DE2820378C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung von Hypertonie. Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthält eine wirksame Menge von Methylreserpat der Formel:

zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieses Arzneimittels zur Bekämpfung der Hypertonie beim Menschen.

Die Hypertonie bzw. Bluthochdruck ist zusammen mit Krebs und Herzerkrankungen eine der typischen Erkrankungen des Erwachsenen. Da die Zahl der älteren Personen zunimmt, nimmt auch die Anzahl von Hypertoniepatienten zu. Die Therapie der Hypertonie ist daher ein sehr wichtiges Problem. Aus verschiedenen Gründen hat sich noch keine endgültige Methode zur Behandlung herausgebildet.

Reserpin (nachstehend als RSP abgekürzt) und Rescinnamin (nachstehend als RCN abgekürzt), die Rauwolfia-Alkaloide darstellen, werden seit langem wegen ihres verlängerten antihypertensiven Effekts als Arzneimittel zur Behandlung der Hypertonie verwendet. Die Verwendung dieser Substanzen ist jedoch mit unangenehmen Nebenwirkungen verbunden, beispielsweise Unbehaglichkeit aufgrund einer ZNS-Depression, Depressionszuständen und Vitalitätsverluste. Kliniker sind daher seit langem auf der Suche nach antihypertensiven Mitteln vom RSP-Typ, die keinen oder nur einen geringen depressiven Effekt auf das Zentral­ nervensystem ausüben.

Methylreserpat (nachstehend als MR abgekürzt) wurde von Hoffmann et al. im Jahre 1954 in Rauwolfia Serpentina gefunden (Helv. Chim. Acta., 37, 849 (1954)). Es ist als Metabolit von RSP bekannt [Dhar, M. M. et al.: J. Sci. Ind. Res., 140, 179 (1955); Glazko A. J. et al.: J. Pharmacol. Exp. Therap., 118, 377 (1956); Dhar, M. M. et al.: Indian J. Pharmacy, 18, 293 (1956); Maggiolo, C. et al.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 115, 149 (1964); und Hübner, C. F. et al.: J. Amer. Chem. Soc., 77, 469 (1955)].

Einige Untersuchungen bezüglich der biologischen Aktivität dieser Verbindung wurden durchgeführt. Diese Arbeiten haben folgendes ergeben:

Die Substanz zeigt keinen antihypertensiven Effekt [Dhar, M. M., et al: J. Sci. Ind. Res., 140, 179 (1955); Dhar, M. M. et al.: Indian J. Pharmacy, 18, 293 (1956); Bein, H. J.: Pharmacol. Rev., 8, 435 (1956); und Hübner C. F. et al.: J. Amer. Chem. Soc., 77, 469 (1955)].

Die Hemmwirkung auf das Zentralnervensystem ist geringer als diejenige von RSP [Dhar, M. M. et al.: J. Sci. Ind. Res., 140, 179 (1955); Indian J. Pharmacy, 18, 293 (1956); Bein, H. J: Pharmacol. Rev., 8. 435 (1956); Hübner, C. F. et al.: J. Amer. Chem. Soc., 77, 469 (1955); Rubin, B. et al.: Fed. Proc., 13, 400 (1954); Dasgupta, S. R. et al.: Brit J. Pharmacol., 12, 529 (1957); und Plummer, A. J. et al.: Fed. Proc., 13, 395 (1954)].

Es wird keine Verminderung von Serotonin im Gehirn beobachtet [Brodie, B. B. et al.: Science, 123, 992 (1956)]. Es wird eine Erhöhung von Histamin beobachtet [Sachdev, K. S. et al.: Arch. Int. Pharmacodyn, Ther., 157, 14 (1965)]. Schließlich wird eine geringfügige Verminderung von Noradrenalin im Herzen und den Nebennieren festgestellt [Creveling, C. R. et al.: J. Med. Chem., 11, 596 (1968)].

Entsprechende Untersuchungen haben nun zunächst ergeben, daß MR im Verdauungstrakt leicht absorbiert wird. Ausgedehnte Un­ tersuchungen des antihypertonischen Effekts von MR auf spontan hypertonische Ratten (SHR) und Hunde haben ergeben, daß oral verabreichtes MR einen verlängerten antihypertonischen Effekt aufweist und daß es eine zwar nur milde, jedoch genügende anti­ hypertonische therapeutische Aktivität besitzt. Weiterhin wurden die Toxizität und der Metabolismus von MR untersucht. Dabei wurde bestätigt, daß MR sicher als antiphypertonisches Mittel mit geringem Risiko einer Zentralnervensystemdepression verwendet werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein neues Arzneimittel zur Behandlung der Hypertonie. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann wiederholt verabreicht werden, ohne daß die Gefahr von unerwünschten Nebenwirkungen besteht.

