JPH11506737A

JPH11506737A - 小細胞肺ガンを治療または検出するためのコノトキシンペプチドｕ００２およびｍｉｉの使用

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Publication number: JPH11506737A
Application number: JP9500831A
Authority: JP
Inventors: オリベラ，バルドメラ・エム; クルツ，ローデス・ジェイ; ヒルヤード，ディビッド・アール; マッキントッシュ，ジェイ・マイケル; サントス，アメウルフィノ・エセ
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1999-06-15
Also published as: EP0844883A4; EP0844883A1; CA2223737A1; US5595972A; WO1996040211A1; AU695055B2; AU6250396A

Abstract

(57)【要約】本発明は、小細胞肺ガン(ＳＣＬＣ)を患う患者を治療し、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細には、α-コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２の使用に指向される。ＭＩＩおよびＵ００２は他のα-コノトキシンペプチドと同様にニューロンニコチン性受容体に結合するが、それらは、神経筋に対して顕著に低い親和性しか有していないことが判明した。ＳＣＬＣを患う患者は、本発明により、有効成分としてα-コノトキシンペプチドを含有する医薬組成物を好ましくは静脈内または筋肉内投与することによって治療する。ＳＣＬＣ腫瘍の存在または位置は、本発明により、検出し得るマーカーで標識したＭＩＩまたはＵ００２を対象に注射し、続いて標識したＭＩＩまたはＵ００２の結合を検出してＳＣＬＣ腫瘍の存在または位置を決定することによって、検出する。

Description

【発明の詳細な説明】小細胞肺ガンを治療または検出するためのコノトキシンペプチドＵ００２およびＭＩＩの使用本発明は、米国国立衛生研究所（Bethesda，Maryland）によって付与された補助金番号GM-22737下の政府補助金によってなされた。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。発明の背景本発明は、小細胞肺ガン(ＳＣＬＣ)を患う患者を治療し、あるいは、ＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための比較的短いペプチド、特に、ＭＩＩ-およびＵ００２-α-コノトキシンの使用に関する。発明の背景、特に、実施に関するさらなる詳細を提供する場合を説明するために本明細書中で用いる刊行物および他の材料は、出典明示して本明細書の一部とみなし、簡便性のため、以下の明細書中および添付した著者目録中に各々対応した群の数字で参照する。イモガイ属の軟体動物は、そのユニークな捕食生活様式を行えるようにする非常に高い毒性の毒を産生する。餌食動物は、銛(harpoon)および皮下注射針の両方の様式で機能するディスポーサブル中空(disposable hollow)歯である非常に特殊化された毒装置によって注射される毒によって固定される。毒性動物とその毒液を注入された餌食との間ほど印象的な生物間の関係は、ほとんど存在しない。毒は餌食を捕捉するための主要な武器としてか、または防御機構として使用され得る。これらの毒は、毒液を注入された動物の必須器官系を破壊し、これらの毒の多くは、神経筋系の受容体およびイオンチャンネルに指向された分子を含有する。捕食性イモガイ(イモガイ科(Conus))はユニークな生物学的戦略を発達させてきた。その毒は、種々の神経筋受容体を標的化する比較的小さなペプチドを含有し、植物のアルカロイドまたは微生物の二次代謝物と薬理学的多様性は同等であり得る。これらのペプチドの多くははっきりとした立体配置を有する最小核酸- コード翻訳産物の中に入り、それ自体が、幾分珍しい。このサイズ範囲のペプチドは、通常、多くの立体配置内で平衡化する。固定立体配置を有する蛋白質は、一般的により大きい。一般的に「コノトキシン」または「コノトキシンペプチド」と呼称されるこれらの毒性ペプチドを産生するイモガイは、ほぼ５００種よりなる毒性複足類動物の大きな属である。すべてのイモガイ種は、毒を注射して餌食を捕捉する捕食者であり、全体として毒を注入し得る属である動物のスペクトルは広い。広範な種々のハンティング戦略が用いられる；しかしながら、どのConus種も根本的には同一の毒注入の基本パターンを用いる。これらの魚類-ハンティング(fish-hunting)イモガイ毒中の主要な麻酔ペプチドは、同定され、特徴付けされた最初のものである。C．geographus毒においては、３つのクラスのジスルフィド-リッチなペプチド：α-コノトキシンペプチド (ニコチン性アセチルコリン受容体を標的化し、遮断する)：μ-コノトキシンペプチド(骨格筋Ｎａ⁺チャンネルを標的化し、遮断する)；および、ω-コノトキシンペプチド(シナプス前部ニューロンＣａ²⁺チャンネルを標的化し、遮断する)が見出された。しかしながら、各毒のクラスに複数の相同物が存在する；例えば、 C．