KR101491860B1 - Ｍｕ-코노톡신 펩티드 및 국소 마취제로서 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 μ-코노톡신 펩티드, 그의 생물학적 활성 단편, 그의 염, 그의 조합물 및/또는 그의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 통증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에서 그의 용도 및 마취제 제조에서 그의 용도에 관한 것이다.

μ-코노톡신 펩티드, 생물학적 활성 단편, 통증, 마취제

Description

ＭＵ-코노톡신 펩티드 및 국소 마취제로서 그의 용도{MU-CONOTOXIN PEPTIDES AND USE THEREOF AS A LOCAL ANESTHETIC}

본 발명은 뮤(μ)-코노톡신 펩티드, 그의 생물학적 활성 단편, 그의 염, 그의 조합물 및/또는 그의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 통증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에서 그의 용도 및 마취제 제조에서 그의 용도에 관한 것이다.

코누스(Conus) 족의 바다청자고둥(marine cone snail)의 독액은 풍부하고 또 생체활성 성분의 극히 다양한 공급원이다. 세계적으로 800종 이상의 코누스(Conus)가 있으며, 청자고둥 독액은 다양한 유형의 생물학적 활성을 나타내는 천연산출 펩티드의 가장 풍부한 공급원 중의 하나인 것으로 보인다. 코노펩티드(conopeptide)는 전압 민감성 이온 채널, 리간드-게이트화된 이온 채널 및 G-단백질 커플링된 수용체를 비롯한 다수의 다양한 분자 성분을 고치환성 및 특이성으로 표적으로 한다(McIntosh et al., 1999; Olivera et al., 1985; Olivera et al., 1990). 모든 기존의 코노펩티드 중에서, 오직 소수만이 단리(isolation), 일차 구조 분석에서부터 정밀한 분자 표적 확인에 이르기까지 광범위하게 특징화되었다. 그러나, 코노펩티드는 기존에는 확인되지 않은 채널의 작용을 분석하기 위한 새롭고도 중요한 수 단을 제공하므로 이 연구에 대한 관심이 점점 증가되고 있다. 이는 또한 원래 생리학적 표적에 대하여 작용하는 신규 약물을 사용하여 완전히 새로운 생물의학적 적용을 위한 기회를 허용한다. 이것은 특정 칼슘 서브타입(subtype)을 분리하기 위한 오메가-코노톡신의 발견과 그 사용 및 통증 관리에서 약물(Prialt®)로서 이들 중의 하나의 용도에 의해 예시된다(Kerr and Yoshikami, 1984; Olivera et al., 1984; Olivera et al., 1987).

뮤(μ)-코노펩티드 패밀리의 첫 번째 대표류의 공개는, 미오톡신 활성을 나타내는 지오그래푸톡신(geographutoxin)의 특징화와 함께 1983년에 이루어졌다(Sato et al., 1983). 그 이후로 몇 가지 다른 μ-코노펩티드의 단리와 확인이 이루어졌다. 지금까지, 총 9개의 μ-코노펩티드가 주로 피시보로우스(piscivorous) 종 및 1개의 몰루시보루스(molluscivorous) 종을 비롯한 6개의 상이한 청자고둥 종으로부터 특징화되었다.

이러한 모든 μ-코노펩티드는 서열 중에서 시스테인 잔기가 보존되는 위치에 의해 나타나는 공통되는 일차 구조를 나타낸다. 디설피드 결합은 Cysl-Cys4, Cys2-Cys5 및 Cys3-Cys6 사이에 있다. 이러한 접힘(fold)은 몇 개의 대표적인 μ-코노펩티드 패밀리에 대하여 연구된 구속된(constrained) 삼차 구조를 초래한다(Hill et al., 1996; Keizer et al., 2003; Nielsen et al., 2002; Ott et al., 1991; Wakamatsu et al., 1992). 수많은 연구에서 μ-코노펩티드는 다소간 특이적으로 다양한 전압-민감성 채널을 표적으로 함이 밝혀졌다(Becker et al., 1989; Bulaj et al., 2005; Cruz et al., 1985; Cruz et al., 1989; Fainzilber et al., 1995; French et al., 1996; Safo et al., 2000; Sato et al., 1991; West et al., 2002). 나트륨 채널의 서브타입이 무엇을 표적으로 하든, 약리학적 효과는 언제나 채널 통과의 차단으로 구성되어, 전압 민감성 채널 작용성의 억제를 초래한다.

전압 민감성 나트륨 채널(VSSC)은 이들이 작용 전위를 생성하고 척추동물 및 비척추동물 여기성(excitable) 세포에서 증식할 수 있기 때문에, 세포 소통을 위해 작용하는 트랜스막(transmemberane) 단백질이다. 최근 포유동물 VSSC를 코딩하는 9개 유전자가 알려졌다(Yu and Catterall, 2003). VSSC는 복어류로부터 단리된 독인 테트로도톡신(TTX)에 대한 이들의 민감성에 따라 분류된다. TTX에 의해 차단된(blocked) VSSC는 TTX-민감성으로 공지되어 있는 반면에, 그렇지 않는 것은 TTX-내성 채널로 공지되어 있다. VSSC의 각 서브타입은 세포성 및 조직 편재에 따라서 특수화된 기능을 갖는다.

VSSC는 근육에서 뿐만 아니라 신경에서 작용 전위의 전달(transmission)에 주요한 역할을 가지므로, 마취에서 주요 표적을 제공한다. 리도카인 또는 프로카인과 같은 약물은 감각 섬유에 존재하는 VSSC의 억제를 통하여 작용한다(Scholz, 2002). 그러나, 상기 약물에 의해 상이하게 영향을 받는 수많은 VSSC 서브타입의 존재로 인하여 모든 섬유에서 동일하게 억제가 생기는 것은 아니다. 이들 중에서, TTX-민감성 VSSC 서브타입은 통증의 전달에 주요한 역할을 가지며 또 현재 공지 약물에 의해 특별히 표적화되지 않고 있다. 또한, 리도카인 및 프로카인의 짧은 지속 시간 뿐만 아니라 이들 적용에 대한 잘 문서화된 부작용 또는 앨러지로 인하여 특정 경우에서 마취제로서 사용하기가 어렵다. 이와 관련하여, TTX-내성 VSSC의 특정 억제를 허용하는 화합물은 통증 제어를 위한 주요한 업적일 것이다. 예컨대, 서브타입 Naν1.8은 통각과민증의 개시 및 유지에 공헌한다. 신경통 통증의 초기 단계에서, Naν1.8의 발현은 손상된 일차 구심성 뉴런에서 감소되는 반면에, Naν1.8의 발현 수준은 인접 뉴런에서 유지된다(Decosterd et al., 2002; Gold et al., 2003). 그러나, 좌골신경 손상된지 2일 후 Naν1.8 발현의 현저한 상향조절(upregulation)뿐만 아니라 C 섬유와 일관적인 통과 속도에서 TTX-내성 화합물 작용 전위에서 비례적인 증가가 있다(Gold et al., 2003). 이러한 것은 신경통 통증에서 Naν1.8의 중요한 역할을 지지한다.

따라서 VSSC는 억제 또는 조절이 마취, 통각상실증 및 통증 제어를 허용하는 유용한 타겟을 나타낸다(Baker and Wood, 2001; Julius and Basbaum, 2001; Lee, 1976).

단리된 μ-코노톡신인 다수의 펩티드가 특허출원 WO 02/07678호로부터 공지되어 있다(University of Utah Research Foundation and Cognetix, Inc.). 그러나, 상기 문헌은 펩티드에 대한 불명확하고 때로는 오해의 여지가 있는 기재를 제공하므로 상기 문헌에 의지하기는 어렵다. 대부분의 경우, 상기에 기재된 대부분의 펩티드는 분자 생물학 수법, μ-코노톡신 펩티드를 코딩하는 DNA의 단리 및 클로닝, 독소 서열의 번역 및 결정에 의해서만 확인된 것으로 보인다. 이러한 수법에 대한 의존은 실수를 유발할 수 있는데, 이는 천연적으로 활성 아미노산 잔기는 암호화된 펩티드의 번역후 변형(posttranslational modification)으로 인하여 생길 수 있고, 이들의 일부는 뉴클레오티드 서열로부터 직접적으로 발견할 수 없기 때문이다.

최근, 특허출원 WO 2004/0099238호(The University of Queensland)는 신규 μ-코노톡신 펩티드 및 그의 유도체와 이들의 신경 활성 나트륨 채널 억제제(길항물질)로서 용도, 분석 및 프로브에서 또 통증, 암, 간질 및 심혈관 질환을 비롯한 질병의 치료에서 용도를 개시하였다. 이 출원은 또한 방사능 리간드 결합 분석법(RLB)에 의한 신규 μ-코노톡신 펩티드의 용도를 개시한다. 이러한 결과는 μ-코노톡신의 어떠한 생물학적 활성이나 결합 효과를 의미하지 않는데, 일부 화합물(코노톡신 포함)은 생물학적 활성 없이도 채널/수용체 부위에 결합되는 것임을 문헌으로부터 알 수 있기 때문이다 (Fainzilber et al., 1994; Shichor et al., 1996). 그러나, 이들 결합 실험에서 나타난 효능은 시험관내 또는 생체내에서 억제 효능과 관련되지 않을 것이므로, 판독자는 가능성있는 생물학적 억제 효능을 모르게된다. 또한, 언급한 발현된 VSSC 채널에 대한 유일한 억제 활성(IC50)은 1 내지 3 μM 보다 더 우수하므로, 생체 밖 또는 생체내 제조에서 사용하기 위한 더 높은 농도를 제시한다.

따라서 양호한 안정성 프로필을 가질 뿐만 아니라 낮은 부작용 또는 전혀 부작용을 갖지 않는, 마취제로서 적용하기 위한 강력하고 장기간 생물학적 활성을 갖는 신규 화합물이 여전히 요청되고 있다.

상기 목적은 신규한 μ-코노톡신 펩티드, 그의 생물학적 활성 단편, 그의 염, 그의 조합물 및/또는 그의 변이체를 제공함으로써 달성되었다. 장기간의 효과를 나타내는 본 발명의 펩티드는 마취제의 제조 및 통증 치료에서 유용할 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 다음 아미노산 서열: Xaa1-Xaa2-Cys-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Cys-Cys-Xaa17 [서열번호 1]을 포함하는 μ-코노톡신 펩티드, 그의 생물학적 활성 단편, 그의 조합물 및/또는 그의 변이체를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되고 정제된 핵산 서열을 제공한다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 본 발명에 따른 1 이상의 펩티드를 약학적 유효량으로 포함하는 약학적 조성물 및 전압 민감성 나트륨 채널과 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한 상기 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 마취제 제조에서 본 발명의 약학적 조성물의 용도 및 마취를 필요로 하는 외과 처치를 받는 환자에서 근육골격 이완을 제공하기 위한 방법에서 그의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 요지는 통증을 치료하거나 통증을 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 명세서에 사용된 바와 같이, "1개" 또는 "하나"는 "적어도 1개(하나)" 또는 "1 또는 그 이상"을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드", "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 인접 잔기의 알파 아미노 및 카르복시 기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 아미노산 잔기를 고안하기 위해 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다"는 일반적으로 1 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허용하는 의미로 사용된다.

코노펩티드는 코노톡신 및 코노톡신 펩티드와 상호 교환적으로 사용되는 용어이다. 코노톡신은 믿을 수 없을 정도로 다양한 작용을 갖는 공지된 가장 강력하고 다양한 신경독의 일부이다. 흥미롭게는, 강한 분할은 연체동물을 먹는 종과 어류를 먹는 종 사이에 뿐만 아니라 동일 그룹 내의 종 사이 또는 동일 종의 개체 사이에도 존재한다. 어류를 먹는 청자고둥으로부터 얻은 독은 연체동물을 먹는 청자고둥에 비하여 인간 계에 대하여 훨씬 더 강한 생체활성을 가지며, 치사가 유발된다.

마비 독의 주요 3종이 집중적으로 연구되었고, 이들 모든 3개 독은 신경 소통을 방해하지만 표적이 상이하다: 알파-코노톡신(α-코노톡신)은 니코틴산 아세틸콜린 수용체에 결합하여 억제하며; 뮤-코노톡신(μ-코노톡신)은 시냅스후부 나트륨 채널에 결합하는 것에 의한 근육 작용을 직접적으로 제거하며; 또 오메가-코노톡신(ω-코노톡신)은 칼슘의 신경 단말에 들어가는 전압 활성화된 진입 방지를 통하여 아세틸콜린의 방출을 죽인다.

μ-코노펩티드는 코누스(Conus) 속의 바다 청자고둥의 독액으로부터 단리한다. μ-코노펩티드의 일차 구조는 15-30개 아미노산에 의해 구성되어 3개의 디설피드 브릿지로 접힌다. 이들 펩티드는 근육 또는 신경계에 존재할 수 있는 다양한 전압-민감성 나트륨 채널을 표적으로 한다. 다수의 μ-코노펩티드 구성원이 확인되었고 또 이들의 서열은 공개되었다. 씨. 지오그래푸스(C. geographus) 독액으로부터 얻은 GIIIA, GIIIB 및 GIIIC는 골격근의 강력한 차단제(blocker)이지만 신경 VSSC(Cruz et al., 1985)는 아니다. 씨. 푸르푸레센스(C. purprescens)로부터 얻은 PIIIA는 근육을 억제하고 또 신경 TTX-민감성 VSSC 정도는 덜하다(Shon et al., 1998).

