ES2300625T3 - Peptido paralizante de musaraña para uso en terapia neuromuscular. - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que comprende: i) la secuencia de aminoácidos DCSQDCAACS ILARPAELNT ETCILECEGK LSSNDTEGGL CKEFLHP SKV DLPR (SEQ ID NO:2); ii) un fragmento de 5-10, 10-15, 15-20 o 20-24 aminoácidos de SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante; o iii) una secuencia con al menos 90% de identidad con SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante.

Description

Péptido paralizante de musaraña para uso en terapia neuromuscular.

Referencia cruzada a una solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de los Estados Unidos Núm. 60/427.682, presentada el 18 de Noviembre de 2002, que se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad.

Campo de la invención

La invención se refiere a un péptido paralizante para la terapia neuromuscular y otros usos que requieren la interrupción de mecanismos neuromusculares.

Antecedentes de la invención

Las musarañas son un grupo muy antiguo de animales primitivos que se parecen muy fielmente a los protomamíferos. No están relacionadas estrechamente con los roedores que evolucionaron de diferentes grupos de animales. Según Dufton (1992), las especies venenosas de musaraña son: la musaraña de cola corta septentrional (Blarina brevicauda), el solenodonte Haitiano (Solenodon paradoxus), la musaraña acuática Europea (Neomys fodiens) y la musaraña mediterránea (Neomys anomalous). Otra musaraña venenosa es la musaraña de cola corta meridional (Blarina carolinensis). También se ha sugerido que el solenodonte Cubano (Apotogale cubanus) y la musaraña Americana (Sorex cinereus) podrían ser venenosas. La musaraña de cola corta septentrional (Blarina brevicauda) y sus especies estrechamente relacionadas utilizan un veneno paralizante en su saliva para paralizar insectos, otros invertebrados (lombrices, anélidos etc.), aves nidificantes y pequeños mamíferos que después almacena, vivos en su madriguera, para su futura ingesta (Martin 1981; George et al. 1986; Dufton 1992).

La literatura sobre el veneno de musaraña consiste generalmente en siete artículos de los años 40 y 50 y una tesis de MA de 1966 [Christenbury 1966]. Éstos se resumen en una revista [Dufton 1992]. Utilizando un precipitado en sulfato de amonio bruto de glándulas salivares de musaraña, Ellis y Krayer (1955) concluyeron que el agente activo era probablemente una proteína y, debido a su incapacidad para someterla a diálisis, una proteína grande. Una contribución principal del trabajo de Ellis y Krayer fue mostrar la actividad en gatos, perros, ratones, ratas, cobayas, y conejos. Christenbury [1966] demostró que la preparación de Ellis y Krayer detenía el consumo de oxígeno en porciones de riñón e hígado de ratón. Parece que la Solicitud de Patente Japonesa (JP 10-236963; 1998) describe un extracto alcohólico de glándulas salivares de dos especies de musaraña (Sorex unguiculatus y Sorex shinto saevus) como bloqueador del canal de calcio y su uso como hipotensor. La pureza es baja - el extracto incluye cualquier compuestos que pueda disolverse en etanol del 70%. No existe información referente a la molécula o las moléculas activas sensibles en la mezcla de compuestos desconocida.

Compendio de la invención

El compuesto paralizante de la saliva de la musaraña permaneció sin identificar hasta ahora. Los autores de la presente invención han aislado y purificado un compuesto paralizante que tiene la secuencia mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO:1) o la Figura 1B (SEQ ID NO:2). Los autores de la presente invención muestran adicionalmente que, si bien una fracción de elevado peso molecular es paralizante, la molécula activa no es una proteína grande sino, inesperadamente, un péptido pequeño unido a un complejo grande de muchas proteínas (Fig. 3, Calle 1). La invención se refiere a un péptido de bajo peso molecular (u opcionalmente una serie de péptidos relacionados), preferiblemente, aislado y purificado de glándulas salivares submaxilares de musarañas de una especie tal como Blarina como agente paralizante. Todo o parte del péptido o su pro-péptido de origen también se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante o síntesis de péptidos in vitro o in vivo. Este nuevo agente paralizante es útil como bloqueador neuromuscular.

Como se ha mencionado antes, el ingrediente activo es un péptido pequeño aislado en una combinación inusual e inesperada dentro de un complejo proteico grande. Los péptidos de la saliva de mamíferos conocidos (p. ej. el polipéptido intestinal vasoactivo y el péptido 1 de tipo glucagón [Pohl y Wank 1998]) no serían contaminantes puesto que son descartados con moléculas de bajo peso molecular, inactivas durante los protocolos de purificación. La preparación de la invención tiene una gran pureza y se puede extraer de una fuente subcelular inesperada.

Los autores de la presente invención han aislado y purificado nuevas proteínas a partir de glándulas salivares submaxilares de musarañas. De acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un péptido de saliva de musaraña aislado y purificado. En una realización específica, el péptido de saliva de musaraña aislado y purificado tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1A o 1B. La invención incluye métodos para aislar un compuesto paralizante de glándula salivar de musaraña o de saliva de musaraña venenosa, que comprende proporcionar la glándula o la saliva, aislar el compuesto paralizante de la glándula o la saliva y opcionalmente purificar el compuesto.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica o una composición cosmética que incluye el péptido aislado y purificado de saliva de musaraña, y el uso del péptido como sustancia farmacéutica, bloqueador neuromuscular o analgésico. La invención se refiere adicionalmente al uso del péptido aislado y purificado de saliva de musaraña para el tratamiento de la migraña, el dolor miofacial y de otros tipos, los temblores musculares, las enfermedades neuromusculares, la sudoración excesiva y las arrugas.

En concreto, la invención se refiere a un método para prevenir o tratar la migrañas, el dolor miofacial y de otros tipos, los temblores musculares, las enfermedades neuromusculares, y la sudoración excesiva en un mamífero que comprende administrar al mamífero un péptido aislado y purificado de saliva de musaraña, por ejemplo en una composición farmacéutica. El mamífero es preferiblemente un ser humano. La invención se refiere también a un método para proporcionar analgesia o bloqueo neuromuscular en un mamífero que comprende administrar a un mamífero una composición farmacéutica que incluye el péptido aislado y purificado de saliva de musaraña. La invención se refiere adicionalmente a un método para prevenir o reducir las arrugas en un mamífero que comprende administrar al mamífero el péptido aislado y purificado de saliva de musaraña, por ejemplo en una composición cosmética.

La invención se refiere también al uso del péptido aislado y purificado de saliva de musaraña para la preparación de anticuerpos, incluyendo anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales. Esta invención también se refiere a los anticuerpos producidos de este modo.

La invención se refiere adicionalmente a un método para determinar la potencia de un agente paralizante mediante la administración del agente paralizante a un gusano de la harina u otro insecto; determinar el tiempo hasta el comienzo de la parálisis y/o la duración de la parálisis; y donde el tiempo para el comienzo de la parálisis es inversamente proporcional a la fuerza del agente paralizante y la duración de la parálisis es proporcional a la fuerza del agente paralizante.

Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, no obstante, que la descripción detallada y los ejemplos específicos si bien indican las realizaciones preferidas de la invención se proporcionan únicamente a modo de ilustración, puesto que resultarán evidentes diferentes cambios y modificaciones en el espíritu y el alcance de la invención para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos en los que:

Fig. 1. Secuencias de aminoácidos de proteína de saliva de musaraña aislada y purificada: A. (SEQ ID NO:1); B. (SEQ ID NO:2)

Fig. 2. Cromatografía de exclusión por tamaños de extracto de glándula submaxilar de musaraña con fracciones bioactivas indicadas mediante sombreado.

Fig 3. Análisis SDS-PAGE de extracto de glándula submaxilar de musaraña. El componente activo pequeño existe como parte de un complejo de peso molecular muy alto.

Fig. 4. Primer perfil de elución de HPLC de la fracción activa.

Fig. 5. Segundo perfil de elución de HPLC de la fracción activa.

Fig. 6. Gel de SDS-PAGE de saliva bucal y producto homogeneizado submaxilar con las glicoproteínas teñidas.

Fig. 7. Tinción de Coomassie de gel de SDS-PAGE de saliva bucal y de producto homogeneizado submaxilar.

