DE3040427A1

DE3040427A1 - Das t-system der immunitaet regulierendes praeparat und verfahren zu seiner herstellung

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Publication number: DE3040427A1
Application number: DE19803040427
Authority: DE
Inventors: Vitalij Yakovlevi&ccaron; Arion; Jurij Nikolaevi&ccaron; Breusov; Tatjana Vladimirovna Gladyseva; Evgenij Fedorovi&ccaron; Dr. Moskva Ivanu&scaron;kin; Serafima Semenovna Bala&scaron;icha Moskovskaja oblast' Kirzon; Vasilij Vyacheslavovi&ccaron; Dr. Moskva Lebedev; Jurij Michailovi&ccaron; Dr. Lopuchin; Rem Viktorovi&ccaron; Dr. Petrov; Irina Vasilievna Sanina
Original assignee: MO MED INST PIROGOVA
Current assignee: MO MED INST PIROGOVA
Priority date: 1980-10-24
Filing date: 1980-10-27
Publication date: 1982-05-06
Also published as: FR2492663A1; FR2492663B1

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin, insbesondere auf Immunopharmakologie und konkreter auf ein das T-System der Immunität regulierendes Präparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Das Präparat wird für die Behandlung primärer und sekundärer immunodefLzienter Zustände breite Verwendung finden. Das Präparat bewirkt die Wiederherstellung der Immunohomöostase des Organismus und übt regulierende Wirkung auf das immune und das blutbildende System aus (das betrifft vor allem die T-Lymphozyten und die Wiederherstellung der Bilanz verschiedener Subpopylat ionen des T-Systems der Immu;-· nität) und beeinflußt dadurch indirekt das B-System der Immunität.

Dashalb ist es verständlich, daß das Präparat in der Klinilc zur Wiederherstellung von Störungen der !Funktion des T-Systems der Immunität Verwendung finden wird. Das betrifft vor allem Störungen des immunen Systems bsi verschiedenen Tumoren, bei angeborener immunodefizienter Pathologie (beispielsweise mit Symptomen des Louis-Bar-Syndroms), akuter Virusinfektion (beispielsweise Herpes Zoster) und einigen anderen Erkrankungen mit Störungen des immunen Status, beispielweise Psoriasis, lupus erythematodes,

Die ersten Versuche, das System der Immunität bei primären und sekundären immunodefizienten Zuständen wiederherzustellen, wurden durch Transplantation des embrionalen oder neonatalen Thymus, des Thymus 'im Blook mit Brustbein (Lopukhin Ju.M,. Morosov Ju.I., Petrov R.V. das Buch:

"Aktuelle Probleme der Transplantation von Organen", Moskau, I974, Seiten 286-502, in Russisch) unternommen. Bei Ataxie- -Teleangiektasiekranken (Louis-Bar-Syndrom), bei genetischer Erkrankung, verbunden mit der Störung der Funktion der T-Zellen und dem Fehlen der Immunoglobuline A und E (IgAi IgE)» bewirkt die Transplantation des Thymus eine teilweise Wiederherstellung der Immunokompetenz und eine positive klinische Dynamik. Jedoch werden dem Organismus

mit dem Gewebe des implantierten Thymus zahlreiche bΙοί
chemische Verbindungen zugeführt, deren Teil für den Rezipienten toxisch sein kann. Die ungenügende Vasfcularisation, die Entstehung des immunologischen Konfliktes sind die Ursache einer raschen Zerstörung des Transplantaten. Bei der Transplantation des Thymus ist es unmöglich, die Zufuhr des Wirkstoffes zum Organismus des Kranken zu dosieren. Deshalb tritt der therapeutische Effekt bei der Transplantation des Thymus kurzzeitig und nicht immer ausgeprägt in Erscheinung, Alle genannten Umstände veranlassen zur Entwicklung von Präparaten aus Thymus oder anderen Organen, die eine höhere biologische Aktivität, ein breiteres Spektrum der therapeutisohen Wirkung gegenüber den durch verschiedene äußere Einwirkungen, bösartige Neubildungen hervorgerufenen primären und sekundären immunodefizienten Zuständen besitzen. Die Präparate müssen keine imsiunogenen Eigenschaft gü aufweisen und keine Komplikationen bei der Verabroiohung verursachen.

Bei der Untersuchung des au3 dem Thymus isolierten Präparates wurde feat, ge at α 11t, daß seine biologische Aktivität mit einem Einweißfitoff verbunden ist, der eine Moleku-

ORiGiNAL iNS^DSC"» ED

lärmanse von 12600 Dalton aufweist. Das Verfahren zur Herstellung des Präparates sieht Homogenisierung des Thymusgewebes in NaCl, Entfernung aus dem Homogenat des Präzipitats, Entfernung aus der Lösung thermolabiler Eiweißstoffe, Präzipitation aus der Lösung der Eiweißstoffe und Peptide, Auflösung der präzipitierten Eiweißstoffe und Peptide, Aus~ salzen der Peptide, Auflösung des Präzipitats der Peptide, Entsalzen der abgetrennten Peptide und deren Lyophilisierung vor (Goldstein, A.L., Guha A., et al., Proc. Natl. A'kad. Soi. USA, 69 p. 1800, 1972).

Die weiteren Untersuchungen haben ergeben, daß der Eiweißstoff ein Aggregat darstellt, der aus einer Reihe von Polypeptiden von der Molekularmasse weniger als 1000 Dalton besteht (Hooper, J.A. Mc. Daniel, M«C·, et al., Αηη.ϊΓ.Τ. Acad. Sei. 249, p· 125, 1975).

Durch Scheibenelektrophorese im Polyakrylamidgel und Isoelektrische Fookussierung in Ampholinen wurden einzelne Polypeptide identifiziert. Die biologisch wirksame Fraktion des Tliymosins (V. Fraktion) weist über 20 Komponenten von der Molekularmasse 1000 bis 15000 ^aIt on auf. Es soll festgestellt werden, daß die einzelnen Polypept idf rakt ionen des Thymuspräparates oder deren Kombinationen verschiedene biologische Aktivität in immunologischen Testen in vivo und in vitro aufweisen. So geigt die größte Aktivität im Test zum Inhibieren der Lyraphozytenwänderung das L^-Thymosin von der MolekularmassQ 3108 und vom isoelektrischen Punkt pi =4,2 (Low 'i'.L.K., Goldstein A.L. In: The Year in Hematology R. Silber, J,Lobac, A.S.Gordon, ede), pp.281-219, Plenum Pablishingj Few Tork, 1978). Andere aus dem Thymus erhaltene

Peptide, beispielsweise ß* und B₄₁ induzieren die Synthese der terminalen Desoxynukleotidyltranspherase in den Vorstufen der T-ZeIlen,Einige Polypeptide des Thymus, beispielsweise ß·,, sind völlig identisch mit den biologisch wirksamen Peptiden aus anderen Organen, insbesondere mit dem Ubiqui-

tin (US-PS Nr«4002602, 1977)· -Das Ubiquitin vermag die Expression der T- und B-Zellmarker in vitro durch Aktivierung des Adenilatzyklase-Zyklus hervorzurufen und Einfluß a'uf die ß -adrenergischen Rezeptoren auszuüben.

Bekannt ist auch, ein thymotischer Humoralfaktör, der Immunokompetenzzellen in vitro nach der Sensitivität der rosettenbildenden Zellen gegenüber Azathioprin zu induzieren vermag. Die Molekularmasse des Humoralfaktors liegt bei 567ΟΟ Dalton· In Fraktionen mit niedrigerer Molekularmasse sind nur Spuren der biologischen Aktivität nachgewiesen (White Α., In: Biochemical action of Hormones (G L^dwik, ed.) VoI 7 Academic press. N.V. 1979).

