 2–4 Stunden (13A und 14C).
Die hypothermischen Wirkungen dieser Zusammensetzungen ähnelten der motorischen Toxizität. Alle drei verursachten einen dosisabhängigen Rückgang der Körpertemperatur. CGX-1160 und –1063 waren bei einer geschätzten TD₅₀ von 100 pmol (15B) äquipotent. Allerdings induzierte bei dieser Dosis CGX-1063 einen 2–3 Stunden dauernden Abfall der Körpertemperatur (15A und 16A), während die von CGX-1160 verursachte hypothermische Wirkung sich nach 60 Minuten legte {15A und 16B). Bei der höchsten Dosierung von CGX-1160 {500 pmol, 500 × die ED₅₀) löste sich der hypothermische Effekt sechs Stunden nach der Injektion nicht auf (16B). NT zeigte eine sehr ähnliche Dosisreaktion und Zeitverlauf wie die Contulakine. Bei den niedrigeren Dosierungen hatte NT keine Wirkung oder zeigte eine kurz dauernde hypothermische Wirkung (16C). Bei der höchsten Dosierung (100 nmol) jedoch verursachte NT eine dramatische und lange dauernde Hypothermie, die sich in drei Stunden nicht gelegt hatte (15A und 16C).
Die vorliegenden Daten, zeigen, dass CGX-1160 und CGX-1063 hochwirksame Breitspektrum-Analgetika sind, die in mehreren Tiermodellen akuter und chronischer Schmerzen wirksam sind. CGX-1160 ist in der Regel 10-fach potenter als CGX-1063 und 1000 mal potenter als NT (Tabelle 6). CGX-1160 ist insbesondere wirksam im Modell des chronischen entzündlichen Schmerzes, wobei CGX-1160 die mechanische Rückzugsschwelle nur in der Pfote, welche die CFA-Injektion erhält, selektiv erhöht während die Schwelle der nicht injizierten Pfote nicht verändert wird. Diese Erkenntnisse verweisen darauf, dass eine chronische Entzündung zu einer Reorganisation der NT-Rezeptoren in Schmerzempfindungsbahnen in Entsprechung zu der entzündeten Pfote führen kann. Da CGX-1160 die einzige Verbindung in diesen Experimenten war, welche eine erhöhte Wirksamkeit aufwies, kann dies auf eine Aufwärtsregulierung eines Rezeptor-Subtyps hinweisen, für den CGX-1160 wohl eine spezifische Selektivität und Spezifität besitzt. Unterstützt wird diese Hypothese der CGX-1160 Subtyp-Selektivität durch die Erkenntnisse, dass diese Verbindung bei Dosierungen von 10 –100-fach weniger als für lokomotorische Beeinträchtigung oder Hypothermie Antinozizeption zeigt, während CGX-1063 und NT bei Verabreichung i. t. Antinozizeption, lokomotorische Beeinträchtigung und Hypothermie bei annähernd gleichen Dosierungen verursachen. Von besonderem Interesse ist die lange dauernde hypothermische Wirkung des CGX-1063. Bei Verabreichung i. t. von 100 pmol (annähernd 10 mal seine ED₅₀ in Phase 2 des Formalintests, vgl. 16A) verursachte CGX-1063 lange dauernde Hypothermie in Relation zu vergleichbaren Antinozizeptions-Dosierungen von CGX-1160 (vgl. die 10 pmol-Dosis in 16B) und NT (vgl. die 10 nmol-Dosis in 16C). Dies weist potenziell darauf hin, dass CGX-1063 selektiv für den an der hypothermischen Wirkung des NT-Analogs beteiligten NT-Rezeptor-Subtyp ist. Folglich kann die O-Glykosylierung von Thr₁₀ in CGX-1160 Selektivität für den antinozizeptiven NTR-Subtyp – der zur Zeit für NT2 gehalten wird – sowie metabolische Resistenz gegen Peptidasen verleihen.
TABELLE 6 Vergleich der antinozizeptiven Wirkungen, Wirkungen der motorischen Beeinträchtigung und der Schutzindices von CGX-1160, CGX-1063 und NT im Formalintest (Phase 2) und CFA-induzierten Allodynie-Test
BEISPIEL 12
Materialien und Methoden zur Bewertung antipsychotischer Wirkung des Contulakin-G

1. Materialien. D-Amphetamin wurde von Sigma (St. Louis, MO) erworben. Contulakin-G (CGX-1160; ein synthetisches 16-Aminosäure-O-verknüpftes Glykopeptid) wurde synthetisiert wie oben beschrieben.