MR, d. h. der Wirkstoff des erfindungsgemäßen Arzneimittels, kann beispielsweise in der Weise hergestellt werden, daß man gleichzeitig die 16- und 18-Stellung von Reserpin hydrolysiert und sodann in 16-Stellung mit Diazomethan methyliert oder indem man die 18-Stellung von Reserpin mit einem Mischlösungsmittel aus Methanol/cyclischem Äther oder mit Methanol allein solvolysiert [Hev. Chim. Acta., 37, 59 (1954); J. Med. Chem., 15 (Nr. 6) 686 bis 687 (1972)]. MR ist ein farbloser oder leicht gelbes Pulver mit einem Schmelzpunkt zwischen 237 und 239°C (Zersetzung). Es ist in Methanol, Chloroform und Äthanol leicht löslich, jedoch in Wasser kaum löslich.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 den Effekt von MR auf den mittleren Blutdruck von SHRs bei Verabreichung durch venöse Injektion;

Fig. 2 den Effekt von MR auf den mittleren Blutdruck von SHRs bei oraler Verabreichung;

Fig. 3 die Dosisantwortkurve von MR bei SHRs;

Fig. 4 den Effekt von MR auf den systolischen Blutdruck bei oraler Verabreichung;

Fig. 5 den Effekt von MR auf den mittleren Blutdruck von anästhesierten Hunden bei Verabreichung durch venöse Injektion;

Fig. 6 die Dosisantwortkurven von MR bei anästhesierten Hunden;

Fig. 7 den Effekt von MR auf den systolischen Blutdruck von SHRs bei wiederholter oraler Verabreichung;

Fig. 8 den Effekt von MR auf die spontane motorische Aktivität;

Fig. 9 die Gewichtsveränderungen der Ratten beim oralen subakuten Toxizitätstest von MR;

Fig. 10 die Veränderung der Futteraufnahme von Ratten beim oralen subakuten Toxizitätstest von MR;

Fig. 11 die Veränderungen der Wasseraufnahme von Ratten beim subakuten Toxizitätstest von MR;

Fig. 12 die Veränderungen des Urinvolumens und der Wasseraufnahme von Ratten der 100-mg/kg-Gruppe beim oralen subakuten Toxizitätstest von MR;

Fig. 13 die Veränderungen des MR-Gehalts im Serum nach oraler Verabreichung;

Fig. 14 die Veränderungen des MR-Gehalts im Serum nach Verabreichung durch venöse Injektion;

Fig. 15 einen Vergleich der Bioverfügbarkeiten von MR und RCN bei oraler Verabreichung an Kaninchen;

Fig. 16 die prozentuale kumulative Exkretion von MR im Urin bei oraler Verabreichung an Kaninchen;

Fig. 17 die prozentuale kumulative Exkretion von MR in der Galle bei Verabreichung durch venöse Injektion an Kaninchen; und

Fig. 18 ein Verfahren zur Extraktion von Substanzen, die in den Urin ausgetragen worden sind.

Die Dosierung des erfindungsgemäßen Arzneimittels beträgt in Abhängigkeit von der Art und Schwere der hypertonischen Erkrankung gewöhnlich 1 bis 500 mg pro Tag. Die Verabreichung erfolgt oral. Alle beliebigen pharmazeutischen Zubereitungen, z. B. Pulver, Tabletten oder Kapseln, können verwendet werden.

Zur Zubereitung kann man beispielsweise den Wirkstoff mit einem anorganischen Träger, wie Magnesiumcarbonat, wasserfreier Kieselsäure, synthetischem Aluminiumsilicat oder Cal­ ciumphosphat, mit einem organischen Träger, wie Lactose, Maisstärke und Cellulose, oder mit jedem beliebigen anderen herkömmlichen Material vermengen.

Der Effekt von MR, d. h. dem Wirkstoff des erfindungsgemäßen Arzneimittels, wird anhand praktischer Werte wie folgt beschrieben.

Beispiel 1 (a) Antihypertonischer Effekt von MR durch eine einzige Verabreichung (1) Effekt auf den Blutdruck von SHR

Dieser Effekt wurde unter Verwendung von männlichen SHR mit einem Alter von 25 bis 30 Wochen und einem Gewicht von etwa 300 g nach modifizierten Schwanzmanschettenmethoden bestimmt.

Bei der direkten Kanülenmethode wurden Polyäthylenkanülen in die Schenkelarterien von nichtanästhesierten SHR, die sich bei Bewußtsein befanden, unter einer Rückfixierung eingesetzt. Die MR-Lösung wurde in einer Menge von 0,1 mg/100 g Gewicht bei venöser Injektion und von 1 ml/100 g Gewicht bei oraler Verabreichung verabreicht. Die Veränderungen des Blutdrucks im Verlauf von 6 h wurden mit einem Vielzweck-Polygraphen (RM-85 von Nihon Koden Co., Ltd.) gemessen. Das MR wurde in 0,9%iger wäßriger NaCl-Lösung mit 1N-HCL aufgelöst und die Lösung wurde zum Gebrauch neutralisiert.