Somit weisen die Peptide, Polypeptide und die Eiweißstoffe des Thymus außerordentlich breite Heterogenität sowohl in der Größe der Moleküle als auch in ihren biologischen Eigenschaften, auf. Bs ist offensichtlich, daß ein Arzneimittel auf der Basis der Peptide mit hoher Wirksamkeit Moleküle mit bestimmter Molekularmasse und hinreichend hoher biologischer Aktivität enthalten soll. In diesem i'al-Ie bestimmt eine einzigartige qualitative und quantitative Zusammensetzung der Peptide die Breite und den Grad ihrer therapeutischen Wirksamkeit. Grundsätzlich kann man die biologische Aktivität der Peptide durch zusätzliche Reinigung oder durch deren chemische odor enzymatisch^ Modifika-

tion ex-'böhon. Versuche einer klinisohon Anwendung der PoIypetido enthaltenden Präparate für die Stimulierung des T- -Systeina der Immunität wurden bereits an Kranken unternommen, die an primären und sekundären immunodefizienten Zuständen leiden. Im Falle des primären immunodef izienten Zustandes (Hypoplasie des Thymus) verbesserte sich nach der Verabreichung des Thymuspolypeptide enthaltenden Präparates das Befinden des Kranken. Jedoch verschlechterte sich unmittelbar nach der Beendigung der Kur der Immunotherapie

i
das Befinden des Kranken stark (Goldstein A.L., Wara D.W.,

et.al.. Transplant Proc.,V.7 PP 681-686, 1975).

Bei sekundären immunodefizienten Zuständen, hervorgerufen durch bösartige Geschwülste, lieferte die Applikation des Polypeptide enthaltenden Präparates (V.Thymusfraktion) positiven Effekt nur bei 5 Kranken von den 32 Leukämiekranken. Dabei verschlechterte sich bei einem Chorionepitheliumkranken das Befinden (Shafer L.A., Goldstein A.L., et alc, Ann. N.T.Acad. Sei., ν.277t P«6Q9t 620, 1976). Es soll festgestellt werden, daß das Polypeptide enthaltende Präparat (Fraktion V) in außerordentlich hohen Dosen um

400 mg/m pro Tag im Verlaufe von 21 Tagen verabreicht wurde. Dabei wurde bei Kranken mit schweren kombinierten immunodef i. ζ ienten Zuständen überhaupt keine positive Dynamik in dem immunologischen Status beobachtet (Astaldi A., Astaldi, G.C,B., et al., Cancer Treat. Hep. 62, p.1779, 1978). Somit ist die Entwicklung eines Polypeptide enthaltenden Präparates, der gegenüber den primären und sekundären immunodefizienten Zuständen therapeutisch wirksamer ist» ein aktuelles Problem der Medizin.

Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein das T- -System der Immunität regulierendes Präparat zu entwickeln, der eine höhre therapeutische Aktivität besitzt und keine Iinmunogenität und keine Pyrogenität aufweist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand im Auffinden eines Präparates auf der Basis von Peptiden, das eine höhre therapeutische Aktivität besitzt und keine Iiiimunogenität und keine Pyrogenität aufweist.

! Diese Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß ein das T-System der Immunität regulierendes Präparat entwickelt wurde, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet wird, daß es als Wirkstoff Peptide von der Molekularraasse 1,500 b£_S 6.000 Dal ton mit einem Absorptionsmäximum im Ultraviolettlicnt bei 208 und 275 om und einer elektrophoretischen Wanderung im Gel gegenüber dem Bromphenolblau von O„062-0,102; 0,156-0,256; 0,35^-0,57^; 0,382-0,422; O,432-0,472; 0,485- -0,545; 0,850-0,930 und ein pharmazeutisches Vehikel für den Wirkstoff enthält.

Im folgenden wird das das T-System der Immunität regulierende-Präparat der Kürze halber als T-Activin bezeichnet.

In dem genannten Präparat dient ala Vehikel eine physiologische Lösung. Als physiologische Lösung verwendet man eine 0,14 molare-NaCl-Lösung. Der Gehalt des erindungsgemäßen Präparates für Injektionen an Wirkstoff beträgt 100 bis 200 /Ug/ml.

Das Präparat besitzt spezifische immunostimulierencie Aktivität gegenüber den T-Lymphozyten in vitro. Im Teat zum

ORIGINAL INSPECTED

Wiederherstellen der Empfindlichkeit der T-rosettenbildenden Zellen zum Azathlaprin zeigt es die Aktivität in der Dosis von 1 Aig-je 5 χ 10⁶ Lymphozyten. Das Präparat zeigt regulierende Wirkung auf das T-immune System bei dessen Störung bei Kranken an bösartigen Ne ab il dung en, Psoriasis und einigen anderen Erkrankungen. Die regulierende Wirkung des T-Activins manifestiert sich in der Normalisierung der Anzahl und der Bilanz der Populationen der T-Lymphozyten bei erniedrigter oder erhöhter Aktivität derselben bei den

i . ■ ■ ■

Kranken. Das Präparat übt lytische Wirkung auf das primäre Tumorgewebe und die Metastasen aus, potenziert die spezifische Polychemo therapie, schafft Möglichkeiten für lokale Strahlentherapie von Geschwülsten. Das T-Activin bewirkt eine nachhaltige Wiederherstellung der T-Immunität bei Kranken mit Störungen des immunen Systems, hervorgerufen durch primären oder sekundären immunodef izienten Zustand, und übt ausgeprägte therapeutische Wirkung beim Lois-Bar" —Syndrom sowie bei Psoriasis aus. Außerdem hebt es Intoxikationssymptome auf, normalisiert die Körpertemperatur und den neurologischen Status bei eilen oben genannten Arten der Erkrankungen.

Das Präparat ruft keine Komplikationen, keinen pyrogenen Effekt hervor und führt nicht zum Auftreten spezifischer Antikörper dazu oder zum Eintreten von Idiüsynkrasiefäliöxi.

Das Verfahren zur Herstellung eines das T-System der Immunität regulierenden Präparates, welches

1) Homogenisierung des Thymusdrüsegewebes in NaCl

2) Entfernung aus dem Homogenat des Präzipitates

3) Entfernung aus dar. Lösung thermolabiler Eiweißstoff ο

-Ti- ■. ^-^7

4) Präzipitation ana der Lösung von Eiweißstoffen und Peptiden

5) Auflösung der präzipitierten Eiweißstoffe und Peptide

6) Aussalzung der Peptide

7) Auflösung deä Peptidpräzipitates .

8) Entsalzung der abgetrennten Peptide und ihre Lyophilisierung vorsieht, wird erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man

9) nach der Stufe (1) das Homogenat während 12 bis 16 Stunden bei einer Temperatur von 2 bis 6⁰C hält,

10,6) das Aussalzen der Peptide in drei Stufen, und zwar die erste in 20 bis 30%iger Lösung, bezogen auf die Absättigung des Ammoniumsulfates, bei einem pH*-Wert von 6,9 bis 7,Ii die zweite in 40 bis 55%igQ£ Lösung,bezogen auf die Absättigung des Ammoniumsulfates, bei einem pH-Wert von 5,9 bis 4,1 und die dritte in 45 bis 55%iger Lösung, bezogen auf die Absättigung des Ammoniumsulfatee, bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,0 durchführt,

11) die Lösung der Peptide nach der Stufe (7) einer Ultrafiltration durch eine Membrane mit einer Rückhaltenenngrenze für Globulareiweißstoffe von 12000 bis JO 000 Dalton unterwirft und das erhaltene

12) Ultrafiltrat unter Abtrennung der Peptide von der Molekularmasse I500 bis 6000 Dalton in einer Pufferlösung mit einem pH~Wert von 6,8 bis 8,2 mit einer Ionenstärlce von 0,1 bis 0,4 Mol chromatographiert und nach der Stufe (8)

15) die Peptide mit einem pharmazeutischen Vehikel vermischt·

"" JL(Z. ^mm

Man führt zweckmäßigerweise das Aussalzen in der Stufe (10,6) bei einer Konzentrati9η der Eiweißstoffe und Peptide in der Lösung in einem Bereioh von I5 bis 25 mg/ml durch. Dadurch wird eine höhere Ausbeute an biologisch wirksamen Peptiden erzielt.

