ES2247642T3

ES2247642T3 - Neuropeptidos procedentes del escorpion.

Info

Publication number: ES2247642T3
Application number: ES97950385T
Authority: ES
Inventors: Bruno Lebrun; Regine Romi-Lebrun; Hiroyuki Minakata; Terumi Nakajima; Junko Hashino
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1996-12-26
Filing date: 1997-12-25
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2017-12-25
Also published as: WO1998029446A1; CA2247328A1; EP0916681A4; US6689749B1; DE69734451T2; JP4212651B2; CA2247328C; EP0916681A1; ATE307829T1; EP0916681B1; DE69734451D1

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA UN PEPTIDO CAPAZ DE BLOQUEAR LOS CANALES DEL CALCIO (K + PASADOS POR TENSION, E INHIBIR LA PRODUCCION DE IL-2, Y QUE ESTA REPRESENTADO POR UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE: ALA - SER - CYS - ARG - THR - PRO - LYS - ASP - CYS - ALA - ASP PRO - CYS - ARG - LYS GLU - THR - GLY - SYS - PRO - TYR - GLY - LYS - CYS - MET - ASN ARG - LYS - CYS LYS CYS - ASN - ARG - CYS; EN LA QUE EL TERMINAL C ESTA AMIDADO, Y EN LA MOLECULA SE ENCUENTRAN PRESENTES CUATRO PUENTES DE DISULFURO, Y SUS PEPTIDOS RELACIONADOS, AISLADOS DE LA GLANDULA DEL VENENO DEL ESCORPION HETEROMETRUS SPINNIFER. LOS PEPTIDOS PROPORCIONADOS POR LA PRESENTE INVENCION SON NEUROPEPTIDOS QUE PUEDEN BLOQUEAR LOS CANALES DEL K + ENVIADO POR TENSION, INHIBIR LA PRODUCCION DE IL-2 A UNA CONCENTRACION SUMAMENTE BAJA Y, EN CONSECUENCIA, SE ESPERA QUE PUEDAN CONTRIBUIR A LA APLICACION DE TOXINAS DE ESCORPION A LAS MEDICINAS Y A OTROS PRODUCTOS.

Description

Neuropéptidos procedentes de escorpión.

Campo técnico

La invención se refiere a nuevos neuropéptidos, más específicamente péptidos relacionados con toxinas de escorpión que se obtienen a partir de la glándula venenosa de Heterometrus spinnifer, una especie de escorpión.

Antecedentes de la técnica

"Escorpión" es un término general para artrópodos pertenecientes a la clase Arachnida, el orden Scorpionida y aproximadamente 600 especies de escorpiones que existen actualmente en el mundo. Los escorpiones se han considerado generalmente como virulentamente venenosos; sin embargo, actualmente aquéllos que poseen toxinas fatales están limitados sólo a unas pocas especies, que incluyen Buthus ustralis (que vive en los desiertos de África), Centruroides exilicauda (nativo de México), y B. occitauda (nativo de Europa del Sur), etc. Hasta ahora, se han aislado diversos tipos de toxinas de escorpión (Dreyer, F., Rev. Physiol Biochem. Pharmacol., vol. 15, pp. 94-128, 1990), que están consideradas como neurotoxinas.

A partir de los estudios sobre propiedades farmacológicas de estas toxinas, se ha concentrado la atención en las acciones de las toxinas contra los canales K^{+}. Por ejemplo, se sabe que la margatoxina (MgTX) aislada de la glándula venenosa de Centruroides margaritatus (García-Calvo et al. J. Biol. Chem. vol. 268, pp. 18866, 18874, 1993) y la agitoxina 2 (AgTX2) aislada de la glándula venenosa de Leiurus quinquestriatus herbraes (García et al., Biochemistry, vol. 33, pp. 6834-6839, 1994) actúan como bloqueadores de los canales K^{+} con compuertas de voltaje. Estas toxinas son péptidos compuestos de 38 residuos de aminoácidos y que contienen tres puentes disulfuro de sus moléculas. Recientemente, se ha informado también de un péptido, la toxina 1 de Pandinus imperator (Pi1), que es un péptido que contiene cuatro puentes disulfuro en la molécula y compuesto de 35 residuos de aminoácidos (Olamendi-Portugal et al., Biochem. J. vol. 315, pp. 977-981, 1996).

Por otra parte, se ha considerado que la producción de interleuquina-2 (IL-2) por las células T requiere la afluencia de Ca^{2+} a las células T. Recientemente, se ha descubierto que K^{+}v1.3, que es un tipo de los canales K^{+}, está implicado en la afluencia de Ca^{2+} a las células T acompañada por activación de las células T (Leonard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 10094-1098, 1992). Adicionalmente, Lin et al. han informado que la inhibición de los canales K^{+}v1.3 suprime la afluencia de Ca^{2+} a las células T, la proliferación de las células T y la producción de IL-2 por las células T (J. Exp. Med., vol. 177, pp. 637-645, 1993).

En estas circunstancias, es de esperar que las toxinas de escorpión sean aplicables a medicamentos en vista de sus diversas actividades farmacológicas. Sin embargo, para aplicación a medicamentos, es necesario separar las actividades farmacológicas útiles de las toxinas de su toxicidad indeseable y, por consiguiente, se hace necesario aislar gran cantidad de toxinas de escorpión y clarificar la relación estructura-actividad de las mismas. En estas condiciones, el objeto de la presente invención es proporcionar nuevos péptidos afines a las toxinas de escorpión para contribución a la aplicación de las toxinas de escorpión a medicamentos.

