ES2278394T3 - Peptidos c de la insulina. - Google Patents

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Hans Jornvall
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Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PEPTIDO QUE ES UN FRAGMENTO DEL PEPTIDO C DE LA INSULINA HUMANA. DICHO PEPTIDO, QUE COMPRENDE LA SECUENCIA ELGGGPGAG O UNO DE SUS FRAGMENTOS, O BIEN LA SECUENCIA EGSLQ O UNO DE SUS FRAGMENTOS, ES CAPAZ DE ESTIMULAR LA ACTIVIDAD NA + K + ATPASE. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS COMPUESTOS ORGANICOS BIOMIMETICOS QUE FAVORECEN LA ACTIVIDAD DE NA + K + ATPASE Y/O LA FIJACION CELULAR SOBRE LAS CELULAS DE LOS TUBULOS RENALES Y LOS FIBROBLASTOS, POR LO MENOS, CON EL MISMO PORCENTAJE QUE LOS PEPTIDOS O SUS FRAGMENTOS MENCIONADOS ANTERIORMENTE. ESTOS PEPTIDOS Y COMPUESTOS SIRVEN PARA LUCHAR CONTRA LA DIABETES Y SUS COMPLICACIONES O PARA ESTIMULAR LA ACTIVIDAD NA + K SUP, + ATPASE.

Description

Péptidos C de la insulina.
La presente invención se refiere a fragmentos del péptido C de la insulina y su uso en el tratamiento de la diabetes y las complicaciones de la diabetes.
Los pacientes con diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), generalmente sinónima con la diabetes de tipo 1, no pueden sobrevivir sin terapia de insulina. La IDDM es la forma clásica de la diabetes, que amenaza la vida, cuyo tratamiento se revolucionó con el descubrimiento de la insulina en 1922. La incidencia de IDDM en Europa, América del Norte y Japón es 0,25-0,4% de la población. Hay una variación estacional en la incidencia de IDDM con más pacientes con el trastorno en los meses de Otoño e Invierno. El trastorno afecta ligeramente más a los hombres aunque esta diferencia es menos marcada con el aumento de la edad.
Los síntomas clásicos de IDDM en su fase aguda son la sed, los grandes volúmenes de orina, el cansancio y la pérdida de peso. Síntomas menores menos frecuentes son los calambres musculares, las infecciones de la piel y la visión nublada. Las náuseas y el vómito pueden suceder en los estadios avanzados y denotan la cetoacidosis inminente y el coma. La duración de los síntomas es corta, generalmente 2-3 semanas o menos. Los pacientes tienen altas concentraciones de glucosa y cuerpos cetónicos en la sangre y orina mientras que las concentraciones de insulina son bajas o no detectables.
La etiología de IDDM es multifactorial pero lo más probable es que incluya una predisposición genética para la reactividad autoinmune junto con activación medioambiental, posiblemente por medio de una infección viral, lo que ocasiona una destrucción parcial o completa de las células beta pancreáticas. La destrucción de las células beta puede haber estado sucediendo durante los 6-12 meses antes de la aparición del trastorno. En la fase aguda de IDDM la deficiencia en insulina es así la característica patofisiológica dominante.
Después de iniciarse el tratamiento con insulina muchos pacientes disfrutan de buen control de la glucosa en la sangre con solo pequeñas dosis de insulina. Hay una fase temprana, el "periodo de luna de miel", que puede durar de unos pocos meses a un año y que probablemente refleja una recuperación parcial de la función de las células beta. Este es, sin embargo, un estadio temporal y a la larga, la destrucción autoinmune progresiva de las células beta conduce a una demanda mayor de insulina exógena.
Mientras que los efectos a corto plazo de la hipoinsulinemia en la fase aguda de IDDM pueden controlarse bien con la administración de insulina, la historia natural de IDDM a largo plazo está oscurecida por la aparición en muchos pacientes de complicaciones potencialmente serias. Estas incluyen los problemas específicamente diabéticos de la nefropatía, retinopatía y neuropatía. Estos trastornos son referidos a menudo como complicaciones microvasculares incluso aunque las alteraciones microvasculares no sean la única causa. Puede también ocurrir la enfermedad aterosclerótica de las grandes arterias, particularmente las arterias coronarias y las arterias de las extremidades inferiores.
La nefropatía se desarrolla en aproximadamente 35% de los pacientes de IDDM particularmente en los pacientes masculinos y en aquellos en que aparece la enfermedad antes de los 15 años de edad. La nefropatía diabética se caracteriza por la albuminuria persistente secundaria al daño a los capilares del glomérulo, una reducción progresiva de la velocidad de filtración glomerular y finalmente, fracaso renal de etapa final.