Bei der modifizierten Schwanzmanschettenmethode wurde MR in 0,2%iger Carboxymethylcelluloselösung dispergiert und die Suspension wurde oral verabreicht (1 ml/100 g Gewicht). Sodann wurden die Veränderungen des Blutdrucks im Verlauf von 72 h mit einer Blutdruckaufzeichnungseinrichtung (8002 von W+W Electronic) gemessen.

Wenn die Messungen operativ erfolgten, dann wurde nach venöser Injektion von 2, 4 und 8 mg/kg die mittlere Ratte der Verminderung des Blutdrucks aus der Depressionsfläche über einen Zeitraum von 6 h errechnet (die Ergebnisse sind, wie in Fig. 1 gezeigt ist, 13%, 22,5% und 28%). Es wurde ein dosisabhängiger antihypertonischer Effekt beobachtet.

In jedem Fall war der beobachtete Effekt eine sofortige Verminderung des Blutdrucks nach Verabreichung, die 4 bis 5 h lang anhielt. Zu diesem Zeitpunkt erreichte der Blutdruck nahezu ebene Werte.

Bei oraler Verabreichung von 4, 8 und 16 mg/kg MR und bei operativer Durchführung der Messungen wurde der gleiche dosisabhängige antihypertonische Effekt wie bei der venösen Injektion erhalten, wie es in Fig. 2 dargestellt ist. Der beoachtete Effekt war wie folgt:

Bei 4 mg/kg nahm der Blutdruck 2 h nach Verabreichung langsam ab. Die Abnahme erreichte 6 h später 18%. Bei 8 und 16 mg/kg nahm nach der Verabreichung der Blutdruck allmählich ab. Die Abnahme erreichte nach 6 h 26% bzw. 37%.

Die Werte von DB₂₀ (d. h. die Dosis, die den Blutdruck um 20% senkt), erhalten aus den Dosisantwortkurven der Fig. 3, betrugen 3,5 mg/kg bei venöser Injektion und 11,9 mg/kg bei oraler Verabreichung.

Bei oraler Verabreichung von MR in Mengen von 6,25, 12,5 und 25,0 mg/kg und bei nicht-operativer Durchführung der Messungen waren die maximalen Raten der Abnahme des Blutdrucks 31,7%, 37,1% bzw. 42,5%, wie in Fig. 4 gezeigt ist. Dies entspricht einem dosisabhängigen antihypertonischen Effekt. In jedem Falle war der beobachtete Effekt eine sofortige Verminderung des Blutdrucks nach der Verabreichung. Nach 3 bis 4 h erreichte der Effekt ein Plateau. Der Blutdruck kehrte allmählich etwa 12 h danach zu seinem ursprünglichen Wert zurück und erreichte bei 6,25 und 12,5 mg/kg seinen ursprünglichen Wert nach 48 h und bei 25,0 mg/kg nach 72 h.

(2) Effekt auf den Blutdruck von anästhesierten Hunden

Männliche und weibliche ausgewachsene Bastardhunde mit einem Gewicht von etwa 10 kg wurden mit Natriumpentobarbital (35 mg/kg, venöse Injektion) anästhesiert. Sie wurden in Rückstellung fixiert. Trachealkanülen wurden durch Einschnitte in zervikalen medialen Linien eingesetzt. Hierauf wurde nach Einsetzen von Polyäthylenkanülen in die Schenkelarterien eine MR-Lösung in einer Menge von 0,5 bis 1 mg/kg durch Polyäthylenkanülen injiziert, die in die Gefäßvene eingesetzt worden war. Die Veränderungen des Blutdrucks wurden 6 h nach Verabreichung mit einem Vielzweck-Polygraphen (RM-85 von Nihon Koden) gemessen.

MR wurde in 0,9%iger wäßriger NaCl-Lösung mit 1N-HCl aufgelöst und die Lösung wurde zum Gebrauch neutralisiert. In den Fällen, wo MR intravenös in Mengen von 1, 3 und 9 mg/kg injiziert worden war, betrugen die mittleren Raten der Verminderung des Blutdrucks, errechnet aus der Depressionsfläche, innerhalb von 6 h 16,2, 22,3 bzw. 35,1%. Es wurde ein dosisabhängiger De­ pressionseffekt beobachtet. Der beobachtete Effekt war eine Blutdruckabnahme unmittelbar nach der Verabreichung, die bei 1 mg/kg nach 2 h und bei 3 mg/kg und 9 mg/kg nach 3 h nahezu zu einem Plateau kam. Die Werte blieben in allen Fällen 6 h nach diesem Zeitpunkt auf dem Plateau. Der DB₂₀-Wert, erhalten aus der Dosisantwortkurve der Fig. 6, war 2 mg/kg.

(b) Antihypertonischer Effekt von MR bei wiederholter Verabreichung

Der Effekt wurde durch eine direkte Kanülierung unter Verwendung von männlichen SHR mit einem Alter von 25 bis 30 Wochen und einem Gewicht von etwa 300 g bestimmt. MR wurde in 0,2%iger Carboxymethylcelluloselösung suspendiert und die Suspension wurde 2 Wochen lang einmal täglich oral verabreicht (1 ml/100 g Gewicht). Der Blutdruck wurde zweimal täglich gemessen und zwar gerade von und 4 h nach der Verabreichung. Die Messung erfolgte mit einem Blutdruckaufzeichnungsgerät (8002 von W+W Electronic).