geographus毒単独に存在する少なくとも５種の異なるω-コノトキシンペプチドが存在する。配列においてはかなりの変動が明らかであり、異なるω-コノトキシンペプチド配列をまず比較した場合、ジスルフィド結合に含まれるシステイン残基と１個のグリシン残基のみが不変動であることが判明した。C．geographu s毒中に見出されたもう１つのクラスのコノトキシンは、若齢マウスに眠りを引き起こし、老齢マウスに活動亢進状態を引き起こすコナントキンと呼称されるものであり、これはＮＭＤＡ受容体を標的化する。各イモガイ毒は、それ自体の特有の群または特性の異なるコノトキシン配列を有するようである。これらのペプチドの多くは、今日、神経科学においてかなり標準的な研究ツールとなっている。μ-コノトキシンペプチドは、筋肉Ｎａ⁺チャンネルを優先的に遮断するが、軸索Ｎａ⁺チャンネルは遮断しないその能力のために、軸索またはシナプス事象に影響を及ぼすことなく、骨格筋を固定するための簡便なツールである。ω-コノトキシンペプチドは、電位-感受性Ｃａ²⁺チャンネルを研究するための標準的な薬理学的試薬となってきており、シナプス前部末端および神経伝達物質放出を遮断するために使用される。α-コノトキシンは種々の臨床用途を有する。１つのかかる用途は、哺乳動物神経筋接合ｎＡＣｈＲのアンタゴニスト的遮断を達成するその能力のための、臨床的筋肉弛緩薬としてのその利用である。小細胞肺ガン(ＳＣＬＣ)細胞は、コリン作動性ニコチン性受容体を発現することが明らかにされている(Maneckjeeら(１９);Chiniら(２０);Tarroniら(２１)； Schullerら(２２))。これらのＳＣＬＣニコチン性受容体は、ニューロンタイプのものであることが示されている(Chiniら(２０)；Tarroniら(２１))。ニコチンおよびシトシンは、各々、ＳＣＬＣ細胞中で強力なマイトジェンとして作用する５-ヒドロキシトリプタミン(５ＨＴまたはセロトニン)の放出を刺激する(Maneck jeeら(１９)；Cattaneoら(２３))。α-コノトキシンＭＩは、セロトニンの放出を誘導するニコチンまたはシトシンを遮断し、１μＭ濃度でＳＣＬＣ不死化のニコチンおよびシトシン刺激に完全に拮抗する(Codignolaら(２４))。ニューロンタイプのニコチン性受容体に結合するα-コノトキシンは、ＳＣＬＣのごとき腫瘍の不死化を防ぐのに適しており、下記のごとく治療的に使用してかかる不死化を治療的に阻害することができる。これらのα-コノトキシンは、下記のごとく小細胞肺ガンの存在および／または位置を検出するために診断的に使用することもできる。Codignolaら(２４)はα-コノトキシンＭＩがこれらのＳＣＬＣ受容体に結合すると報告しているが、α-コノトキシンＭＩは治療および診断用途には適していない。なぜならば、それは、神経筋受容体にも結合し、死に至り得る完全麻痺を引き起こし得るからである。神経筋受容体に結合しないα-コノトキシンか、またはニコチン性ニューロン受容体と比してかかる受容体に遥かに低い親和性しか有していないα-コノトキシンが、治療または診断の目的に適している。前記の種々の一般特性を有するさらなるコノトキシンペプチド、および小細胞肺ガンを治療するための神経筋受容体に対して低い親和性しか有していないコノトキシンペプチドが求め続けられている。発明の概要本発明は、小細胞肺ガン(ＳＣＬＣ)を患う患者を治療するためか、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための、比較的短いペプチド、詳細にはα-コノトキシンペプチドＭＩおよびＵ００２の使用に指向される。ＭＩＩおよびＵ００２は他のα-コノトキシンペプチドと同様にニューロンニコチン性受容体に結合するが、それらが神経筋受容体に対して顕著に低い親和性しか有していないことが見出された。ＳＣＬＣを患う患者は、有効成分としてα-コノトキシンペプチドを含有する医薬組成物を投与することによって、本発明により治療する。該組成物は、一般的に、約２００ないし約２０００ナノモル、好ましくは５００ナノモルの有効成分を含有する、投与ユニット、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、注射剤、茶サジ一杯剤(teaspoonful)などを含有するであろう。投与の好ましい様式は、静脈内または筋肉内である。投与スケジュールは、用いる特定のα-コノトキシンペプチドの生物学的寿命に依存して、１日当たり１回から数日間毎日１回までのいずれかの範囲とし得る。ＳＣＬＣ腫瘍の存在または位置は、検出可能なマーカーで標識したＭＩＩまたはＵ００２を対象に注射し、続いて、標識ＭＩＩまたはＵ００２の結合を検出して、ＳＣＬＣ腫瘍の存在または位置を決定することによって、本発明により検出する。好ましい具体例の詳細な説明魚類-ハンティング・イモガイは、その餌食に毒物を注射するのに種々の麻酔性ペプチドを使用する。単離され、特徴付けられた最初のConusペプチドは、Con usgeographusの毒からの１３-アミノ酸塩基性ペプチド、α-コノトキシンＧＩであり、これは、脊椎動物の神経筋接合部でニコチン性アセチルコリン受容体を阻害する。α-コノトキシンは、多種の魚類-ハンティングConus種によって使用され、その餌食の神経筋接合部を遮断する。３種の異なる魚類-ハンティングConus種から６種のα-コノトキシンが生化学的に特徴付けられている。