Man hält zweokmaßigerweise das Homogenat in der Stufe (2) boi einem Verhältnis des festen und des flüssigen Teils von 1:3 und führt die Gelchromatographie der Peptide in der Stufe (11) in einer Pufferlösung durch, die KCl oder NaCl enthält·

Das erfindungsgemäße Präparat T-Activin besitzt hohe immunostimulierende Aktivität gegenüber den T^Lymphozyten in vitro. Im Test zum Inhibieren der spontanen lEosettenbildung durch Azathioprin tritt seine Wirkung in einer Dosis von 1 ug je 3 xlO Lymphozyten in Erscheinung. Das Prä_T parat besitzt die Fähigkeit, die T-Rosettenbildung bei einer Störung des immunen Systems wiederherzustellen, darunter solche, die onkologische und andere Erkrankungen begleitet. Nach der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Präparat von Lymphozyten der onkologischen und anderen Kranken in vitro wird eine Normalisierung des prozentualen Gehaltes der T-rosettenbildenden Zellen T-RBZ festgestellt (Tabelle 1).

-Ϊ5- . ■-,„.,./ Tabelle 1. Wiederherstellung durch das T-Activin der T-RBZ

In vitro

Nr. des	Diagnose	% T-RBZ Im	peripheren Blut
Kranken		vor der Be	nach der Be
		handlung	handlung mit
			T-Activin
			(1 jug je 2XL0⁵
			Lymphozyten)
1.	Lymphosapkom.	22	46
ä	Lymphosapkom.	34
3	Lymphosapkom	50	56
4	Lymphosapkom	16	37
5	Lymphogranulomat öse		67
6	Lymphogranulomatοse	54	83
7	Lymphogranulomatoae	41	80
8	Lymphogranulomatose	42	73
9	chromische Lympholeukose	44	70
IO	Psoriasis	42	51
11	Psoriasis	42	59
12	Psoriasis	12	60
15	Psoriasis	23	59

Die Fähigkeit, die immunologische Antwort bei Tieren unter der Wirkung des T-Activins wiederherzustellen, folgt aus den experimentellen Angaben, erhalten an thyraektomiertan Mäusen und Mäusen mit angeborener Thymusaplasie. Die thymek» tomierten Mäuse gewinnen unter der Wirkung des Präparates die Fähigkeit zur Bildung von T-rosettenbildenden Zellen nach Ablauf verschiedener Zeit nach der Eatfernung den Thyiaus. Angaben zum Einfluß des T-Activins in einer Dos in von 40

jüg/m. nach Ablauf von 5 Tagen, 35 Tagen_f 245 Tagen nach der

WSPECTED

Thymektomie auf die Immune Antwort der thyniektomierten Mäuse auf die Erythrozyten dea Schafbocks (T-RBZ) sind in Schaubild 1 dargestellt. Auf der Abszissenachse ist die Anzahl der rosettenbildenden Zellen .je 1(K kernhaltige Milzzellen, auf der Ordinatenachse die nach der Thymektomie abgelaufene Zeit in Tagen aufgetragen; IZZI bedeutet die Zufuhr der Erythrozyten bei normalen Tieren; V///A bedeutet die Zufuhr der Erythrozyten bei thymektomierten Tieren; l^-=! bedeutet die Zufuhr der Erythrozyten bei thymektomierten Tieren unter Verabreichen des T-Activins.

Aus Sohaubild 1 ist zu ersehen, daß die Wiederherstellung der T-Rosettenbildung auf die Normalwerte bei Tieren 245 Tage nach der Thymektomie, das heißt selbst in der Peiode der physiologischen Alterung des Organismus festgestellt wird.

Der über das T-inimune System vermittelte Einfluß des T-Activins auf das B-immune System bei der Immunisierung der Mäuse "Nude" mit den Erythrozyten von Schafbock nach dem Test der antikörperbildenden Zellen (ABZ) ist in Schaubild 2 gezeigt, wo auf der Abszissenachse die Anzahl der ABZ je

6

IO kernhaltige Zellen aufgetragen ist, L_ I Immunisierung mit den Erythrozyten des Schafbocks und Χ77Ά Immunisierung mit den Erythrozyten des Schafbocks bei Verabreichung des T-Activins bedeutet.

Unter dem Einfluß des T-Activins nehmen die Mäuse der Linie "nude" die Fähigkeit zur normalen immunologischen Antwort _auf das T-abhängige Antigen*, die Erythrozyten des Schafbocks, an und bilden spezifische antikörperbildende Zellen. Die erhaltenen Resultate zeigen die regulierende

Wirkung des T-Activin3 auf das immune System des Organismus.

Das Präparat besitzt spezifische Wirkung nur auf die Organe des immunen Systems, den Thymus, die Zymphknoten und die Milz. Bei der Verabreichung des T-Activins wird in diesen Organen Stimulierung der Proliferation der lymphoiden Zellen und der DNS-Synthese festgestellt. In den übrigen Organen, wie Leber, Nieren, Herz, Darmwand, Lungen, Rückenmark und Gehirn, werden nach den Angaben der Lichtmikroskopie keine morphologischen Veränderungen festgestellt.

Das Präparat weist keine Toxizität auf und verändert nicht die physiologischen Punktionen des Nervensystems, der Atmung, des Blutkreislaufes, in Dosen, die die therapeutische um das Einhundertfache übersteigen. Das T-Activin ruft keine Störungen der Blutbildung und der Zusammensetzung der Zellen des periipheren Blutes bei praktisch gesunden Tieren hervor, was aus den in den Tabellen 2(a,b,o) und 3 (a und b) dargestellten Angaben hervorgeht. .

Tabelle 2a. Erythrozytenzusammensetzung des peripheren Blutes experimenteller Tiere eine Wochen nach Verabreichen des T-Activins

Kennwerte

Kontrolle

therapeutisehe Dosis

20fache Dosis

M+ra

M+m

Hämoglobin,g% 12,0+0,57 11,7+0,15 ^0,2 11,1+0,5 Erythrozyten,

Mio./jul 4,2+0,21 5,9+0,16' <0,001 6,0+0,38 < 0,001

0,86+0,02 0,54+0,01 <0,00I 0,54+0,0I<>0,001

Färb index

Tabelle 2b Eryfchrozytenzusammensetzung des peripheren

Blutes experimenteller Tiere zwei Wochen nach Verabreichen des T-Activina

Kennwerte Kontrolle therapeuti- 20fache Dosis

sehe Dosis

M+m M+ m ρ M+m ' ρ

Hämoglobin,g% 12,0+0,57 12,9+1,10 0,01 14,1+0,40 0,001

Erythrozyten,

Mio./Ul 4,2+0,21 6,2+0,16 0,001 6,3+0,38 0,001

Färbindex 0,86+0,02 0,7+0,02 0,001 O,75±O,O3 0,001

Tabelle 2c» Erybhrozytenzusammensetzung des peripheren Blutes experimenteller Tiere äin Jahr nach Verabreichen des T-Activins

Kennwerte Kontrolle therapeuti- 20 fache Dosis

sehe Dosis

m+m. M+m ρ · i/L+m ρ

Hämoglobin,g% 15,2+0,66 15i5±O,75 0,2 14,5+0,75 0,2

Erythrozyten,

Mio./fUl 6,2+0,28 6,7+0,2 0,1 5,6+0,3 0,1

Parbindex 0,84+0,04 0,78+0,02 0,1 0,76+0,04 0,1

ORIQiNAL

Tabelle 3a» Leukoisytenzuaaiiiniensetzung des peripheren Blutes experimenteller Tiere nach. Verabreichung der therapeutischen und der 20fachen Dosis des T-Activins nach IA Tagen

Kennwerte Kontrolle therapeutische

Dosis

2Ofache Dosis

M+m

Leukozyten,

'in 1 Jül 4,7+0,3

Eosinophilen,% 5,0+0,8 Stabkern ige .
Neutrophilen,% 1,5^0,5 Segment kernige lie ut roph.il en, % 14,0+_2,6 Lymphoayten,% 76 Monozyten,% 5

Index der Kernverschiebung der Neutrophilen 0,1+0,01

0,5+0,2

0,2 4,64^0,12 0,2 0,01 0,5+0,2 0,01

0,1 3,5±0,4 0,01

18,5±2,7 0,1 13,25+3,6 0,05 74,0+2,5 · - 0,05 81,0+4,2 0,05 3,5+1,1 0,05 1,75+0,2 0,05

