ES2268885T3 - Peptidos de chi-conotoxina como inhibidores de transportadores neuronales de anima. - Google Patents
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Abstract
Un péptido de x-conotoxina aislado, recombinante o sintético o un derivado de este que tiene la capacidad de inhibir un transportador neuronal de amina.
Description
Péptidos de chi-conotoxina como
inhibidores de transportadores neuronales de amina
La presente invención se relaciona con péptidos
novedosos y derivados de estos útiles como inhibidores de
transportadores neuronales de amina de neurotransmisores tal como
noradrenalina, serotonina, dopamina, ácido glutámico y glicina. La
invención también se relaciona con las composiciones farmacéuticas
que comprenden estos péptidos, sondas de ácido nucleico útiles en
encontrar analogías activas de estos péptidos, ensayos para
encontrar compuestos que tienen un transportador neuronal de
noradrenalina inhibidor de la actividad y el uso de estos péptidos
en la profilaxis o tratamiento de condiciones tal como, pero no
limitado a, incontinencia, condiciones cardiovasculares y desórdenes
de humor.
El caracol marino del género Conus
(caracol cónico) utiliza una estrategia bioquímica sofisticada para
capturar sus presas. Como depredadores de cualquier pescado, gusanos
u otros moluscos, el caracol cónico inyecta a su presa con veneno
que contiene un cóctel de péptidos bioactivos pequeños. Estas
moléculas de toxina, que se refieren como conotoxinas, interfieren
con la neurotransmisión apuntando a una variedad de receptores y
canales iónicos. El veneno de alguna sola especie Conus puede
contener más de 100 péptidos diferentes. Las conotoxinas se dividen
en clases en la base de sus blancos fisiológicos. Hasta ahora, se
han descrito diez clases. La clase
\omega-conotoxina de péptidos blanco y el bloqueo
de canales-Ca2+ voltaje-sensible que
inhiben la liberación del neurotransmisor. Las
\alpha-conotoxinas (Ver
WO-A-98/22126) y
\Psi-conotoxinas apuntan y bloquean los receptores
ACh nicotínicos, que causan bloqueo ganglionar y neuromuscular. Los
péptidos de la clase \mu-conotoxina actúan en el
bloqueo de canales-Na^{+}
voltaje-sensible inhibiendo el músculo y los
potenciales de acción del nervio. Las
\delta-conotoxinas apuntan y retrazan la
inactivación de canales-Na+
voltaje-sensible, incrementando la excitabilidad
neuronal. La clase \kappa-conotoxina de péptidos
apunta y bloquea los canales-K+,
voltaje-sensible y estos también causan el
incremento de la excitabilidad neuronal. Las conopresinas son
antagonistas del receptor de vasopresina y las conantoquinas son
antagonistas del receptor NMDA. Más recientemente, el prototipo de
una nueva clase de \gamma-conotoxina, que apunta a
un canal catión no específico voltaje-sensible, y de
una nueva clase o-conotoxina, que antagonisa al
receptor 5HT3, se ha descrito.
Ahora se ha encontrado que una nueva clase de
conotoxina existe, a partir de ahora se refiere como a la clase
\chi-conotoxina, que se caracteriza por que tiene
la capacidad de inhibir los transportadores neuronales de amina.
Los compuestos que inhiben el neurotransmisor de
la reabsorción han sido encontrados por ser útiles en el tratamiento
de desórdenes de las vías urinarias inferiores, tal como
incontinencia urinaria, inestabilidad del detrusor y cistitis
intersticial. Uno de tales compuestos es "imipramina" la cual,
en adición a la inhibición de la reabsorción de noradrenalina, se ha
demostrado que afecta el bloqueo del canal de calcio, y exhibe
actividad anticolinérgica, anestésica local y un número de otros
efectos. Otros compuestos capaces de inhibir la reabsorción de
noradrenalina se describen en la Patente U.S. 5, 441,985. Se dice
que, estos compuestos tienen un efecto anticolinérgico reducido
relativo a la imipramina.
En el caso de los péptidos de la presente
invención esta inhibición de reabsorción del neurotransmisor se
logra por inhibición selectiva del transportador neuronal del
neurotransmisor, tal como el transportador de noradrenalina, que
funciona liberando la noradrenalina libre rápidamente de la sinapsis
nuevamente en las neuronas.
Los péptidos de la presente invención son los
primeros péptidos que tienen actividad en la inhibición de un
transportador de amina. Todos los otros péptidos de conotoxina
caracterizados hasta ahora apuntan a los canales iónicos o a los
receptores en las superficies de las células.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención se proporciona un péptido de
\chi-conotoxina aislado, sintético o recombinante
que tiene la capacidad de inhibir un transportador neuronal de
amina.
Preferiblemente, el transportador neuronal de
amina es el transportador neuronal de noradrenalina.
El péptido de \chi-conotoxina
puede ser un péptido que ocurre naturalmente aislado de un caracol
cónico, o un derivado de estos.
Preferiblemente el péptido de
\chi-conotoxina es \chi-MrIA o
\chi-MrIB, o un derivado de estos.
\chi-MrIA y \chi-MrIB puede ser
aislado del veneno del caracol cónico que caza moluscos, Conus
marmoreus.
Son ambos péptidos de 13 residuos de aminoácidos
de longitud, y contiene 2-enlaces disulfuro; los
péptidos muestran más homología a los miembros en la clase
\alpha-conotoxina, que actúan como antagonistas
del receptor ACh nicotínico.
Las secuencias de aminoácido de
\chi-MrIA y \chi-MrIB son como
sigue:
| \chi-MrIA NGVCCGYKLCHOC | SEQ ID NO. 1 | |
| \chi-MrIB VGVCCGYKLCHOC | SEQ ID NO. 2 |
EL C-terminal puede ser un ácido
libre o aminado.
En las secuencias arriba la "O" se refiere
a 4-hidroxi prolina (Hyp). Este residuo de
aminoácido resulta de la modificación post translacional del péptido
codificado y no es directamente codificado por la secuencia del
nucleótido.
Preferiblemente, el péptido de
\chi-conotoxina es un inhibidor selectivo del
transportador neuronal de noradrenalina. Los términos
"selectivo" y "selectivamente" se utilizan en esta para
dar a entender que la actividad del péptido como un inhibidor de
transportador neuronal de noradrenalina es considerablemente mayor
de cualquier actividad en los
\alpha_{1}-adrenoceptores.
La Patente U.S. 5, 441,985 indica que la
reabsorción de los inhibidores de noradrenalina que tienen un efecto
anticolinérgico insignificante son particularmente útiles en el
tratamiento de desórdenes de la vía urinaria baja. Se ha encontrado
también que \chi-MrIA no tiene ningún efecto
anticolinérgico no detectable.
Consecuentemente en una modalidad preferida de
la invención se proporciona un péptido de
\chi-conotoxina aislado, sintético o recombinante
que tiene la capacidad de inhibir selectivamente un transportador
neuronal de noradrenalina, y que tiene efecto insignificante o
ningún efecto anticolinérgico. Se ha encontrado también que
\chi-MrIA no tiene actividad como un bloqueador de
canal de sodio o como un inhibidor del transportador de dopamina. La
ausencia dentro de \chi-MrIA de estas actividades
farmacológicas adicionales comúnmente asociadas con otros
inhibidores del transportador de noradrenalina y en preferencia los
péptidos de acuerdo con la invención, hace de estos péptidos, útiles
herramientas farmacológicas.
Los péptidos de
\chi-conotoxina de acuerdo con la invención pueden
ser péptidos que ocurren naturalmente, tal como
\chi-MrIA y \chi-MrIB, o pueden
ser derivados de péptidos que ocurren naturalmente.
El término "derivado" como se utiliza en
esta en conexión con los péptidos de
\chi-conotoxina que ocurren naturalmente, tal como
\chi-MrIA y \chi-MrIB, se
refiere a un péptido que difiere de los péptidos que ocurren
naturalmente de uno o más deleciones, adiciones, sustituciones de
aminoácido, o modificaciones de la cadena lateral. Tales derivados
que no tienen la capacidad de inhibir el transportador neuronal de
noradrenalina no caen dentro del alcance de la presente
invención.