Die nicht-operative Bestimmung ergab 4 h nach der Verabreichung in jedem Falle durchschnittliche Raten der Blutdruckverminderung von 20 bis 40%. 24 h nach diesem Zeitpunkt war der Blutdruck fast auf seinen ursprünglichen Wert zurückgekehrt. Der beobachtete Effekt war daher über einen Zeitraum von 2 Wochen nahezu der gleiche wie bei einer einzigen Verabreichung.

Aus der Tatsache, daß MR der Metabolit von RSP ist, wurde geschlossen, daß MR keinen langandauernden Effekt besitzt, was durch die oben beschriebenen pharmakologischen Experimente mit einer einzigen Verabreichung und wiederholten Verabreichungen an SHR bestätigt wurde. Da weiterhin bei wiederholter Verabreichung MR über 2 Wochen lang einen nahezu konstanten antihypertonischen Effekt zeigte, wurde gefunden, daß MR die Charakteristik hat, daß kaum eine Toleranz wie bei dem Arzneimittel vom RSP-Typ gegeben ist.

Da der Effekt von MR rascher als derjenige von RSP oder dergleichen verschwindet, ist die Verabreichung 2- bis 3mal täglich notwendig, wenn es als antihypertonisches Mittel verwendet wird.

Die Tabelle I zeigt den antihypertonischen Effekt von MR im Vergleich zu herkömmlichen Antihypertonika. Der Effekt von MR ist zwar im Vergleich zu demjenigen von RCN bei venöser Injektion weniger intensiv, doch fast der gleiche, wenn die Verabreichung oral erfolgt.

Tabelle I

Vergleich der Effekte von MR und herkömmlicher Antihypertonika

Um zu beweisen, daß MR ein Arzneimittel mit hoher Sicherheit ist, wurden die nachfolgend beschriebenen Versuche hinsichtlich der Nebenwirkungen und der Toxizität durchgeführt.

Beispiel 2 Effekte auf das Zentralnervensystem

MR wurde in 0,2%iger Carboxymethylcelluloselösung suspendiert. Die Suspension wurde oral männlichen Mäusen vom dd-Stamm mit einem Gewicht von 23 bis 27 g in einer Menge von 1 ml/100 g Gewicht verabreicht.

Die Effekte auf das Zentralnervensystem wurden wie folgt unter­ sucht:

(a) Effekt auf die spontane motorische Aktivität

25 mg/kg MR wurden den Mäusen verabreicht. Nachdem sie 15 min lang allein gelassen worden waren, wurden die spontane motorische Aktivität über einen Zeitraum von 6 h stündlich mit einer "Animex"-Vorrichtung, hergestellt von AB Farad, gemessen. Die Verabreichung von MR neigte dazu, die spontane motorische Aktivität von 3 h nach der Verabreichung an zu unterdrücken. Kein signifikanter Unterschied (P=0,05) wurde hinsichtlich des durchschnittlichen unterdrückenden Effekts unter vier Gruppen mit jeweils 5 Mäusen beobachtet.

(b) Effekt auf Hexobarbitalhypnose

MR wurden 10 Mäusen pro einer Gruppe in einer Menge von 12,5 mg/kg oder 25 mg/kg verabreicht. 6 h später wurden 100 mg/kg Natrium­ hexobarbital intraperitoneal injiziert. Die Periode des induzierten Schlafes wurde mit dem aufrichtenden Reflex als Parameter gemessen.

Wie aus Tabelle II ersichtlicht wird, beeinflußt MR weder den Zeitraum, der zur Induzierung des Schlafes notwendig war, noch die Schlafperiode.

Tabelle II

Effekt von MR auf die Hexobarbitalhypnose

(c) Effekt auf die Körpertemperatur

25 mg/kg MR wurden 10 Mäusen pro Gruppe verabreicht. Die Rek­ taltemperaturen wurden mit einem Widerstandsthermometer (MGA- III-219 von Nihon Koden Co., Ltd.) gemessen. Die Verabreichung von MR führte, wie die Tabelle III gezeigt ist, zu einer geringen Verminderung der Temperatur 3 h nach Verabreichung.

Tabelle III

Effekt von MR auf die Körpertemperatur

(d) Effekt auf die Motorik

25 mg/kg MR wurden jeweils 10 Mäusen einer Gruppe verabreicht. Die Mäuse wurden auf eine Holzstange mit einem Durchmesser von 2 cm aufgesetzt, die mit 10 Upm rotierte. Die Anzahl der Mäuse, die von der Stange herabfielen, wurde gezählt.

Die Verabreichung von MR ergab, wie aus Tabelle IV ersichtlich wird, 3 h nach Verabreichung eine geringfügige Verminderung der Motorik.