불행히도, 이들 코노톡신은 특별히 강력한 신경 VSSC는 아니고 골격근 VSSC(GIIIA, GIIIB 및 GIIIC)에 대해 선택적이거나 또는 골격근 및 신경 VSSC 서브타입(PIIIA) 사이를 구별할 수 없다. 또한, 이들 펩티드는 3차원(3D) 구조능을 결여하고 있고 용액 중에서 입체형태(conformational) 교환하기 쉽다(Nielsen et al., 2002). 새로운 코노펩티드를 확인하고 특징화하는 동안, 출원인들은 μ-코노펩티드 패밀리가 포유류 신경근 접합부의 차단제로서 뿐만 아니라 운동 신경과 감각 뉴런에서 작용 전위의 강력한 억제제로서 극히 강력한 특성을 나타냄을 밝혀내었다. 이 새로운 μ-코노톡신 펩티드는 필수적으로 다음 아미노산 서열: Xaa1-Xaa2-Cys-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Cys-Cys-Xaa17 [서열번호 1]을 포함하는 μ-코노톡신 펩티드, 그의 생물학적 활성 단편, 그의 조합물 및/또는 그의 변이체를 포함하며, 이때 Cys는 시스테인이다.

통상, Xaa1은 N-변형 산성 아미노산이다. 바람직하게는, 이러한 변형은 아세틸화, 포르밀화, 미리스토일화 또는 피롤리돈을 포함하는 군으로부터 선택된다. 포르밀화는 메티오닌(N-포르밀메티오닌)에 적용된다. 아세틸화는 메티오닌(N-아세틸메티오닌), 트레오닌(N-아세틸트레오닌), 세린(N-아세틸세린), 아스파트산(N-아세틸아스파테이트), 글루탐산(N-아세틸글루타메이트), 글리신, 발린 및 알라닌을 포함하는 다수의 잔기에 적용된다.

가장 바람직하게는, 산성 아미노산 변형은 피로글루타메이트(pGlu 또는 Z)이다.

Xaa2는 바람직하게는 글리신이다.

Xaa3은 산성 아미노산 또는 그의 아미드 형태이다. 바람직하게는, Xaa3은 아스파라긴(Asn)이다.

Xaa4는 통상 글리신(Gly)이다.

Xaa5는 보통 프롤린 또는 히드록실-프롤린이다.

Xaa6은 염기성 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa6은 리신(Lys)이다.

Xaa7은 통상 글리신(GIy)이다.

Xaa8은 비-방향족 히드록실 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa8은 세린(Ser)이다.

Xaa9는 비-방향족 히드록실 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa8은 세린 (Ser)이다.

Xaa10은 염기성 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa10은 리신(Lys)이다.

Xaa11은 방향족 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa11은 트립토판(Trp)이다.

Xaa12는 염기성 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa12는 아르기닌(Arg)이다.

Xaa13은 산성 아미노산 또는 그의 아미드 형태이다. 바람직하게는, Xaa13은 아스파트산(Asp)이다.

Xaa14는 염기성 아미노산 또는 황 함유 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa14는 메티오닌(Met) 또는 히스티딘(His)이다.

Xaa15는 소수성 또는 비극성 아미노산, 또는 비-방향족 히드록실 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa15는 알라민(Ala)이다.

Xaa16은 염기성 아미노산이다. 바람직하게는, Xaa16은 아르기닌(Arg)이다.

Xaa17은 비극성 아미노산, 또는 아미드 기이다. Xaa17은 존재하지 않을 수 있다.

경우에 따라, 상기 기재한 바와 같은 μ-코노톡신에서, Cys 잔기의 쌍은 Ser/ (GIu 또는 Asp), Lys/(GIu 또는 Asp), Cys/(GIu 또는 Asp) 또는 Cys/Ala 조합물과 같은 이소테릭(isoteric) 락탐 또는 에스테르-티오에스테르 치환에 의해 상을 이루게 치환된다. 공지 방법(Barnay et al, 2000; Hruby et al, 1994; Bitan et al, 1997)에 의한 순차적인 커플링은 고유한 Cys 브릿지를 락탐 브릿지로 치환하게 한다. 티오에테르 유사체는 RSP Amino Acid Analogues로부터 시판되는 할로-Ala 잔기를 사용하여 용이하게 합성될 수 있다.

본 발명은 아미노산 Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 및 Xaa7로 구성된 1 이상의 아미노산 또는 그의 조합물이 존재하지 않는 μ-코노톡신에 관한 것이다(그룹 1).

아미노산 Xaa8, Xaa9, Xaa1O 및 Xaa11로 구성된 1 이상의 아미노산 또는 그의 조합물이 존재하지 않는 μ-코노톡신도 포함된다(그룹 2).

또한 아미노산 Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15 및 Xaa16으로 구성된 1 이상의 아미노산 또는 그의 조합물이 존재하지 않는 μ-코노톡신도 또한 포함된다(그룹 3).

다르게는, 상기 그룹 1, 2 또는 3으로부터 3개 아미노산, 또는 그의 조합물은 본 발명의 동일 μ-코노톡신 펩티드에 존재하지 않을 수 있다.

지방족 R-기를 갖는 소수성 아미노산의 예는 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 발린(Val), 로이신(Leu) 및 이소로이신(Ile)을 포함한다.

비-방향족 히드록실을 갖는 아미노산의 예는 세린(Ser) 및 트레오닌(Thr)을 포함한다.

황-함유 아미노산의 예는 시스테인(Cys) 및 메티오닌(Met)을 포함한다.

예시적 산성 아미노산 및 이들의 아미드 형태는 아스파트산(Asp), 아스파라긴(Asn), 글루탐산(Glu), 글루타민(Gln) 및 피로글루타민산(pGlu)을 포함한다.

예시적 염기성 아미노산은 아르기닌(Arg), 리신(Lys) 및 히스티딘(His)을 포함한다.

예시적 방향족 아미노산은 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr) 및 트립토판(Trp)을 포함한다.

이미노산의 예는 예컨대 프롤린(Pro) 및 히드록시프롤린(Hyp 또는 Hpro 또는 O)을 포함한다.

본 발명은 μ-코노톡신 펩티드의 "생물학적 활성 단편"을 고려하며, 이것은 상기 펩티드의 서열보다 작은 아미노산 길이를 갖는 서열을 지칭한다. 이 서열은 이것이 유도되는 천연 서열과 동일한 특성 또는 생물학적 활성을 나타내는 한 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 서열은 본 발명의 펩티드의 서열에 비하여 아미노산 길이에서 99% 미만, 바람직하게는 90% 미만, 특히 60% 미만, 및 보다 특히 30% 미만을 함유한다.

산 부가염 또는 예컨대 아연, 철 등의 금속 복합체(상기 목적을 위해 염으로 간주되는)와 같은 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드의 염도 포함된다. 이러한 산 부가염의 예는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 설페이트, 포스페이트, 말레에이트, 아세테이트, 시트레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 말레이트, 아스코르베이트, 타르트레이트 등이다.

본 발명의 활성 μ-코노톡신의 불활성 형태를 나타낸 성분인 "프로드럭"도 본 발명의 범위에 포함된다. 다른 말로, 본 발명은 세포에 대하여 소망하는 생리학적 효과를 생성할 능력을 갖지만 처음에는 불활성(상기 효과를 생성하지 않는)이고 약간의 변형을 거친 후에만 생리학적 활성으로 되어서 세포에 대하여 상기 생리학적 효과를 나타내는, 즉 생체 변환후에 약학적 활성으로 되는, 안정한 용해성 펩티드 접합 전구체(조성물)에 관한 것이다.

μ-코노톡신 펩티드의 생체변환은 생리학적 조건(시험관 내 및 생체 내에서)하에서 실시될 수 있고 또 효소, 또는 위산, 혈액과 같은 체액과의 반응결과로 효소적 산화, 환원, 가수분해 등을 거치거나 또는 화학적 가수분해를 거쳐 아실 이동 반응에 의해 활성 화합물로 전환된다.

본 발명은 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드의 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 천연 서열 펩티드와 조금 상이한 아미노산 서열, 즉 천연 서열로부터 보존적 아미노산 치환에 의해 1 이상의 아미노산이 동일 특징 또는 입체형태 작용을 갖는 다른 것으로 치환되어 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 치환, 결실, 측쇄 변형 및/또는 삽입을 보유한다. 보존적 아미노산 치환은 다음 5개 그룹 중의 1개 내에서 상호교환으로 정의된다.

I. 소형 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

II. 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys

III. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아미드: Asp, Asn, GIu, GIn

IV. 대형 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp

V. 대형 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, Cys.

일부 비-보존적 아미노산은 천연산출 아미노산에 대한 적합한 치환일 수 있다고 이해한다. 예컨대 Lys 잔기는 오르니틴, 호모아르기닌, nor-Lys, N-메틸-Lys, N,N-디메틸-Lys 및 N,N,N-트리메틸-Lys에 의해 치환될 수 있다. Lys 잔기는 비제한적으로 N-1-(2-피라졸리닐)-Arg, 2-(4-피페리닐)-Gly, 2-(4-피페리닐)-Ala, 2-[3-(2S)피롤리디닐]-Gly 및 2-[3-(2S)피롤리니닐]-Ala을 포함한 합성 염기성 아미노산에 의해 치환될 수 있다. Tyr 잔기는 4-메톡시티로신(MeY), 메타-Tyr, 오르토-Tyr, nor-Tyr, 1251-Tyr, 모노할로-Tyr, 디-할로-Tyr, O-설포-Tyr, O-포스포-Tyr, 및 니트로-Tyr에 의해 치환될 수 있다.

Tyr 잔기는 3-히드록실 또는 2-히드록실 이성질체(각각 메타-Tyr 또는 오르토-Tyr) 및 상응하는 O-설포- 및 O-포스포 유도체에 의해 치환될 수 있다. Tyr 잔기는 합성 히드록실 함유 아미노산, 예컨대 4-히드록시메틸-Phe, 4-히드록시페닐-Gly, 2,6-디메틸-Tyr 및 5-아미노-Tyr에 의해 치환될 수 있다. 지방족 아미노산은 합성 유도체 함유 비-천연 지방족 측쇄 또는 직쇄 CnH2n+2에 의해 치환될 수 있고, 이때 n은 1 내지 8의 수이다. 비-통상적인 아미노산에 의해 치환된 적합한 보존적 치환의 예는 WO2004/0099238호(하기 표 1 참조)에 기재되어 있다.

표 1

삽입은 1 이상의 천연 산출 또는 비통상적인 아미노산의 부가를 포함하지만, 바람직하게는 시스테인 잔기는 아니다.

결실은 1 이상의 아미노산의 결실을 포함하지만, 바람직하게는 시스테인 잔기는 아니다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 Cys 이외의 1이상의 아미노산이 측쇄 변형을 거친 펩티드를 포함한다. 본 발명에 의해 고려된 측쇄 변형의 예는 알데히드의 반응에 의한 환원적 알킬화에 이은 NaBH4에 의한 환원과 같은 아미노산의 변형; 메틸아세트이미데이트에 의한 아미드화; 무수 아세트산에 의한 아실화; 시아네이트에 의한 아미노기의 카르바모일화; 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS)에 의한 아미노산의 트리니트로벤질화; 무수 숙신산 및 무수 테트라히드로프탈산에 의한 아미노 기의 아실화; 및 피리독살-5-포스페이트에 의한 리신의 피리독실화에 이은 NaBH4의 환원; 및 N-아세틸화를 포함한다.

아르기닌의 구아니딘 기는 2,3-부탄디온, 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 헤테로시클릭 축합 생성물의 형성에 의해 변형될 수 있다.

카르복실 기는 O-아실화 형성을 통한 카르보디이미드 활성화에 이은 예컨대 상응하는 아미드로의 유도체화에 의해 변형된다.

산성 아미노산은 WO 02/060923 (COGNETIX INC; Univ. Utah Res Found.)에 기재된 바와 같이 글리신 및 알라닌의 테트라졸릴 유도체에 의해 치환될 수 있다.

티로신 잔기는 예컨대 4-위치에서 메톡시화에 의해 변형될 수 있다. 티로신은 테트라니트로메탄에 의한 니트로화에 의해 변형되어 3-니트롤리로신 유도체를 형성한다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 고리의 변형은 요오도아세트산 유도체에 의한 알킬화 또는 디에틸피로카르보네이트에 의한 N-카르에톡시화에 의해 달성될 수 있다.

프롤린 잔기는 예컨대 4-위치에서 히드록실화에 의해 변형될 수 있다.

본 발명에 의해 고려할 수 있는 다른 변이체는 다양한 글리코실화 변이체를 포함한다. 변형된 글리코실화 패턴은 상이한 숙주 세포에서 재조합 분자의 발현으로부터 생길 수 있다. Ser, Thr 및 Hyp 잔기는 변형되어 O-글리칸을 함유할 수 있는 한편, Asn 및 Gln 잔기는 변형되어 N-글리칸을 형성한다. 본 발명에 따르면, 용어 "글리칸"은 당해 분야에 공지된 합성 또는 효소적 방법에 의해 변형된 아미노산의 히드록시, 아미노 또는 티올 기에 부착될 수 있는 N-, S- 또는 O-결합된 모노-, 디-, 트리-, 폴리- 또는 올리고당류를 지칭한다. 글리칸을 형성하는 단당류는 D-알로오스, D-알트로오스, D-글루코오스, D-만노오스, D-글루코오스, D-아이도오스, D-갈락토오스, D-탈로오스, D-갈락토오사민, D-글루코사민, D-N-아세틸-글루코사민 (GIcNAc), D-N-아세틸-갈락토사민 (GaINac), D-푸코오스 또는 D-아라비노오스를 포함할 수 있다. 이들 당류는 시알산 및 그의 조합물과 같은 1 이상의 O-설페이트, O-포스페이트, O-아세틸 또는 산성 기에 의해 구조적으로 변형될 수 있다. 글리칸은 D-페니실아민, 2,5- 및 할로겐화된 유도체 또는 폴리프로필렌 글리콜 유도체와 같은 유사한 폴리히드록실 기를 포함할 수 있다. 글리코시드 결합은 베타 및 1-4 또는 1-3, 바람직하게는 1-3이다.

