DE60214135T2

DE60214135T2 - Modifizierte derivate von cck-8

Info

Publication number: DE60214135T2
Application number: DE60214135T
Authority: DE
Inventors: Raymond Peter FLATT; Paul Finbarr O'HARTE
Original assignee: UUTech Ltd
Current assignee: UUTech Ltd
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2022-03-01
Also published as: ES2271218T3; WO2002070546A2; WO2002070546A3; US20040116657A1; AU2002238701B2; ATE337337T1; EP1363945A2; EP1363945B1; NZ528031A; GB0105069D0; DE60214135D1; US7402663B2; CA2439598A1; CA2439598C

Description

Die Erfindung betrifft die Regulierung der Nahrungsaufnahme und die Steuerung des Energiestoffwechsels. Sie ist insbesondere auf die Verwendung von Peptiden zur Unterdrückung der Nahrungsaufnahme und pharmazeutische Zubereitungen für die Behandlung von Fettsucht und Diabetes Typ II gerichtet.
Cholecystokinin (CCK) ist ein Neuropeptidhormon, das sich im Gehirn finden lässt, von Drüsenzellen des Darms ausgeschieden wird und ursprünglich aufgrund seines Vermögens zur Stimulierung der Gallenblasenkontraktion identifiziert wurde. CCK ist gegenwärtig dafür bekannt, dass es eine bedeutende Rolle bei vielen physiologischen Vorgängen, einschließlich der Regulation von Sättigungsgefühl, Darmbeweglichkeit, Magenleerung, Insulinsekretion, Bauchspeicheldrüsenenzymsekretion und Neurotransmission, spielt. CCK liegt in mehreren molekularen Formen mit einer Länge von 58, 39, 33, 22, 8 und 4 Aminosäuren im Kreislauf vor. CCK-33 war die erste Form, die aus Schweinedarm aufgereinigt wurde. Das C-terminale Octapeptid CCK-8 ist zwischen den Spezies gut erhalten und ist die kleinste Form, die das vollständige Spektrum der biologischen Aktivitäten behält. Eine Vielfalt von molekularen CCK-Formen wird nach der Aufnahme von Lebensmittelfett und -protein von endokrinen Schleimhaut-I-Zellen ausgeschieden, die sich hauptsächlich im Zwölffingerdarm und im proximalen Jejunum befinden. Nach seiner Abgabe übt CCK-8 seine biologische Wirkung in verschiedenen Targetgeweben im Körper auf eine neurokrine, parakrine oder endokrine Art und Weise aus. Diese Wirkungen werden von zwei großen Rezeptorsubpopulationen CCK_A, (peripherer Subtyp) und CCK_B (Gehirn-Subtyp), vermittelt. Spezifische Rezeptorantagonisten wie Proglumid haben unser Verständnis der Wirkung von CCK auf die Nahrungsaufnahme unterstützt.
Die Beteiligung des CCK an der Steuerung der Nahrungsaufnahme bei Nagetieren wurde in den frühen 1970er Jahren erkannt, und seitdem hat dieses Peptidhormon gezeigt, dass es die Nahrungsaufnahme beim Menschen und bei verschiedenen Tierspezies reduziert. Die Auslösung des Sättigungsgefühls ist ein gemeinsames Merkmal bei verschiedenen Spezies, wobei aber der Mechanismus, durch welchen dies erreicht wird, bisher noch schlecht verstanden ist. Es sind jedoch viele verschiedene Gewebe dafür bekannt, dass sie spezifische CCK-Rezeptoren besitzen, einschließlich des Vagusnervs, des Pylorussphinkters und des Gehirns, wobei alle an diesem Steuerungsmechanismus beteiligt sein können. Es ist vorgeschlagen worden, dass CCK Rezeptoren im Darm stimuliert, die den Vagusnerv aktivieren, der eine Botschaft an die Sättigungszentren im Hypothalamus schickt. In Unterstützung dieses Konzeptes ist festgestellt worden, dass Sättigungseffekte von CCK bei vagotomisierten Tieren ausgeschaltet sind. Weiterhin haben Studien an Nagetieren gezeigt, dass CCK ein potenteres Sättigungsvermögen hat, wenn es anstatt zentral auf intraperitonealem Weg verabreicht wird. Dabei wird angenommen, dass intraperitoneales CCK-8 lokal anstatt hormonell wirkt. Zusätzlich dazu ist bekannt, dass CCK-8 die Blut-Gehirn-Schranke nicht überwindet.
Dennoch legen andere Nachweise nahe, dass CCK einen bestimmten neuronalen Einfluss im Zentralnervensystem auf die Nahrungsaufnahme hat. Einige Untersuchungen an Hunden legen nahe, dass die zirkulierenden CCK-Spiegel zu niedrig waren, um Sättigungsgefühle auszulösen. Jedoch zeigten Studien an gegen CCK immunisierten Schweinen, dass diese Tiere ihre Nahrungsaufnahme erhöhten und eine beschleunigte Gewichtszunahme aufwiesen, verglichen mit Kontrolltieren. Zusätzlich erhöhten CCK-Rezeptor-Antagonisten die Nahrungsaufnahme bei Schweinen und senkten die Sättigung bei Menschen. Insgesamt zeigen diese Studien, dass CCK eine bedeutende Rolle bei der Regulierung der Nahrungsaufnahme in Säugetieren spielt.
CCK-8 wird als ein kurzzeitiges mit dem Essen verbundenes Sättigungssignal angesehen, während es wahrscheinlicher ist, dass das kürzlich entdeckte OB-Gen-Produkt Leptin als ein Adipositassignal wirkt, das die gesamte Nahrungsaufnahme über einen langen Zeitraum reduzieren kann. Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass CCK-8 und Leptin synergistisch wirken, um die langfristige Nahrungsaufnahme bei Mäusen zu steuern.
Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, wirkungsvolle CCK-8-Analoge bereitzustellen. Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, Arzneimittel zur Behandlung von Fettsucht und/oder Diabetes Typ II bereitzustellen. Eine ähnliche Verbindung für diese Verwendungen ist in Diabetes, 47(10), S. 1619-1624 (1998) beschrieben.
Erfindungsgemäß wird ein wirkungsvolles Peptidanaloges des biologisch aktiven CCK-8, das verbesserte Eigenschaften für die Behandlung von Fettsucht und/oder Diabetes Typ II hat, bereitgestellt, wobei das Analoge durch N-terminale Verlängerung mit pGlu-Gln an Asp' oder N-Alkylierung, N-Acetylierung, N-Acylierung oder N-Isopropylierung von Asp' modifiziert ist und das Analoge, wie weiter unten beschrieben, nicht mehr als eine Aminosäuresubstitution oder -modifizierung besitzt und kein Asp¹-Glucitol-CCK-8 umfasst.