0,19+0,13 0,05 0,26+0,08 0,05

Tabelle 3b»

Leukozytenzuaamiaensetzung des peripheren Bluts experimenteller Tiere nach. Verabreichung der therapeutischen und der 20fachen Dosis des T-Activins nach einem Jahr

RiOiWAL INSPECTED

040427

Kennwerte Kontrollo therapeutische 2Ofache Dosis

Dos is

M+m M+m ρ M+ m

Leukozyten,

1O⁵ in ul 4,1+0,3 4,10+0,25 0,1 3,9+0,3 0,1

Eosinophilen,% 3,0+0,8 1,5+0,2 0,02 1,8+0,2 0,02

Stabkernige

Ne_:utrophilen,% 1,5+0,3 2,9+0,5 0,02 3,1+0,5 0,02

Se'gmeatkernige

Neutrophilen,% 14,0+2,6 17,1+1,1 0,02 18,3+2,1 0,03 Lymphozyten,?5 76,5+3,2 79,1±2,3 0,1 69,1+3,4 0,1 Monozyten,% 5,0+1,1 3,4+0,6 0,1 4,5+0,5 0,1

Index der Kernverschiebung
der Heutrophilen 0,1+0,01 0,15+0,05 0,2 0,13+0,03 0,2

Eine wichtigere Eigenschaft des Präparates T-Aetivin.ist sein positiver Effekt in vito hinsichtlich der Normalisierung der Kennwerte des T-immunen Systems und die mittelbare Beeinflussung des B-Systeras des Organismus bei verschiedenen pathologischen Zuständen sowie seine unmittelbare therapeutische Wirkung bei primären immunodefizienten Zuständen, beispielsweise Ataxie-Teleangiektasie (Louis-Bar-Syndrom) und sekundären, darunter bösartigen Geschwülsten, beispielsweise Lymphogranulomatose, Lymphosarkom, Retinoblastom. und vielen anderen.

Bei der Bewertung des immunologischen Status von Kranken mit dem primären immunodef izienten Zustand wurde funktionale

Störung des T- und B-Systems festgestellt, die sich. In der Senkung der Fähigkeit der T-Lymphozyten zur Blasttransformation und der Senkung der Menge des Serumimmunoglobulins A (IgA) äußert. Die Angaben sind in Tabelle 4 angeführt. Tabelle 4. Dynamik der Veränderung der Konzentration der Serumimmunoglobuline (in mg%) bei Kindern mit

Louis-Bar-Syndrom

Vor Immunotherapie

Nach Immunotherapie Nach Immuno-(7 Tage) therapie

(14 Tage)

Ig A IgG I gM · IgA IgG IgM IgA IgG I gM

Norm

50-200 950-1980 70-200

1.	45	550	49	74	330	505	82	560	IO5
2c	110	1680	280	190	2460	500	48	225O	560
5.	56	960	70				58	IO5O	140
4.	74	1140	90	8	I5OO	250	16	I35O	550
5.	58	690	250

Mittel 69+25 964+444 146+.95

46+27 I297+258+I55 198

Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, wird naoh der Verabreichung des Präparates im Verlaufe der ersten 7 ^age eine Tendenz nach dem ursprünglichen Stand der funktionalen Aktivität der T- -Lymphozyten im Test zur Reaktion der Blasttransformation gebracht. Dabei nimmt die Menge der Serumimmunoglobuline IgA, G_f M ebenfalls zu, was auf eine mittelbare Stimulation des B-Syatenis der Immunität hindeutet.

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-ZO-

Der klinische Effekt bei der Verabreichung des Präparates tritt am dritten Tag nach der Applikation des Präparates din und kommt in der positiven Dynamik dee akinetiko— regiden und des hyperkinetischen Syndrome, in der Wiederherstellung der Geschwindigkeit der Fortpflanzung des Impulses über die Nervenfasern und der Zunahme der Stärke der Muskelkontraktionen um das 1,5 bis 2fache zum Ausdruck.

Bei der Bewertung des immunologischen Status von Kranken mit dem sekundären immunodefizienten Zustand bei Lymphogranulomatose wurden quantitative und funktionale Störungen des T-ßystems der Immunität festgestellt. In tabelle 5 sind Angaben angeführt, die auf eine Senkung des absoluten Gehaltes an T~Lymphozyten und ihrer funktionalen Aktivität im Test zur Blasttransf ormat ion mit dem Phytohämaglutinin (PHA) hindeuten. Dabei wird, wie aus dem quantitativen Gehalt an Immunoglobulinen IgA, IgG, IgM folgt, keine funktionale Störung des B-Systems festgestellt.

Nach der Verabreichung des T-Activins wird eine Wiederherstellung des absoluten Gehaltes an T-Lymphozyten festgestellt. In der Gruppe der Kranken mit erniedrigtem prozentuarlem Gehalt an T-rosettenbildenden Zellen (B-BBZ) wird eine Wiederherstellung dieses Kennwertes auf den normalen Stand festgestellt. Die funktionale Aktivität wurde ebenfalls auf normale Werte wiederhergestellt. Die erhaltenen Angaben deuten auf die regulierende Wirkung des T-Activins hinsichtlich der Zellularimmunität hin, Die Angaben sind in der Tabelle angeführt* „

Tabelle 5. Kl inia cn-immunologische Kennwerte der Kinder mit Lymphogranulomatose (LGM) vor Immunotherapie

Nr. des Kranken und Alter

Stufe der LGM

histolo- aba.Zahl giache der Lym- . Variante phozyten

E-RBZ

Norm

über

1500

65

1 ,	7	Jahre	Jahre	HAa	g.Z.	726	29
2	6	Jahre	Jahre	HlAb	g.Z.	1300	30
3	3	Jahre	Jahre	HBb	g.Z.	1080	36
4		,5 Jahre	Jahre	HlAb	g.z.	294O	32
5	7	Jahre	Jahre	HlAb	g.Z.	1480	25
6		,5 Jahre	Jahre	HAa	g.z.	875	46
7	15 Jahre	HlBb	g.z.	1533	46
8	7	HlAb	■ -	2394	46
9	8	HBb	-	1495	52
10	7	HlBb	lym.D.	2490	60
11	7	HAb	g.Z.	2223	40
12	9	IV Bb	g.Z.	2071	41
13	4	IHAb	g.z.	1330	68

Abkürzungen: EÄC=B-rosettenbildende Zellen; g.Z. ^gemischte Zellenvariante;
lym.D alymphoides Dominieren; PHA=Pnytohämaglutinin

abs.Zahl Reakt'ion der der T-Lym-formation mit phozyten	blank PHA	18869	Blasttrans- PHA	%EAC	Konzentrat ion der Se rum immuno gl ο b ul ine in mg%	IgM	IgG
		14355	Index		IgA	70-200	950-1980
über 1000	424	3350	über 40	10-30	50-200	40	950
i 211 I	346		30,3	40	195	160	2100
390	115	1357	41,4	20	320
588		2352	29,1	24		220	1400
940	152			28	208	90	1520
370	130	2527	9.	20	150	60	1320
402		9810	18,0	30	116	160	2000
720	80			22	376	135	1050
1110	439	6830	31,3 .	23	125
748			22,3	25		120	1680 .
1494	286	16773	5,7	30	210	70	I5OO
889		23	25	62
848	585		14		130	1380
904		28,6	37	72

_ ρ -χ _'■"*" ..»■·♦ -« . U U -ι j ■■[ Z. /

Tabelle 6; Klinisch-immunologische Kennwerte dar Kinder mit
Lymphogranulomatose (IMG) nach, der Immunotherapie

