DE69737065T2

DE69737065T2 - Insulin c-peptide

Info

Publication number: DE69737065T2
Application number: DE69737065T
Authority: DE
Inventors: John Wahren; Bo-Lennart Johansson; Hans Jörnvall
Original assignee: Creative Peptides Sweden AB
Current assignee: Creative Peptides Sweden AB
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2017-09-27
Also published as: HUP0000432A2; US6610649B2; SE9603533D0; IL129143A0; BG103362A; NO991483L; DK0938503T3; IS5008A; SK39499A3; CA2266416C; CA2266416A1; JP2001500893A; US20020107175A1; HUP0000432A3; EP0938503A1; SE9603533L; DE69737065D1; ES2278394T3; PL332494A1; KR20000048643A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fragmente des Insulin-C-Peptids und ihre Verwendung bei der Behandlung von Diabetes und diabetischen Komplikationen.
Patienten mit insulinabhängigem Diabetes mellitus (IDDM), grundsätzlich synonym mit Typ-1-Diabetes, können ohne Insulintherapie nicht überleben. Die IDDM ist die klassische, lebensbedrohliche Form des Diabetes, deren Behandlung durch die Entdeckung von Insulin 1922 revolutioniert wurde. Die Prävalenz von IDDM in Europa, Nordamerika und Japan beträgt 0,25–0,4 % der Bevölkerung. Es gibt eine jahreszeitlich abhängige Variation im Auftreten von IDDM, wobei mehr Patienten in den Herbst- und Wintermonaten erscheinen. Die Erkrankung betrifft einen geringfügigen Überschuss von Männern, aber dieser Unterschied wird mit zunehmendem Alter weniger deutlich.
Die klassischen Symptome von IDDM in seiner akuten Phase sind Durst, große Urinvolumina, Müdigkeit und Gewichtsverlust. Seltene und untergeordnete Symptome sind Muskelkrämpfe, Hautinfektionen und verschwommene Sicht. Übelkeit und Erbrechen können in fortgeschrittenen Stadien auftreten und deuten auf bevorstehende Ketoazidose und Koma hin. Die Dauer der Symptome ist kurz, üblicherweise 2–3 Wochen oder weniger. Die Patienten erscheinen mit hohen Konzentrationen an Glukose und Ketonkörpern in Blut und Urin, während die Insulinspiegel gering oder nicht detektierbar sind.
Die Ätiologie von IDDM ist multifaktoriell, aber umfasst mit größter Wahrscheinlichkeit eine genetische Prädisposition für Autoimmunreaktivität zusammen mit einem Auslöser in der Umwelt, möglicherweise über eine Virusinfektion, was zu teilweiser oder vollständiger Zerstörung der pankreatischen Betazellen führt. Die Zerstörung der Betazellen kann während der letzten 6–12 Monate vor dem Eintreten der Zerstörung in Gang gewesen sein. Somit ist in der akuten Phase des IDDM der Insulinmangel das vorherrschende pathophysiologische Merkmal.
Nach dem Beginn der Insulinbehandlung profitieren viele Patienten von einer guten Kontrolle über die Blutglukose bei lediglich kleinen Insulindosen. Es gibt eine frühe Phase, die „Flitterwochenperiode", die von einigen Monaten bis zu einem Jahr andauern kann und wahrscheinlich eine teilweise Wiederherstellung der Betazellfunktion beruht. Dies ist jedoch ein vorübergehender Zustand, und schlussendlich führt die fortschreitende autoimmune Zerstörung der Betazellen zu einem zunehmenden Bedarf an exogenem Insulin.
Während die kurzfristigen Wirkungen der Hypoinsulinämie in der akuten Phase des IDDM durch Verabreichung von Insulin gut kontrolliert werden können, wird der langfristige natürliche Krankheitsverlauf von IDDM bei vielen Patienten durch das Auftreten potentiell ernsthafter Komplikationen überschattet. Hierzu gehören die spezifisch diabetischen Probleme der Neph ropathie, Retinopathie und Neuropathie. Diese Zustände werden häufig als mikrovaskuläre Komplikationen bezeichnet, obwohl mikrovaskuläre Veränderungen nicht die einzigen Ursachen sind. Es kann auch eine atherosklerotische Erkrankung der Großarterien, insbesondere der Herzkranzgefäße und der Arterien der unteren Extremitäten auftreten.
Eine Nephropathie entwickelt sich bei ungefähr 35 % der IDDM-Patienten, insbesondere bei männlichen Patienten und solchen mit einem Krankheitsausbruch in einem Alter von weniger als 15 Jahren. Die diabetische Nephropathie ist durch persistierende Albuminurie im Gefolge von glomerulären Kapillarschäden, eine fortschreitende Verringerung der glomerulären Filtrationsrate und schließlich terminales Nierenversagen gekennzeichnet.
Die Prävalenz der diabetischen Retinopathie ist am höchsten bei IDDM-Patienten mit Krankheitsausbruch in jungen Jahren, und sie nimmt mit der Dauer der Erkrankung zu. Eine proliferative Retinopathie ist im Allgemeinen bei ungefähr 25 % der Patienten nach 15 Jahren Dauer und in mehr als 50 % nach 20 Jahren anzutreffen. Die erste Läsion bei der diabetischen Retinopathie ist eine Verdickung der Kapillar-Basalmembran, dann treten Kapillardilatationen und Undichtigkeit und Bildung von Mikroaneurysmen ein. Anschließend führt eine Okklusion der Netzhautgefäße zu ungenügender Durchblutung von Teilen der Retina, Ödemen, Blutungen und zur Ausbildung neuer Gefäße ebenso wie zu fortschreitendem Verlust des Sehvermögens.