2. Tiere. Männliche CF-1-Mäuse (30–35g; Charles River Laboratories) wurden verwendet. Alle Tiere wurden in einem temperaturgeregelten Raum (23° ± 3°C) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Alle Tiere wurden nach den Vorschriften des Public Health Service über die humane Haltung von Labortieren euthanasiert.
3. Lokomotorische Wirkung. Die Tiere wurden in durchsichtigen Kunststoffkäfigen (40 cm × 22 cm, 20 cm tief) untergebracht und durften sich 30 Minuten lang akklimatisieren. Die Tiere erhielten dann entweder Contulakin-G (100 pmol) oder Salzlösung (Träger) durch freihändige intracerebroventrikuläre (i. c. v.) Injektion (5 μl Volumen) mittels einer 10 μl Hamilton-Spritze. Nach 5 Minuten erhielten die Tiere eine Salzlösung oder D-Amphetaminsulfat (3 mg/kg) in intraperitonealer (i. p.) Verabreichung. Die zurückgelegte Distanz (cm) und die in Bewegung verbrachte Zeit (s) wurden 30 Minuten mit einem Videomex-V Tracking System (Columbus Instruments, Columbus, OH) überwacht. Sämtliche Tests wurden in einem isolierten, dämmerig beleuchteten Verhaltensraum durchgeführt.
4. Statistik. Die Analyse der Daten erfolgte mittels Einweg-Analyse der Varianz (ANOVA) mit der Medikamentenbehandlung als einzigem Faktor, gefolgt von einem Multiple-Comparison-Test nach Newman-Keuls für den Vergleich individueller Gruppen, wobei P<0,05 als statistisch signifikant anerkannt wurde. Die statistischen Analysen wurden mit GraphPad PRISM Software (Version 2.01, GraphPad, San Diego, CA) durchgeführt.

BEISPIEL 13
Antipsychotische Wirkung von Contulakin-G
In der vorliegenden Studie wurde eine signifikante Wirkung der medikamentösen Behandlung auf die lokomotorische Aktivität sowohl nach der zurückgelegten Distanz [F (4,21) = 7,87,P<0,05] wie nach der in Bewegung verbrachten Zeit [F (4,21) = 6,17, P<0,05] gefunden. Die Verabreichung von D-Amphetamin ergab eine dosisabhängige Zunahme sowohl der zurückgelegten Distanz wie der in Bewegung verbrachten Zeit (17–18). Die Vorbehandlung der Mäuse mit Contulakin-G (100 pmol i. c. v.) reduzierte signifikant die Amphetamin-stimulierten (3 mg/kg i. p.) Zunahmen der zurückgelegten Distanz und der in Bewegung verbrachten Zeit. Zwar war nach Vorbehandlung mit Contulakin-G (100 pmol i. c. v.) eine Reduzierung der basalen lokomotorischen Wirkung (zurückgelegte Distanz sowie in Bewegung verbrachte Zeit) festzustellen, doch erreichte diese Reduzierung keine statistische Signifikanz.
Es gibt einander stützende Hinweise darauf, dass Neurotensin antipsychotische Eigenschaften ohne die damit verbundenen Nebenwirkungsprofile herkömmlicher neuroleptischer Medikamente besitzt (Besprechung in (Nemeroff et al., 1992)). Folglich haben sich zahlreiche Gruppen auf Neurotensin-Analoge als neuartige antipsychotische Medikamente konzentriert. Da Contulakin-G eine C-terminale Homologie mit Neurotensin gemeinsam hat und dem Neurotensin sowohl in In-vivo- wie auch in In-vitro-Assays gleicht, wurde die Fähigkeit des Contulakin-G erprobt, die D-Amphetamin-stimulierte lokomotorische Wirkung zu hemmen – ein präklinischer Filter mit prognostischer Kraft für antipsychotische Wirksamkeit.