Hr. des Kranken . und Alter

Stufe der

LGM

histolo-

giache

Variante

abs. Zahl der Lymphozyten

% E-EBZ

Norm

über 1500

^1# !	7	6	Jahre	HAa	g.Z.	1178	66
2	3	Jahre	HlAb	g.Z.	1316	65
3	3,5	Jahre	HBb	g.Z.	1566	67
4	7	Jahre	HlAb	g.Z.	2288	68
5	3,5	Jahre	HlAb	g.Z.	1184	68
6	13	Jahre	HAa	g.Z.	2544	68
7	7	Jahre	HlBb	g.Z.	1540	72
8	8	Jahre	IHAb		I59I	68
9	7	Jahre	HBb	-	1664	64
10	7	Jahre	HlBb	lyra. D	3180
11	9	Jahre	HAb	g.Z.	I07I	67
12		Jahre	IV Bb	g.Z«	1040
13	Jahre	HlAb	g.Z.	I3O8	54

Abkürzungen: EAC sB-rosettenbildende Zellen; g.Z. = gemischte Zellenvariante t
lym.D = lymphoidea Dominieren; PHA= Phytohämaglu-

tinln

ORIGINAL INSPECTED

abs.Zahl der T-Lymphozyten

Reaktion der Blaattransfor- %EAC Konzentration der mation mit RHA Serumimmunoglo-

b ul ine in mg%

blank

PHA

Index

IgA IgM IgG

TTHer I0-30 50-200 70-200 950-40 1980

über 1000

777;	149	23965	160	26	200	60	860
855	375	19962		22	400	270	25OO
1049	184	8720	29	19
1556			107	28	210	144	1680
805	714	66282	92	23	135	90	1120
1248	248	8437	' 34	35	120	120	1740
1108	330	4900	14	25	210	310	1440
1081	508	9512	30	48	90	85	1200
1064	200	7545	38	19	50	30	480
I749	420	I7902	47	20	320	80	1440
717	273	17046	62	20	280	500	200

707

1513

34433

22

40

45 70 IO5O

Eine besonders wichtige Eigenschaft des Präparates ist seine therapeutische Wirkung hinsichtlich der onkologischen Erkrankungen, besonders bei immunodefizienten Zuständen bei den Kranken« Optimale therapeutische Wirkung tritt in Erscheinung bei der Verabreichung des Präparates in Injektionen in Behandlungakuren · in einer Tagesdosis von- 20 bis 40 /ig

je 1 m² Körperoberfläche. Dabei normalisiert sich bei den Kranken, die an bösartigen Neubildungen mit spezifischer Intoxikation leiden, bereits in den ersten 24 Stunden die Temperatur, es tritt eine Besserung des Befindens ein und es wird besser der Appetit. Bei der Imaunotherapie mit dem T-Activin der an Lymphogranulomatose kranken Kinder wird bereits in den ersten 24 Stunden nach dem Beginn der Applikation des Präparates eine Zerstückelung, Auflockerung und Ausscheidung einzelner Lymphknoten aus dem Konglomerat der

befallenen Lymphknoten und im weiteren, am 7«· bis 14.Tag, eine Verringerung der Fläche der befallenen Lymphknoten um 60 bis 70%, bezogen auf die ursprüngliche befallene Fläche, beobachtet. Bei der Analyse der Zytogramme der befallenen Lymphknoten im Prozeß der Therapie mit T~Activin wird eine Zunahme des Prozentsatzes der Lymphozyten in den Lympfknoten von 70 bis 80% auf 95 bis 98% unter Erzielen eines lympfonodulytischen Effektes festgestellt, es werden die spezifischen Beresowskij-Sternberg-Zellen zerstört· Bei Kindern mit ausgeprägter biologischer Aktivität des Prozesses wird Normalisierung der Geschwindigkeit der Präzipitation der Erythrozyten (GPB) sowie Aufhebung der Intoxikation festgestellt. Diese Angaben sind in den Schaubildern Ja und Jb dargestellt, wo es bedeuten: a Einfluß auf die Symptome der spezifischen Intoxikation, b Einfluß auf die biologische Aktivität des Prozesses (GPE), CU vor der Verabreichung des T-Aotivins, y777a nach der Verabreichung des T-Activins. Gleichzeitig mit der Wirkung des T-rActivins normalisiert sich bei den Kranken der absolute Gehalt an periphoren T-Lymphozyten, normalisiert sich der prozentuale Gehalt an E-roaet-

I ' I Z Z " I IZ ϊ ^ -1 / D / 9 7

— 26 — ■"' ' **" " °* "* vj L -i· U'4 Z /

tenbildenden Zellen, der Index der Stimulation der Lymphozyton. Naoh der Beendigung der Iinmunotherapie der an bösartigen Neubildungen Kranken mit T-Aotivin entsteht die Möglichkeit für die Fortsetzung einer wirksameren Polyohemotherapie oder lokale Strahlentherapie. Dabei wird ein rasches Eintreten der Remission im Verlauf der bösartigen Erkrankung festgestellt. Die Angaben sind in. den Tabellen 7 und 8 dargestellt.

Tabelle 7. Einfluß des T-Activins auf den Zeitpunkt des Eintretens der Remission der Lymphogranulomatose bei Kindern

Gruppen der Zeitpunkt des Eintretens der Remission

K*axdom . . . (Monate)

1,5 - 2,0 6,0 12 keine Remission Tod

Anzahl der Kinder

1. 3Jaoh der Iminunotherapie mit

T-Activin 13 ■ .

Kinder 12 I

2. Ohne Immunotherapie mit

T.-Activin 2 1? I I I

22 Kinder

Tabelle 8. Einfluß des T-Activins auf die Häufigkeit der Komplikationen bei an Lyniphogranulomatose kranken Kindern

Gruppen der Kranken Arten der Komplikationen

Zytotaxische Krankheit Induzierte (Anzahl der Kinder) immunologische

Insuffizienz

I (Anzahl der

Kinder)

1. Mit Immunotherapie
mit T-Activin

13 Kinder I

2. Ohne Immunotherapie
mit ^rf-Activin

22 Kinder II 14

Die positive Dynamik des lymphonodulytischen Effektes ist im ^chaufcild 4 dargestellt, in dem auf der Abszissenach-

se die Fläche der Lympfknoten in cm und auf der Ordinaten*- achse Tage vom Behandlungsbeginn an aufgetragen sind, wobei es bedeuten:

die Linie Perioden der Verabreichung des T-Akti-

vins; die Linie-^v—φ- die Periode der fehlenden Arzneitherapie; die Linie die Periode der Chemotherapie.

Das Präparat T-Activin bewirkt eine nachhaltige Wiederherstellung der Immunität, Bei der Behandlung bösartiger Geschwülste besitzt das Präparat ausgeprägte direkte anti-

OSlGMAL (NSPECTED

* * fr*

— 2ο —

tumorale Wirkung, verkürzt die Zeit bis zum Eintreten der Remission, potenziert die spezifische Polyenemotheraptθ, ermöglicht die lokale Strahlentherapie.

Im Hinblick auf die regulierende Wirkung des Präpara- ' tes wird ea möglich, das T-Activin zur Behandlung sekundärer hypoplastischer Zustände der Blutbildung anzuwenden. Bei der Immunotherapie mit dem Präparat des akuten hypoplastischen Zustandea im Verein mit dem immunodef izienten Zustand beob'aohtet man die Wiederherstellung der Immunität und der

Kennwerte der peripheren Blutes und der Knoohenmarkblutblldung.