Die Primärstruktur des humanen CCK-8 ist: Asp¹Tyr²(SO₃H)-Met³Gly⁴Trp⁵Met⁶Asp⁷Phe⁸amid.
Die erfindungsgemäßen Analogen werden von dieser Formel mit einer terminalen Verlängerung und anderen Modifizierungen, wie weiter unten beschrieben, dargestellt.
Das Analoge kann eine Modifizierung durch eine Fettsäureaddition (beispielsweise Palmitoyl) an der α-Aminogruppe von Asp¹ umfassen.
CCK-8-Analoge können ein verbessertes Vermögen zur Hemmung der Nahrungsaufnahme, Stimulierung der Insulinausscheidung und Verbesserung der Glucoseverarbeitung oder, verglichen mit nativem CCK-8, eine erhöhte Stabilität im Plasma besitzen. Sie können auch eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber Abbau durch natürlich vorkommende Exo- und Endopeptidasen besitzen.
Jede dieser Eigenschaften erhöht die Potenz des Analogen als therapeutisches Mittel.
Analoge mit einer D-Aminosäuresubstitution in CCK-8 und/oder N-glykatisierten, N-alkylierten, N-acetylierten, N-acylierten, N-Isopropyl- und N-Pyroglutamylaminosäuren in Position 1 sind eingeschlossen.
Verschiedene Aminosäuresubstitutionen umfassen beispielsweise einen Ersatz von Met³ und/oder Met⁶ durch Norleucin oder 2-Aminohexansäure. Verschiedene andere Substitutionen einer oder mehrerer Aminosäuren durch alternative Aminosäuren umfassen den Ersatz von Met³ durch Thr, Met⁶ durch Phe und Phe⁸ durch N-Methyl-Phe.
Weitere stabilisierte Analoge umfassen diejenigen mit einer isosterischen Peptidbindung, welche die normale Peptidbindung zwischen den Resten 1 und 2 sowie an einer beliebigen anderen Stelle innerhalb des Moleküls ersetzt. Diese verschiedenen Analogen sollten gegenüber Plasmaenzymen, einschließlich beispielsweise Aminopeptidase A, die für den in-vivo-Abbau und die in-vivo-Inaktivierung von CCK-8 verantwortlich sind, resistent sein.
In speziellen Ausführungsformen wird erfindungsgemäß ein Peptid bereitgestellt, das beim Auslösen des Sättigungsgefühls, Hemmen der Nahrungsaufnahme oder Moderieren von Blutglucoseausreißern potenter als CCK-8 ist und aus CCK(1-8) oder einem kleineren Fragment mit einer oder mehreren Modifizierungen besteht, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus der:

(i) N-terminalen Verlängerung von CCK-8 durch pGlu-Gln
(ii) N-terminalen Verlängerung von CCK-8 durch pGlu-Gln mit Substitution von Met⁸ durch Phe
(iii) Substitution des vorletzten Tyr²(SO₃H) durch phosphoryliertes Tyr
(iv) Substitution des vorletzten Tyr²(SO₃H) durch Phe-(pCH₂SO₃Na)
(v) Substitution einer natürlich vorkommenden Aminosäure durch eine alternative Aminosäure, einschließlich Met³ oder Met⁶ durch Norleucin oder 2-Aminohexansäure, Met³ durch Thr, Met⁶ durch Phe, Phe⁸ durch N-Methyl-Phe
(vi) in (v) beschriebenen Substitution mit oder ohne N-terminale Modifizierung von Asp¹ (beispielsweise durch Acetylierung, Acylierung, Alkylierung und pGlu-Gln)
(vii) Modifizierung von Asp¹ durch Acetylierung
(viii) Modifizierung von Asp¹ durch Acylierung (beispielsweise Palmitat)
(ix) Modifizierung eines substituierten Lys-Restes durch eine Fettsäure (beispielsweise Palmitat)
(x) Modifizierung von Asp¹ durch Alkylierung
(xi) Modifizierung von Asp¹ durch Isopropyl
(xii) Umwandlung einer Asp¹-Tyr²-Bindung in eine stabile isosterische Nicht-Peptidbindung CH₂NH
(xiii) Umwandlung einer Tyr²-Met³-Bindung in eine psi-[CH₂NH]-Bindung
(xiv) Umwandlung einer Met³-Gly⁴-Bindung in eine psi-[CH₂NH]-Bindung
(xv) Umwandlung einer Met⁶-Asp⁷-Bindung in eine psi-[CH₂NH]-Bindung
(xvi) Umwandlung einer weiteren Peptidbindung in eine psi-[CH₂NH]-Bindung
(xvii) an einer Stelle D-Aminosäure-substituiertes CCK-8
(xviii) CCK-8, das an einer oder mehreren Stellen D-Aminosäure-substituiert ist, zusätzlich zu einer N-terminalen Modifizierung durch beispielsweise Acetylierung oder Acylierung
(xix) retero-inverso CCK-8 (substituiert durch D-Aminosäuren durch das Octapeptid und die in umgekehrter Reihenfolge synthetisierte Primärstruktur hindurch)
(xx) verkürzten C-terminal trunkierten Formen von CCK-8 und cyclischen Formen von CCK-8 und
(xxi) erfindungsgemäßen Bereitstellung eines Verfahrens zur N-terminalen Modifizierung von CCK-8 oder Analogen davon während der Synthese; vorzugsweise sind die Agentien Glucose, Essigsäureanhydrid oder Pyroglutaminsäure.

Erfindungsgemäß wird auch die Verwendung von einem wie in Anspruch 3 definierten Peptid und anderen Analogen zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Fettsucht und/oder Diabetes Typ II bereitgestellt.
Erfindungsgemäß werden weiterhin verbesserte pharmazeutische Zusammensetzungen, einschließlich erfindungsgemäßer Peptide, mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften bereitgestellt.
Erfindungsgemäß wird ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, die für die Behandlung von Fettsucht und/oder Diabetes Typ II nützlich ist und einen wirksamen Anteil des hier beschriebenen Peptids zusammen mit einer pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelgrundlage umfasst, für eine Abgabe auf transdermalem, nasalem Inhalations-, oralem oder injiziertem Wege bereitgestellt. Dieses Peptid ist allein oder bei einer Kombinationstherapie zusammen mit natürlichen oder abgeleiteten Analogen von Leptin, Isletamyloidpolypeptid (IAPP) oder Bombesin (Gastrinfreisetzendes Peptid) zu verabreichen.
Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur N-terminalen Modifizierung von CCK-8 und Analogen davon bereitgestellt. Dieses dreistufige Verfahren umfasst zunächst die Festphasensynthese des C-Terminus bis zu Met³. Zweitens Zugabe von Tyr(tBu) als Fmoc-geschütztes PAM-Harz zu einem manuellen Gasdurchleitungssystem, Abspalten des Fmoc durch Piperidin in DMF, Umsetzung mit einem Fmoc-geschützten Asp(OtBu)-OH, weitere vollständige Umsetzung, Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe aus dem Dipeptid, Umsetzung des Dipeptids mit einem modifizierenden Agens (beispielsweise Glucose, Essigsäureanhydrid und Palmitat), Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen (tBu und OtBu) durch eine Säure, Sulfatieren des Tyr² mit Schwefeltrioxid und Abspalten des Peptids aus dem Harz unter alkalischen Bedingungen. Drittens kann das N-terminal modifizierte Dipeptid zu dem C-terminalen Peptidharz in dem Synthesizer mit anschließender Abspaltung aus dem Harz unter alkalischen Bedingungen mit methanolischem Ammoniak und schließlich Aufreinigung des fertigen Produkts unter Anwendung von Standardprozeduren zugegeben werden.
Die Erfindung wird anschließend anhand der folgenden Beispiele und der im Anhang befindlichen Figuren näher erläutert, wobei
1 den Abbau von CCK-8 und Asp¹-Glucitol-CCK-8 durch Plasma,
2 den fehlenden Abbau von pGlu-Gln-CCK-8 durch Plasma,
3 die Wirkung von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme,
4 die Wirkung von CCK-8 und Asp¹-Glucitol-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme in ob/ob-Mäusen,
5 die Wirkung verschiedener CCK-8-Dosen auf die Nahrungsaufnahme,
6 die Wirkung verschiedener Dosen von Asp¹-Glucitol-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme,
7 die Wirkung verschiedener Dosen von pGlu-Gln-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme,
8 die Wirkung von CCK-8 und Leptin sowohl allein als auch zusammen auf die Nahrungsaufnahme,
9 die Wirkung von CCK-8 und IAPP sowohl allein als auch zusammen auf die Nahrungsaufnahme,
10 die Wirkung von Bombesin und pGlu-Gln-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme,
11 die Wirkung von pGlu-Gln-CCK-8 und Leptin sowohl allein als auch zusammen auf die Nahrungsaufnahme und
12 die Wirkung von pGlu-Glin-CCK-8 und Leptin sowohl allein als auch zusammen auf die Nahrungsaufnahme zeigt.
BEISPIEL 1
Herstellung von N-terminal modifiziertem CCK-8 und Analogen davon
Die N-terminale Modifizierung von CCK-8 ist im Wesentlichen ein dreistufiges Verfahren. Zunächst wird CCK-8 aus seinem C-Terminus (ausgehend von einem Fmoc-Phe-OCH₂-PAM-Harz, Novabiochem) bis zu Met³ in einem automatischen Peptidsynthesizer (Applied Biosystems, CA, USA) synthetisiert. Die Synthese folgt Standard-Fmoc-Peptidchemie-Vorschriften unter Verwendung weiterer geschützter Aminosäuren, die sequentiell verwendet werden, einschließlich Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Gly-OH und Fmoc-Met-OH. Die Entfernung des N-terminalen Fmoc-Met erfolgt unter Verwendung von Piperidin in DMF (20 % Vol./Vol.). Die OtBu-Gruppe wird durch Schütteln in TFA/Anisol/DCM entfernt. Zweitens wird die vorletzte N-terminale Aminosäure des nativen CCK-8 (Tyr[tBu]) zu einem manuellen Gasdurchleitungssystem als ein alkalilabiles Fmoc-geschütztes Tyr(tBu)-PAM-Harz zugegeben. Die Schutzgruppe dieser Aminosäure wird an deren N-Terminus (Piperidin in DMF [20 % Vol./Vol.]) entfernt. Diese wird dann mit überschüssigem Fmoc-Asp(OtBu)-OH umgesetzt, wobei sich ein harzgebundes Dipeptid, Fmoc-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-PAM-Harz, bildet. Dessen Schutzgruppe wird an seinem N-Terminus (Piperidin in DMF [20 % Vol./Vol.]) entfernt, worauf eine freie α-Aminogruppe zurückbleibt. Diese wird beispielsweise mit Essigsäureanhydrid (Acetylierung) oder Pyroglutaminsäure (Pyroglutamyl) erforderlichenfalls bis zu 24 Stunden lang bis zur vollständigen Reaktion umgesetzt. Die Vollständigkeit der Umsetzung wird unter Anwendung des Ninhydrintests überwacht, durch welchen das Vorhandensein zur Verfügung stehender freier α-Aminosäuren bestimmt wird. Die Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten wird durch Schütteln in TFA/Anisol/DCM erreicht. Die Sulfatierung des N-terminal modifizierten Dipeptids wird durch Suspendieren des Peptids in DMF/Pyridin und Zugabe des Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplexes unter bis zu 24 Stunden langem Schütteln erreicht. Nach Vollendung der Umsetzung wird das nun strukturell modifizierte N-terminale Dipeptid, das das sulfatierte Tyr enthält, aus dem PAM-Harz (unter basischen Bedingungen mit methanolischem Ammoniak) und mit geeigneten Fängern abgespalten. Drittens wird ein 4-facher Überschuss des N-terminal modifizierten Asp-Tyr(SO₃H)-OH direkt in den automatischen Peptidsynthesizer gegeben, der die Synthese durchführt, wodurch die N-terminal modifizierte Region an das α-Amino von CCK(Met³) angeheftet und die Synthese des sulfatierten CCK-Analogen vollendet wird. Dieses Peptid wird von dem PAM-Harz (wie weiter oben unter alkalischen Bedingungen) abgespalten und danach unter Anwendung des Standard-Buchner-Filtrier-, Ausfällungs-, Rotationsverdampfungs- und Trocknungsverfahrens aufgearbeitet. Vor Aufreinigung in einer halbpräparativen Vydac-C-18-HPLC-Säule (1,0 cm × 25 cm) wird das Filtrat gefriergetrocknet. Die Bestätigung der Struktur der CCK-8-verwandten Analogen erfolgt durch Massenspektroskopie (ESI-MS und/oder MALDI-MS).