Zur diabetischen Neuropathie gehört eine große Vielfalt von Störungen der somatischen und autonomen Nervenfunktionen. Die sensorische Neuropathie kann zu fortschreitendem Verlust der Empfindung oder alternativ zu unangenehmen Empfindungen, oftmals Schmerzen, in Beinen oder Füßen, führen. Die motorische Neuropathie wird üblicherweise von Muskelschwund und Schwäche begleitet. Nervenbiopsien zeigen im Allgemeinen axonale Degeneration, Demyelinisierung und Abnormalitäten der Nervenblutgefäße. Neurophysiologische Untersuchungen zeigen verringerte Leitungsgeschwindigkeiten der motorischen und sensorischen Nerven. Die autonome Neuropathie betrifft ungefähr 40 % der Patienten mit IDDM von mehr als 15 Jahren Dauer. Sie kann sich über Mängel in der Thermoregulation, Impotenz und Blasendysfunktion gefolgt von kardiovaskulären Reflexabnormalitäten, entwickeln. Zu den späten Manifestationen können allgemeine Schweißstörungen, posturale Hypotension, Magen-/Darm-Probleme und verringerte Wahrnehmung einer Hypoglykämie gehören. Das letztgenannte Symptom hat schwerwiegende klinische Implikationen.
Im Hinblick auf an der Pathogenese der verschiedenen diabetischen Komplikationen beteiligte mögliche Mechanismen wurden mehrere Theorien vorgeschlagen (1). Metabolische Faktoren können von Bedeutung sein, und jüngere Studien zeigen, dass eine gute metabolische Kontrolle mit erheblich verringertem Auftreten von Komplikationen aller Arten einhergeht (2). Dennoch zeigen nach 7–10 Jahren guter metabolischer Kontrolle nicht weniger als 15–25 % der Pati enten Anzeichen einer beginnenden Nephropathie, 10–25 % haben retinopathische Symptome und 15–20 % zeigen eine verringerte Nervenleitungsgeschwindigkeit, die auf Neuropathie hindeutet. Mit längerer Krankheitsdauer steigt die Häufigkeit der Komplikationen weiter an.
Das C-Peptid ist ein Teil des Proinsulinmaleküls, das seinerseits ein Vorläufer des Insulins ist, das in den Betazellen des Pankreas gebildet wird. Das menschliche C-Peptid ist ein Peptid von 31 Aminosäuren mit der folgenden Sequenz:
EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ (SEQ ID NO. 1). In der EP 132 769 wurde vorgeschlagen, dass das C-Peptid zur Behandlung von Diabetes verabreicht werden kann, und in der SE 460334, dass Insulin in Kombination mit dem C-Peptid zur Behandlung von Diabetes und zur Vorbeugung diabetischer Komplikationen verabreicht werden kann.
In den letzten Jahren wurde erkennbar, dass Diabetes vom Typ 1 mit einer durchgängig verringerten Aktivität des Enzyms Na⁺K⁺ATPase in mehreren Geweben einhergeht, insbesondere in den Nierenglomeruli, in der Retina, in den peripheren Nerven, im Herz und im Skelettmuskel (3, 4, 5). Die Na⁺K⁺ATPase ist ein Enzym, das in der Zellmembran lokalisiert ist und Energie für den transzellulären Transport von Na⁺ und K⁺ ebenso wie für alle co- oder antiportierten Substate in allen Säugerzellen erzeugt. Es ist daher offensichtlich, dass die Aktivität dieses Enyzms für die normale Zellfunktion von grundlegender Bedeutung ist. Mangelnde Na⁺K⁺ATPase-Aktivität in Nervengewebe, Glomeruli und Retina ist mit hoher Wahrscheinlichkeit ein wichtiger Faktor, der zur Pathogenese in der diabetischen Neuropathie, Nephropathie und Retinopathie beiträgt. Die Aktivität der Na⁺K⁺ATPase wird über die Na⁺-Konzentration und über Hormonwirkung reguliert; verschiedene Hormone stimulieren (Schilddrüsenhormon, Noradrenalin, Angiotensin, Neuropeptid Y, Insulin) oder inhibieren (Dopamin, ANF) die Enzymaktivität (6). Trotz einer zur Erreichung einer guten glykämischen Kontrolle ausreichenden Insulinbehandlung zeigen Patienten mit Typ-1-Diabetes langfristig Zeichen einer ungenügenden Na⁺K⁺ATPase-Aktivität.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung einer Gruppe von Peptiden aus dem Mittelteil und dem C-terminalen Teil des C-Peptid-Moleküls, die durch eine bemerkenswerte Fähigkeit gekennzeichnet sind, die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität zu stimulieren. Alle diese Peptide sind kleine Fragmente des C-Peptid-Moleküls. Das C-Peptid selber ist imstande, die Na⁺K⁺ATPase über die Aktivierung eines G-Proteins, Steigerung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration und Aktivierung der Proteinphosphatase 2B zu steigern (7). Jedoch ist der stimulatorische Effekt der kleineren Peptide auf die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität der des C-Peptides selber ähnlich oder größer. Sowohl in vitro als auch in vivo liegen Beweise vor, die zeigen, dass bei der Verabreichung eines dieser Peptide zusammen mit regulärer Insulinbehandlung sich die Nierenfunktion bessert, frühe Anzeichen der Retinopathie sich zurückentwickeln und die Funktion der somatischen und autonomen Nerven sich verbessert. Eine Behandlung mit diesen spezifischen Peptiden, gegebenenfalls in Kombination mit herkömmlicher Insulintherapie, ist daher zur Vorbeugung oder wesentlichen Verzögerung der Entwicklung später diabetischer Komplikationen verwendbar. Ein potentieller Vorteil, den die kleinen Peptide gegenüber dem C-Peptid besitzen, ist, dass sie oral verabreicht werden können, anstatt durch Injektion wie im Fall von C-Peptid und Insulin.
Ein Aspekt der vorliegende Erfindung betrifft somit ein Peptid, das ein Fragment des Humaninsulin-C-Peptids ist, wobei dieses Peptid die Sequenz ELGGGPGAG (SEQ ID NO. 2) (nachfolgend „Peptid A") oder ein Fragment davon, oder die Sequenz EGSLQ (SEQ ID NO. 3) (nachfolgend „Peptid E") oder ein Fragment davon umfasst und die Fähigkeit hat, die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität zu stimulieren.
In einer besonderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Sequenz ELGGGPGAG (SEQ ID NO. 2) oder EGSLQ (SEQ ID NO. 3) oder ein Fragment davon bereit.