La ocurrencia de la retinopatía diabética es más alta entre los pacientes de IDDM de aparición juvenil y aumenta con la duración de la enfermedad. La retinopatía proliferativa está generalmente presente en alrededor del 25% de los pacientes después de 15 años de duración de la enfermedad y en más del 50% después de 20 años. La lesión más temprana de la retinopatía diabética es un espesamiento de la membrana basal capilar, a continuación se produce la dilatación capilar y derrames y la formación de microaneurismos. Subsecuentemente, sucede la oclusión de los vasos de la retina lo que produce hipoperfusión de partes de la retina, edema, derrame sanguíneo y formación de vasos nuevos así como la pérdida progresiva de la visión.
La neuropatía diabética incluye una amplia variedad de alteraciones de la función nerviosa somática y autonómica. La neuropatía sensorial puede ocasionar la pérdida progresiva de la sensación o, alternativamente, ocasionar sensaciones desagradables, a menudo dolor, en las piernas o los pies. La neuropatía motora está acompañada normalmente por la pérdida de músculo y la debilidad. Las biopsias de los nervios generalmente muestran degeneración axonal, desmielinización y anormalidades de los vasa nervorum. Los estudios neurofisiológicos indican velocidades de conducción reducidas de los nervios motores y sensoriales. La neuropatía autonómica afecta a un 40% de los pacientes con IDDM de más de 15 años de duración. Puede evolucionar a defectos en la termorregulación, impotencia y disfunción de la vejiga seguido de anormalidades en los reflejos cardiovasculares. Manifestaciones tardías pueden incluir trastornos del sudor generalizados, hipotensión postural, problemas gastrointestinales y conciencia reducida de la hipoglicemia. El último síntoma tiene implicaciones clínicas serias.
Se han ofrecido varias teorías en relación con el mecanismo(s) posible(s) envuelto(s) en la patogénesis de las distintas complicaciones diabéticas (1). Los factores metabólicos pueden ser importantes y estudios recientes demuestran que un buen control metabólico está acompañado de una incidencia significativamente reducida de complicaciones de todo tipo (2). De cualquier forma, después de 7-10 años de buen control metabólico tanto como el 15-25% de los pacientes muestran signos de aparición de nefropatía, 10-25% tienen síntomas de retinopatía y 15-20% muestran velocidad de conducción nerviosa retrasada lo que indica neuropatía. Con una duración más larga de la enfermedad la incidencia de complicaciones aumenta más.
El péptido C es una parte de la molécula de la proinsulina que, a su vez, es un precursor de la insulina formada en las células beta del páncreas. El péptido C humano es un péptido de 31 aminoácidos que tiene la secuencia siguiente:
EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ (Nº 1 de identificación de secuencia). Se ha sugerido en el documento de patente europea EP 132 769 que puede administrarse el péptido C en el tratamiento de la diabetes y en el documento SE 460334 que la insulina en combinación con el péptido C puede administrarse en el tratamiento de la diabetes y en la prevención de las complicaciones diabéticas.
En años recientes se ha hecho patente que la diabetes de tipo 1 está acompañada de actividad consistentemente reducida de la enzima Na^{+},K^{+}-ATPasa en varios tejidos, notablemente en el glomérulo renal, la retina, los nervios periféricos, el corazón y el músculo esquelético (3, 4, 5). La Na^{+}, K^{+}-ATPasa es una enzima que está localizada en la membrana celular y genera energía para el transporte transcelular de Na^{+} y K^{+} así como para todos los sustratos co- o contratransportados en todas las células de los mamíferos. Es así obvio que la actividad de esta enzima es de importancia fundamental en la función celular normal. La actividad deficiente de la Na^{+},K^{+}-ATPasa en el tejido nervioso, glomérulos y retina es probable que sea un factor contribuyente importante en la patogénesis de la neuropatía, nefropatía y retinopatía diabéticas. La actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa está regulada por la concentración de Na^{+} y por la acción hormonal; varias hormonas (la hormona tiroidea, la noradrenalina, la angiotensina, el neuropéptido Y, la insulina) estimulan o inhiben (la dopamina, ANF) la actividad de la enzima (6). A pesar del tratamiento con suficiente insulina para conseguir buen control glicémico, los pacientes con diabetes de tipo 1 muestran a largo plazo signos de actividad insuficiente de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa.
La presente invención está basada en el descubrimiento de un grupo de péptidos de la parte media y la parte C terminal de la molécula del péptido C que se caracterizan por una habilidad notoria para estimular la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa. Estos péptidos son todos fragmentos pequeños de la molécula del péptido C. El péptido C mismo es capaz de estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa por medio de la activación de una proteína G, un aumento en la concentración intracelular de Ca^{2+} y la activación de la proteína fosfatasa 2B 7. Sin embargo, los efectos estimuladores de los pequeños péptidos en la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa son similares a o mayores que el del péptido C mismo. Hay evidencia tanto in vitro como in vivo que indica que después de la administración de uno de estos péptidos junto con el tratamiento normal de insulina, se mejora la función renal, los signos tempranos de retinopatía retroceden y la función de los nervios somáticos y autonómicos mejora. El tratamiento con estos péptidos específicos, opcionalmente en combinación con la terapia convencional de insulina es así útil para prevenir o sustancialmente retrasar el desarrollo de las complicaciones tardías de la diabetes. Una ventaja potencial que los pequeños péptidos poseen en relación al péptido C es que pueden ser administrados oralmente en lugar de por inyección como es el caso del péptido C y de la insulina.