Las sustituciones abarcan alteraciones del
aminoácido en las cuales un aminoácido se reemplaza con un residuo
de aminoácido diferente que ocurre naturalmente o un
no-convencional. Tales sustituciones se pueden
clasificar como "conservadora", en tal caso un residuo de
aminoácido contenido en un polipéptido se reemplaza con otro
aminoácido que ocurre naturalmente de carácter similar ya sea en
relación a la polaridad, funcionalidad de cadena lateral o tamaño,
por ejemplo
Ser\leftrightarrowThr\leftrightarrowHPro\leftrightarrowHyp\leftrightarrowGly\leftrightarrowAla,
Val\leftrightarrowIle\leftrightarrowLeu,
His\leftrightarrowLys\leftrightarrowArg\leftrightarrow,
Asn\leftrightarrowGln\leftrightarrowAsp\leftrightarrowGlu o
Phe\leftrightarrowTrp\leftrightarrowTyr. Debe ser entendido que
algunos aminoácidos no-convencionales también pueden
ser apropiados reemplazos para los aminoácidos que ocurren
naturalmente. Por ejemplo ornitina, homoarginina y dimetillisina se
relacionan con His, Arg y Lys.
Las sustituciones abarcadas por la presente
invención también pueden ser
"no-conservadoras", en las cuales un residuo de
aminoácido que está presente en un péptido se sustituye con un
aminoácido que tiene diferentes propiedades, tal como un aminoácido
que ocurre naturalmente de un grupo diferente (por ejemplo.
Sustituyendo un aminoácido cargado o hidrofóbico con alanina), o
alternativamente, en el que un aminoácido que ocurre naturalmente se
sustituye con un aminoácido no-convencional.
Las sustituciones de aminoácidos son típicamente
de residuos sencillos, pero pueden ser de residuos multiples, ya
sean agrupados o dispersos.
Preferiblemente, las sustituciones de
aminoácidos son conservadoras.
Las adiciones abarcan la adición de uno o más
residuos de aminoácidos que ocurren naturalmente o
no-convencionales. La deleción abarca la deleción de
uno o más residuos de aminoácidos.
Como se afirma arriba la presente invención
incluye péptidos en los cuales uno o más de los aminoácidos ha
experimentado modificaciones en la cadena lateral. Ejemplos de
modificaciones de cadena lateral contempladas por la presente
invención incluyen modificaciones de grupos amino tal como por
alquilación reductiva mediante reacción con un aldehído seguido por
la reducción con NaBH_{4}; amidinación con metilacetimidato;
acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con
cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2, 4,
6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS); acilación de
grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico;
y piridoxilación de lisina con
piridoxal-5-fosfato seguido por la
reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidina de residuos de arginina puede
ser modificado por la formación de productos de condensación
heterocíclicos con reactivos tales como
2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo se puede modificar por
activación de carbodiimida vía formación de
O-acilisourea seguido por derivatización
subsecuente, por ejemplo, a una amida correspondiente.
Grupos sulfidrilo pueden ser modificados por
métodos tales como carboximetilación con ácido iodoacético o
iodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico;
formación de un disulfuro mezclado con otros compuestos tiol;
reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida
sustituida; formación de derivados de mercurio utilizando
4-cloromercuribenzoato, ácido
4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de
fenilmercurio,
2-cloromercuri-4-nitrofenol
y otros mercuriales; carbamoilación con cianato a pH alcalino.
Cualquier modificación de los residuos de cisteina no debe afectar
la capacidad del péptido para formar los enlaces disulfuro
necesarios. También es posible reemplazar los grupos sulfidrilo de
cisteina con equivalentes de selenio de tal manera que el péptido
forma un enlace diselenio en lugar de uno o más de los enlaces
disulfuro.
Residuos de triptófano se pueden modificar por,
por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o
alquilación del anillo indol con
2-hidroxi-5-nitrobenzil
bromuro o haluros sulfenil. Los residuos de tirosina por otra parte,
pueden ser alterados por nitración con tetranitrometano para formar
un derivado 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo imidazol de un
residuo de histidina puede ser realizada por alquilación con
derivados de ácido iodoacético o N-carbetoxilación
con dietilpirocarbonato.
Un residuo de prolina se puede modificar
mediante, por ejemplo, hidroxilación en la
posición-4.
Una lista de algunos aminoácidos que tienen
cadena laterales modificadas y otros aminoácidos
no-naturales se muestra en la Tabla 1.
Estos tipos de modificaciones pueden ser
importantes para estabilizar el péptido si se administra a un
individuo o se utiliza como un reactivo de diagnóstico.
Otros derivados contemplados por la presente
invención incluyen un rango de variantes de glicosilación de una
molécula no glicosilada completamente para una molécula glicosilada
modificada. Los patrones de glicosilación alterados pueden resultar
de una expresión de moléculas recombinantes en diferentes células
huésped.
Las \chi-conotoxinas de la
presente invención son típicamente aminadas en el
C-terminal, sin embargo los compuestos con un
terminal carboxilo libre u otras modificaciones en el
C-terminal se consideran por estar dentro del
alcance de la presente invención. Preferiblemente los péptidos son
aminados o tienen un carboxilo libre en el
C-terminal.
Preferiblemente los derivados de péptidos de
\chi-conotoxina que ocurren naturalmente retendrán
los residuos Cys y moldearan el enlace disulfuro característico. Los
derivados pueden incluir residuos Cys adicionales proporcionados,
que se protegen durante la formación de los enlaces disulfuro.
En la modificación para formar los derivados de
los péptidos de \chi-conotoxina que ocurren
naturalmente es útil comparar las secuencias de aminoácido de
péptidos activos que ocurren naturalmente para determinar cuales, si
los hay, de los residuos se conservan entre especies activas. La
sustitución de estos residuos conservados, mientras que no este
prohibida, es menos favorecida que las sustituciones de residuos
no-conservados.
Los derivados donde Ala reemplaza uno o más
residuos se pueden utilizar para identificar el farmacóforo.
Preferiblemente solo uno o dos aminoácidos se reemplazan con Ala a
la vez. Los péptidos nuevos adicionales se pueden hacer donde los
residuos cargados, polares o hidrofóbicos, respectivamente, se
reemplazan para ayudar a la definición más precisamente el tipo de
interacciones involucradas en el enlace de esta clase farmacológica
de péptido en su receptor. Los reemplazos
no-conservadores, donde la carga se pone al revés, o
residuos polares reemplazan residuos hidrofóbicos, pueden a demás
identificar los residuos involucrados en el enlace. Todos estos
péptidos tienen potencial para mostrar la potencia mejorada, o mayor
selectividad. Los cambios de aminoácido no-nativo
podrían también ser incluidos para mejorar la potencia, selectividad
y/o estabilidad.
Los residuos expuestos son más probables por ser
involucrados en el enlace receptor y pueden ser sistemáticamente
reemplazados. El énfasis particular se coloca en los residuos que
cambian involucrados en el enlace y los residuos apenas en la
periferia del farmacóforo, utilizando formas más largas de la cadena
lateral o cambios no-conservados para tomar las
interacciones del enlace adicionales para mejorar la potencia y/o
selectividad. Que reduce o alarga los tamaños del lazo y la cola de
MrIA o MrIB, además modifica la actividad.
Se debe observar que MrIA y MrIB se componen de
una cola (residuos 1-3), y dos lazos (residuos
6-9 y 11-12), sin embargo los
péptidos de \chi-conotoxina y derivados de la
presente invención no son restringidos a aquellos que tienen esta
particular configuración de aminoácidos y enlaces disulfuro. Otras
configuraciones también son posibles, y a condición de que el
péptido resultante tenga la actividad requerida, un péptido estará
dentro del alcance de la presente invención. Preferiblemente los
péptidos tendrán al menos dos residuos de cisteina y al menos un
enlace disulfuro, o más preferiblemente cuatro residuos de cisteina
y dos enlaces disulfuro.