Dieses Beispiel beweist, dass die Vorbehandlung von Mäusen mit Contulakin-G die Amphetamin-stimulierten Zunahmen der lokomotorischen Aktivität signifikant reduzierte. Diese Daten zeigen, dass Contulakin-G ähnliche antipsychotische Wirkung wie Neurotensin hat. Während jedoch, wie oben gezeigt, das Neurotensin bei den Ratten-Neurotensin-Rezeptoren rNTR1 (IC₅₀ : 3,2 nM für Neurotensin; 524 nM für Contulakin-G) und rNTR2 (IC₅₀: 6,0 nM für Neurotensin; 730 nM für Contulakin-G) und beim Maus-Neurotensin-Rezeptor mNTR3 (IC₅₀ : 1,4 nM für Neurotensin; 250 nM für Contulakin-G) wesentlich potenter als Contulakin-G war, erwies sich das Contulakin-G in einem In-vivo-Assay (eine visuell bewertete Prüfung der lokomotorischen Aktivität) nach i. c. v. Verabreichung um 1 bis 2 Größenordnungen potenter. Diese Ergebnisse zeigen, dass Contulakin-G und Neurotensin bei überlappenden aber eindeutig definierten Populationen von Neurotensin-Rezeptor-Subtypen oder Aktivierungszuständen interagieren können. Folglich würde Contulakin-G nicht die einschränkenden Nebenwirkungen des Neurotensins aufweisen.
BEISPIEL 14
Materialien und Methoden zur Bewertung antikonvulsivischer Wirkung des Contulakin-G

1. Tiere. Männliche Frings-Mäuse (20–25 g) wurden in einem temperaturgeregelten (23° ± 1°C) Raum mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus bei freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Die Mäuse wurden unter Beachtung der Empfehlungen der HEW-Publikation (NIH) Nr. 8623, "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren) untergebracht, gefüttert und behandelt. Alle Mäuse wurden unter Beachtung der Grundsätze über die humane Pflege von Labortieren des Public Health Service euthanasiert.
2. Bewertung als Antikonvulsivum. Die Frings-Mäuse wurden in einem runden Plexiglasbecher (Durchmesser 15 cm, Höhe 18 cm) untergebracht und einer Schallstimulierung mit 110 Dezibel (11 KHz) ausgesetzt. Die Mäuse wurden dann 25 Sekunden lang auf die Anwesenheit oder Abwesenheit einer tonischen Hintergliedstreckung beobachtet. Tiere, die keine tonische Hintergliedstreckung zeigten, wurden als geschützt betrachtet.
3. Rotorod-Test. Die motorische Beeinträchtigung wurde zur Zeit der Spitzenwirkung bewertet, indem die Mäuse auf ein Rotorod gesetzt wurden, das sich mit 6 UpM drehte. Tiere, die in einer Minute drei Mal fielen, wurden als beeinträchtigt betrachtet.

BEISPIEL 15
Antikonvulsivische Wirkung des Contulakin-G
Contulakin-G (CGX-1160) und Thr₁₀-Contulakin-G (CGX-1063) blockierten nach i. c. v. Verabreichung auf hochwirksame und dosisabhängige Weise audiogene Anfälle bei Frings-Mäusen (19). Ähnlich der Wirksamkeit in den Schmerzmodellen erwies sich CGX-1160 als potenter als CGX-1063, bei ED₅₀ von 7,1 pmol bzw. 27,0 pmol (Tabelle 7). Ebenfalls im Einklang mit früheren Studien, war NT dramatisch weniger potent als CGX-1160 oder –1063. Obwohl eine Dosisreaktionskurve für NT noch nicht vollständig erarbeitet wurde, zeigte NT 50% Schutz nach einer i. c. v. Verabreichung von 1 nmol. Bei der Prüfung auf motorische Toxizität erreichte CGX-1160 bei Dosierungen von bis zu 200 pmol nicht den 50 Toxizitätswert (19), wohingegen die TD₅₀ für CGX-1063 auf annähernd 375 pmol geschätzt wird, was für die getesteten Dosierungen einen geschätzten PI von 14 ergibt.
TABELLE 7 Antikonvulsivum-Profil von CGX-1160 und CGX-1063 in Frings AGS Mäusen nach i. c. v. Verabreichung
In einem getrennten Experiment wurden der Time-to-Peak-Effekt (Zeit bis zur Maximalwirkung) und die Dauer der Wirksamkeit des CGX-1160 untersucht. Die i. c. v. Verabreichung von 100 pmol (etwa 14 × ED₅₀) von CGX-1160 zeigte nach 30 Minuten keine Wirkung, war aber nach 60 Minuten 100% protektiv und zeigte in den getesteten Tieren 4 Stunden nach der i. c. v. Injektion noch 50% Schutz (20).
Es versteht sich, dass die Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Form unterschiedlicher Ausführungsbeispiele realisiert werden können, von denen hier nur wenige offenbart sind. Die beschriebenen Ausführungsbeispiele sind demnach illustrativ und dürfen nicht restriktiv ausgelegt werden.