글리칸과 아미노산 사이의 결합은 알파 또는 베타, 바람직하게는 알파이고 1-이다.

또한, 천연 펩티드(L-형태)와 관련된 고유한 문제는 천연 프로테아제에 의한 분해이며, 본 발명의 펩티드는 펩티드의 D-형태 및/또는 "레트로-인버소(retro-inverso) 이성질체"를 포함하기 위해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩티드의 짧은 부분, 변이체 또는 조합물의 레트로-인버소 이성질체도 제조한다.

천연 단백질분해로부터 펩티드를 보호하는 것은 특정 헤테로 이가 또는 헤테로 다가 화합물의 효능을 증가시켜야 한다. 천연 프로테이나제에 의한 분해로부터 보호하는 것으로 인하여 비-레트로-인버소 함유 유사체와 비교할 때 레트로-인버소 함유 펩티드에 대해 더 높은 생물학적 활성이 예상된다. 또한 이들은 증가된 안정성 및 더 낮은 면역원성을 나타내는 것으로 밝혀졌다[Sela M. and Zisman E., (1997) Different roles of D-amino acids in immune phenomena- FASEB J. 11, 449].

레트로-인버소 펩티드는 예컨대 Sela and Zisman (1997)에 기재된 바와 같이 공지된 서열의 펩티드에 대해 제조된다.

"레트로-인버소 이성질체"는 서열의 방향이 역전되고 아미노산 잔기의 키럴성이 반전되는 선형 펩티드의 이성질체를 의미하므로; 말단 기 상보성이 없을 수 있다.

본 발명은 1 이상의 펩티드 결합이 펩티다아제에 의해 분해되지 않은 다른 유형의 공유결합("펩티드 모의체")으로 치환된 유사체를 포함한다. 펩티드의 단백질분해성 분해에 이은 검체로의 주사가 문제인 경우, 특정 민간성 펩티드 결합을 비분해성 펩티드 모의체로 치환하는 것은 그로 인하여 생긴 펩티드를 더욱 안정하게 하므로 활성 물질로서 더욱 유용하게 한다. 이러한 모의체, 이들을 펩티드에 혼입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

t-부틸옥시카르보닐, 아세틸, 테일, 숙시닐, 메톡시숙시닐, 수베릴, 아디필, 아젤라일, 단실, 벤질옥시카르보닐, 플루오레닐메톡시카르보닐, 메톡시아젤레일, 메톡시아디필, 메톡시수베릴 및 2,4-디니트로페닐과 같은 아미노-말단 차단기도 유용하다.

본 발명의 μ-코노톡신의 조합물, 또는 그의 특정 생물학적 활성 단편의 조합물도 포함되며, 본 발명의 기존 펩티드의 효능, 선택성 및 안정성을 향상하기 위하여 제조될 수 있다.

바람직하게는 μ-코노톡신 펩티드는 pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys [서열번호 2] 및 pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-Met-Ala-Arg-Cys-Cys [서열번호 3]을 포함하는 군으로부터 선택된다.

통상 이들 펩티드의 C 말단은 아미드화(amidated)된다.

용어 μ-코노톡신 펩티드 또는 μ-코노톡신은 코누스 속으로부터 얻은 천연산출 독성 펩티드에만 한정되지 않고 오히려 펩티드가 유도되거나 유도될 수 있는 초기 공급원을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 μ-코노톡신뿐만 아니라 그의 단편, 그의 조합물 및 그의 변이체는 예컨대 Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory and Amblard et al. 2005 에 기재된 바와 같은 화학적 합성법 또는 재조합 수법과 같은 당해 분야에 공지된 다양한 방법 및 수법에 의해 제조할 수 있다.

재조합 수법을 이용하여 본 발명에 따른 μ-코노톡신 펩티드를 제조할 때, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 또는 그의 생물학적 활성 단편이 바람직하게 사용된다.

따라서, 본 발명은 상기 기재한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되고 정제된 핵산 서열에 관한 것이다.

"단리되고 정제된 핵산 서열"은 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 또는 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 핵산이 본 발명에 따라 존재하는 상태를 의미한다. 핵산은 천연 환경 또는 이러한 제제가 시험관내 또는 생체내에서 실시되는 재조합 핵산 기술에 의해 실시될 때 제조되는 환경(예컨대 세포 배양액)에서 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산과 천연적으로 관련된 물질을 포함하지 않는다.

용어 "핵산"은 DNA 또는 RNA를 지칭한다.

핵산이 DNA인 경우, 본 명세서에 사용될 수 있는 DNA는 이중쇄 DNA, 단일쇄 DNA, 1쇄 또는 양쪽 쇄가 2 이상의 단편으로 구성되는 이중쇄 DNA, 1쇄 또는 양쪽쇄가 분단되지 않은 포스포디에스테르 골격을 갖는 이중쇄 DNA, 1 또는 그 이상의 단일쇄 부분 및1 이상의 이중쇄 부분을 함유하는 DNA, DNA 쇄가 충분히 상보적인 이중쇄 DNA, DNA쇄가 오직 부분적으로 상보적인 이중쇄 DNA, 환형 DNA, 공유결합적으로 폐쇄된(closed) DNA, 선형 DNA, 공유 교차결합된 DNA, cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, 반합성 DNA, 생합성 DNA, 천연적 단리된 DNA, 효소분해된 DNA, 전단된 DNA, 라벨링된 DNA, 예컨대 방사능표지된 DNA 및 플루오로크롬-라벨링된 DNA, 1 이상의 비-천연 산출 핵산 종을 함유하는 DNA일 수 있다.

μ-코노톡신 펩티드, 또는 그의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 DNA 서열은 표준 화학 수법에 의해, 예컨대 포스포트리에스테르 방법 또는 자동화된 합성법 및 PCR 방법에 의해 합성될 수 있다.

본 발명에 따른 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 정제되고 단리된 DNA 서열은 효소적 수법으로도 합성될 수 있다. 따라서, 소정 인식 서열에서 핵산 분자를 절단하는 제한 효소를 사용하여 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 DNA (또는 RNA) 또는 그의 단편과 같은 핵산서열을 함유하는 대형 핵산 분자로부터 핵산 서열을 단리할 수 있다.

단일쇄 RNA, 이중쇄 RNA, 1쇄 또는 양쪽쇄가 2 이상의 단편으로 구성된 이중쇄 RNA, 1쇄 또는 양쪽 쇄가 분단되지 않은 포스포디에스테르 골격을 갖는 이중쇄 RNA, 1 이상의 단일쇄 부분 및 1 이상의 이중쇄 부분을 함유하는 1 또는 그 이상의 단일쇄 부분 및 1 이상의 이중쇄 부분을 함유하는 RNA, RNA 쇄가 충분히 상보적인 이중쇄 RNA, RNA쇄가 오직 부분적으로 상보적인 이중쇄 RNA, 공유결합적으로 폐쇄된(closed) RNA, mRNA, 화학적으로 합성된 RNA, 반합성 RNA, 생합성 RNA, 천연 단리 RNA, 라벨링된 RNA, 방사능표지된 RNA 및 플루오로크롬-라벨링된 RNA, 1 이상의 비-천연 산출 핵산 종을 함유하는 RNA를 비롯한 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) 형태의 핵산도 본 발명에 포함된다.

단리되고 정제된 핵산 서열, DNA 또는 RNA는 또한 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 대하여 실질적인 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 단리되고 정제된 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 실질적인 서열 상동성, 예컨대 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 핵산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 핵산 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.

본 명세서에 공지된 바와 같은 동일성이라는 것은 2 이상의 아미노산 서열 또는 2 이상의 핵산 서열을 비교함으로써 결정되는 관계이다. 이러한 서열의 스트링 사이의 맷치에 의해 결정되는 바와 같은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관계도이다. 동일성 및 유사성은 당업자에게 공지된 것이고 또 이들은 통상적인 방법으로 산출될 수 있다(예컨대 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. and Griffin, H. G. eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. eds. M. Stockton Press, New York, 1991, Carillo, H. and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073, 1988).

서열 사이의 최대 매치를 내기 위해 고안된 방법이 일반적으로 선호된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 GCG 프로그램 팩키지를 비롯한 시판되는 컴퓨터 프로그램으로 분류된다(Devereux J. et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387, 1984); BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul, S. F. et al. J. Molec. Biol. 215: 403-410, 1990). BLAST X 프로그램은 NCBI 및 기타 공급원으로부터 시판되고 있다(BLAST Manual, Altschul, S. et al. NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S. et al. J. MoI. Biol. 215: 403-410, 1990).

본 발명의 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 단리되고 정제된 핵산 서열에 대해 상보적인 핵산 서열도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 핵산 서열과 상이한 서열을 갖는 축퇴된(degenerated) 핵산 서열, 또는 그의 상보적 서열은 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 핵산은 기능적으로 μ-코노톡신 펩티드와 동일하지만 유전자 코드의 축퇴로 인하여 상이한 서열을 갖는다. 이것은 아미노산 서열에는 영향을 주지 않는 침묵 돌연변이(silent mutation)을 초래할 수 있다. 이러한 모든 핵산 변이체는 본 발명의 범위에 속한다.

또한 스트린젠트 조건하에서, 바람직하게는 높은 스트린젠트 조건하에서 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 핵산 서열과 혼성화(hybridizing)될 수 있는 핵산 서열, 그의 상보적인 핵산 서열 또는 그의 축퇴된 핵산 서열도 본 발명의 범위에 속한다. DNA 혼성화(hybridization)를 촉진하는 적합한 스트린젠트 조건은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾아 볼 수 있다. 예컨대, 약 45℃에서 6.0 X 염화 나트륨/나트륨 시트레이트 (SSC)에 이어 2.0X SSC의 세척을 50℃에서 실시할 수 있다. 스트린젠시(stringency)는 세척 단계에서 사용되는 조건에 따라서 선택할 수 있다. 예로서, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 0.2 X SSC의 높은 스트린젠시로부터 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서 온도는 높은 스트린젠시 조건에서, 약 65℃ 일 수 있다.

본 발명은 μ-코노톡신 펩티드의 말단이 절단된(truncated) 또는 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 단리되고 정제된 핵산을 포함한다. 용어 "말단이 절단된(truncated)"은 천연의 것보다 적은 아미노산을 함유하지만 동일 특성을 나타내는 펩티드를 암호화하는 서열을 지칭한다.

본 발명은 또한 기재된 단리되고 정제된 핵산 서열의 대립형질(allelic) 변이체를 포함한다; 즉, 단리되고 정제된 핵산에 의해 암호화되는 핵산과 동일하거나, 상동인 또는 관련된 펩티드를 암호화하는 천연 산출의 다른 형태의 단리되고 정제된 핵산이다. 다르게는, 비-천연 산출 변이체는 돌연변이 수법에 의해 또는 직접 합성법에 의해 생성될 수 있다.

기재된 단리되고 정제된 핵산 서열의 생물학적 활성 단편도 또한 포함되며 이것은 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 핵산 서열보다 길이가 작은 뉴클레오티드를 함유하는 서열, 그에 상보적인 핵산서열 또는 그의 축퇴된 핵산 서열을 지칭한다. 이 서열은 이것이 유도되는 천연 서열과 동일한 특성을 나타내는 한 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 서열은 μ-코노톡신 펩티드이 각 단리되고 정제된 핵산 서열에 비하여 길이가 90% 작은, 바람직하게는 60% 작은, 특히 30% 작은 아미노산을 함유한다.

본 발명은 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 단리되고 정제된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터의 선택은 당해 분야에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 소망하는 작용 특성, 예컨대 μ-코노톡신 펩티드 발현 및 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 기본으로 한다.

놀랍게도, 본 출원인은 본 명세서에 기재한 바와 같은 μ-코노톡신 펩티드가 마취제로서 적용하기에 유용하고 강력한 생물학적 활성을 가짐을 나타내었다. 이들 펩티드는 프로카인 또는 리도카인과 같이 국소 마취제로서 현재 사용되는 것에 비하여 더 우수한 활성과 더 긴 활성 지속 시간을 분명히 나타낸다. 이들 μ-코노톡신은 길고 효과적인 마취를 필요로 하는 특정 경우에 적용될 수 있다. 이들은 또한 프로카인 또는 리도카인과 같은 전통적인 마취제에 대하여 바람직하지 않은 부작용 또는 앨러지가 있는 경우에 대체 물질로 적용될 수 있다(Finucane B.T., 2005).

이들 μ-코노톡신은 또한 상기 인용한 특허 및 첨부한 예에 기재된 과학 문헌에서 얻을 수 있는 데이터와 대조하는 것에 의해 생물학적 활성에서 더 우수한 능력을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 보조제와 조합된 상술한 바와 같은 1 이상의 μ-코노톡신 펩티드 약학적 유효량을 활성성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

"약학적 유효량"은 인간 또는 동물 생물에 투여될 때 검출가능한 약리적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화학물질 또는 화합물을 지칭한다.