今日までにConus毒から精製されたすべてのα-コノトキシン(表Ｉに示す)は幾つかの共通した構造特徴を有し；高親和性α-コノトキシンに対する最小機能単位を規定する１２個の「コア」アミノ酸が存在し；６種の異なるα-コノトキシンからの共通配列を表に示す。最も普通でないα-コノトキシンは、さらなるジスルフィド結合がその中に存在するConus striatusからのα-コノトキシンSIIである。しかしながら、すべてのα-コノトキシンのコア配列の中には、２個のジスルフィド結合および多数の他のアミノ酸がよく保存されている。最近、C．geographusからのα-コノトキシンの予想前駆体構造が、α-コノトキシンＧＩおよびその相同体をコードするｃＤＮＡクローンの配列分析によって決定された。ＧＩの前駆体は、６４アミノ酸のプレプロペプチドである。一般的なConusペプチドについては、シグナル配列およびオープンリーディングフレームに隣接する３'非翻訳領域はかなり保存されている。ＰＣＲプライマーは、他のConus毒からのさらなるα-コノトキシン相同体の配列の予想を目的として、これらのα-コノトキシンＧＩ配列を用いて作製した。該戦略は、特定のConus毒輸送管からのメッセンジャーＲＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを用いて出発し、α -コノトキシンに関連する配列を選択的に増幅した。本発明は、小細胞肺ガン(ＳＣＬＣ)を患う患者を治療するか、またはＳＣＬＣ腫瘍の存在を検出するための比較的短いペプチド、詳細には、α-コノトキシンペプチドＭＩＩおよびＵ００２の使用に指向される。ＭＩＩおよびＵ００２は他のα-コノトキシンペプチドと同様にニューロンニコチン性受容体に結合するが、それらは神経筋受容体に対して顕著に低い親和性しか有していないことが見出された。従って、ＭＩＩおよびＵ００２はＳＣＬＣの診断および治療に特に適している。ＳＣＬＣを患う患者は、有効成分としてα-コノトキシンペプチドを含有する医薬組成物を投与することによって、本発明により治療する。該組成物は、一般的に、約２００ないし約２０００ナノモル、好ましくは５００ナノモルの有効成分を含有する投与ユニット、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、注射剤、茶サジ一杯剤などを含むであろう。投与の好ましい様式は、静脈内または筋肉内である。投与スケジュールは、用いる特定のα-コノトキシンペプチドの生物学的寿命に依存して、１日当たり１回から数日間にわたって１回までのいずれの範囲とすることもできる。ＳＣＬＣ腫瘍の存在または位置は、検出可能なマーカーで標識したＭＩＩまたはＵ００２を対象に注射し、続いて標識したＭＩＩまたはＵ００２の結合を検出してＳＣＬＣ腫瘍の存在または位置を決定することによって、本発明により検出する。Ａ-系統コノトキシンペプチドは、α-コノトキシンペプチド中の配列に対して、シグナル配列、およびコノトキシンペプチドをコードする遺伝子の３’-非翻訳領域に強力な相同性を有するコノトキシンペプチドである。Ａ-系統コノトキシンペプチドは、該シグナル配列および３'非翻訳領域をベースとするプライマーを用いて、毒輸送管ｍＲＮＡの逆転写によって調製したConus ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)増幅を行うことによって同定し得る。Ａ-系統コノトキシンペプチドには、α-コノトキシンペプチド、α- コノトキシン-様ペプチド、およびκ-コノトキシンペプチドが含まれる。詳細には、本発明において有用なα-コノトキシンペプチドは以下の配列を有する：Ｕ００２：Gly-Cys-Cys-Ser-Asp-Pro-Arg-Cys-Ala-Trp-Arg-Cys(配列番号：９ )。Ｃ-末端は好ましくはアミド化されている。ＭＩＩ：Gly-Cys-Cys-Ser-Asn-Xaa₁-Val-Cys-His-Leu-Glu-His-Ser-Asn-Leu-C ys(配列番号：１０)。Xaa₁はProまたはヒドロキシ-Proであってもよく、Ｃ-末端は好ましくはアミド化されている。 Conus種から精製したコノトキシンペプチドは、一般的に、多くのプロリル残基のProの代わりにヒドロキシ-Proを含有している。Proまたはヒドロキシ-Proのいずれかを用いて合成したコノトキシンペプチドは本明細書に記載する生物活性を有する。従って、Proまたはヒドロキシ-Proは、本明細書において同定したペプチドのいずれのプロリルまたはヒドロキシ-プロリル残基においても使用することができ、それらは同等であると考えられる。コノトキシンペプチドの修飾プロリル残基ないしヒドロキシ-Proへの翻訳後修飾に加えて、他の残基も貝中で翻訳後修飾される。これらの残基には、γ-カルボキシグルタメートまたはβ-カルボキシアスパルテートに各々修飾され得るＧｌｘまたはＡｓｘが含まれる。かかる修飾は、残基がコノトキシンペプチドのＮ-末端に存在する場合に見られる。さらなる翻訳後修飾には、Ｓｅｒおよび／またはＴｈｒ残基のグリコシル化が含まれ得る。従って、これらの修飾を有するコノトキシンペプチドは前記で特定した配列の同等物であると考えられ、本発明の範囲内に入る。精製および配列分析、ＰＣＲ増幅、組換えＤＮＡ技術などによるごとき、コノトキシンペプチドのアミノ酸配列を同定した後、成熟コノトキシンペプチドはさらに下記する慣用的な技術を用いて合成することができる。Ｕ００２およびＭII (以前はＭＧ-１とも命名されていた)をコードするＤＮＡは、WO 95/11256(１８) 記載のごとく得ることができる。