Tabelle IV

Effekt von MR auf die Motorik

Aus den oben beschriebenen pharmakologischen Untersuchungen geht hervor, daß der Dämpfungseffekt von MR auf das Zentalnerven­ system geringer ist als derjenige von RSP.

Beispiel 3 Akute Toxizität

Die Tabelle V zeigt die aktute Toxizität von MR bei Mäusen und Ratten, bestimmt nach einer herkömmlichen Testmethode.

Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, sind die LD₅₀-Werte bei der oralen Verabreichung an die Maus und die Ratte 210 mg/kg bzw. 479 mg/kg. Die Werte sind etwa 10 000mal bzw. etwa 24 000mal so groß wie die klinische Dosis von RCN mit einem Effekt, der demjenigen von MR nahezu gleich ist. MR kann daher als sehr sicheres Arzneimittel angesehen werden.

Tabelle V

Akute Toxizität von MR

Beispiel 4 Subakute Toxizität von MR Test der oralen subakuten Toxizität bei Ratten Verwendete Tiere, Aufzuchtbedingungen und Verabreichungsmethode

Männliche Ratten vom SD-(SPF)-Stamm mit einem Alter von 4 Wochen wurden gekauft. Nach 10tägigem Aufziehen wurden diejenigen mit einem Gewicht von 146 bis 150 g ausgewählt, um Gruppen mit jeweils 10 Ratten zu bilden. Die Ratten wurden in Einzelkäfigen unter den folgenden Bedingungen aufgezogen: Temperatur 23±2°C, relative Feuchtigkeit 55±5%, freie Aufnahme vom festem Futter (CE-2, CLEA Japan, Inc.) und Leitungswasser.

Das Arzneimittel wurde in der Weise hergestellt, daß MR in einem Mörtel zu einem feinen Pulver vermahlen wurde und beim Gebrauch in einer 0,2%igen Carboxymethylcelluloselösung suspendiert wurde. Die Verabreichung erfolgte oral durch ein Metallmagenrohr an die Ratten. Das Volumen der Arzneimittellösung für eine Verabreichung wurde auf 1 ml pro 100 g Köpergewicht festgelegt. Diese Dosis wurde einmal am Tag, 6mal in der Woche über einen Zeitraum von 5 Wochen verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt das gleiche Volumen einer 0,2%igen Carboxymethylcelluloselösung. Die Dosierungen wurden auf 5 Werte, nämlich 12,5 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg und 200 mg/kg, festgesetzt, was der 625-, 1250-, 2500-, 5000- und 10 000fachen klinischen Tagesdosis von RCN entspricht, die den gleichen Effekt wie MR hat.

(1) Beobachtung der Allgemeinsymptome, des Körpergewichts, der Futteraufnahme und der Wasseraufnahme

Alle Ratten wurden täglich beobachtet und die Allgemeinsymptome wurden notiert. Das Gewicht wurde täglich bestimmt. Die durchschnittliche Futteraufnahme wurde einmal alle drei Tage bestimmt. Die durchschnittliche Wasseraufnahme wurde einmal alle 2 Tage bestimmt.

Bei der Gruppe, der 50 mg/kg verabreicht worden waren, wurden etwa nach dem 15. Tag und bei der Gruppe, der 100 mg/kg verabreicht worden waren, etwa nach dem 10. Tag eine Blepharoptose, ein Aufrauhen des Fells und ein schmutziges Aussehen der Schamgegend beobachtet. Bei der Gruppe, der 200 mg/kg verabreicht worden waren wurden zusätzlich zu den obigen Symptomen eine Verminderung des Köpergewichts, eine blutige kon­ junktivitische Austragung und eine Temperaturverminderung der Gliedhaut festgestellt. Alle Tiere starben zwischen dem 2. und dem 17. Tag, viele 2 bis 4 h nach der Verabreichung.

Die Meßwerte des Körpergewichts, der Futteraufnahme und der Wasseraufnahme sind in den Fig. 9 bis 11 dargestellt. Bei der Gruppe mit 12,5 mg/kg, mit 25 mg/kg und mit 50 mg/kg war durch den Testzeitraum hindurch keine Veränderung des Gewichts feststellbar. Andererseits wurde bei der Gruppe mit 100 mg/kg eine Neigung zu einer Hemmung einer Gewichtszunahme festgestellt, die in der Intensität, beginnend kurz nach der Verabreichung, zunahm. Bei der Gruppe mit 200 mg/kg wurde eine Verminderung des Gewichts festgestellt. Hinsichtlich der Futteraufnahme wurde im Vergleich zu der Kontrollgruppe mit Ausnahme der Gruppe mit 200 mg/kg kein Unterschied festgestellt. Die Wasseraufnahme nahm bei der Gruppe mit 100 mg/kg etwas zu, jedoch bestand bei anderen Gruppen keine Veränderung.