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SEQUENZLISTE

Claims

Im wesentlichen reines Contulakin-G, umfassend die Aminosäuresequenz Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Alα-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO:1), wobei Xaai Pyro-Glu ist, Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist und Thr₁₀ so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan enthält, und wobei das O-Glykan Gal(β 1→3)GalNAc(α1→) ist.
Im wesentlichen reines Contulakin-G nach Anspruch 1, wobei Xaa₂ Prolin ist.
Im wesentlichen reines generisches Contulakin-G mit folgender allgemeiner Formel Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₃-Gly-Gly-Xaa₂-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈--Xaa₇-Xaa₉-Xaa₁₀-Ile-Leu (SEQ ID NO: 2), wobei Xaa Pyro-Glu, Glu, Gln oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₂ Ser, Thr oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₃ Glu oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₄ Asn, N-Glykan-modifiziertes Asn oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₅ Ala oder Gly ist; Xaa₆ Thr, Ser, S-Glykan-modifiziertes Cys, Tyr oder jede hydroxyhaltige unnatürliche Aminosäure ist; Xaa₇ Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin cder jede unnatürliche basische Aminosäure ist; Xaaθ Ala, Gly, Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homcorginin, jede unnatürliche basische Aminosäure oder K-Lys ist, wobei X (CH₂)_n, Phenyl, -(CH₂)_m-(CH=CH)-(CH₂)_mH oder -(CH₂)_m-(C≡C)-(CH₂)_mH ist, wobei n 1–4 und m 0–2 ist; Xaa₉ Pro oder Hydroxy-Pro ist; und Xaa₁₀ Tyr, Monoiod-Tyr, Diiod-Tyr, O-Sulfo-Tyr, O-Phospho-Tyr, Nitro-Tyr, Trp, D-Trp, Brom-Trp, Brom-T-Trp, Chlor-Trp, Chlor-Trp, Phe, L-Nec-Trp oder jede unnatürliche aromatische Aminosäure ist, unter der Bedingung, dass das generische Contulakin-G kein Peptid der Formel Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) ist, wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist und Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist.
Im wesentlichen reines generisches Contulakin-G mit folgender allgemeiner Formel Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₃-Gly-Gly-Xaa₂-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈--Xaa₇-Xaa₉-Xaa₁₀-Ile-Leu (SEQ ID NO: 2) , das so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan, ein S-Glykan oder ein N-Glykan enthält, wobei Xaa₁ Pyro-Glu, Glu, Gln oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₂ Ser, Thr oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₃ Glu oder y-Carboxy-Glu ist; Xaa₄ Asn, N-Glykan-modifiziertes Asn oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₅ Ala oder Gly ist; Xaa₆ Thr, Ser, S-Glykan-modifiziertes Cys, Tyr oder jede hydroxyhaltige unnatürliche Aminosäure ist; Xaa₇ Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin oder jede unnatürliche basische Aminosäure ist; Xaa₈ Ala, Gly, Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin, jede unnatürliche basische Aminosäure oder X-Lys ist , wobei X (CH₂) _n, Phenyl , -(CH₂) _m-(CH=CH)-(CH₂)_mH oder -(CH₂)_m-(C≡C)-(CH₂)_mH ist, wobei n 1–4 ist und m 0–2 ist; Xaa₉ Pro oder Hydroxy-Pro ist; und Xaa₁₀ Tyr, Monoiod-Tyr, Diiod-Tyr, O-Sulfo-Tyr, O-Phospho-Tyr, Nitro-Tyr, Trp, D-Trp, Brom-Trp, Brom-D-Trp, Chlor-Trp, Chlor-D-Trp, Phe, L-Neo-Trp oder jede unnatürliche aromatische Aminosäure ist, unter der Bedingung, dass, wenn das generische Contulakin-G ein Peptid der Formel Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO:1) ist, wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist und Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist und nur das Thr₁₀ so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan enthält, das Glykan Gal (β1→3) GalNAc (α1→) oder ein Glykan mit der Struktur der Formel (3) ist:
wobei R₁ eine Aminosäure ist, die mit einem Glykan chemisch oder enzymatisch derivatisiert werden kann; R2 OH, NH2, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat oder O-Glykan ist; R₃ H, SO₃, PO₃, Acetyl, Sialinsäure oder Monosaccharid ist; R₄ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₅ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat, O-Monosaccharid oder O-Acetyl ist; R₆ H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid ist ; R₇ H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid ist; R₈ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; n 0–4 ist und m 1–4 ist.