Die Erfindung stellt insbesondere solche Peptide zur Verwendung in der Therapie und insbesondere zur Verwendung bei der Bekämpfung von Diabetes und diabetischen Komplikationen bereit.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Mittel, das ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein Fragment davon, wie zuvor definiert, zusammen mit mindestens einem pharmazeutischen akzeptablen Träger oder Hilfsstoff umfasst.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids oder eines Fragmentes davon, wie oben definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung von Diabetes oder diabetischen Komplikationen.
Der Begriff „Bekämpfung" wird hier sowohl für die Behandlung als auch für die Vorbeugung verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung der folgenden Peptide, die alle Fragmente des C-Peptids sind: Peptid A (Aminosäurensequenz ELGGGPGAG) (SEQ ID NO. 2) oder Teile davon, z. B. Peptid B (ELGG) (SEQ ID NO. 4), Peptid C (ELGGGP) (SEQ ID NO. 5) oder Peptid D (GGPGA) (SEQ ID NO. 6). Überdies schließt die Erfindung das Peptid E (EGSLQ) (SEQ ID NO. 3) und Teile davon, z. B. Peptid F (GSLQ) (SEQ ID No. 7) ein. Alle dienen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Typ-1-Diabetes.
Für die erfindungsgemäßen Fragmente wurde gezeigt, dass sie die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität in unterschiedlichem Ausmaß stimulieren. Somit zeigen Studien, an denen Nierentubuluszellen unter in vitro-Bedingungen beteiligt sind, dass die Peptide A–D die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität in einem Ausmaß stimulieren, das vergleichbar mit dem des ganzen C-Peptid-Moleküls ist. Innerhalb von 3 Minuten werden bis zu 90 % der Wirkung erreicht. Überdies besitzen die Peptide E und F eine stimulatorische Wirkung auf die Na⁺K⁺ATPase der Nierenzellen, die mit der des gesamten Moleküls gleich oder größer ist. Kombinationen von Peptiden A–D mit den Peptiden E oder F führen zu einer Stimulation der Enzymaktivität, die größer ist als die für jedes einzelne Peptid alleine. Für detaillierte Beispiele der stimulatorischen Wirkung der oben genannten Peptide siehe Beispiel 1 unten.
Das C-Peptid zeigt eine spezifische Bindung an die Oberfläche verschiedener Zelltypen, insbesondere Nierentubuluszellen und Fibroblasten. Wenn fluoreszenzmarkiertes C-Peptid mit den Zellen inkubiert wird, bindet es an die Zelloberfläche. Die Spezifität der Bindung wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass eine Vorinkubation mit unmarkiertem C-Peptid die Bindung des fluoreszenzmarkierten C-Peptids verhindert. Wenn die Vorinkubation mit den erfindungsgemäßen Fragmenten, insbesondere mit Fragment E oder F, erfolgte, wurde gefunden, dass die Fragmente die Bindung des fluoreszenzmarkierten C-Peptids verhindern, was zeigt, dass die Fragmente spezifisch an die gleichen Bindungsstellen auf der Zelloberfläche binden wie das C-Peptid selber. Für eine detaillierte Beschreibung der Bindung des Fragments E siehe Beispiel 28 unten.
Wie oben beschrieben, umfasst der Schutzbereich der Erfindung Peptide, die nicht nur die Sequenzen der Peptide A und E, sondern auch die ihrer Fragmente umfassen. Im Fall des Nonapeptids A können solche Fragmente von 8 bis 2 Aminosäuren lang sein. Im Fall des Pentapeptids E können solche Fragmente von 4 bis 2 Aminosäuren lang sein. Die exemplarischen Fragmente B, C und D (für Peptid A) und F (für Peptid E) sind oben aufgeführt, aber auch andere Fragmente werden erfasst.
Im Fall des Peptids A haben gewisse Untersuchungen an der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität betreffend die Fähigkeit der Peptidfragmente, die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität von Ratten-Nierentubulussegmenten zu stimulieren, gezeigt, dass einer oder mehrere der zentralen drei Glyzinreste von Bedeutung sein können, und somit umfassen bevorzugte Peptidfragmente, soweit es das Peptid A betrifft, mindestens einen und vorzugsweise mindestens zwei der zentralen drei Glyzinreste. Somit gehören zu repräsentativen beispielhaften Peptidfragmenten zusätzlich zu den oben erwähnten Peptiden B, C und D auch GGGPGAG (SEQ ID NO. 8), GGGPG (SEQ ID NO. 9), GGGP (SEQ ID NO. 10), GGP und GGPG (SEQ ID NO. 11).
Weiterhin wurde gefunden, dass Peptide, die unnatürliche D-Aminsosäuren-Isomere enthalten, ebenfalls aktiv sein können, darunter z. B. das Dipeptid D-LG oder D, L-LG. Somit umfasst der Schutzbereich der Erfindung „nicht-native" Isomere der „nativen" L-Aminosäuren-C-Peptidsequenzen. Soweit es das Peptid A betrifft, wird angenommen, dass die Gegenwart von mindes tens einem (beim D-Peptid) oder zwei (beim L-Peptid) der zentralen drei Glyzinreste in einem Peptidsegment von 9 Aminosäuren oder weniger von Bedeutung sein kann.
Im Fall des Peptids E gehören zu den exemplarischen repräsentativen Fragmenten nicht nur das Tetrapeptid, Peptid F, sondern auch SLQ und LQ. Es wird angenommen, dass der C-terminale Q-Rest von Bedeutung ist. Nicht-native Isomere oder Derivate der Peptide, z. B. D-Aminosäuren enthaltende Peptide, werden ebenfalls vom Schutzbereich der Erfindung abgedeckt.