Hämatologische Untersuchungen

Am 10. Tag, am 20. Tag und am 30. Tag wurden folgende Bestimmungen durchgeführt: Zählungen der roten Blutkörperchen und der weißen Blutkörperchen (mit einem Celloscope 401, AB Larsljungberg & Co.); der Hämatokritwert (Kapillarmethode unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge); der Hämoglobinwert (Cyanmetohämoglobinmethode); Plättchenzählung (Toa-Plättchenzähler PL-100); und das Hämogramm (Giemsastaining). Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Bei der Gruppe mit 100 mg/kg und 200 mg/kg wurde eine Erhöhung der Anzahl der roten Zellen und eine Verminderung der Anzahl der weißen Zellen beobachtet. Bei den anderen Gruppen wurde jedoch durch die ganze Testperiode hindurch keine signifikante Veränderung beobachtet.

(3) Urinanalyse

Eine Urinanalyse wurde am letzten Tag der wiederholten Verabreichung hinsichtlich des pH-Wertes, des Proteingehalts, des Glucosegehalts, des Ketonkörpergehalts und des okkulten Blutes unter Anwendung von Teststreifenmethoden (Labstix, Mile-Sankyo Co., Ltd.) durchgeführt.

Wie aus Tabelle VII ersichtlicht wird, weisen die Werte auf keinerlei nennenswerte abnormale Merkmale hin.

Die Fig. 12 zeigt die täglichen Mengen des Urins von 10 Tieren der Gruppe mit 100 mg/kg und von 5 Tieren der Kontrollgruppe vom 19. Tag der Verabreichung an. Das Urinvolumen der Gruppe mit 100 mg/kg war etwa 2- bis 3mal so groß wie das Volumen der Kontrollgruppe.

Tabelle VII

Urinanalyse von 10 mit MR behandelten Ratten über einen Zeitraum von 30 Tagen (subakute Toxizität)

(4) Biochemische Serumuntersuchung

Nach der letzten Verabreichung und anschließendem 24stündigen Fasten wurden die folgenden Analysen durchgeführt: Glucose (nach der o-Toluidin-borsäure-Methode); Gesamtprotein (nach der Biuretmethode); Blut-Harnstoff-Stickstoff (nach der Diace­ tylmonoximmethode); GOT- und GPT-Aktivitäten (nach der Reitman- Frankel-Methode); alkalische Phosphataseaktivität (nach der Kind-King-Methode); und Natrium- und Kaliumgehalt (unter Verwendung eines Flammenphotometers).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt. Es wurde eine Verminderung des Glucosewerts bei der Gruppe mit 50 mg/kg und der Gruppe mit 100 mg/kg festgestellt. Die Ergebnisse der anderen Bestimmungen lagen, zwar mit bestimmten Schwankungen, alle innerhalb des Rahmens der normalen Werte.

(5) Histopathologische Untersuchung

Die Ratten wurden unter Narkose mit Äther getötet. Nach Beobachtung des Gesamtaussehens aller Organe wurden die Milz, die Lunge, die Leber, die Nebennieren, das Herz, die Thymusdrüse, die Nieren, die Hoden, die Hypophyse und die Schilddrüse herausoperiert und gewogen. Zusätzlich zu den obengenannten Organen wurden das Oberschenkelknochenmark, die Lymphknoten, der Magen, der Darm, der Pankreas, die Urinblase, die Prostata und das Zentralnervensystem herausgenommen und in 10%iger Formalinlösung fixiert.

In jeder Gruppe wurden fünf Proben willkürlich ausgewählt. Paraffinstückzubereitungen der Organe wurden durch Routinemethoden hergestellt. Die Zubereitungen wurden mit Hämatoxylin- Eosin-Farbe und Luxol-Echtblau (nur Zentralnervensystem) angefärbt und histopathologisch untersucht.

Hinsichtlich des Gesamtaussehens der Organe der betreffenden Tiere war keine nennenswerte Veränderung festzustellen.

Die Tabellen IX und X zeigen die Werte für die absoluten Organgewichte und die relativen Organgewichte. Bei den absoluten Gewichten wurde eine Gewichtszunahme der Nebennieren bei der Gruppe mit 25 mg/kg und mit 50 mg/kg gefunden. Bei der Gruppe mit einer Verabreichung von 100 mg/kg war zusätzlich zu den obigen Veränderungen eine Verminderung des Gewichts der anderen Organe festzustellen. Bei den relativen Gewichten war, obgleich bestimmte Unterschiede zwischen den behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen bestanden, insgesamt keine signifikante Veränderung festzustellen.

Es wurden folgende histologische Feststellungen gemacht. Die Feststellungen bei jeder Ratte sind in Tabelle XI aufgeführt.

Milz: 5/5 Ratten der Gruppe mit 200 mg/kg hatten eine geringfügige bis mäßige Atrophie. 4/5 Ratten der Gruppe mit 100 mg/kg hatten eine geringfügige bis mäßige Kongestion.

Knochenmark: Das Mark des Oberschenkelknochens wurde untersucht. Bei 2/2 Ratten der Gruppe mit 200 mg/kg wurde eine mäßige Hypoplasie beobachtet. Bei 3/5 Ratten der Gruppe mit 100 mg/kg wurde eine geringfügige Hypoplasie beobachtet.

