JP2002509080A

JP2002509080A - グラモストラ・スパチュラタの毒から得られる鎮痛性ペプチドおよびその使用

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Publication number: JP2002509080A
Application number: JP2000532432A
Authority: JP
Inventors: ランペ，リチャード・アレクサンダー
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2002-03-26
Also published as: AU6109698A; WO1999042480A1; EP1054896A1; CA2319038A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、痛みを処置するための新規方法であって、その処置を必要とする哺乳動物に、有効鎮痛量の、アミノ酸配列：Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（配列番号：１）またはＴｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ（配列番号：２）を有するペプチドを投与する方法を提供する。本発明はさらに配列番号：１のアミノ酸配列を有する精製ペプチドを提供する。配列番号：１および配列番号：２のペプチドは、鎮痛誘導活性を有する化合物の同定方法にも使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、哺乳動物に鎮痛作用（ａｎａｌｇｅｓｉａ）を誘導するペプチドに
関する。より詳細には本発明は、グラモストラ・スパチュラタ（Ｇｒａｍｍｏｓ
ｔｏｌａｓｐａｔｕｌａｔａ）、すなわちチリピンクタランチュラグモ（Ｃｈ
ｉｌｅａｎｐｉｎｋｔａｒａｎｔｕｌａｓｐｉｄｅｒ）の毒（ｖｅｎｏｍ
）から得られる鎮痛誘導性ペプチドに関する。

【０００２】発明の背景痛みは各医師がみる基本的な臨床症状のひとつであり、通常は軽度、中程度お
よび重度の３区分に分類される。軽度ないし中程度の区分には、アスピリン、ア
セトアミノフェン、イブプロフェン、および他の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳ
ＡＩＤ）製剤を含めた多数の製剤が含まれる。麻薬系鎮痛薬は依然として、中程
度ないし重度の痛みを治療するための現在市販されている製剤の主力である。

【０００３】癌および外科手術後期間は、中程度ないし重度の痛みを伴うことが最も多い２
つの状態である。骨、神経、軟組織または内蔵への腫瘍の浸潤が最も一般的な癌
の痛みの原因であり、患者の６５〜７５％を占める。外科処置、化学療法または
放射線療法による癌の治療の結果としての痛みが患者の１５〜２５％を占め、残
り５〜１０％は彼らの癌または癌療法とは無関係な痛みを訴えている。原発腫瘍
のタイプ、疾病の段階および部位、ならびに患者自体の変動要因（ｖａｒｉａｂ
ｌｅｓ）、特に心理的変動要因を含めた各種要因が、癌の痛みの程度に影響を与
える。また外科処置後の痛みに対する患者の応答も、介入の位置および範囲、な
らびに個人的性状に依存する。しかし外科処置後の痛みは、治療期間の長さの違
いにより癌とは区別される。

【０００４】中程度ないし重度の痛みの治療に関する米国市場の最大区分をなす麻薬につい
ての多大な関心は、連続使用に伴う麻薬中毒および活性喪失（すなわち耐性）の
可能性である。したがって、痛み、特に癌に伴う中程度ないし重度の痛みを軽減
しうる他の鎮痛薬が求められている。鎮痛薬に対する応答性を改善し、かつ副作
用を減らすために、ドラッグデリバリー方式と新規薬物の両方に研究努力が向け
られている。新規なドラッグデリバリー方式には、経皮麻薬、ＰＣＡ、制御放出
ポンプの髄腔内埋込み、および天然エンドルフィンその他の鎮痛性ペプチドを放
出する封入生細胞の埋込みが含まれる。新薬アプローチは、中程度ないし重度の
痛みの多様な経路および原因を反映している。痛みの治療のために開発されてい
る化合物の種類には、セロトニン様作用薬、ノルアドレナリン様作用薬、オピオ
イド部分アゴニスト（ｏｐｉｏｉｄｐａｒｔｉａｌａｇｏｎｉｓｔｓ）およ
びカッパオピオイドアゴニスト（ｋａｐｐａｏｐｉｏｉｄａｇｏｎｉｓｔｓ
）が含まれる。重要な前臨床試験が行われている治療法ターゲットには、タキキ
ニン／ブラジキニンアンタゴニストおよび興奮性アミノ酸アンタゴニストが含ま
れる。開発中のより新しいターゲットには、成長因子、サイトカイン、窒化物酸
化物調節剤（ｎｉｔｒｉｄｅｏｘｉｄｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）などが含ま
れる。民間薬およびカエル毒抽出物を含めた天然資源（ｎａｔｕｒａｌｓｏｕ
ｒｃｅｓ）も研究されている。

【０００５】商業的可能性をもつ生物学的物質の同定を目的としたクモ毒の研究は、主に農
薬部門で注目された。これらの活動の最終目標は、最小の哺乳動物毒性で選択的
に無脊椎動物種と相互作用して麻痺および／または死を誘発する化学成分を探査
することであった。しかし最近クモ毒は、哺乳動物ターゲットを同定する化合物
および医薬の開発を補助する化合物の同定のために開発されている他の捕食動物
由来の毒と結びついた。クモ形種グラモストラ・スパチュラタ（一般にチリピン
クタランチュラグモと呼ばれる）はオオツチグモ科（Ｔｈｅｒａｐｈｏｓｉｄａ
ｅ）鋏角類目（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）のメンバーである。Ｌａｍｐｅｅｔ
ａｌ．（１９９３）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４：４
５１−４６０による先の研究で、グラモストラ・スパチュラタの毒は電位感受性
カルシウムチャンネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｃａｌｃｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｓ）と非選択的に相互作用するペプチドを含有することが示され
た。

【０００６】発明の概要本発明は、痛みの処置方法であって、その処置を必要とする哺乳動物に、有効
鎮痛量の下記のアミノ酸配列を有するペプチド：

【０００７】

【化１５】

【０００８】（以下、ＧｓＡＦＩと呼ぶ）（配列番号：１）または

【０００９】

【化１６】

【００１０】（以下、ＧｓＡＦＩＩと呼ぶ）（配列番号：２）を投与する方法を提供する。したがって本発明は、痛みの処置のための医薬の製造における、配列番号：１
または配列番号：２のペプチドの使用を提供する。本発明はさらに、痛みの処置
における配列番号：１または配列番号：２のペプチドの使用を提供する。

【００１１】本発明の他の態様は、下記のアミノ酸配列を有する精製ペプチド：

【００１２】

【化１７】

【００１３】を提供する。本発明の他の態様は、医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、および下
記のアミノ酸配列を有するペプチド：

【００１４】

【化１８】

【００１５】を含む医薬組成物を提供する。本発明のさらに他の態様は、ＧｓＡＦＩおよび／またはＧｓＡＦＩＩの鎮
痛誘導活性を「模倣する（ｍｉｍｉｃ）」化合物の同定方法を提供する。

【００１６】本発明はさらに、ＧｓＡＦＩに対して特異的な抗体を提供する。抗体はモノ
クローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。抗体は当技術分
野で既知の方法、たとえばＨａｒｌｏｗｅｔａｌ．編，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ニューヨーク、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８８）の方法で調製できる。

【００１７】発明の詳細な説明本発明者らは、チリピンクタランチュラグモ、すなわちグラモストラ・スパチ
ュラタの毒から得られるペプチドが鎮痛誘導性をもち、したがってヒトを含めた
哺乳動物において痛みを処置するための鎮痛薬として、またそれらのペプチドの
鎮痛活性を模倣する化合物を同定するための研究道具として、有用であることを
見出した。

【００１８】したがって本発明は、痛みの処置方法であって、その処置を必要とする哺乳動
物に、有効鎮痛量の下記のアミノ酸配列を有するペプチド：

【００１９】

【化１９】

【００２０】または

【００２１】

【化２０】

【００２２】を投与する方法を提供する。これらのペプチドは、ヒト、一般的な実験室動物、たとえばラット、マウスお
よびモルモット、家畜、たとえばネコ、イヌおよびウマ、ならびに他のいかなる
哺乳動物種をも含めた哺乳動物において、痛みを処置するのに有用である。これ
らのペプチドは、いずれかの原因または状態（たとえば火傷、癌、神経疾患、器
官炎症、または外科的介入）による急性または慢性の痛みを処置するのに使用で
きる。しかしこれらのペプチドは、癌または手術による中程度ないし重度の痛み
を処置するために使用するのが好ましい。これらのペプチドは、経口、非経口、
くも膜下（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）、局所、静脈内、筋肉内または皮内／
神経上膜に投与できる。好ましい投与経路はくも膜下である。

【００２３】これらのペプチドは、それらを医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤と
共に含有させることにより、医薬用として調製できる。したがって本発明の他の
態様は、グラモストラ・スパチュラタから得られる前記ペプチド、および医薬的
に許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。これらのペ
プチドは、それらを単独で、または適切なキャリヤー、たとえば炭酸カルシウム
、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびアラビアゴムと組
み合わせて、経口または非経口投与用の錠剤またはカプセル剤として単位薬量（
ｕｎｉｔｄｏｓａｇｅ）に含有させることにより、医薬用に調製できる。これ
らのペプチドを経口、非経口または局所投与用として、水溶液、水性アルコール
溶液、グリコール溶液もしくは油性溶液、または油−水エマルション中で製剤化
できる。緩衝化−水性またはキャリヤー仲介水性／非水性の、くも膜下剤形およ
び静脈内剤形を製剤化することができる。本発明の医薬組成物に適したこれらお
よび他の適切な剤形は、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、第１５版、マック・パブリシング・カンパニー、
ペンシルベニア州イーストン（１９８０）中にみられる。本発明の医薬組成物は
、前記ペプチドの一方または両方の組合わせを含むことができる。