これらのペプチドは化学合成するのに十分に小さい。前記のペプチドを調製する一般的化学合成は本明細書中にて後記する。１つのα-コノトキシンペプチドの特定の化学合成の一例は、WO 95/11256に示されている。これらのコノトキシンペプチドは、米国特許第4,447,356号(１)またはOliveraら(２)に記載されている技術を用いて、特定のConus種から単離し、精製することによっても得ることができる。該コノトキシンペプチドは数種のイモガイから精製することによっても得ることができるが、個々の貝から得ることができるコノトキシンペプチドの量は非常に少量なため、望ましい実質的に純粋なコノトキシンペプチドは、化学合成によって商業的に価値ある量で最良の実施で得られる。例えば、単一のイモガイからの収量は、約１０μｇ以下のＡ-系統コノトキシンペプチドである。「実質的に純粋な」とは、実質的に他の同タイプの他の生物学的分子が実質的に存在しないで、該ペプチドが存在することを意味し；それは、好ましくは少なくとも約８５重量％、好ましくは少なくとも約９５％のかかる存在する同タイプの生物学的分子(例えば、水、緩衝液および無害な小分子が存在し得る)の量で存在する。生物学的に活性なコノトキシンペプチドの化学合成は、アミノ酸配列の正確な決定の工程に依存する。該コノトキシンペプチドは、当該分野でよく知られている組換えＤＮＡ技術によっても作製し得る。かかる技術はSambrookら(３)によって記載されている。このようにして作製したペプチドを単離し、要すれば還元し、酸化させて正確なジスルフィド結合を形成させる。本発明のＡ-系統コノトキシンペプチドにおけるジスルフィド結合を形成する１つの方法は、冷室温下の長期間の該線状ペプチドの空気酸化である。この方法は、実質量の生物活性ジスルフィド結合ペプチドを生成する。酸化ペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)などを用いて分画し、異なる結合配置を有するペプチドを分離する。その後に、これらの画分と天然物の溶出とを比較するか、または単純なアッセイを用いることによって、最大生物活性の正確な結合を有する特定の画分を簡単に決定する。また、線状ペプチド、または２以上の画分を有する酸化産物を時としてイン・ビボ投与に使用し得ることも判明した。なぜならば、イン・ビボで生じる架橋および／または再配列が生物学的に活性なコノトキシン分子を生成することが判明したからである。しかしながら、より低い生物活性の他の画分が存在することにより希釈されるため、幾分高い用量が必要となり得る。本発明のＡ-系統コノトキシンペプチド中にジスルフィド結合を形成させる第２の方法には、Ａ-系統コノトキシンペプチドの合成の間の、第２および第５システイン上の保護剤としてのアセトアミドメチル(Ａｃｍ)の使用が含まれる。これらの２個の残基に対するＡｃｍの使用は、他のＡ-系統コノトキシンペプチドにおけるジスルフィド結合との類似性に基づいている。Ａｃｍ保護システインを有するペプチドを室温にて一晩空気酸化する。二環式ペプチドをＨＰＬＣによって分離し、所望の異性体を単離する。最終のジスルフィド架橋は、ヨウ素化によって行う。望ましくない異性体は、線状ペプチドに還元することによって効率的にリサイクルされる。所望の異性体は、部分還元分析(４)によって決定する。この分析においては、二環式前駆体の試料をトリス-[２-カルボキシエチル]ホスフィンで処理して線状ペプチドおよび単一-架橋中間体を得る。後者のペプチドをヨードアセトアミドと反応させて、アルキル化システイン残基の位置を配列分析によって確立する。該ペプチドは、排他的な固相技術によるか、部分固相技術によるか、断片縮合によるか、または古典的な溶液カップリングによるごとき、適当な方法によって合成する。近年開発された組換えＤＮＡ技術を用いて、これらのペプチド、特に翻訳後修飾工程に不要な天然アミノ酸残基のみを含有する長いもの、を調製することができる。従来の溶液相ペプチド合成においては、構成アミノ酸を所望の配列で伸長するペプチド鎖に付加する一連のカップリング反応によって、ペプチド鎖を調製することができる。種々のＮ-保護基、例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミドまたはカルボニルジイミダゾール、種々の活性エステル、例えば、Ｎ-ヒドロキシフタルイミドまたはＮ-ヒドロキシ-スクシンイミドのエステル、ならびに種々の切断試薬を使用して、溶液中で反応を行わせ、続いて単離し、中間体を精製することは、よく知られた古典的なペプチド方法である。古典的な溶液合成は、論文 "Methoden der Organischen Chemie(Houben-Weyl)：Synthese von Peptiden"（５）に詳細に記載されている。排他的固相合成の技術は、テキストブック”Soli d-Phase Peptide Synthesis”（６）に記載されており、米国特許第4,105,603号（７）の開示によって例示されている。合成の断片縮合法は米国特許第3,972,85 9号(８)に例示されている。他の利用し得る合成は、米国特許第3,842,067号(９) および第3,862,925号(１０)によって例示されている。かかる化学合成に共通することは、種々のアミノ酸基のラービル側鎖基の適当な保護基での保護であり、これは該基が最終的に除去されるまで、そのサイトで化学反応が生じるのを防ぐであろう。