Olamendi-Portugal et al. (Biochem. J. (1996) 315, 977-981) describen una nueva clase estructural de toxina bloqueadora de los canales K^{+} del escorpión Pandinus imperator. De acuerdo con estos autores, se ha purificado y caracterizado un nuevo péptido a partir del veneno del escorpión Pandinus imperator. El análisis de su estructura primaria revela que el mismo pertenece a una nueva clase estructural de péptido bloqueador de los canales K^{+}, compuesto de solo 35 aminoácidos, pero reticulado por cuatro puentes disulfuro.

Kharrat et al. (Eur. J. Biochem. 242, 491-498 (1996) describen la síntesis química y caracterización de maurotoxina, una toxina corta de escorpión con cuatro puentes disulfuro que actúa sobre los canales K^{+}. De acuerdo con estos autores, la maurotoxina es una toxina aislada del veneno del escorpión cactoide tunecino Scorpio maurus. Se trata de un péptido de 34 aminoácidos reticulado por cuatro puentes disulfuro.

Adicionalmente, la solicitud de patente internacional WO 95/03065 describe un péptido de 39 aminoácidos, Margatoxina (MgTX), que se purifica hasta homogeneidad a partir del veneno del escorpión Centruroides margaritatus. De acuerdo con este documento, MgTX es un inhibidor potente y selectivo de un canal K^{+} dependiente del voltaje presente en los linfocitos humanos, exhibe actividad inmunosupresora con los linfocitos T humanos, y es útil como inmunosupresor.

Exposición de la invención

Los inventores han realizado estudios intensos y extensos sobre el aislamiento de nuevos péptidos afines a las toxinas de escorpión de la glándula venenosa de un escorpión Heterometrus spinnifer, sobre la base de la capacidad para bloquear los canales K^{+} K^{+}v1.3 con compuertas de voltaje del cerebro de la rata (denominados también "RC K3") expresados en oocitos de Xenopus. Como resultado, los autores de la invención han alcanzado éxito en el aislamiento y la purificación de un nuevo péptido, denominado HsTX1, representado por SEQ ID NO: 1, en el cual están presentes en la molécula cuatro puentes disulfuro. Los inventores han alcanzado éxito también en la determinación de las estructuras primaria y de orden superior de HsTX1. Se ha encontrado que HsTX1 exhibe una capacidad mucho más fuerte para bloquear los canales K^{+} en comparación con las toxinas de escorpión consignadas previamente e inhibe la producción de IL-2 por las células T de la sangre periférica humana. De este modo se ha culminado la invención.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un péptido representado por una secuencia de aminoácidos:

100

en la cual están presentes en la molécula 0 a 4 puentes disulfuro seleccionados del grupo constituido por Cys^{3}-Cys^{24}, Cys^{9}-Cys^{29}, Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{19}-Cys^{34} y el terminal C puede estar amidado, como bloqueador de los canales K^{+} con compuertas de voltaje o un inhibidor de la producción de IL-2.

En una realización muy preferida, la presente invención proporciona un péptido representado por la secuencia de aminoácidos anterior en la cual el terminal C está amidado y están presentes en la molécula cuatro puentes disulfuro, Cys^{3}-Cys^{24}, Cys^{9}-Cys^{29}, Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{19}-Cys^{34}.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 es un gráfico que ilustra la actividad bloqueadora de los péptidos de acuerdo con la invención sobre los canales K^{+}v1.3 de la rata, dependiendo de la concentración de los péptidos; en el cual el círculo vacío (\medcirc) indica los datos para HsTX1 natural, el cuadrado lleno (\sqbullet) indica los datos para HsTX1 sintético, y el triángulo lleno (\blacktriangle) indica los datos para HsTX1-COOH que tiene el terminal C de -COOH.

Fig. 2 es un gráfico que ilustra la acción inhibidora de HsTX1 sobre la producción de IL-2 por las células T de sangre periférica humana estimuladas con PMA y ionomicina, dependiendo de la concentración de HsTX1.

Modo óptimo de realización de la invención

Los péptidos de la presente invención pueden obtenerse por extirpación de la glándula venenosa de un escorpión que contiene el péptido de la presente invención, tal como Heterometrus spinnifer, sometiendo la misma a extracción con, por ejemplo, aproximadamente 0,5 M de ácido acético para dar un extracto bruto del péptido, seguido por aislamiento y purificación del péptido a partir del extracto bruto por una técnica convencional tal como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía en fase inversa.

En cuanto a HsTX1, que es un péptido existente naturalmente y uno de los péptidos de la presente invención, se aprecia claramente que el terminal C está amidado y están presentes cuatro puentes disulfuro en la molécula, teniendo en cuenta lo siguiente:

(1) el análisis de la secuencia de aminoácidos del péptido reveló la presencia de ocho residuos Cys en la molécula;

(2) la espectrometría de masas del péptido reveló que el péptido se encuentra en forma de monómero; y

(3) la concordancia satisfactoria entre el peso molecular del péptido determinado experimentalmente y el peso molecular del péptido calculado partiendo de la suposición de que el terminal C está amidado y están presentes en la molécula cuatro puentes disulfuro.

En los péptidos de la presente invención, el número de puentes disulfuro no está limitado particularmente. Entre los péptidos de la presente invención, se encontró que el existente naturalmente contiene cuatro puentes disulfuro en la posición Cys^{3}-Cys^{24}, Cys^{9}-Cys^{29}, Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{19}-Cys^{34}, como se aprecia claramente por los ejemplos mencionados más adelante. Este péptido natural puede obtenerse también introduciendo aleatoriamente cuatro puentes disulfuro en un péptido que no contiene ningún puente disulfuro, seguido por escrutinio y purificación de un péptido que tiene la misma estructura que la del péptido natural.