【００２４】医薬組成物中の有効化合物（すなわちペプチド）の量は、適切な投与量が得ら
れ、有効鎮痛量を患者に投与できるように変更できる。個々の患者に投与する用
量は、投与経路、治療期間、患者の体格および身体状態、ペプチドの力価、なら
びにそれに対する患者の応答など、多数の要因に依存するであろう。くも膜下に
投与する場合のペプチドの有効鎮痛量は、一般に約５ナノグラム／ｋｇ（患者の
体重）から約５００マイクログラム／ｋｇ；好ましくは約５０ナノグラム／ｋｇ
から約５０マイクログラム／ｋｇ；より好ましくは約５００ナノグラム／ｋｇか
ら約５マイクログラム／ｋｇである。他の経路で投与する場合、ペプチドの有効
量は異なるであろう。有効鎮痛量は、用量を求めるために本明細書に開示した１
以上の疼痛試験においてペプチドを試験することにより推定できる。用量は、哺
乳動物に対する適切なペプチド量を求めるための前記に挙げた１以上の基準に従
って変更できる。

【００２５】 ”鎮痛を誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇａｎａｌｇｅｓｉａ）”、”鎮痛誘導
活性（ａｎａｌｇｅｓｉａ−ｉｎｄｕｃｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ）”、”鎮痛
を生じる（ａｎａｌｇｅｓｉａｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）”、およびこれらに類す
る用語は、痛みを試験するため、または治療を評価するための１以上の慣用され
る実験室モデル、たとえば本明細書に述べる試験法における好ましい結果により
証明されるように、本発明のペプチドが哺乳動物において痛みを治療または軽減
する能力を表す。

【００２６】ペプチドの鎮痛活性は、下記を含めた一連の試験のうち少なくとも１つ、好ま
しくは２以上の試験により測定される：１）尾フリック（振り）潜伏（ｔａｉｌ
ｆｌｉｃｋｌａｔｅｎｃｙ）（Ａｂｂｏｔｔ，Ｆ．Ｖ．ｅｔａｌ．，Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．，１７，１２１３−１２１９，
１９８２；Ｃｒｉｄｌａｎｄ，Ｒ．Ａ．ａｎｄＨｅｎｒｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｒａ
ｉｎＲｅｓ．，５８４：１−２，１６３−１６８，１９９２）、２）ホットプ
レート閾値（Ｗｏｏｌｆｅ，Ｇ．ａｎｄＭａｃｄｏｎａｌｄ，Ａ．Ａ．，Ｊ
ＰＥＴ，８０，３００，１９９４；Ａｎｋｉｅｒ，Ｓ．Ｉ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２７，１−４，１０７４）、および３）フォンフ
レイ（ｖｏｎＦｒｅｙ）フィラメント閾値（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｐ
ａｉｎ，５５，８５−９２，１９９３）。

【００２７】尾フリック潜伏試験およびホットプレート閾値試験は、熱侵害受容（ｔｈｅｒ
ｍａｌｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）の測定である。フォンフレイフィラメント閾
値試験は、機械的侵害受容活性を評価する。これら３つの試験はすべて、熱−ま
たは機械的−侵害受容器の相動性刺激（ｐｈａｓｉｃｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
）に対する化合物の鎮痛活性を評価し、求心性のＡ−線維および多型Ｃ−線維の
活性化を著しく反映する。オピオイドに基づく活性機序をもつ臨床鎮痛薬はこれ
らの試験において有効であるが、末梢ターゲットと優先的に相互作用するか、ま
たは多数の作用部位をもつ鎮痛薬は、一般に活性がより低い。これらの試験は中
程度ないし強い鎮痛薬を推定するのに良好であり、オピオイド群の化合物内では
臨床効果との相関性が良い。より低い規模の痛みを臨床ターゲットとする非ステ
ロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）群の鎮痛薬は、これらの試験に普通に採用する
パラメーター下ではルーティンに検出されない。

【００２８】ＮＳＡＩＤの鎮痛性検出は、一次求心組織（ｐｒｉｍａｒｙａｆｆｅｒｅｎ
ｔｔｉｓｓｕｅ）損傷および炎症に応答して応答性が亢進した侵害受容状態（
すなわち有害刺激に対する閾値の低下）の発生に依存する。この状態を誘導する
免疫系と神経系の相互作用は、ＮＳＡＩＤ活性のターゲットとなる。末梢侵害受
容器（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ）および対応する中枢回路
構成部分（ｃｅｎｔｒａｌｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）のこの亢進した活性の阻害は
、自発行動またはその後の有害刺激に対する応答を監視することにより、長期間
にわたって検出できる。”痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉｃ）”状態のこれ
らのより長期的な測定は、痛みの大部分の臨床状態を模倣すると考えられる。そ
れらは相動性疼痛試験（ｐｈａｓｉｃｐａｉｎｔｅｓｔｓ）で検出される有
効薬剤を除外することなく、有用な鎮痛薬の検出可能性をも拡張する。実験室動
物においてこの状態のモデルを作成するために、多数の疼痛試験が開発された。
この状態を誘発するために用いられる有害刺激は、刺激性化学物質／腐食性（ｃ
ａｕｓｔｉｃ）薬剤または炎症性刺激物質である。これらの試験において主要な
決定変数（ｄｅｆｉｎｉｎｇｖａｌａｂｌｅ）は、痛覚過敏／炎症状態の発生
に必要な時間間隔、および倫理的に正当化できるその持続時間である。化合物は
、痛覚過敏状態の発生を阻止するそれらの固有活性（すなわち有害刺激前に投与
された化合物）、もしくは亢進した侵害受容応答を低下させる固有活性（すなわ
ち有害刺激後に投与された化合物）、または両方について評価することができる
。これらの試験の一次目標は、侵害受容状態および炎症状態の測定である。

【００２９】ホルマリン試験（Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，Ｄ．ａｎｄＤｅｎｎｉｓ，Ｓ．Ｇ．
，Ｐａｉｎ，４，１６１−１７４，１９７７）を用いた。これは短期の痛みに対
比して持続性の痛みを示すと考えられる２相応答（ｂｉ−ｐｈａｓｉｃｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ）を良好に表し、妥当な短期間内（すなわち１時間以内）に実施でき
るからである。この応答の初期は、実質性一次求心性バラージ（ｓｕｂｓｔａｎ
ｔｉａｌｐｒｉｍａｒｙａｆｆｅｒｅｎｔｂａｒｒａｇｅ）により開始す
る。これは、化学物質侵害受容器が仲介体であるという点を除いて、短期相動試
験について記載したものと類似の性質のものである。第２期は、初期の組織損傷
の結果生じる痛覚過敏性自発活動であり、侵害受容閾値の低下および対応する脊
髄回路部品の準備刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）または”ワインドアップ（ｗｉｎｄ−
ｕｐ）”を反映すると考えられる。このように、痛みのあるこの組織損傷状態を
誘発および持続させるには、末梢および中枢両方の神経回路部品および仲介物が
必要である。

【００３０】げっ歯類のホルマリンモデルはヒトの損傷誘発疼痛の治療の予測試験として有
効であることが立証された（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｓ．Ｇ．ａｎｄＭｅｌｚａｃｋ，
Ｒ．，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｈｅ
ｒａｐｙ，ｖｏｌ．３，７４７−７５７，編者Ｊ．Ｊ．Ｂｏｎｉｃａｅｔａ
ｌ．，ラバン・プレス：ニューヨーク、１９７９；Ｔｊｏｌｓｅｎ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐａｉｎ，５１：５−１７，１９９２）。臨床的に用いられている鎮痛
薬をこのモデルで評価すると、オピオイド系と相互作用することが知られている
オピオイドに基づく化合物または薬物に対するヒト有効性との強い相関性が一貫
して証明された（Ｗｈｅｅｌｅｒ−Ａｃｅｔｏ，Ｈ．”ラットにおけるホルマリ
ン誘発性組織損傷後の侵害受容および浮腫の解明：オピオイド活性の薬理学的分
析”、博士論文、テンプル・スクール・オブ・メディシン、ペンシルベニア州フ
ィラデルフィア、１９９４；Ｓｈｉｂａｔａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｐａｉｎ，３
８，３４７−３５２，１９８９）。主にＮＳＡＩＤに基づく作用機序をもつ比較
的緩和な鎮痛薬に関する有効性および力価プロフィル（ｐｏｔｅｎｃｙｐｒｏ
ｆｉｌｅｓ）は、多様に解釈できる結果を与えた（Ｗｈｅｅｌｅｒ−Ａｃｅｔｏ
，Ｈ．、博士論文、テンプル・スクール・オブ・メディシン、ペンシルベニア州
フィラデルフィア、１９９４；Ｈｕｎｓｋａａｒ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．，１４，６９−７６，１９８５；Ｓｈｉｂａｔａ，Ｍ．ｅ
ｔａｌ．，Ｐａｉｎ，３８，３４７−３５２，１９８９；Ｍａｌｍｂｅｒｇ，
Ａ．Ｂ．ａｎｄＹａｋｓｈ，Ｔ．Ｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔ
ｈｅｒ．，２６３，１３６−１４６，１９９２）。ホルマリンモデルにおける多
様に解釈できるこれらの所見は、試験の実施方法、たとえば試験パラメーター（
すなわち与えた刺激の強さ、応答測定方法、および分析した応答間隔）、用いた
実験動物の種および系統、ならびに化合物投与の経路／タイミングにおける、実
験上の相異を反映している（概説についてはＷｈｅｅｌｅｒ−Ａｃｅｔｏ，Ｈ．
、博士論文、テンプル・スクール・オブ・メディシン、ペンシルベニア州フィラ
デルフィア、１９９４）。しかし、これらの試験ではこれらの実験上の相異に関
係なく、中程度ないし重度の痛みを治療するために用いた有効性の高い鎮痛薬が
検出されるというコンセンサスが存在する。これらの化合物の中枢神経系への透
過性に限界があれば、検出される活性はより低い。