각 약학적 유효량은 처리할 특정 환자, 처리할 질병 및 투여방법에 따라 달라질 수 있다. 또한, 약학적 유효량은 특히 펩티드가 상술한 바와 같이 약물을 부가적으로 함유할 때 사용한 특정 펩티드에 따라 달라진다. 치료는 보통 약학적 조성물의 다수회 투여를 포함하며, 통상 몇 시간, 몇 일 또는 수주 간격으로 한다. 폴리펩티드의 투여 단위의 약학적 유효량은 치료할 환자의 체중 kg당 0.001 ng 내지 100 ㎍이다. 체중 kg당 0.1 ng 내지 10 ㎍ 범위도 바람직하다.

바람직하게는, 상기 기재한 바와 같은 1 이상의 μ-코토톡신 펩티드 이외에, 약학적 조성물은 1 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 보조제를 함유할 수 있다.

활성 화합물을 약학적으로 사용할 수 있는 제제로 가공하기 위한 허용되는 담체, 희석제 및 보조제는 적용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성이며 또 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화방지제; 방부제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 오르벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화무, 예컨대 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예컨대 Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 포함한다.

약학적 조성물의 투여형태는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 예컨대 이러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피부내, 근육내, 복강내, 코내, 경피, 볼내 경로 와 같은 다양한 비경구적 경로 또는 이식 가능한 장치(implanted device)를 통할 수 있고, 또 연동식(peristaltic) 수단에 의해 전달될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 μ-코노톡신 또는 약학적 조성물을 포함하는 이식 가능한 장치를 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 μ-코노톡신 펩티드를 활성제로 포함하는 약학적 조성물 뿐만 아니라 마취제는 생체흡수성 매트릭스에 혼입되거나 함침될 수 있으며, 상기 매트릭스는 매트릭스의 현탁액, 겔, 또는 고체 지지체 형태로 투여될 수 있다. 매트릭스는 생중합체로 구성될 수 있다.

서방형 제제가 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 μ-코노톡신 펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반 투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형 물품 형태, 예컨대 필름, 미세구체, 삽입물 또는 마이크로캡슐 형태일 수 있다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(에컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올), 폴리락티드(미국특허 3,773,919호), L-글루탐산과 [감마]에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT(^TM) (락트산-글리콜산 공중합체 및 로이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여용으로 사용되는 제제는 멸균이어야 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명의 μ-코노톡신 펩티드의 적합한 투여는 수용체의 연령, 성별, 건강, 및 체중, 동시 행해지는 치료의 종류 및 소망하는 효과의 성질에 따라 달라질 것임을 이해해야 한다.

적합한 투여형태는 징병, 펩티드 및 투여형태에 따라 달라지며; 가능성은 정제, 캡슐, 로젠지, 치과 페이스트, 좌약, 흡입제, 용액, 연고, 크림 및 비경구 데포(parenteral depot)를 포함한다.

흡입제의 경우, 스프레이 형태가 바람직하다. 본 발명의 μ-코노톡신의 경비 제제는 예컨대 효과적인 상피적 나트륨 채널 억제를 제공하기 위해 제조한다. 경비 스프레이를 통하여 주사될 양은 연령 및 체중과 같은 검체 특징에 따라 달라진다. 유효 투여 범위의 결정은 당업자에게 통상적인 기술이다.

특정 제제의 예의 경우, 약 30 내지 약 300 μL의 부피를 갖는 매일 경비 스프레이 제제 중의 μ-코노톡신의 양은 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍의 μ-코노톡신의 매일 투여량을 전달할 수 있다. 매일 스프레이 부피는 소망하는 매일 스프레이 부피를 달성하기 위하여 1, 2 또는 그 이상의 별개 전달형태로 투여될 수 있다. 경비 제제 중의 스프레이 부피 및 μ-코노톡신의 양은 소망하는 매일 투여량을 달성하기 위하여 개별적으로 조정될 수 있다.

μ-코노톡신 펩티드의 아미노산의 아미노산 변형은 본 발명에 포함되기 때문에, 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드를 수용성 매트릭스 또는 다른 고분자 담체에 교차결합시키거나, 또는 혈액내 장벽을 통한 용해도, 흡착성 및 투과성을 향상시키는데 유용할 수 있다. 이러한 변형은 당업자에게 공지되어 있고 또 펩티드의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 감쇠시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 약학적 조성물은 μ-코노톡신 펩티드를 활성제로서 포함하지만, 대체성 약학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 단리되고 정제된 핵산 서열을 활성제로 함유할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 전체 단리되고 정제된 DNA 서열, 상기 단리되고 정제된 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터에 의해 미리 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 후자의 예로서, 숙주 세포는 바람직하게는 항원성 문제를 피하기 위하여 치료할 환자로부터 단리할 것이다. 이들 유전자 및 세포 요법 접근법은, 상기 정제되고 단리된 DNA 서열, 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터에 의해 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포가 환자의 세포에 혼입되어 들어가서 단백질 내생성을 생성하기 때문에, 약학적 조성물의 반복 투여를 필요로 하는 환자에게 적합할 것이다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 약학적 조성물은 통증의 치료 또는 예방을 위해 사용된다. 치료되거나 예방될 통증은 예컨대 편두통, 급성 통증, 지속 통증, 만성 통증, 신경통 통증 또는 통각수용기 통증(nociceptive pain)을 포함하는 군으로부터 선택된다.

다르게는, 본 명세서에 기재된 약학적 조성물은 포낭성 섬유증 또는 오토-리노(oto-rhino)-후두 질환을 치료하기 위해 사용된다.

본 발명의 μ-코노톡신은 나트륨 채널 억제제이기 때문에, 상피성 나트륨 채널에 의한 나트륨 흡수 향상을 차단하기 위하여 상피 또는 코 막에 적용될 수 있다. 이것은 점막 점도를 저하시키고 또 폐 액체 및 콧물과 같은 외부 생물학적 액체의 더 우수한 제거를 증진하는 효과를 갖는다. 이 점에서 μ-코노톡신은 저농도에서 포낭성 섬유증 질환 및 점막 생산이 정상치 이상인 염증 상태와 관련된 막에 존재하는 나트륨 채널을 억제한다. 본 발명의 μ-코노톡신을 마이크로몰 및 서브마이크로몰 범위로 포함하는 약학적 조성물의 상이한 농도의 적용은 점액에서 생물학적 유체의 축적 제거를 더 잘 유도할 것이다. 따라서 μ-코노톡신은 점액에서 비정상적 유체 분비를 나타내는 오토-리노-후두 염증 상태에서 치료 가능성을 갖는다. μ-코노톡신의 적용은 포낭성 섬유증에 생기는 비정상적 폐 분비의 치료에 공헌한다.

전압 민감성 나트륨 채널과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 의약을 제조에 있어서 본 발명의 약학적 조성물의 용도도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 μ-코노톡신은 주로 의도한 목적을 달성하기 위한 양으로 사용된다. 통증을 치료 또는 예방하기 위한 용도의 경우, 펩티드 또는 그의 약학적 조성물은 치료 유효량으로 투여되거나 적용된다. "치료 유효량"은 증상을 완화 또는 예방하기 위해 효과적인 양이다. 치료 유효량의 결정은 본 명세서에 제공된 본 발명의 상세한 설명을 참조하여 당업자가 용이하게 결정할 것이다.

전신 투여의 경우, 치료 유효량 또는 투여량은 시험관내 분석으로부터 먼저 추정된다. 예컨대, 투여량은 세포 배양에서 측정된 바와 같은 IC50을 비롯한 순환성 농도 범위를 달성하기 위한 동물 모델에서 결정될 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.

초기 투여량은 또한 당업자에게 공지된 수법을 이용하여 생체 내 데이터, 예컨대 동물 모델로부터 산출할 수 있다. 당업자는 동물 데이터를 기본으로 하여 사람에게 투여하기 위한 적절한 양을 선택할 것이고, 물론 치료할 환자, 환자의 체중, 질병의 심각도, 투여방식 및 처방 의사의 판단에 따라 다를 것이다.

마취제의 제조에서 본 발명의 약학적 조성물의 용도도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 1 이상의 μ-코노톡신 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 약학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 마취를 필요로 하는 외과 처치를 받는 환자에서 근육골격 이완을 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "투여된" 또는 "투여하는"은 "제공하는" 또는 "접촉하는"을 의미하며 또 약학적, 치료적 또는 마취 조성물을 환자,바람직하게는 사람과 접촉시키는 것을 지칭한다.

통상 상술한 방법에서, 1 이상의 μ-코노톡신 펩티드를 국소적 마취제로서 투여한다. 바람직하게는, 1 이상의 μ-코노톡신 펩티드는 예컨대 안과에서 근육긴장이상 치료, 이비인후과에서 항문열창 치료, 피부학에서 외상치료, 성형외과에서 섬유근육통 및 만성 근육근막통증의 치료뿐만 아니라 모든 통증의 치료에 사용된다.

바람직하게는, 1 이상의 μ-코노톡신 펩티드는 안과 마취제로서 투여된다.

본 발명의 1 이상의 μ-코노톡신 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 약학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 국소 마취 방법도 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게는 본 발명의 μ-코노톡신 펩티드 또는 약학적 조성물의 상기 약학적 유효량은 실시예에 기재된 바와 같이 긴 지속 효과를 제공한다.

바람직하게는, 긴 지속 효과는 치료할 환자 및/또는 사용된 본 발명의 μ-코노톡신의 농도에 따라 약 30분 내지 48시간이다. 그러나, 어떤 경우든, 상기 지속 시간은 리도카인 또는 프로카인과 같은 전통적인 마취제에 비해 지금까지 기재된 지속시간보다 더 길다. 바람직하게는 지속시간은 30분 내지 12시간이다.

본 발명에 기재된 약학적 조성물 또는 μ-코노톡신 펩티드를 포함하는 마취제도 본 발명의 범위에 포함된다.

바람직하게는 상기 마취제는 피하, 정맥내, 피부내, 근육내, 복강내, 코내, 경피, 볼내 경로 또는 이식 가능한 장치에 적합하다.

통상, 마취제는 정제, 캡슐, 로젠지, 치과용 페이스트, 좌약, 흡입제, 용액, 연고, 크림 및 비경구적 데포(depot) 형태이다. 바람직하게는, 흡입제는 스프레이이다.

도 1은 천연 μ-코노펩티드 CnIIIA의 전자스프레이 이온화 질량 스펙트럼을 도시한다. 질량측정은 양이온 모드 및 TOF-MS 배치로 QTOFI 질량 분광계 상에서 실시하였다. 나타낸 질량은 측정된 모노아이소토픽(monoisotopic) 분자 질량이다. CnIIIA의 칼륨 부가생물이 확인될 수 있다.

도 2는 합성 및 천연 μ-코노펩티드 CnIIIA의 확인 대조이다. (A) 합성, 천연 및 양쪽 펩티드의 50:50 혼합물의 역상 HPLC에 의한 공용출 실험. (B) 감소된 합성 CnIIIA (상부)와 감소된 천연 CnIIIA (하부)의 MS/MS로서, 동일 단편 거동을 나타낸다.

도 3은 마우스 편측횡경막 수축시 μ-코노펩티드 CnIIIA의 효과를 도시한다. (A) 마우스 편측횡경막의 직접 자극에 의해 유발된 근육 수축시 CnIIIA의 효과. 100 내지 600 nM의 CnIIIA의 부재하 및 존재하에서 기록된 수축의 자취. (B) 수축시 CnIIIA의 효과의 투여량-반응 곡선. CnIIIA의 각 농도의 경우, 수축의 최대 진폭은 대조군 값을 기초로 하여 표시된다. 이론적 곡선은 나타낸 방정식으로부터 확립되었고, Hill 수(n_H)는 1.78이고 또 수축의 50% 억제에 필요한 CnIIIA 농도는 150 nM이다. n회 실험의 평균값 ± SEM.

도 4는 개구리의 큐테이너스 펙토리스(Cutaneous pectoris) 근육 조직표본에서 기록된 작용 전위 및 시냅스 반응에 대한 μ-코노펩티드 CnIIIA의 효과를 도시한다. (A) 개구리의 큐테이너스 펙토리스(Cutaneous pectoris) 근육에서 기록된 근육 작용 전위에 대한 CnIIIA의 효과: 1 μM CnIIIA를 바스 용액(bathing solution)에 적용하기 전 및 적용한 후 상이한 시점에서 작용 전위 트레이스 및 운동 신경 자극에 대하여 기록된 EPP. 근육 작용 전위의 점진적 차단이 확인될 수 있다. (B) 개구리의 큐테이너스 펙토리스(Cutaneous pectoris) 근육에서 기록된 시냅스 반응에 대한 CnIIIA의 효과: 1 및 2 μM 의 CnIIIA의 부재하 및 존재하에서 기록된 MEPP의 평균 트레이스.