BEISPIEL 2
Wirkungen von CCK-8-Analogen auf die Nahrungsaufnahme
Im folgenden Beispiel wird die Herstellung von Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 zusammen mit der Bewertung ihrer Wirksamkeit beim Auslösen des Sättigungsgefühls und Senken der Nahrungsaufnahme in vivo untersucht. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass diese neuen Analogen eine beträchtliche Widerstandsfähigkeit gegenüber dem Abbau durch Aminopeptidasen und erhöhte biologische Aktivität, verglichen mit nativem CCK-8, aufweisen.
Planung der Forschung und Verfahren
Materialien. Cholecystokinin-Octapeptid (sulfatiertes CCK-8), pGlu-Gln-CCK-8 und weitere Analoge wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 432 Peptide synthesizer (wie weiter oben beschrieben) synthetisiert. Von Rathburn (Walkersburn, Schottland) wurde HPLC-reines Acetonitril erhalten. Für das Sequenzieren reine Trifluoressigsäure (TFA) wurde von Aldrich (Poole, UK) erhalten. Das in diesen Versuchen verwendete Wasser wurde unter Verwendung eines Milli-Q, Water Purification System (Millipore Corporation, Milford, MA, USA) gereinigt. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma, Poole, UK bezogen.
Herstellung von Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8. Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 wurden durch das in Beispiel 1 beschriebene 3-stufige Verfahren hergestellt. Die Peptide wurden in einer halbpräparativen Vydac-C-18-HPLC-Säule (1,0 × 25 cm) und anschließend in einer analytischen C-18-Säule unter Anwendung einer Gradientenelution mit Acetonitril/Wasser/TFA-Lösungsmitteln aufgereinigt. Der Nachweis der Struktur der CCK-8-verwandten Analogen erfolgte durch Massenspektroskopie (ESI-MS und/oder MALDI-MS). Aufgereinigte Kontroll- und strukturell modifizierte CCK-8-Fraktionen, die für Tierversuche verwendet wurden, wurden (unter Verwendung einer Supelcosil-C-8-Säule) durch Vergleich von Peakflächen mit einer Standard kurve, die aus bekannten CCK-8-Konzentrationen (0,78 bis 25 μg/ml) aufgestellt worden war, quantifiziert.
Molekulargewichtsbestimmung von Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 durch Elektrospray-Ionisierungsmassenspektroskopie (ESI-MS). Proben von CCK-8 und strukturell modifizierten CCK-8-Analogen wurden durch Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Peptide wurden (etwa 400 pmol) in 100 μl Wasser gelöst und auf ein LCQ-Tisch-Massenspektrometer (Finnigan MAT, Hemel Hempstead, UK), das mit einer Mikroporen-C-18-HPLC-Säule (150 × 2,0 mm, Phenomenex, UK, Ltd., Macclesfield) ausgerüstet war, aufgegeben. Die Proben (30 μl direkte Ringinjektion) wurden mit einem Durchfluss von 0,2 ml/min unter isokratischen Bedingungen 35 % (Vol./Vol.) Acetonitril/Wasser eingespritzt. Die Massenspektren wurden von einem Quadripol-Ionenfallenmassenanalysator erhalten und aufgezeichnet. Die Spektren wurden im positiven und negativen Modus unter Anwendung des vollständigen Ionenscanmodus über den Massen/Ladungs-(m/z-)Bereich von 150 bis 2000 gesammelt. Die Molekulargewichte der positiven Ionen von CCK-8 und verwandten Analogen wurden aus ESI-MS-Profilen unter Verwendung prominenter mehrfach geladener Ionen und der folgenden Gleichung M_r = iM_i – iM_h (wobei M_r = Molekulargewicht, M_i = m/z-Verhältnis, i = Anzahl der Ladungen und M_h = Masse eines Protons) bestimmt.
Wirkungen von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8, pGlu-Gln-CCK-8 und anderen Peptiden auf die Nahrungsaufnahme bei Mäusen. Es wurden Studien zur Bewertung der relativen Potenzen von Kontroll-CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8, pGlu-Gln-CCK-8 und anderen an der Regulierung der Nahrungsaufnahme beteiligten Peptiden unter Verwendung von männlichen Schweizer TO-Mäusen (n = 16), die 7 bis 12 Wochen alt und von einer Gruppe waren, die von der Behavioral and Biomedical Research Unit, University of Ulster, stammte, durchgeführt. Die Versuchstiere wurden einzeln in einem klimatisierten Raum bei 22 ± 2 °C und einem Zyklus aus 12 h Licht/12 h Dunkelheit gehalten. Sie konnten nach Belieben Wasser trinken, und übliches Mausfutter (Trouw Nutrition, Cheshire, UK) wurde, wie weiter unten beschrieben, zu verschiedenen Zeiten gegeben. Die Mäuse wurden an eine tägliche Fütterungsperiode von 3 h/Tag durch fortschreitende Verkürzung der Fütterungsperiode über einen Zeitraum von 3 Wochen gewöhnt. Vom 1. bis zum 6. Tag wurde das Futter von 10:00 bis 20:00 Uhr gegeben, und am 7. bis 14. Tag auf 10:00 bis 16:00 Uhr und am 15. bis 21. Tag auf 10:00 bis 13:00 Uhr begrenzt. Körpergewicht, Futter- und Wasseraufnahme wurden täglich überwacht.
Den Mäusen, die zuvor an eine Fütterung von 3 h/Tag gewöhnt worden waren, wurde eine einzige intraperitoneale Injektion einer physiologischen Kochsalzlösung (0,9 % Gew./Vol. NaCl, 10 ml/kg) im Fastenzustand (10:00 Uhr) verabreicht, und danach wurde sofort gefüttert. Zwei Tage nach Injektion der physiologischen Kochsalzlösung wurden die Mäuse zufällig auf Gruppen von 7 bis 8 Tieren aufgeteilt, denen eine einzige intraperitoneale Injektion (1 bis 100 nmol/kg) von entweder CCK-8, strukturell modifizierten CCK-8-Analogen und/oder anderen Peptidhormonen (einschließlich Bombesin, Leptin und Isletamyloidpolypeptid [IAPP]) verabreicht wurde. Die Nahrungsaufnahme wurde sorgfältig in 30-min-Abständen bis zu 180 min nach der Injektion überwacht. In einer Versuchsreihe wurde das Vermögen von CCK-8 und Asp¹-Glucitol-CCK-8 zur Hemmung der Fressaktivität bei über Nacht fastenden erwachsenen fettsüchtigen hyperglykämischen (ob/ob) Mäusen untersucht. Alle Tierversuche wurden gemäß dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt.