En un aspecto, la presente invención proporciona así un péptido que es un fragmento del péptido C de la insulina, dicho péptido comprende la secuencia ELGGGPGAG (Nº 2 de identificación de secuencia) (de aquí en adelante referido como "péptido A") o un fragmento del mismo, o la secuencia EGSLQ (Nº 3 de identificación de secuencia) (de aquí en adelante referido como "péptido E") o un fragmento del mismo, y tiene la habilidad de estimular la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa.
En una realización más particular, la presente invención proporciona un péptido que tiene la secuencia ELGGGPGAG (Nº 2 de identificación de secuencia) o EGSLQ (Nº 3 de identificación de secuencia) o un fragmento del mismo.
Especialmente, la invención proporciona dichos péptidos para uso en terapia y más particularmente para uso para combatir la diabetes y las complicaciones de la diabetes.
En otro aspecto la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de la invención o un fragmento del mismo como se ha definido aquí anteriormente, junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente.
Todavía un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso de un péptido de la invención, o un fragmento del mismo, como se ha definido aquí anteriormente, para la fabricación de un medicamento para combatir la diabetes o las complicaciones de la diabetes.
Como se usa aquí el término "combatir" incluye ambos, el tratamiento y la profilaxis.
La presente invención se refiere así al uso de los siguientes péptidos que son todos fragmentos del péptido C: péptido A (secuencia de aminoácidos ELGGGPGAG) (Nº 2 de identificación de secuencia) o componentes del mismo; por ejemplo el péptido B (ELGG) (Nº 4 de identificación de secuencia), el péptido C (ELGGGP) (Nº 5 de identificación de secuencia) o el péptido D (GGPGA) (Nº 6 de identificación de secuencia). Además, la invención incluye el péptido E (EGSLQ) (Nº 3 de identificación de secuencia) y partes del mismo, por ejemplo el péptido F (GSLQ) (Nº 7 de identificación de secuencia). Todos están destinados a la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 1.
Se ha probado que los fragmentos de la invención estimulan la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa en grado variable. Así, estudios que envuelven células de los túbulos renales en condiciones in vitro indican que los péptidos A-D estimulan la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa en un grado comparable al de la molécula de péptido C entera. Tanto como el 90% del efecto se consigue en 3 minutos. Además, los péptidos E y F poseen un efecto estimulante de la Na^{+},K^{+}-ATPasa de las células renales que es comparable a o mayor que el de la molécula entera. Combinaciones de los péptidos A-D con los péptidos E o F producen una estimulación de la actividad enzimática que es mayor que la obtenida por cada péptido solo. Para ejemplos detallados de los efectos estimulantes de los péptidos anteriores, véase el ejemplo 1, a continuación.
El péptido C muestra una unión específica con la superficie de varios tipos de células, notablemente células de los túbulos renales y fibroblastos. Cuando se incuba el péptido C con un marcaje fluorescente con células se une a la superficie de las células. La especificidad de la unión se ilustra con el hecho de que la preincubación con el péptido C sin marcaje previene la unión del péptido C con el marcaje fluorescente. Cuando se realizó la preincubación con los fragmentos de la invención, particularmente tanto con el fragmento E como con el F, se encontró que los fragmentos previnieron la unión del péptido C con el marcaje fluorescente, demostrando que los fragmentos se unen específicamente al mismo lugar de unión en la superficie de la célula que el péptido C mismo. Para un ejemplo detallado de la unión del Fragmento E véase el ejemplo 28, a continuación.
Como se ha mencionado anteriormente, se incluye dentro del alcance de la invención los péptidos que comprenden las secuencias de no sólo los péptidos A y E, sino también de sus fragmentos. En el caso del nonapéptido A, dichos fragmentos pueden ser de 8 a 2 aminoácidos de longitud. En el caso del pentapéptido E, dichos fragmentos pueden ser de 4 a 2 aminoácidos de longitud. Fragmentos de ejemplo B, C y D (para el péptido A) y F (para el péptido E) se han listado anteriormente, pero otros fragmentos se incluyen también.
En el caso del péptido A ciertos estudios de la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa, que estudian la habilidad de los fragmentos del péptido para estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa de los segmentos de túbulos renales de las ratas, han mostrado que uno o más de los restos centrales de triglicina pueden ser importantes, y los fragmentos de péptido preferidos, en cuanto se refiere al péptido A, incluyen así al menos uno, y más preferiblemente, al menos dos, de los restos de triglicina centrales. Así, además de los péptidos B, C y D mencionados anteriormente, ejemplos representativos de fragmentos de péptido incluyen GGGPGAG (Nº 8 de identificación de secuencia), GGGPG (Nº 9 de identificación de secuencia), GGGP (Nº 10 de identificación de secuencia), GGP y GGPG (Nº 11 de identificación de secuencia).