La conectividad de los enlaces disulfuro en
estos péptidos puede ser A-B/C-D,
A-C/B-D o
A-D/B-C, siendo el último el
preferido para MrIA y MrIB. A, B, C y D se refiere al primer,
segundo, tercer y cuarto residuos Cys implicados en la formación del
enlace disulfuro, respectivamente.
Estos péptidos también pueden ser etiquetados y
utilizados para establecer los ensayos de enlaces para identificar
nuevas moléculas que actúan en el mismo sitio. Por ejemplo, el
ligando etiquetado de MrIA o MrIB podría tener un tritio incluido o
puede tener yoduro radio-activo o adherencia similar
a través de un Tyr u otro residuo apropiado. Un barrido de Tyr a
través de cada péptido establecerá una localización apropiada para
la incorporación del Tyr. La inhibición del enlace de tales péptidos
etiquetados para tejidos homogeneizados o transportadores
expresados por compuestos o mezclas permitiría la identificación de
nuevos péptidos activos en este sitio, incluyendo los péptidos
presentes en suero y tejido nervioso y muscular de mamíferos, que
incluyen tejidos humanos. El ensayo también permitirá la
identificación de moléculas no-péptidicas o que
también actúan en el mismo sitio como MrIA y MrIB, y que puede tener
la utilidad como formas activas oralmente de estos péptidos. Los
péptidos etiquetados adicionalmente permitirán estudios
autoradiográficos para identificar la localización del enlace
peptídico a través de varios
tejidos.
tejidos.
Las porciones de estas secuencias pueden ser
utilizadas para buscar bases de datos de ESTR para identificar los
péptidos o proteínas de mamíferos que contienen información de la
secuencia relacionada que podría ser utilizada para identificar
ligandos endógenos que actúan de una manera similar en
mamíferos.
Las \chi-conotoxinas de la
presente invención se pueden preparar utilizando métodos sintéticos
de péptido estándar seguido por la formación del enlace disulfuro
oxidativo. Por ejemplo, los péptidos lineales pueden ser
sintetizados por la metodología de fase sólida utilizando química
BOC, según lo descrito por Schnoltzer et al (1992). Siguiendo
con la desprotección y división del soporte sólido los péptidos
reducidos se purifican utilizando la cromatografía preparativa. Los
péptidos purificados reducidos se oxidan en sistemas regulados, por
ejemplo como se describe en el ejemplo 2. Los péptidos oxidados se
purificaron utilizando cromatografía preparativa.
Las referencias que describen la síntesis de
conotoxinas incluyen Sato et al, Lew et al y WO
91/07980.
Las \chi-conotoxinas también
se pueden preparar utilizando tecnología de ADN recombinante. Una
secuencia del nucleótido que codifica la secuencia del péptido
deseada se puede insertar en un vector apropiado y la proteína
expresada en un sistema de expresión apropiada. En algunas
instancias, adicional modificación química del péptido expresado
puede ser apropiada, por ejemplo amidación del
C-terminal. Bajo algunas circunstancias puede ser
deseable emprender la formación del enlace oxidativo del péptido
expresado como una etapa química siguiendo la expresión del péptido.
Esto puede ser precedido por una etapa reductiva para proporcionar
el péptido desplegado. Aquellos de habilidad en el oficio pueden
fácilmente determinar las condiciones apropiadas para la reducción y
oxidación del péptido.
La invención además provee una molécula aislada
de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos
codificada o complementaria a la secuencia que codifica un péptido
de \chi-conotoxina según se describe arriba.
En un aspecto adicional de la presente invención
hay proporcionado una sonda de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos codificada o complementaria a una secuencia
que codifica todo o parte de un péptido de
\chi-conotoxina.
En una modalidad preferida particularmente la
sonda del ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos
codificada o complementaria a una secuencia que codifica la
secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
Como se utiliza aquí una referencia a una
"sonda" incluye la referencia a un cebador utilizado en la
amplificación o una sonda para utilizar en la hibridización
directa.
Todavía otro aspecto de la presente invención se
dirige a los anticuerpos de los péptidos de
\chi-conotoxina de acuerdo con la invención. Tales
anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser
seleccionados de anticuerpos que ocurren naturalmente en los
péptidos o pueden ser específicamente construidos por los péptidos
utilizando técnicas estándar. En el caso del último, los péptidos
pueden primero necesitar ser asociados con una molécula
transportadora. Los anticuerpos de la presente invención son
particularmente útiles como agentes terapéuticos o de
diagnóstico.
En este respecto, los anticuerpos específicos se
pueden utilizar para seleccionar los péptidos de acuerdo con la
invención. Técnicas para tales ensayos son conocidos en el oficio e
incluyen, por ejemplo, ensayos de doble enlace y ELISA. El
conocimiento de niveles peptídicos pueden ser importante para
monitorear ciertos protocolos terapéuti-
cos.
cos.
También puede ser posible preparar anticuerpos
antiidiotipicos utilizando técnicas conocidas en el oficio. Estos
anticuerpos antiidiotipicos y sus usos como agentes terapéuticos
representan un aspecto adicional de la presente invención.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden ser ADN o ARN. Cuando la molécula de ácido nucleico
está en la forma de ADN, puede ser ADN genómico o cADN. Las formas
ARN de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son
generalmente mARN.
Aunque las moléculas de ácido nucleico de la
presente invención son generalmente en forma aislada, se pueden
integrar en o ligar a o de otra manera fusionar o asociar con otras
moléculas genéticas tal como moléculas vector y en particular las
moléculas de vector de expresión. Los vectores y vectores de
expresión son generalmente capaces de replicación y, si fuera
aplicable, expresión en una o cualquiera de una célula procariota o
una célula eucariota. Preferiblemente, células procariotas incluyen
E. coli, Bacillus sp y Pseudomonas sp. Células
eucariotas preferidas incluyen células de levaduras, hongos,
mamíferos e insectos.
Consecuentemente, otro aspecto de la presente
invención contempla una construcción genética que comprende una
porción del vector y un gen capaz de codificar un péptido de acuerdo
con la invención.
Preferiblemente, la porción del gen de la
construcción genética está enlazada operablemente a un promotor
sobre el vector de tal manera que dicho promotor es capaz de dirigir
la expresión de la porción del gen en una célula apropiada.
La presente invención se extiende a tales
construcciones genéticas y a las células procariotas o eucariotas
que comprende las mismas.
Quimeras de \chi-conotoxinas
tal como MrIA, con otras conotoxinas o adicionalmente con otros
péptidos o proteínas, pueden ser hechas para manipular la actividad
en otras moléculas, en algunas instancias producir una nueva
molécula con funcionalidad extra. Esto podría preferiblemente
hacerse utilizando el segmento o segmentos de la secuencia de estos
péptidos que contienen el farmacóforo. Donde el farmacóforo es
discontinuo, los segmentos que componen el farmacóforo podrían
posicionarse en la nueva construcción para permitir el enlace al
receptor. Las quimeras con otras conotoxinas pueden incluir
residuos Cys adicionales y enlaces disulfuro adicionales.
Es común para los péptidos de conotoxina dentro
de una clase de actividad tener un patrón similar de los enlaces
disulfuro, con lazos del péptido entre los residuos de cisteina
respectivos. Para los enlaces disulfuro \chi-MrIA
y \chi-MrIB une el primer y cuarto, y el segundo y
tercer residuos de cisteina. Este patrón es diferente del patrón de
enlace observado para los péptidos de
\chi-conotoxina. A pesar de esa diferencia
derivados quiméricos se pueden preparar por la sustitución de un
lazo de un péptido de \chi-conotoxina con el lazo
que comprende una secuencia a partir de otro péptido, que incluye
\chi-conotoxina.
La invención también incluye dímeros, trímeros,
etc. de péptidos de \chi-conotoxina así como los
péptidos de \chi-conotoxina unidos a otros
péptidos.