Lunge: Bei 5/5 Ratten der Gruppe mit 200 mg/kg wurde eine Veränderung ähnlich einer interstitiellen Pneumonie beobachtet. Darunter hatten 2/5 Ratten eine ausgeprägte Kongestion.

Leber: Bei 5/5 Ratten der Gruppe mit 200 mg/kg wurde eine Nekrose und ein Kollaps oder eine Vakuolenbildung der Leberzellen in der Mittelzone der Läppchen festgestellt. Bei einigen der Ratten mit Einschluß der Kontrollgruppe wurde hie und da eine lymphozytische Zellinfiltration in den Glisson′schen Kapseln oder den Leberzellenschnüren und eine Schwellung der Kupferzellen festgestellt.

Nebennieren: 1/5 Ratten der Gruppe mit 25 mg/kg, 5/5 Ratten der Gruppe mit 50 mg/kg und der Gruppe mit 100 mg/kg und 1/5 Ratten der Gruppe mit 200 mg/kg hatten eine Rindenhypertrophie.

Herz: Einige Ratten mit Einschluß der Kontrollgruppe hatten einen Fokalkollaps der Herzmuskeln.

Thymusdrüsen: Bei 2/2 Ratten der Gruppe mit 200 mg/kg wurde eine ausgeprägte Atrophie beobachtet.

In den anderen Organen: Lymphknoten, Magen, Darm, Pankreas, Nieren, Harnblase, Hoden, Prostata, Hypophyse, Schilddrüse und Zentralnervensystem wurden keine anderen pathologischen Veränderungen gefunden.

Tabelle IX

Absolute Organgewichte von oral mit MR behandelten Ratten

Tabelle X

Relative Organgewichte von oral mit MR behandelten Ratten

Tabelle XI-B

Histopathologische Feststellungen bei oral mit MR behandelten Ratten

Aus den obigen Tests der subakuten Toxizität ergeben sich die unwirksame Dosis und die letale Dosis von MR bei Ratten als 12,5 mg/kg bzw. 200 mg/kg. Andererseits wurde aufgrund des durchgeführten Tests der subakuten Toxizität die unwirksame Dosis und die letale Dosis von RCN mit 6 mg/kg bzw. 36 mg/kg bestimmt. Angeschichts der Tatsache, daß die unwirksame Dosis von MR derjenigen von RCN nahezu gleich oder höher ist und daß die letale Dosis von MR etwa 3- bis 5mal so groß ist wie diejenige von RCN, ist MR als sicherere Substanz als RCN anzusehen.

Als Nebenwirkungen wurden eine Blepharoptose, eine Leukopenie, eine Erhöhung des Urinvolumens, eine Atrophie der hämotopoetischen Organe, eine Rindenhypertrophie der Nebennieren und eine Degenerierung der Leberzellen (bei toten Ratten) nur bei den höheren Dosierungen festgestellt. Außerhalb dieser Nebenwirkungen wurden pathologische Veränderungen der Nebennieren und der Leber bei RCN nicht berichtet. Die pathologische Veränderung der Nebennieren ist jedoch eine reversible Hypertrophie der Rinde, die durch eine Hyperfunktion bewirkt wird. Die morbide Veränderung der Leber wurde nur bei den toten Tieren mit der höchsten Dosis gebildet. Wenn man weiterhin berücksichtigt, daß durch histopathologische Untersuchungen der Niere keine pathologische Veränderung gefunden wurde, scheint die Erhöhung des Urinvolumens bei höheren Dosen ein diuretischer Effekt zu sein, der bei einem Antihypertonikum eine erwünschte Eigenschaft ist. Es wurden keine pathologischen Veränderungen der Magenschleimhaut festgestellt, was oftmals bei Verwendung von RCN der Fall ist.

Aufgrund der langen klinischen Verwendung von RSP und RCN kann gesagt werden, daß MR, das der Metabolit davon ist, bislang schon tatsächlich, jedoch ohne irgendeine Erkenntnis, klinisch angewendet worden ist. Es kann daher die Schlußfolgerung gezogen werden, daß MR ein Antihypertonikum mit sehr hoher Sicherheit ist.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt einen Versuch, der durchgeführt wurde, um eine detaillierte Analyse des medizinischen Effekts und der Toxizität hinsichtlich des Metabolismus von MR zu erhalten.

Verwendete Tiere

Männliche, erwachsene Bastardhunde mit einem Gewicht von etwa 10 kg. Männliche Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 3 kg und männliche Ratten vom SD-Stamm mit einem Gewicht von etwa 150 g. Bei oraler Verabreichung durften die Tiere 24 h lang nichts fressen mit Ausnahme des Versuchs der Biotransformation.

Versuchsmethode:

MR wurde in 0,2%iger Carboxymethylcelluloselösung dispergiert und den Tieren mit einer Dosis von 10 mg/kg Gewicht bei oraler Verabreichung oder 1 ml/kg Gewicht bei venöser Injektion verabreicht.