Wirkungen von Mausserum auf den Abbau von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8. Serum (20 μl) von fastenden Schweizer TO-Mäusen wurde bei 37 °C mit 10 μg von entweder nativem CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8 oder pGlu-Gln-CCK-8 für Zeiträume von bis zu 2 h in einem Reaktionsgemisch (Endvolumen 500 μl), das 50 mmol/l Triethanolamin/HCl-Puffer, pH 7,8, enthielt, inkubiert. Die Reaktion wurde abgebrochen durch Zugabe von 5 μl TFA, und das Endvolumen wurde auf 1,0 ml unter Verwendung von 0,1 % (Vol./Vol.) TFA/Wasser eingestellt. Die Proben wurden zentrifugiert (13000 g, 5 min), und der Überstand wurde auf eine C-18 Sep-Pak Cartridge (Waters/Millipore) aufgegeben, die zuvor mit einem Primer versehen und mit 0,1 % (Vol./Vol.) TFA/Wasser gewaschen worden war. Nach Waschen mit 20 ml 0,12 % TFA/Wasser wurde das gebun dene Material durch Elution mit 2 ml 80 % (Vol./Vol.) Acetonitril/Wasser freigesetzt und unter Verwendung eines Speed-Vac-Konzentrators (AES 1000, Savant) aufkonzentriert. Das Volumen wurde auf 1,0 ml mit 0,12 % (Vol./Vol.) TFA/Wasser eingestellt und auf eine (250 × 4,6 mm) Vydac-C-18-Säule aufgegeben, die zuvor mit 0,12 % (Vol./Vol.) TFA/Wasser mit einem Durchfluss von 1,0 ml/min ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Acetonitrilkonzentration im Elutionsmittel wurde von 0 auf 31,5 % 15 min lang, von 31,5 bis 38,5 % 30 min lang und von 38,5 bis 70 % 5 min lang unter Verwendung von linearen Gradienten unter Überwachung der Elutionspeaks bei 206 nm erhöht.
Statistische Analyse. Die Datengruppen werden als Mittelwerte ± SA dargestellt. Die statistische Bewertung wurde je nachdem unter Anwendung der Varianzanalyse, des Grenzdifferenz-Mehrfachvergleichstests und des unpaarigen Student-t-Tests durchgeführt. Differenzen wurden als signifikant angesehen, wenn P < 0,05.
Ergebnisse
Molekulargewichtsbestimmung. Nach Inkubation wurden Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 klar von nativem CCK-8 in einer Vydac-C-18-HPLC-Säule abgetrennt. Die mittleren Molekulargewichte von CCK-8 (Mr 1064,2), Asp¹-Glucitol-CCK-8 (M_T 1228,4) und pGlu-Gln-CCK-8 (M_r 1352,4) wurden durch ESI-MS bestimmt und dadurch ihre Struktur bestätigt.
In-vitro-Abbau von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8. In 1 ist ein Vergleich der typischen Beispiele von HPLC-Spuren nach einer 0, 1 und 2 h langen in-vitro-Einwirkung von Mausserum auf den Abbau von CCK-8 (linke Diagramme) oder Asp¹-Glucitol-CCK-8 (rechte Diagramme). Intaktes CCK-8 (Peak A) und drei separate CCK-8-Fragmente (Peaks B, C, D) eluierten bei 22,18, 22,01, 19,81 bzw. 18,98 min. Asp¹-Glucitol-CCK-8 (Peak E, rechte Diagramme) eluierte bei 21,65 min. In Tabelle 1 sind die Muster des CCK-8- und Asp¹-Glucitol-CCK-8-Abbaus für jeden Fall zusammengefasst. Aus der Analyse der HPLC-Peakflächendaten ist es offensichtlich, dass 83,1 % und 100 % des CCK-8 in die CCK-8-Fragmente nach 1 bzw. 2 h Inkubation umgewandelt wurden. Im Gegensatz dazu blieb Asp¹-Glucitol-CCK-8 nach 1 und 2 h Inkubation intakt, und es wurden keine zusätzlichen Peptidfragmente detektiert. Auf ähnliche Weise war auch pGlu-Gln-CCK-8 gegenüber einem Plasmaabbau nach 2 h (2) sehr resistent.
Nahrungsaufnahmeversuche. Die tägliche Nahrungsaufnahme von Mäusen innerhalb des Zeitraums vor Verabreichung der Peptide zeigte, dass der mittlere Futterverzehr der Mäuse, denen 3 h Zugang zum Futter erlaubt worden war, 3,8 ± 0,2 g/Maus betrug. Nach der intraperitonealen Verabreichung der physiologischen Kochsalzlösung bestand kein signifikanter Unterschied in der 3-stündigen freiwilligen Nahrungsaufnahme (3,66 ± 0,1 g), verglichen mit alleiniger 3 h Nahrungsaufnahme. In 3 ist gezeigt, dass die intraperitoneale Injektion von CCK-8 eine Hemmwirkung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme 30, 60 und 90 min nach der Behandlung, verglichen mit der physiologischen Kochsalzlösung allein, hatte. Es gab jedoch keine nachhaltige Hemmwirkung des CCK-8 auf die kumulative Nahrungsaufnahme über 90 min hinaus. Im Gegensatz dazu blieb die Hemmwirkung von Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme über die 3 h Fütterungsperiode nach der Behandlung erhalten, verglichen mit der Reaktion auf die physiologische Kochsalzlösung. Weiterhin waren beide strukturell modifizierten CCK-8-Peptide deutlich potenter beim Senken der Nahrungsaufnahme zu jedem Zeitpunkt (außer bei 30 min), verglichen mit der äquivalenten CCK-8-Dosis. In 4 ist gezeigt, dass CCK-8 und Asp¹-Glucitol-CCK-8 auch die freiwillige Nahrungsaufnahme bei genetisch fettsüchtigen diabetischen (ob/ob)-Mäusen deutlich senkt. Asp¹-Glucitol-CCK-8 ist deutlich potenter als natives CCK-8.