Además, se ha encontrado que los péptidos que contienen los isómeros D-aminoácidos no naturales pueden ser también activos, incluyendo por ejemplo el dipéptido D-LG o D,L-LG. Así, se incluye dentro del alcance de la invención isómeros "no naturales" de las secuencias de los L-aminoácidos "naturales" del péptido C. En cuanto al péptido A se refiere, se cree que la presencia de al menos uno (si es un D-péptido) o dos (si es un L-péptido) de los restos triglicina centrales puede ser importante en un segmento de péptido de 9 aminoácidos o menos.
En el caso del péptido E, ejemplos representativos de fragmentos incluyen no sólo el tetrapéptido, péptido F, sino también SLQ y LQ. Se cree que el resto C terminal Q es importante. De la misma forma, isómeros o derivados no naturales de los péptidos por ejemplo péptidos que incluyen D-aminoácidos están incluidos dentro del alcance de la invención.
La invención abarca péptidos que comprenden las secuencias de péptidos A y E. Así, están también incluidos en el alcance de la invención los péptidos que tienen extensiones N terminales y/o C terminales, o secuencias laterales, en las secuencias de los péptidos A y C. Dichos péptidos pueden incluir aminoácidos adicionales que pueden ser tanto aquellos que se proporcionan en la posición correspondiente en el péptido C de la insulina natural humana como otros aminoácidos (excluyendo por descontado la posibilidad de reconstituir el péptido C entero de la insulina). La longitud de dichos péptidos "extendidos" puede variar, pero preferiblemente los péptidos de la invención son de no más de 25 o 20, especialmente preferiblemente no más de 15 o 10 aminoácidos de longitud. Péptidos de ejemplo incluyen octa, hepta y hexapéptidos incluyendo la secuencia del péptido E, por ejemplo LALEGSLQ (Nº 12 de identificación de secuencia), ALEGSLQ (Nº 13 de identificación de secuencia) y LEGSLQ (Nº 14 de identificación de secuencia).
Los péptidos de la invención pueden usarse en el tratamiento de la diabetes y de las complicaciones de la diabetes, lo más notable la diabetes tipo 1 y sus complicaciones. Como se usa aquí el término "complicaciones de la diabetes" incluye así todas las complicaciones que se sabe en la técnica que están asociadas a varias formas de diabetes. Mientras que no deseamos estar confinados por ninguna teoría, se cree que la utilidad de los péptidos, como se ha explicado anteriormente, está unida a su habilidad para estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa. Un aspecto adicional de la invención incluye así los péptidos para uso en la estimulación de la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa en un sujeto, y su uso en la preparación de medicamentos para uso en la estimulación de la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa en un sujeto.
La actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa puede ensayarse fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica y descritas en la bibliografía y así puede fácilmente determinarse el efecto de los péptidos en la estimulación de la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa (por ejemplo, véase la referencia 7).
Así, los péptidos pueden usarse en la fabricación de un medicamento para la estimulación de la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa, para tratar a pacientes de diabetes tipo 1 con retinopatía, para tratar a pacientes de diabetes tipo 1 con nefropatía, para tratar a pacientes de diabetes tipo 1 con neuropatía, y para retrasar el desarrollo de complicaciones diabéticas tardías. El medicamento puede comprender insulina. La invención se refiere también al método para el tratamiento o prevención de las indicaciones dadas anteriormente.
Los péptidos de la invención pueden usarse solos o en combinación y así puede prepararse una composición farmacéutica o medicamento que comprende uno o más de los péptidos. Como se mencionó anteriormente, se ha observado una sinergia entre el péptido A o los péptidos basados en o derivados del péptido A (el "grupo del péptido A") y el péptido E o los péptidos basados en o derivados del péptido E (el "grupo del péptido E"). Así, las combinaciones sinérgicas de un péptido del grupo del péptido A, con un péptido del grupo del péptido E representan una realización preferida de la invención.
Los péptidos pueden también usarse en combinación o conjunción con otros agentes activos o eficaces para tratar la diabetes y/o sus complicaciones. Dichos otros agentes activos incluyen por ejemplo la insulina. En dichas terapias de "combinación" el péptido(s) y el segundo agente activo pueden administrarse juntos en la misma composición o separadamente en composiciones separadas, simultáneamente o secuencialmente.
Un aspecto adicional de la invención proporciona así un producto que contiene un péptido de la invención, o un fragmento del mismo, como se ha definido aquí anteriormente junto con un agente activo adicional eficaz para combatir la diabetes o las complicaciones de la diabetes, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial para combatir la diabetes y/o las complicaciones de la diabetes. Preferiblemente dicho agente activo adicional es la insulina.
En dichas terapias combinadas, donde se usa la insulina, debe entenderse que el término "insulina" incluye todas las formas, tipos y derivados de la insulina que puedan usarse en terapia por ejemplo variantes sintéticas, modificadas o truncadas de la secuencia activa de la insulina humana.