【００３１】本発明のペプチドは、鎮痛薬としての使用のほか、生物学的アッセイ、たとえ
ばこれらのペプチドの鎮痛活性を模倣する化合物を検出するためのアッセイ、こ
れらのペプチドの解剖学的作用部位を検出するためのアッセイ、またはこれらの
ペプチドの作用機序についての研究に有用である。したがって本発明の他の態様
は、ＧｓＡＦＩおよび／またはＧｓＡＦＩＩの鎮痛活性を模倣する化合物を
検出するための方法を提供する。本明細書に開示するペプチドの活性を模倣する
とは、被験化合物が鎮痛を誘導し、これらのペプチドと同一または類似の生理学
的様式で、これらのペプチドが結合または他の形で作用する細胞受容体に、結合
する能力を表す。したがって本発明は、鎮痛誘導活性を有するか、あるいは他の
形でＧｓＡＦＩおよび／またはＧｓＡＦＩＩの活性を模倣する化合物を同定
するための方法であって、配列番号：１または配列番号：２のアミノ酸配列を有
するペプチドの活性を測定する生物学的アッセイに被験化合物を添加し；そして
被験化合物の活性を検出する工程を含む方法を提供する。

【００３２】ＧｓＡＦＩおよび／またはＧｓＡＦＩＩの活性を模倣する化合物を同定す
るための生物学的アッセイ法は、本明細書に記載するようなインビボアッセイ法
、または以下に記載するアッセイ法のようなインビトロアッセイ法であってよい
。たとえばＧｓＡＦＩおよび／またはＧｓＡＦＩＩを競合結合スクリーニン
グアッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｂｉｎｄｉｎｇｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ａｓｓａｙｓ）に用いて、ＧｓＡＦＩおよびＧｓＡＦＩＩの活性を模倣する
化合物を下記の方法で同定できる。被験化合物および検出できるように標識した
ペプチドを、哺乳動物の細胞または組織に結合しうる条件下で哺乳動物の細胞ま
たは組織に添加する。次いで哺乳動物の細胞または組織への標識ペプチドの結合
を測定する。検出できるように標識したペプチドの活性を模倣する化合物は、受
容体上の結合部位に対しペプチドと競合するであろう。その結果、被験化合物が
ペプチドの活性を模倣する場合は、受容体への結合によって、被験化合物がペプ
チドの活性を模擬せず受容体に結合しないか、またはより低い親和性で結合する
場合より少量の検出標識が測定されるであろう。特に、ＧｓＡＦＩおよび／ま
たはＧｓＡＦＩＩを¹²⁵Ｉで標識して、Ｓｔｕｍｐｏｅｔａｌ．，ＥｕｒｏｐｅａｎＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０６：１５５，１９９１に記載され、
Ａｂｅｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．７１：２０３，１９８６
により改変されたアッセイ法に使用できる。要約すると、個々の被験化合物を脳
または脊髄膜組織と共にプレインキュベートした後、¹²⁵Ｉ標識ＧｓＡＦＩおよび／またはＧｓＡＦＩＩを添加し、次いでインキュベートして結合させる。
次いで反応混合物を濾過し、脳または脊髄膜組織を含むフィルターを緩衝液です
すぐ。¹²⁵Ｉ標識ペプチドの結合をシンチレーション計数により測定することができる。ＧｓＡＦＩおよびＩＩの活性を模倣する化合物は標識ペプチドと競合
し、ＧｓＡＦＩまたはＩＩの活性を模擬しない化合物より低い、脳または脊髄
膜組織の細胞上の受容体への標識ペプチド結合レベルを生じるであろう。非特異
的結合は、過剰の（１００〜１，０００倍）非標識ＧｓＡＦＩまたはＧｓＡＦ
ＩＩの存在下で残留するものとして規定されるであろう。

【００３３】生物学的アッセイに使用するために、これらのペプチドに検出可能な標識を取
り込ませる。検出可能な標識は、慣用されるいかなるタイプの標識であってもよ
く、実施するアッセイのタイプに従って選択される。たとえば、検出可能な標識
は、放射性標識、たとえば¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉまたは³Ｈ、酵素、たとえばペルオキシダ
ーゼ、アルカリもしくは酸性ホスファターゼ、蛍光標識、たとえばフルオロイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはローダミン、抗体、抗原、小分子、たとえ
ばビオチン、常磁性イオン、ラテックス粒子、電子密度の高い粒子、たとえばフ
ェリチン（ｆｅｒｒｉｔｉｎ）、または光散乱性粒子、たとえばコロイド状の金
を含むことができる。それらの標識を検出するのに適した方法には、シンチレー
ション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定または発光測定が含
まれる。検出可能な標識、それらの標識化を行う方法、および標識の検出方法は
当技術分野で周知であり、たとえば下記にみられる：ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎｄＲｅｌａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、第
４版、編者Ｔ．Ｃｈａｒｄ、エルゼビル・サイエンス・パブリッシャー、オラン
ダ国アムステルダム、１９９０；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＮｏｎ−ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＧｒａｙＣ．Ｈｏｗａｒｄ編、アップルト
ン・アンド・ランゲ、コネチカット州イースト・ノーウォーク、１９９３、また
はＲａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、Ｒ．Ｊ．Ｓｌａｔｅｒ編、オックスフォード大学出版社
ＩＲＬプレス、英国オックスフォード、１９９０。

【００３４】さらに、本発明のペプチドをＫｅｉｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｎ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．，９：２４３−２５２，１９８９、およびＭａｎｇａｎｏ
ｅｔａｌ．，ＥｕｒｏｐｅａｎＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９２：９−１７
，１９９１のアッセイに使用して、ＧｓＡＦＩまたはＩＩの活性を模倣する化
合物を同定することができる。要約するとこのアッセイ法は、Ｋ⁺により誘発されたラット脳または脊髄切片からの³Ｈ−Ｄ−アスパラギン酸（³Ｈ−Ｄ−ａｓｐ
ａｒｔａｔｅ）および³Ｈ−ノルエピネフリン放出を測定する。脊髄または脳の切片を、Ｋ⁺刺激前に、ＧｓＡＦＩ／ＧｓＡＦＩＩ、被験化合物またはビヒクルで予め１５分間平衡化することができる。Ｋ⁺により誘発されたラット脳または脊髄切片からの³Ｈ−ノルエピネフリンおよび³Ｈ−Ｄ−アスパラギン酸放出
レベルを測定する。次いでビヒクル対照と対比した、ＧｓＡＦＩ／ＧｓＡＦ
ＩＩ、または被験化合物による、Ｋ⁺誘発性のラット脳または脊髄切片からの³Ｈ
−ノルエピネフリンおよび³Ｈ−Ｄ−アスパラギン酸放出の阻害を判定する。被験化合物をスクリーニングして、絶対阻害活性およびＧｓＡＦＩ／ＧｓＡＦ
ＩＩに対する活性の両方を判定することができる。

【００３５】ＧｓＡＦＩおよび／またはＩＩの鎮痛活性を模倣する化合物自体が鎮痛活性
をもち、鎮痛薬として、または他の目的で、たとえば解剖学的作用部位の判定、
本発明のペプチドの作用機序の判定、および本発明のペプチドの鎮痛活性を模倣
する他の化合物を同定するためのスクリーニングアッセイに使用できる。好まし
くは、スクリーニングアッセイに用いる被験化合物は小型の有機分子であるが、
いかなるタイプまたは大きさの化合物（タンパク質およびペプチドなど）の鎮痛
活性も本発明方法により試験することができる。

【００３６】ＧｓＡＦＩおよび／またはＩＩを、その作用部位の確認のためのアッセイ、
およびさらにその活性の生理学的解明に使用できる。たとえばこれらのペプチド
を用いて、哺乳動物組織、単離した細胞、またはそれに由来する細胞下成分（ｓ
ｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）への、標識リガンドの結合／相
互作用の阻害を調べることができる。また、これらのペプチドを用いて、真核細
胞または原核細胞宿主系のｃＤＮＡまたはゲノム形質転換／ゲノムトランスフェ
クションにより生成した特異的な組換え発現タンパク質への、標識リガンドの結
合／相互作用の阻害を調べることができる。これらのペプチドを用いて哺乳動物
組織機能との同等な生化学的相互作用を調べることができ、これには受容体仲介
による特定の形質導入経路（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｓ）の
活性化／阻害、生体膜を通るイオン種の移動、および痛みにより誘導された特異
的な遺伝子活性の転写／翻訳プロフィルの変化が含まれる。具体的には、特定の
イオン種の放射性同位体検出または蛍光検出により測定される、哺乳動物細胞由
来の膜バリヤーを通したカリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン
、クロリド（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）イオンまたは水素イオン分布の変化を測定する
方法を利用できる。これらのイオンの移動が特異的な極初期遺伝子（ｉｍｍｅｄ
ｉａｔｅｅａｒｌｙｇｅｎｅｓ）の調節に与える影響も調べることができる
。