通常、アミノ酸またはフラグメント上のα -アミノ基の保護も共通するが、その基はカルボキシル基で反応し、続いてα-アミノ保護基が選択的に除去されて、その位置で起こる続く反応が許容される。従って、かかる合成における工程のごとく、ラービル側鎖を有する残基のうちの種々のものに結合した適当な側鎖保護基を有するペプチド鎖中にその所望の配列で位置する各アミノ酸残基を含有する中間化合物を生成することは共通する。側鎖アミノ保護基の選択に関する限りは、一般的に、該合成の間のα-アミノ基の脱保護の間に除去されないものを選択する。しかしながら、数種のアミノ酸、例えば、Ｈｉｓについては、保護は一般的に不要である。ペプチドの合成に使用する特定の側鎖保護基の選択においては、以下の一般ルールに従う：(ａ)該保護基は、好ましくはその保護特性を維持し、カップリング条件下において分裂しないこと、(ｂ)該保護基は、合成の各工程におけるα-アミノ保護基を除去するために選択される反応条件下で安定でなければならないこと、および(ｃ)側鎖保護基は、該ペプチド鎖を望ましくないように変化させない反応条件下で、所望のアミノ酸配列を含有する合成が完了した際に除去され得るものでなければならないこと。組換えＤＮＡ技術を用いてこれらのペプチドの多く、またはすべてさえも調製することが可能であろう。しかしながら、ペプチドがそのように調製されない場合には、当該技術分野で知られている他の同等の化学合成も前記のごとく用いることができるが、Merrifield固相合成を用いてそれを調製するのが好ましい。固相合成は、適当な樹脂に保護α-アミノ酸をカップリングさせることによってペプチドのＣ-末端から開始する。かかる出発物質は、α-アミノ-保護アミノ酸を、エステル結合によってクロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に結合することによってか、あるいは、アミド結合によってベンズヒドリルアミン(ＢＨＡ)樹脂またはパラメチルベンズヒドリルアミン(ＭＢＨＡ)樹脂に結合することによって調製し得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bondanskyら(１１)によって記載されている。クロロ-メチル化樹脂は、Bio Rad Laboratories社(Rich mond,CA)およびLab．Systems，Inc社から市販されている。かかる樹脂の調製は、Stewartら(６)によって記載されている。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、合成する所望のポリペプチドがＣ-末端に非置換アミドを有する場合に一般的に用いられる。従って、固相樹脂支持体は、式-Ｏ-ＣＨ₂-樹脂支持体、-ＮＨＢＨＡ樹脂支持体、または-ＮＨ-ＭＢＨＡ樹脂支持体を有するもののごとき、当該技術分野で知られているいずれのものであってもよい。非置換アミドが望ましい場合には、ＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂を使用するのが好ましい。なぜならば、切断によって直接アミドが得られるからである。Ｎ-メチルアミドが望ましい場合には、Ｎ-メチルＢＨＡ樹脂からそれを生成することができる。他の置換アミドが望ましい場合には、米国特許第4,569,967号(１２)の教示を用いることができ、あるいは、遊離酸以外のなお他の基が望ましい場合には、Houb enWeylテキスト(５)に記載されている古典的方法を用いて該ペプチドを合成することが好ましい。Ｂｏｃによって、および側鎖保護基によって保護されたＣ-末端アミノ酸は、適当には、K．Horikiら(１３)に記載の方法に従って、Ｃ-末端に遊離酸を有するペプチドを合成すべき場合には、撹拌しつつ２４時間、約６０℃のＤＭＦ中のＫＦを用いて、クロロメチル化樹脂に最初にカップリングさせることができる。ＢＯＣ-保護アミノ酸を樹脂支持体にカップリングさせた後に、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)またはＴＦＡ単独を用いることによって、該アミノ保護基を除去する。該脱保護は、約０℃ないし室温の温度にて行う。ジオキサン中のＨＣｌのごとき他の標準的な切断試薬、および特定のα-アミノ保護基を除去するための条件は、SchroderおよびLubke(１４)記載と同様に使用し得る。 α-アミノ-保護基を除去した後に、残りのα-アミノ-および側鎖-保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングさせて、前記定義の中間化合物を得、あるいは、別法として、合成において各アミノ酸に別々に付加して、固相反応器に添加する前に、そのうちの幾つかを互いにカップリングさせることもできる。適当なカップリング試薬の選択は、当業者の範囲内に入る。カップリング試薬として特に適当なのは、Ｎ,Ｎ'-ジクロロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)である。ペプチドの固相合成で用いる活性化試薬は、ペプチド技術分野でよく知られている。適当な活性化試薬の例は、Ｎ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドのごとき、カルボジイミドである。