Las composiciones de la invención pueden administrarse oralmente o parenteralmente por la ruta subcutánea, intramuscular o intravenosa. Las composiciones de esta invención comprenden fragmentos/péptidos activos de la molécula del péptido C (o sea los péptidos A-F), junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para esto y opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos, por ejemplo insulina humana. La cantidad total de ingredientes activos en la composición varía de 99,99 a 0,01 por ciento en peso. El vehículo debe ser aceptable en el sentido de que sea compatible con otros componentes de la composición y no sea nocivo para el usuario de la misma.
Las composiciones pueden formularse según técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica y ampliamente descritos en la bibliografía, y pueden comprender cualquiera de los vehículos, diluyentes o excipientes conocidos. Así, por ejemplo, las composiciones de esta invención adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente soluciones acuosas estériles y/o suspensiones de los ingredientes farmacéuticamente activos (por ejemplo los péptidos A-F) preferiblemente hechas isotónicas con la sangre del usuario, generalmente usando cloruro sódico, glicerina, glucosa, manitol, sorbitol y similares. Además, las composiciones pueden contener cualquiera de un número de adyuvantes tales como tampones, preservantes, agentes dispersantes, agentes que promueven un comienzo rápido de la acción o una duración prolongada de la acción y similares.
Las composiciones de esta invención adecuadas para la administración oral pueden, por ejemplo, comprender fragmentos/péptidos activos de la molécula del péptido C (por ejemplo, los péptidos A-F) en forma de polvo base estéril purificado preferiblemente cubierto con una cubierta o cubiertas (cápsulas entéricas) que lo protegen de la degradación (descarboxilación o hidrólisis) de los péptidos activos en el estómago y de esta forma haciendo posible la absorción bucal de estas sustancias o en el intestino delgado. La(s) cubierta(s) puede(n) contener cualquiera de un número de adyuvantes tales como tampones, agentes preservantes, agentes que promocionan liberación prolongada o rápida proporcionando una biodisponibilidad óptima de las composiciones de esta invención, y similares.
Además, la presente invención se refiere a compuestos no peptídicos que muestran los mismos efectos estimulantes mostrados por sus duplicados derivados del péptido C. Dichos peptidomiméticos o "pequeñas moléculas" capaces de imitar la actividad de las proteínas o péptidos naturales son probablemente más adecuados para por ejemplo administración oral debido a su mayor estabilidad química (8, 9).
Es ahora usual en la técnica el reemplazar agentes activos basados en péptidos o proteínas o sea péptidos terapéuticos con dichos peptidomiméticos que tienen actividad funcionalmente equivalente. Existen varias bibliotecas moleculares y técnicas de química combinatoria y pueden usarse para facilitar la identificación, selección y/o síntesis de dichos compuestos usando técnicas estándares (10). Dichas técnicas estándares pueden usarse para obtener los compuestos peptidomiméticos según la presente invención, a saber compuestos orgánicos peptidomiméticos que muestran una activación sustancialmente similar o igual de la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa y/o características similares de unión celular a los péptidos de la invención, por ejemplo como se describe aquí en los ejemplos.
Un aspecto adicional de la invención proporciona así un compuesto orgánico biomimético basado en los péptidos de la invención, caracterizado porque dicho compuesto muestra la activación de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa y/o las características de unión celular a las células de los túbulos renales y fibroblastos a al menos el nivel mostrado por los péptidos y fragmentos de péptido de la invención como se ha definido aquí anteriormente.
La invención se describirá ahora en más detalle con los siguientes ejemplos no limitativos que muestran, entre otros, los efectos estimulantes de péptidos específicos en la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa, y la unión celular con referencia al dibujo en el que:
La Figura 1 muestra un cromatograma de una purificación preparativa en fase reversa del péptido C humano marcado con tetrametilrodamina. La columna se eluyó con un gradiente de acetonitrilo de 20 a 40% (acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA)) durante 20 minutos. El pico A corresponde a una fracción que no ha reaccionado del péptido C. Los picos B y C corresponden al péptido C marcado con tetrametilrodamina. La separación de los picos B y C corresponde a la presencia de dos isómeros de la tetrametilrodamina en el reactivo activado. Se usó el material del pico C en los estudios adicionales. La línea sólida corresponde a la absortividad a 220 nm (péptido) y la línea interrumpida a la absortividad a 555 nm (tetrametilrodamina).
Ejemplo 1
Se examinó el efecto estimulante de los péptidos A-F en la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa de las células de los túbulos renales de la rata. Se prepararon túbulos aislados contorneados proximales de riñones de ratas por microdisección. Se incubaron los túbulos durante 30 minutos a temperatura ambiente con uno de los péptidos A-F o el péptido C 1 de rata. Se midió entonces la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa siguiendo la exposición de los túbulos al choque hipotónico e incubación durante 15 minutos en un medio que contenía P^{32}-ATP en presencia o ausencia de ouabaína.