Die Erfindung schließt Peptide ein, die die Sequenzen der Peptide A und E enthalten. Somit werden vom Schutzbereich der Erfindung auch Peptide erfasst, die N- und/oder C-terminale Erweiterungen oder flankierende Sequenzen gegenüber den Sequenzen der Peptide A und C besitzen. Solche Peptide können zusätzlich Aminosäuren enthalten, die entweder diejenigen sind, die in der entsprechenden Position im nativen menschlichen Insulin-C-Peptid bereitgestellt werden, oder andere Aminosäuren (ausgenommen natürlich die Möglichkeit der Wiederherstellung des gesamten Insulin-C-Peptids). Die Länge solcher „erweiterten" Peptide Kann unterschiedlich sein, aber vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Peptide nicht länger als 25 oder 20 Aminosäuren, und besonders bevorzugt nicht mehr als 15 oder 10 Aminosäuren. Zu den exemplarischen Peptiden gehören Octa-, Hepta- und Hexapeptide, die die Sequenz des Peptids E enthalten, z. B. LALEGSLQ (SEQ ID No. 12), ALEGSLQ (SEQ ID NO. 13) und LEGSLQ (SEQ ID NO. 14).
Die erfindungsgemäßen Peptide können zur Behandlung von Diabetes und diabetischen Komplikationen verwendet werden, insbesondere von Typ-1-Diabetes und seinen Komplikationen. Der Begriff „diabetische Komplikationen" wird hierin verwendet, um alle Komplikationen einzuschließen, die aus dem Stand der Technik als mit verschiedenen Formen von Diabetes assoziiert bekannt sind. Ohne Beschränkung auf die Theorie wird angenommen, dass die Verwendbarkeit der Peptide, wie oben dargelegt, mit ihrer Fähigkeit verknüpft ist, die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität zu stimulieren. Somit schließt ein weiterer Aspekt der Erfindung die Peptide zur Verwendung bei sowie ihre Verwendung bei der Herstellung von Medikamenten zur Verwendung bei der Stimulation der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität bei einem Patienten ein.
Die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität kann unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten und in der Literatur beschriebenen Techniken ohne weiteres gemessen werden, und somit kann die Wirkung der Peptide bei der Stimulation der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität ohne weiteres bestimmt werden (siehe z. B. Referenz 7).
Somit können die Peptids zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulation der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität, zur Behandlung von Typ-1-Diabetes-Patienten mit Retinopathie, zur Behandlung von Typ-1-Diabetes-Patienten mit Nephropathie, zur Behandlung von Typ-1-Diabetes-Patienten mit Neuropathie und zur Verzögerung der Entwicklung später diabetischer Komplikationen verwendet werden. Das Medikament kann Insulin enthalten. Die Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Behandlung oder Prävention der oben genannten Indikationen.
Die erfindungsgemäßen Peptide können einzeln oder in Kombination verwendet werden, und somit kann eine pharmazeutische Zubereitung oder ein Medikament hergestellt werden, enthaltend eines oder mehrere der Peptide. Wie oben erwähnt, wurde zwischen dem Peptid A oder auf dem Peptid A basierenden oder von dem Peptid A abgeleiteten Peptiden (der „Peptid-A-Gruppe") und dem Peptid E oder darauf basierenden oder von dem Peptid E abgeleiteten Peptiden (der „Peptid-E-Gruppe") ein Synergismus beobachtet. Somit stellen synergistische Kombinationen eines Peptids aus der Peptid-A-Gruppe mit einem Peptid aus der Peptid-E-Gruppe eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Die Peptide können auch in Kombination oder Verbindung mit anderen Mitteln verwendet werden, die zur Behandlung von Diabetes und/oder seinen Komplikationen aktiv oder wirksam sind. Zu solchen anderen aktiven Mitteln gehört z. B. Insulin. In solchen „Kombinations"-Therapien können die Peptide und das zweite aktive Mittel zusammen in der gleichen Zusammensetzung oder getrennt in verschiedenen Zusammensetzungen, gleichzeitig oder sequentiell verabreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Produkt, das ein erfindungsgemäßes Peptid oder ein Fragment davon, wie zuvor definiert, zusammen mit einem weiteren aktiven Mittel, das wirksam ist bei der Bekämpfung von Diabetes oder diabetischen Komplikationen, enthält, als Kombinationspräparat für die gleichzeitige, separate oder sequentielle Verwendung bei der Bekämpfung von Diabetes und/oder diabetischen Komplikationen. Vorzugsweise ist ein solches weiteres aktives Mittel Insulin.
In solchen Kombinationstherapien versteht es sich, dass, wenn Insulin verwendet wird, der Ausdruck „Insulin" alle Formen, Typen und Derivate von Insulin einschließt, die für die Therapie verwendet werden können, z. B. synthetische, modifizierte oder verkürzte Varianten der aktiven menschlichen Insulinsequenz.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können oral oder parenteral auf subkutanem, intramuskulärem oder intravenösem Weg verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen aktive Fragmente/Peptide des C-Peptid-Moleküls (z. B. die Peptide A–F), zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür und gegebenenfalls anderen therapeutischen Inhaltsstoffen, z. B. Humaninsulin. Die Gesamtmenge aktiver Inhaltsstoffe in der Zusammensetzung variiert von 99,99 bis 0,01 Gew.-%. Der Träger muss in diesem Sinne akzeptabel sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung kompatibel ist und auf den Empfänger nicht schädlich wirkt.