Un péptido que no contiene ningún puente disulfuro puede sintetizarse convenientemente por un método en fase sólida utilizando un sintetizador de péptidos convencional (v.g., el sintetizador de péptidos 433A, disponible de Applied Biosystems). Los puentes disulfuro pueden introducirse en la molécula del péptido por una reacción de oxidación tal como oxidación por exposición al aire o con ferricianuro de potasio (Hope et al., J. Biol. Chem., vol. 237, pp. 1563-1566, 1962). El escrutinio y la purificación del péptido idéntico al péptido natural a partir de los péptidos introducidos con puentes disulfuro puede conducirse, por ejemplo, por un método que utiliza cromatografía líquida de alta resolución C-18 en fase inversa (C-18 HPLC), en el cual se aísla(n) la o las fracciones que registran el mismo tiempo de retención que el del péptido natural.

Los péptidos de la presente invención pueden obtenerse también por empleo adecuado de una técnica de recombinación de genes de manera convencional.

Los métodos de síntesis arriba mencionados permiten también producir otro tipo de péptidos que tienen las mismas estructuras primarias que la del péptido natural pero tienen el número de puentes disulfuro diferente de los del péptido natural. Por esta razón, tales péptidos están abarcados también dentro del alcance de la invención, siempre que los mismos estén representados por SEQ ID NO: 1 en la cual están presentes 0 a 4 puentes disulfuro de tal manera que los residuos Cys en cualesquiera posiciones de la molécula están enlazados a través de puentes disulfuro.

Los péptidos pueden incluir deleciones, adiciones o sustituciones de una porción del residuo de aminoácido, siempre que aquéllos tengan las mismas actividades farmacológicas que la del péptido natural de la presente invención. Dichos péptidos pueden ser también útiles como bloqueadores de los canales K^{+} con compuertas de voltaje o inhibidores de la producción de IL-2.

Como se demuestra en el Ejemplo de Evaluación 2 que se presenta más adelante, los péptidos que tienen el terminal C de -COOH poseen también una actividad inhibidora de los canales K^{+}, y por consiguiente están abarcados también dentro del alcance técnico de la invención.

Entre ellos, el péptido natural es el primer neuropéptido descubierto de neuropéptidos de 34 residuos de aminoácidos y que contienen cuatro puentes disulfuro en la molécula. El péptido natural puede bloquear los canales K^{+}v1.3 de K^{+} con compuertas de voltaje del cerebro de la rata expresados en oocitos de Xenopus a una concentración extremadamente baja y puede inhibir también la producción de IL-2 por las células T de la sangre periférica humana. De acuerdo con ello, los péptidos proporcionados por la presente invención y análogos de los mismos podrían contribuir a la aplicación de péptidos afines a las toxinas de escorpión a reactivos bioquímicos en neurofisiología así como la aplicación a medicamentos humanos o veterinarios. Ejemplos de medicamentos a los cuales pueden aplicarse los péptidos y análogos de los mismos incluyen agentes inmunosupresores para trasplante de órganos, enfermedades de rechazo inverso (GVHD) y enfermedades autoinmunológicas.

Cuando los péptidos de la presente invención se utilizan como medicamentos, las formas de dosificación no están limitadas particularmente, y pueden utilizarse para administración oral o parenteral. Los péptidos se pueden preparar en diversos tipos de formulaciones, con inclusión de soluciones de inyección, soluciones de infusión, polvos, gránulos, tabletas, cápsulas, jarabes, recubrimientos entéricos, inhaladores, trociscos, ungüentos, supositorios y tabletas sublinguales. Estas formulaciones pueden utilizarse solas o en combinación, dependiendo de las condiciones del individuo. La preparación de las formulaciones puede realizarse por cualquiera de los métodos conocidos utilizando aditivos conocidos apropiados que se emplean convencionalmente en la formulación de medicamentos (v.g., excipientes, aglomerantes, desintegradores, lubricantes, saborizantes), dependiendo de los usos propuestos.

En la administración del péptido como medicamento a un humano, la dosis eficaz no está limitada particularmente, y puede variar dependiendo del grado de actividad efectiva del péptido, la edad, el sexo y el peso corporal del paciente a tratar y de las condiciones de las enfermedades del paciente. En el caso de administración a un adulto humano, como regla general la dosis puede seleccionarse adecuadamente dentro del intervalo de 0,1 a 100 mg por día para administración oral o el intervalo de 0,01 a 10 mg por día para administración parenteral.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará con mayor detalle por los ejemplos que siguen. Debe comprenderse que la presente invención no está limitada a los ejemplos.

Ejemplo 1 Purificación de HsTX1 a. Extracción bruta

50 mg de glándula venenosa de Heterometrus spinnifer liofilizada (obtenida de Latoxan, Francia) se homogeneizaron con aproximadamente 5 ml de una solución 0,5 M de ácido acético, y el homogeneizado se centrifugó a 3.000 x g durante 20 min. El precipitado se sometió a homogeneización y centrifugación tres veces del mismo modo. El sobrenadante resultante se pasó a través de un filtro de 0,45 \mum para obtener un extracto bruto.

b. Cromatografía en columna de fase inversa (1)