Se estableció la actividad estimulante de 5-10^{-7} M del péptido C 1 de rata a 100%. Se obtuvieron con la misma concentración de péptidos A-F las siguientes actividades relativas:
Péptido A
88\pm3 por ciento
Péptido B
36\pm2 por ciento
Péptido C
46\pm3 por ciento
Péptido D
65\pm4 por ciento
Péptido E
110\pm3 por ciento
Péptido F
96\pm2 por ciento
Péptidos B + C
86\pm3 por ciento.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas específicas de esta invención se proporcionan en los ejemplos a continuación.
Ejemplo 2
Insulina humana: Péptido A solo o mezclado equimolecular con los péptidos B, C, D, E y F (1:4 sobre una base molar de 100 unidades M insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido A solo - 16,8 mg
m-Cresol - 25 mg
glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8 o una combinación con
Péptido A - 16,8 mg
Péptido B - 8,8 mg
Péptido C - 13,6 mg
Péptido D - 10 mg
Péptido E - 12,4 mg
Péptido F - 9,2 mg
m-Cresol - 25 mg
glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
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Ejemplo 3
Insulina humana: Péptido B (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido B - 8,8 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,7 - 7,8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Insulina humana: Péptido C (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido C - 13,6 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Insulina humana: Péptido D (1:5 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido D - 10,0 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
\newpage
\global\parskip0.860000\baselineskip
Ejemplo 6
Insulina humana: Péptido E (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido E - 12,4 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
Ejemplo 7
Insulina humana: Péptido E (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido F - 9,2 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
Ejemplo 8
Insulina humana: Péptido A solo o mezclado equimolecular con los fragmentos B, C, D, E y F (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido A - 4,2 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8
o una combinación con
Péptido A - 4,2 mg
Péptido B - 2,2 mg
Péptido C - 3,4 mg
Péptido D - 2,5 mg
Péptido E - 3,1 mg
Péptido F - 2,3 mg
m-Cresol - 25 mg
glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Insulina humana: Péptido B (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido B - 2,2 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
Ejemplo 10
Insulina humana: Péptido C (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido C - 3,4 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
Ejemplo 11
Insulina humana: Péptido D (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido D - 2,5 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
Ejemplo 12
Insulina humana: Péptido E (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido E - 3,1 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
Ejemplo 13
Insulina humana: Péptido F (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana (28 U/mg) - 1000 U
Péptido F - 2,3 mg
m-Cresol - 25 mg
Glicerol - 160 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,0 - 7,8.
Ejemplo 14
Insulina humana de zinc: Péptido A solo o mezclado equimolecular con los fragmentos B, C, D, E y F (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido A - 16,8 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4
o una combinación con
Péptido A - 16,8 mg
Péptido B - 8,8 mg
Péptido C - 13,6 mg
Péptido D - 10 mg
Péptido E - 12,4 mg
Péptido F - 9,2 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
\newpage
Ejemplo 15
Insulina humana de zinc: Péptido B (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido B - 8,8 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 16
Insulina humana de zinc: Péptido C (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido C - 13,6 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 17
Insulina humana de zinc: Péptido D (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido D - 10,0 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Ejemplo 18
Insulina humana de zinc: Péptido E (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido E - 12,4 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 19
Insulina humana de zinc: Péptido F (1:4 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por ml).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido F - 9,2 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 20
Insulina humana de zinc: Péptido A solo o mezclado equimolecular con los fragmentos B, C, D, E y F (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido A - 4,2 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
\global\parskip0.930000\baselineskip
o una combinación con
Péptido A - 4,2 mg
Péptido B - 2,2 mg
Péptido C - 3,4 mg
Péptido D - 2,5 mg
Péptido E - 3,1 mg
Péptido F - 2,3 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 21
Insulina humana de zinc: Péptido B (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido B - 2,2 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 22
Insulina humana de zinc: Péptido C (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido C - 3,4 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 23
Insulina humana de zinc: Péptido D (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido D - 2,5 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 24
Insulina humana de zinc: Péptido E (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido E - 3,1 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4.
Ejemplo 25
Insulina humana de zinc: Péptido F (1:1 sobre una base molar de 100 unidades (U) insulina por mililitro).
Para preparar 10 ml de la composición, mézclese
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(20 U/mg) - 1000 U
Insulina humana en modificación amorfa 300 U y en modificación cristalina 700 U
(28 U/mg) - 1000 U
Péptido F - 2,3 mg
Zinc - 1,3 mg
Cloruro sódico - 70 mg
Acetato sódico - 16 mg
Parahidroxibenzoato de metilo - 10 mg.