Fig. 8. Electroforetograma capilar del péptido aislado y purificado de saliva de musaraña en tampón borato de sodio.

Fig. 9. Electroforetograma capilar del péptido aislado y purificado de saliva de musaraña.

Fig. 10. Espectro ultra-violeta del péptido aislado y purificado de saliva de musaraña.

Fig. 11. Espectro de masas MALDI-TOF del péptido aislado y purificado de saliva de musaraña.

Fig. 12. Mapeo de masas peptídico de los péptidos trípticos del péptido de saliva de musaraña aislado y purificado.

Fig. 13. Resultados de la búsqueda MASCOT de los datos de MS/MS a partir del análisis HPLC-ESI-Q-TOF.

Fig. 14. Gusanos de la harina inmediatamente post-inyección y con parálisis total.

Descripción detallada de la invención

La invención implica el aislamiento y la purificación de un agente paralizante peptídico de glándula salivar o saliva de musaraña (denominado "péptido PS" o soricidina). El péptido tiene preferiblemente 54 aminoácidos y la secuencia mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO:1) o 1B (SEQ ID NO:2). El péptido se puede aislar de cualquier musaraña que tenga actividad paralizante en su saliva, tales como las especies de musaraña Blarina, Neomys y Sorex. La invención también incluye un bioanálisis que utiliza el gusano de la harina común u otro insecto para la evaluación rápida de la bioactividad paralizante. Por ejemplo, el bioanálisis muestra que la saliva paralizante administrada al gusano de la harina puede mantenerlo paralizado pero vivo durante al menos 7 días. La toxina es muy potente; en estudios de dosis-respuesta una inyección de 10 microlitros de extractos de glándula bruta al 20% (p/v) produce parálisis total en menos de 1 segundo mientras que al 10% requiere 10 segundos para la parálisis total. La muestra de 10 microlitros representó aproximadamente 8 microgramos de proteína extraída soluble total (0,8 mg/mL de extracto, 0,010 mL de éste inyectado = 0,008 mg = 8 microgramos de proteína soluble total). De esto, el péptido representa (según se evaluó a partir de la densidad de coloración del gel) aproximadamente 1/10 de la proteína en el extracto total (calle más a la derecha de la imagen del gel). De este modo, el péptido real inyectado representa aproximadamente 0,8 microgramos de material u 800 nanogramos. Utilizando el bioanálisis y diferentes métodos cromatográficos los autores de la invención aislaron uno o varios péptidos con un peso molecular de aproximadamente 6000 (SDS-PAGE) que muestran actividad paralizante. Inesperadamente, el componente activo pequeño existe como parte de un complejo multiproteico de peso molecular muy alto (Fig. 2; Fig. 3, calle 1) el peso molecular del complejo fue de aproximadamente 600.000 daltons. Apareció en una fracción de volumen vacío de una columna de exclusión por tamaños (Sephadex G-200) que tiene un peso molecular de corte de 600.000 daltons. Después de la purificación, el complejo muestra una sola banda sobre el gel (Fig. 3 calle 2). La secuencia peptídica se obtiene fácilmente mediante técnicas conocidas, tales como la degradación secuencial de Edman normalizada (P. Edman y G. Begg. 1967. Eur. J. Biochem. 1: 80-91. H.D. Niall, 1973. Methods Enzymol. 27: 942-1010.) y determinación de la secuencia mediante espectroscopia de masas.

De este modo la invención incluye un método para aislar y secuenciar un péptido de musaraña paralizante aislando el péptido como se describe en esta solicitud y secuenciando el péptido. La secuencia del péptido de saliva de musaraña aislado y purificado se muestra en la Figura 1A (SEQ ID NO:1) o la Figura 1B (SEQ ID NO:2) y la invención incluye variantes de la secuencia como se describe en la presente memoria. Se utilizan dos métodos preferidos para aislar la proteína: i) cromatografía de exclusión por tamaños y de intercambio iónico y ii) centrifugación a través de membranas con distintos cortes de peso molecular: preferiblemente Centricones de Amicon con cortes de peso molecular de 100.000, 10.000 y 3.000, otros métodos son también útiles. El primer método permite la separación del agente activo que participa en el complejo (fracciones de peso molecular muy elevado) del que podría eluir normalmente un péptido libre de peso molecular 6.000 de la columna de cromatografía de exclusión por tamaños. En los protocolos cromatográficos de intercambio iónico se empleó un intercambiador aniónico de un tampón fosfato de sodio, pH neutro. El péptido se une fuertemente al complejo (el aumento de fuerza iónica no lo disocia) y preferiblemente se expone a tratamiento con dodecilsulfato de sodio (SDS) o con etanol acuoso para disociarlo del complejo. Se puede utilizar cualquier alcohol de cadena corta (preferiblemente C1 a C6, más preferiblemente C2 o C3) tal como alcohol isopropílico, propanol o butanol en lugar de etanol. Parece que el péptido bioactivo se mantiene formando complejo en la glándula salivar hasta que se libera como una forma activa en la saliva. El producto aislado peptídico es débilmente reactivo con reactivo de Clellands indicando la presencia de grupos sulfhidrilo y el aminoácido cisteína aunque es razonable esperar que estos existan en los enlaces disulfhidrilo. La preparación del péptido también mostró una absorbancia a 280 nm indicando la presencia de aminoácidos aromáticos. En concreto, la preparación del péptido mostró absorción débil a 280 nm, pero absorción más fuerte a 260 nm, indicando fenilalanina pero no tirosina ni triptófano. La Figura 14 muestra gusanos de la harina inmediatamente post-inyección y con parálisis total.

El péptido se puede modificar como se describe más abajo para producir variantes del péptido paralizante con diferente potencias paralizantes. Algunas variantes que serán desarrolladas mediante este procedimiento tendrán el potencial de comportarse como inhibidores competitivos (p. ej. antídotos) contra la parálisis desarrollada en respuesta al péptido de los autores de la presente invención.

Péptidos de la invención

La invención proporciona un péptido aislado PS. El término "péptido PS" según se utiliza en la presente memoria incluye los péptidos mostrados en la Figura 1A (SEQ ID NO:1) o la Figura 1B (SEQ ID NO:2), hómologos, análogos, miméticos, fragmentos o derivados del péptido PS.

En una realización, el péptido aislado PS consiste en 54 restos aminoácido y tiene la secuencia mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO:1) o la Figura 1B (SEQ ID NO:2). En otra realización, el péptido PS comprende secuencias sustancialmente idénticas a la de los péptidos observados antes o que comprende su equivalente químico obvio. También incluye secuencias peptídicas con más o menos aminoácidos en el extremo amino y/o carboxi de las secuencias del péptido PS observadas antes. En otra realización más, la invención incluye proteínas de fusión, que comprenden el péptido PS, péptidos PS marcados, sus análogos, hómologos y variantes.

En el contexto de la presente invención, un péptido de la invención puede incluir diferentes formas estructurales del péptido PS primario que conservan la actividad biológica. Por ejemplo, un péptido de la invención puede estar en forma de sales ácidas o alcalinas o en forma neutra. Además, los restos aminoácido individuales se pueden modificar mediante oxidación o reducción.

Además de la secuencia completa de aminoácidos, el péptido de la presente invención puede incluir también truncamientos, análogos y hómologos del péptido y sus truncamientos como se describe en la presente memoria. Los péptidos o fragmentos truncados pueden comprender péptidos de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos o más restos aminoácido de la secuencia enumerada antes. Los fragmentos útiles también incluyen, por ejemplo, 50-54, 45-50, 45-52, 44-55, 42-54, 40-54, 35-45 o 25-35 aminoácidos. Los fragmentos útiles son susceptibles de proporcionar analgesia o bloqueo neuromuscular. Los aminoácidos núms. 42-54, 40-54, 38-54 y 45-54 son ejemplos de fragmentos útiles.

La invención proporciona adicionalmente polipéptidos que comprenden al menos un dominio funcional o al menos un determinante antigénico de un péptido PS.