Im wesentlichen reines generisches Contulakin-G nach Änspruch 3, in dem das Glykan Gal(β1→3)GalNAc(α1→) ist.
Im wesentlichen reines generisches Contulakin-G nach Anspruch 4, in dem das Glykan Gal(β1→3)GalNAc(α1→) ist.
Im wesentlichen reines generisches Contulakin-G nach Anspruch 3, wobei das Glykan die Struktur der Formel (3) wie in Anspruch 4 angegeben hat, wobei R₁ eine Aminosäure ist, die mit einem Glykan chemisch oder enzymatisch derivatisiert werden kann; R₂ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat oder O-Glykan ist; R₃ H, SO₃, PO₃, Acetyl, Sialinsäure oder Monosaccharid ist; R₄ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₅ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat, O-Monosaccharid oder O-Rcetyl ist; R₆ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₈ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; n 0–4 ist und m 1–4 ist.
Im wesentlichen reines generisches Contulakin-G nach Anspruch 4, wobei das Glykan die Struktur der Formel (3) hat, wobei R₁ eine Aminosäure ist, die mit einem Glykan chemisch oder enzymatisch derivatisiert werden kann; R₂ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat oder O-Glykan ist; R₃ H, SO₃, PO₃, Acetyl, Sialinsäure oder Monosaccharid ist; R₄ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₅ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat, O-Monosaccharid oder O-Acetyl ist; R₆ H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid ist ; R₇ H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid ist; R₈ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; n 0–4 ist und m 1–4 ist.
Im wesentlichen reines Contulakin-G-Analog, das eine Nterminale Verkürzung von 1 bis 9 Aminosäuren des generischen Contulakin-G aus einem der Ansprüche 3–8 umfasst.
Im wesentlichen reines Contulakin-G-Analog nach Anspruch 9, wobei der Aminosäurerest am verkürzten N-Terminus durch ein Ser-O-Glykan, Thr-O-Glykan oder Cys-S-Glykan substituiert ist.
Im wesentlichen reines Contulakin-G-Analog nach Anspruch 9, wobei ein Rest an den Positionen 2–9 des generischen Contulakin-G durch ein Ser-O-Glykan, Thr-O-Glykan oder Cys-S-Glykan substituiert ist.
Im wesentlichen reines Contulakin-G-Analog, das eine Nterminale Verkürzung von 10 Aminosäuren des generischen Contulakin-G aus einem der Ansprüche 3–8 umfasst und das des weiteren so modifiziert ist, dass es ein Lys-N-Glykan am Rest 11 des generischen Contulakin-G enthält.
Isolierte Nucleinsäure, umfassend eine Nucleinsäure, die für den Contulakin-G-Vorläufer codiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 angeführt.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 13, umfassend eine Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 5 angeführt.
Isoliertes Contulakin-G-Vorläuferpeptid, umfassend eine Aminosäuresquenz, wie in SEQ ID NO: 6 angeführt.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Wirkstoffes, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Contulakin-G, umfassend die Aminosäuresequenz Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO:1), wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist, Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist und Thr₁₀ so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan enthält, und wobei das O-Glykan Gal(β1→3)GalNAc(α1→) ist; (b) einem generischen Contulakin-G mit der folgenden allgemeinen Formel Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₃-Gly-Gly-Xaa₂-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₇-Xaa₉-Xaa₁₀-Ile-Leu (SEQ ID NO: 2) , wobei Xaa₁ Pyro-Glu, Glu, Gln oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₂ Ser, Thr oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₃ Glu oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₄ Asn, N-Glykan-modifiziertes Asn oder 5-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₅ Ala oder Gly ist; Xaa₆ Thr, Ser, S-Glykan-modifiziertes Cys, Tyr oder jede hydroxyhaltige unnatürliche Aminosäure ist; Xaa₇ Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin oder jede unnatürliche basische Aminosäure ist; Xaa₈ Ala, Gly, Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin, jede unnatürliche basische Aminosäure oder X-Lys ist , wobei X (CH₂)_n, Phenyl , -(CH₂) _m-(CH=CH)-(CH₂)_mH oder -(CH₂)_m-(C=C)-(CH₂)_mH ist, wobei n 1–4 