Die Zusammensetzungen können gemäß Techniken und Verfahren formuliert werden, die aus dem Stand der Technik wohlbekannt und in der Literatur eingehend beschrieben sind, und sie können beliebige der bekannten Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe enthalten. Somit enthalten z. B. erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die sich zur parenteralen Verabreichung eignen, zweckmäßigerweise sterile wässrige Lösungen und/oder Suspensionen der pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoffe (z. B. Peptide A–F), vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des Rezipienten eingestellt, allgemein unter Verwendung von Natriumchlorid, Glyzerin, Glukose, Mannitol, Sorbitol und dergleichen. Weiterhin können die Zusammensetzungen beliebige aus einer Reihe von Adjuvantien, wie z. B. Puffern, Konservierungsmitteln, Dispergierungsmitteln, Mitteln, die das rasche Eintreten der Wirkung oder eine verlängerte Dauer der Wirkung bewirken und dergleichen, enthalten.
Zur oralen Verabreichung geeignete erfindungsgemäße Zusammensetzungen können z. B. aktive Fragmente/Peptide des C-Peptid-Moleküls (z. B. Peptide A–F) in steriler gereinigter Stammpulverform enthalten, vorzugsweise von einer Hülle oder Hüllen (Enterokapseln) bedeckt, die vor Abbau (Decarboxylierung oder Hydrolyse) der aktiven Peptide im Magen schützen und dadurch die Absorption dieser Substanzen aus dem Zahnfleisch oder im Dünndarm ermöglichen. Die Hüllen können beliebige aus einer Reihe von Adjuvantien, wie z. B. Puffern, Konservierungsmitteln, Mitteln, die eine verlängerte oder schnelle Freisetzung bewirken, was eine optimale Bioverfügbarkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ergibt, und dergleichen, enthalten.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nicht-Peptid-Verbindungen mit den gleichen stimulatorischen Wirkungen, wie von ihren C-Peptid-abgeleiteten Gegenstücken gezeigt. Solche Peptidomimetika oder „kleinen Moleküle", die imstande sind, die Aktivität der natürlich vorkommenden Proteine oder Peptide zu imitieren, sind aufgrund ihrer erhöhten chemischen Stabilität für z. B. orale Verabreichung wahrscheinlich besser geeignet (8, 9).
Es ist jetzt aus dem Stand der Technik allgemein bekannt, Peptide oder Protein-basierte aktive Inhaltsstoffe, z. B. therapeutische Peptide, durch solche Peptidomimetika zu ersetzen, die eine funktional gleichwertige Aktivität haben. Verschiedene molekulare Bibliotheken und kombinatorische Chemietechniken existieren und sind verfügbar, um die Identifikation, Auswahl und/oder Synthese solcher Verbindungen unter Verwendung von Standardtechniken zu erleichtern (10). Solche Standardtechniken können verwendet werden, um die erfindungsgemäßen peptidomimetischen Verbindungen zu erhalten, nämlich peptidomimetische organische Verbindungen, die eine im wesentlichen ähnliche oder gleiche Aktivierung der Na⁺K⁺ATPase und/oder zellulären Bindungscharakteristika wie die erfindungsgemäßen Peptide zeigen, z. B. wie hier in den Beispielen beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt somit eine biomimetische organische Verbindung bereit, die auf den erfindungsgemäßen Peptiden basiert, dadurch gekennzeichnet, dass diese Verbindung eine Aktivierung der Na⁺K⁺ATPase und/oder zellulären Bindungsmerkmale an den Nierentubuluszellen und Fibroblasten in mindestens dem Ausmaß zeigt, das von den erfindungsgemäßen Peptiden und Peptidfragmenten, wie zuvor definiert, gezeigt wird.
Die Erfindung wird jetzt detaillierter anhand der folgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben, die u. a. die stimulatorische Wirkung spezifischer Peptide auf die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität und die Zellbindung zeigen, wobei Bezug auf die Zeichnung genommen wird, wobei:
1 ein Chromatogramm aus einer präparativen Reversphasenreinigung eines menschlichen C-Peptids, markiert mit Tetramethylrhodamin, zeigt. Die Säule wurde mit einem 20–40 % Acetonitrilgradienten (Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) über 20 Minuten) eluiert. Peak A entspricht einer unveränderten Fraktion des C-Peptids. Die Peaks B und C entsprechen mit Tetramethylrhodamin markierten C-Peptiden. Die Trennung der B- und C-Peaks entspricht der Gegenwart von zwei Tetramethylrhodaminisomeren in dem aktivierten Reagens. Für die weiteren Studien wurde Material aus dem C-Peak verwendet. Die durchgezogene Linie entspricht der Absorption bei 220 nm (Peptid), und die gepunktete Linie entspricht der Absorption bei 555 nm (Tetramethylrhodamin).
Beispiel 1
Die stimulatorische Wirkung der Peptide A–F auf die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität in Nierentubuluszellen der Ratte wurde untersucht. Einzelne proximale Tubuluskonvolute wurden durch Mikrodissektion aus Rattennieren hergestellt. Die Tubuli wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem der Peptide A–F oder mit Ratten C-Peptid 1 inkubiert. Die Na⁺K⁺ATPase-Aktivität wurde dann gemessen, nachdem die Tubuli einem hypotonischen Schock ausgesetzt worden waren und 15 Minuten lang in einem ³²P-ATP enthaltenem Medium in Gegenwart oder Abwesenheit von Oubain inkubiert worden waren.
Die stimulatorische Aktivität von 5–10^–7 M Ratten C-Peptid 1 wurde als 100 % betrachtet. Für die gleiche Konzentration der Peptide A–F wurden die folgenden relativen Aktivitäten erhalten:
Peptid A 88 ± 3 Prozent
Peptid B 36 ± 2 Prozent
Peptid C 46 ± 3 Prozent
Peptid D 65 ± 4 Prozent
Peptid E 110 ± 3 Prozent
Peptid F 96 ± 2 Prozent
Peptide B + C 86 ± 3 Prozent
Beispiele besonderer erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen sind in den nachfolgenden Beispielen bereitgestellt.
Beispiel 2