Blut wurde von der Bronchialvene von Hunden, der Vene des Ohrs der Kaninchen und der Karotisarterie der Ratten nach dem Schlachten abgezogen. Urin wurde mit einem Harnblasenkatheter bei den Kaninchen und Stoffwechselkäfigen bei den Ratten gesammelt. Das Sammeln der Galle erfolgt durch eine Kanülierung des Gallengangs ohne Anästhesie. Eine quantitative Analyse von MR in biologischen Flüssigkeiten erfolgte durch Fluoreszenzbestimmung nach Glazco et al.

(a) Veränderung des MR-Gehalts im Blut

Die Fig. 13 und die Fig. 14 zeigen die Veränderung des unveränderten Materials im Serum von Hunden, Kaninchen und Ratten, denen MR oral oder durch venöse Injektion verabreicht wurde.

Das Muster der Serumspiegel zeigte hohe Korrelation mit dem Muster der Blutdrucksenkung. Die Messung des Serumspiegels kann daher wahrscheinlich als Parameter des medizinischen Effekts verwendet werden. Bei der klinischen Verwendung kann erwartet werden, daß diese Bestimmung zur Planung der Verabreichung von MR einsetzbar ist.

Die Fig. 15 zeigt die Bioverfügbarkeit von oral verabreichtem MR im Vergleich zu derjenigen von RCN.

Die Fig. 13 und 14 zeigen, daß trotz der Tatsache, daß MR ein Metabolit von RSP und RCN ist, MR aus dem Verdauungstrakt leichter absorbiert wird und daß der Serumspiegel 1 bis 2 h nach der Verabreichung einen maximalen Wert erreicht. Die Figur zeigt weiterhin, daß die Verweilzeit im Körper erheblich länger ist.

Im Diagramm der Fig. 15 wurde die Fläche unter der Kurve des MR-Gehalts im Serum auf folgender Basis errechnet:

(b) Exkretion in den Urin und die Galle

Die Fig. 16 zeigt die Veränderung der prozentualen Exkretion von MR in den Urin im Verlauf der Zeit bei oraler Verabreichung an Kaninchen. Aus der Figur geht hervor, daß 10 bis 15% des verabreichten MR innerhalb von 48 h nach der Verabreichung in den Urin abgegeben werden und daß die Abgabegeschwindigkeit 1 bis 4 h danach am höchsten ist. Es zeigt sich eine hohe Korrelation mit der oben erwähnten Veränderung des MR-Gehalts im Blut nach der oralen Verabreichung.

Die Fig. 17 zeigt die Veränderung der prozentualen Exkretion von MR in die Galle im Verlauf der Zeit bei venöser Injektion an Kaninchen. Aus der Figur geht hervor, daß so geringe Mengen wie 0,3 bis 0,5% des verabreichten MR innerhalb von 6 h nach der Verabreichung in die Galle abgegeben werden. Als Schlußfolgerung kann daher gesagt werden, daß die Hauptexkretionsroute von MR die Abgabe in den Urin ist.

(c) Biotransformation

100 mg/kg MR wurden 10 Ratten 18 Tage lang jeden Tag verabreicht, um den Urin zu sammeln.

Die Extraktion erfolgte gemäß der in Fig. 18 dargestellten Verfahrensweise. Dabei wurden als Dichloräthanextrakt 0,56 g einer basischen Fraktion erhalten. Die Betrachtung der aus­ getragenen Substanzen in den Fraktionen durch Dünnschicht­ chromatographie zeigte, daß zwei Arten von exkretierten Substanzen vorliegen, nämlich M-I und M-II. M-I und M-II wurden durch Dünnschichtchromatographie von den üblichen Urinkomponenten abgetrennt. Es wurden 220 mg bzw. 5 mg erhalten.

Die strukturelle Untersuchung von M-I und M-II durch NMR, MS, IR und UV zeigte, daß M-I mit MR identisch ist und daß M-II das demethylierte Produkt von MR an der Methoxygruppe des "A"-Rings ist.

Als Ergebnis der obigen Untersuchungen hinsichtlich der sich von MR ableitenden Substanzen mit biologischen Aktivitäten kann die Schlußfolgerung gezogen weren, daß MR kaum metabolisiert wird, wenn es oral verabreicht wird, und daß hauptsächlich das unveränderte MR die Effekte zeigt.

In Fig. 16 ist die prozentuale Exkretion in Urin als prozentuale Menge der verabreichten Menge angegeben, die in den Urin ausgetragen wird. In Fig. 17 ist die prozentuale Exkretion in die Galle als die prozentuale Menge definiert, die bezogen auf die verabreichte Menge, in die Galle ausgetragen worden ist.

Claims (2)

1. Oral verabreichbares Arzneimittel zur Behandlung von Hypertonie, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge von Methylreserpat als Wirkstoff zusammen mit mindestens einem Hilfsstoff enthält, ausgenommen Gesamtextrakt von Rauwolfia Serpentina.

2. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 1 zur Bekämpfung der Hypertonie beim Menschen.