El extracto bruto obtenido en el paso (a) anterior se sometió a C18-HPLC utilizando un paquete Capcell C18 SG-120 (Shiseido Co., Ltd., \phi10 x 250 mm) por lotes de 12,5 mg, se reveló con una solución acuosa de TFA al 0,1% (pH 2,2) a un caudal de 3 ml/min durante 6 min, y se eluyó luego con un gradiente lineal de acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 0% a 50% en 100 min. Mientras se observaba la absorbancia UV a 230 nm, se agruparon las fracciones que indicaban la absorbancia pico. Estas fracciones se ensayaron respecto a la actividad inhibidora sobre los canales K^{+} K^{+}v1.3 con compuertas de voltaje del cerebro de la rata expresados en oocitos de Xenopus, y se recogieron las fracciones activas que se eluían para los tiempos de retención de 38-41 min.

c. Cromatografía en columna de intercambio de iones catiónicos

Las fracciones activas obtenidas en el paso (b) se disolvieron en un tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 6,8). La solución resultante se sometió a cromatografía en columna con intercambio de iones catiónicos utilizando el gel TS K SP-5PW (Tosoh Corporation, \phi7,5 x 75 mm), se reveló en un tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 6,8) a un caudal de 0,5 ml/min durante 5 min, y se eluyó luego con un gradiente lineal de NaCl desde 0 M a 0,80 M en 80 min. Mientras se observaba la absorbancia UV a 230 nm, se agruparon las fracciones que indicaban la absorbancia pico. Estas fracciones se ensayaron del mismo modo que en el paso (b) y se recogieron las fracciones activas que se eluían para los tiempos de retención de 64-69 min.

d. Cromatografía en columna de fase inversa (2)

La fracción activa obtenida en el paso (c) se sometió a HPLC utilizando una columna C-18 (Merck & Co., Inc., Lichrospher de 100 angstroms, tamaño de las perlas: 5 \mum, \phi4 x 125), se reveló con una solución acuosa de TFA al 0,1% (pH 2,2) a un caudal de 1,0 ml/min durante 3 min, y se eluyó luego con un gradiente lineal de disolvente B (una solución mixta de 2-propanol:acetonitrilo = 2:1) en una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 5% a 18% en 35 min mientras se observaba la absorbancia UV a 230 nm. Se eluyó HsTX1 como un pico simple para un tiempo de retención de 27,5 min.

Estas fracciones se agruparon y se liofilizaron luego para dar HsTX1 con un rendimiento global de 130 \mug.

Ejemplo 2 Determinación de la estructura de HsTX1 a. Determinación de la composición de aminoácidos

El HsTX1 obtenido del Ejemplo 1 se hidrolizó con HCl 6 N de punto de ebullición constante en un tubo sellado a 110ºC durante 20 h y el producto resultante se sometió a determinación de la composición de aminoácidos utilizando un analizador de aminoácidos. La composición de aminoácidos se muestra a continuación en la Tabla 1.

TABLA 1 Composición de aminoácidos de HsTX1

Aminoácido	HstX1
Asx	3,6(4)
Glx	1,1(1)
Ser	1,0(1)
Gly	2,3(2)
His	0
Thr	2,0(2)
Ala	2,1(2)
Pro	3,0(3)
Arg	3,8(4)
Tyr	0,8(1)
Val	0
Met	0,9(1)
½ cistina	7,4(8)
Ile	0
Leu	0
Phe	O
Lys	5,0(5)

Los números entre paréntesis indican el número de residuos determinado por cálculo.

b. Secuenciación de aminoácidos

Paso 1

Reducción y modificación de los puentes disulfuro

Se hizo reaccionar HsTX1 con 5 equivalentes de tributil-fosfina basados en el número de los puentes disulfuro y 2 equivalentes de 4-vinilpiridina basados en la cantidad de la tributil-fosfina en n-propanol al 20% en un tampón de bicarbonato 0,5 M a 37ºC durante 2 h en corriente de nitrógeno en la condición sombreada, con lo cual los residuos Cys estaban piridiletilados en S. El péptido piridiletilado en S (al que se hace referencia en lo sucesivo simplemente como "péptido PE") se purificó por HPLC utilizando una columna C-18 (Merck & Co., Inc., Lichrospher 100 angstroms, tamaño de las perlas: 5 \mum, \phi4 x 125), con un gradiente lineal de acetonitrilo en una solución mixta 0,1% TFA/agua desde 5% a 60% en 55 min a un caudal de 1,0 ml/min.

Paso 2

Secuenciación de aminoácidos

El péptido PE obtenido en el paso 1 se sometió a determinación de la secuencia de aminoácidos utilizando un secuenciador de aminoácidos Shimadzu PPSQ10 (Shimadzu Corp.). Como resultado, se encontró que HsTX1 es un péptido representado por SEQ ID NO: 1 en el cual están presentes cuatro puentes disulfuro en la molécula.

Paso 3

Determinación del peso molecular

El peso molecular de HsTX1 determinado por el tiempo de desorción láser asistido por matriz de la espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF-MS) era 3815,63. Este resultado estaba en concordancia satisfactoria con el valor determinado por cálculo para la formulación C_{149}H_{246}N_{54}O_{46}S_{9} en la cual están presentes cuatro puentes disulfuro (3815,61).