【００３７】本発明のペプチドはさらに、哺乳動物細胞膜を通したカリウム、ナトリウム、
カルシウムおよびクロリドの分布の電気生理学的測定に使用できる。これには、
シナプス伝達のマクロ分析（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓ）およ
び特定イオン電流の顕微分析（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓ）が
含まれる。具体的には、脊髄後角ニューロン内での有害仲介による（ｎｏｘｉｏ
ｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）神経作動開始（ｎｅｕｒｏｎａｌｆｉｒｉｎｇ）お
よびシナプス伝達の阻害、ならびに個々の後根神経節または脊髄後角ニューロン
内での分離した特異的イオン電流の阻害を分析することができる。

【００３８】本発明のペプチドはさらに、哺乳動物種に与えられた侵害性（ｎｏｃｉｏｆｅ
ｎｓｉｖｅ）／有害刺激に対する生理学的応答の阻害の研究に使用できる。具体
的には、未経験（ｎａｉｖｅ）動物または疼痛状態を実験的に誘発した動物に与
えた熱的、機械的または化学的有害刺激に応答した運動パラメーター（すなわち
四肢引去り閾値（ｌｉｍｂｗｉｔｈｄｒａｗａｌｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）また
は応答時間の潜伏／持続期間）を定量できる。

【００３９】ＧｓＡＦＩおよびＩＩは、グラモストラ・スパチュラタ毒からの単離、化学
的合成、または組換えＤＮＡ法により調製できる。グラモストラ・スパチュラタ
毒はスパイダー・ファーム（米国ペンシルベニア州フィースタービル）から市販
されている。クモ毒から、Ｃ−８およびＣ−１８シリカ支持体上でトリフルオロ
酢酸／アセトニトリル緩衝液を用いる逆相高圧液体クロマトグラフィーにより連
続分画することによって、これらのペプチドを単離するのが好ましい。好ましい
Ｃ−８シリカ支持体はゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ、登録商標）ＲｘＣ−８（
マック−モッド・アナリティカル社、ペンシルベニア州ウェストチェスター）で
あり、これはポアサイズ３００Åをもち、ジイソプロピルオクチル側鎖を含むよ
うに共有結合的に修飾された（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄ）、直
径５ミクロンのシリカ粒子からなる。Ｃ−１８シリカ支持体は、ポアサイズ３０
０Åをもち、オクタデシル側鎖を含むように共有結合的に修飾された、直径５ミ
クロンのシリカ粒子からなるものが好ましい。他のタイプのＣ−８およびＣ−１
８シリカ支持体もこれらのペプチドの単離に使用するのに適する。好ましい緩衝
液はアセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸である。好ましい方法では、
粗製毒をまずＣ−８半調製用カラム上で、アセトニトリル中の０．１％トリフル
オロ酢酸緩衝液２０〜５０％という幅広い濃度勾配を用いて分画する。Ｃ−８カ
ラムおよび同一緩衝液のより狭い濃度勾配を用いて、これらのペプチドをさらに
精製し、次いでＣ−８カラムおよび幅広い緩衝液濃度勾配を用いてさらに分画す
る。

【００４０】ＧｓＡＦＩおよびＩＩは組換えＤＮＡ法により調製できる。これらのペプチ
ドの１つをコードするＤＮＡ配列を調製し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主
細胞において発現させる。次いでこうして産生されたペプチドを宿主細胞および
／または細胞培養培地から精製する。これらのペプチドをコードするＤＮＡの調
製方法およびそのＤＮＡの発現方法は周知であり、たとえば下記にみられる：Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールド・スプ
リング・ハーバー：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス；ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．
ＢｅｒｇｅｒａｎｄＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編、アカデミック・プレス（カリ
フォルニア州サンディエゴ）１９８７；およびＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、ヒ
ューマナ・プレス（ニュージャージー州クリフトン）、１９９１。

【００４１】本発明のペプチドは、自動または手動の固相合成法を用いる化学的合成によっ
ても調製できる。これらの方法は当技術分野で周知であり、合成樹脂主鎖の選択
、アミノ、カルボキシルおよび側鎖保護基の選択、ならびに脱保護方式の選択な
どの特性に基づいて区別される。ペプチドの合成方法は、たとえば下記の標準的
テキストにみられる：Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎａｎｄＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒ
ｄ，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬプレス／オックスフォード大学出版
社、英国オックスフォード、１９８９、およびＭ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，ＰｅｐｔｉｄｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＴｅｘｔｂｏｏｋ，
スプリンガー出版社、米国ニューヨーク，１９８８。

【００４２】好ましい合成方法においては、Ｆｍｏｃ化学を用いて自動合成装置によりＧｓ
ＡＦＩおよびＧｓＡＦＩＩの合成を行うことができる。収量に応じて、線状
の還元ペプチドの調製を単一プロセス、またはフラグメントを結合させる縮合反
応を伴う２つの異なるプロセスで実施できる。目的ペプチドの単離、精製および
／または収率を高めるために、多様な保護基を線状ペプチドの合成に導入するこ
とができる。ペプチド中にあるシステイン残基の保護は、たとえばトリフェニル
メチル、アセトアミドメチルおよび／または４−メトキシベンジル基を任意の組
合わせで用いて達成できる。そのような方式は、折りたたまれたペプチドを得る
ための後続の酸化試験に有利となりうる。天然ＧｓＡＦＩおよびＧｓＡＦＩ
Ｉの分別タンパク質分解消化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｏｌｙｔ
ｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）と得られたフラグメントの質量分析とを組み合わせ
て、分子間ジスルフィド結合のアサイン（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）に利用できる
。次いで、収率を高めるために、このデータを合成ペプチド方式に採用すること
ができる。酸化方式には、目的とする折りたたまれたペプチドを得るための酸化
反応における、ランダム空気酸化、ヨウ素介助酸化、およびジメチルスルホキシ
ド介助酸化、ならびに少量のチオール試薬の使用が含まれる。粗製の線状還元ペ
プチドは、均質な酸化ペプチドと同様に、逆相高圧液体クロマトグラフィー−Ｈ
ＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）または他の標準法により精製できる。

【００４３】本発明の他の態様は、下記のアミノ酸配列を有する新規ペプチドを提供する：

【００４４】

【化２１】

【００４５】このペプチドのカルボキシ末端のロイシンはアミド化されている。すなわち末端
ロイシン残基の遊離末端が−ＣＯＯＨではなく−ＣＯ−ＮＨ₂で終わっている。アミド化されたペプチドおよびアミド化されていないペプチドの両方が本発明の
範囲に含まれる。

【００４６】本明細書中で用いる精製または単離したペプチドとは、汚染細胞成分、他の毒
性成分、または他の物質、たとえばペプチドの化学的合成に用いた試薬を実質的
に含まないペプチドを表す。好ましくは、ペプチドは全混合物の約５０％以上の
量、より好ましくは約８０％以上の量、最も好ましくは約９０％以上の量のペプ
チドを含有する混合物中に存在する。

【００４７】

【実施例】

【００４８】

【実施例１】−グラモストラ・スパチュラタ毒からのペプチドＧｓＡＦＩの単
離および解明Ａ．ペプチドの単離粗製グラモストラ・スパチュラタ毒は、凍結アリコートとしてスパイダー・フ
ァーム社（米国１９０５３、ペンシルベニア州フィースタービル）により供給さ
れた。Ｃ−８半調製用（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）カラム（２５ｃｍ
×９．４ｍｍ）および分析用カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）（ゾルバックス（
登録商標）ＲＸ−Ｃ８（マック−モッド・アナリティカル社、ペンシルベニア州
ウェストチェスター；ポアサイズ３００Åをもち、ジイソプロピルオクチル側鎖
で共有結合的に修飾された、直径５ミクロンのシリカマイクロスフェア粒子から
なる）；およびＣ−１８分析用カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）（バイダック（
Ｖｙｄａｃ）、カリフォルニア州ヘスペリア；ポアサイズ３００Åをもち、オク
タデシル側鎖で共有結合的に修飾された、直径５ミクロンのシリカミクロスフェ
ア粒子からなる）を用いて、毒の逆相高圧液体クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ（
ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行った。半調製規模のＲＰ−ＨＰＬＣは５ｍｌ／分の流速を
用いて行われ、これに対し分析用分析には１ｍｌ／分の流速を用いた。

【００４９】溶出物の検出を２１５ｎｍでの紫外分光法により監視し、画分を１分間隔で採
集するか、または紫外線強度に基づいて手動で採集した。初回注入体積を粗製毒
３０〜５０μｌとした。したがって精製の各段階で多数回の分画を行い、個々の
同等画分をプールした。すべての画分を凍結乾燥した後、その後の精製またはイ
ンビボ鎮痛試験のためにＨＰＬＣ用Ｈ₂Ｏに再懸濁した。再懸濁体積は、元の粗製毒体積に基づいた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより９０％を超える均質性であると思わ
れる試料について鎮痛評価を行った。試料を再懸濁後、４度Ｃで保存した。保存
またはプラスチックもしくはガラスへの付着による検出可能な活性損失は証明さ
れなかった。

【００５０】ゾルバックス（登録商標）ＲＸ−Ｃ８半調製用カラム上での粗製グラモストラ
・スパチュラタ毒の最初の分画は、濃度勾配２０〜５０％のＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液（アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸）を用い、３分の遅れで
３０分間にわたって行われた（ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液は、４ｍｌのトリフルオロ酢酸を４Ｌのアセトニトリルに添加することにより調製された）。カラム流
速は５ｍｌ／分であり、１分間隔で画分を採集した。画分１８が著しくＧｓＡＦ
Ｉに富んでいた。画分１７もＧｓＡＦＩペプチドを含有していたが、最も精
製された画分１８より少量であった。画分１８および所望により画分１７の凍結
乾燥および再懸濁の後、より狭い濃度勾配のＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液を用いてさらに分離を行った。