Bei der Applikation des Präparates zur Behandlung anderer mit den Störungen des Systems der Immunität verbundener Erkrankungen wie Psoriasis, lupus erythematodes und an dere, wird ein guter klinischer Effekt bereits nach der ersten Immunotherapiekur erzielt. Die klinische Wirkung des T-Activins kommt dabei in der Verkürzung der Zeit bis zum Eintreten der Remission zum Ausdruck, was für die Behandlung .von Kranken, die die Beständigkeit gegen spezifische Chemotherapie zeigen,besonders wichtig ist. Bei der Verordnung des Präparates den Kranken wird niemals die Entstehung von Komplikationen, wie pyrogener Effekt oder Auftreten von Antikörpern zum T~Activin, werden keine Fälle der Ideosynkraeie festgestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Präparates wird wie folgt durchgeführt. Als Rohstoffquelle verwendet man Kälbthymusdrüse. Vor der Verwendung kann.das Gewebe der Drüse bei einer Temperatur von minus 20⁰C innerhalb von 35 Monaten aufbewahrt werden. Den Thymoa reinigt man

JU4J — 29 —

von der Kapsel und zerkleinert an der Kälte zu Stückchen von 0,5 bis 1 g Gewicht. -Dem zerkleinerten Rohstoff gibt man eine beliebige physiologische Salzlösung, im allgemeinen 0,14 molare NaCl-Lösung im Verhältnis 1:3 zu· Dann homogenisiert man das Material in einem Wirbelhomogenisator innerhalb 3 Minuten bei 8000 U/min. Im dieser Stufe wird eine Zerkleinerung des Materials zu einer homogenen Masse erzielt. Die Stufe wird an der Kälte bei einer Temperatur von plus 2⁰C bis plus 4⁰C durchgeführt. Das genannte Verhältnis

des Eohstoffes und der physiologischen Lösung ermöglicht es, ein homogenes Homogenat zu erhalten und aus dem Rohstoff die biologischen Wirkstoffe möglichst vollständig in der Stufe des Stehenlassana abzutrennen. Das Homogenat wird bei einer Temperatur von plus 2⁰C bis plus 6⁰C innerhalb 12 bis 16 Stunden stehengelassen. Die Bedingungen des Stehenlassens (der Autolyse) wurden experimentell ermittelt. Eine Abänderung des Zeit- oder Temperaturparameters bewirkt eine Senkung der Ausbeute an Endprodukt und seiner biologischen Aktivität. Während der Autolyse kommt es zu einer zusätzlichen Zerstörung der Zellen, zytoplasmat ischen und Kernmembranen, zur Modifikation unter der Wirkung der Enzyme der Eiweißstoffe und Peptide. Das bewirkt eine Erhöhung der Ausbeute an biologischen Wirkstoffen und ihre Umwandlung unter Erhöhung der spezifischen biologischen Aktivität. Dann weiden die unlösliohen groben Fragmente durch Zentrifugieren bei 14.000 bis 20.000 g innerhalb einer Stunde bei einer Temperatur von 4⁰C entfernt. Den Überstand zieht man durch

ein Gaze- oder Kapronfilter zum Zurückhalten grobdiaperier e ab·

. 3(

Dann erhitzt man den Überstand auf Wasserbad unter intensivem Rühren auf eine Temperatur von 70 bis 9O⁰C, gewöhnlich auf pine Temperatur von 80⁰C und hält bei dieaer Temperatur innerhalb von 15 Minuten. In dieser Stufe kommt es zu einer Denaturation der thermolabilen Ballaste inweißkoinponenten. Nach der Abkühlung auf. eine Temperatur von 4⁰C entfernt man die thermolabilen Komponenten duroh Zentrifugieren bei 14.000 bis 20.000 g innerhalb einer Stunde. Pas Zentrifugieren kann durch eine beliebige andere Methode, die die Entfernung der denaturierten Eiweißstoffe gewährleistet, beispielsweise duroh Filtration auf Filtern mit ausreichender. Porengröße, ersetzt werden. Den Überstand, der biologisch wirksame thermostabile Eiweißstoffe und Peptide enthält, unterwirft man· einer Präzipitation mit Azeton. Möglich ist auch die Verwendung eines anderen organischen Lösungsmittels, beispielsweise von Äthanol. Die Prozedur wird bei einer Temperatur von minus 20⁰C bis minus 25°C durchgeführt. Ein Volumen des Überstandes setzt man zu 5 Volumen des Azetons unter gleichzeitigem Rühren des Gemisches hinzu. Das Gemisch wird 2 Tage bei einer Temperatur von minus 20⁰C stehengelassen. In dieser Stufe wird die Auflösung von Fetten und anderen Ballaststoffen in einem organischen Lösungsmittel herbeigeführt. Das Präzipitat enthält biologische Wirkstoffe und Peptide. Der flüssige Teil (wird entfernt, das Präzipitat unter Vakuum bei einer Temperatur von 4⁰C getrocknet. Sine wichtige Bedeutung hat bei der Präzipitation dar biologisch wirksamen Paptide mit Azeton die strikte Einhaitung der Temperaturführung und das Verhältnis zwischen dem Volumen des Überstandes und des Azetons (1:5 bis 1:7). Eine

PZ. Π/.

Abänderung der genannten Parameter führt zu einer Senkung der biologischen Aktivität des Materials und seiner Verunreinigung durch die Ballastoffe. Das getrocknete Präzipital löst man in 0,01 molaren Natrium-Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0, einer Temperatur von 18 bis 22⁰C auf und rührt innerhalb einer Stunde. Die unlöslichen Produkte entfernt man durch Zentrifugieren bei 10.000 bis 16.000 g innerhalb 40 Minuten. Den Überstand sammelt man und verdünnt mit der Pufferlösung auf eine Konzentration von 15 bis 2'5 mg/ml.

Man wendet zweckmäßigerweise gerade die genannte Konzentration der Eiweißstoffe und Peptide in der Lösung an, weil dabei minimale Verluste an biologisch wirksamen Peptiden bei anschließendem Aussalzen zu verzeichnen sind. Der erhaltenen Lösung gibt man eine gesättigte Lösung von Ammoniutasulfat bis zur Erzielung einer End konzentrat ion von 20 bis yyfo bei einem pH-Wert von 6,9 bis 9,7 zu. Das Gemisch rührt man innerhalb von 1 Stunde bei einer Temperatur von 2 bis 4⁰C. Den unlöslichen Teil entfernt man durch Zentrifugieren bei 16.000 g innerhalb von 30 bis 40 Minuten. Dann gibt man dem Überstand 10%ige Essigsäure bis zur Erzielung eines pH-Wertes von 3,0 bis 4,1 zu. Dabei beobachtet man ein teilweises Ausfallen des biologisch wirksamen Materials zum Präzipitat. Die vollständige Präzipitation wird beim Eintragen in den Überstand des trockenen Pulvers von Ammoniumsulfat bis zur Erzielung eines Sättigungsgrades von 45 bis 55%, bezogen auf das Endvolumen des Gemisches, erreicht. Das Gemisch rührt man 1 Stunde bei einer Temperatur von 2 bis 4⁰C. Durch Zentrifugieren bei 16.000 g innerhalb

von ^O big 40 Minuten bei einer Temperatur von 2 bis 4⁰C erhält wan ein Präzipitat. Der Überstand wird entfernt und das Präzipitat in 0,01 molarer Tris-HCl-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0 aufgelöst. Die dritte Stufe des Aussalzens wird in einer 45 bis 55%ige& Lösung, bezogen auf die Absättigung des Ammoniumsulfates, bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,0 durchgeführt. Die Lösung wird bei einer Temperatur von 2 bis 4⁰C innerhalb 1 Stunde innig verrührt und d,as Präzipitat durch Zentrifugieren bei 16.000 g innerhalb von 20 bis 40 Minuten gesammelt. Die Durchführung des Aussalzens in drei Stufen macht es möglich, eine zusätzliche fieinigung von den Ballaststoffen durchzuführen und dadurch ein Endprodukt mit vorgegebenen Eigenschaften zu erhalten.

Dann löst man das Präzipitat in 10 ti molarer Tris-HCl-Puf-

ferlösung bei einem pH-Wert von 8,0 auf und bringt die Konzentration des Eiweißstoffes mit der gleichen Pufferlösung auf 8 bis 12 mg/ml.