Paso 4

Determinación de las posiciones de los puentes disulfuro a) Reducción-alquilación parcial y determinación de la secuencia

Se realizó la reducción-alquilación parcial de HsTX1 de acuerdo con el método de Jones et al. (Jones et al., Rapid Commun. Mass Spectrum., vol. 10, pp, 138-143, 1996) con ligera modificación. Resumidamente, 2 a 3 nanomoles de HsTX1 obtenido en el Ejemplo 1 en 25 \mul de una solución 0,1 M de acetato de amonio/acetonitrilo (90:10, pH 4) se incubaron con 2 equivalentes molares de tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP) a 50ºC durante 10 min. Se añadió luego a la mezcla un exceso de 100 equivalentes molares de N-fenil-maleimida y se dejó reaccionar a 50ºC durante 30 min. Después de añadir 200 \mul de una solución acuosa de TFA al 0,1%, la mezcla de reacción se aplicó a una columna C-18 de fase inversa (Merck & Co., Inc., Lichrospher, \phi4 x 125 mm), y se eluyó luego con un gradiente lineal de acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 5% a 45% en 80 min a un caudal de 1 ml/min. El análisis MALDI-TOF-MS permitió identificar el péptido alquilado, parcialmente reducido. Este péptido se secuenció luego sin procedimientos adicionales de reducción-alquilación.

Como resultado del análisis MALDI-TOF-MS del péptido alquilado parcialmente reducido, se confirmó que uno de los puentes disulfuro en la molécula se había reducido y estaban presentes dos residuos cisteína alquilados. Se identificó que el derivado 3-fenil-2-tiohidantoína (PTH) de los residuos cisteína alquilados estaba presente en las posiciones 19 y 34. Estos resultados revelaron que uno de los puentes disulfuro presentes en HsTX1 es Cys^{19}- Cys^{34}.

b) Escisión enzimática

Se llevó a cabo la escisión tríptica de HsTX1 utilizando un cartucho de tripsina inmovilizada Poroszyme® (PerSeptive Biosystems, USA). Resumidamente, el cartucho se montó en un sistema HPLC en un horno ajustado a 40ºC, y se equilibró luego en tampón de digestión (CaCl_{2} 10 mM, Tris-HCl 50 mM; pH 8): acetonitrilo (95:5, v/v) a un caudal de 1 ml/min. Un nanomol del MsTX1 sintético sintetizado en el Ejemplo 3 siguiente se disolvió en 50 \mul del tampón de digestión y se inyectó en la columna a un caudal de 50 \mul/min. Un flujo de parada permitió un tiempo de reacción de 20 min. La mezcla de reacción se eluyó con 3 volúmenes de columna (3 x 100 \mul) de la solución tampón de digestión:acetonitrilo (95:5, v/v). Los materiales eluidos se recogieron en un tubo de polietileno que contenía 6 \mul de HCl 6N (pH final: no mayor que 2) y se guardó inmediatamente después a -80ºC.

La mezcla de reacción resultante se aplicó a una columna C-18 de fase inversa (Merck & Co., Inc., \phi4 x 125 mm), y se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 0% a 45% en 80 min a un caudal de 1 ml/min. Tres minutos después del comienzo de la elución, se inició la observación de la absorbancia UV a 230 nm de cada fracción y se recogieron las fracciones que indicaban valores pico. Estas fracciones se liofilizaron antes de las caracterizaciones fisico-químicas (a saber, espectrometría de masas, secuenciación). El fragmento tríptico eluido a 24 min se escindió ulteriormente con AspN-endopeptidasa (en 1 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,1; la relación de la peptidasa para aproximadamente 40 picomoles de péptido era aproximadamente 4% p/p), y se sometió luego a la determinación directa MALDI-TOF-MS en una microplaca.

Estos procedimientos de escisión enzimática dieron cuatro fragmentos. El rendimiento de la reacción era cuantitativo y no se observó transposición aleatoria alguna de los puentes disulfuro intramoleculares. Los fragmentos resultantes se sometieron a espectrometría de masas y se secuenciaron para analizar el patrón de puentes disulfuro. Como resultado, se reveló que el péptido que se obtuvo a partir de las fracciones digeridas con tripsina y se eluyó a los 24 min contenía dos puentes disulfuro que incluían residuos de semi-cistina en las posiciones 9, 13, 29 y 31. Aproximadamente 40 picomoles de los fragmentos anteriores se eluyeron ulteriormente con AspN-endopeptidasa y se sometieron luego a la determinación directa MALDI-TOF-MS en una microplaca. El resultado indicó que dos de estos fragmentos contenían puentes disulfuro correspondientes a Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{9}-Cys^{29}, respectivamente.

Estos resultados demuestran claramente que el HsTX1 de la presente invención contiene cuatro puentes disulfuro, Cys^{3}-Cys^{24}, Cys^{9}-Cys^{29}, Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{19}-Cys^{34}.

Paso 5

Análisis estructural por dicroísmo circular

Los espectros de dicroísmo circular (CD) de los péptidos de la presente invención (es decir, HsTX1 natural, HsTX1 sintético obtenido en el Ejemplo 3 siguiente y HsTX1-COOH, que es un derivado de HsTX1 que tiene el terminal C de -COOH) y caribdotoxina (ChTX) (Peptide Institute, Inc., Japón) se determinaron utilizando un espectrómetro Jasco J-600 CD (Jasco Corporation) con ácido (+)-canfo-10-sulfónico como patrón.

En la determinación, los espectros se midieron en un tampón de fosfato 20 mM (pH 7,1) a la temperatura ambiente a 160-190 nm de longitud de onda utilizando una celdilla de 1 mm de recorrido. Los datos del espectro se recogieron a intervalos de 0,1 nm con una tasa de barrido de 100 nm/min durante 500 min. La concentración de cada péptido se hizo igual (80 \mug/ml) con ayuda del análisis de aminoácidos. Los datos se expresaron como elipticidad molecular por residuo y se analizaron por el método de Compton y Johnson (Anal Biochem., vol. 155, pp. 155-167, 1986).