Die Dosis-Antwort-Wirkungen von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme sind in den 5 bis 7 gezeigt. Verglichen mit CCK-8 übten beide strukturell modifizierten Peptide länger andauernde Wirkungen bei niedrigeren Dosen aus. Wie in den 8 bis 10 gezeigt, war CCK-8 oder pGlu-Gln-CCK-8 deutlich potenter auf äquimolarer Basis als entweder Leptin, Isletamyloidpolypeptid (IAPP) oder Bombesin bei der Hemmung der Nahrungsaufnahme über einen Zeitraum von 30 bis 180 min. Eine Kombination von CCK-8 mit entweder Leptin oder IAPP, insbesondere dem Letzteren, ergab eine sehr ausgeprägte Potenzierung der Sättigungswirkung (8 und 9). In 10 ist gezeigt, dass sowohl pGlu-Gln-CCK-8 als auch Bombesin wirksame appetitzügelnde Mittel sind, wobei Ersteres länger anhaltende Wirkungen hat. In 11 ist gezeigt, dass eine Kombination von CCK-8 mit Exendin (1-39) eine besonders gesteigerte Sättigungswirkung hat. Die Verabreichung von Leptin mit pGlu-Gln-CCK-8 resultierte auch in einer besonders ausgeprägten und langanhaltenden Hemmung der Nahrungsaufnahme.
Diskussion
Die vorliegende Studie untersuchte die Wirkungen von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme bei Mäusen. Die Studie zeigt, dass CCK-8 bei der Senkung der Nahrungsaufnahme bis zu 90 min nach Verabreichung wirksam war, verglichen mit physiologischen Kochsalzlösungskontrollen. Die Wirkungen von Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme wurden untersucht und es zeigte sich, dass diese Amino-terminal modifizierten Peptide ein beträchtlich gesteigertes und verlängertes Vermögen zur Senkung der freiwilligen Nahrungsaufnahme, verglichen mit der äquimolaren Dosis von nativem CCK-8, hatten. Die Veränderung der Primärstruktur durch N-terminale Modifizierung von CCK-8 scheint dessen biologische Aktivität zu verstärken und seine Wirkungsdauer bei normalen Tieren von 90 min auf mehr als 3 h zu verlängern. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass ein potenter Sättigungseffekt über mehr als 5 h bei fettsüchtigen diabetischen (ob/ob)-Mäusen fortexistieren kann. Die Veränderung der biologischen Aktivität, die bei Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 festgestellt wurde, erweitert frühere Beobachtungen, dass die Glykation von Peptiden deren biologische Aktivitäten verändern kann. Es ist bemerkenswert, dass Kontrollversuche, die mit glykatisiertem tGLP-1 durchgeführt wurden, zeigen, dass das Vorhandensein eines Glucitoladdukts am Aminoterminus eines Peptids von sich aus nicht genügt, in diesem Versuchssystem ein Sättigungsgefühl hervorzurufen.
Die Tatsache, dass Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 die Zügelung des Appetits verstärken, wirft die Frage nach einem möglichen Mechanismus auf. Da die sehr kurze Halbwertszeit von 1 bis 2 min von CCK-8 im Allgemeinen als Erklärung für den vorübergehenden Sättigungseffekt des Peptids akzeptiert ist, ist es möglich, dass durch die Modifizierung des Aminoterminus von CCK-8 die Halbwertszeit durch Schutz vor dem Angriff von Aminopeptidasen verlängert und somit seine Wirkung verstärkt wird. Es ist gezeigt worden, dass Aminopeptidase A CCK-8 in vivo durch Hydrolyse der Asp-Tyr-Bindung direkt abbaut. Das Peptid kann auch durch die neutrale Endopeptidase 24.11 (NEP), die Thiol- oder die Serinendopeptidase und das Angiotensin-Konversions-Enzym abgebaut werden. Die vorliegende Studie zeigt, dass Asp¹-Glucitol-CCK-8 und pGlu-Gln-CCK-8 gegenüber dem Abbau durch Peptidasen im Serum äußerst widerstandsfähig sind. Somit scheint es wahrscheinlich, dass der Schutz des Aminoterminus von CCK-8 durch ein Glucitol- oder Pyroglutamyl-Gln-Addukt die Halbwertszeit des glykatisierten CCK-8 im Kreislauf verlängert und somit zur Verstärkung seiner biologischen Aktivität durch Verlängerung der Dauer seiner in-vivo-Wirkung beiträgt.
Zur Erklärung der Wirkung des CCK bei der Senkung der Nahrungsaufnahme sind verschiedene Mechanismen vorgeschlagen worden. Eine Hypothese besteht darin, dass nach der Nahrungsaufnahme Magenausdehnung und Nährstoffabsorption die Freisetzung von CCK-8 verursachen, wodurch die Nahrungsaufnahme beendet wird. Es ist vorgeschlagen worden, dass CCK-8 sowohl den Pylorussphinkter kontrahiert als auch den proximalen Magen entspannt, wobei beide zusammen die Magenentleerung verzögern. Der Magenzweig des Vagusnervs ist eng an der Vermittlung der CCK-8-Wirkung beteiligt. Das Sättigungssignal scheint vom Vagusnerv über den Nucleus tractus solitarius und die Area postrema zum Hypothalamus geschickt zu werden.
Obwohl den Wirkungen und der möglichen therapeutischen Verwendung von Leptin bei Fettsucht und NIDDM viel Aufmerksamkeit gewidmet wurde, können Asp¹-Glucitol-CCK-8, pGlu-Gln-CCK-B oder andere strukturell modifizierte Analoge von CCK-8 potentiell eine Anzahl signifikanter Merkmale, verglichen mit Leptin, haben. Zunächst häufen sich die Nachweise von Defekten beim Leptinrezeptor und -postrezeptor, was bestimmte Formen von Fettsucht-Diabetes anzeigt. Zweitens hat CCK-8 potente periphere Wirkungen, während Leptin zentral wirkt und den Durchgang durch die Blut-Hirn-Schranke erfordert. Drittens sind die Wirkungen von CCK-8 auf die Nahrungsaufnahme unmittelbar, während die Wirkung von Leptin eine hohe Dosierung erfordert und verzögert ist. Viertens hat es sich gezeigt, dass CCK als ein Sättigungshormon bei Menschen in physiologischen Konzentrationen wirkt, und ein spezifischer Inhibitor des CCK-Abbaus zeigt Prosättigungseffekte bei Ratten. Weiterhin ist es interessant festzustellen, dass die Wirkungen von CCK-8, das zusammen mit entweder Leptin, IAPP, Exendin (1-39) oder Bombesin verabreicht wird, auf das Sättigungsgefühl additiv sind und die Möglichkeit von komplementären Mechanismen und kombinierten Therapien begründen.
Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass sich CCK-8 am Aminoterminus leicht strukturell modifizieren lässt, und dass insbesondere intraperitoneal verabreichtes Asp¹-Glucitol-CCK-8 oder pGlu-Gln-CCK-8 eine deutlich verstärkte Sättigungswirkung in vivo aufweist, die teilweise auf den Schutz vor Serumaminopeptidasen zurückzuführen ist. Diese Daten zeigen klar das Potential von N-terminal modifizierten CCK-8-Analogen für die Hemmung der Nahrungsaufnahme und legen eine mögliche therapeutische Verwendung bei Menschen zur Bekämpfung von Fettsucht und damit verwandten Stoffwechselstörungen nahe.