Los análogos de la proteína de la invención y/o sus truncamientos como se describe en la presente memoria, pueden incluir, pero no están limitados a una secuencia de aminoácidos que contiene una o más sustituciones, inserciones, deleciones y/o mutaciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser de una naturaleza conservativa o no conservativa. Las sustituciones de aminoácidos conservativas implican reemplazar uno o más aminoácidos de los péptidos de la invención por aminoácidos de características de carga, tamaño, y/o carácter hidrófobo similares. Cuando sólo se realizan sustituciones conservativas el análogo resultante debe ser funcionalmente equivalente. Las sustituciones no conservativas implican reemplazar uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos por uno o más aminoácidos que poseen características de carga, tamaño, y/o carácter hidrófobo distintas.

Se pueden introducir una o más inserciones de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de la invención. Las inserciones de aminoácidos pueden consistir en restos aminoácido sencillos o aminoácidos sucesivos que oscilan por ejemplo de 2 a 15 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, las inserciones de aminoácidos se pueden utilizar para destruir secuencias diana de manera que el péptido ya no sea activo. Este procedimiento se puede utilizar para inhibir la actividad del péptido de la invención.

Las deleciones pueden consistir en la eliminación de uno o más aminoácidos, o porciones discretas de la secuencia de aminoácidos del péptido PS. Los aminoácidos suprimidos pueden ser contiguos o no.

Los análogos de una proteína de la invención se pueden preparar introduciendo mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido. Las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas para la expresión de análogos de una proteína de la invención deben preservar el marco de lectura de las secuencias codificantes. Además, las mutaciones no crearán preferiblemente regiones complementarias que pudieran hibridar para producir estructuras secundarias de ARNm tales como bucles y horquillas, que podrían afectar adversamente a la traducción del ARNm.

Las mutaciones se pueden introducir en loci concretos sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que posibilitan la ligación a los fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución, o deleción de aminoácidos deseada.

Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis de sitio específico dirigida a oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tiene codones concretos alterados de acuerdo con la sustitución, deleción, o inserción requerida. La deleción o el truncamiento de un péptido de la invención se puede construir también utilizando sitios para endonucleasas de restricción convenientes adyacentes a la deleción deseada. Después de la restricción, se pueden rellenar los salientes, y religar el ADN. Los métodos ilustrativos para elaborar las alteraciones mostradas antes los describen Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Además, se pueden preparar los análogos de una proteína de la invención mediante síntesis química utilizando técnicas bien conocidas en la química de proteínas tales como síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) o síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart). Los péptidos de la invención también incluyen péptidos que tienen identidad de secuencia con el péptido PS, los péptidos PS mutados y/o sus truncamientos como se describe en la presente memoria. Tales péptidos tienen secuencias de aminoácidos que corresponden a secuencias de ácidos nucleicos que hibridan en condiciones de hibridación restrictivas (véase el comentario de las condiciones de hibridación restrictivas de la presente memoria) con una sonda utilizada para obtener un péptido de la invención. Los péptidos que tienen identidad de secuencia a menudo tendrán las regiones que son características de la proteína.

Los péptidos tienen preferiblemente una secuencia de aminoácidos con al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, preferiblemente 80-95% o más identidad con la secuencia de aminoácidos del péptido PS. El compuesto tiene opcionalmente pureza de grado farmacéutico (p. ej. para los aminoácidos, esto significa opcionalmente una pureza superior a 99%, que tiene una estructura cristalina uniforme, y color blanco). La identidad de secuencia se evalúa muy preferiblemente mediante la búsqueda avanzada del programa BLAST versión 2.1 (parámetros anteriores; Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403_410). BLAST son una serie de programas que están disponibles en línea en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. La búsqueda avanzada blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?
Jform=1) se ajusta a los parámetros por defecto. (esto es Matrix BLOSUM62; Coste de la existencia de espacios 11; Coste del espacio por resto 1; Razón de Lambda 0,85 por defecto).

La invención también contempla las isoformas de los péptidos de la invención. Una isoforma contiene el mismo número y clases de aminoácidos que un péptido de la invención, pero la isoforma tiene una estructura tridimensional diferente. Las isoformas contempladas por la presente invención son aquellas que tienen las mismas propiedades que el péptido de la invención como se describe en la presente memoria.

La presente invención también incluye una proteína de la invención conjugada con una proteína seleccionada, o una proteína marcadora seleccionable para producir proteínas de fusión. Por ejemplo, la secuencia de ADNc para el péptido PS se puede insertar en un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica otro péptido (p. ej. GST-glutation succinil transferasa). La proteína de fusión se expresa y recupera de células procarióticas (p. ej. bacterianas o baculovirus) o eucarióticas. La proteína de fusión se puede purificar después mediante cromatografía de afinidad basándose en la secuencia vectora de fusión y el péptido PS obtenido mediante escisión enzimática de la proteína de fusión.

Un método alternativo para producir la proteína es mediante el uso de una etiqueta de poli-histidina. La secuencia de ADNc se diseña para que tenga una etiqueta de poli-histidina en el extremo N-terminal. La proteína se expresa en células procarióticas o eucarióticas, y después se aísla fácilmente utilizando una columna de afinidad de níquel. La polihistidina (usualmente 6 histidinas) se adsorbe fuertemente al níquel unido a la columna de afinidad aunque nada más se una fuertemente. El péptido "etiquetado con his" se aísla lavando la columna con imidazol.

Las proteínas de la invención (incluyendo truncamientos, análogos, etc.) se pueden preparar utilizando métodos de ADN recombinante. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que tienen una secuencia que codifica un péptido de la invención se aíslan utilizando tecnologías conocidas y se incorporan de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica en un vector de expresión apropiado que asegura buena expresión del péptido. El ADNc se obtiene preferiblemente mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa mediante Transcriptasa Inversa (RT-PCR). La tecnología se presenta en forma de kit. Se aísla el ARN mensajero que codifica el péptido y después se utiliza la transcriptasa inversa para convertir todos los mensajeros de un extracto de tejido en copias de ADNc. Después se amplifica el ADN clonado mediante PCR normalizada utilizando un cebador sintetizado para emparejar un segmento del péptido. La técnica RACE es útil para obtener el transcrito de ARNm completo puesto que codifica una serie de péptidos que después se escinden luego de sintetizar una proteína más grande que contiene todos ellos. Los vectores de expresión incluyen pero no están limitados a cósmidos, plásmidos, o virus modificados (p. ej., retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados de replicación defectuosa), con tal que el vector sea compatible con la célula anfitriona utilizada. La expresión "vectores adecuados para la transformación de una célula anfitriona", significa que los vectores de expresión contiene una molécula de ácido nucleico de la invención y secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células anfitrionas que se van a utilizar para la expresión, que están conectadas operativamente a la molécula de ácido nucleico. "Conectado operativamente" significa que el ácido nucleico está conectado a secuencias reguladoras de manera que se permite la expresión del ácido nucleico.

La invención incluye por lo tanto un vector de expresión recombinante de la invención que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, o un fragmento de la misma, y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia peptídica insertada. Las secuencias reguladoras adecuadas están derivadas opcionalmente de una variedad de fuentes, incluyendo genes bacterianos, fúngicos, o virales (Por ejemplo, véanse las secuencias reguladoras descritas por Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). La selección de las secuencias reguladoras apropiadas depende de la célula anfitriona elegida, y la puede completar fácilmente un experto normal en la técnica. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen: un promotor y potenciador de la transcripción o secuencia de unión a la ARN-polimerasa, una secuencia de unión al ribosoma, incluyendo una señal de iniciación de la traducción. Adicionalmente, dependiendo de la célula anfitriona elegida y del vector empleado, se pueden incorporar al vector de expresión otras secuencias, tales como un origen de replicación, sitios de restricción de ADN adicionales, potenciadores, y secuencias que confieren inducibilidad. También se apreciará que las secuencias reguladoras necesarias pueden ser suministradas por el compuesto nativo y/o sus regiones limítrofes.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Estos vectores son sistemas experimentales útiles para estudiar los péptidos de la invención o sus variantes o para probar antídotos. Los péptidos pueden ser tóxicos o no para las células anfitrionas. También son útiles para producir grandes cantidades de péptido. Los vectores son particularmente útiles puesto que los agentes de liberación biológica específicos de insectos (p. ej. virus) proporcionarán agentes inmovilizadores para insectos buscados específicamente. Los virus dirigidos contra una plaga de insectos específica se diseñan para que contengan el fragmento génico que codifica el péptido paralizante junto con las secuencias reguladoras de la expresión. Los virus se dirigirían a especies de insectos y después, durante su reproducción, también producirían el péptido. Se pueden elegir secuencias reguladoras conectadas operativamente al ácido nucleico antisentido que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden contener también un gen marcador seleccionable que facilita la selección de las células anfitrionas transformadas o transfectadas con una molécula recombinante de la invención. Los ejemplos de los genes marcadores seleccionables son los genes que codifican una proteína tal como G418 e higromicina que confieren resistencia a algunos fármacos, \beta-galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa, o luciferasa de luciérnaga. La transcripción del gen marcador seleccionable se verifica por los cambios en la concentración de la proteína marcadora seleccionable tal como \beta-galactosidasa, cloramfenicol acetiltransferasa, o luciferasa de luciérnaga. Si el gen marcador seleccionable codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos tal como resistencia a la neomicina las células transformantes se pueden seleccionar con G418. Las células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán. Esto hace posible visualizar y someter a ensayo la expresión de los vectores de expresión recombinantes de la invención y en particular determinar el efecto de una mutación sobre la expresión y el fenotipo. Se apreciará que los marcadores seleccionables se pueden introducir en vectores separados de los ácidos nucleicos de interés.