Agua y o ácido clorhídrico al 10% o hidróxido sódico al 10% suficiente para hacer un volumen de la composición de 10 ml y un pH final de 7,1 - 7,4
Ejemplo 26
Péptido A
Para preparar comprimidos sublinguales de cápsulas entéricas cada una conteniendo la composición equimolar a 100 U de insulina, mézclese
Péptido A - 0,42 mg
Lactosa - 30 mg.
y constituyentes en cantidad suficiente
o en combinación de péptido A: péptido B: péptido C: péptido D: péptido E: péptido F: (1:1:1:1:1:1 en bases molares)
Para preparar comprimidos sublinguales de cápsulas entéricas cada una conteniendo la composición equimolecular a 100 U de insulina, mézclese
Péptido A - 0,42 mg
Péptido B - 0,22 mg
Péptido C - 0,34 mg
Péptido D - 0,25 mg
Péptido E - 0,31 mg
Péptido F - 0,23 mg
Lactosa - 30 mg.
y constituyentes en cantidad suficiente
Ejemplo 27
Péptido A
Para preparar comprimidos sublinguales o cápsulas entéricas cada una conteniendo la composición equimolar a 400 U de insulina, mézclese
Péptido A - 1,67 mg
Lactosa - 30 mg
y constituyentes en cantidad suficiente
o en combinación de péptido A: péptido B: péptido C: péptido D: péptido E: péptido F: (1:1:1:1:1:1 en bases molares).
Para preparar comprimidos sublinguales o cápsulas entéricas cada una conteniendo la composición equimolecular a 400 U de insulina, mézclese
Péptido A - 1,68 mg
Péptido B - 0,88 mg
Péptido C - 1,36 mg
Péptido D - 1,0 mg
Péptido E - 1,24 mg
Péptido F - 0,92 mg
Lactosa - 30 mg
y constituyentes cantidad suficiente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 28
La unión específica del péptido E a la superficie de la célula se ilustra como sigue. Péptido C humano biosintético (Eli - Lilly, Inc., Indianápolis, USA) se marcó con tetrametilrodamina usando el reactivo activado éster de tetrametilrodamina de succinimidilo (FluoReporter® Kit de marcado de proteína, Artículo nº. F-6163; Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo a pH 8,3 (tampón de NaHCO_{3} 0,1 M) con un exceso estequiométrico de cinco veces del reactivo activado para el péptido C. El grupo tetrametilrodamina tiene la absorción/emisión máxima a 555/580 nm, respectivamente y se incorpora en el N terminal del péptido C. Los péptidos C marcados se purificaron por filtración de gel (eliminando la sal con 50 mM de tampón de fosfato, 0,1 M NaCl, pH 7,4) en una columna NAP - 5; Pharmacia Biotech Uppsala, Suecia) y a continuación por cromatografía de fase reversa preparativa (columna de 250 mm de Kromasil C8, diámetro 4,6 mm, tamaño de partícula 7 \mum, tamaño de poro 10 nm, Eka-Nobel, Surte, Suecia) usando un sistema de cromatografía de HPLC 1090 Hewlett Packard (Grenoble, Francia) (Fig. 1). El material eluido se ajustó inmediatamente a pH 8 con adición de amoniaco y a continuación se liofilizó.
Las células cultivadas humanas de los túbulos renales (túbulos contorneados proximales, PCT) se incubaron con el péptido C marcado con rodamina sintetizado como se describió anteriormente. Las células se prepararon de la parte sana de un riñón humano extraído quirúrgicamente debido a un hipernefroma. Se seccionó los 150 \mum externos de la corteza renal en un micrótomo y se incubaron en una solución de colagenasa (0,05%) a 37ºC durante 15 minutos. Una suspensión del tejido se centrifugó y lavó dos veces con una solución al 0,01% del inhibidor de tripsina de la soja (Gibco Laboratories, Grand Island, N. Y., USA) y un concentrado de fragmentos de PCT y células de PCT se colocó en portas de vidrio. Las células se cultivaron en medio de cultivo de Dulbecco Modified Eagle [DMEM, 20 mmol/l ácido sulfónico de 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetano (Hepes), 24 mmoles/l NaHCO_{3} 50.000 UI/l penicilina y 50 mg/l estreptomicina, PH 7,4] con 10% de suero bovino fetal (Gibco) en un incubador a 37ºC con 95% O_{2}, y 5% CO_{2}. Después de 28 horas en cultivo el medio se cambió a DMEM con 1% de suero fetal bovino. Las células se examinaron aproximadamente 18 - 36 horas después.
Se registró la interacción entre el péptido C y la superficie de la célula de las células de los túbulos utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia (11). Utilizando una concentración de péptido C de 5 nM se encontró 92% del péptido unido a la superficie celular dentro de un intervalo de 50 minutos. Por el contrario, cuando las células se preincubaron con 5 \muM de péptido E, el péptido C unido después de 50 minutos no fue más que 12%. Igualmente, cuando el péptido C se había unido a las células durante 50 minutos y el péptido E se añadió después, este originó la dislocación de una mayor proporción del péptido C de su lugar de unión dentro del intervalo de 4 horas; solamente el 14% permaneció unido. Condiciones similares se obtuvieron con el péptido F. Los resultados indican que los péptidos, en semejanza con el péptido C, se unen a un lugar de unión específico de la superficie celular.