Erläuterung der Figuren
1: HPLC-Profile von CCK-8 und Asp¹-Glucitol-CCK-8 nach Inkubation mit Serum 0,1 und 2 h lang in einer Vydac-C-18-Säule. Repräsentative Spuren sind für CCK-8 (linke Diagramme) und Asp¹-Glucitol-CCK-8 (rechte Diagramme) gezeigt. Asp¹-Glucitol-CCK-8- und CCK-8-Inkubationen wurden unter Anwendung von linearen Gradienten 0 % bis 31,5 % Acetonitril 15 min lang, 31,5 % bis 38,5 % 30 min lang und anschließend 38,5 % bis 70 % Acetonitril 5 min lang voneinander getrennt. Peak A entspricht dem intakten CCK-8, Peaks B, C und D entsprechen CCK-8-Fragmenten und Peak E entspricht Asp¹-Glucitol-CCK-8.
2: HPLC-Profile von pGlu-Gln-CCK-8 nach Inkubation mit Serum 0 und 2 h lang in einer Vydac-C-18-Säule. Repräsentative Spuren sind für pGlu-Gln-CCK-8 nach 0 h (oberes Diagramm) und 2 h (unteres Diagramm) gezeigt. pGlu-Gln-CCK-8-Inkubationen wurden unter Anwendung von linearen Gradienten von 0 % bis 31,5 % Acetonitril 15 min lang und anschließend 31,5 % bis 38,5 % 30 min lang und 38,5 % bis 70 % Acetonitril 5 min lang voneinander getrennt. Der einzige Elutionspeak bei 0 und 2 h entspricht dem intakten pGlu-Gln-CCK-8.
3: Wirkung von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8, pGlu-Gln-CCK-8 oder physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion (100 nmol/kg) fastenden Mäusen zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen (n = 16 für die physiologische Kochsalzlösungskontrollen). Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet durch *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung zu denselben Zeitpunkten, und ΔP < 0,05, ΔΔP < 0,01, verglichen mit nativem CCK-8.
4: Wirkung von CCK-8, Asp¹-Glucitol-CCK-8 oder physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von fettsüchtigen diabetischen (ob/ob) Mäusen. Physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion (100 nmol/kg) fastenden fettsüchtigen diabetischen (ob/ob)-Mäusen zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 und 300 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 8 Beobachtungen. Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung zur selben Zeit, und ΔP < 0,05 und ΔΔΔP < 0,001, verglichen mit nativem CCK-8.
5: Wirkung verschiedener Dosen von CCK-8 oder physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Die physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion (1 bis 100 nmol/kg) an fastende Mäuse zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen (n = 16 für die physiologischen Kochsalzlösungskontrollen). Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung zur selben Zeit.
6: Wirkung verschiedener Dosen von Aps¹-Glucitol-CCK-8 oder physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Die physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion (1 bis 100 nmol/kg) an fastende Mäuse zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen (n = 16 für die physiologischen Kochsalzlösungskontrollen). Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung zur selben Zeit.
7: Wirkung verschiedener Dosen von pGlu-Gln-CCK-8 oder physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Die physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion (1 bis 100 nmol/kg) an fastende Mäuse zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen (n = 16 für die physiologischen Kochsalzlösungskontrollen). Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung zur selben Zeit.
8: Wirkung von CCK-8, Leptin und kombiniertem CCK-8 und Leptin sowie physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Die physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion einzeln (100 nmol/kg) oder kombiniert (jeweils 100 nmol/kg) an fastende Mäuse zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen. Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit **P < 0,01, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung, und **P < 0,01, verglichen mit Leptin allein zur selben Zeit.
9: Wirkung von CCK-8, IAPP, kombiniertem CCK-8 und IAPP sowie physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Die physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion einzeln (100 nmol/kg) oder kombiniert (jeweils 100 nmol/kg) an fastende Mäuse zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen. Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit **P < 0,01, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung, und ΔΔP < 0,01, verglichen mit IAPP allein zur selben Zeit.
10: Wirkung von pGlu-Gln-CCK-8, Bombesin sowie physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Die physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion einzeln (100 nmol/kg) oder kombiniert (jeweils 100 nmol/kg) an fastende Mäuse zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen. Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit **P < 0,01, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung, und ΔΔP < 0,01, verglichen mit IAPP allein zur selben Zeit.
11: Wirkung von CCK-8, Exendin(1-39) und kombiniertem CCK-8 und Exendin (1-39) sowie physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion einzeln (50 bzw. 100 mmol/kg) oder kombiniert fastenden Mäusen zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 9 Beobachtungen. Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung, und ΔP < 0,05, ΔΔP < 0,01 und ΔΔΔP < 0,001, verglichen mit Exendin(1-39), zur selben Zeit.
12: Wirkung von pGlu-Gln-CCK-8, Leptin und kombiniertem pGlu-Gln-CCK-8 und Leptin sowie physiologischer Kochsalzlösung auf die freiwillige Nahrungsaufnahme von Schweizer TO-Mäusen. Physiologische Kochsalzlösung oder Testmittel wurden durch intraperitoneale Injektion einzeln (pGlu-Gln-CCK-8 50 mmol/kg, Leptin 100 nmol/kg) oder kombiniert fastenden Mäusen zum Zeitpunkt 0 unmittelbar vor der Fütterung verabreicht. Die kummulative Nahrungsaufnahme wurde 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min nach der Injektion überwacht. Die Werte sind Mittelwerte ± SA von 7 bis 8 Beobachtungen. Signifikante Unterschiede sind gekennzeichnet mit *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001, verglichen mit physiologischer Kochsalzlösung, und ΔP < 0,05, ΔΔP < 0,01 und ΔΔΔP < 0,001, verglichen mit Leptin, zur selben Zeit.