Los vectores de expresión recombinantes también pueden contener genes que codifican un radical de fusión que proporciona un aumento de expresión de la proteína recombinante; un aumento de solubilidad de la proteína recombinante; y ayuda en la purificación de una proteína diana recombinante actuando como ligando en la purificación de afinidad. Por ejemplo, se puede añadir un sitio de escisión proteolítica a la proteína diana recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del radical de fusión subsiguiente a la purificación de la proteína de
fusión.

Los vectores de expresión recombinantes se pueden introducir en las células anfitrionas para producir una célula anfitriona transformada. Estas células son sistemas experimentales útiles. Por consiguiente, la invención incluye una célula anfitriona que comprende un vector de expresión recombinante de la invención. Se pretende que el término "célula anfitriona transformada" incluya células procarióticas y eucarióticas que han sido transformadas o transfectadas con un vector de expresión recombinante de la invención. Las células procarióticas se pueden transformar con un ácido nucleico, por ejemplo, mediante electroporación o transformación mediada por cloruro de calcio. El ácido nucleico se puede introducir en células de mamífero por medio de técnicas convencionales tales como precipitación simultánea con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, electroporación o microinyección. Los métodos adecuados para transformar y transfectar células anfitrionas se pueden encontrar en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989) de Sambrook et al., y otros libros de texto de laboratorio semejantes.

Las células anfitrionas adecuadas incluyen una amplia variedad de células anfitrionas procarióticas y eucarióticas. Por ejemplo, los péptidos de la invención se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtillus, células de insecto (utilizando baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Otras células anfitrionas adecuadas se pueden encontrar en Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991) de Goeddel.

Como ejemplo, para producir los péptidos PS de manera recombinante se puede utilizar, por ejemplo, E. coli utilizando el sistema ARN polimerasa/promotor de T7 utilizando dos plásmidos o marcando las proteínas codificadas por plásmidos, o mediante la expresión por infección con mGPI-2 del Fago M13. También se pueden utilizar vectores de E. coli con secuencias reguladoras del Fago lambda, mediante vectores con proteínas de fusión (p. ej. lacZ y trpE), mediante fusiones de proteína que se unen a maltosa, y mediante proteínas de fusión de glutation-S-transferasa.

Alternativamente, un péptido PS se puede expresar en células de insecto utilizando vectores baculovirales, o en células de mamífero utilizando virus vacunal. Para su expresión en células de mamífero, la secuencia de ADNc se puede ligar a promotores heterólogos e introducir en células, tales como células COS para lograr la expresión transitoria o a largo plazo. La integración estable del constructo génico quimérico se puede mantener en células de mamífero mediante selección bioquímica, tal como neomicina y ácido micofenólico.

La secuencia de ADN de PS se puede alterar utilizando procedimientos tales como digestión mediante enzimas de restricción, rellenado con ADN polimerasa, deleción mediante exonucleasa, extensión mediante desoxinucleótido transferasa terminal, ligación de secuencias de ADN clonadas o sintéticas, alteración de la secuencia dirigida al sitio con el uso de oligonucleótidos específicos junto con PCR. Por ejemplo, se pueden eliminar o mutar de uno a cinco o de cinco a diez aminoácidos o más.

La secuencia de ADNc o porciones de la misma, o un minigen que consiste en un ADNc con un intrón y su propio promotor, se introduce en vectores de expresión eucarióticos mediante técnicas convencionales. Estos vectores permiten la transcripción del ADNc en células eucarióticas proporcionando secuencias reguladoras que inician y potencian la transcripción del ADNc y aseguran su empalme y poliadenilación apropiados. También se puede utilizar el promotor del gen PS endógeno. Diferentes promotores dentro de los vectores tienen diferentes actividades que alteran el nivel de expresión del ADNc. Además, ciertos promotores pueden modular también una función tal como el promotor sensible a glucocorticoides del virus del tumor mamario de ratón.

Algunos de los vectores enumerados contienen marcadores seleccionables o genes neobacterianos que permiten el aislamiento de las células mediante selección química. Los vectores estables a largo plazo se pueden mantener en las células en forma de entidades episomales, que replican libremente utilizando elementos reguladores de virus. También se pueden producir líneas celulares que tienen integrado el vector en el ADN genómico. De esta manera, el producto génico se produce sobre una base continua.

Los vectores se introducen en células receptoras mediante diferentes métodos incluyendo fosfato de calcio, fosfato de estroncio, electroporación, lipofección, DEAE- dextrano, microinyección, o mediante fusión de protoplastos. Alternativamente, el ADNc se puede introducir mediante infección utilizando vectores virales.

Los péptidos PS también se pueden aislar de células o tejidos, incluyendo células o tejidos de mamífero, en los que el péptido se expresa normalmente.

La proteína se puede purificar mediante métodos de purificación convencionales conocidos por los expertos en la técnica, tales como métodos de cromatografía, métodos de cromatografía de líquidos de alta resolución o precipitación.

Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo anti-PS (como se describe más abajo) para aislar un péptido PS, que después se purifica mediante métodos normalizados.

Los péptidos de la invención se pueden preparar también mediante síntesis química utilizando técnicas bien conocidas en la química de proteínas tales como la síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) o síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart).

Miméticos de péptidos

La presente invención también incluye miméticos de péptidos de PS. Los "miméticos de péptidos" son estructuras que sirven como sustitutos de los péptidos en interacciones entre moléculas (Véase Morgan et al (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252 para una revisión). Los miméticos de péptidos incluyen estructuras sintéticas que contienen opcionalmente aminoácidos y/o enlaces peptídicos pero conservan las características estructurales y funcionales de un péptido, o potenciador o inhibidor de la invención. Los miméticos de péptidos también incluyen peptoides, oligopeptoides (Simon et al (1972) Proc. Natl. Acad, Sci USA 89:9367); y genotecas de péptidos que contienen péptidos de una longitud diseñada que representan todas las posibles secuencias de aminoácidos correspondientes a un péptido de la invención.

Los miméticos de péptidos se diseñan basándose en la información obtenida mediante la reposición sistemática de L-aminoácidos por D-aminoácidos, la reposición de cadenas laterales con grupos que tienen propiedades electrónicas diferentes, y mediante la reposición sistemática de enlaces peptídicos con reposiciones de enlaces amida. También se pueden introducir restricciones conformacionales locales para determinar los requerimientos conformacionales en cuanto a la actividad de un mimético de péptido candidato. Los miméticos pueden incluir enlaces amida isostéricos, o D-aminoácidos para estabilizar o promover conformaciones de giro inverso y para ayudar a estabilizar la molécula. Se pueden utilizar análogos de aminoácidos cíclicos para constreñir los restos aminoácido a estados conformacionales concretos. Los miméticos también pueden incluir imitaciones de las estructuras secundarias del péptido inhibidor. Estas estructuras pueden modelar la orientación tridimensional de los restos aminoácido a las conformaciones secundarias conocidas de las proteínas. También se pueden utilizar peptoides que son oligómeros de aminoácidos N-sustituidos y se pueden utilizar como motivos para la generación de genotecas diversas químicamente de las nuevas moléculas.