Preferiblemente los péptidos de
\chi-conotoxina de acuerdo con la invención tienen
de 10 a 30 aminoácidos, más preferiblemente 11 a 20.
La secuencia génica completa para los péptidos
que ocurren naturalmente de \chi-conotoxina se
puede obtener utilizando una estrategia combinada 5' RACE y 3' RACE
acoplada con clonación y secuenciación de ADN.
Los péptidos de
\chi-conotoxina de acuerdo con la presente
invención son activos en la inhibición del transportador neuronal de
noradrenalina. Consecuentemente la invención provee el uso de un
péptido de \chi-conotoxina como un inhibidor del
transportador neuronal de noradrenalina, y en el tratamiento o
profilaxis de enfermedades o condiciones en relación a las cuales la
inhibición del transportador neuronal de noradrenalina se asocia con
un tratamiento eficaz. Tal actividad en agentes farmacológicos se
asocia con la actividad en la profilaxis o el tratamiento de
enfermedades o condiciones de los sistemas urinarios o
cardiovasculares, o desórdenes de humor, o en el tratamiento o
control del dolor o la inflamación.
Consecuentemente la presente invención provee un
método para el tratamiento o profilaxis de condiciones o
enfermedades urinarias o cardiovasculares o desórdenes de humor o
para el tratamiento o control del dolor o la inflamación que
incluyen la etapa de administración a un mamífero de una cantidad
eficaz de un péptido de \chi-conotoxina aislado,
sintético o recombinante que tiene la capacidad de inhibir el
transportador neuronal de noradrenalina.
Ejemplos de enfermedades o condiciones del
sistema urinario incluyen incontinencia urinaria y fecal. Ejemplos
de enfermedades o condiciones cardiovasculares incluyen arritmias de
varios orígenes e insuficiencia cardiaca coronaria. Ejemplos de
desórdenes de humor incluyen depresión, ansiedad y anhelos, tal como
fumar. Ejemplos de dolor incluyen dolor crónico, dolor neuropático y
dolor inflamatorio.
Preferiblemente el mamífero tiene la necesidad
de dicho tratamiento aunque el péptido puede ser administrado en un
sentido profiláctico.
La invención también provee una composición que
comprende un péptido de \chi-conotoxina aislado,
sintético o recombinante que tiene la capacidad de inhibir el
transportador neuronal de noradrenalina, y un excipiente o diluente
farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente la composición esta en la forma
de una composición farmacéutica.
También se proporciona el uso de un péptido de
\chi-conotoxina aislado, sintético o recombinante
que tiene la capacidad de inhibir el transportador neuronal de
noradrenalina en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o profilaxis de condiciones o enfermedades urinarias o
cardiovasculares, o desórdenes de humor, para el tratamiento o
control del dolor o de la inflamación.
También se observa que el transportador de
noradrenalina no se expresa solamente por células nerviosas, pero
también por otros tejidos que incluyen la placenta, células
endoteliales pulmonares y el útero. Los péptidos de acuerdo con la
presente invención también pueden ser eficaces en la inhibición de
estos transportadores de noradrenalina, y pueden ser útiles en el
tratamiento de condiciones en las cuales estos transportadores son
implicados.
Como será apreciado fácilmente por aquellos de
habilidad en el oficio, la ruta de administración y la naturaleza
del excipiente farmacéuticamente aceptable dependerá de la
naturaleza de la condición y el mamífero que se trata. Se considera
que el cambio de un particular excipiente o sistema de entrega, y la
ruta de administración sería fácilmente determinada por una persona
de habilidad en el oficio. En la preparación de cualquier
formulación que contiene el péptido activo se debería tener cuidado
para asegurar que la actividad del péptido no se destruye en el
proceso y que el péptido es capaz de alcanzar su sitio de acción sin
ser destruido. En algunas circunstancias sería necesario proteger el
péptido por métodos conocidos en el oficio, tal como, por ejemplo,
micro encapsulación. De modo semejante la ruta de administración
escogida sería tal que el péptido alcance su sitio de acción.
Las formas farmacéuticas apropiadas para uso
inyectable incluyen soluciones inyectables o dispersiones estériles,
y polvos estériles para la preparación de soluciones estériles
inyectables extemporáneas. Ellas serían estables bajo las
condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden preservarse
contra la oxidación y la acción de contaminación de microorganismos
tal como bacterias u hongos.
Aquellos de habilidad en el oficio fácilmente
pueden determinar apropiadas formulaciones para los péptidos o
péptidos modificados de la presente invención utilizando metodología
convencional. La identificación de rangos de pH preferidos y
excipientes apropiados, por ejemplo antioxidantes, es rutina en el
oficio (ver por ejemplo Cleland et al, 1993). Sistemas de
solución reguladora son rutinariamente utilizados para proveer los
valores de pH de un rango deseado e incluyen soluciones reguladoras
de ácido carboxílico por ejemplo acetato, citrato, lactato y
succinato. Una variedad de antioxidantes son disponibles para tales
formulaciones que incluyen compuestos fenólicos como BHT o vitamina
E, agentes reductores como metionina o sulfito, y quelantes de
metales tal como EDTA.
El solvente o medio de dispersión para la
solución o dispersión inyectable puede contener cualquiera de los
sistemas de solventes o excipientes convencionales para péptidos
activos, y pueden contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y
similares), mezclas apropiadas de estos, y aceites vegetales. La
fluidez correcta se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de
un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño
de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de los
surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos puede
ser causada donde sea necesario por la inclusión de varios agentes
antibacteriales y antifúngicos, por ejemplo, parabenos,
clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos
casos, sería preferible incluir agentes para ajustar la osmolalidad,
por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Preferiblemente, la
formulación para inyección será isotónica con sangre. La absorción
prolongada de las composiciones inyectables se puede causar por el
uso de las composiciones de agentes que retardan la absorción, por
ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Formas farmacéuticas
apropiadas para uso de inyectable pueden ser liberadas por cualquier
ruta apropiada que incluye inyección o infusión intravenosa,
intramuscular, intracerebral, intratecal o epidural.
Soluciones inyectables estériles se preparan por
la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida
en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes tal
como estos enumerados arriba, como requerido, seguido por
esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se
preparan por la incorporación de los varios ingredientes activos
esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de
dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos
enumerados arriba. En el caso de polvos estériles para la
preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de
preparación preferidos son secados por vacío o liofilización de una
solución filtrada-estéril previamente del
ingrediente activo más cualquiera de los ingredientes deseados
adicionales.
Cuando los ingredientes activos se protegen
apropiadamente, ellos pueden ser administrados por vía oral, por
ejemplo, con un diluente inerte o con un excipiente comestible
asimilable, o puede ser incluido en una cápsula de gelatina de
cáscara suave o dura, o se puede comprimir en tabletas, o pueden ser
incorporados directamente con el alimento de la dieta. Para
administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede
incorporar con excipientes y se utiliza en la forma que se pueden
ingerir de tabletas, tabletas bucales, pastillas, cápsulas,
elíxires, suspensiones, jarabes, wafers, y similares. Tales
composiciones y preparaciones preferiblemente contienen al menos 1%
en peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y
preparaciones pueden, por supuesto, ser variados y puede
convenientemente estar dentro de aproximadamente 5 a aproximadamente
80% del peso de la unidad. Se obtendrá la cantidad del compuesto
activo en tales composiciones útiles terapéuticamente en aquellas
dosificaciones adecuadas.