他の活性化試薬およびペプチドカップリングにおけるそれらの使用は、SchroderおよびLubke(１４)、およびKapoor(１５)によって記載されている。各保護アミノ酸またはアミノ酸配列は、約２倍量またはより過剰な量で固相反応器に導入し、カップリングは、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)：ＣＨ₂Ｃｌ₂( １：１)の媒質、またはＤＭＦもしくはＣＨ₂Ｃｌ₂単独中にて行うことができる。中間カップリングが起こる場合には、次のアミノ酸のカップリングの前のα- アミノ保護基を除去する前に、該カップリング工程を繰り返す。合成の各ステージにおけるカップリング反応の成功は、手動で行う場合、好ましくは、Kaiserら (１６)によって記載されているごとく、ニンヒドリン反応によってモニターする。カップリング反応は、Rivierら(１７)に報告されているようなプログラムを用いて、Beckman 990 automatic synthesizer上でのごとく、自動的に行うことができる。所望のアミノ酸配列が完成した後に、樹脂からペプチドを切断するのみならず、すべての残っている側鎖保護基、および以前に除去されていない場合にはＮ- 末端のα-アミノ保護基も切断する液体フッ化水素のごとき試薬で処理することによって、中間ペプチドを樹脂支持体から除去し、遊離酸形態のペプチドを得ることができる。配列中にＭｅｔが存在する場合には、好ましくは、ＨＦで樹脂からペプチドを切断して、活性なＳ-アルキル化を除去する前に、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／エタンジオールを用いてＢｏｃ-保護基を最初に除去する。切断にフッ化水素を用いる場合には、アニソール、クレゾール、ジメチルスルフィドおよびメチルエチルスルフィドのごとき１種または２種以上のスキャベンジャーを反応容器に含ませる。線状ペプチドの環化は、好ましくは、ペプチド樹脂の一部分の間のペプチドの環化とは反対に行って、Ｃｙｓ残基の間に結合を生成させる。かかるジスルフィド環化結合に作用するためには、当該技術分野でよく知られているように、アンモノリシスによって完全に保護したペプチドをヒドロキシメチル化樹脂またはクロロメチル化樹脂支持体から切断して、完全に保護されたアミド中間体を得、その後、これを適当に環化させ、脱保護することができる。別法として、脱保護、ならびに、前記の樹脂またはベンズヒドリルアミン(ＢＨＡ)樹脂もしくはメチルベンズヒドリルアミン(ＭＢＨＡ)からのペプチドの切断は、フッ化水素(ＨＦ)を用いて０℃で起こし、続いて前記のごとく酸化することができる。ＳＣＬＣを患う患者は、有効成分としてα-コノトキシンペプチドを含有する医薬組成物を投与することによって、本発明により治療する。該組成物は、一般的に、約２００ないし約２０００ナノモル、好ましくは５００ナノモルの有効成分を含有する、投与ユニット、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、注射剤、茶サジ一杯剤などを含有するであろう。投与の好ましい様式は、静脈内または筋肉内である。一般的に、α-コノトキシンペプチドは分解に対して比較的耐性であり、体内で数日間のオーダーで持続し得る。従って、投与スケジュールは、用いる特定のα-コノトキシンペプチドの生物学的寿命に依存して、１日当たり２回から数日間毎日１回までのいずれの範囲ともし得る。医薬担体と完全な混合物中の有効成分として本発明の化合物を含有する医薬組成物は、慣用的な医薬製剤技術に従って調製し得る。該担体は、投与、例えば、静脈内、経口、または非経口、に望まれる調製物の形態に依存して、広範な種々の形態を採り得る。経口投与形態の組成物の調製においては、例えば、経口液体調製物(例えば、懸濁液、エリクシルおよび溶液のごとき)の場合には、水、グリコール、油剤、アルコール、賦香剤、保存料、着色剤などのごときいずれかの通常の医薬媒質；あるいは、経口固形調製物(例えば、散剤、カプセル剤および錠剤のごとき)の場合には、デンプン、砂糖、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのごとき担体を用いることができる。投与におけるそれらの容易性のために、錠剤およびカプセル剤が、固形医薬担体を明らかに用いる場合の、最も有利な経口投与ユニット形態を代表する。望むなら、錠剤は標準的な技術によって糖衣または腸溶外皮とすることもできる。非経口に関しては、担体は、通常、例えば、溶解性を補助するために、または保存目的で他の成分も含有することができるが、滅菌水を含むであろう。注射用懸濁液は、適当な液体担体、懸濁化剤などを用いことができる場合でも調製し得る。Ｕ００２またはＭＩＩコノトキシンは、当該技術分野でよく知られている標準的な技術によって、１種または２種以上のラジオアイソトープで標識する。イン・ビボでスキャンし得るいずれの適当なラジオアイソトープも用いることができる。¹³¹Ｉまたは¹²⁵Ｉを標識として用いるのが好ましい。標識毒素は、５-５０ナノモルの範囲、好ましくは約２５ナノモルで静脈内投与する。ついで、標識ＭＩＩまたはＵ００２の結合を、フォトスキャン装置の使用によるごとき、当該技術分野でよく知られている標準的な技術によって検出する。標識毒素はＳＣＬＣ細胞に結合するであろうが、それらは自律神経節にも結合し得る。しかしながら、自律神経節の位置は知られており、ＳＣＬＣ細胞に対する標識毒素の結合から生じるシグナルから区別し得る。