Die erhaltene Lösung unterwirft man einer ultrafiltration durch Membranfilter mit einer Rückhaltenenngrenze für Globulareiweißstoffe von 12.000 bis 30„000 Dalton in der Sticket off atmosphäre unter einem Druck von 3,0 bis 3,5 at bei einer !Temperatur von 2 bis 4⁰C. Man verwendet Vorzugs-· ' weise Membranen Pellicon PSED (Millipore), wenn auch ein beliebiges anderes Filter mit gleichen Kennwerten (VM-50,PM-JO) verwendet werden kann. Dann wäscht man die Membrane mit dreifachem Volumen der 0,01 molaren-Tris-HCl-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0. Dadurch wird ein vollständiger Übergang der biologisch wirksamen Komponenten in das Piltrat erreicht. Auf dem Filter werden ÖO bis 85% Ballaststoffe zu-

-t * * « P η * λ * r

rückgehalten. Das Filtrat wird gesammelt und lyophilisiert» Das erhaltene Material löst man in minimalem Volumen destillierten Wassers auf und unterwirft einem Entsalzen durch. Exklusionschromatographie auf Säulen (2,5x30 cm) mit Sephadex G-15 (medium). Möglich ist es, ein anderes Molekularsieb mit analogen Kennwerten zu verwenden. Das Bluieren wird in destilliertem Wasser durchgeführt. Das die EiweiJBkomponenten enthaltende Material wird gesammelt und wieder lyophil getrocknet. Das trockene Pulver löst man in einer Pufferlö-

i
süng mit einem pH-Wert von 6,8 bis 8,2 und einer Ionenatärke von 0,1 bis 0,4 Mol,die NaCl oder KCl enthält., auf. Die Lösung unterwirft man einer Gelchromatographie auf einer Säule (2,5 x 100 cm) mit Sephadex G-50 (medium), die vorher mit der gleichen Pufferlösung ausgeglichen wurde. Als Träger für die Gelchromatographie in dieser Stufe können auch andere Molekularsiebe mit gleichen Kennwerten verwendet werden.

Eine optimale Trennung der biologisch wirksamen Peptide wird in einer Pufferlösung mit den genannten Kennwerten erreicht, Nach der Durchführung der Gelchromatographie entnimmt man ein Endprodukt von der Molekularmasse I.500 bis 6.000 Dalton. Gerade in diesem Intervall sind Peptide enthalten, die regulierende Wirkung auf das T-System des Organismus besitzen. Die Peptidlösung entsalzt man wiederum durch Gelchromatographie auf Säulen mit Sephadex G~15, lyophilisiert, löst in einer physiologischen Salzlösung auf und annulliert in einer Dosis von 100 bis 200 /ug/nrl.

Nachstehend werden Beispiele für die Herstellung des Präparates angeführt.

ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 1« 500 g frischgefrorenen Kalbthymus (minus 20⁰C) reinigt man von der Kapsel und homogenisiert in 0,614 molater NaCl Lösung (Volumen 16,5 Liter) bei einer Temperatur von plus 4⁰C. Das Homogenat wird 16 Stunden bei einer Temperatur von 4⁰C stehengelassen. Danach zentrifugiert man das Homogenat bei 20.000 g innerhalb von 2 Stunden. Das Präzipitat wird entfernt. Den Überstand in einer Menge von zirka l_f5 Litern durchwärmt man bei einer Temperatur von 80⁰C innerhalb von 15 Minuten auf Wasserbad. Dann kühlt man die Lösung ab und entfernt die denaturierten thermolabilen Komponenten durch Zentrifugieren bei 20.000 g innerhalb von 1 Stunde. Den Überstand (Volumen zirka l_f55 Liter) behandelt man mit 5fachem Volumen des auf eine Temperatur von minus 20⁰C abgekühlten Azetons innerhalb von 2 Tagen. Das ausgefallene Präzipitat trennt man von dem flüssigen Teil durch Dekantieren ab und trocknet im Vakuum. Das Präzipitat löst man in 100 ml 10 Jv molarer Natrium-Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 unter kontinuierlichem Rühren innerhalb 1 Stunde bei Zimmertemperatur auf. Den unlöslichen Teil entfernt man durch Zentrifugieren bei 16.000 g innerhalb von 40 Minuten und verdünnt den Überstand mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration deo Eiweißstoffes naoh der Biurot- -Methode von 25 mg/ml. Der erhaltenen Lösung gibt man 59,6 ml bei einer Temperatur von 4⁰C gesättigte Ammoniumsulfatlösung mit einem pH-Wert von 7,0 zu. Das Gemisch wird innerhalb von 1 Stunde bei einer Temperatur von 4°C gerührt. Den unlöslichen Teil entfernt man durch Zentrifugieren bei 16.000 g. Den Überstand säuert man mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4,0 ε·η, gibt 24,82 g Amiuoniumsulfat zu und rührt innerhalb

q η / η ο L/-T¹J

einer Stunde bei einer Temperatur von 4⁰C. Das gebildete Präzipitat sammelt man durch. Zentrifugieren, löst in 80 ml 10 ^molarer Tris-HCl -Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 auf und präzipitiert erneut durch Zugabe von 80 ml bei einer Temperatur von 4⁰C gesättigter Ammoniumsulfat lösung bei einem pH-Wert von 5,0. Das Präzipitat sammelt man wiederum durch Zentrifugieren, löst in 10 !{.molarer Tris-HCl- -Pufferlösung mit einem, pH-Wert von 8,0 auf und bringt die Konzentration des Eiweißstoffes, bestimmt nach der Biuret-

-Methode, mit der gleichen Pufferlösung auf 10 mg/ml. Die erhaltene Lösung unterwirft man einer Ultrafiltration durch eine Membrane Pellicon PSBD (Millipore) bei einer Temperatur yon 4⁰C und einem Stickstoffdruck von 3,5 bis 4 atm. Die Membrane wird mit drei Portionen zu je 150 ml der 10

v'

rer Tris-HCl-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,0 gewaschen. Das Volumen und die Konzentration des Eiweißstoffes für die Fraktion unter dem Filter und über dem Filter beträgt 510 ml, 0,7 mg/ml beziehungsweise 0,6 ml, 12 mg/ml· Beide Fraktionen wurden nach dem Entsalzen und Lyophilisieren auf biologische Aktivität in dem System der T-Rosettenbildung geprüft. Biologische Aktivität besitzt nur die Fraktion unter dem Filter, während die von dem Filter zurückgehaltene Fraktion unwirksam ist. Einen Teil der biologisch wirksamen Fraktion in einer Menge von JO mg löst wan in 2,0 m-KCl, bereitet auf der Tris-HCl~Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0, auf und führt Gelchromatographie auf einer Säule (Ix 100 cm) mit Sephadex G-50, ausgeglichen mit der gleichen Pufferlösung, durch. Man sammelt Peptide von der Molekularmasse 1.500 bis 6.000 Dalton, entsalzt auf einer

Säule mit Sephadex G-15 und lyophilisiert. Die minimale wirksame Dosis beträgt 1 bis 2 /ig je 35.10 Lymphozyten in Vitra. Die Ge g amt aus beute an Endprodukt beträgt 110 mg/kg Thymua. Die Aktivität nach dem Test zum Inhibieren der spontanen Rosettenbildung durch Azathioprin beträgt höchstens 1 Jug je 3.1O⁶ Lymphozyten.

Zur Bestimmung der Heterogenität des Thymuspräparates nach der Molekül ar mass β bringt man 10 mg Präparat in 1 ml

Pufferlösung (0,14 m - UaCl - 0,01 m-Tris-HCl) bei einem i
ρΉ-Wert von 8,0 auf eine Säule (Ix 100 cm) mit Sephadex G-50 (fine), ausgeglichen mit der gleichen Pufferlösung, auf. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 6,0 ml/St, die Zeitdauer der Sammlung der Fraktion 15 Minuten. In jeder Fraktion wird die Absorption bei 280 nm bestimmt. Die Komponenten des Präparates verteilt man in den Probiergläsern mit den laufenden Nummern 32 bis 50. Die Säule wird vorher mit einem Gemisch von St and art st off en mit bekannter Molekularmasse geeicht. Dadurch wird es möglich, in den genannten Probiergläsern die ,Anwesenheit der Komponenten von der Molekularmasse 1.500 bis 6,000 DaIton nachzuweisen.