Humaninsulin:Peptid A alleine oder in äquimolarem Gemisch mit den Peptiden B, C, D, E und F (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten M Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid A - 16,8 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml oder eine Kombination und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8, oder eine Kombination mit
Peptid A - 16,8 mg
Peptid B - 8,8 mg
Peptid C - 13,6 mg
Peptid D - 10 mg
Peptid E - 12,4 mg
Peptid F - 9,2 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 3

Humaninsulin:Peptid B (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid B - 8,8 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,7–7,8.
Beispiel 4

Humaninsulin:Peptid C (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid C - 13,6 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 5

Humaninsulin:Peptide D (1:5 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid D - 10,0 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 6

Humaninsulin:Peptid E (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid E - 12,4 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 7

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid E - 9,2 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 8

Humaninsulin:Peptid A alleine oder in äquimolarem Gemisch mit den Peptiden B, C, D, E und F (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten M Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid A - 4,2 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml oder eine Kombination und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8, oder eine Kombination mit
Peptid A - 4,2 mg
Peptid B - 2,2 mg
Peptid C - 3,4 mg
Peptid D - 2,5 mg
Peptid E - 3,1 mg
Peptid F - 2,3 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 9

Humaninsulin:Peptid B (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid B - 2,2 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 10

Humaninsulin:Peptid C (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid C - 3,4 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 11

Humaninsulin:Peptid D (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid D - 2,5 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 12

Humaninsulin:Peptid E (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid E - 3,1 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 13

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid E - 2,3 mg
m-Kresol - 25 mg
Glycerin - 160 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,0–7,8.
Beispiel 14

Zink-Humaninsulin:Peptid A allein oder in äquimolarem Gemisch mit den Fragmenten B, C, D, E und F (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid A - 16,8 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml oder eine Kombination und einen End-pH-Wert von 7,1 –7,4, oder eine Kombination mit
Peptid A - 16,8 mg
Peptid B - 8,8 mg
Peptid C - 13,6 mg
Peptid D - 10 mg
Peptid E - 12,4 mg
Peptid F - 9,2 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 15

Zink-Humaninsulin:Peptid B (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid B - 8,8 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 16

Zink-Humaninsulin:Peptid C (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) – 1000 Einheiten
Peptid C - 13,6 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 17

Zink-Humaninsulin:Peptid D (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid D - 10,0 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 18

Zink-Humaninsulin:Peptid E (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid E - 12,4 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 19

Zink-Humaninsulin:Peptid F (1:4 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid F - 9,2 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 20

Zink-Humaninsulin:Peptid A allein oder in äquimolarem Gemisch mit den Fragmenten B, C, D, E und F (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid A - 4,2 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml oder eine Kombination und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4, oder eine Kombination mit
Peptid A - 16,8 mg
Peptid B - 8,8 mg
Peptid C - 13,6 mg
Peptid D - 10 mg
Peptid E - 12,4 mg
Peptid F - 9,2 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 21

Zink-Humaninsulin:Peptid B (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid B - 2,2 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 22

Zink-Humaninsulin:Peptid C (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid C - 3,4 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1 – 7,4.
Beispiel 23

Zink-Humaninsulin:Peptid D (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid D - 2,5 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 24

Zink-Humaninsulin:Peptid E (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifikation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid E - 3,1 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 25

Zink-Humaninsulin:Peptid F (1:1 auf einer molaren Basis von 100 Einheiten (U) Insulin pro ml).