Bibliografía
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11. R. Rigler. Journal of Biotechnology 1995, 41: 177-186.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Creative Peptides Sweden AB
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: c/o Wahren, Dahlbergsstigen 6
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Djursholm
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
DISTRITO POSTAL (ZIP): 18264
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: John Wahren
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Dahlbergsstigen 6
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Djursholm
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
DISTRITO POSTAL (ZIP): 18264
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Bo-Lennart Johansson
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Crusebjörnsvägen 5A
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Uttran
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
DISTRITO POSTAL (ZIP): 14763
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Hans Jörnvall
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Vallstigen 18
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Estocolmo
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
DISTRITO POSTAL (ZIP): 17246
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Hanna Dzieglewska
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Frank B. Dehn & Co., 179 Queen Victoria Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Inglaterra
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
DISTRITO POSTAL (ZIP): EC4V 4EL
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos C de insulina
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DEL MEDIO: Disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE LA SOLICITUD: SE 96035533.2
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE LA SOLICITUD: 27-SEP-1996
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro}
\sac{Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE DENTIFICACIÓN 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gly Ser Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Gly Gly Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Pro Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Pro Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Pro Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE Nº DE IDENTIFICACIÓN 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA. Nº DE IDENTIFICACIÓN 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Gly Ser Leu Gln}

Claims (15)

1. Una composición farmacéutica que comprende:
(a)
un péptido que es un fragmento del péptido C de la insulina humana, dicho péptido comprende la secuencia ELGGGPGAG (Nº 2 de identificación de secuencia) o un fragmento del mismo, o la secuencia EGSLQ (Nº 3 de identificación de secuencia) o un fragmento del mismo, y que tiene la habilidad de estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa, o
(b)
un péptido de hasta 10 aminoácidos de longitud que comprende la secuencia ELGGGPGAG (Nº 2 de identificación de secuencia) o un péptido de hasta 15 aminoácidos de longitud que comprende la secuencia EGSLQ (Nº 3 de identificación de secuencia) y que tiene la habilidad de estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa, o
(c)
un péptido que comprende la secuencia ELGGGPGAG (Nº 2 de identificación de secuencia) o EGSLQ (Nº 3 de identificación de secuencia) y una o dos secuencias de aminoácidos adicionales lateralmente al N y/o C terminal de las secuencias de Nº de identificación 2 o 3, siempre que cualquiera de dichas secuencias laterales no sea natural al péptido C de la insulina humana, dicho péptido tiene la habilidad de estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa
junto con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente.
2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde el péptido tiene la secuencia ELGGGPGAG (Nº 2 de identificación de secuencia) o EGSLQ (Nº 3 de identificación de secuencia), o un fragmento de los
mismos.
3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, en donde dicho fragmento se selecciona de: ELGG (Nº 4 de identificación de secuencia) (péptido B), ELGGGP (Nº 5 de identificación de secuencia) (péptido C), GGPGA (Nº 6 de identificación de secuencia) (péptido D) y GSLQ (Nº 7 de identificación de secuencia) (péptido F).
4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde el péptido tiene la secuencia LALEGSLQ (Nº 12 de identificación de secuencia), ALEGSLQ (Nº 13 de identificación de secuencia) o LEGSLQ (Nº 14 de identificación de secuencia).
5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho péptido o fragmento es de 2 a 25 aminoácidos de longitud.
6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 5, en donde dicho péptido o fragmento es de 2 a 9 aminoácidos de longitud.
7. Una composición farmacéutica como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además al menos un agente activo adicional eficaz para combatir la diabetes o las complicaciones de la diabetes.
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7, en donde dicho agente activo adicional es la insu-
lina.
9. Un péptido o fragmento como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso en terapia.
10. Un péptido o fragmento del mismo como se ha reivindicado en la reivindicación 9, para uso para combatir la diabetes y/o las complicaciones de la diabetes, o para estimular la actividad de la Na^{+}, K^{+}-ATPasa.
11. El uso de un péptido o fragmento del mismo como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento para combatir la diabetes y/o las complicaciones de la diabetes, o para estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa.
12. El uso según la reivindicación 11, que comprende además el uso de la insulina.
13. El uso según la reivindicación 11 o 12, en donde dicho medicamento se usa para tratar la diabetes tipo 1, opcionalmente con nefropatía, neuropatía o retinopatía o para retrasar el desarrollo de las complicaciones diabéticas tardías.
14. Un producto que contiene un péptido, o un fragmento del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, junto con al menos un agente activo adicional eficaz para combatir la diabetes o las complicaciones diabéticas como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial para combatir la diabetes y/o las complicaciones diabéticas.
15. Un péptido seleccionado de ELGGGPGAG (Nº 2 de identificación de secuencia), ELGG (Nº 4 de identificación de secuencia) (péptido B), ELGGGP (Nº 5 de identificación de secuencia) (péptido C), GGPGA (Nº 6 de identificación de secuencia) (péptido D), GGGPGAG (Nº 8 de identificación de secuencia), GGGPG (Nº 9 de identificación de secuencia), GGGP (Nº 10 de identificación de secuencia) o GGP y que tiene la habilidad de estimular la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa.
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