実施例本発明を以下の実施例に参照して説明するが、説明様式で記載されているものであり、如何なる場合においても該発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野でよく知られている標準的な技術、または以下に詳細に記載した技術を用いた。実施例１Ｕ００２の生物活性 WO 95/11256号(１８)に記載されているごとく調製したコノトキシンペプチドＵ００２の生物活性は、カエル皮膚胸筋の自然発生微小終板電位に対するその作用を測定することにより、およびα-ブンガロトキシンと競合するその能力を測定することによって決定した。Ｕ００２がアセチルコリン受容体に作用するか否かを試験するために、自然発生微小終板電位(mepps)に対する毒素の作用を測定した。自然発生微小終板電位( mepps)は、Sylgard-被覆カバーガラスにピン留めし、ついで、蛍光顕微鏡のステージに固定したチャンバーに入れた皮膚胸筋から細胞内的に測定した。毒素は、テトラメチルローダミン-リゾチームコンジュゲート(５μＭ)を含有する溶液中に中心に適用した。パッファー(puffer)ピペットから放出した毒素が終板領域と接触していることを確かめるために、溶液の蛍光を、モニターすべきその位置に放置した。浴を灌流することによって、パッファーピペットを取り除いた後に毒を終板から洗い流した。パッファーピペットから適用したＵ００２(２０５ｍＭ) は、ｍｅｐｐ増幅を３０％低下させ、これは毒を洗い流した後に回復した。この結果は、アセチルコリン受容体が毒によって可逆的に遮断されることを示している。電気生理学的データはNational Instruments社(Lab NB)またはGW Instruments 社(Mac-ADIOS adio)のいずれかからのＡ／Ｄ変換器ハードウエアを備えたMacin- toshコンピュータ上のバーチャルインスツルメントソフトウェア(LabVIEW National Inst.社製)で得た。カエル神経筋接合部で得られた結果、すなわち、前記した微小終板電位(mepps )の遮断は、(決定的な事実ではないが)このペプチドが脊椎動物神経筋接合部のアセチルコリン受容体に結合することを強く示している。この受容体指摘を確認するために、α-コノトキシンペプチドＵ００２がニコチン性アセチルコリン受容体のリガンド結合サイトに結合するか否かを、このサイトに対するラジオアイソトープ標識α-ブンガロトキシンと競合するこのペプチドの能力をアッセイすることによって実験した。結合実験は、Torpedo Californicaの電気板から単離したシナプス後膜画分の濾過アッセイを用いることによって行った。¹²⁵Ｉ-ブンガロトキシン(２０００Ｃｉ／ミリモル)をアッセイ当たりほぼ１０⁵ｃｐｍで用い；用いた条件下での１００％結合は２０,０００cpmであった。非標識α-ブンガロトキシン１μＭと予めインキュベートすることによって測定した非特異的結合は、差し引いた。この実験の結果は、５０μＭのα-コノトキシンペプチドＵ００２がTorped電気器官に見出されたよく特徴付けられたニコチン性アセチルコリン受容体への¹²⁵Ｉ-α -ブンガロトキシンの結合を７０％遮断することを示した。実施例２ α-コノトキシンＭＩＩペプチドの精製 α-コノトキシンＭＩＩは、α₃β₂サブタイプのニューロンニコチン性受容体に結合するペプチドについてスクリーニングすることによってConus magusの毒から単離された(ＭＩＩは、別法としてWO 95/11256(１８)に記載のごとく生成することもできる)。ニューロンニコチン性受容体をコードするラット脳からのクローン化ｃＤＮＡを用いてｍＲＮＡを作製し、これを標準的な技術によってXeno pus卵母細胞に注射した。このｍＲＮＡは該母卵細胞中で発現され、正常なニコチン性受容体が産生し、卵母細胞の細胞表面の一部分を形成した。アセチルコリンの直接的な生理学的効果がこれらの細胞で生成し得た。ＭＩＩは、Xenopus卵母細胞中に発現されたクローン化ニコチン性受容体に対して毒画分を電気生理学的にスクリーニングすることによって見出された。該アッセイは標準的なものである。卵母細胞を電流固定し、該細胞を含有する媒質にアセチルコリンを添加した。毒が全く存在しなければ、アセチルコリンを添加すると電流トレーシング (current tracing)によって認められ得る負の電流を引き起こす。毒が存在するとこの効果を低下させるか、または全くなくするであろう。種々のイモガイ毒を試験し、Conus magusからの毒がこのアッセイにおいては特に活性が強いことが判明した。この毒をＨＰＬＣによって分画し、種々の画分をこの方法によってアッセイした。コノトキシンＭＩＩは活性毒であるまま単離した。コノトキシンＭＩＩはアセチルコリンの作用に拮抗することが判明した。従って、それは、それがニコチン性アセチルコリン受容体アンタゴニストであるという意味において他のすべてのα-コノトキシンと同様に挙動する。しかしながら、ＭＩＩは、それがニコチン性受容体のα₃β₂サブタイプを潜在的に標的化する点で他のα-コノトキシンとは異なる。また、それは、ニコチン性受容体のα₇サブタイプにも強力な活性を示す。α-コノトキシンＭＩＩは、５-１０ｎＭのＩＣ₅₀で、α₃β₂ニコチン性アセチルコリン受容体を発現する卵母細胞中でアセチルコリンに対する応答を遮断する。