Los péptidos de la invención también son útiles para identificar compuestos líder para el desarrollo de fármacos. La estructura de los péptidos descritos en la presente memoria se puede determinar fácilmente mediante varios métodos tales como RMN y cristalografía de rayos X. Una comparación de las estructuras de los péptidos de secuencia similar, pero que difieren en las actividades biológicas que logran en las moléculas diana puede proporcionar información a cerca de la relación de estructura-actividad de la diana. La información obtenida para el examen de las relaciones de estructura-actividad se puede utilizar para diseñar péptidos modificados, u otras moléculas pequeñas o compuestos líder que se pueden someter a ensayo en cuanto a las propiedades pronosticadas por lo que se refiere a la molécula diana. La actividad de los compuestos líder se evalúa utilizando análisis similares a los descritos en la presente memoria. La información a cerca de las relaciones de estructura-actividad se obtiene a partir de estudios de cristalización simultánea. En estos estudios, se cristaliza un péptido con una actividad deseada asociado con una molécula diana, y se determina la estructura de rayos X del complejo. La estructura se compara después opcionalmente con la estructura de la molécula diana en su estado nativo, y la información de tal comparación es útil para diseñar compuestos que se espera que la posean.

Métodos terapéuticos y cosméticos

El agente paralizante es útil para el mercado de los trastornos neuromusculares incluyendo las aplicaciones cosméticas bien publicitadas de bloqueadores neuromusculares. (Para un estudio del uso de Botox para la inmovilización de músculos faciales y el tratamiento de las arrugas, véase: Fagien, S. 1999. Plast Reconstr Surg 103: 701-713; Carruthers, J, & Carruthers, A. 1998. Dermatol Surg 24: 1244-1247). Las aplicaciones terapéuticas de bloqueadores neuromusculares tales como el alivio de la migraña, el dolor miofacial y de otros tipos (esto es, actividad analgésica) se han añadido recientemente a los usos médicos existentes que incluyen los temblores musculares y las enfermedades neuromusculares. Están emergiendo constantemente nuevos usos incluyendo la aplicación cosmética de la reducción de arrugas y, más recientemente, el tratamiento de la sudoración excesiva (también denominada hiperhidrosis; Blaheta, HJ, Vollert, B, Zuder, D, y Rassner, G. 2002. Dermatol. Surg. 28:666-671; Naumann, M y Hamm, H. 2002. Br. J. Surg. 89: 259-261).

Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método para bloquear la actividad neuronal que comprende administrar una cantidad eficaz del péptido PS tal como el SEQ ID NO:1 o el SEQ ID NO:2 o los otros compuestos descritos en esta solicitud a un animal que lo necesite. La presente invención también proporciona el uso de una cantidad eficaz de un péptido PS como bloqueador neuromuscular. La presente invención proporciona adicionalmente el uso de una cantidad eficaz de un péptido PS en la fabricación de un medicamento para bloquear la actividad neuronal o proporcionar analgesia.

Otra realización de la invención proporciona un método para la curación de heridas que comprende administrar una cantidad eficaz del péptido PS a un animal que lo necesite. La presente invención proporciona adicionalmente el uso del péptido PS en la curación de heridas, por ejemplo proporcionando analgesia. Por ejemplo, los vendajes se pueden embeber con el péptido PS o se pueden aplicar geles que contienen el péptido PS al vendaje, para que se comporten como analgésico local, de larga duración a las heridas.

La frase "sustancia que puede bloquear la actividad neuromuscular" según se utiliza en la presente memoria incluye todos los péptidos de la invención descritos en la presente memoria que bloquean la actividad neuromuscular temporalmente o permanentemente, incluyendo pero no limitados a receptores del dolor (p. ej. un nociceptor, que es un órgano nervioso periférico o mecanismo para la recepción y transmisión de estímulos dolorosos o dañinos).

El término "cantidad eficaz" según se utiliza en la presente memoria significa una cantidad efectiva y a dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado (p. ej., bloqueo de la actividad neuromuscular).

El término "animal" según se utiliza en la presente memoria incluye todos los miembros del reino animal y es preferiblemente un mamífero, tal como un ser humano. La administración de un péptido o sustancia PS a un animal incluye las administraciones tanto in vivo como ex vivo.

El término "una célula" según se utiliza en la presente memoria incluye una sola célula así como una pluralidad o población de células. La administración de un péptido o sustancia PS a una célula incluye las administraciones tanto in vitro como in vivo.

La frase "bloquear la actividad neuromuscular" según se utiliza en la presente memoria significa que la sustancia puede dar como resultado el descenso de la actividad neuromuscular en comparación con la actividad neuromuscular en ausencia de la sustancia.

Bloquear la actividad neuromuscular es útil para un analgésico al tratar enfermedades tales como la migraña, los temblores, las enfermedades neuromusculares, la sudoración excesiva y las arrugas. Por consiguiente, en una realización específica, la presente invención se refiere a un método para tratar las enfermedades antedichas que comprende administrar una cantidad eficaz de una sustancia PS a un animal que lo necesite. La presente invención también proporciona el uso de una cantidad eficaz de una sustancia que puede bloquear la actividad neuromuscular o proporcionar analgesia. La presente invención proporciona adicionalmente el uso de una cantidad eficaz de una sustancia PS que puede inhibir la función neuromuscular para preparar un medicamento para tratar las enfermedades antedichas.

Según se utiliza en la presente memoria, y como es bien sabido en la técnica, "tratar" o "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no están limitados a, alivio o mejora de uno o más síntomas o condiciones, disminución del grado de enfermedad, estabilización de la enfermedad o trastorno (es decir no empeoramiento), prevención de la propagación de la enfermedad o trastorno, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad o trastorno, mejoría o paliación de la enfermedad o trastorno, y remisión (parcial o total), detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

Composiciones farmacéuticas y cosméticas

Los péptidos PS y los ácidos nucleicos que codifican los péptidos PS se formulan opcionalmente en una composición farmacéutica para la administración a sujetos en una forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo. Por "forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo" se significa una forma de la sustancia que se va a administrar en la que los efectos terapéuticos son preponderantes sobre cualquier efecto tóxico. Las sustancias se pueden administrar a organismos vivientes incluyendo seres humanos, y animales.

La administración de una cantidad terapéuticamente activa de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se define como una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de una sustancia puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo, y el peso del individuo, y la capacidad de la sustancia para lograr una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica.

El polipéptido de la invención se combina preferiblemente con otros componentes tales como un portador en una composición tal como una composición farmacéutica o una composición cosmética. Las composiciones son útiles cuando se administran en métodos de tratamiento médico, prevención, o diagnosis de una enfermedad, trastorno o estado físico anómalo. Por ejemplo, se puede administrar como bloqueador neuromuscular. Son útiles para el tratamiento de la migraña, el dolor miofacial y de otros tipos (función analgésica), los temblores musculares y las enfermedades neuromusculares, la sudoración excesiva y las arrugas. También son útiles para la curación de heridas mediante su acción como analgésico local.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a seres humanos o animales mediante una variedad de métodos incluyendo, pero no restringidos a la administración tópica, la administración oral, la administración en aerosol, la instilación intratraqueal, la inyección intraperitoneal, la inyección en el fluido cerebroespinal, la inyección intravenosa y la inyección subcutánea. Las dosificaciones que se van a administrar dependen de las necesidades del paciente, del efecto deseado y de la ruta de administración elegida. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden estar en un vendaje, que se utiliza para la curación de heridas actuando como analgésico. Las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos se pueden introducir en las células utilizando vehículos de liberación in vivo tales como liposomas. También se pueden introducir en estas células utilizando técnicas físicas tales como microinyección y electroporación o métodos químicos tales como precipitación simultánea o utilizando liposomas.