도 5는 마우스로부터 단리한 좌골신경의 GAP(global action potential)에 대한 μ-코노톡신 CnIIIA의 효과를 도시한다. (A) GAP는 대조 조건으로(독소 부가되지 않음) 0.1 내지 15 V로 다양한 세기로 0.05 ms 자극에 감응하여 기록하며 또 신경을 다양한 농도의 코노톡신 CnIIIA (0.1 내지 50 μM)으로 처리할 때. (B) 0.05 ms 자극의 상이한 세기 및 상이한 농도의 CnIIIA 독소(죄측 패널)에 대한 GAP의 진 폭. (C) 이 표는 다양한 세기(0.1 내지 15V)에서 0.05 ms 자극 후에 기록된 GAP의 상이한 변수를 요약한다. ⁽¹⁾ 15V 자극 후에 μ-코노톡신을 사용하거나 사용하지 않고 기록된 최대 진폭의 비율. ⁽²⁾ 15V 자극 후에 최대 진폭의 50%에 상응하는 자극의 세기. n의 좌골 신경에 대한 평균 ± SEM 이다.

도 6은 다양한 농도(0.1 내지 50 μM)의 코노톡신 존재하에서 기록된 마우스 좌골 신경의 GAP에 대한 μ-코노톡신 CnIIIA의 효과를 도시한다. 다양한 농도(0.1 내지 100 μM)의 독소에서 기록된 GAP의 최대 진폭을 대조용 값에 따라 표현하였다. 이론적 곡선은 다음 방정식: A_CnIIIA /A_C = 1/[1 + ([μ-코노톡신 CnIIIA]/K_D)_NH] 에 따라 산출하였다. Hill 수(nH)는 1.02이고 또 GAP의 50%를 차단하는데 필요한 독소 농도(K_D)는 1.53 μM이었다. n개 좌골 신경의 평균 값 ± SEM.

도 7은 마우스로부터 단리된 좌골 신경의 GAP에 대한 μ-코노톡신 CnIIIA 효과의 가역성의 연구를 도시한다. GAP는 2, 10 또는 50 μM의 CnIIIA 독소로 처리되거나 또는 새로운 포유동물 링거액 중에서 16시간 또는 24시간 동안 세척된 신경과 대조하여 제어 조건에서 다양한 세기(0.1 내지 15 V)로 0.05 ms 자극을 가한 경우에 기록하였다. n개 좌골 신경의 평균 값 ± SEM.

도 8은 유로피언 파이크(에속스 루시우스(Esox lucius))로부터 단리한 후각 신경의 GAP(global action potential)에 대한 μ-코노톡신 CnIIIA의 효과를 도시한다. (A) GAP는 제어 조건에서(독소 부가되지 않음) 1 내지 15V으로 다양한 세기로 8 ms 자극에 반응하여 기록하며 또 신경은 다양한 농도의 코노톡신 CnIIIA (0.02 내지 1 μM)으로 처리하였다. (b) 상이한 세기의 8 ms 자극 및 상이한 농도의 CnIIIA 독소에 대하여 상이한 접촉 시간으로 반응한 GAP의 진폭(좌측 패널 참조). (C) 이 표는 다양한 세기(1 내지 15 V)에서 8 ms 자극 후 기록된 GAP의 상이한 변수를 요약한다. ⁽¹⁾ μ-코노톡신을 사용하거나 사용하지 않고 15V 자극후 기록된 최대 진폭 사이의 비율. ⁽²⁾ 15V 자극에 이은 최대 진폭 50%에 상응하는 자극의 세기. n개 후각 신경의 평균 값 ± SEM.

도 9는 다양한 농도(0.01 내지 10 μM)의 코노톡신 존재하에서 기록된 유로피언 파이크(에속스 루시우스(Esox lucius))로부터 단리한 후각 신경의 GAP(global action potential)에 대한 μ-코노톡신 CnIIIA의 효과를 도시하며, 대조값과 상대적으로 표시한다. 다양한 농도(0.1 내지 10μM)의 독소에서 기록된 GAP의 최대 진폭은 대조값에 따라 표시하였다. 이론적 값은 다음 방정식A_CnIIIA /A_C = 1/[1 + ([μ-코노톡신 CnIIIA]/K_D)_NH] 에 따라 산출하였다. Hill 수(nH)는 1.09이고 또 GAP의 50%를 차단하는데 필요한 독소 농도(K_D)는 0.15μM이었다. n개 후각 신경의 평균 값 ± SEM.

도 10은 μ-코노톡신 CnIIIA의 표면 마취 효과 및 리도카인의 값에 대한 그의 대조를 도시한다. 마취 효과의 세기는 각 시험 농도에 의한 눈-안검 반사를 유도하지 못하는 자극의 전체 수로서 표현한다. 데이터는 6개의 상이한 측정의 평균 값 ± SEM를 나타낸다.

도 11은 마우스 상의 생체내에서 얻은 DAS(Digit Abduction Score)를 도시한다.

도 12는 마우스 상의 생체내에서 얻은 그립(grip) 세기 평가를 도시한다.

도 13은 40분간 배양한 후 CnIIIA (100 nM)과 대조하는 것에 의한 각 펩티드 (100 nM)에 대하여 측정한 근육의 상대적 평균 수축 억제를 도시한다. CnIIIA는 용이한 대조를 위하여 100%로 기준화되었다. 모든 펩티드 SmIIIA, PIIIA 및 T3.1은 CnIIIA에 비하여 더 낮은 활성을 나타낸다.

도 14의 A는 500 nM의 CnIIIA의 존재하에서 시간 함수로 Naν1.4 전류 자취를 도시한다. B는 500 nM의 CnIIIA 농도를 이용하여 Naν1.4 전류/Naν1.4 최대 전류를 시간에 대하여 플로팅하였다. 전류는 1로 기준화하였다. 보유 전위는 90 mV이었고 또 시험 전위는 -10 mV 이었다.

도 15의 A)는 대조용으로 HEK 세포에서 기록된 나트륨 전류를 도시한다. B)는 50 nM CnIIIA 존재하에서 나트륨 전류를 도시하고 또 C)는 CnIIIA에 의한 나트륨 전류 억제를 시간의 함수로 나타낸다. 안정한 상태 후 세척 단계는 차단 효과를 억제하는데 있어서 효과적이지 않다.

실시예 1:

재료 및 방법

재료

코누스 콘소르스(Conus consors) 종을 체스터필드 섬(뉴 칼레도니아)에서 수집하고 -80℃에서 즉각 냉동시켰다. 새로이 해부된 독액 관 장치로부터 독액을 얻고 물 중의 0.08% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 추출하였다. 몇 개 독액 관으로부터 얻은 추출물을 원심분리하여 불용성 입자를 제거하였다. 모든 추출물의 상층액을 모으고, 냉동건조시키고, 중량측정한 다음 -80℃에서 사용이 필요할 때까지 저장하였다.

크로마토그래피

조 냉동건조된 독액의 분획(fractionation)은 TSP-150 UV 검출기를 구비한 Thermo Separation Proudct (TSP) 고압 액체 크로마토그래피 계를 이용하여 실시하였다. 역상 크로마토그래피에 사용된 용리 완충액은 다음과 같다: 완충액 A, H2O/0.1% TFA; 완충액 B, H2O/CH3CN 40/60 0.1% TFA. 조 독액 상에서 반보존적 전개(run)는 다음 성분을 사용하는 C18 Vydac 218TP510 컬럼을 사용하여 실시하였다. 프로그램은 0-8% B/5분, 8-80% B/70분, 80-100% B/10분, 이어 100% B/10분. (유동 속도, 2 ml/분). 분석용 C18 Vydac 218TP54 컬럼을 사용한 다른 정제 단계는 0-10% B/5분, 10-20% B/10분, 20-40% B/40분과 같은 구배로 실시하였다. 분획을 220 nm에서 검출하였다.

아미노산 조성 및 에드만 서열결정( sequencing )

바이얼의 바닥에서 200 ml의 6M HCl을 부가하는 것에 의해 펩티드 샘플을 가수분해하고 배기시킨 다음 밀폐하고 또 120℃에서 16시간 동안 가열하였다. 가수분해물은 유리 아미노산을 이들의 페닐티오카르바모일 유도체로 전환하기 위한 온-라 인 유도화기(모델 420A)를 구비한 자동 분석기(Applied Biosystems, 모델 130A) 상에서 분석하였다. 서열결정 시험은 자동 Applied Biosystems 477A 마이크로서열결정기 상에서 에드만 분해에 의해 실시하였다. 서열결정화하기 전에, 균질 펩티드는 6M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.5M 트리스/HCl, 2mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) (pH 7.5)에 의해 1시간 동안 환원된 다음 4-비닐피리딘(1.5 μM)을 사용하여 실온에서 3시간 동안 처리하였다. 이 펩티드 유도체는 C₁₈ Vydac 컬럼 (4.6 mm x 25 cm, 5 ㎛ 입자 크기)를 이용한 역상 HPLC에 의해 정제하였다.

질량 분광측정

분자 질량 측정은 전자스프레이 이온 공급원을 구비한 QTOF I 기구 (Micromass/Waters, USA) 상에서 실시하였다. 샘플 분석은 H2O/CH3CN/HCOOH(49.9/49.9/0.2)의 캐리어 주입 용매를 이용하여 포지티브 모드로 실시하였다. TOF-MS 배치를 갖는 단일 MS 실험을 사용하여 단순한 분자 질량 측정에 사용하였다. 구조적 조사를 위해 탄뎀 질량 분광측정법을 실시하였다. 이 배치에서, 모 질량은 쿼드러폴(quadrupole)을 이용하여 선택하였고, 또 충돌 유도된 분리는 충돌 에너지를 수동 조절하는 것에 의해 실시하였다. 이 경우, 천연 샘플은 암모늄 비카보네이트 (pH 7.8)중의 100 mM 디티오트레이톨(DTT)를 사용하여 56℃에서 3시간 동안 미리 환원시켰다. 환원된 펩티드는 제조사 순서에 따라서 ZipTip (Millipore, USA)을 이용하여 탈염시켰다. 얻어진 다수-하전된 스펙트럼은 MaxEnt3 옵션을 사용하여 소프트웨어 MassLynx (Micromass/Waters, USA)의 도움으로 단일 하전된 데이터로 전환하였다. 수동 및 반자동 데이터 처리는 서열 특징화를 위해 조작하였다.

펩티드 합성

고상 합성은 Applied Biosystems로부터 입수한 맞춤 변형된 433 A 펩티드 합성기 상에서 그 자리 중화/2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로-포스페이트 (HBTU) 활성화 수법을 이용하여 단계별로 Boc 화학 사슬 연장법에 대해 실시하였다. 사슬 조립을 완성한 후, 펩티드를 보호해제하고 5% p-크레졸을 스캐빈저로 하고 무수 HF를 사용하여 0℃에서 1시간 동안 처리하여 수지로부터 절단해내었다. 절단 후에, 펩티드를 얼음-냉각 디에틸에테르를 사용하여 석출시키고, 무수 아세토니트릴에 용해시키며 냉동건조시켰다. 펩티드를 완충액 B (아세토니트릴/10% H₂O/0.1% 트리플루오로아세트산)의 선형 구배를 이용함으로써 Vydac C18 칼럼을 사용하는 RP-HPLC에 의해 정제하고 또 214 nm에서 UV 검출하였다. 샘플은 Platform II 기구(Micromass, Manchester, England 소재)를 이용한 전기스프레이 질량 분광측정으로 분석하였다.

펩티드의 산화적 폴딩(folding)을 위하여, 재료(약 0.5 내지 1 mg/mL)를 0.5M GuHCl, 100 mM 트리스, pH 7.8 (0.5 mM 환원되고 또 0.1 mM 산화된 글루타치온 함유)에 용해시켰다. 실온에서 부드럽게 철야 교반한 후, 단백질 용액을 상기 기재한 바와 같은 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 폴딩(folding) 단계의 전체 수율은 약 35% 이었다.

개구리 및 마우스 신경근육 조직표본

큐테이너스 펙토리스(cutaneous pectoris ) 근육 및 관련된 신경을 20-25 g 중량의 이중 척수(double pithed) 웅성 개구리(라나 에스쿨렌타(Rana esculenta))로부터 제거하고 (mM) NaCl, 115.0; KCl, 2.0; CaCl₂, 1.8 및 HEPES 완충액, 5.0 (pH 7.25)를 함유하는 표준 용액으로 관류된(superfused) 2 ml 조직 바스(bath)의 기저에 고정하였다. 일부 실험에서, 큐테이너스 펙토리스 근육 조직표본을 2M 포름아미드로 처리함으로써 여기-수축을 분리하였다. 좌우측 편측횡경막 근육과 이들의 관련 가로막 신경은 척추 경부를 이탈시킨 다음 즉각적인 출혈에 의해 치사된 스위스-웹스터 마우스(20-25 g)로부터 단리하였다. 2개의 편측횡경막을 분리하고 각각을, 다음 조성(mM): NaCl, 154.0 ; KCl, 5.0 ; CaCl₂, 2 ; MgCl₂, 1.0 ; HEPES 완충액, 5.0 ; 글루코오스, 11.0을 갖는 생리적 용액(포유류 krebs-Ringer 용액)으로 관류된 로도르실(Rhodorsil)(Rhone-Polulenc, St. Fons France)-라이닝된 기관 바스(2 ml 부피)에 장착하였다 순수한 O₂ 로 배기된 용액은 pH7.4를 가졌다.

마우스 좌골신경 조직표본

척추 경부를 이탈시켜 죽인 마우스로부터 양측 좌골신경(좌측 및 우측)을 분리하였다. 신경은, 사용하기 전에, 산소처리된 포유류 Krebs-Ringer 용액으로 실온에서 30분간 헹구었다.