Zur Herstellung von 10 ml der Zusammensetzung werden gemischt:
Humaninsulin in amorpher Modifikation 300 Einheiten und in kristalliner Modifkation 700 Einheiten (28 Einheiten/mg) - 1000 Einheiten
Peptid F - 2,3 mg
Zink - 1,3 mg
Natriumchlorid - 70 mg
Natriumacetat - 16 mg
Methylparahydroxbenzoat - 10 mg
Wasser und entweder 10 % Salzsäure oder 10 % Natriumhydroxid, ausreichend für ein Volumen der Zusammensetzung von 10 ml und einen End-pH-Wert von 7,1–7,4.
Beispiel 26
Peptid A
Zur Herstellung von Sublingualtabletten von Enterokapseln, von denen jede eine mit 100 Einheiten Insulin äquimolare Menge der Zusammensetzung enthält, werden vermischt:
Peptid A - 0,42 mg
Laktose - 30 mg
et const q s
oder in Kombination von Peptid A:Peptid B:Peptid C:Peptid D:Peptid E:Peptid F:(1:1:11:1:1) auf einer molaren Basis.
Zur Herstellung von Sublingualtabletten von Enterokapseln, von denen jede eine mit 100 Einheiten Insulin äquimolare Menge der Zusammensetzung enthält, werden vermischt:
Peptid A - 0,42 mg
Peptid B - 0,22 mg
Peptid C - 0,32 mg
Peptid D - 0,25 mg
Peptid E - 0,31 mg
Peptid F - 0,23 mg
Laktose - 30 mg
et const q s
Beispiel 27
Peptid A
Zur Herstellung von Sublingualtabletten von Enterokapseln, von denen jede eine mit 100 Einheiten Insulin äquimolare Menge der Zusammensetzung enthält, werden vermischt:
Peptid A - 1,67 mg
Laktose - 30 mg
et const q s
oder in Kombination von Peptid A:Peptid B:Peptid C:Peptid D:Peptid E:Peptid F:(1:1:1 1:1:1) auf einer molaren Basis.
Zur Herstellung von Sublingualtabletten von Enterokapseln, von denen jede eine mit 400 Einheiten Insulin äquimolare Menge der Zusammensetzung enthält, werden vermischt:
Peptid A - 1,68 mg
Peptid B - 0,88 mg
Peptid C - 1,36 mg
Peptid D - 1,0 mg
Peptid E - 1,24 mg
Peptid F - 0,92 mg
Laktose - 30 mg
et const q s
Beispiel 28
Die spezifische Bindung von Peptid E an die Zelloberfläche wird wie folgt illustriert. Biosynthetisches humanes C-Peptid (Eli-Lilly, Inc., Indianapolis, USA) wurde unter Verwendung des aktivierten Reagens Tetramethylrhodaminsuccinimidylester (FluoReporter^® Protein labelling kit, Art. no. F-6163; Molecular Probes Europe BV, Leiden, Niederlande) mit Tetramethylrhodamin markiert. Die Kopplungsreaktion wurde bei pH 8,3 (0,1 M NaHCO₃-Puffer) mit einem fünffachen stöchiometrischen Überschuss eines aktivierten Reagens im Verhältnis zum C-Peptid durchgeführt. Die Tetramethylrhodamingruppe hat Absorptions- bzw. Emissionsmaxima bei 555 nm bzw. 580 nm und wird in den N-Terminus des C-Peptides eingebaut. Markierte C-Peptide wurden durch Gelfiltration auf einer NAP-5-Säule (Entsalzen gegen 50 mM Phosphatpuffer, 0,1 M NaCl pH 7,4) (Pharmacia Biotech Uppsala, Schweden) und nachfolgende präparative Reversphasenchromatographie (250 mm Kromasil C8-Säule, Durchmesser 4,6 mm, 7 μm Partikelgröße, 10 nm Porengröße, Eka-Nobel, Surte, Schweden) unter Verwendung eines 1090 Hewlett Packard HPLC-Chromatographiesystems (Grenoble, Frankreich) gereinigt (1). Das eluierte Material wurde sofort durch Zusatz von Ammoniak auf pH 8 eingestellt und anschließend lyophilisert.
Kultivierte menschliche Nierentubuluszellen (proximales Tubuluskonvolut, PCT) wurden mit den wie oben beschrieben synthetisierten rhodaminmarkierten C-Peptid inkubiert. Die Zellen wurden aus dem gesunden Teil einer aufgrund von Hypernephrom chirurgisch entfernten menschlichen Niere hergestellt. Die äußeren 150 μm der Nierenrinde wurden in einem Mikrotom entfernt und 15 Minuten lang bei 37 °C in einer Kollagenaselösung (0,05 %) inkubiert. Eine Gewebssuspension wurde zentrifugiert und zwei mal mit einer 0,01 % Lösung von Sojabohnen-Trypsininhibitor (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y., USA) gespült, und ein Konzentrat von PCT-Fragmenten und PCT-Zellen wurde auf Glasdeckgläschen ausplattiert. Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium [DMEM, 20 mmol/l 4-(2-hydroxethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 24 mmol/l NaHCO₃ 50,000 IU/l Penicillin und 50 mg/l Streptomycin, pH 7,4] mit 10 % fötalem Rinderserum (Gibco) in einem Inkubator mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. Nach 28 Stunden Kultur wurde das Medium auf DMEM mit 1 % fötalem Kälberserum umgestellt. Die Zellen wurden ungefähr 18–36 Stunden später untersucht.
Die Interaktion zwischen dem C-Peptid und der Zelloberfläche der Tubuluszellen wurde unter Verwendung von Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie aufgezeichnet (11). Unter Verwendung einer C-Peptid-Konzentration von 5 nM wurde gefunden, dass 92 % des Peptids innerhalb von 50 Minuten an die Zelloberfläche banden. Im Gegensatz hierzu betrug die C-Peptid-Bindung nach 50 Minuten nicht mehr als 12 %, wenn die Zellen mit 5 μM Peptid E vorinkubiert wurden. Wenn das C-Peptid 50 Minuten lang an die Zellen gebunden hatte und anschließend Peptid E zugesetzt wurde, führte dies gleichfalls zur Dislokation eines größeren Teils des C-Peptids von seiner Bindungsstelle innerhalb von 4 Stunden; nur 14 % verblieben gebunden. Ähnliche Bedingungen wurden für Peptid F behalten. Die Resultate zeigen, dass die Peptide – ähnlich wie das C-Peptid – an eine spezifische Bindungsstelle auf der Zelloberfläche binden.
Zitierter Stand der Technik