Las composiciones farmacéuticas se preparan mediante métodos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que se pueden administrar a los pacientes, y de manera que una cantidad eficaz de la molécula de ácido nucleico o polipéptido se combina en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA) o Handbook of Pharmaceutical Additives (recopilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995)). Basándose en esto, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias asociadas con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y pueden estar contenidas en soluciones tamponadas con un pH adecuado y/o ser iso-osmóticas con los fluidos fisiológicos. Con respecto a esto, se puede hacer referencia a la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.843.456.

Basándose en esto, las composiciones farmacéuticas incluyen opcionalmente un compuesto o sustancia activos, tales como un péptido o molécula de ácido nucleico, asociados con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y contenidos en soluciones tamponadas con un pH adecuado e iso-osmóticos con los fluidos fisiológicos. Los métodos para combinar las moléculas activas con los vehículos o combinarlas con diluyentes son bien conocidos por los expertos en la técnica. La composición incluye opcionalmente un agente localizador para el transporte del compuesto activo a los sitios especificados en el tejido.

Preparación de anticuerpos

Los anticuerpos contra el péptido son útiles para identificar receptores y encontrarán uso en el desarrollo de ensayos diagnósticos. Algunas condiciones neuromusculares resultan del funcionamiento defectuoso de la diana peptídica. La detección de las moléculas receptoras diana y la determinación de su densidad sobre la superficie de la célula, o su localización sobre la superficie de la célula es útil en los diagnósticos. Esto se puede realizar con el tratamiento con anticuerpos después de la administración del péptido y después de la detección secundaria de los complejos anticuerpo/péptido como en el protocolo ELISA general. Sería útil cualquier método de marcaje del péptido que pudiera informar sobre la densidad/localización del receptor (p. ej. péptido marcado radiactivamente o péptido etiquetado fluorescentemente). Una vez que el péptido y su receptor están caracterizados en cuanto a cómo se solicita el efecto, el péptido PS o sus variantes se utilizan para someter a ensayo cómo trabaja la diana en otros tejidos o animales o personas. Una variante o receptor/diana dañado contra el péptido PS o variante no actuaría de una manera que fuera idéntica a la diana caracterizada como "normal". La invención incluye un anticuerpo aislado inmunorreactivo con un polipéptido de la invención. Los anticuerpos se generan preferiblemente contra epítopos de la secuencia. El anticuerpo se puede marcar con un marcador detectable o no marcar. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. Tales anticuerpos se emplean para escrutar organismos. Los anticuerpos son valiosos también para la inmunopurificación de polipéptidos de extractos brutos. Por ejemplo, se puede poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico entre el anticuerpo y un polipéptido reconocido por el anticuerpo y la detección de la presencia o ausencia del complejo inmunológico con lo que se detecta la presencia del péptido de la invención o un péptido similar en la muestra. La invención también incluye composiciones que incluyen preferiblemente el anticuerpo, un medio adecuado para la formación de un complejo inmunológico entre el anticuerpo y un polipéptido reconocido por el anticuerpo y un reactivo capaz de detectar el complejo inmunológico para determinar la presencia del péptido de la invención o un polipéptido similar.

Para reconocer el péptido de la invención, se pueden generar anticuerpos contra un intervalo de epítopos únicos en toda la molécula.

Los anticuerpos monoclonales y policlonales se preparan de acuerdo con la descripción en esta solicitud y los mecanismos conocidos en la técnica. Para los ejemplos de los métodos de preparación y los usos de los anticuerpos monoclonales, véanse las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.688.681, 5.688.657, 5.683.693, 5.667.781, 5.665.356, 5.591.628, 5.510.241, 5.503.987, 5.501.988, 5.500.345 y 5.496.705 que se incorporan como referencia en su totalidad. Los ejemplos de la preparación y los usos de los anticuerpos policlonales se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.512.282, 4.828.985, 5.225.331 y 5.124.147 que se incorporan como referencia en su totalidad.

El término "anticuerpo" según se utiliza en la presente memoria incluye fragmentos del mismo que también reaccionan específicamente con un péptido PS o fragmentos del mismo. Los anticuerpos se pueden fragmentar utilizando técnicas convencionales y los fragmentos se pueden escrutar en cuanto a su utilidad de la misma manera que se ha descrito antes. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante se puede tratar para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'.

También se contempla que los derivados de anticuerpos quiméricos, es decir, moléculas de anticuerpos que combinan una región variable animal no humana y una región constante humana están dentro del alcance de la invención. Las moléculas de anticuerpos quiméricos incluyen, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo de un ratón, rata, u otra especie, con regiones constantes humanas. Los métodos convencionales son útiles para elaborar anticuerpos quiméricos que contienen la región variable de una inmunoglobulina que reconoce los antígenos contra el péptido PS de la invención (Véanse, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81,6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; Boss et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.397; Tanaguchi et al., Publicación de la Patente Europea EP171496; Publicación de la Patente Europea 0173494, Patente del Reino Unido GB 2177096B). Se espera que los anticuerpos quiméricos sean menos inmunogénicos en un sujeto humano que el anticuerpo no quimérico correspondiente.

Los anticuerpos monoclonales o quiméricos específicamente reactivos con una proteína de la invención como se describe en la presente memoria se pueden humanizar adicionalmente produciendo quimeras de la región constante humana, en las que partes de las regiones variables, particularmente las regiones marco conservadas del dominio de unión al antígeno, son de origen humano y sólo las regiones hipervariables son de origen no humano. Tales moléculas de inmunoglobulina se elaboran mediante mecanismos conocidos en la técnica, (p. ej., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)), y Publicación PCT WO92/06193 o EP 0239400). Los anticuerpos humanizados se pueden producir también comercialmente (Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretaña).

También se pueden generar anticuerpos específicos, o fragmentos de anticuerpos, tales como, pero no limitados a, anticuerpos monoclonales Fv de cadena sencilla reactivos contra los péptidos de la invención escrutando genotecas de expresión que codifican genes de inmunoglobulina, o porciones de los mismos, expresados en bacterias con péptidos producidos a partir de moléculas de ácido nucleico de los péptidos PS. Por ejemplo, se pueden expresar fragmentos Fab, regiones VH y regiones FV completos en bacterias utilizando genotecas de expresión en fagos (Véase por ejemplo Ward et al., Nature 341, 544-546: (1989); Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989); y McCafferty et al. Nature 348, 552-554 (1990)). Alternativamente, se puede utilizar un ratón SCID-hu, por ejemplo el modelo desarrollado por Genpharm, para producir anticuerpos o fragmentos de los mismos.

La invención también incluye métodos para utilizar los anticuerpos, tal como en la detección de receptores que se unen al péptido de la invención. Por ejemplo, la invención incluye un método para detectar la presencia de un péptido de la invención: a) poniendo en contacto una muestra que contiene uno o más péptidos con un anticuerpo de la invención en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo a los péptidos con los que es específicamente reactivo; b) separando los péptidos no unidos del anticuerpo; y c) detectando el anticuerpo que permanece unido a uno o más de los péptidos en la muestra.

Herramienta de investigación

El péptido y sus derivados son útiles en protocolos de investigación para explorar la unión neuromuscular y los canales iónicos. La capacidad para alterar selectivamente ciertos canales iónicos o clases de canales iónicos proporciona otra herramienta con la que perturbar la unión neuromuscular de una manera predecible. Esto identifica el papel de las dianas peptídicas susceptibles en las funciones y procesos neuromusculares.

Ejemplos

Los siguientes Ejemplos son realizaciones ilustrativas y no limitan en alcance de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento y purificación del péptido de saliva de musaraña de las glándulas salivares submaxilares de la musaraña (Blarina brevicauda) Tratamiento del tejido

Las glándulas submaxilares izquierda y derecha (que oscilaban entre 100 y 200 mg de peso total) se disecan y se colocan en nitrógeno líquido para someterlas a congelación instantánea. El tejido se tritura y se pulveriza en nitrógeno líquido. El polvo de tejido se transfiere rápidamente a un receptáculo pesado y se determina el peso del tejido transferido. El tejido se homogeneiza después en tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7,0 para proporcionar un producto homogeneizado al 20% en peso a volumen (2 g/100 mL). El producto homogeneizado se centrifuga a 12.000 x g a 4ºC durante 15 minutos para sedimentar los restos celulares. El sobrenadante se elimina.