【００５１】画分１８（および所望により１７）をゾルバックス（登録商標）ＲＸ−Ｃ８半
調製用カラムに付与し、濃度勾配２４〜３０％のＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液を用い、３分の遅れで２４分間にわたって分画した。主ＵＶ吸収ピークを、ピークテ
イル（ｐｅａｋ−ｔａｉｌｓ）を除いて手動で採集した。この工程後、試料の純
度は通常は少なくとも８５％であることが認められた。

【００５２】上記の工程で採集した主ＵＶ吸収ピークをゾルバックス（登録商標）ＲＸ−Ｃ
８半調製用カラム上で（流速５ｍｌ／分）、濃度勾配２０〜５０％のＴＦＡ／Ｃ
Ｈ₃ＣＮ緩衝液を用い、３分の遅れで３０分間にわたってさらに精製した。２２分で溶出した最初のピークを、ピークテイルを除いて手動で採集した。ＧｓＡＦ
Ｉ試料の純度は約９８％の純度であることが認められた。

【００５３】場合により、ＧｓＡＦＩ試料をゾルバックス（登録商標）ＲＸ−Ｃ８半調製
用カラム上で、きわめて狭い濃度勾配４８〜５１％のＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液に２１分間にわたって暴露し、次いで凍結乾燥すると、質量が１６ダルトン異な
る２種類のＲＰ−ＨＰＬＣ分離可能なペプチドが現れた。他のペプチド試料を用
いて行った内部試験から、この質量の差は一次アミノ酸配列の相異によるもので
はなく、側鎖付加物を反映している可能性が最も高いと思われる。

【００５４】Ｂ．ペプチドの解明１．分子量およびジスルフィド橋アサインのエレクトロスプレー質量分析（Ｅ
Ｓ−ＭＳ）：質量分析計（ＶＧ／ファイソンズ（Ｆｉｓｏｎｓ）ＱＵＡＴＴＲＯ、ファイソ
ンズ・インスツルメンツ、英国マンチェスター）を連続捕捉モードで用いて、こ
のペプチドについてエレクトロスプレースペクトル（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ
ｓｐｅｃｔｒａ）を得た。各試料について（Ｍ＋５Ｈ）³⁺、（Ｍ＋４Ｈ）⁴⁺お
よび（Ｍ＋５Ｈ）⁵⁺電荷状態を観察し、換算してゼロ電荷状態スペクトルを求め
た。天然／酸化状態および還元状態の両方のペプチドについて分析を行った。凍
結乾燥ＧｓＡＦＩを０．５Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１ＭＮ−
エチルモルホリン（ｐＨ８．５）中、３８Ｃで１０分間、還元した。約２００〜
４００ｐｍｏｌｅ（ピコモル）のペプチドを含有するフローインジェクションを
測定した。ＧｓＡＦＩの平均分子量は３７０７．５ダルトン（Ｄａ）と測定さ
れた。チオール還元後、平均分子量は３７１３．５ダルトンと測定された。各ジ
スルフィド結合が還元されるとペプチドの質量は２Ｄａ増加するので、６Ｄａの
質量シフトに基づけば、これらのペプチドは３つのジスルフィド結合を含む。

【００５５】天然の酸化ペプチドを改質トリプシン（ベーリンガー・マンハイム）およびエ
ンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎプロテアーゼの組合わせにより消化した。得られ
たタンパク質分解生成物の混合物を液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレ
ー質量分析して、ジスルフィド結合をアサインした。ＧｓＡＦＩペプチドのア
ミノ酸９と２１を連結するジスルフィド橋を含む多数のペプチドが観察された。
ｐＨ８でタンパク質分解を行うと、ジスルフィド橋のスクランブリング（ｓｃｒ
ａｍｂｌｉｎｇ）が起きる可能性がある；しかしタンパク質分解生成物のランダ
ム化はみられず、この場合、ジスルフィド結合スクランブリングの可能性はない
と考えられる。残りのジスルフィド橋の結合は樹立されなかった。マトリックス
介助レーザーデソープションイオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量
分析（ＶＧ分析用／ファイソンズＴＯＦＳｐｅｃ−ＳＥ、ファイソンズ・インス
ツルメンツ、英国マンチェスター）による、粗製タンパク質分解生成物混合物の
その後の分析で、エレクトロスプレー質量分析測定が確認された。

【００５６】２．還元ペプチド、ピリジルエチル化天然ペプチドおよびタンパク質分解消化
フラグメントのＮ−末端配列分析気相シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ４７５、カリフォルニア
州フォスター・シティー）によりＮ−末端配列決定を行った。１６．５％高架橋
度トリス−トリシン（Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ）ゲルを用いてＳＤＳ−Ｐａｇ
ｅを行い（Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄＧ．ｖｏｎＪａｇｏｗ，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６：３６８−３７９，１９８７）、Ｍａｔｓｕｉｄａ
ｒａ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１００３５−１００３８の記
載に従ってＰｒｏＢｌｏｔ（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州
フォスター・シティー）にエレクトロブロット（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ）した
。エレクトロブロットしたバンドを、Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄＪ．Ｅ
．Ｄｉｘｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６１：５２４−５２８，１９８
７に記載の方法に従って、気相でピリジルエチル化した。カルボキシル基の活性
化およびセクアロン（ｓｅｑｕａｌｏｎ）メンブラン（ミノポア社、マサチュセ
ッツ州ミルフォード）を用いるアリールアミン誘導体化ポリビニリデンジフルオ
リドとの反応によるペプチドの共有結合を、製造業者の指示に従って行った。還
元（Ｃｙｓに対して１００倍のジチオトレイトール、モル基準）ＧｓＡＦＩペ
プチドのＶ８タンパク質分解消化を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
．８）中で１８時間、酵素：基質比１：４４を用いて行った。ＲＰ−ＨＰＬＣに
よりフラグメントを単離し、配列分析前にレーザーデソープション／イオン化質
量分析によりそれらの質量を分析した。試料を、コーティングされたディスク上
にそのままの溶液として、または共有結合物としてシークエンサーに付与し、カ
ルボキシル末端酸性化／アミド化を確認した。下記に示すのはペプチドＧｓＡＦ
Ｉについて得た配列である。ＧｓＡＦＩペプチドのアミド化は、無傷の天然
ペプチドについての、またはＶ８（またはトリプシン）カルボキシル末端フラグ
メントそれぞれについてのＥＳ−ＭＳデータにより支持される。

【００５７】ペプチドＧｓＡＦＩについて得た配列は下記のとおりである：

【００５８】

【化２２】

【００５９】Ｌｅｕ−ＮＨ２は、末端ロイシン残基がアミド化されていること、すなわち末端
ロイシン残基の遊離末端が−ＣＯＯＨではなく−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ₂で終わっていることを表す。このペプチドのアミノ酸配列は、アミノ末端から出発して示さ
れている。

【００６０】３．ＵＶスペクトル分析：これらのペプチドについて、８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計（ヒュー
レット・パッカード、米国ペンシルベニア州アボンデール）を用いて完全なスペ
クトルを得た。最終ペプチドの濃度は、Ａｂｓ_280nmから推論された。３Ｔｒｐ、１Ｔｙｒおよび６Ｃｙｓからの別個の寄与に基づいて計算した、２８０ｎｍで
のＧｓＡＦＩのモル吸光係数は１８７１０である。厳密な秤量に十分なペプチ
ドが単離された場合（かつＴＦＡ塩の結果として適切なペプチド含量であると仮
定して）、各濃度値は良好に一致した。定量法および多数の天然ＧｓＡＦＩ調
製物を用いて、ＧｓＡＦＩの毒濃度は約５００〜７５０μＭであると推定され
る。

【００６１】

【実施例２】−ペプチドＧｓＡＦＩＩの単離および解明Ａ．ペプチドの単離粗製グラモストラ・スパチュラタ毒は、凍結アリコートとして業者スパイダー
・ファーム社（米国１９０５３、ペンシルベニア州フィースタービル）により供
給された。ゾルバックス（登録商標）Ｒｘ−Ｃ８半調製用カラム（２５ｃｍ×９
．４ｍｍ）および分析用カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）（マック−モッド・ア
ナリティカル社、ペンシルベニア州ウェストチェスター；ゾルバックス（登録商
標）Ｒｘ−Ｃ８は、ポアサイズ３００Åをもち、ジイソプロピルオクチル側鎖で
共有結合的に修飾された、直径５ミクロンのシリカマイクロスフェア粒子からな
る）、およびＣ−１８分析用カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ）（バイダック）、
カリフォルニア州ヘスペリア；ポアサイズ３００Åをもち、オクタデシル側鎖で
共有結合的に修飾された、直径５ミクロンのシリカマイクロスフェア粒子からな
る）を用いて、毒の逆相高圧液体クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）を行った。半調製規模のＲＰ−ＨＰＬＣは５ｍｌ／分の流速を用いて行われ
、これに対し分析用分析には１ｍｌ／分の流速を用いた。

【００６２】溶出物の検出を２１５ｎｍでの紫外（ＵＶ）分光法により監視し、画分を１分
間隔で採集するか、または紫外線強度に基づいて手動で採集した。初回注入体積
を粗製毒３０〜５０μｌとした。したがって精製の各段階で多数回の分画を行い
、個々の同等画分（ｉｄｅｎｔｉｃａｌｆｒａｃｔｉｏｎｓ）をプールした。
すべての画分を凍結乾燥した後、その後の精製またはインビボ鎮痛試験のために
ＨＰＬＣ用Ｈ₂Ｏに再懸濁した。再懸濁体積は、元の粗製毒体積に基づいた。ＲＰ−ＨＰＬＣにより９０％を超える均質性であると思われる試料について評価を
行った。試料を再懸濁後、４度Ｃで保存した。保存またはプラスチックもしくは
ガラスへの付着による検出可能な活性損失は証明されなかった。