El espectro CD de cada uno de los HsTX1 y HsTX1-COOH sintéticos (péptidos de la presente invención) era casi el mismo que el del HsTX1 natural. Cuando se comparó el espectro CD de ChTX con el de HsTX1 para comparación de la estructura secundaria entre ellos, la absorbancia mínima y la absorbancia máxima del espectro CD de ChTX estaban desplazadas ligeramente, con el mínimo a 218 nm y el máximo a 195 nm (frente a 220 nm y 190 nm, respectivamente, para HsTX1).

Estos resultados revelaron que HcTX y HsTX1-COOH, HsTX1 sintético y HsTX1 natural de la presente invención tienen todos hélice \alpha (36, 29, 34 y 28%, respectivamente), hoja \beta (18, 21, 20 y 20%, respectivamente) y vuelta \beta (19, 14, 12 y 14%, respectivamente) en ellos. Estos datos del análisis estructural demuestran que la estructura plegada de HsTX1 es similar a la de ChTX.

Se ha sabido que tanto Pi1 (supra) como maurotoxina (Kharrat et al., Eur. J. Biochem., vol. 242, pp. 491-498, 1996) tienen la estructura plegada similar a la de ChTX, pero la maurotoxina tiene un patrón de puentes disulfuro específico. Este hecho ilustra la validez de la estructura de HsTX1 arriba mencionada, deducida por utilización de los parámetros de la ChTX.

Ejemplo 3 Síntesis de HsTX1 por un método en fase sólida

La síntesis del péptido se realizó por el método en fase sólida FastMoc® en un sintetizador automático de péptidos 433A (Applied Biosystems) utilizando resina Fmoc-aminoetil-SAL (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) como soporte y Fmoc-Ala, Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Asn (Trt), Fmoc-Cys (Trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Met, Fmoc-Pro, Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Thr (tBu) y Fmoc-Tyr (tBu), en donde las abreviaturas utilizadas son como sigue: Fmoc = 9-fluorenilmetoxi-carbonilo, SAL = super ácido lábil, Pmc = 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo, Trt = tritilo, tBu = t-butilo, Boc = t-butiloxicarbonilo.

Los procedimientos para escisión del péptido del conjugado péptido-resina y desprotección del péptido bruto se realizaron por adición de una solución mixta TFA:tioanisol:etanoditiol (90:5:5, v/v) al conjugado péptido-resina en una cantidad de aproximadamente 10 ml por 1 g del conjugado y reacción posterior de la mezcla a la temperatura ambiente durante 1,5 a 3 horas. A la solución de reacción resultante, se añadió dietil-éter para precipitar el péptido. El precipitado se lavó tres veces con dietil-éter para dar un péptido bruto. El péptido bruto se purificó por HPLC C-18 en fase inversa.

El péptido purificado se disolvió en un tampón Tris-HCl 0,5 mM (pH 8,2) complementado con glutatión 1 mM oxidado y glutatión 1 mM reducido, y la solución se expuso luego al aire durante 30 horas para oxidar el péptido, por lo cual se introdujeron en el péptido puentes disulfuro. Después que se hubo completado la reacción de oxidación, la solución de reacción se sometió a HPLC utilizando una columna C-18 (Merck & Co., Inc., Lichro-spher 100 angstroms, tamaño de las perlas: 5 \mum, \diameter 4 x 125 mm), se reveló con acetonitrilo al 5% en una solución acuosa de TFA al 0,1% (pH 2,2) a un caudal de 1,0 ml/min durante 3 min, y se eluyó luego con un gradiente lineal de acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 5% a 20% en 30 min mientras se observaba la absorbancia UV a 230 nm. Basándose en el hecho de que el HsTX1 natural se eluye con este sistema HPLC con el tiempo de retención de 26,6 min en un solo pico, las fracciones pico eluidas para el mismo tiempo de retención (es decir, 26,6 min) se agruparon para dar HsTX1 sintético.

El HsTX1 sintético obtenido se mezcló con el natural, y la mezcla se co-eluyó en el mismo sistema HPLC que se ha mencionado arriba. Como resultado, se detectaron HsTX1s tanto naturales como sintéticos para el tiempo de retención de 26,6 min en un solo pico bien definido. El peso molecular del HsTX1 sintético determinado por MALDI-TOF-MS era 3815,67, que estaba en concordancia satisfactoria con el del péptido natural (3815,63).

Ejemplo 4 Preparación para inyección que comprende HsTX1

Se disolvió 1 miligramo del HsTX1 sintético obtenido en el Ejemplo 3 en 20 ml de agua para inyección y la solución resultante se pasó a través de un filtro de 0,22 \mum para esterilización. Después de ello, la solución se envasó en ampollas de 1 ml cada una en condiciones esterilizadas, obteniéndose así preparaciones para inyección que comprendían HsTX1.

Ejemplo de Evaluación 1

Ensayo de inhibición de los canales K^{+}

El ensayo de la actividad inhibidora de los péptidos sobre los canales K^{+} se realizó de la manera siguiente. El gen del canal K^{+} K^{+}v1.3 con compuertas de voltaje del cerebro de la rata (Stuhmer et al., EMBO J., 8, vol. 11, pp. 3235-3244, 1988) que fue aportado generosamente por el Prof. O. Pongs (Institute für Neurale Signalverarbeitung, Hamburgo, Alemania) se insertó en el vector pAS18 de acuerdo con una técnica convencional. Este vector se trató con EcoRI y el clon resultante se transcribió después in vitro con RNA-polimerasa SP6 utilizando un kit de transcripción (Stratagene Inc., USA). El cRNA obtenido se inyectó en oocitos de Xenopus 16-72 h antes de los experimentos electrofisiológicos.