Si las glándulas no se utilizan inmediatamente se someten a congelación instantánea en nitrógeno líquido y se almacenan a -80ºC o menos hasta su tratamiento.

Aislamiento del péptido

Los métodos para aislar y purificar la proteína de saliva de musaraña incluyen: i) cromatografía de exclusión por tamaños y de intercambio iónico (véase la Figura 2 y 3) y ii) centrifugación con distintos cortes de peso molecular: preferiblemente Centricones con cortes de peso molecular de 100.000, 10.000 y 3.000 de Amicon. El primer método permite la separación del agente activo que participa en el complejo (fracciones de peso molecular muy elevado) del que eluiría normalmente un péptido libre de peso molecular 6.000 de la columna de cromatografía de exclusión por tamaños. En los protocolos cromatográficos de intercambio iónico se empleó un intercambiador aniónico de un tampón fosfato de sodio, pH neutro. El péptido se une fuertemente al complejo (el aumento de fuerza iónica no lo disocia) y preferiblemente se expone a tratamiento con dodecilsulfato de sodio (SDS) o con etanol acuoso para disociarlo del complejo. Se puede utilizar cualquier alcohol de cadena corta (preferiblemente C1 a C6, más preferiblemente C2 o C3) tal como alcohol isopropílico, propanol o butanol en lugar de etanol. El calentamiento del extracto bruto a 40ºC durante 20 minutos aumenta la cantidad de péptido aislable. Parece que el péptido bioactivo se mantiene formando complejo en la glándula salivar hasta que se libera como una forma activa en la saliva. El producto aislado peptídico es débilmente reactivo con reactivo de Clellands indicando la presencia de grupos sulfhidrilo y el aminoácido cisteína aunque es razonable esperar que estos existan en los enlaces disulfhidrilo. La preparación del péptido también mostró una absorbancia débil a 280 nm y una absorbancia fuerte a 260 nm indicando la presencia de fenilalanina, pero no triptófano ni tirosina.

El método de exclusión por tamaños incluye también una etapa de precipitación de las proteínas solubles con acetona fría (-20ºC o -80ºC; acetona 10:1 v/v: producto homogeneizado), que también precipita las proteínas de peso molecular más alto. Esta etapa de precipitación con acetona se puede realizar antes o después del fraccionamiento por tamaños. El precipitado en acetona se seca al aire rápidamente y es activo durante un largo período de tiempo (Ellis S. y Krayer O. (1955) J Pharm Exper Therapeutics 114: 127-137). El precipitado (\sim50 mg) se disuelve en aproximadamente 1 mL de tampón fosfato de potasio 25 mM y se aísla mediante HPLC inmediatamente o se incuba primero a 40ºC antes del aislamiento mediante HPLC.

Aislamiento mediante cromatografía líquida de alta presión

Una manera de aislar el péptido una vez que el precipitado en acetona se vuelve a disolver es la HPLC en fase reversa. Se utilizan una columna Phenomenex Jupiter C-18, 250 x 4,6 mm, 5 \mu a 20-25ºC y una elución por gradiente de acetonitrilo al 10% (v/v):agua al 90% (v/v) a acetonitrilo al 60%:agua al 40% a lo largo de 30 minutos y una velocidad de flujo de 1,0 mL/min. Todos los disolventes contienen ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (v/v). Esto proporciona el perfil de elución mostrado en la Figura 4.

La fracción activa de este primer conjunto de HPLC es la del pico que eluye a aproximadamente 14,7 minutos. Este pico se recoge (Véase la Fig. 4, barra en el "eje del tiempo"). Esta sustancia se liofiliza durante la noche para eliminar los disolventes y el TFA.

El residuo que contiene el péptido principal de interés y de 2 a 3 proteínas minoritarias diferentes se disuelve en un volumen mínimo de tampón fosfato de potasio 25 mM. El péptido solubilizado se purifica bajo otro protocolo de HPLC. Se utilizan una columna Phenomenex Jupiter C-18, 250 x 4,6 mm, 5 \mu a 20-25ºC y una elución por gradiente de acetonitrilo al 10% (v/v):agua al 90% (v/v) a acetonitrilo al 60%:agua al 40% a lo largo de 40 minutos y una velocidad de flujo de 2,3 mL/min. Todos los disolventes contienen ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (v/v). Esto proporciona el perfil de elución mostrado en (Véase la HPLC Fig 02) con el péptido eluyendo a 13,76 min: el eluyente recogido mostrado por la barra densa en el "eje del tiempo" es el péptido puro. Esta sustancia se liofiliza eliminando los disolventes y el TFA. Esta sustancia es el péptido puro mediante HPLC (Figura 5), mediante SDS-PAGE (Figuras 6 y 7) y mediante CE (Figuras 8 y 9).

Electroforesis capilar

El péptido de saliva de musaraña purificado (disuelto en tampón fosfato de potasio 25 mM, pH 7,0) se sometió a electroforesis capilar utilizando un Sistema de Electroforesis Capilar Beckman Coulter P/ACE en una columna de sílice fusionada de 60 cm ((diámetro interno de 75 \mum, diámetro externo de 375 \mum) con tampón borato de sodio (1 Molar, tampón de electroforesis) con termostato a 25ºC. El régimen de voltaje fue una rampa de 0,17 minutos a 30.000 voltios durante 20 minutos a una polaridad normal. La presión de inyección fue de 3,44 kPa durante 10,0 segundos proporcionando un volumen de muestra de aproximadamente 5 nL (nanolitros)).

La Figura 8 muestra el electroforetograma del péptido purificado en el tampón y tenía un tiempo de elución de 2,67 minutos. La Figura 9 muestra una electroforesis idéntica a la del tampón fosfato de potasio 25 mM. Este pico mostró un espectro de uv idéntico al obtenido con un espectrofotómetro normalizado (véase más abajo).

Espectro electrónico

El péptido purificado se disolvió en fosfato de potasio 50 mM, pH 7,0 y se midió su espectro ultravioleta (Figura 10). El espectro no mostró absorción en el intervalo de 280 nm y en este caso indicó que los aminoácidos triptófano y tirosina no estuvieron presentes en el péptido. El hombro centrado a aproximadamente 260 nm indicó la presencia del aminoácido fenilalanina mientras que la baja absorción indicó sólo una pequeña cantidad del aminoácido presente en el péptido. La posterior secuenciación de los aminoácidos del péptido coincidió con esto puesto que no hubo triptófano ni tirosina y sólo se detectó un resto fenilalanina.

Modificación post-traduccional

Muchas proteínas salivares se modifican post-traduccionalmente mediante glicosilación pero el péptido de saliva de musaraña aislado y purificado no es una glicoproteína producida mediante tal procedimiento. El péptido de saliva de musaraña no tiene carbohidratos unidos covalentemente a su estructura.

SDS-PAGE

La Figura 6 muestra un gel de SDS-PAGE (acrilamida al 15%) tanto de saliva bucal (lavado bucal) como de producto homogeneizado sub-maxilar junto con patrones internos de una proteína no glicosilada y glicosilada. La Figura 7 muestra una tinción de proteína (Coomassie) después de completar la tinción para glúcidos y es el mismo gel que se ha vuelto a teñir con Coomassie. El péptido de saliva de musaraña aparece como el más móvil de los componentes proteináceos (la banda menos teñida, difusa) y no reaccionó positivamente a la tinción para glúcidos como lo hicieron otras proteínas en estos fluidos biológicos al peso molecular más alto.

Ejemplo 2 Secuencia de aminoácidos

El péptido purificado se sometió a secuenciación N-terminal utilizando la degradación secuencial de Edman (Figura 1B). Se utilizó espectroscopía de masas/espectroscopía de masas (ms/ms) para obtener los aminoácidos C-terminales (Figura 1A). Ambas secuencias son péptidos útiles.

Ión molecular del péptido purificado

La masa molecular del péptido de saliva de musaraña aislado y purificado (Bruker Reflex III, MALDI-TOF, modo Lineal, matriz HCCA, método bicapa) proporcionó un catión molecular (MH+) de 5805,8 Daltons y en ese caso una masa molecular (M) de 5804,8 Daltons. (Véase la Figura 11).