Zur Bestimmung der Heterogenität des Präparates wird auch analytische Scheibenelektrophorese in 15%igem Polyakrylamidgel bei einem pH-Wert von 8,9 auf einem Apparat der Firma fieanal (Ungarn) durchgeführt· Auf jede Höhre des Gels bringt man 400 bis 600 /Ug Präparat in 0,02 bis 0,0? ml Elektrodenpuffer auf. Die Elektrophorese wird bei einer Temperatur von plus 5⁰C bis plus 7⁰C und einer Stromstärke von mA je Röhre in den darauffolgenden 1 bis 1,5 Stunden durchgeführt. Die Wanderungsfront der Ionen wird mit

- 57 -

phenolblau markiert. Nach, der Beendigung der Elektrophorese nimmt man daa Gel aus den Röhren heraus, fixiert es und färbt mit O,l%iger Lösung von Amid schwär ζ 1OB in 7%iger Essigsäure innerhalb von 40 Minuten, wäscht danach den Farbstoff mit 7%iger Essigsäure. Man erhält 7 Banden, denen 7 Komponenten des Präparates entsprechen, deren elektrophoretisch« Wanderung nach, der folgenden Formel bestimmt wird:

elektrophor. Wanderung -

¹bphb/l

Worin 1 ₌ Länge des Gels vor dem Färben, 1 = Länge des Gel3 nach dem Färben, 1. a von der Eiweißstoffbande zurückgelegten Weg, l_fa ^b = von dem Bromphenolblau zurückgelegter Weg.

Die Ergebnisse sind in tabelle 9 angeführt. Tabelle 9.

Nr. der Bande, von der ; 1 2 5 4 5 6 7

Katode gerechnet

^Kelektrophor. Wanderung 0,082 0,169 0,564 0,402 0,452 O,5L5 0,89

Zur Bestimmung der isoelektrischen Punkte der Komponenten des Thymuspräparates wird isoelektrische Fockussierung in dünner Schient von Polyakrylamidgel in einem pH-Bereich von 5»5 bis 10 auf einem Gerät "Multiphor" durchgeführt» Nach beendeter Fockussierung fixiert man das Gel in Trichloressigsäure, 25%igem Isopropanol innerhalb von 16 Stunden, färbt mit 0,05%igem Kumassiblau R-250 in 10%iger Essigsäure, 25%igem Isopropanol über Nacht, behandelt dann mit 10%iger Essigsäure. Den pH-Wert bestimmt man nach der Lage der Eiweißmarkor mit bekanntem isoelektriochem Punkt. Dar

Thymuspräparat wird in 13 Bändern mit folgenden isoelektrieohen Punkten fixiert: 4,0; 4,3; 4,6; 4,7; 4,8; 5,0; 5,2; 5,5; 6,1}· 6,3; 6,7; 7,4; 9,0. ......

Der Polypeptide enthaltende Thymuapräparat weist bei der Spektralanalyse im Ultraviolettlioht zwei Absorptionsmaxima auf, und zwar bei 203 und 275 nm.

Beispiel 2. Der Prozeß wird analog zu Beispiel 1 mit einer Ausnahme durchgeführt, daß das Homogenat 12 Stunden lang bei einer Temperatur von 2⁰C stehengelassen und die Säule mit Sephadex G-50 mit 0,14 Mol - NaCl in 0,5 molarer Tris-HCl-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,2 ausgeglichen wird.

Die Ausbeute an Endprodukt beträgt 118 mg/kg Thymus. Die Aktivität im Test zum Inhibieren der spontanen Rosettenbildung durch Azathioprin beträgt höchstens 1 «g ja 3.10 Erythrozyten* . ■" ·

■Beispiel 3. Der Prozeß wird analog zu Beispiel 1 mit einer Ausnahme durchgeführt, daß das erste . Aussalzen in einer 20%igen Lösung, bezogen auf die Absättigung des Ammoniums ulfats, bei einem pH-Wert von 6,9, das zweite Aussalzen in einer 40%igen Lösung, bezogen auf die Absättigung des Ammoniums ulf at s, bei einem pH-Wert von 3,9, das dritte Aussalzen in einer 45%igen Lösung, bezogen auf die Abaättigung des Amiuoniumsulfats, bei einem pH-Wert von 4,5 vorgenommen und die Säule mit Sephadex G-50 mit 0,14m-NaCl in 0,01 molarer Tris-HCl-Lösung bei einem pH-Wert von 7>2 ausgeglichen wird.

Die Ausbaute an Endprodukt beträgt 118 mg/kg Thymus. Die Aktivität im Test zum Inhibieren der spontanen Rosetten-

bildung durch Azathioprln beträgt höchatQns 1 ug je 5.10° Erythrozyten.

Claims

P/fi&/t P-

on/ ο/ 07 sj ο ^Li- u A· Z /

DAS T-SXSTM DER IMMUNITÄT IiEGULIERMDES .PRÄPARAT UND VEKFAHBESI ZU SSlIiSR HERSTELLUNG PATENTANSPRÜCHE:

1. Das T-System der Immunität regulierendas Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkatoff Peptide von der Molekularmasaa I.5OO bis 6.000 DaIton, die ein Adsorptionsmaxinium im Ultuaviolettlicht bei 208 und 275 am und eine elektrophoretisch^ Wanderung im. Polyakrylemidgel ges⁶^'³®^ ü^Qm- Bromphenolbiäu von 0,062 bis 0,102; 0,156 bis 0,236; 0,354 bis 0,37*; 0,382 bia 0,422; 0,432 bis 0,472; 0,485 bis 0,545j 0,850 bis 0,930 aufweisen, und ein pharmazeutisches Vehikel für den Wirkstoff ent hält.

2. Präparat nach Ansprach 1, dadurch go-

k ο η η κ β i ohnet, daß das Vehikel in die sea eine phy siologische Lösung ist.

3- Präparat" nach Anspruch 2, d< 0. durch gekGn Zu lehnet, daß die physiologloche Lösung 0,14 molare) NaCl ist.

■ '· j u 4 υ

4. Präparat nach Anspruch 1, dadurch geke nnze iohnet, daß der Gehalt an Wirkstoff für Injektionen 100 bia 200 üg/ml beträgt. .

5. Verfahren zur Herstellung eines das Τ-System der Immunität regulierenden Präparates, welches

1) Homogenisierung des Thymusdrüsegewebes in NaCl

2) Eatfernung aus dem Homogenat des Präzipitatea

3) Entfernung aus der Lösung thermolabiler Biweiß-

stoffe

4) Präzipitation aus der Lösung von Eiweißstoffen und Peptiden

5) Auflösung der präzipitierten Eiweißstoffe und Peptide

G) Aussalzung der Peptide

7) Auflösung des Peptidpräzipitates

8) Entsalzung der abgetrennten Peptide und ihre Lyophilisierung vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß man

9) nach der Stufe (1) das Homogenat innerhalb vö£tl2 bis 16 Stunden bei einer Temperatur von 2 bis 6⁰C hält,

10,6) das Aussalzen der Peptide in drei Stufen, und zwar die erste in 20 bis 30%iger Lösung, bezogen auf die Absattigung des Ammoniumsulfates, bei einem pH-Wert von 6,9 bis 7,1; die zweite in 40 bis 45%iger Lösung, bezogen auf die Absattigung des Ammoniumsulfates, bei einem pH-Wert von 5,9 bis 4,1 und die dritte in 45 bis 55%iger Lösung, bezogen auf die Absättigung des Amuioniumsulfates, bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,0 durchfülirt,

11) die Lösung dei» Peptide nach der Stufe (7) einer

ORIGINAL INSPECTED

Ultrafiltration duxoh a ine Membrane mit einer Rückhalteranngrenze für Globularolweißatoffe von 12000 bia 20 000 Galton unterwirft und das erhaltene

12) ültrafiltrat chromatographiert unter Abtrennung der Paptide von der Molekül ar masse 1 500 bia 6 000 DaI-ton in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,8 bis 8,2 und einer Ionenstärke von 0,1 bis 0,4 Mol und nach der Stufe (8)

• 13) die Peptide mit einem pharmazeutischen Vehikel vermischt·

6. Verfahren nach Anspruch 5f dadurch gekennzeichnet, daß das Homogenat in der Stufe(9) bei einem Verhältnis des festen und flüssigen Teila von 1:35 stehengelassen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, da durch gekennze lohnet, daß das Aussalzen der Peptide in der Stufe (10) bei einer Konzentration derselben von 15 bis 25 mg/ml durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5»dadurch gekennzeichnet, daß die GelChromatographie der Peptide in der Stufe (12) in einer Pufferlösung durchgeführt wird, die KCl oder NaCl enthält.

OP'GINAI.