Los oocitos en los que se había expresado el gen K^{+}v1.3 se añadieron a una cámara de 100 \mul llena con una solución ND96 (CaCl_{2} 0,3 mM, MgCl_{2} 1 mM, KCl 2 mM, y NaCl 96 mM en tampón Hepes 5 mM, pH 7,6) complementada con 50 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA), y la solución ND96 se perfundió continuamente a través de depósitos a un caudal de 4 ml/min. La muestra a ensayar se disolvió por separado en una solución ND96 y se añadió luego a la cámara por perfusión a través de un depósito. El cambio de un depósito a otro para cada experimento se realizó por medio de válvulas de Teflón. Todas las medidas se realizaron a la temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC).

Los oocitos se atravesaron con dos microelectrodos llenos con KCl 3M (resistencia interna: 0,5-2 M\Omega) y se seleccionaron por voltaje utilizando un amplificador seleccionado por voltaje de dos electrodos Axoclamp-2 (Axon Instruments, Inc.) en un modo en el cual el voltaje de la cámara se seleccionó a 0 V. Las corrientes se sometieron a filtración de paso bajo a 1 kHz utilizando un filtro Bessel de 8 polos (CiberAmp, Axon Instruments Inc.; -3 dB), se muestrearon y digitalizaron a 10 kHz utilizando una Interfaz Digidate 1200 (Axon Instruments Inc.), y los datos se registraron en un disco fotomagnético para análisis subsiguiente fuera de la línea. La programación y el registro del potencial y el análisis de los datos registrados se realizaron ejecutando el soporte lógico Pclamp (Axon Instruments Inc.) en un ordenador PC Compaq. La medida se realizó con un potencial de retención de -80 mV y una corriente de retención no mayor que -40 nA.

Como resultado, se encontró que el HsTX1 de la presente invención exhibía una acción bloqueadora extremadamente potente sobre los canales K^{+}, a saber, la concentración bloqueadora del 50% (CI_{50}) de 12 \pm 1,6 pM, que es aproximadamente 800 veces más potente que la de Pi1 (supra) que es otra toxina de escorpión que exhibe la misma actividad.

Ejemplo de Evaluación 2

Actividad de HsTX1 sobre los canales K^{+}v1.3 de la rata

La actividad inhibidora del HsTX1 de la presente invención sobre los canales K^{+}v1.3 se examinó por medida de la inhibición dependiente de la concentración de la corriente de salida con compuertas de voltaje sobre los canales K^{+} con compuertas de voltaje expresados en el sistema de oocitos de Xenopus. Como resultado, se encontró que en presencia de 10 pM de HsTX1, la corriente de salida era inhibida aproximadamente en un 50% para todos los voltajes ensayados, en comparación con un control (sin péptido alguno). La perfusión transitoria con 100 pM de HsTX1 seguida por perfusión sin péptido alguno como control causaba más de 85% de recuperación de la corriente K^{+} a lo largo del tiempo. Este resultado revela que la actividad inhibidora de HsTX1 sobre el canal K^{+} es prácticamente reversible.

La Fig. 1 muestra la curva de actividad inhibidora dependiente de la concentración del péptido de la presente invención sobre los canales K^{+}v1.3 de la rata.

Como se aprecia claramente a partir de la Fig. 1, puede comprenderse que los péptidos de la presente invención, es decir, HsTX1 natural y HsTX1 sintético obtenido en el Ejemplo 3, exhiben prácticamente el mismo patrón de inhibición, en el cual la concentración de inhibición del 50% (CI_{50}) era 12 pM para el HsTX1 natural y aproximadamente 13 pM para el HsTX1 sintético y ambos péptidos exhiben una actividad inhibidora muy potente sobre los canales K^{+}.

Por el contrario, HsTX1-COOH, que es un derivado de HsTX1 con el terminal C no amidado, exhibía un valor CI_{50} de 69 pM, que es aproximadamente un quinto del correspondiente al HsTX1 de la presente invención. De acuerdo con ello, puede comprenderse que los péptidos de la presente invención pueden exhibir la actividad inhibidora incluso cuando el terminal C es -COOH, pero la amidación del terminal C mejora la actividad inhibidora específica sobre los canales K^{+}.

Ejemplo de Evaluación 3

Actividad de HsTX1 sobre otros canales K^{+} con compuertas de voltaje

La actividad inhibidora de HsTX1 de la presente invención sobre otros canales K^{+} con compuertas de voltaje se examinó del mismo modo. Los canales ensayados fueron K^{+}v1.1 y K^{+}v1.6, los dos cuales son subtipos del canal K^{+} con compuertas de voltaje del cerebro de la rata. El experimento en el sistema de oocitos de Xenopus se realizó del mismo modo que se ha mencionado arriba utilizando los clones de los genes K^{+}v1.1 y K^{+}v1.6. Aunque ambos canales K^{+}v1.1 y K^{+}v1.6 eran bloqueados por el HsTX1 sintético, el valor CI_{50} para ambos canales era aproximadamente 300 pM, que es aproximadamente una trigésima parte más pequeño que el correspondiente al canal K^{+}v1.3.

Como resultado, se reveló que el HsTX1 de la presente invención exhibe una actividad bloqueadora específica sobre los canales K^{+}v1.3.