ist und m 0–2 ist; Xaa₉ Pro oder Hydroxy-Pro ist; und Xaa₁₀ Tyr, Monoiod-Tyr, Diiod-Tyr, O-Sulfo-Tyr, O-Phospho-Tyr, Nitro-Tyr, Trp, D-Trp, Brom-Trp, Brom-D-Trp, Chlor-Trp, Chlor-D-Trp, Phe, L-Neo-Trp oder jede unnatürliche aromatische Aminosäure ist, unter der Bedingung, dass das generische Contulakin-G kein Peptid der Formel Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) ist, wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist und Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist; (c) einem generischen Contulakin-G mit der folgenden allgemeinen Formel Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₃-Gly-Gly-Xaa₂-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₇-Xaa₉-Xaa₁₀-Ile-Leu (SEQ ID NO: 2) , das so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan, ein S-Glykan oder ein N-Glykan enthält, wobei Xaa₁ Pyro-Glu, Glu, Gln oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₂ Ser, Thr oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₃ Glu oder y-Carboxy-Glu ist; Xaa₄ Asn, N-Glykan-modifiziertes Asn oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₅ Ala oder Gly ist; Xaa₆ Thr, Ser, S-Glykan-modifiziertes Cys, Tyr oder jede hydroxyhaltige unnatürliche Aminosäure ist; Xaa₇ Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin oder jede unnatürliche basische Aminosäure ist; Xaa₈ Ala, Gly, Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin, jede unnatürliche basische Aminosäure oder X-Lys ist, wobei X (CH₂)_n, Phenyl, -(CH₂)_m-(CH=CH)-(CH₂)_mH oder -(CH₂)_m-(C=C)-(CH₂)_mH ist, wobei n 1–4 ist und m 0–2 ist; Xaa₉ Pro oder Hydroxy-Pro ist; und Xaa₁₀ Tyr, Monoiod-Tyr, Diiod-Tyr, O-Sulfo-Tyr, O-Phospho-Tyr, Nitro-Tyr, Trp, D-Trp, Brom-Trp, Brom-D-Trp, Chlor-Trp, Chlor-D=Trp, Phe, L-Neo-Trp oder jede unnatürliche aromatische Aminosäure ist, unter der Bedingung, dass, wenn das generische Contulakin-G ein Peptid der Formel Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) ist, wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist, Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist und das Thr₁₀ so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan enthält, das Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gal(β1→3)GalNAc(α1→) und einem Glykan mit der Struktur
wobei R₁ eine Aminosäure ist, die mit einem Glykan chemisch oder enzymatisch derivatisiert werden kann; R₂ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAC, O-Sulfat, O-Phosphat oder O-Glykan ist; R₃ H, SO₃, PO₃, Acetyl, Sialinsäure oder Monosaccharid ist; R₄ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₅ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat, O-Monosaccharid oder O-Acetyl ist; R₆ H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid ist; R₇ H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid ist; R₈ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; n 0–4 ist und m 1–4 ist. (d) einem Contulakin-G-Analog, das eine N-terminale Verkürzung von 1 bis 9 Aminosäuren des generischen Contulakin-G von (b) oder (c) umfasst; (e) einem Contulakin-G-Analog von (d), wobei der Aminosäurerest am verkürzten N-Terminus durch ein Ser-O-Glykan, Thr-O-Glykan oder Cys-S-Glykan substituiert ist; (f) einem Contulakin-G-Analog von (d), wobei ein Rest an den Positionen 2–9 des generischen Contulakin-G durch ein Ser-O-Glykan, Thr-O-Glykan oder Cys-S-Glykan sustituiert ist; und (g) einem Contulakin-G-Analog, das eine N-terminale Verkürzung von 10 Aminosäuren des generischen Contulakin-G von (b) oder (c) umfasst, das des weiteren so modifiziert ist, dass es ein Lys-N-Glykan am Rest 11 des generischen Contulakin-G enthält, zur Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der Contulakin-G-Stelle auf dem Neurotensinrezeptor bei einer Person, die dessen bedarf.