【００６３】ゾルバックス（登録商標）ＲＸ−Ｃ８半調製用カラム上での粗製グラモストラ
・スパチュラタ毒の最初の分画は、濃度勾配２０〜５０％のＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液（アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸）を用い、３分の遅れで
３０分間にわたって行われた（ＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液は、４ｍｌのトリフルオロ酢酸を４Ｌのアセトニトリルに添加することにより調製された）。カラム流
速は５ｍｌ／分であり、１分間隔で画分を採集した。画分１９が著しくＧｓＡＦ
ＩＩに富んでいた。画分１９の凍結乾燥および再懸濁の後、より狭い濃度勾配
のＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液を用いてこの画分をさらに分離した。

【００６４】画分１９をゾルバックス（登録商標）ＲＸ−Ｃ８半調製用カラムに付与し、濃
度勾配２９〜３３％または３０〜３４％のＴＦＡ／ＣＨ₃ＣＮ緩衝液を用い、３分の遅れで２４分間にわたって分画した。主ＵＶ吸収ピークを、ピークテイルを
除いて手動で採集した。この工程後、試料の純度は通常は少なくとも８５％であ
ることが認められた。主ＵＶ吸収ピークを、濃度勾配２０〜５０％のＴＦＡ／Ｃ
Ｈ₃ＣＮ緩衝液を用い、３分の遅れで３０分間にわたってさらに精製した。２３．５分で溶出した最初のピークを、ピークテイルを除いて手動で採集した。Ｇｓ
ＡＦＩＩ試料の純度は約９８％の純度であることが認められた。

【００６５】Ｂ．ペプチドの解明実施例１にペプチドＧｓＡＦＩについて記載した方法で、ペプチドＧｓＡＦ
ＩＩを解明した。ＧｓＡＦＩＩの平均分子量は３９７９．９ダルトン（Ｄａ
）と測定された。チオール還元後、平均分子量は３９８５．９Ｄａであった。各
ジスルフィド結合が還元されるとペプチドの質量は２Ｄａ増加するので、６Ｄａ
の質量シフトに基づけば、これらのペプチドは３つのジスルフィド結合を含む。

【００６６】アミノ酸組成分析は、アミノ酸分析装置を用いて行われた（アプライド・バイ
オシステムズ４２０Ｈ、カリフォルニア州フォスター・シティー）。データの正
規化をロイシンに関して行った。エドマン（Ｅｄｍａｎ）Ｎ−末端配列分析に関
しては、残基／モル値に不一致は記録されなかった（加水分解に際して部分的ま
たは全体的に破壊された残基を除く）。

【００６７】アミノ酸組成分析により、次表に示すデータが得られた。この分析でトリプト
ファンは完全に破壊され、システインは部分的に破壊されたので、それらの存在
は、それぞれＵＶ分光法およびエレクトロスプレー質量分析により推測された。
残基／モル値は基準としてのＬｅｕに基づいて計算された。

【００６８】

【表１】

【００６９】ペプチドＧｓＡＦＩＩのアミノ酸配列を以下に示す：

【００７０】

【化２３】

【００７１】ＧｓＡＦＩＩの位置３１におけるＴｒｐの推論は、アミノ酸組成データおよ
びＥＳ−ＭＳ分析に基づく。具体的には、エドマン推論配列についての計算質量
値と天然ペプチドについての質量分析との説明されていない相異は、遊離酸カル
ボキシル末端であると推定して１８６Ｄａ、カルボキシル末端がアミド化されて
いる場合は１８７Ｄａである。この質量差（＋または−１Ｄａ）は、多重のアミ
ノ酸の組合わせにより説明できる。しかしこれらの組合わせはいずれもアミノ酸
組成データと良く一致しない。内部Ｔｒｐの質量は１８６Ｄａであり、Ｔｒｐは
加水分解条件下で破壊されるので、遊離酸としてのＴｒｐを仮に位置３１にアサ
インした。このアサインはその後、トリプシン消化後に単離したＧｓＡＦＩＩ
のカルボキシルフラグメントを分析することにより支持された。このフラグメン
トの高分解能質量分析およびＭＳ−ＭＳ配列決定分析の両方が、カルボキシル末
端に遊離酸Ｔｒｐが存在することを証明する。これらのデータは、合成により調
製したＬｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐペプチドについて等しい分析結果が得ら
れて、さらに確証された。さらに、天然ペプチドフラグメントおよび合成フラグ
メント両方のＲＰ−ＨＰＬＣ保持プロフィルが一致した。

【００７２】４Ｔｒｐ、１Ｔｙｒの存在および６Ｃｙｓからのわずかな寄与に基づいて、Ｇ
ｓＡＦＩＩについて２８０ｎｍでのモル吸光係数２４３１０が推論された。こ
の数値を用いると、天然ＧｓＡＦＩＩ調製物のＵＶ分光法によりこのペプチド
の毒濃度が約３〜５Ｍであると推定される。

【００７３】

【実施例３】−鎮痛性評価−尾フリック潜伏この試験は、ラットが脊髄仲介反射機序により、その尾を、この付属物（尾）
の背面に収束させた高強度光源（ＩＩＴＣ社／ライフ・サイエンシズ・インスツ
ルメント、９１３６７カリフォルニア州ウッドランド・ヒルズ）から引き去るの
に要する時間間隔を測定する。光ビームの強度は、未経験動物がそれらの尾を２
〜４秒以内に引き去るように実験的に決定された。二次的な組織損傷の量を少な
くするために、光源の最大カットオフ時間を１０秒に設定した。

【００７４】データは、絶対時間、または下記の方程式で表される最大可能効果（ｍａｘｉ
ｍａｌｐｏｓｓｉｂｌｅｅｆｆｅｃｔ，ＭＰＥ）の％として表示され、１０
秒が最大である：％ＭＰＥ＝（処置後潜伏時間−処置前潜伏時間）１０−処置前潜伏時間（潜伏時間（ｌａｔｅｎｃｙ）は、動物がその尾を光源から引き去る前の時間量
を表す）ＧｓＡＦＩ投与：拘束を最小にして、ペプチドＧｓＡＦＩを、若い（７５〜１５０ｇ）の雄ス
プラーグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（チャールズ・リ
バーズ・ラボラトリーズ、０１８８７マサチュセッツ州ウィルミントン）にくも
膜下（ｉ．ｔｈ．）注射した。くも膜下注射は、脊髄くも膜下腔の腰椎部棘突起
Ｌ４とＬ５の間に、３／８インチ×２８Ｇ注射針を備えた１０μＬハミルトン注
射器を用いて行われた。投与量は、吸光係数１８７１０を用いて２８０ｎｍでの
紫外線吸収値から推論された濃度に基づいた。注射量は１０μＬであった。注射
ビヒクルは食塩水または０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／食塩水であっ
た。ラットを光源暴露の３０分前にＧｓＡＦＩで前処置した。

【００７５】尾フリック応答の完全阻害（すなわち１０秒を超える潜伏時間）は、１８０ピ
コモル（ｐｍｏｌｅ）（６６６ナノグラム）のＧｓＡＦＩを投与した後に大部
分のラットにおいて記録された。この用量で９５％ＭＰＥが達成され、運動障害
、四肢機能障害／麻痺、立直り反射、鎮静などの副作用は最小であるか、または
なかった。用量を対数的に減少させると、効果が急速に失われた。１８ｐｍｏｌ
ｅ（６６ナノグラム）のＧｓＡＦＩは２９％のＭＰＥを生じ、１．８ｐｍｏｌ
ｅ（６．６ナノグラム）のＧｓＡＦＩは無効（不活性）であった。前処置時間
３０分で最大活性が検出された。

【００７６】ＧｓＡＦＩＩ投与：拘束を最小にして、ペプチドＧｓＡＦＩＩを、若い（７５〜１５０ｇ）の雄
スプラーグ−ドーレイラット（チャールズ・リバーズ・ラボラトリーズ、０１８
８７マサチュセッツ州ウィルミントン）に、脊髄くも膜下腔の腰椎部棘突起Ｌ４
とＬ５の間に、３／８インチ×２８Ｇ注射針を備えた１０μＬハミルトン注射器
を用いてくも膜下注射した。投与量は、推定モル吸光係数２４３１０を用いて２
８０ｎｍでの紫外線吸収値から推論された濃度に基づいた。注射量は１０μＬで
あった。注射ビヒクルは食塩水または０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／
食塩水であった。ラットを光源暴露の１５分前にＧｓＡＦＩＩで前処置した。

【００７７】尾フリック応答の完全阻害（すなわち１０秒を超える潜伏時間）は、２．３３
ナノモル（ｎｍｏｌｅ）（９．２７マイクログラム）のＧｓＡＦＩＩを投与し
たすべての動物（ｎ＝８）において記録された。動物に５８３ｐｍｏｌｅ（２．
３３マイクログラム）のＧｓＡＦＩＩを投与した場合、６匹中５匹の動物に１
００％のＭＰＥが記録され、この用量での平均ＭＰＥは９２％であった。ＧｓＡ
ＦＩと同様に、これらの用量で著しい副作用は検出されなかった。