1. Biochemical Basis of Microvascular Disease, C.J. Mullarkey und M. Brownlee, S. 534–545, in Textbook of Diabetes, Band 2, J. Pickup and G. Williams (Hrsg.), Biackwell, Oxford 1991.
2. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus, DCCT Gruppe, N Engl J Med 1993; 329: 977–983.
3. K. Kjeldsen, H. Braendgaard, P. Sidenius, J., Stenfatt Larsen und A. Nergaard: Diabetes decreases Na⁺K⁺ pump concentration in skeletal muscles, heart ventricular muscle, and peripheral nerves of rat; Diabetes 1987; 36: 842–848.
4. L.C. MacGregor and F.M. Matschinsky: Experimental diabetes impairs the function of the retinal pigmented epithelium. Metab Clin Exp 1986; 35: Suppl. Bd. 1, 28–34.
5. D.A. Greene und S.A. Lattimer: Impaired rat sciatic nerve sodium potassium adenosine triphosphatase in acute streptozocin diabetes and its correction by dietary myo-inositol supplementation. J Clin Invest 1983; 72: 1058–1063.
6. T. Clausen und M.E. Everts: Regulation of the Na, K-pump in skeletal muscle. Kidney International 1989; 35: 1–13.
7. Y. Ohtomo, A. Aperia, B.L. Johansson und J, Wahren: C-peptide stimulates renal Na⁺K⁺ATPase activity in synergism with neuropeptide Y. Diabetologia 1996; 39: 199–205.
8. T. Clackson and J. Wells: In vitro selection from protein and peptide libraries. Trends in Biotechnology 1995, 12: 173–184.
9. H. Nakanishi, S. Ramurthy, A. Raktabutr, R. Shen und M. Eahn: Peptidomimetics of the immunoglobulin supergene family – a review. Gene 1993, 137: 51–56.
10. T. Kieber-Emons, R. Murali und M.I. Greene: Therapeutic peptides and peptidomimetics. Current Opinion in Biotechnology 1997, 8: 435–441.
11. R. Rigler: Journal of Biotechnology 1995, 41: 177–186.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend; (a) ein Peptidfragment des humanen Insulin-C-Peptids, wobei das Peptid die Sequenz ELGGGPGAG (SEQ ID NO.2) oder ein Fragment davon oder die Sequenz EGSLQ (SEQ ID NO.3) oder ein Fragment davon umfasst und die Befähigung zur Stimulierung der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität besitzt, oder (b) ein Peptid mit einer Länge von bis zu 10 Aminosäuren, umfassend die Sequenz ELGGGPGAG (SEQ ID NO.2) oder ein Peptid mit einer Länge von bis zu 15 Aminosäuren umfassend die Sequenz EGSLQ (SEQ ID NO.3), welches die Befähigung zur Stimulierung der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität besitzt, oder (c) ein Peptid umfassend die Sequenz ELGGGPGAG (SEQ ID NO.2) oder EGSLQ (SEQ ID NO.3) sowie eine oder zwei zusätzliche Aminosäuresequenzen, welche den N- und/oder C-Terminus der SEQ ID NOs. 2 oder 3 flankieren, mit der Maßgabe, dass jegliche der flankierenden Sequenzen für das humane Insulin-C-Peptid nicht nativ ist, und wobei das Peptid die Befähigung zur Stimulierung der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität aufweist, zusammen mit wenigstens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Peptid die Sequenz ELGGGPGAG (SEQ ID NO.2) oder EGSLQ (SEQ ID NO.3) aufweist, oder ein Fragment davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Fragment ausgewählt ist unter ELGG (SEQ ID NO.4) (Peptid B), ELGGGP (SEQ ID NO.5) (Peptid C), GGPGA (SEQ ID NO.6) (Peptid D) und GSLQ (SEQ ID NO.7) (Peptid F).
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Peptid die Sequenz LALEGSLQ (SEQ ID NO.12), ALEGSLQ (SEQ ID NO.13) oder LEGSLQ (SEQ ID NO.14) aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Peptid oder das Fragment eine Länge von 2 bis 25 Aminosäuren aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Peptid oder Fragment eine Länge von 2 bis 9 Aminosäuren aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welches außerdem wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil umfasst, der zur Bekämpfung von Diabetes oder diabetischen Komplikationen befähigt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das zusätzliche aktive Agens Insulin ist.
Peptid oder Fragment gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Therapie.
Peptid oder Fragment davon nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Diabetes und/oder diabetischen Komplikationen oder zur Stimulierung der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität.
Verwendung eines Peptids oder Fragments davon gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung von Diabetes und/oder diabetischen Komplikationen oder zur Stimulierung der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität.
Verwendung nach Anspruch 11, außerdem umfassend die Verwendung von Insulin.
Verwendung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei das Medikament zur Behandlung von Typ-I-Diabetes gegebenenfalls zusammen mit Nephropathie, Neuropathie oder Retinopathie oder zur Retardierung der Entwicklung später diabetischer Komplikationen verwendet wird.
Produkt enthaltend ein Peptid oder ein Fragment davon gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 6 zusammen mit wenigstens einem zusätzlichen aktiven Agens, welches zur Bekämpfung von Diabetes und/oder diabetischen Komplikationen geeignet ist, als Kombinationspräparat zur simultanen, getrennten oder sequenziellen Verwendung bei der Bekämpfung von Diabetes und/oder diabetischen Komplikationen.
Peptid ausgewählt unter ELGGGPGAG (SEQ ID NO.2), ELGG (SEQ ID NO.4) (Peptid B), ELGGGP (SEQ ID NO.5) (Peptid C), GGPGA (SEQ ID NO.6) (Peptid D), GGGPGAG (SEQ ID NO.8), GGGPG (SEQ ID NO.9), GGGP (SEQ ID NO.10) oder GGP, welches die Befähigung zur Stimulierung der Na⁺K⁺ATPase-Aktivität aufweist.