Ejemplo de Evaluación 4

Actividad de HsTX1 sobre la producción de IL-2 por las células T de la sangre periférica humana

La actividad inhibidora de HsTX1 sobre la producción de IL-2 por las células T activadas se examinó de la manera siguiente. Se aislaron leucocitos mononucleares de sangre periférica heparinizada de un donante normal por una técnica de centrifugación con un medio de resolución mono-poli (Dainippon Pharmaceuticals Co., Ltd.), y se aplicaron luego a una columna de lana de nailon. La columna se incubó a 37ºC durante 30 min y las células no adherentes se aislaron luego a partir de la misma. Las células T purificadas obtenidas se suspendieron en medio RPMI 1640 complementado con suero de ternero fetal desactivado al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Esta suspensión se extendió sobre una placa de 96 pocillos con fondo plano en una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml. Se añadieron ulteriormente a la misma 1 ng/ml de miristato-acetato de forbol (PMA) y 250 ng/ml de ionomicina como estimulantes, y la placa se cultivó en una incubadora con 5% de CO_{2} gaseoso a 37ºC.

En el momento del comienzo del cultivo, se añadió HsTX1 a cada pocillo en concentraciones de 0,1, 1, 10 y 100 nM, respectivamente, al volumen final para cada pocillo de 200 \mul. Después de 20 h, se recogió el sobrenadante de cultivo y se determinó luego la concentración de IL-2 en el mismo utilizando un kit ELISA de IL-2 humana (Endogen).

Los resultados se muestran en la Fig. 2.

Como se aprecia claramente por la Fig. 2, el HsTX1 de la presente invención inhibía significativamente la producción de IL-2 por las células T periféricas humanas para todas las concentraciones anteriores (ensayo de Dunnett).

La tasa de inhibición del HsTX1 de la presente invención contra la producción de IL-2 a concentraciones de 0,1, 1, 10 y 100 nM era 28,6, 45,7, 46,0 y 46,7%, respectivamente.

En los ejemplos y ejemplos de evaluación mencionados anteriormente, los autores de la presente invención alcanzaron éxito en el aislamiento y la síntesis de una nueva clase de péptido afín a la toxina de escorpión, denominado HsTX1, y alcanzaron asimismo éxito en el aclaramiento de las estructuras primaria y de orden superior de los péptidos y las actividades fisiológicas sobre los canales K^{+} con compuertas de voltaje y la inhibición de la producción de IL-2 de los mismos. De acuerdo con ello, péptidos que tengan estructuras similares primaria y/o de orden superior a las de HsTX1, aun cuando los mismos incluyan deleciones, adiciones o sustituciones de una porción del aminoácido, pueden ser útiles también como péptidos que tienen actividad bloqueadora sobre los canales K^{+} con compuertas de voltaje y actividad inhibidora sobre la producción de IL-2.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se pueden proporcionar, como péptidos afines a la toxina de escorpión, péptidos representados por SEQ ID No: 1 en la cual están presentes 0-4 puente disulfuro y sus péptidos afines. Entre ellos, HsTX1 es el primer péptido descubierto de neuropéptidos que tienen cuatro puentes disulfuro en la molécula y compuestos de 34 residuos de aminoácidos. Basándose en el hecho de que la actividad inhibidora de HsTX1 sobre los canales K^{+}v1.3 es prácticamente reversible, se espera que HsTX1 tenga una toxicidad satisfactoriamente baja.

Entre los péptidos de acuerdo con la presente invención, HsTX1 inhibía significativamente la producción de IL-2 por las células T de la sangre periférica humana a una concentración de al menos 0,1 nM. Dado que IL-2 es una citoquina que promueve la diferenciación y proliferación de las células T, dicha inhibición de la producción de IL-2 podría conducir a la inhibición de la activación de las células T.

De acuerdo con ello, es de esperar que los péptidos de la presente invención y sus análogos contribuyan a la aplicación de péptidos afines a la toxina de escorpión para reactivos bioquímicos en neurofisiología así como a la aplicación a medicamentos humanos y veterinarios con inclusión de los correspondientes a las enfermedades de rechazo inverso (GVHD), enfermedades autoinmunológicas y trasplante de órganos.

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1

LONGITUD: 34

TIPO: aminoácido

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

FUENTE ORIGINAL:

\hskip1cm ORGANISMO: escorpión (Heterometrus spinnifer)

CARACTERÍSTICA:

\hskip1cm OTRA INFORMACIÓN: el terminal C está amidado

\hskip1cm LOCALIZACIÓN: 34

\hskip1cm MÉTODO PARA DETERMINACIÓN: E

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp Pro Cys Arg Lys Glu}

\sac{Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys Cys Asn}

\sac{Arg Cys}

Claims

1. Un péptido representado por una secuencia de aminoácidos de:

100

en el cual el terminal C puede estar amidado y están presentes 0 a 4 puentes disulfuro en la molécula, en donde

dichos puentes disulfuro se seleccionan del grupo constituido por Cys^{3}-Cys^{24}, Cys^{9}-Cys^{29}, Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{19}-Cys^{34}.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual están presentes cuatro puentes disulfuro en Cys^{3}-Cys^{24}, Cys^{9}-Cys^{29}, Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{19}-Cys^{34}.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual están presentes cuatro puentes disulfuro en Cys^{3}-Cys^{24}, Cys^{9}-Cys^{29}, Cys^{13}-Cys^{31} y Cys^{19}-Cys^{34}, y el terminal C está amidado.

4. Un agente bloqueador de los canales K^{+} con compuertas de voltaje, que comprende el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Uso del péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un agente bloqueador de los canales K^{+} con compuertas de voltaje.

6. Un inhibidor de la producción de interleuquina-2, que comprende el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Uso del péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un inhibidor de la producción de interleuquina-2.

8. Un agente inmunosupresor que comprende el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. Uso del péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un agente inmunosupresor.