【００７８】

【実施例４】−鎮痛性評価−ホットプレート閾値この試験では、ラットが加熱面からその後脚の一方を自発的に取り去り、影響
を受けた脚を振るか、またはなめる（ｌｉｃｋ、リッキングする）時点の温度を
測定する。加熱面の温度は実験的に推論した３８度Ｃの値に予め設定され、５３
度Ｃまたは５４度Ｃの最大カットオフ値を採用した。データは絶対温度（度Ｃ）
として、または次式で記載される最大可能効果％として表される。％ＭＰＥ＝（後潜伏値−前潜伏値）５３−前潜伏値（５４が最大値である場合、５３の代わりに５４を挿入する）ＧｓＡＦＩ投与：拘束を最小にして、ペプチドＧｓＡＦＩを、若い（７５〜１５０ｇ）の雄ス
プラーグ−ドーレイラット（チャールズ・リバーズ・ラボラトリーズ、０１８８
７マサチュセッツ州ウィルミントン）に、脊髄くも膜下腔の腰椎部棘突起Ｌ４と
Ｌ５の間に、３／８インチ×２８Ｇ注射針を備えた１０μＬハミルトン注射器を
用いてくも膜下注射した。投与量は、吸光係数１８７１０を用いて２８０ｎｍで
の紫外線吸収値から推論された濃度に基づいた。注射量は１０μＬであった。注
射ビヒクルは食塩水または０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／食塩水であ
った。ラットを熱暴露の３０分前にＧｓＡＦＩで前処置した。

【００７９】３０分の前処置間隔で、１８０ｐｍｏｌｅ（６６６ナノグラム）のＧｓＡＦ
Ｉが７０％のＭＰＥを生じた。用量を１０倍減少させると（１８ｐｍｏｌｅに）
、活性が有意に失われた。１時間の前処置で多数回投与において、より大きな有
効性が得られた。１時間の前処置では、１８０ｐｍｏｌｅ（６６ナノグラム）の
ＧｓＡＦＩが９１％のＭＰＥを生じ、１８ｐｍｏｌｅ（６．６ナノグラム）が
２４％のＭＰＥを生じた。これらの用量で運動に対する不都合な影響はみられな
かった。これは、動物の前脚が閾値より低い温度で応答性であり、温度を高める
と前脚を加熱面から速やかに持ち上げたという所見により確証された。

【００８０】ＧｓＡＦＩＩ投与：拘束を最小にして、ペプチドＧｓＡＦＩＩを、若い（７５〜１５０ｇ）の雄
スプラーグ−ドーレイラット（チャールズ・リバーズ・ラボラトリーズ、マサチ
ュセッツ州ウィルミントン）に、脊髄くも膜下腔の腰椎部棘突起Ｌ４とＬ５の間
に、３／８インチ×２８Ｇ注射針を備えた１０μＬハミルトン注射器を用いてく
も膜下注射した。投与量は、吸光係数１８７１０を用いて２８０ｎｍでの紫外線
吸収値から推論された濃度に基づいた。注射量は１０μＬであった。注射ビヒク
ルは食塩水または０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／食塩水であった。ラ
ットを熱暴露の１５分前にＧｓＡＦＩＩで前処置した。

【００８１】２．３３ｎｍｏｌｅ（９．２７マイクログラム）用量のＧｓＡＦＩＩを投与
したすべての動物（ｎ＝８）において、１００％のＭＰＥが記録された。用量を
５８３ｐｍｏｌｅ（２．３２マイクログラム）に減少させると、５９％の平均Ｍ
ＰＥが記録された。これらの用量で運動共調問題（ｍｏｔｏｒｃｏｏｒｄｉｎ
ａｔｉｏｎｐｒｏｂｌｅｍｓ）はみられなかった。

【００８２】

【実施例５】−鎮痛性評価−フォンフレイ閾値この試験では、ラットが自発的に強引な逃避運動で後脚を引き去るか、または
鳴き声をあげるまで、後脚の背面に次第に太いフィラメントを当てる。フィラメ
ントの太さには任意の数値を付し、これを下記の方程式により重量グラムに換算
できる：重量グラム＝１０⁽フォンフレイスコア^-1) １０００データは絶対重量グラム値として、または次式で記載される最大可能効果（ＭＰ
Ｅ）％として表される。％ＭＰＥ＝（後潜伏値−前潜伏値）４４６．７−前潜伏値ＧｓＡＦＩ投与：注射の３０分後に試験した場合、１８０ｐｍｏｌｅ（６６６ナノグラム）およ
び１８ｐｍｏｌｅ（６６ナノグラム）のＧｓＡＦＩが、それぞれ９３％および
２４％のＭＰＥを生じた。前処置期間を１時間に延長すると、１８０ｐｍｏｌｅ
用量では１００％のＭＰＥ、１８ｐｍｏｌｅ（６．６ナノグラム）用量では２２
％のＭＰＥが得られた。著しい副作用はなかった。

【００８３】ＧｓＡＦＩＩ投与：注射の３０分後に試験した場合、２．３３ｎｍｏｌｅ（９．２７マイクログラ
ム）用量のＧｓＡＦＩＩが８３％のＭＰＥを生じた。５８３ｐｍｏｌｅ（２．
３２マイクログラム）用量のＧｓＡＦＩは４８％のＭＰＥを生じた。高い方の
用量で、試験したラットの７５％が最大鎮痛活性（すなわち１００％のＭＰＥ）
を示した。ＧｓＡＦＩのデータに基づいて、より長い前処置を採用するとより
大きな鎮痛効果が得られると推測される。

【００８４】

【実施例６】−鎮痛性評価−ホルマリン疼痛試験この試験のための有害刺激は、動物の後脚の一方の背面への５％ホルマリン溶
液皮下注射である。この試験に用いた運動活性指数は、１）その付属物（脚）を
リッキングするのに費やした全時間、および２）刺激した脚のフリンチ（ｆｌｉ
ｎｃｈｉｎｇ、引取り）／揺らし（ｓｈａｋｉｎｇ）応答の全回数である。デー
タ収集は、脚にホルマリン溶液を注射した直後から開始される。短期応答は、ホ
ルマリン注射後０〜５分の期間で判定される。長期応答は、ホルマリン注射後２
０〜３５分の期間で判定される。データ収集をコンピュータ処理フォーマットで
行う。データの表示は、絶対値を用いて、または食塩水ビヒクル注射後の応答レ
ベルにより定められる対照に対する％として行われる。

【００８５】ＧｓＡＦＩ投与：拘束を最小にして、ペプチドＧｓＡＦＩを、若い（７５〜１５０ｇ）の雄ス
プラーグ−ドーレイラット（チャールズ・リバーズ・ラボラトリーズ、０１８８
７マサチュセッツ州ウィルミントン）に、脊髄くも膜下腔の腰椎部棘突起Ｌ４と
Ｌ５の間に、３／８インチ×２８Ｇ注射針を備えた１０μＬハミルトン注射器を
用いてくも膜下注射した。投与量は、吸光係数１８７１０を用いて２８０ｎｍで
の紫外線吸収値から推論された濃度に基づいた。注射量は１０μＬであった。注
射ビヒクルは食塩水または０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／食塩水であ
った。ラットをホルマリン溶液注射の３０分前にＧｓＡＦＩで前処置した。

【００８６】１８０ｐｍｏｌｅ（６６６ナノグラム）、１８ｐｍｏｌｅ（６６ナノグラム）
のＧｓＡＦＩが９１％のＭＰＥを生じ、１．８ｐｍｏｌｅ（６．６ナノグラム
）のＧｓＡＦＩ注射後、下記の結果が得られた。数値は対照に対する％として
示され、絶対レベルをかっこ内に示す。

【００８７】

【表２】

【００８８】ＧｓＡＦＩＩ投与：拘束を最小にして、ペプチドＧｓＡＦＩＩを、若い（７５〜１５０ｇ）の雄
スプラーグ−ドーレイラット（チャールズ・リバーズ・ラボラトリーズ、０１８
８７マサチュセッツ州ウィルミントン）に、脊髄くも膜下腔の腰椎部棘突起Ｌ４
とＬ５の間に、３／８インチ×２８Ｇ注射針を備えた１０μＬハミルトン注射器
を用いてくも膜下注射した。投与量は、前記のように２８０ｎｍでの紫外線吸収
値から推論された濃度に基づいた。３９８０Ｄａの質量に基づくと、ＧｓＡＦ
ＩＩの５８３ｐｍｏｌｅは２．３マイクログラムに相当し、ＧｓＡＦＩＩの２
．３３ｎｍｏｌｅは９．３マイクログラムに相当する。注射量は１０μＬであっ
た。注射ビヒクルは食塩水または０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／食塩
水であった。ラットをホルマリン注射の１５分前にＧｓＡＦＩＩで前処置した
。

【００８９】

【表３】

【００９０】前記分析のほか、１８０ｐｍｏｌｅ（６６６ナノグラム）のＧｓＡＦＩを５
％ホルマリン注射の５分後に投与し、前記に従って長期応答を記録した。有効性
の高いＧｓＡＦＩの活性が保持された。長期フリンチ応答（ｔｏｎｉｃｆｌ
ｉｎｃｈｒｅｓｐｏｎｓｅ）は８６％阻害され（すなわち対照の１４％）、長
期リッキング期間は９１％短縮された（すなわち対照の９％）。この特性は、μ
−オピオイド受容体と相互作用する強い鎮痛性化合物についてのみ報告されてい
る。これは、ＧｓＡＦＩの鎮痛活性が感覚線維（主にｃ−線維）の初期の迅速
な作動開始（ｆｉｒｉｎｇ）の妨害、または後角ニューロン内でワインドアップ
の閉塞によるものではないことも証明する。