파이크 후각 신경 조직표본

절두된 파이크(에속스 루시우스(Esox lucius))로부터 좌우측 후각 신경을 제 거하였다. 각 신경은, 사용하기 전에, 실온에서 30분간 산소처리된 파이크 링거 용액(82.5mM NaCl, 2.5mM KCl, ImM CaCl₂, 1 mM Na2HPO4 완충액, 5mM HEPES, 1 mM MgCl₂, NaOH에 의해 pH 7.3으로 조정)으로 헹구었다.

마우스 신경근 조직표본에 대한 기계적 기록

이 유형의 실험에서, 마우스 편측횡경막 근육의 한 쪽 단부는 조직 바스에 고정하고 또 다른 단부(힘줄)는 등척성(isometric) 트랜스듀서(FT03, Grass Instruments)에 부착하였다. 흡인 전극을 통하여 0.1 Hz 주기로 0.15 ms의 지속시간의 전류 펄스를 이용한 운동 신경의 자극에 의해 수축을 유발하였다. 각 조직 표본의 휴식기 긴장은, 정상 조건에서, 근육의 직접적 자극 또는 운동 신경을 통한 간접적 자극에 의해 최대 수축 반응이 얻어지도록 조정하였다. 트랜스듀서로부터 기록된 긴장 신호를 증폭하고, 수집하며 디지털 인터페이스 (DT-2821, Data Translation)를 구비한 컴퓨터의 도움으로 디지털화하였다. 실험은 실온에서 실시하였다.

개구리 및 마우스 신경근육 조직표본에 대한 전기생리학적 기록

단리된 신경근육 조직표본의 운동신경은 신경의 직경에 맞추어진 흡인 미세전극을 통하여, 0.05-0.1 msec 지속시간의 펄스 및 최대초과 전압(전형적으로 3-8V)을 이용하여 자극하였다. 이들 펄스는 자극 단리 단위에 연결된 S-44 자극기(Grass Instruments, 미국 웨스트 워윅 소재)에 의해 생성되었다. 막전위 및 시냅스 전위는 통상의 수법 및 Axoclamp-2A 시스템(Axon Instruments, 미국 캘리포니 아 포스터 시티 소재)을 이용하여 3M KCl (8-12 MΩ 저항)으로 충전된 세포 내 미세전극을 이용하여 실온에서 종판 영역으로부터 기록하였다. 기록들은 시험한 코노톡신을 적용하기 전 및 적용하는 동안, 동일한 종판으로부터 연속적으로 실시하였다. 증폭 후 전기적 신호는 디지털 오실로스코프 상에 나타내었고 또 변조된 디지털 오디오 처리기(Sony PCM 701 ES) 및 비디오 카세트 리코더 (Sony SLC9F)를 이용하여 비디오 테이프 상에 동시에 기록하였다. 데이터를 수집하고 25 kHz의 샘플링 속도로 아날로그 및 디지털 I/O 인터페이스 보드(DT2821, Data Translation Marlboro, 미국 소재)를 구비한 컴퓨터를 이용하여 디지털화하였다. 컴퓨터화된 데이터 취득 및 분석은 존 뎀프스터 박사(스코트랜드에 소재하는 유니버시티 오브 스트라트클리드)가 제공한 프로그램을 이용하여 실시하였고 또 진폭 및 시간 경과에 대하여 개별적으로 미니어쳐(miniature) 종판 전위(MEPP)를 분석하였다. 각 연구된 조건당 3-6개 개별 실험을 실시하였고 결과를 평균하여 평균 ± 평균 표준 편차(S.E.M)를 구하였다. 통계적 시험은 스투덴트(student)의 시험을 이용하여 실시하였고 p < 0.05는 유의성을 나타내는 것으로 본다.

마우스 및 파이크 신경 상에서 전기생리학적 기록

마우스 또는 파이크 후각 신경으로부터 얻은 좌골 신경을 플렉시글래스 챔버에 연결된 2쌍의 백금 와이어 (내부 직경 0.5 mm) 상에 장착하였다. 자극을 위해, 첫번째 쌍의 전극을 자극기(S-88, Grass Instruments)에 연결시켰고, 이것은 다양한 진폭 및 시간에서 직각맥박의 전류를 전달하였다. GAP(Glabal action potential)를 기록하기 위하여, 두번째 쌍의 전극을 집에서 만든 차동 진폭기에 높 은 이득(gain)으로 연결하였다. 부가적인 백금 와이어를 이용하여 양쪽 전극쌍을 접지시켰다. 전기적 자극에 반응하여, 신경 활성을 수집하고, 디지털화하여 소프트웨어 프로그램 Axon Pclamp version 6.0 (Axon instruments)을 이용하여 아날로그 및 디지털 변환기를 구비한 컴퓨터 상에 기록하였다. 모든 실험은 실온에서 실시하였다. 기록하는 동안, 신경은 단락을 피하기 위하여 어떠한 용액과도 밀착 접촉함 없이 습실에서 유지하였다. 각 기록하는 사이, 신경은 링거 용액 또는 시험 용액이 채워진 작은 용기 중, 4℃에 위치시켰다.

토끼 눈에 대한 생체내 실험

표면 신경 말단 단부 상에서 CnIIIA의 국소 마취 활성은 생체 내 토끼 각막에서 결정하였다. 이를 위하여, 1.5-2 kg 중량의 칼러 눈을 갖는 성체 웅성 칠레 토끼를 사용하였다. 시험 용액을 한쪽 눈의 결막 주머니에 주입하고 2분간 방치하였다. 눈-안검 반사가 유발될 때까지 약 2 Hz의 주파수로 나일론 모(hair) 자극기로부터 압력에 의해 각막에 자극을 가하였다. 각 자극 기간은 눈-안검 반사가 유발되면 100 자극 또는 그 이하로 구성된다. 5분 이상의 간격은 2개 자극 기간을 분리하였다. 마취 활성의 세기는 눈-안검 반사가 다시 나타날 때까지 시험 용액 또는 마취 용액을 투여로부터 각막에 인가될 수 있는 자극의 전체 수로서 나타내었다. 이 방법은 상기 효과의 지속 시간의 측정을 허용하였다. 리도카인 HCl (시그마-알드리히)를 염수 용액으로 사용하였고 또 그의 pH 값은 1N NaOH를 사용하여 6.9±0.01로 조정하였다.

실시예 2:

결과

단리, 정제 및 신규 μ- 코노펩티드의 특징화

건조된 독액을 물 중의 0.08% TFA에 용해시키고 또 반보존적 C18 Vydac 컬럼 상에 10 mg의 뱃치로 로딩(load)하였다. 크로마토그램에서 약 20분에서 용출되는 분획은 분석을 위해 더 정제하였다. 이 분획은 개구리 신경근 접합부에 대하여 강력한 예비적 활성을 나타내었다. 이 분획을 생체 밖 조직표본에 적용하면 운동 신경의 자극에 의해 유발되는 근육 수축의 차단을 유도하였다. 이 분획을 정제하여 UV 크로마토그램 및 ESI-MS 질량 스펙트럼(도 1)에 의해 도시된 바와 같이 동일성을 평가하였다. 이 분획을 몇 회 에드만 분해 처리하였으나, 어떠한 결과도 얻지 못했다. 이 분획의 아미노산 분석은 몇 개의 상이한 아미노산의 확인을 초래하였고(결과는 도시하지 않음), 따라서 이는 상기 분획이 펩티드 성질이지만 볼로킹된 N-말단을 가지는 것임을 나타낸다. 상기 화합물을 더 특징화하기 위하여, 상기 분획을 DTT를 사용하여 환원시키고 또 분석하기 전에 샘플을 탈염시켰다. 탈염된 샘플에 대하여 탄뎀 질량 분광측정을 실시하였다. m/z 596에서 4x 장입된 종의 선택 및 충돌 에너지의 조정은 펩티드의 적절하고 균질한 단편화를 허용하였다. 상기 데이터의 매뉴얼 해석에 의해 22개 아미노산을 갖는 펩티드 서열을 확인하였다. 앞서 공개된 μ-코노펩티드와 상동성을 공유하였고 따라서 이를 CnIIIA라 칭하였다(표 4).

CnIIIA 의 화학적 합성

펩티드를 상술한 바와 같이 조립하였다(펩티드 합성 참조). 이 합성 펩티드 를 산성화된 물 중의 ACN 구배를 사용한 역상 HPLC에 의해 균질성을 갖게 정제하였다. 펩티드 순도 및 통합성은 ESI-MS에 의해 조절하였다. 선형 펩티드의 산화적 재폴딩을 조사하기 위하여 몇 가지 조건을 시험하였다. 펩티드를 트리스 완충액(100 mM), pH 7.8 중에 구아니디늄 클로라이드 (0.5 M)와 함께 용해하고, 공기 산화 하, 4℃에서 또는 다양한 비율의 환원된/산화된 글루타치온을 함유하는 혼합물 중에 방치하였다. 최종 리폴딩 시험은 트리스 100 mM, 구아니디늄 클로라이드 0.5M 및 환원/산화된 글루타치온 0.5 mM/0.1mM을 사용하여 실시하였다. 이 혼합물을 실온에서 철야로 교반하에 방치하였다. 이것을 아세트산으로 산성화시키고, 또 제조자의 지시에 따라 C18 SepPak 카트릿지를 이용하여 농축시켰다. 최종 폴딩된 펩티드는 역상 크로마토그래피에 의해 반보존적 규모로 정제하였다. 이것은 균질한 것으로 보이며 선형 성분으로부터 출발해서 35% 수율을 초래하였다. 합성 화합물의 순도는 HPLC 및 ESI-MS 분석에 의해 평가하였다. 합성 펩티드의 천연 형태와의 확실성은 HPLC 공동용출 및 MS/MS 분석에 의해 확인하였다(도 2). 합성 CnIIIA는 상이한 생물학적 분석에 사용되었다.

마우스 편측횡경막 수축에 대한 효과

CnIIIA의 활성은 직접 마우스 편측횡경막 자극에 의해 유도된 근육 수축에 대하여 평가하였다(도 3). 각 조건에서(다양한 CnIIIA 농도 부재하 또는 존재하에서), 250 μs의 자극 및 다양한 세기의 자극에 대한 수축을 기록하였다. 이것은 최대초과 자극 세기, 즉 최대 수축 진폭을 얻는데 필요한 세기의 측정을 허용하였다. 각 CnIIIA 농도에서, 근육 수축 기록은 독소 수용체 부위를 포화하기 위해 조직표 본에 펩티드를 적용한 지 2시간 후에 실시하였다. 도 3A에 도시한 바와 같이, 100 및 300 nM CnIIIA의 존재하에서 수축 진폭은 600 nM CnIIIA에 의한 완전한 억제까지 감소하였다. 대조적으로, 2 μM 이상의 μ-코노톡신 GIIIA 또는 GIIIB의 농도는 동일 조건에서 동일 제제의 완전한 차단에 필요하다. 따라서 CnIIIA는 생체 밖 모델로 시험된 기존의 μ-코노톡신에 비하여 4배 이상 더 강력한 것으로 보인다. CnIIIA 의 효과의 투여량-반응 곡선은 마우스 편측횡경막 수축의 1/2 최대 억제를 생성하는 CnIIIA 농도는 150 nM임을 나타내었다(도 3B). 운동신경의 자극에 의해 근육 수축을 유도하였을 때 유사한 결과를 얻었다(결과는 도시하지 않음).

마우스 신경근육 접합부에서 시냅스 반응에 대한 효과

근육 및 신경 조직 사이의 작용의 CnIIIA 선택성을 평가하기 위하여, 600 nM의 CnIIIA를 적용한 후 마우스 편측횡경막 신경근육 접합부에서 시냅스 반응의 세포내 기록을 실시하였다. 먼저, 결과는 섬유의 막 휴식(membrane resting) 전위가,대조용과 비교하여, 변화되지 않음을 나타내었다. 이것은 근육 수축의 억제가 CnIIIA의 탈분극(depolarising) 효과에 기인하지 않음을 나타낸다. 둘째, 미니어처 종판 전위(MEPP)는 CnIIIA 존재하에서 검출될 수 있었으므로, 니코틴 아세틸콜린 수용체의 감수성은 근육 수축의 완벽한 차단을 생성하는 투여량에서도 변하지 않음을 나타낸다. 마지막으로, 600 nM의 CnIIIA 존재하에서, 신경 자극은 상(phasic) 시냅스 반응을 생성할 수 있었다. 따라서, 대조용과 유사하게 종판(endplate) 전위(EPP)는 기록될 수 있었다. 이것은 신경 전달이 상기 코노톡신 농도에서 변경되지 않았음을 의미한다. 또한, 세포외 전류 기록은 시냅스전부 전류의 검출을 허용 하였고, 이는 운동 신경 말단에 시냅스전부 신경 작용 전위의 존재를 반영한다. 근육 막에서 양이온성 시냅스 채널의 개방으로 인하여 시냅스후부 전류도 관찰되었다.