Las tabletas, pastillas, píldoras, cápsulas y
similares también pueden contener los componentes según lo enumerado
a partir de ahora: Un aglutinante tal como goma, acacia, almidón de
maíz o gelatina; excipientes tal como fosfato dicalcio; un agente
desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido
algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio;
y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina se
puede adicionar o un agente saborizante tal como saborizante de
menta, aceite de gaulteria, o cereza. Cuando la forma de la unidad
de dosificación es una cápsula, esta puede contener, en adición a
los materiales del tipo de arriba, un excipiente líquido. Varios
otros materiales pueden estar presentes como cubiertas o de otra
manera como cubiertas o para modificar la forma física de la unidad
de dosificación. Por ejemplo, tabletas, píldoras, o cápsulas se
pueden cubrir con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir
puede contener el compuesto activo, sacarosa como un agente
edulcorante, metil y propilparabenos como preservativos, un
colorante y saborizante tal como sabor de cereza o naranja. Por
supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de
cualquier forma de unidad de dosificación debería ser
farmacéuticamente puro y sustancialmente no-tóxico
en las cantidades empleadas. En adición, el compuesto(s)
activo(s) se puede incorporar en preparaciones y
formulaciones de liberación controlada.
La presente invención también extiende a
cualquier otra forma apropiada para la administración, por ejemplo
aplicación tópica tal como cremas, lociones y geles, o composiciones
apropiadas para entrega por inhalación o intranasal, por ejemplo
soluciones o polvos secos.
Se prefieren formas de dosificación parenteral,
que incluyan aquellas apropiadas para entrega intravenosa,
intratecal, intracerebral o epidural.
Excipientes y/o diluentes farmacéuticamente
aceptables incluyen cualquier y todos los solventes, medios de
dispersión, cubierta, agentes antibacteriales y antifúngicos,
isotónicos y agentes que retardan la absorción y similares. El uso
de tales medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas
es conocido en el oficio. Excepto a tal grado como cualquier medio o
agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se
contempla el uso de estos en las composiciones terapéuticas. Los
ingredientes activos suplementarios también pueden ser incorporados
en las composiciones.
Es especialmente ventajoso para formular
composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para
facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La
forma de unidad de dosificación como se utiliza en esta se refiere a
unidades discretas físicamente como dosificaciones unitarias para
los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad que contiene una
cantidad predeterminada de material activo calculada para producir
el deseado efecto terapéutico en asociación con el excipiente
farmacéutico requerido. La especificación para las novedosas formas
de unidad de dosificación de la invención son estipuladas por y
directamente dependen de (a) las características únicas del
material activo y el efecto terapéutico particular para lograrse, y
(b) las limitaciones inherentes en el oficio para sintetizar tal
material activo para el tratamiento de la enfermedad en sujetos
vivos que tienen una condición mórbida en la cual la salud corporal
se deteriora según se revela en esta en detalle.
El ingrediente activo principal se sintetiza
para una administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces
con un apropiado excipiente farmacéuticamente aceptable en la forma
de unidad de dosificación. Una forma de unidad de dosificación
puede, por ejemplo, contener el compuesto activo principal en
cantidades que fluctúan entre 0.25 mg a aproximadamente 2000 mg.
Expresadas en proporciones, el compuesto activo está generalmente
presente entre aproximadamente 0.25 mg a aproximadamente 200 mg/ml
del excipiente. En el caso de composiciones que contienen
ingredientes activos suplementarios, Las dosificaciones se
determinan por referencia a la dosis usual y a la manera de
administración de dichos ingredientes.
La invención ahora será descrita con referencia
a los dibujos y ejemplos acompañantes, sin embargo debe ser
entendido que la particularidad de la descripción siguiente no es
reemplazar la generalidad de la descripción precedente de la
invención.
Refiriendose a las figuras:
Figura 1 es una representación gráfica que
muestra el efecto típico de \chi-MrIA en el curso
del tiempo de la contracción de los conductos deferentes prostáticos
de rata bisectados al estímulo en campo con un pulso supramáximo
sencillo (55 V, 1 ms). Se adicionó \chi-MrIA (30
nM-3 \muM) al baño del órgano acumulativamente en
medidas de unidad de registro medio.
Figura 2 es un representación gráfica del efecto
de \chi-MrIA, -MrIA en respuestas contráctiles de
porciones bisectadas de los conductos deferentes epididimarios de la
rata para agonistas \alpha_{1}-adrenoceptor
exógenos. (a) registro de las curvas de
respuesta-concentración para noradrenalina en la
ausencia (o) y la presencia de 1 \muM (\Delta) o 3 \muM
(\Box) in \chi-MrIA, -MrIA. (b) registro de las
curvas de respuesta-concentración para metoxamina en
la ausencia (o) y la presencia (\Box) de 3 \muM
\chi-MrIA. Cada punto de dato en (a) y (b)
representa la media 6SEM de observaciones de preparaciones de
tejidos de 4-5 individuos. Algunas barras de error
se opacan por los símbolos.
Figura 3 es una representación gráfica que
muestra la inhibición por \chi-MrIA en la
acumulación sensible de la desipramina de
[^{3}H]-noradrenalina mediante las células de
Ovario de Hamster Chino (CHO) transfectadas con el clon de cADN para
el transportador neuronal de noradrenalina humano. La acumulación de
[^{3}H]-noradrenalina se expresa como un
porcentaje de la absorción celular en la ausencia de
\chi-MrIA. Los puntos de datos representan la
media de 6SEM u observaciones de 4 experimentos separados.
Figura 4 es una representación diagramática que
muestra la derivación de la secuencias del péptido del veneno de la
concha del cono. La 5'RACE PCR utilizando los cebadores AP1 +
CHI-1B produce el 5' UTR y la secuencia líder del
péptido que luego se utilizado para generar los cebadores PCR
específicos para \chi-conotoxinas. La 3' UTR
utilizando los cebadores CHI-1A + ANCHOR completan
la derivación de la secuencia del péptido madura remanente y la
secuencia 3' UTR.
Los medicamentos usados en esta y los siguientes
ejemplos incluyen: desipramina hidrocloruro (Sigma); indomethacin
(Sigma); metoxamina hidorcloruro (Sigma);
(-)-noradrenalina bitartrato (Sigma);
[^{3}H]-1-noradrenalina (actividad
específica 2200 Ci/mM; New England Nuclear, Boston, MA, U.S.A.);
tetrodotoxina (Sigma); yohimbine hidrocloruro (Sigma).
Los datos para los ejemplos debajo se expresan
como la media y el error estándar de 4-6
experimentos. El ajuste de curvas sigmoide para el cálculo de los
valores EC_{50} se realizó por regresión no-lineal
utilizando el paquete de software Igor Pro (WaveMetrics). Las
diferencias entre las medias se evaluaron por el test de Student
(dos-colas) utilizando el paquete de software Prism
(GraphPad). Valores de P < 0.05 se tomaron para indicar
estadísticamente las diferencias significativas.
Ratas Wistar macho (250-350 g)
se mataron por un golpe en la cabeza y los conductos deferentes se
retiraron. Cada tejido se dividió en porciones epididimarias y
prostáticas bisectadas. Los segmentos del tejido se montaron en 5 mL
de baño de órganos bajo una tensión de 0.5 g. La solución de baño
tenía la siguiente composición (mM): NaCl, 119; KCl, 4.7;
MgSO_{4}, 1.17; KH_{2}PO_{4}, 1.18; NaHCO_{3}, 25.0;
glucosa, 5.5; CaCl_{2}, 2.5; EDTA, 0.026; se conservaron a 37ºC y
burbujearon con CO_{2} al 5% v/v en O_{2}. Las preparaciones se
equilibraron por al menos 45 min previo al inicio de la
experimentación. Las contracciones se registraron por medio de un
transductor de fuerza isométrica (Narco Bio-System
F-60) y se registraron en un ordenador Power
Macintosh utilizando el software Chart versión 3.5.4/s y un sistema
de adquisición de datos MacLab/8s (ADInstruments) a una frecuencia
de muestreo de 200 Hz.
Los segmentos prostáticos bisectados se
utilizaron para examinar el efecto de \chi-MrIA
sobre la contracción evocada eléctricamente del músculo liso mediado
por neurotransmisión simpática. Las preparaciones del tejido se
montaron con electrodos de estimulación de platino. La estimulación
de campo eléctrico (EFS) se hizo a intervalos de 3 min utilizando un
solo pulso de 55 V de una duración de 1 ms generada por un
Estimulador S44 Grass. Las contracciones se podrían bloquear
mediante tetrodotoxina (0.1 mM), indicando que ellas fueron mediadas
neuralmente. El incremento de las concentraciones del péptido se
adiciono al baño de órganos acumulativamente en incrementos de la
unidad del registro medio. Cada dosis se aplicó una vez que el
efecto de la dosis previa en la respuesta a la estimulación
eléctrica había logrado un nivel estable.