【００９１】

【実施例７】−鎮痛性評価−オピオイド受容体試験ＧｓＡＦＩおよびＩＩの抗侵害受容効果がオピオイド受容体により仲介され
るか否かを判定するために、若い（７５〜１５０ｇ）の雄スプラーグ−ドーレイ
ラット（チャールズ・リバーズ・ラボラトリーズ、マサチュセッツ州ウィルミン
トン）を、モルフィンの抗侵害受容活性を復帰させる用量のオピオイドアンタゴ
ニストで前処置した。次いで動物を尾フリック試験（実施例３）およびフォンフ
レイ試験（実施例５）で試験した。１８０ｐｍｏｌｅ（６６６ナノグラム）のＧ
ｓＡＦＩをくも膜下投与する５分前の１０ｍｇ／ｋｇナロキソン（ｎａｌｏｘ
ｏｎｅ）皮下投与は、１０分後（すなわち、ＧｓＡＦＩ投与の１０分後であっ
て、ナロキソン皮下投与の１５分後）に測定して、ＧｓＡＦＩ（１８０ｐｍｏ
ｌｅ、くも膜下）の鎮痛活性を阻止できなかったが、モルフィン（３μｇ、くも
膜下）の鎮痛効果には完全に拮抗した。さらに、１８０ｐｍｏｌｅのＧｓＡＦ
Ｉをくも膜下投与する直前のナロキソン（５０μｇ）くも膜下投与は、１０分後
に測定して、鎮痛応答を阻止できなかったのに対し、くも膜下モルフィン（３μ
ｇ）の復帰が測定された。

【００９２】また、不可逆的オピオイドアンタゴニストであるＢ−フナルトレキサミン（ｆ
ｕｎａｌｔｒｅｘａｍｉｎｅ）による前処置（ＧｓＡＦＩ注射の１８時間前に
５μｇをくも膜下投与）は、ホットプレート試験（実施例４）またはホルマリン
試験（実施例６）のいずれにおいても、ＧｓＡＦＩの鎮痛活性を阻止できなか
った。ＧｓＡＦＩ（おそらくＧｓＡＦＩＩも）の鎮痛プロフィルは、非オピ
オイド受容体関連機序で仲介される高い有効性を示す。

【００９３】

【実施例８】−ＧｓＡＦＩとモルフィンの交差耐性に関する鎮痛性評価ヒトおよびげっ歯類にモルフィンを反復投与すると、いかなる各用量について
も鎮痛応答性が低下し、すなわち用量応答曲線が左方シフトする。耐性と呼ばれ
るこの現象により、同等の疼痛軽減を維持するためのモルフィン用量が経時的に
漸増する。臨床的には、負の副作用（すなわち鎮静、便秘、呼吸抑圧など）と対
比した鎮痛に対する耐性発現の差が、長期治療方式におけるモルフィンの有用性
を制限する可能性がある。耐性の生理学的根拠は完全には理解されていないが、
推定鎮痛性化合物はそれらの有効性がモルフィン投与の結果変化する（すなわち
モルフィン交差耐性）か否かを判定する評価を行うことができる。若い（７５〜
１５０ｇ）の雄スプラーグ−ドーレイラット（チャールズ・リバーズ・ラボラト
リーズ、マサチュセッツ州ウィルミントン）に、１日２回、６日間、漸増量（す
なわち２．５ｍｇ／ｋｇ／回−１日目；５ｍｇ／ｋｇ／回−２日目；１０ｍｇ／
ｋｇ／回−３日目；２０ｍｇ／ｋｇ／回−４および５日目；２５ｍｇ／ｋｇ／回
−６日目）のモルフィン、またはビヒクル対照としての食塩水を皮下投与した。
７日目に、ホルマリン疼痛試験の長期フリンチ応答（実施例６に記載）により、
モルフィンとＧｓＡＦＩの鎮痛活性を試験した。モルフィンおよびＧｓＡＦ
Ｉの用量応答測定は、若い（７５〜１５０ｇ）の雄スプラーグ−ドーレイラット
（チャールズ・リバーズ・ラボラトリーズ、０１８８７マサチュセッツ州ウィル
ミントン）へのくも膜下投与により行われた。拘束を最小にして、モルフィンま
たはＧｓＡＦＩを脊髄くも膜下腔の腰椎部棘突起Ｌ４とＬ５の間に、３／８イ
ンチ×２８Ｇ注射針を備えた１０μＬハミルトン注射器を用いて注射した。Ｇｓ
ＡＦＩの投与量は、吸光係数１８７１０を用いて２８０ｎｍでの紫外線吸収値
から推論された濃度に基づいた。注射量は、モルフィンおよびＧｓＡＦＩとも
１０μＬであった。モルフィンおよびＧｓＡＦＩのビヒクル対照は、それぞれ
食塩水および０．１％ＢＳＡ／食塩水であった。

【００９４】モルフィンで６日間処置し、次いでモルフィン投与の結果としての鎮痛誘導を
７日目に評価した動物は、食塩水ビヒクルを与えた動物と対比して、有意に左方
への用量応答曲線シフト（３００倍）を示した（食塩水対照群についてはＥＤ₅₀ ＝０．１ｕｇ、くも膜下；モルフィン処置群についてはＥＤ₅₀＞３０ｕｇ、くも
膜下）。ＥＤ₅₀は、最大鎮痛効果の５０％を与えるのに必要な用量である。これ
に対しＧｓＡＦＩの用量応答特性は、この試験の２つの処置群について有意差
がなかった（食塩水対照群についてはＥＤ₅₀−２６．７ｐｍｏｌｅ、くも膜下；
モルフィン処置群についてはＥＤ₅₀−２０ｐｍｏｌｅ、くも膜下）。これは、予
めモルフィンに暴露してもＧｓＡＦＩの鎮痛特性は変化せず、すなわち、交差
耐性が生じないことを示す。

【００９５】

【実施例９】−鎮痛性評価−急性炎症疼痛試験組織傷害は、傷害部位および隣接組織部位の両方に炎症および痛覚過敏（すな
わち閾値を超える有害刺激に対する疼痛応答の程度や持続時間の亢進）を生じる
。炎症疼痛状態でのＧｓＡＦＩＩの抗痛覚過敏活性を評価するために、３５〜
４００ｇの成体雄スプラーグ−ドーレイラットにおいて、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ
ｅｔａｌ．，Ｐａｉｎ，３２：７７−８８，１９８８の方法に従って海草抽
出物カラゲニンを後脚に片側注射した後、脚引去り潜伏時間を測定した。要約す
ると、ラットをガラス板に乗せ、板の下側から後脚の表面へ向けて放射熱を収束
させることにより、引去り潜伏時間を測定する。板の表面から後脚を引き去るま
での秒数として、潜伏値を記録する。カラゲニン（４ｍｇ／後脚）注射の前に基
礎測定を行い、次いでカラゲニン注射の１５０分後に測定して、痛覚過敏応答レ
ベルを求める。２回目の測定の後、ＧｓＡＦＩまたはビヒクル（すなわち０．
１％ＢＳＡ／食塩水）を、脊髄の腰膨大部内に配置したくも膜下留置カニューレ
により投与する。化合物投与後、種々の時間間隔で脚引去り潜伏時間を測定する
ことにより、抗痛覚過敏活性を判定する。脚引去り潜伏と同時に、抗炎症活性お
よび抗発熱活性を検出するために、脚体積および脚温度を測定する。

【００９６】

【表４】

【００９７】痛覚過敏は試験したすべての動物に検出された。上の表に示すように、カラゲ
ニン注射後１５０分で、脚引去り時間が有意に短縮した。３ｎｍｏｌｅのＧｓＡ
ＦＩＩを投与すると、脚引去り潜伏が３０分でほぼ最大値（１７．８２±３．
７８秒）、６０分では予定したカットオフ値（２０．８秒）にまで高まることに
より、この痛覚過敏、熱誘発応答が完全に復帰した。脚体積または脚温度のいず
れにも有意の低下は検出されず、著しい運動損失または明らかな副作用の徴候は
なかった。ＧｓＡＦＩＩは急性末梢炎症疼痛に対する有効な鎮痛／抗痛覚過敏
性化合物である。鎮痛誘導に浮腫または体温の短期低下は伴わなかったので、Ｇ
ｓＡＦＩＩは抗炎症性はもたないと思われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/68 33/68 Ａ６１Ｋ 37/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人Ｆｅｒｎｈｕｒｓｔ，Ｈａｓｌｅｍｅｒｅ，ＳｕｒｒｅｙＧＵ27 ３ＪＥ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する精製ペプチド：【化１】
【請求項２】医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤、および下記のア
ミノ酸配列を有するペプチド：【化２】を含む医薬組成物。
【請求項３】鎮痛誘導活性を有する化合物の同定方法であって、下記のアミ
ノ酸配列を有するペプチド：【化３】または【化４】の活性を測定する生物学的アッセイに被験化合物を添加し；そして被験化合物の活性を検出する工程を含む方法。
【請求項４】ペプチドが下記のアミノ酸配列を有するペプチド：【化５】である、請求項３記載の方法。
【請求項５】ペプチドが下記のアミノ酸配列を有するペプチド：【化６】である、請求項３記載の方法。
【請求項６】ペプチド：【化７】または【化８】に対して特異的な抗体。
【請求項７】痛みの処置のための医薬の製造における、下記のアミノ酸配列
を有するペプチド：【化９】または【化１０】の使用。
【請求項８】痛みの処置のための、下記のアミノ酸配列を有するペプチド：【化１１】または【化１２】の使用。
【請求項９】痛みの処置方法であって、その処置を必要とする哺乳動物に、
有効鎮痛量の下記のアミノ酸配列を有するペプチド：【化１３】または【化１４】を投与する方法。