개구리 신경근육 조직표본에서 근육 작용 전위 및 시냅스 반응에 대한 효과

CnIIIA의 효과는 개구리 큐테이너스 펙토리스 신경-근육 조직표본에 대하여 연구하였다(도 4). 이 조직표본에서, 포름아미드 처리에 의해 여기-수축의 분리가 용이하게 달성되므로, 움직임 없이 신경 자극에 의해 유도된 근육 작용 전위의 세포내 기록을 허용한다. 결과는 2 μM CnIIIA 의 존재하에서 섬유의 막 휴식 전위가 대조용과 유사함을 나타내었다. 1 μM CnIIIA를 상기 조직표본에 5-20분간 적용하면, 진폭의 증가 및 운동 신경 자극에 의해 유발된 작용 전위의 지속시간의 증가를 유발하였다. 25분 후, 근육 작용 전위는 완전히 제거되는 반면에, EPP는 여전히 기록되었다. 더 빨리 일어나긴 하지만 유사한 효과가 고 농도의 CnIIIA (2μM) 존재하에서도 관찰되었다. 신경 자극 및 근육 반응 사이의 잠재 시간은 코노톡신에 의해 현저히 영향을 받지 않았다. CnIIIA 적용(1 및 2μM)은 대조용과 비교하여 MEPP의 진폭 및 주기를 변화시키지 않았다. 이들 결과는 코노톡신 CnIIIA에 의해 생성된 골격근 수축의 억제는 근육 작용 전위의 우선적 차단으로부터 기인하며, 신경 작용 전위에 비하여 코노톡신에 더 민감함을 보여준다.

마우스 좌골 운동신경의 GAP ( Global action potential )에 대한 효과

본 출원인은 신경을 구성하는 모든 섬유의 활성을 나타내는 GAP를 얻기 위한 자극의 지속 시간 및 세기를 최적화하였다. 주어진 자극 지속 시간(0.10, 0.05 또 는 0.01 ms)의 경우, GAP 진폭은 인가된 자극의 세기에 증가함에 따라 이용되는 섬유의 수의 증가로 인하여 증가하였다(0.1 내지 15 V). 7V과 동일하거나 또는 그 보다 더 우수한 자극 세기에 반응하여, GAP 진폭은 최대값에 도달하였고, 어떤 자극 지속시간(0.05 또는 0.10 ms)이든 일정하게 유지하였다. 이것은 신경의 모든 섬유가 자극에 반응함을 의미한다. 대조적으로, 0.01 ms-자극은 모든 섬유를 이용하기에 불충분한데, 이는 GAP의 최대 진폭이 0.05 또는 0.10 ms의 자극 후에 기록된 것의 92%에 불과하였기 때문이다. GAP에 대한 CnIIIA의 효과를 연구하기 위하여, 자극의 지속시간을 0.05 ms로 설정하고 인가한 세기를 0.1 내지 15 V로 증가시켰다. 그러나, 우리의 실험 조건이 연구한 어떠한 농도의 CnIIIA에 대해서도 최적임을 보이기 위하여, 다양한 세기에서 0.10 ms의 자극을 또한 인가하였다. 0.1 내지 50V 범위의 농도에서, CnIIIA는 GAP 진폭을 감소시키는 것으로 밝혀졌고, 신경이 50 μM CnIIIA를 사용하여 30 내지 60분간 처리되었을 때 거의 0에 도달하였다(도 5A, B). 또한 GAP 최대 진폭의 50%에 도달하는데 필요한 자극의 세기는 코노톡신 농도 증가에 따라 증가하였다(도 5C). 마지막으로, CnIIIA는 GAP의 증식 속도를 현저히 변형시키지 않았다.

이들 결과는 막 여기성을 현저히 변화시키지 않고 개별 섬유의 반응을 감소시키는 것에 의해 마우스 좌골 신경에 대하여 μ-코노톡신 CnIIIA가 작용함을 종합적으로 보여준다.

마우스 좌골 신경에 대한 CnIIIA의 투여량-반응 곡선은 1.53 μM 코노톡신의 농도는 좌골신경의 최대 GAP 진폭에 의해 감소됨(도 6)을 보여주었다. 이들 데이터 는 운동 신경 반응이 근육 수축 반응에 비하여 CnIIIA에 대하여 10배 덜 민감함을 보여준다. 이들 결과는 또한 μ-코노톡신이 마우스 좌골 신경에 대하여 리도카인과 같은 전통적인 마취제보다 약 1000배 더 강력함을 보여준다. 마우스 좌골 신경에 대하여 유사한 억제 효과를 얻기 위하여 밀리몰 농도의 리도카인이 필요하다.

CnIIIA 효과의 가역성은 첫번 째 다양한 농도의 코노톡신(2, 10 및 50 μM) 존재하에서 또 두번 째 CnIIIA를 갖지 않는 포유동물의 링거 용액 중에 신경을 침지한 후 다양한 시간(2 내지 24시간)에서 좌골 신경의 GAP를 기록함으로써 평가하였다. 24시간 세척한 후에, GAP 진폭에서 약간의 증가가 관찰되었다(도 7). 가역성의 부재가 시간 함수로서 GAP 진폭의 자발 감소에 기인하는지 여부("런-다운"(run-down) 현상)를 시험하기 위하여, 신경을 오직 포유동물 Krebs-Ringer 용액에 담군 후 다양한 시간(2 내지 66시간)에서 좌골 신경의 GAP를 기록하였다. 이들 조건하에서, GAP 진폭의 어떠한 현저한 변형도 관찰되지 않았다.

이들 데이터는 μ-코노톡신 CnIIIA가 마우스 좌골 신경 상의 수용체 부위에 강하게 결합됨을, 즉 복합체 코노톡신/수용체의 분리가 비교적 서서히 생김을 강하게 제시한다.

파이크의 후각신경의 GAP ( global action potential )에 대한 효과

유럽 파이크(Esox lucius)의 감각 후각 신경은 평균 직경이 0.20 ㎛인 약 5백만개의 비교적 균질한(95%) 무수초(unmyelinated) 액손을 함유한다. 이 신경은 고밀도의 액손 막 팩킹을 가지므로, 생체물리적, 전기생리학적 및 약리학적 연구를 위한 예외적인 모델이다. 이 감각 신경을 구성하는 모든 섬유의 GAP를 기록하기 위 한 최적 조건(자극의 세기 및 지속 시간)은 이미 보고된 바와 같았다(Benoit et al., 2000). 8-9 V 및 7-8 ms의 자극 세기 및 지속시간 동안 후각 신경의 모든 신경을 이용하였다. 이러한 조건하에서 반응의 최대 진폭은 2.77 ± 0.15 mV (n = 37)이었고 12±0.5 cm/s (n = 37)의 속도로 증식하였으며, 이는 수초 액손(myelinated axon)으로 구성된 좌골신경에서 보다 60배 더 느린 것이다. 따라서, CnIIIA의 효과는 8 ms 지속시간 및 1-15V 세기의 자극을 이용하여 파이크 후각 신경의 GAP에 대하여 연구하였다. 후각 신경을 증가하는 농도의 코노톡신으로 처리할 때 GAP 진폭의 감소가 관찰되었고 또 30-60분간 적용된 10 μM 코노톡신을 이용할 때 어떤 GAP도 기록되지 않았다(도 8A, B). 또한, 50% 최대 GAP 진폭에 대응하는 자극의 세기(즉, 15V에서 기록됨)는 코노톡신의 농도가 증가됨에 따라 증가하였다. 결국, CnIIIA는 GAP의 증식속도를 현저히 변형시키지 않았다(도 8C).

이들 결과는 막 여기성을 현저히 변형시키지 않고 개별 섬유의 반응을 감소시키는 것에 의해 파이크 후각 신경에 CnIIIA가 작용하는 것을 분명히 나타낸다.

파이크 후각 신경에 대한 CnIIIA의 효과의 투여량-반응 곡선은 0.15 μM 코노톡신의 농도는 좌골신경의 최대 GAP 진폭에 의해 50% 감소됨(도 9)을 보여주었다. 이들 데이터는 후각 감각 신경을 구성하는 무척수 액손의 반응이 마우스 근육(도 3B 참조)만큼 CnIIIA에 민감하며 좌골 운동 신경을 구성하는 척추 액손의 반응보다 μ-코노톡신에 대하여 10배 더 민감함을 보여준다(도 6).

CnIIIA 효과의 가역성은 첫째, 다양한 농도의 코노톡신(1, 2 및 10 μM) 존재하에서 또 둘째, CnIIIA를 갖지 않는 포유동물의 링거 용액 중에 신경을 침지한 후 다양한 시간(12 내지 24시간)에서 좌골 신경의 GAP를 기록함으로써 평가하였다. 24시간 세척한 후에도, GAP 진폭에서 증가는 관찰되지 않았다. 가역성의 부재가 시간 함수로서 GAP 진폭의 자발 감소에 기인하는지 여부("런-다운"(run-down) 현상)를 시험하기 위하여, 후각 신경을 다음과 같은 다양한 조건하에서 파이크 링거 용액에서만 담군 후 후각 신경의 GAP를 기록하였다: (i) 실험실 중의 실온에서 30-60분간 (n=10); (ii) 파이크 링거 용액 중 실온에서 3시간 미만 동안(n = 14), 및 (iii) 파이크 링거 용액 중의 4℃에서 48시간 동안 (n = 66) 및 72 시간 동안 (n = 46). 어떤 실험 조건이었던, GAP 진폭의 현저한 변형은 관찰되지 않았다.

이들 데이터는 μ-코노톡신 CnIIIA가 파이크 후각 신경에 대한 수용체 부위에 강하게 결합됨을, 즉 복합체 코노톡신/수용체의 분리가 비교적 서서히 생김을 강하게 제시한다.

토끼 눈에서 CnIIIA 의 표면 마취 효과 및 리도카인의 표면 마취 효과와 대조

토기 각막에 대해 얻은 결과는 2.5, 5.0 및 10 g/l의 농도에서 리도카인의 마취 작용의 지속 시간이 5.3, 14.2 및 23.2 분이었음을 나타낸다. CnIIIA는 도 10에 도시한 바와 같이, 동몰 기준으로 리도카인에 비하여 훨씬 활성이었을 뿐만 아니라 작용의 지속시간도 더 오래 지속되었다. 눈깜빡임 반사가 다시 나타날 때까지 각막 표면에 인가된 자극의 총 합계로서 표현되는 CnIIIA의 마취 작용의 세기는 리도카인의 세기보다 더 중요하다. 흥미롭게도, 각막 반사는 CnIIIA 후 점막 표면의 검출가능한 손상없이 회복되었다.

패치 클램프에 의한 HEK 로부터 기록된 나트륨 전류에 대한 시험관내 실험

패치 클램프 전류 기록은 쥐의 골격근 Na 채널 α 서브유닛(μl, Naν1.4) 를 안정하게 발현하는 HEK293 세포에서 실시하였다(Yamagishi et al, 1997). 이들 세ㅍ포는 강인한 Na 전류(> 2 nA)를 나타내며, 삭시톡신(STX) 및 유도체(Velez et al., 2001)에 대해 민감하며 또 소형(직경<20 ㎛)이어서, 보유 전위의 적절한 제어를 허용한다.

전체 세포 패치 클램프 기록(Hamill et al., 1981)은 Naν1.4 채널을 안정하게 발현하는 HEK 293 세포 상, 실온(20-22℃)에서 실시하였다. 보로실리케이트 유리로 제조하고 P-97 풀러(puller)(Sutter Instrument Company, Novato, CA) 상에 잡아당긴 패치 피펫은 내부 생리학적 용액으로 충전될 때 1.5-3.0 MΩ 선단 저항을 가졌다. 막 전류는 Axopatch 200-B 패치 클래프 증폭기(Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 기록하였다. 피이크 나트륨 전류는 보유 전압 -100 내지 -10 mV로부터 10-ms 탈분극 펄스에 의해 여기되었다. P/4 프로토콜을 사용하여 선형 축전기 전류 및 누설 전류를 차감하였다. 막 전류는 10 kHz에서 통합된 8-폴(pole) 저-패스(low-pass) 베셀 필터(Bessel filter)를 이용하여 여과하였다. 여과된 신호는 12 비트 A/D 변환기(Digidata 1200B, Axon Instruments)에 의해 디지털화하고 pCLAMP 소프트웨어(Axon Instruments)를 이용하여 저장하였다. Origin 7 소프트웨어 (OriginLab Corp., Northampton, MA)를 이용하여 기록들을 분석하였다.

(mM): 70 NaCl, 70 테트라에틸암모늄 클로로히드레이트, 5 KCl, 3 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 mM 글루코오스, 10 HEPES (pH 7.4)를 함유하는 대조용 외부 용액을 사용 하여 세포를 1 ml 분^-1로 관류하였다. 패치 피펫은 (mM) 140 CsF, 5 NaCl, 1 MgCl₂, 10 EGTA, 10 HEPES 완충액 (pH 7.2)을 함유하였다. Na 전류는 대조용 조건하에서 또 상이한 농도의 μ-코노톡신 CnIIIA (μ-CnIIIA) 또는 삭시톡신 디아세테이트 (STX)(Sigma-Aldrich Chemical Corp)를 사용하여 관류한 후 기록하였다.

전형적인 실험으로 나타낸 바와 같이(도 15), μ-CnIIIA (50 nM)은 -100 내지 -10 mV의 탈분극 펄스 족에 의해 유발된 바스 관류 차단된 나트륨 전류(도 15A 및 도 15B)에 의해 공급되었다. μ-CnIIIA는 농도-반응 데이터에 대한 시그모이달 비선형 회귀 곡선에 의해 측정되는 바와 같이 농도 의존적 방식으로 나트륨 전류를 차단하였다. 50% 피이크 나트륨 전류(EC₅₀)을 감소시킨 효과적인 농도는 14.0 nM이었다. 도 1C에 도시한 바와 같이, 세척은 μ-CnIIIA 존재하에서 피이크 나트륨 전류가 안정한 상태 수준에 도달한 후에 개시되었고 펩티드를 갖지 않는 배지로 세척할 때에는 반전되지 않았다. 대조적으로, 나트륨 전류에 대한 STX 작용은 STX를 갖지 않는 용액으로 관류한지 2-3분 이내에 완전히 반전되었다. 전형적인 실험으로, μ-CnIIIA는 지속적이었고 STX 효과는 배지로부터 세척할 때 가역적이었다.