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Glykan Gal(β1→3)GalNAc(α1→) ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Glykan die Struktur der Formel (3) hat, wobei R₁ eine Aminosäure ist, die mit einem Glykan chemisch oder enzymatisch derivatisiert werden kann; R₂ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat oder O-Glykan ist; R₃ H, SO₃, PO₃, Acetyl, Sialinsäure oder Monosaccharid ist; R₄ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₅ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat, O-Monosaccharid oder O-Acetyl ist; R₆ H, SO₃ , PO₃ , Acetyl oder Monosaccharid ist ; R₇ H, SO₃ , PO3 , Acetyl oder Monosaccharid ist; R₈ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; n 0–4 ist und m 1–4 ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Modulation des Neurotensinrezeptors zur Behandlung von epileptischen Anfällen, Entzündungen, Schock, Thrombosen, Hypertension, Schmerzen, Psychosen, Parkinsonscher Krankheit, gastrointestinalen Krankheiten, depressiven Zuständen, kognitiven Dysfunktionen, Ängsten, Spätdyskinesien, Drogenabhängigkeit, Panikattacken, Manien, Reizdarmsyndrom, Diarrhö, Geschwüren, gastrointestinalen Tumoren, Tourette-Syndrom, Huntingtonscher Chorea, Gefäßundichtheit, Arteriosklerose, Gefäßerweiterung und Vasodilatation dient.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Modulation des Neurotensinrezeptors zur Behandlung von Epilepsie, epileptischen Anfällen oder Krämpfen dient.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Modulation des Neurotensinrezeptors zur Behandlung von Schmerzen dient.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Modulation des Neurotensinrezeptors zur Behandlung von Schizophrenie dient.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Modulation des Neurotensinrezeptors zur Behandlung von Entzündungen dient.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Modulation des Neurotensinrezeptors zur Behandlung von Spätdyskinesie oder akuten dystonischen Reaktionen dient ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Verabreichung des Wirkstoffes unter Verwendung eines Abgabesystems erfolgt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend auf Infusion, Abgabe durch Pumpe, Abgabe durch biologisch abbaubares Polymer, Abgabe durch mikroverkapselte Zelle, Injektion und Abgabe durch makroverkapselte Zelle.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Verabreichung in das Zentralnervensystem erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Zentralnervensystem ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Intrathekalraum, den Gehirnventrikeln und dem Gehirnparenchym.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Verabreichung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus subkutan, intravenös, intra-arteriell und intramuskulär.
Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Contulakin-G, umfassend die Aminosäuresequenz Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1), wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist, Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist und Thr₁₀ so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan enthält, und wobei das O-Glykan Gal(β1→3)GalNAc(α1→) ist; (b) einem generischen Contulakin-G mit der folgenden allgemeinen Formel Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₃-Gly-Gly-Xaa₂-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₇-Xaa₉-Xaa₁₀-Ile-Leu (SEQ ID NO: 2) , wobei Xaa₁ Pyro-Glu, Glu, Gln oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₂ Ser, Thr oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₃ Glu oder y-Carboxy-Glu ist; Xaa₄ Asn, N-Glykan-modifiziertes Asn oder 5-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₅ Ala oder Gly ist; Xaa₆ Thr, Ser, S-Glykan-modifiziertes Cys, Tyr oder jede hydroxyhaltige unnatürliche Aminosäure ist; Xaa₇ Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin oder jede unnatürliche basische Aminosäure ist; Xaa₈ Ala, Gly, Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin, jede unnatürliche basische Aminosäure oder X-Lys ist, wobei X (CH₂)_n, Phenyl, -(CH₂)_m-(CH=CH)-(CH₂)_mH oder -(CH₂)_m-(C≡C)-(CH₂)_mH ist, wobei n 1–4 ist und m 0–2 ist; Xaa₉ Pro oder Hydroxy-Pro ist; und Xaa₁₀ Tyr, Monoiod-Tyr, Diiod-Tyr, O-Sulfo-Tyr, O-Phospho-Tyr, Nitro-Tyr, Trp, D-Trp, Brom-Trp, Brom-D-Trp, Chlor-Trp, Chlor-D-Trp, Phe, L-Neo-Trp oder jede unnatürliche aromatische Aminosäure ist, unter der Bedingung, dass das generische Contulakin-G kein Peptid der Formel Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) ist, wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist und Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist; (c) einem generischen Contulakin-G mit der folgenden allgemeinen