Mapa de masas del péptido sometido a digestión tríptica

La digestión tríptica seguida del mapeo del masas del péptido mediante MALDI-TOF proporcionó el espectrograma de masas presentado en la Figura 12. Este mapa de masas de digestión es absolutamente característico del péptido de saliva de musaraña aislado y purificado. No existen emparejamientos de este mapa de masas y la base de datos pública utilizando la búsqueda MASCOT (Figura 13) (Perkins et al. 1999. Electrophoresis, 20(18) 3551-3567).

Puntos isoeléctricos y masas teóricos

Se pueden calcular el punto isoeléctrico y la masa teóricos de la proteína de saliva de musaraña aislada y purificada. El punto isoeléctrico teórico es 4,60. Su masa teórica de 5754,51 Da, con una reducción de 6 unidades de masa debido a la formación de enlaces disulfuro sería de 5748,5 Da. El déficit de masas del ión molecular determinado mediante espectrometría de masas es (5804,8-5748,5) 56,3 Da, y puede representar 3 moléculas de agua completas (3 x 18 = 54). Si el resto histidina está protonado esto proporcionaría otra unidad de masa produciendo una discrepancia de masas de 1 unidad de masa.

Ejemplo 3 Bioanálisis

La invención incluye un bioanálisis que muestra que la saliva paralizante administrada al gusano de la harina puede mantenerlo vivo durante al menos 7 días. La Figura 14 muestra gusanos de la harina inmediatamente post-inyección y con parálisis total. También son útiles en el bioanálisis otros insectos.

Ejemplo 4 Toxicidad

La Tabla 1 muestra la toxicidad del extracto bruto general (10 microlitros por 100 mg de masa de gusano). La Tabla 2 muestra la toxicidad de la preparación durante el procedimiento de purificación (inyección de 5 microlitros por 100 miligramos de gusano).

Si bien la presente invención se ha descrito con referencia a los que se consideran actualmente los ejemplos preferidos, se debe entender que la invención no está limitada a los ejemplos descritos. Por el contrario, se pretende que la invención cubra diferentes modificaciones y adaptaciones equivalentes incluidas en el espíritu y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Estudios de toxicidad

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TABLA 1

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1

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TABLA 2

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2

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Referencias

Christenbury PA (1966) MA Thesis. A study of the ecology of Blarina brevicauda in North Carolina and of the effect of shrew toxin on the liver and kidneys of mice. Wake Forest College, Winston-Salem, NC, U.S.A.

Daisuke K & Kaoru Y (1997) Sagami Chemical Research Center, Japan Patent Office Publication Number 10-236963 (Date of publication of application: 08.09.1998)

Dufton M (1982) Pharmac. Ther. 53: 199-215

Ellis S & Krayer O (1955) J Pharm Exper Therapeutics 114: 127-137

Eng J (1993) USPTO Application No. 066480

George S et al. (1986) Am. Soc. Mammal. 261: 1-9

Martin I (1981) J. Mamm. 62: 189-192

Pohl M & Wank SA (1998) J Biol Chem 273: 9778-9784

<110> Stewart, John M.

\hskip1cm Steeves, Bradley J.

\hskip1cm Varness, Karl

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<120> Péptido paralízante para uso en terapia neuromuscular

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<130> 13119-5

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<140> PCT/CA03/01749

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<141> 18-11-2003

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<150> US60/427.682

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<151> 18-11-2002

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 54

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<212> PRT

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<213> Blarina brevicauda

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<400> 1

3

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<210> 2

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<211> 54

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<212> PRT

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<213> Blarina brevicauda

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<400> 2

4

Claims (31)

1. Un péptido aislado que comprende:

i)

la secuencia de aminoácidos DCSQDCAACS ILARPAELNT ETCILECEGK LSSNDTEGGL CKEFLHP SKV DLPR (SEQ ID NO:2);

ii)

un fragmento de 5-10, 10-15, 15-20 o 20-24 aminoácidos de SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante; o

iii)

una secuencia con al menos 90% de identidad con SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante.

2. El péptido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos DCSQDCAACS ILARPAELNT ETCILECEGK LSSNDTEGGL CKEFLHPSKV DLPR (SEQ ID NO:2).

3. El péptido de la reivindicación 1, que comprende un fragmento de 5-10, 10-15, 15-20 o 20-24 aminoácidos de SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante.

4. El péptido de la reivindicación 1, que comprende un fragmento de 10-15, 15-20 o 20-24 aminoácidos de SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante.

5. El péptido de la reivindicación 1, que comprende un fragmento de al menos 10 aminoácidos de SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante.

6. El péptido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia con al menos 90% de identidad con SEQ ID NO 2 que tiene actividad paralizante.

7. El péptido de la reivindicación 2, que es un péptido paralizante de musaraña aislado que comprende un peso molecular de aproximadamente 6000 Da medido mediante SDS-PAGE.

8. El péptido de la reivindicación 1, que incluye al menos un aminoácido cisteína que tiene un grupo sulfhidrilo.

9. El péptido de la reivindicación 8, que comprende al menos dos aminoácidos cisteína que tienen cada uno un grupo sulfhidrilo y forman un enlace disulfhidrilo.

10. El péptido de la reivindicación 9, que comprende seis aminoácidos cisteína que tienen cada uno un grupo sulfhidrilo y forman tres enlaces disulfhidrilo.

11. El péptido de la reivindicación 1, que tiene adicionalmente la propiedad de absorber luz a 280 nm y más fuerte a 260 nm y que incluye al menos un aminoácido aromático.

12. El péptido de la reivindicación 1, aislado de glándula submaxilar de musaraña y/o saliva de musaraña.

13. El péptido de la reivindicación 12, donde la glándula submaxilar de musaraña se aísla de Blarina brevicauda, Blarina carolinensis, Sorex unguiculatus, Sorex shinto saevu (Solenodon paradoxus), Neomys fodiens o Neomys anomalous.

14. El péptido de la reivindicación 12, donde i) una dosis de 10 microlitros de extracto bruto de glándula al 20% (p/v) inyectado a un gusano de la harina en un análisis in vitro causa parálisis en el gusano de la harina en menos de 1 segundo; y ii) una dosis de 10 microlitros de extracto bruto de glándula al 10% (p/v) inyectado a un gusano de la harina en un análisis in vitro causa parálisis en el gusano de la harina en menos de 10 segundos.

15. El péptido de la reivindicación 1, en una forma purificada.

16. El péptido de la reivindicación 1, purificado al menos en un 90%, 95% o 99%.

17. Una composición farmacéutica o composición cosmética que incluye el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16.

18. Un complejo multiproteico aislado y purificado que comprende el péptido de la reivindicación 1 y que tiene un peso molecular mayor o igual a 600.000 daltons.

19. Un método para disociar el péptido de la reivindicación 1 del complejo multiproteico de la reivindicación 18, que comprende poner en contacto el complejo multiproteico con docecilsulfato de sodio o alcohol acuoso.

20. El péptido de la reivindicación 1, para su uso como sustancia farmacéutica.

21. El péptido de la reivindicación 1, para su uso como bloqueador neuromuscular.

22. El péptido de la reivindicación 1, para su uso como analgésico.

23. El uso del péptido de la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la migraña, el dolor miofacial y de otros tipos, los temblores musculares, las enfermedades neuromusculares, la sudoración excesiva y las arrugas.

24. El péptido de la reivindicación 1, para su uso como analgésico para heridas.

25. El péptido de la reivindicación 1, para su uso como agente inmovilizador de insectos.

26. El uso del péptido de la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para bloquear la actividad neuronal o proporcionar analgesia.

27. El péptido de la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de las arrugas.

28. Un anticuerpo contra el péptido de la reivindicación 1.

29. Un método para determinar la potencia de un agente paralizante, que comprende administrar el agente paralizante a un gusano de la harina u otro insecto; determinar el tiempo hasta el comienzo de la parálisis y/o la duración de la parálisis; donde el tiempo para el comienzo de la parálisis es inversamente proporcional a la fuerza del agente paralizante y la duración de la parálisis es proporcional a la fuerza del agente paralizante.

30. Un ácido nucleico que codifica el péptido de la reivindicación 1.

31. El péptido de la reivindicación 16, purificado al menos en un 99%.