마우스에 대한 생체 내 실험 - DAS ( Digit Abduction Score ) 에세이

이들 실험은 성체(2 내지 3개월령 사이) 웅성 또는 자성 스위스-웹스터 마우스(20-40g)에 대해 실시하였다. 각각 약하게 마취된 마우스에 μ-CnIIIA 또는 프로카인을 함유하는 50 또는 100 μL 생리적 용액의 단일 근육내 주사로 좌측 후지( hind limb)의 전측면(antero-lateral) 영역에 주사하였다. 주사 후에, DAS 에세 이(Aoki, 2001)를 이용하여 기능 회복을 모니터링하였다. 간단히 말해, 마우스는 꼬리에 의해 서스펜드되어 동물이 그 후지(hind limb)를 연장하여 그의 후지 디지트를 외전시키는 특징적인 놀라운 반응을 유발하였다. μ-CnIIIA 또는 프로카인의 주사에 이어, 좌측 및 우측 후지의 DA(digit abduction) 정도를 시간 함수로 측정하고 상기 처리를 보지 않은 관찰자가 5점 기준으로 점수를 매겼다(0 = 정상 내지 4 = 최대 디지트 외전 및 다리 연장에서 최대 감소).

마우스에 대한 생체 내 실험 - 그립 세기 평가

각각 약하게 마취된 마우스에 μ-CnIIIA 또는 프로카인을 함유하는 50 또는 100 μL 생리적 용액의 단일 근육내 주사로 전지(fron limb)의 전측면(antero-lateral) 영역에 주사하였다. 상기 주사를 하기 전 및 주사한 후 다양한 시간에서 랩탑 컴퓨터에 연결된 마우스용 그립 세기 측정기(600 g 범위; Technical and Scientific Euqipment GmbH, Bad Homburg, Germany)를 이용하여 근육 세기를 측정하였다. 이 시험은 래트에 대해 원래 기재한 바와 같이 실시하였다(tilson & Cabe, 1978). 간단히 말해, 마우스를 꼬리의 기저에 유지시키고 양쪽 앞발을 사용하여 장치의 잡아당기는 바를 단단히 쥐도록 하였다. 마우스는 그의 그립을 놓을 때까지 충분히 후방으로 잡아당겼다. 각 시험의 피이크 력은 그립 세기로 간주하였다. 각 마우스는 약 30s 간격으로 3번의 실험을 하였다. 시험의 평균 값을 상응하는 대조군과 상대적으로 표현하였고 또 통계적 분석용으로 이용하였다(2-3마리 마우스의 평균±SEM).

결과(도 12)는 상대적 강도의 50%의 감소는 마우스 g당 108-111 pmole의 μ- CnIIIA 및 22-26 pmole의 프로카인을 근육내 주사한 후 약 5분 및 10분에 생겼음을 나타낸다. 약 2배 정도 신속하게 생기는 이외에, 상기 효과는 국소 마취 존재하에서보다 펩티드 존재하에서 더욱 현저하였다. 따라서, μ-CnIIIA의 근육내 주사는 프로카인에 비하여 약 5000배 이상 더 효과적이며, 생체 내에서 마우스의 근육 강도의 감소를 생성한다.

나트륨 채널 발현

개구리(X. laevis) 난모세포에서 발현하는 경우, Naν1.4/pUI-2 벡터를 NotI에 의해 선형화시키고 T7 mMESSASGE mMACHINE kit (Ambion)를 이용하여 전사시켰다.

클로닝된 채널 상에서 전기생리학적 연구

난모 세포에 드러몬드 사이언티픽(필라델피아 브루몰 소재)이 제조한 마이크로인젝터를 사용하여 1 ng/nl 농도로 50 nl의 cRNA를 주사하였다. 난모세포를 배양하기 위해 사용된 용액은 96 mM NaCl, 2mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2 및 5 mM HEPES, pH 7.4를 함유하였고, 50 mg/l 겐타마이신 설페이트 및 180 mg/l 트레오필린이 보충되었다. 2전극 전압-클램프(TEVC) 기록은 pClamp 데이터 이식 시스템(Molecular Devices)에 의해 제어되는 GeneClamp 500 증폭기(Molecular Devices)를 이용하여 실온(18-22℃)에서 실시하였다. 난모세포로부터 전체 세포 전류는 주사한지 1일 후에 기록하였다. 전압 및 전류 전극에는 3 M KCl을 충전시켰다. 양쪽 전극의 저항은 가능한 한 낮게 유지시켰다. 바스(bath) 용액 조성물은 96 nM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 및 5 mM HEPES, pH 7.4이었다. 전류는 4-폴, 로-패스(low-pass) 베셀 필터를 이용하여 1 kHz에서 여과하였고 또 5 kHz에서 샘플링하였다. 누출 공제는 -P/4 프로토콜을 이용하여 실시하였다. 전류는 -90 mV의 지지 전위로부터 100 ms 동안 -10 mV의 시험 전위로 탈분극하는 것에 의해 클로닝된 Naν1.4 전압 게이트화된 나트륨 채널을 발현하는 난모세포에서 유발되었다. 펄스 주기는 0.2 Hz이었고 또 샘플링 주기는 20 kHz 이었다. 모든 실험은 실온에서 실시하였다.

도 14에 도시한 결과는 발현된 Naν1.4 채널을 차단하는 CnIIIA(500 nM)의 능력을 나타낸다. 이들 결과로부터, IC50이 1-50 nM 범위인 것에서 펩티드 CnIIIA는 전압-게이트된 나트륨 채널 Naν1.4 이소형태를 차단할 수 있는 것으로 볼 수 있다. 펩티드-채널 상호작용은 결합속도가 농도에 의존하는 생분자 반응과 양립하였다. 결국, 상기 효과의 가역성은 아주 낮은 것으로 보인다.

실시예 3:

다른 μ- 코노톡신을 사용한 CnIIIA 대조

마우스의 EDL 근육의 수축시 시험관내 실험

척추 탈골에 이은 즉각적인 출혈에 의해 치사된 마우스로부터 EDL 근육을 단리하였다. 단리된 근육은 다음 조성: (mM): 154 NaCl; 5 KCl; 2 CaCl₂; 1 MgCl₂; 5 HEPES 완충액 (pH 7.4); 11 글루코오스을 갖는 표준 Krebs-Ringer 생리학적 용액을 함유하는 실리콘-라이닝된 플렉시글래스 바스(4 ml 부피)에 장착시켰다. 상기 용액에 순수한 O₂를 넣었다.

연축 긴장(twitch tension) 측정의 경우, EDL 근육의 힘줄의 하나를 실크사를 이용하여 조정가능한 스테인레스강 후크를 통하여 FT03 등척성 트랜스듀서(Grass Instruments, Astro-Med Inc., West Warwick, RI, USA)에 고정하고 다른 힘줄은 스테인레스강 핀을 갖는 실리콘-라이닝된 바스에 고정하였다. 연축은 0.1 Hz의 주파수에서 근육을 따라 배치된 전극 어레이에 S-44 자극기(Grass Instruments, Astro-Med Inc., West Warwick, RI, USA)에 의해 공급된 0.2 ms 지속시간 및 최대초과 세기의 전류 펄스에 의해 근육 섬유를 직접적으로 자극하는 것에 의해 유발된다. 각 조사하고자 하는 조직표본의 경우, 휴식 긴장도는 최대 수축성 반응을 얻도록 조정하였고 또 실험의 전체 지속 시간 동안 모니터링하였다. 등척성 트랜스듀서로부터 얻은 긴장도 신호를 증폭하고, 수집하며 또 DT2821 아날로그 디지털 인터페이스 보드(Data Translation, Marlboro, MA, USA)를 구비한 컴퓨터를 이용하여 디지털화하였다. 컴퓨터처리된 데이터 취득 및 분석은 존 뎀프스터 박사(스코트랜드 글래스고우에 소재하는 유니버시티 오브 트라티클라이드의 생리학 및 약리학과)가 제공한 프로그램을 이용하여 실시하였다. 모든 실험은 22℃에서 실시하였다. 조직표본을 10 μM 튜보쿠라린(tubocurarine)(니코틴 수용체를 차단하기 위한)을 함유하는 산소처리된 생리학적 용액으로 15분간 평형화시킨 후, μ-코노톡신 (CnIIIA, TIIIA, T3.1, PIIIA, SmIIIA 또는 SIIIA)을 배지에 부가하였다.

조사한 상이한 μ-코노톡신의 EDL 근육에 대한 상대적 효과를 비교하기 위하여, 근육 수축에 대한 유사한 농도(즉, 100 nM)의 μ-코노톡신을 시험하였다. 가능하면, 수축-반응 곡선은 개별 근육별로 생성하였다(다양한 농도의 주어진 μ-코노 톡신의 μ-코노톡신 존재하에서 측정된 수축은 대조용 연축 반응의 %로서 표시함). 각 μ-코노톡신 농도는 관류에 의해 적용하였고 45-60분간 평형화시켰다. 농도-반응 데이터에 대한 시그모이달 비선형 회귀 곡선은 연축 긴장을 50% 감소시키는 효과적인 농도(EC₅₀)의 산출을 허용한다.

결과(도 13)

근육의 상대적 평균 수축 억제는 40분간 배양한 후 CnIIIA(100 nM)과 대조에 의해 각 펩티드(100 nM)에 대해 주어진다. CnIIIA는 용이한 대조를 위하여 100%로 기준화하였다. 모든 펩티드 SmIIIA, PIIIA 및 T3.1은 CnIIIA에 비하여 더 낮은 활성을 나타냄을 알 수 있다(하기 표 참조).

농도-반응 데이터에 맞는 시그모이달 비선형 회귀 곡선은 연축 긴장(twitch tension)을 50% (EC₅₀)로 감소시키는 유효농도의 추정을 허용하므로, 각 펩티드에 대한 Kd(nM)를 유추한다. 결과를 하기 표에 나타낸다.

문헌에 공개된 μ- 코노톡신 서열 대 CnIIIA [서열번호 2]의 요약

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SEQUENCE LISTING <110> ATHERIS LABORATORIES C.N.R.S. <120> Mu-conotoxin peptides and use thereof as a local anesthetic <130> 15601/PCT <140> PCT/IB2006/003147 <141> 2006-11-08 <150> US 60/734,267 <151> 2005-11-08 <160> 2 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa1 is any N-modified amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa2 is glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa3 is any acidic amino acid or any of its amide form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa4 is glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa5 is proline or hydroxy-proline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa6 is any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa7 is glycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa8 is any non-aromatic hydroxyl amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa9 is any non-aromatic hydroxyl amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa10 is any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa11 is any aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa12 is any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa13 is any acidic amino acid or any of its amide form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa14 is any basic amino acid, or any sulfur-containing amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa15 is any hydrophobic or apolar amino acid, or any non-aromatic hydroxyl amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa16 is any basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa17 is absent or is any apolar amino acid, or an amide group <400> 1 Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys Xaa 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artifical sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X stands for pyroglutamic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for pyroglutamic acid <400> 2 Xaa Gly Cys Cys Asn Gly Pro Lys Gly Cys Ser Ser Lys Trp Cys Arg 1 5 10 15 Asp His Ala Arg Cys Cys 20

Claims (28)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 아미노산 서열 pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys [서열번호 2]를 갖는 μ-코노톡신 펩티드.
8. i) 제 7항에 따른 μ-코노톡신 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열,

   ii) i)에 상보적인 핵산 서열, 및

   iii) i) 또는 ii)의 축퇴된(degenerated) 핵산 서열을 포함하는, 단리되고 정제된 핵산.
9. 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 보조제와 함께 활성성분으로서 제 7항에 따른 μ-코노톡신 펩티드의 약학적 유효량을 포함하는 통증을 치료하기 위한 약학적 조성물.
10. 삭제
11. 제 9항에 있어서,

    상기 통증은 편두통, 급성 통증, 지속적인 통증, 만성 통증, 신경통 통증 및 통각수용기 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
12. 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 보조제와 함께 활성성분으로서 제 7항에 따른 μ-코노톡신 펩티드의 약학적 유효량을 포함하는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근육긴장이상(dystonia), 항문열창(anal fissure), 섬유근육통(fibromyalgia), 및 만성 근육근막통증(chronic myofascial pain)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료를 위한 약학적 조성물.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 제 7항에 따른 μ-코노톡신 펩티드를 포함하는 마취제.
24. 제 23항에 있어서,

    상기 마취제는 피하, 정맥내, 피부내, 근육내, 복강내, 코안, 경피, 또는 볼내 투여에 적합한 마취제.
25. 제 24항에 있어서,

    정제, 캡슐, 로젠지, 치과 페이스트, 좌약, 흡입제, 용액, 연고, 크림 및 비경구 데포(depot) 형태인 마취제.
26. 제 25항에 있어서,

    상기 흡입제는 스프레이인 마취제.
27. 제 8항의 단리되고 정제된 핵산을 포함하는 벡터.
28. 제 9항의 약학적 조성물 또는 제 7항에 따른 μ-코노톡신 펩티드를 포함하는 이식 가능한 장치.

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