このペプチドは、他のすべての試験したα_xβ_yニコチン性アセチルコリン受容体のアセチルコリン応答を遮断することにおいて、２-３桁、活性が低かった。実施例３ α-コノトキシンによるＳＣＬＣ不死化の阻害以前に記載したごとく、小細胞肺ガン(ＳＣＬＣ)細胞は、ニューロンタイプであるコリン作動性ニコチン性受容体を発現している。ニコチンおよびシトシンは、各々、ＳＣＬＣ細胞で強力なマイトジェンとして作用する５-ヒドロキシトリプタミン(５ＨＴまたはセロトニン)の放出を刺激する。α-コノトキシンＭＩはニコチンまたはシトシンが誘導したセロトニンの放出を遮断し、それは、ＳＣＬＣ不死化のニコチンおよびシトシン刺激に１μＭの濃度で完全に拮抗する。α- コノトキシンＭＩはこれらのＳＣＬＣ受容体に結合するが、α-コノトキシンＭＩは治療または診断用途に適さない。なぜならば、それは、神経筋受容体にも結合し、死に至り得る完全麻酔を引き起こし得るからである。α-コノトキシンＭＩおよびＵ００２は、ニコチン性ニューロン受容体と比して、神経筋受容体に対して遥かに低い親和性しか有していない。α-コノトキシンＭＩＩおよびＵ００２のＳＣＬＣ細胞に対する活性は、Codignolaら(２４)に記載のごとく試験する。これらのペプチドは、ニコチンまたはシトシンが誘導したセロトニンの放出を遮断し、ＳＣＬＣ不死化のニコチンおよびシトシン刺激に拮抗した。従って、ＭＩＩおよびＵ００２はＳＣＬＣのごとき腫瘍の不死化を防ぐのに適しており、以下に記載するごとく治療的に使用してかかる不死化を阻害することができる。これらのα-コノトキシンは、以下に記載するごとく小細胞肺ガンの存在および／または位置を検出するために診断的に使用することもできる。実施例４ α-コノトキシンを用いたＳＣＬＣの診断 α-コノトキシンＭＩＩまたはＵ００２を、当該技術分野でよく知られている標準的な技術を用いて¹³¹Ｉまたは¹²⁵Ｉで標識する。標識した毒は、５-５０ナノモルの範囲、好ましくは約２５ナノモルで静脈内投与する。ついで、フォトスキャン装置の使用するごとき当該技術分野でよく知られた標準的な技術によって該標識を検出する。標識した毒は、ＳＣＬＣ細胞に結合する。加えて、自律神経節に対しても幾分かの結合が起こり得る。標識した毒のＳＣＬＣ細胞に対する結合から生じるシグナルは、標識した毒の自律神経節に対する結合からのシグナルから、後者の知られている位置に基づいて容易に区別される。実施例５ＳＣＬＣ腫瘍を治療するためのα-コノトキシンの治療的使用ＳＣＬＣニコチン性受容体に結合し、神経筋受容体に対して低い親和性を有するα-コノトキシンＭＩＩまたはＵ００２は、治療的に用いてＳＣＬＣ腫瘍を患う患者を治療する。ＭＩＩまたはＵ００２を含有する医薬組成物は、好ましくは静脈内または筋肉内で、適当な投与コノトキシンを有し得る、ＳＣＬＣと診断された患者に投与する。２００-２０００ナノモル、好ましくは約５００ナノモルの用量を投与する。投与スケジュールは、用いる特定のコノトキシンのイン・ビボ安定性に依存する。コノトキシンは分解に対して比較的耐性であるため、それは、数日間のオーダーで持続し得る。したがって、ＭＩＩまたはＵ００２に関する典型的な投与スケジュールは、１日当たりに２回から数日間毎日１回までのいずれかである。本発明の方法および組成物が種々の具体例の形で取り込まれ得、本明細書中においてはそのうちの数種を開示したに過ぎないことは理解されるであろう。他の実施例が存在し、本発明の範囲から離れないことは当業者であれば明らかであろう。かくして、記載した具体例は例示的なものであって、限定することを意図するものでは決してない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クルツ，ローデス・ジェイアメリカ合衆国84114ユタ州ソルト・レイク・シティ、エム・ストリート・ナンバー 403、31番 (72)発明者ヒルヤード，ディビッド・アールアメリカ合衆国84124ユタ州ソルト・レイク・シティ・ジュノ・サークル3685番 (72)発明者マッキントッシュ，ジェイ・マイケルアメリカ合衆国84108ユタ州ソルト・レイク・シティ、サウス・2000・イースト1151 番 (72)発明者サントス，アメウルフィノ・エセフィリピン、ケソン・シティ、ディリマン、ユー・ピー・キャンパス、プロク・アキナルド７番

Claims

【特許請求の範囲】１．医薬上許容される担体中にＭＩＩおよびＵ００２よりなる群から選択されるα-コノトキシンの有効量を含んでなる医薬組成物を投与することを特徴とする小細胞肺ガンを患う患者を治療する方法。２．医薬上許容される担体中にＭＩＩおよびＵ００２よりなる群から選択されるα-コノトキシンの有効量を含んでなる医薬組成物を投与することを特徴とする小細胞肺ガン不死化(proliferation)を阻害する方法。３．ＭＩＩおよびＵ００２よりなる群から選択される標識したα-コノトキシンを対象に注射し、腫瘍の存在を検出することを特徴とする小細胞肺ガン腫瘍の存在を検出する方法。４．ＭＩＩおよびＵ００２よりなる群から選択される標識したα-コノトキシンを対象に注射し、腫瘍の存在を検出することを特徴とする小細胞肺ガン腫瘍の位置を検出する方法。５．小細胞肺ガンを患う患者を治療する医薬組成物を調製するためのα-コノトキシンＭＩＩまたはＵ００２の使用。６．小細胞肺ガン不死化を阻害する医薬組成物を調製するためのα-コノトキシンＭＩＩまたはＵ００２の使用。７．小細胞肺ガン腫瘍の存在または位置を検出する診断組成物を調製するためのα-コノトキシンＭＩＩまたはＵ００２の使用。