Las porciones bisectadas de los conductos
deferentes de rata prostática responden a estimulación en campo con
una contracción bifásica. En esta preparación, los dos componentes
de la contracción bifásica se separaron bien temporalmente. La
primera parte de la respuesta fue la dominante, y alcanzó un nivel
máximo de aproximadamente 200 ms después de la entrega del pulso
eléctrico. La segunda fase de la contracción maximizada
aproximadamente 500 ms después de estimulación. Nuestros intentos
por identificar la actividad farmacológica de
\chi-MrIA inició con una investigación de sus
efectos en los conductos deferentes de rata estimulados en campo. El
efecto de \chi-MrIA sobre la repuesta de la
preparación para estimulación en campo se muestra en la Figura 1. La
conotoxina (30 nM-3 \muM) actuó para incrementar
la segunda fase de la contracción. Se encontró que este efecto
depende de la concentración. Mediante la sustracción de la repuesta
control de las trazas obtenidas en la presencia de
\chi-MrIA, el mejoramiento específico mediante el
péptido de solo el segundo componente de la contracción llega a ser
aparente. También se puede construir una curva de la
respuesta-concentración para
\chi-MrIA que actúa para potenciar
específicamente el segundo componente.
La acción de \chi-MrIA sobre
la repuesta evocada eléctricamente fue altamente específica,
incrementando solo el segundo componente de la respuesta bifásica.
Esta última fase de la contracción se reconoce por ser mediada por
la noradrenalina, y se inhibe selectivamente por prazosina y otros
antagonistas \alpha_{1}-adrenoceptor. La primera
fase de la contracción, que se debió a la activación de
P_{2x}-purinoceptores post-unión
por liberación de ATP, no se incrementó de manera similar. La
magnitud del componente noradrenérgico de la contracción se modula
por la cantidad de noradrenalina liberada por disparo del nervio
simpático, la densidad de
\alpha_{1}-adrenoceptores
post-unión y sus acoplamientos a sistemas
ejecutadores, y el índice al cual la noradrenalina se despeja de la
sinapsis.
El antagonismo en
\alpha_{2}-adrenoceptores presinóptico se
reconoce bien para mejorar la liberación evocada eléctricamente de
noradrenalina de los nervios simpáticos mediante el bloqueo de la
activación de un sistema de retroalimentación negativo por la
liberación de noradrenalina. Sin embargo, el antagonismo de
\alpha_{2}-adrenoceptor no puede ser el
mecanismo de acción de \chi-MrIA. Distintos
\chi-MrIA, antagonistas
\alpha_{2}-adrenoceptor tal como yohimbine e
idazoxano actúan para mejorar igualmente los componentes
purinérgicos y noradrenérgicos de la contracción de los conductos
deferentes de rata. Adicionalmente, la repuesta a un solo pulso,
contrariamente a un tren de estímulo, no es sujeta a la regulación
por este mecanismo de retroalimentación negativa dado que no habría
un agonista presente en estos sitios del receptor en el tiempo de
estimulación. Por consiguiente yohimbine (1 mM) no tiene ningún
efecto sobre las respuestas evocada en este ensayo.
Los conductos deferentes de rata se utilizaron
como se describe arriba, excepto que los segmentos de epididimaria
bisectados no fueron estimulados eléctricamente. Estas preparaciones
se utilizaron en lugar de establecer curvas de
repuesta-concentración para noradrenalina y
metoxamina en la ausencia y presencia de
\chi-MrIA: En este tejido, la noradrenalina y la
metoxamina causa contracción del músculo liso vía activación de
postjunctional \alpha_{1}-adrenoceptores. Se
aplicó un \chi-MrIA a una concentración de ya sea
1 \muM o 3 \muM al baño de órganos y se deja equilibrar con el
tejido por 20 min previo a las adiciones acumulativas de
noradrenalina o metoxamina. Una sola curva de
repuesta-concentración se determinó para la
preparación, con segmentos del tejido contralaterales a los cuales
\chi-MrIA no le fue aplicada una porción como
controles.
Fue posible determinar si la acción de
\chi-MrIA ocurre secuencia arriba o en dirección
3' de la liberación del neurotransmisor analizando el efecto del
péptido bajo la repuesta a noradrenalina aplicada exógenamente. Dado
que \chi-MrIA incrementa la potencia de
noradrenalina baño-aplicado, nosotros podemos
concluir que la conotoxina actúa potenciando la repuesta de la
noradrenalina, mejor que promoviendo su liberación del
almacenamiento neural. Esta potenciación podría ocurrir como una
consecuencia de la sensibilidad creciente de
\alpha_{1}-adrenoceptor o de la terminación
deteriorada de la acción de noradrenalina. El agonista
\alpha_{1}-adrenoceptor metoxamina se utilizó
para verificar cual de estos fue el mecanismo de acción de x MrIA.
Este agonista \alpha_{1}-adrenoceptor difiere de
la noradrenalina en que no es un sustrato para el transportador
neuronal de noradrenalina. Este transportador funciona para eliminar
la noradrenalina y otras catecolaminas de la sinapsis por la
absorción en los terminales nerviosos, y representa el principal
mecanismo para la terminación de la acción de noradrenalina en los
adrenoceptores de tejidos enervados simpáticamente. Puesto que la
metoxamina no está sujeta a la terminación por este mecanismo, la
inhibición del transportador no mejora la potencia de sus
acciones.
Se investigó, el efecto de
\chi-MrIA en las repuestas de los segmentos
bisectados de los conductos deferentes epididimaria de rata a dos
agonistas \alpha_{1}-adrenoceptor. El registro
de las curvas respuesta-concentración para
noradrenalina en la ausencia y presencia de
\chi-MrIA se muestra en la Figura 2a. A una
concentración de 1 \muM, \chi-MrIA actuó para
incrementar la sensibilidad del tejido a la noradrenalina, cambiando
la curva de repuesta-concentración a la izquierda.
El grado de potenciación observado fue mayor en los experimentos con
3 \muM \chi-MrIA. Ninguna concentración de la
conotoxina alteró la repuesta máxima del tejido a la noradrenalina.
El \chi-MrIA a una concentración de 3 \muM no
tuvo efecto en la curva de repuesta-concentración
para metoxamina (Figura 2b). La observación de que
\chi-MrIA no potencia la acción de metoxamina, en
contraste a su efecto en el grado de reacción a la noradrenalina, es
consistente con \chi-MrIA siendo un inhibidor del
transportador neuronal de noradrenalina.
La falta de efecto de
\chi-MrIA en la curva de
repuesta-concentración para metoxamina también
demuestra que \chi-MrIA no tiene efecto en los
\alpha_{1}-adrenoceptores, que podría ser
evidente como un cambio paralelo de la curva a la derecha. Esto
distingue un \chi-MrIA de algunos otros
inhibidores de transporte de noradrenalina, particularmente aquellos
utilizados como antidepresivos. El blanco terapéutico de muchos de
los medicamentos antidepresivos es el transportador neuronal de
noradrenalina. Sin embargo, muchos de estos compuestos,
especialmente los antidepresivos tricíclico, y para una extensión
menor de algunos medicamentos nuevos que son
no-relacionados estructuralmente para los
tricíclicos convencionales, se reconocen por actuar en otros sitios
tales como \alpha_{1}-adrenoceptores y
receptores ACh muscarínico.