Tabelle 1. Wirkung von Serum auf den in-vitro-Abbau von CCK-8 und glykatisiertem CCK-8
SEQUENZLISTE

Claims

Ein Verfahren zum N-terminalen Modifizieren von CCK-8 und Analogen davon, das die Schritte der Festphasen-Peptidsynthese des C-Terminus bis zu Met³, das Zugeben von Tyr(tBu) als ein Fmoc geschütztes PAM-Harz, das Abspalten des Fmoc durch Piperidin in DMF und das Reagierenlassen mit einem Fmoc geschützten Asp(OtBu)-OH, das Ermöglichen des Fortfahrens der Reaktion zur Vervollständigung, das Entfernen der Fmoc geschützten Gruppe aus dem Dipeptid, das Reagierenlassen des Dipeptids mit einem modifizierenden Agens, das Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen (tBu und OtBu) durch Säure, das Sulfatieren des Tyr² mit Schwefeltrioxid, das Spalten des Peptids aus dem Harz unter alkalischen Bedingungen, beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner den Schritt des Hinzugebens des N-Terminal modifizierten Dipeptids zu dem C-Terminal-Peptidharz in dem Synthesizer umfasst, gefolgt von der Spaltung aus dem Harz unter alkalischen Bedingungen mit methanolischem Ammoniak.
Ein Peptid für die Behandlung von Fettsucht und/oder Typ-2-Diabetes, wobei das Peptid aus folgender Primärstruktur besteht: Asp¹Tyr²(SO₃H)-Met³G1y⁴Trp⁵Met⁶Asp⁷Phe⁸amid (Seq ID Nr.: 1)wobei die Primärstruktur durch N-Terminal-Erweiterung um pGlu-Gln bei Asp¹- oder N-Alkylierung, N-Acetylierung, N-Acylierung oder N-Isopropylierung von Asp¹ und wahlweise eine weitere Aminosäure-Substitution oder -modifikation oder eine Peptidbindungsmodifikation modifiziert wird, wobei die weitere Aminosäuresubstitution oder -modifikation bei einem anderen Aminosäurerest als Asp¹ stattfindet; wobei die weitere Aminosäuresubstitution oder -modifikation oder eine Peptidbindungsmodifikation aus Folgendem besteht: (i) Substitution von Met⁸ durch Phe, wobei die Modifikation der Primärstruktur durch N-Terminal-Erweiterung um pGlu-Gln erfolgt (ii) Substitution des vorletzten Tyr²(SO₃H) durch ein phosphoryliertes Tyr (iii) Substitution des vorletzten Tyr²(SO₃H) durch Phe(pCH₂SO₃Na) (iv) Substitution einer natürlich vorkommenden Aminosäure durch eine alternative Aminosäure einschließlich: Met³ oder Met⁶ durch Norleucin oder 2-Aminohexansäure, Met³ durch Thr, Met⁶ durch Phe, Ph⁸ durch N-Methyl-Phe (v) Modifikation eines substituierten Lys-Rests durch eine Fettsäure (z. B. Palmitat) (vi) Konvertierung einer Asp¹-Tyr²-Bindung in eine stabile Nicht-Peptidisosterbindung CH₂NH (vii) Ersatz einer Peptidbindung zwischen zwei angrenzenden Resten durch eine Peptidisosterbindung (viii) Konvertierung einer Tyr²-Met³-Bindung in eine psi[CH₂NH]-Bindung (ix) Konvertierung einer Met³-Gly⁴-Bindung in eine psi[CH₂NH]-Bindung (x) Konvertierung einer Met⁶-Asp⁷-Bindung in eine psi [CH₂NH]-Bindung (xi) Konvertierung einer weiteren Peptidbindung in eine psi [CH₂NH]-Bindung (xii) D-Aminosäure-Substitution CCK-8 an einer Stelle (xiii) retero-inverso CCK-8 (substituiert durch D-Aminosäuren durch das ganze Octapeptid und die in umgekehrter Reihenfolge synthetisierte Primärstruktur hindurch) (xiv) Löschung von Phe⁸.
Peptid gemäß Anspruch 3, wobei die N-Terminal-Erweiterung aus der Erweiterung um pGlu-Gln oder N-Alkylierung oder N-Isopropylierung besteht.
Peptid gemäß Anspruch 4, wobei die N-Terminal-Erweiterung aus der Erweiterung um pGly-Gln besteht.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Primärstruktur die weitere Aminosäure-Substitution oder -modifikation nicht beinhaltet.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die N-Terminal-Modifikation N-Terminal-Acylierung durch eine Fettsäure bei der Alpha-Aminogruppe von Asp¹ ist.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die weitere Aminosäure-Modifikation aus einer D-Aminosäure-Substitution besteht.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei weiter die Aminosäure-Substitution aus dem Ersatz von Met³ durch Norleucin, 2-Aminohexansäure oder Thr, dem Ersatz von Met⁶ durch Norleucin, 2-Aminohexansäure oder Phe, oder dem Ersatz von Phe⁸ durch N-Methyl-Phe besteht.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die weitere Aminosäure-Modifikation aus Folgendem besteht: (i) Substitution des Tyr²(SO₃H) durch ein phosphoryliertes Tyr, (ii) Substitution des Tyr²(SO₃H) durch Phe(pCH₂SO₃Na), (iii) Substitution eines Aminosäurerests durch einen Lys-Rest mit einer Fettsäure (z. B. Palmitat) an der Epsilon-Aminogruppe des Lys-Rests, oder (iv) Substitution jedes Rests durch D-Aminosäuren, die in umgekehrter Reihenfolge zu dem in Seq ID Nr. 1 gezeigten synthetisiert werden.
Peptid gemäß Anspruch 3, wobei die weitere Modifikation die Löschung von Phe⁸ beinhaltet.
Peptid gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens eine Peptidbindung durch eine Peptidisosterbindung ersetzt wird.
Peptid gemäß Anspruch 12, wobei eine Peptidisosterbindung zwischen den Resten Asp¹ und Tyr²(SO₃H) vorliegt.
Die Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 13 bei der Zubereitung eines Medikaments zur Unterdrückung der Nahrungsaufnahme, Hervorrufung von Sattheit, Stimulation von Insulinabsonderung, Mäßigung von Blutzuckerexkursionen, Verbesserung der Glukoseabgabe und/oder Darstellung der verbesserten Stabilität bei Plasma im Vergleich zu nativem CCK-8.
Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 13 bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Fettsucht und/oder Typ-2-Diabetes.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung einschließlich eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 13.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die bei der Behandlung von Fettsucht und/oder Typ-2-Diabetes nützlich ist, die eine wirksame Menge eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 3 bis 13 unter Beimischung eines pharmazeutisch akzeptablen Bindemittels zur Abgabe durch transdermale, nasale Inhalation, orale oder injizierte Wege beinhaltet.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, die ferner native oder abgeleitete Analoge aus Leptin, Exendin, Islet-Amyloid-Polypeptid (IAPP) oder Bombesin (Gastrin freisetzendes Peptid) beinhaltet.