Formel Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₃-Gly-Gly-Xaa₂-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Xaa₇-Xaa₉-Xaa₁₀-Ile-Leu (SEQ ID NO: 2) , das so modifiziert ist, dass es ein O-Glykan, ein S-Glykan oder ein N-Glykan enthält, wobei Xaa₁ Pyro-Glu, Glu, Gln oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₂ Ser, Thr oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₃ Glu oder γ-Carboxy-Glu ist; Xaa₄ Asn, N-Glykan-modifiziertes Asn oder S-Glykan-modifiziertes Cys ist; Xaa₅ Ala oder Gly ist; Xaa₆ Thr, Ser, S-Glykan-modifiziertes Cys, Tyr oder jede hydroxyhaltige unnatürliche Aminosäure ist; Xaa₇ Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin oder jede unnatürliche basische Aminosäure ist; Xaa₈ Ala, Gly, Lys, N-Methyl-Lys, N,N-Dimethyl-Lys, N,N,N-Trimethyl-Lys, Arg, Ornithin, Homoarginin, jede unnatürliche basische Aminosäure oder x-Lys ist , wobei X (CH₂)_n, Phenyl , -(CH₂)_m-(CH=CH)-(CH₂)_mH oder -(CH₂)_m-(C≡C)-(CH₂)_mH ist, wobei n 1–4 ist und m 0–2 ist; Xaa₉ Pro oder Hydroxy-Pro ist; und Xaa₁₀ Tyr, Monoiod-Tyr, Diiod-Tyr, O-Sulfo-Tyr, O-Phospho-Tyr, Nitro-Tyr, Trp, D-Trp, Brom-Trp, Brom-D-Trp, Chlor-Trp, Chlor-D-Trp, Phe, L-Neo-Trp oder jede unnatürliche aromatische Aminosäure ist, unter der Bedingung, dass, wenn das generische Contulakin-G ein Peptid der Formel Xaa₁-Ser-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn-Ala-Thr-Lys-Lys-Xaa₂-Tyr-Ile-Leu (SEQ ID NO: 1) ist, wobei Xaa₁ Pyro-Glu ist, Xaa₂ Prolin oder Hydroxyprolin ist und das Thrio so modifiziert ist, dass es O-Glykan enthält, das Glykan ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gal(β1→3)GalNAc(α1→) und einem Glykan mit der Struktur
wobei R₁ eine Aminosäure ist, die mit einem Glykan chemisch oder enzymatisch derivatisiert werden kann; R₂ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat oder O-Glykan ist; R₃ H, SO₃, PO₃, Acetyl, Sialinsäure oder Monosaccharid ist; R₄ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₅ OH, NH₂, NHSO₃Na, NHAc, O-Sulfat, O-Phosphat, O-Monosaccharid oder O-Acetyl ist; R₆ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R, H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; R₅ H, SO₃, PO₃, Acetyl oder Monosaccharid ist; n 0–4 ist und m 1–4 ist. (d) einem Contulakin-G-Analog, das eine N-terminale Verkürzung von 1 bis 9 Aminosäuren des generischen Contulakin-G von (b) oder (c) umfasst; (e) einem Contulakin-G-Analog von (d), wobei der Aminosäurerest am verkürzten N-Terminus durch ein Ser-O-Glykan, Thr-O-Glykan oder Cys-S-Glykan substituiert ist; (f) einem Contulakin-G-Analog von (d), wobei ein Rest an den Positionen 2-9 des generischen Contulakin-G durch ein Ser-O-Glykan, Thr-O-Glykan oder Cys-S-Glykan substituiert ist; und (g) einem Contulakin-G-Analog, das eine N-terminale Verkürzung von 10 Aminosäuren des generischen Contulakin-G von (b) oder (c) umfasst, das des weiteren so modifiziert ist, dass es ein Lys-N-Glykan am Rest 11 des generischen Contulakin-G enthält, zur Verwendung als Medikament.
Wirkstoff nach Anspruch 29, wobei das Medikament für die Behandlung von Schmerzen, insbesondere akuter Schmerzen, vorgesehen ist.
Wirkstoff nach Anspruch 30, wobei die akuten Schmerzen ein Post-Trauma sind.
Wirkstoff nach Anspruch 30, wobei die Schmerzen chronische Schmerzen sind.
Wirkstoff nach Anspruch 32, wobei die chronischen Schmerzen durch Krebs verursacht werden.
Wirkstoff nach Anspruch 32, wobei die chronischen Schmerzen neuropathische Schmerzen sind.
Wirkstoff nach Anspruch 32, wobei die chronischen Schmerzen entzündlicher Natur sind.
Wirkstoff nach einem der Ansprüche 29–35, wobei der Wirkstoff unter Verwendung eines Abgabesystems verabreicht wird, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Infusion, Abgabe durch Pumpe, Abgabe durch biologisch abbaubares Polymer, Abgabe durch mikroverkapselte Zelle, Injektion und Abgabe durch makroverkapselte Zelle.
Wirkstoff nach Anspruch 36, wobei die Verabreichung in das Zentralnervensystem erfolgt.
Wirkstoff nach Anspruch 37, wobei das Zentralnervensystem ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Intrathekalraum, den Gehirnventrikeln und dem Gehirnparenchym.
Wirkstoff nach Anspruch 36, wobei die Verabreichung ausgewählt wird auf der Gruppe bestehend aus subkutan, intravenös, intra-arteriell und intramuskulär.