Unos conejillos de Indias macho
(285-425 g) hambrientos durante la noche se mataron
con un golpe en la cabeza y se les extrajo la sangre. Los segmentos
del íleon de aproximadamente 1.5 cm longitud se retiraron y los
contenidos luminosos libres por lavado suave utilizando una jeringa
llena con solución de baño. Las preparaciones se colocaron en 5 mL
de baño de órganos que contiene la solución de baño de la siguiente
composición (mM): NaCl, 136.9; KCl, 2.68; CaCl_{2}, 1.84;
MgCl_{2}, 1.03; glucosa, 5.55; NaHCO_{3}, 11.9; y
KH_{2}PO_{4}, 0.45; se calentaron a 37ºC y burbujearon con 5%
v/v de CO_{2} en O_{2}, se incluyó Indomethacin (10 mM) en la
solución de baño para producir una línea base estable. Los tejidos
se colocaron bajo una tensión de 1.0 g y se dejaron equilibrar por
40 min previo al inicio de la experimentación. Las dosis de nicotina
(4 mM) luego se aplicaron a intervalos de 15 min hasta que las
repuestas se observaron por ser consistentes. Luego se adicionó el
\chi-MrIA (3 \muM), 25 min después de la cual
otra dosis de nicotina se aplicó. Las repuestas a la nicotina se
midieron isométricamente y se digitalizaron en un índice de muestreo
de
10 Hz.
10 Hz.
El \chi-MrIA (3 mM) no tiene
ningún efecto significante en las repuestas de los segmentos ileales
para la nicotina. En la ausencia de la conotoxina, la repuesta media
fue de 3.83 \pm 0.76 g, comparada con 4.07 \pm 0.80 g cuando
\chi-MrIA esta presente (p > 0.1; apareado
t-test; n=4). Las \chi-conotoxinas
bloquean los receptores Ach nicotínicos de cualquier subtipo
neuronal o músculo. Esto demostró que el \chi-MrIA
no apunta a los receptores ACh nicotínicos neuronales utilizando
segmentos aislados de íleon de conejillo de Indias. Puesto que de la
dependencia de la repuesta contráctil en la activación del receptor
muscarínico, se esperaba que la repuesta del íleon del conejillo de
Indias a la nicotina sería atenuada en la presencia de
\chi-MrIA si la conotoxina también actuó como un
antagonista receptor ACh muscarínico. En esta preparación, la
liberación de nicotina-inducida de ACh y varios
otros neurotransmisores que activan los receptores
post-unión no se afectaron por
\chi-MrIA. De esta manera, y en contraste a muchos
otros inhibidores de transporte, \chi-MrIA carece
de actividad anti-muscarínica.
Ratones Quackenbush machos
(20-30 g) se mataron por dislocación cervical. Los
hemidiafragmas izquierdos y derechos se retiraron con la adherencia
de nervios frénicos. La base de cada hemidiafragma se posicionaron
entre dos electrodos de estimulación de platino en paralelo y el
nervio frénico se coloco a través de dos lazos de platino pequeños
para estimulación de campo. La preparación se incuba a 37ºC en 5 mL
de un baño de órganos, se burbujeo con 5% v/v de CO_{2} en
O_{2}. La composición de la solución de baño fue (mM): NaCl,
135.0; KCl, 5.0; CaCl_{2}, 2.0; MgCl_{2}, 1.0; glucosa, 11.0;
NaHCO_{3}, 15.0; y KH_{2}PO_{4}, 1.0. Los tejidos se colocaron
bajo 1.0 g de tensión de reposo. Después se deja al menos 30 min
para equilibrio, alternando estimulación directa e indirecta se
hizo en intervalos de 10 s utilizando un pulso de 30 V de duración
de 2 ms en el músculo, y un pulso de 3 V de 0.2 ms de duración en el
nervio, respectivamente. Se registró el efecto de una sola dosis de
\chi-MrIA a una concentración de 3 \muM en las
contracciones producidas directamente e indirectamente. Las
respuestas se digitalizaron y registraron como se describe para las
preparaciones de los conductos deferentes.
Las contracciones producidas por la estimulación
de campo del nervio frénico, o por estimulación directa del músculo,
fueron no afectadas por 3 \muM de \chi-MrIA
(n=4). El \chi-MrIA no bloquea los receptores del
ACh nicotínicos del músculo en la preparación del nervio frénico
hemidiafragma de ratón. La carencia de actividad de
\chi-MrIA en el músculo esquelético o nervio motor
distingue este de la mayoría de los péptidos de conotoxina
caracterizados hasta hoy, los cuales son toxinas paralíticas y por
lo tanto tiene un papel claro en la captura de la presa.
Células de ovario de hámster Chino (CHO) se
cultivaron en placas de 24 pozos (Falcon) en 10% v/v de suero de
becerro fetal. Al alcanzar la confluencia 60-70%,
las células se transfectaron temporalmente (Lipofectamina, Gibco)
con un vector de expresión (pcADN3, Invitrogen) incorporando el cADN
íntegro para el transportador neuronal de noradrenalina humano
(Pacholczyk et al., (1991) Nature, 350,
350-4). Se utilizó un clon de cADN del transportador
neuronal de noradrenalina (Vollum Institute, Portland, OR, USA).
Estudios de absorción celular se realizaron 36 horas después de la
transfección. Las células CHO inicialmente se lavaron con una
solución reguladora de transporte que contiene (mM): NaCl, 157; KCl,
2.7; NaH_{2}PO_{4}, 11.8; MgCl_{2}, 1.0 y CaCl_{2}, 0.1; y
de pH 7.4. Las células luego se incubaron con solución reguladora de
transporte que contiene 50 nM
[^{3}H]-noradrenalina (suplementado con
noradrenalina sin marcar como sea necesario) y ácido ascórbico 100
\muM. También se incluyeron como apropiados
\chi-MrIA (0.1 nM-1 \muM) o
desipramina (10 \muM). Después de 20 minutos a temperatura
ambiente, las células se lavaron rápidamente con solución reguladora
salina fosfato helada luego se lisaron en 0.1% v/v
Triton-X. La célula lisada se tomo por el conteo de
centelleo líquido para determinar su nivel de radioactividad.
Adicionalmente, una alícuota de la célula lisada se utilizó para
medir la concentración de la proteína (ensayo de proteína BioRad
DC). La absorción de [3H]-noradrenalina específica
por el transportador de noradrenalina se definió como el componente
sensible a la desipramina
(10 mM).
(10 mM).
La acumulación de noradrenalina en las células
CHO que expresan el transportador neuronal de noradrenalina humano
se reduce a menos de 0.5% de la cantidad control para desipramina
(10 \muM), demostrando que la acumulación se debió casi
absolutamente a la absorción específica vía el transportador
clonado. El transportador de noradrenalina se confirmó como el
blanco de la conotoxina en estudios de absorción celular. El
\chi-MrIA (0.1 nM-1 mM) inhibe la
acumulación de noradrenalina radiomarcada de una manera
concentración-dependiente (Figura 3), con un
registro del valor IC_{50} de -8.17 \pm 0.0275 (n = 4). Se
encontró que la concentración de \chi-MrIA
requerida para inhibir la acumulación por el 50% es de
aproximadamente 7 nM. Esta concentración es aproximadamente una
orden de magnitud inferior que aquella necesitada para la
desipramina para producir el mismo efecto.
La cocaína y el \chi-MrIA son
ambos compuestos que ocurren naturalmente, sin embargo, ellos son
bastante diferentes. La cocaína es un alcaloide extraído de las
hojas de la planta de coca, mientras que \chi-MrIA
es un péptido directamente codificado por un gen de animal. En
adición a su efecto a la absorción del transportador, la cocaína se
conoce por poseer propiedades anestésicas locales potentes. Esto se
debe al bloqueo de ambos canales de sodio y potasio. Ninguna
evidencia se encontró de la actividad anestésica local de
\chi-MrIA en cualquiera de los ensayos. Se
encontró que \chi-MrIA no tiene ni efectos
contráctiles ni relajantes en el tono de los conductos deferentes
por sí mismo. Estudios similares revelan que la
\chi-conotoxina no inhibe el transportador de
dopamina.
El enlace mazindol tritiado con el transportador
de noradrenalina se midió en las células expresando la proteína
transportadora (ver Ejemplo 5). Se midió la influencia de
\chi-MrIA de 10^{-6} a 10^{9} sobre el enlace
mazindol tritiado. El \chi-MrIA no tiene ningún
efecto sobre el enlace mazindol tritiado, indicando que este actúa
no-competitivamente, en un sitio distinto de los
inhibidores del transportador de noradrenalina tradicional, tal como
desipramina, mazindol y cocaína.
La secuencia génica completa para la
\chi-MrIA se aisló utilizando un 5' RACE combinado
(Amplificación al azar de Terminales de cADN) y estrategia 3' RACE
acoplada con clonación y secuenciación de ADN.
El cebador del oligonucleótido
CH1-1B se diseñó de la secuencia del péptido madura.
La relación de los oligonucleótidos para el péptido es como sigue,
juntos con la secuencia del oligonucleótido:
| x-MrIA - NGVCCGYKLCHPC | SEQ ID NO. 3 | |
| CHI-1B 5'-CANGGRTGRCANARYTTRTA-3' | SEQ ID NO. 4 | |
| AP1 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' | SEQ ID NO. 5 |
(donde N=A/C/G/T, R=A/G, Y=C/T,)
La Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) se
llevó a cabo utilizando el oligonucleótido CH1-1B en
combinación con el oligonucleótido AP1 sobre las plantillas de cADN
derivadas de ellas ARN aislado de los conductos de veneno del
caparazón cónico. Los productos PCR, que representan la región 5'
del gen MrIA se aislaron, purificaron, clonaron en vectores
bacterianos y se secuenciaron. La secuencia génica para MrIA se
obtuvo de C. marmoreus (Fig. 4).
La secuencia de ADN para las
regiones-5' del gen se utilizó para diseñar los
oligonucleótidos que son capaces de detectar la secuencia MrIA, y
las secuencias de otros péptidos relacionados estrechamente. El
posicionamiento de los oligonucleótidos relativos a la secuencia
génica se muestra en la Figura 4. El oligonucleótido
CH1-1A se utilizó en PCR en conjunción con el
oligonucleótido ANCHOR para producir fragmentos de ADN
correspondientes al péptido líder, el péptido maduro y las regiones
3' no-traducidas (3'UTR) del gen. El PCR de las
plantillas de cADN del conducto de veneno de C. marmoreus
produce fragmentos de ADN correspondientes al péptido MrIA.
Las secuencias de ADN para los oligonucleótidos
son:
| CHI-1A 5'-ACAGGCAGAATGCGCTGTCTCCC-3' | SEQ ID NO. 6 | |
| ANCHOR 5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT-3' | SEQ ID NO. 7 |
La secuencia génica para el
\chi-MrIA producido utilizando 5' RACE y 3' RACE
representa los fragmentos traslapados del gen. Estos fragmentos se
combinaron, para producir una secuencia consenso para el gen. La
secuencia consenso es el cADN completo para el gen, e incluye 5'
UTR, el péptido líder, el péptido maduro y 3' UTR. El
\chi-MrIA líder y la secuencia del oligonucleótido
péptido madura se muestra en SEQ ID NO. 8, mientras que la secuencia
del aminoácido del péptido líder y maduro se muestra en SEQ ID NO.
9.
A través de esta especificación y las
reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de
otra manera, la palabra "comprender", y las variaciones tal
como "comprende" y "que comprende", será entendida para
implicar la inclusión de un número entero o paso o grupo de números
enteros o pasos indicados pero no la exclusión de cualquier otro
número entero o paso o grupo de números enteros o pasos.
<110> Lewis, Richard J.
\hskip1cmAlewood, Paul F.
\hskip1cmSharpe, Iain A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS NOVEDOSOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Davies Collison cave
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 09/787,986
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-10-01
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conus marmoreus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 12 es 4Hyp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His
Xaa Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conus marmoreus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 12 es 4Hyp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His
Xaa Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conus marmoreus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Gly Val Cys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys His
Pro Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcanggrtgrc anaryttrta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sonda de oligonucleotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatcctaat acgactcact atagggc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sonda del oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaggcagaa tgcgctgtct ccc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sonda del oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaactggaaga attcgcggcc gcaggaat
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conus marmoreus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conus marmoreus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
Claims (26)
1. Un péptido de
\chi-conotoxina aislado, recombinante o sintético
o un derivado de este que tiene la capacidad de inhibir un
transportador neuronal de amina.
2. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 1
que tiene la capacidad de inhibir un transportador neuronal de
noradrenalina.
3. Un péptido de
\chi-conotoxina aislado, sintético o recombinante
que tiene la capacidad de inhibir un transportador neuronal de amina
que tiene una secuencia seleccionada de:
o una secuencia que ha experimentado una o más
deleciones, adiciones, sustituciones de aminoácidos o modificaciones
de la cadena lateral.
4. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 3
que es \chi-MrIA o
\chi-MrIB.
5. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4 que es un inhibidor selectivo del
transportador neuronal de noradrenalina.
6. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5 que no tiene un efecto insignificante o
ningún anticolinérgico.
7. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 2
que tiene actividad insignificante o nula como un bloqueador de
canal de sodio.
8. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 2
que tiene actividad insignificante o nula como un inhibidor de
transportador de dopamina.
9. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 que tiene cuatro residuos de cisteina y dos
enlaces disulfuro.
10. Un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 9
en donde la conectividad del enlace disulfuro es
A-D/B-C, en donde A, B, C y D se
refieren al primer, segundo, tercer y cuarto residuos de cisteina
involucrados en la formación del enlace disulfuro,
respectivamente.
11. El uso de un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en un ensayo de enlace receptor para
probar la actividad de una molécula como inhibidor de un
transportador neuronal de amina, preferiblemente un transportador
neuronal de noradrenalina.
12. Una molécula de ácido nucleico aislado que
comprende una secuencia de nucleótidos codificada o complementaria a
una secuencia que codifica un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10.
13. Una sonda de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos codificada o complementaria a una
secuencia que codifica todo o parte de un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10.
14. Un anticuerpo monoclonal o policlonal para
un péptido de \chi-conotoxina de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
15. Una construcción genética que comprende a
porción del vector y un ácido nucleico capaz de codificar un péptido
de \chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10.
16. Un péptido quimérico que comprende un
segmento o una secuencia de un péptido que ocurre naturalmente de
\chi-conotoxina como se define en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10 y un segmento o secuencia de otro
péptido o proteína biológicamente activo, tal que el péptido
quimérico resultante posee una actividad asociada con otro péptido o
proteína.
\newpage
17. Un péptido \chi-conotoxina
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para
utilizar en el tratamiento o profilaxis de condiciones o
enfermedades urinarias o cardiovasculares o desórdenes de humor, o
para el tratamiento o control del dolor o la inflamación.
18. El uso de un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o profilaxis de enfermedades o las condiciones en
consideración a las cuales la inhibición de un transportador
neuronal de noradrenalina se asocia con un tratamiento o profilaxis
eficaz.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18
en donde dicho medicamento es destinado al tratamiento o profilaxis
de condiciones o enfermedades urinarias o cardiovasculares, o
desórdenes de humor, o para el tratamiento o control del dolor o la
inflamación.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19
en donde la enfermedad o condición del sistema urinario es
incontinencia urinaria o fecal.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19
en donde la enfermedad o condición cardiovascular es una arritmia o
insuficiencia cardiaca coronaria.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 19
en donde los desórdenes de humor son depresión, ansiedad o
anhelos.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 19
en donde el dolor es dolor crónico, dolor neuropático o dolor
inflamatorio.
24. Una composición que comprende un péptido de
\chi-conotoxina aislado, sintético o recombinante
que tiene la capacidad de inhibir un transportador neuronal de
noradrenalina, y un excipiente o diluente farmacéuticamente
aceptable.
25. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 24 que es una composición farmacéutica.
26. Utilización de un péptido de
\chi-conotoxina de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o profilaxis de enfermedades o condiciones en
consideración a las cuales la inhibición de un transportador de
noradrenalina se asocia con un tratamiento o profilaxis eficaz.
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